KR101611004B1 - ＴｒｋＡ를 이용한 백혈병 진단용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 TrkA를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 백혈병 진단용 조성물, TrkA 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 백혈병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법, TrkA 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 저하시킬 수 있는 물질을 스크리닝하는 단계를 포함하는 백혈병의 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법 및 상기 TrkA 유전자의 발현을 억제하거나 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 활성을 억제하는 제제를 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 TrkA 유전자를 이용하면, 다양한 종류의 백혈병의 발병을 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 백혈병의 발병을 억제할 수 있으므로, 백혈병의 예방 또는 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

ＴｒｋＡ를 이용한 백혈병 진단용 조성물{Composition for diagnosis of leukemia using TrkA}
본 발명은 TrkA를 이용한 백혈병 진단용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 TrkA를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 백혈병 진단용 조성물, TrkA 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 백혈병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법, TrkA 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 저하시킬 수 있는 물질을 스크리닝하는 단계를 포함하는 백혈병의 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법 및 상기 TrkA 유전자의 발현을 억제하거나 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 활성을 억제하는 제제를 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
백혈병(leukemia)은 백혈구가 종양성으로 증식하는 질환을 총칭한다. 백혈병의 종류는 백혈병이 기원하는 백혈구에 따라 골수성 백혈병과 림프성 백혈병으로 나눌 수 있고, 진행속도에 따라 급성백혈병과 만성백혈병으로 나뉜다. 백혈병의 임상양상은 질환의 유형과 침범된 세포의 성질에 따라 다양하다. 림프성 백혈병은 림프계 혈액세포가, 골수성 백혈병은 골수계 혈액세포가, 그리고 만성골수성백혈병은 성숙기에 있는 세포가 변이, 즉 혈구모세포(pluripotent hematopoietic stem cell)의 악성 클론들에 의해서 발생하며, 급성골수성백혈병은 비교적 초기단계의 조혈과정에서 분화를 시작하는 골수계 모세포의 장애로 초래된다.
이러한 백혈병을 진단하기 위하여, 초기에는 환자의 말초혈중의 백혈구 수를 측정하여, 계측치가 정상치를 웃도는 경우에 백혈병의 발생을 의심하는 방법을 사용하여 왔으나, 감기 등의 백혈병 이외의 질환에 있어서도, 체내의 면역 반응의 항진에 의해 백혈구 수는 증대하므로, 백혈구 수의 측정만으로는, 의사양성(擬似陽性)의 가능성이 있다는 단점이 있었다. 이에, 보다 신뢰성이 있는 백혈병 진단방법을 개발하려는 연구가 계속되었다.
최근에는 분자유전학이 발달되고, 악성 혈액질환의 80-90% 이상에서 백혈병 특이염색체 및 유전자의 이상이 규명되면서, 염색체 이상에 의한 분자생물학적 진단방법인 고 분염법, 형광 인시튜 하이브리드법( in situ hybridization), 중합효소 연쇄반응법 등이 사용되어 진단 성공율을 향상시키고 있다. 특히, 급성 림프구성 백혈병의 경우에는 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene), 암유전자(oncogene) 및 몇몇 염색체에 영향을 미치는 유전적 돌연변이가 주된 발병원인으로 알려져 있기 때문에, 유전적 변이를 검출하여 백혈병의 발병여부를 판단하는 방법이 사용되고 있다. 이같은 유전적 변이의 검출대상으로 사용되는 유전자로는 CYP, GST, NAT, MTHFR, NQO1, XRCC1, MDR1, cyclin D1, CCND1 등이 알려져 있으나, 상기 유전자를 마커로 사용하여 백혈병의 발병여부를 신뢰성있게 검출할 수 있는 환자는 아직까지도 일부에 불과하므로, 보다 다양한 백혈병 진단용 유전자 마커를 개발하여야 할 필요성이 절실히 대두되었다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 새로운 백혈병 진단용 유전자 마커를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 백혈병 세포주에서 특이적으로 발현되는 TrkA 유전자가 백혈병 세포주의 성장을 촉진시킬 뿐만 아니라 백혈병 세포주의 세포자멸을 억제할 수 있어, 상기 TrkA 유전자를 백혈병 진단용 유전자 마커로서 사용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 TrkA 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 백혈병 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 TrkA 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 백혈병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 TrkA 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 저하시킬 수 있는 물질을 스크리닝하는 단계를 포함하는 백혈병의 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 TrkA 유전자의 발현을 억제하거나 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 활성을 억제하는 제제를 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 실시양태로서, 본 발명은 TrkA를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 백혈병 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 새로운 백혈병 진단용 유전자 마커를 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, TrkA 유전자에 주목하게 되었다. 상기 TrkA 유전자는 일부 암의 진단마커로서 사용되어 왔으나, 백혈병의 진단에 사용할 수 있는지의 여부에 대하여는 연구되지 않았으므로, 상기 TrkA 유전자가 백혈병의 진단에도 사용될 수 있는지의 여부를 확인하고자 하였다.
먼저, 급성 림프구성 백혈병(Acute lymphoblastic leukemia, ALL) 환자, 급성 골수성 백혈병(Acute myeloid leukemia, AML) 환자, 만성 림프구성 백혈병(Chronic lymphocytic leukemia, CLL) 환자, 만성 골수성 백혈병(Chronic myeloid leukemia, CML) 환자 및 척수형성이상증(myelodysplasic syndrome, MDS) 환자의 골수세포를 대상으로 TrkA 발현수준을 비교한 결과, 백혈병에 속하는 ALL, AML 및 CML 뿐만 아니라 MDS에서는 정상인보다도 TrkA의 발현수준이 증가한 반면, CLL 환자에서는 정상인 보다도 TrkA의 발현수준이 감소함을 확인하였다.
또한, ALL 환자의 면역관련 세포 중에서, B-cell ALL 및 Pro-B ALL에서는 TrkA 발현수준이 정상인 시료에 비하여 유의하게 상향 조절되었으나, B-cell childhood ALL 및 T-cell ALL에서는 TrkA 발현수준이 정상인 시료에 비하여 유의한 차이를 나타내지 않음을 확인하여, TrkA 발현수준이 ALL의 아형에 따라 달라짐을 확인하였다.
아울러, 백혈병 세포주인 Jurkat, CCRF-HSB2, CCRF-SB, HL-60, K562, KU812, Meg01, ML-1, NB4 및 U937에서는 정상인에 비하여 높은 수준으로 TrkA가 검출됨을 확인하였다. 따라서, TrkA는 백혈병의 진단마커로서 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
다음으로, TrkA의 발현을 억제한 K562 세포주에서는 TrkA의 발현수준이 감소할 뿐만 아니라, 세포의 증식수준이 감소하였고, Trk 신호전달 억제제를 처리할 경우에는 백혈병 세포주의 증식이 현저하게 감소함을 확인하였다. 또한, TrkA의 발현을 억제한 K562 세포주에서는 세포자멸과 관련된 캐스파제-3의 활성이 증가하고, 이의 기질인 PARP의 수준이 감소하였으며, 이는 Trk 신호전달 억제제를 처리할 경우에도 동일한 양상을 나타냄을 확인하였다. 뿐만 아니라, TrkA의 발현을 억제한 K562 세포주 또는 Trk 신호전달 억제제가 처리된 K562 세포주에서는 백혈병의 초기에 활성화되는 PLK-1과 Twist-1의 발현이 억제됨을 확인하였다. 따라서, TrkA는 백혈병의 치료표적으로서도 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 용어 "TrkA"란, 신경영향인자 수용체(neurotrophin receptor)의 트로포마이오신 연관 인산화효소(tropomyosin-related kinase, Trk)의 일종을 의미하는데, 상기 TrkA는 뉴런의 일차적인 성장, 분화 및 생존을 조절하는 역할을 수행하고, 이의 돌연변이는 신경성 장애를 유발시킬 수 있으며, 특히 CIPA(congenital insensitivity to pain and anhidrosis)의 주요한 유발원인이 되는 것으로 알려져 있다. 상기 TrkA의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: AY293743.2).
본 발명의 용어 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 진단은 백혈병의 발병 여부를 확인하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 용어 "유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 유전자의 발현여부를 확인하기 위하여, 상기 표적 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 프라이머가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 TrkA 유전자의 증폭에 사용될 수 있는 프라이머가 될 수 있고, 상기 TrkA 유전자와 상보적으로 결합하여 TrkA 유전자를 증폭시킬 수 있는 한, 상기 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않으나, 바람직하게는 서열번호 5 또는 6의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 TrkA 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 될 수 있고, 상기 TrkA 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 한, 상기 프로브의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "단백질의 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 단백질의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩 분석법(protein chip assay) 등의 방법에 사용되는 항체가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 TrkA 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있고, 바람직하게는 TrkA 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 그의 일부가 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 급성 림프구성 백혈병(Acute lymphoblastic leukemia, ALL) 환자, 급성 골수성 백혈병(Acute myeloid leukemia, AML) 환자, 만성 림프구성 백혈병(Chronic lymphocytic leukemia, CLL) 환자, 만성 골수성 백혈병(Chronic myeloid leukemia, CML) 환자 및 척수형성이상증(myelodysplasic syndrome, MDS) 환자를 대상으로 TrkA 발현수준을 비교한 결과, 백혈병에 속하는 ALL, AML 및 CML 뿐만 아니라 MDS에서는 정상인보다도 TrkA의 발현수준이 증가한 반면, CLL 환자에서는 정상인 보다도 TrkA의 발현수준이 감소함을 확인하였다(도 1의 A), ALL 환자의 면역관련 세포 중에서, B-cell ALL 및 Pro-B ALL에서는 정상인 시료에 비하여 유의하게 상향 조절되었으나, B-cell childhood ALL 및 T-cell ALL에서는 정상인 시료에 비하여 유의한 차이를 나타내지 않음을 확인하여, TrkA 발현수준이 ALL의 아형에 따라 달라짐을 확인하였고(도 1의 B), 정상적인 골수시료(normal bone marrow samples, NBM)에 비하여, 대부분의 AML 환자에서 TrkA의 발현수준이 증가함을 알 수 있었으며(도 1의 C), 백혈병 세포주인 Jurkat, CCRF-HSB2, CCRF-SB, HL-60, K562, KU812, Meg01, ML-1, NB4 및 U937에서는 높은 수준으로 TrkA가 검출됨을 확인하였으므로(도 1의 D), TrkA는 백혈병의 진단마커로서 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 TrkA를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 이용하면 백혈병을 효과적으로 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 백혈병 진단용 조성물을 포함하는 백혈병 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 백혈병의 발병이 의심되는 환자의 시료로부터 TrkA를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하여 백혈병의 발병여부를 확인함으로써 백혈병을 진단하는데 사용될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 항체 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다.
본 발명의 용어 "시료"란, 백혈병 환자로부터 분리되어 TrkA의 발현수준을 측정하는 직접적인 대상을 의미하고, 바람직하게는 백혈병 환자의 혈액, 골수, 조직시료 등이 될 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명의 TrkA 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
다른 일례로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 분석용 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
또 다른 일례로서, 본 발명의 키트는 TrkA 유전자로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하기 위한 단백질 칩 분석용 키트가 될 수 있는데, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있으며, 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC, RITC 등이 될 수 있고, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 진단용 조성물 또는 키트를 이용하여 백혈병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데, 구체적으로, (a) 백혈병의 발병이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 TrkA를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 정상 대조군의 시료로부터 측정된 수준과 비교하여, 유의한 차이를 나타내는 경우 백혈병이 발병된 것으로 판정하는 단계를 포함한다.
이때, 상기 백혈병은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML) 등이 될 수 있는데, 상기 (a) 단계에서 측정된 TrkA를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 정상 대조군의 시료로부터 측정된 수준보다 유의하게 증가하는 경우에는 ALL, AML 또는 CML이 발병된 것으로 판정하고, 상기 (a) 단계에서 측정된 TrkA를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 정상 대조군의 시료로부터 측정된 수준보다 유의하게 감소하는 경우에는 CLL이 발병된 것으로 판정할 수 있다. 또한, ALL이 발병된 것으로 판정된 경우, 상기 ALL은 B-cell ALL 및 Pro-B ALL 중의 하나가 발병된 것으로 판단할 수 있다.
한편, 상기 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 방법은 상술한 바와 동일하다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 백혈병의 발병을 예방 또는 치료할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 실험동물에 투여하고, 상기 투여된 실험동물로부터 TrkA를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 백혈병의 예방 또는 치료용 제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
백혈병을 예방 또는 치료할 수 있는 후보 물질의 부재 하에 세포에서의 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하고, 또한, 상기 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 상기 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 변화시키는 물질을 백혈병의 예방 또는 치료용 제제로 예측할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 백혈병 예방 또는 치료용 제제를 스크리닝하는 방법은 (a) 백혈병이 발병된 실험동물의 시료로부터 TrkA를 코딩하는 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계;
(b) 백혈병을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 상기 실험동물에 투여하는 단계;
(c) 상기 (b)단계에서 후보물질이 투여된 실험동물의 시료로부터 TrkA를 코딩하는 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및,
(d) 상기 (a) 단계에서 측정된 TrkA 유전자의 발현수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준과 상기 (c)단계에서 측정된 수준을 비교하여, 상기 (a)단계에서 측정된 수준에 비하여 상기 (c)단계에서 측정된 수준이 유의한 차이를 나타내는 경우, 상기 후보물질을 백혈병의 발병을 방지하는 예방용 제제 또는 백혈병을 치료하는 치료용 제제로서 사용할 수 있는 것으로 판정하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 백혈병이 ALL, AML 또는 CML인 경우에는, 상기 (a) 단계에서 측정된 수준에 비하여 상기 (c)단계에서 측정된 수준이 유의하게 낮은 수준을 나타낼 때, 치료용 제제로서 사용할 수 있는 것으로 판정하고; 상기 백혈병이 CLL인 경우에는, 상기 (a) 단계에서 측정된 수준에 비하여 상기 (c)단계에서 측정된 수준이 유의하게 높은 수준을 나타낼 때, 치료용 제제로서 사용할 수 있는 것으로 판정한다.
또 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 상기 TrkA 유전자의 발현을 억제하거나 또는 TrkA 유전자로부터 발현된 단백질의 활성을 억제하는 제제를 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 이때, 상기 백혈병은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML) 또는 만성 골수성 백혈병(CML)이 될 수 있다.
상기 TrkA 유전자의 발현을 억제하거나 또는 TrkA 유전자로부터 발현된 단백질의 활성을 억제하면, 백혈병 세포의 성장 및 증식을 억제할 뿐만 아니라, 상기 백혈병 세포의 세포자멸을 촉진시킬 수 있으므로, 결과적으로는 백혈병의 발병을 예방 또는 치료할 수 있다.
상기 TrkA 유전자의 발현을 억제하는 제제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 TrkA 유전자로부터 유래된 mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 siRNA, shRNA 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 3 또는 4의 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 shRNA가 될 수 있다. 이때, 상기 siRNA 또는 shRNA는 벡터에 포함될 수 있는데, 이때 사용되는 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 신린셈리키 바이러스 등의 바이러스 벡터를 사용할 수 있다.
또한, 상기 TrkA 유전자로부터 발현된 단백질의 활성을 억제하는 제제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 TrkA 유전자로부터 발현된 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, TrkA 유전자로부터 발현된 단백질의 신호전달을 억제하는 억제제 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 TrkA 유전자로부터 발현된 단백질의 신호전달을 억제하는 Trk 타이로신 키나제의 억제제가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 Trk 타이로신 키나제의 억제제인 K252a가 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, TrkA의 발현을 억제한 K562 세포주에서는 TrkA의 발현수준이 감소할 뿐만 아니라(도 2의 A), 세포의 증식수준이 감소하였고(도 2의 B), Trk 신호전달 억제제를 처리할 경우에는 백혈병 세포주의 증식이 현저하게 감소함을 확인하였다(도 2의 C).
또한, TrkA의 발현을 억제한 K562 세포주에서는 세포자멸과 관련된 캐스파제-3의 활성이 증가하고, 이의 기질인 PARP의 수준이 감소하였으며(도 4의 A), 이는 Trk 신호전달 억제제를 처리할 경우에도 동일한 양상을 나타내고(도 4의 B), Trk 신호전달 억제제를 처리할 경우에 백혈병 세포주의 생존율이 현저하게 감소하였으며(도 4의 C), Trk 신호전달 억제제를 처리한 경우에는 백혈병 세포의 세포자멸이 급격히 증가하였고(도 4의 D), TrkA의 발현을 억제한 K562 세포주에서도 백혈병 세포의 세포자멸이 급격히 증가함을 확인하였다(도 4의 E).
뿐만 아니라, TrkA의 발현을 억제한 K562 세포주 또는 Trk 신호전달 억제제가 처리된 K562 세포주에서는 백혈병의 초기에 활성화되는 PLK-1과 Twist-1의 발현이 억제됨(도 3)을 확인하였으므로, TrkA는 백혈병의 치료표적으로서도 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 TrkA 유전자의 발현을 억제하는 제제를 포함하는 약학적 조성물은 백혈병이 발생할 가능성이 있거나 또는 발생된 개체에게 투여함으로써 백혈병의 발병을 예방 또는 치료하는데 활용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물에 포함된 상기 제제의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10 중량%의 함량으로 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 10 내지 100 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 10 내지 30 ㎎/㎏으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 내지 3회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 백혈병이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 백혈병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "개체"란, 상기 백혈병이 발병될 가능성이 있거나, 또는 발병된 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 조성물을 개체에 투여함으로써, 백혈병을 완화 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 용어 "완화"란, 본 발명에 따른 조성물의 투여로 백혈병이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 백혈병을 치료하는 방법에 있어서, 상기 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 TrkA 유전자를 이용하면, 다양한 종류의 백혈병의 발병을 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 백혈병의 발병을 억제할 수 있으므로, 백혈병의 예방 또는 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 백혈병 세포와 정상인의 세포에서 TrkA의 발현수준이 서로 상이함을 나타내는 그래프 및 사진으로서, 도 1의 A는 정상인(n=74)의 골수세포에서 발현되는 TrkA의 평균 발현수준과 각 증상별 환자의 골수세포에서 발현되는 TrkA의 평균 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 1의 B는 정상인(n=74)의 골수세포에서 발현되는 TrkA의 평균 발현수준과 ALL 환자(n=174)의 B-cell, B-cell childhood, Pro-B 및 T-cell에서 발현되는 TrkA의 평균 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 1의 C는 MDS로부터 유래된 AML의 초기 단계의 환자와 MDS로부터 전개된 이차 AML 환자에서 TrkA의 발현수준을 나타내는 사진이고, 도 1의 D는 다양한 종류의 백혈병 세포주로부터 발현되는 TrkA의 mRNA 수준과 정상적인 골수시료(NBM)에서 발현되는 TrkA의 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 백혈병 세포의 성장에 관여하는 TrkA의 작용기작을 나타내는 그래프 및 사진으로서, 도 2의 A는 K562 세포주에 도입된 대조군, TrkA #1-shRNA 및 TrkA #2-shRNA에 의해 변화된 TrkA의 발현수준을 나타내는 전기영동사진이고, 도 2의 B는 대조군, TrkA #1-shRNA 및 TrkA #2-shRNA가 도입된 K562 세포주의 세포수 변화를 배양시간의 경과에 따라 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 2의 C는 Trk 신호전달 억제제의 처리에 의한 백혈병 세포주의 증식수준의 변화를 배양시간의 경과에 따라 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 2의 D는 TrkA의 발현을 억제하는 shRNA로 처리된 백혈병 세포주에서 생산되는 인산화되거나 또는 인산화되지 않은 mTOR 및 Akt의 단백질 수준과, mTOR의 mRNA 수준을 나타내는 사진이며, 도 2의 E는 Trk 신호전달 억제제로 처리된 백혈병 세포주에서 생산되는 인산화되거나 또는 인산화되지 않은 mTOR 및 Akt의 단백질 수준과, mTOR의 mRNA 수준을 나타내는 사진이다.
도 3은 AML에서 과발현되는 PLK-1과 CML에서 과발현되는 Twist-1의 발현수준에 미치는 TrkA의 효과를 나타내는 그래프로서, 도 3의 A는 TrkA-shRNA가 도입된 K562 세포주에서 PLK-1의 mRNA 수준의 변화를 나타내는 그래프이고, 도 3의 B는 TrkA-shRNA가 도입된 K562 세포주에서 Twist-1의 mRNA 수준의 변화를 나타내는 그래프이며, 도 3의 C는 Trk 타이로신 키나제의 억제제가 처리된 K562 세포주에서 PLK-1의 mRNA 수준의 변화를 나타내는 그래프이고, 도 3의 D는 Trk 타이로신 키나제의 억제제가 처리된 K562 세포주에서 Twist-1의 mRNA 수준의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 백혈병 세포의 세포자멸에 관여하는 TrkA의 효과를 나타내는 그래프로서, 도 4의 A는 대조군, TrkA #1-shRNA 및 TrkA #2-shRNA가 도입된 K562 세포주에서, 캐스파제-3 및 PARP의 수준을 비교한 결과를 나타내는 사진이고, 도 4의 B는 Trk 신호전달 억제제를 처리한 백혈병 세포주에서 캐스파제-3 및 PARP의 수준을 비교한 결과를 나타내는 사진이며, 도 4의 C는 Trk 신호전달 억제제의 처리에 의한 백혈병 세포주의 생존율의 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 4의 D는 Trk 신호전달 억제제의 처리에 의한 백혈병 세포주의 세포자멸 수준을 비교한 결과를 나타내는 히스토그램 및 그래프이며, 도 4의 E는 TrkA의 발현을 억제하는 shRNA의 처리에 의한 백혈병 세포주의 세포자멸 수준을 비교한 결과를 나타내는 히스토그램 및 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 백혈병과 TrkA 발현수준의 상관관계 분석
본 발명자들은 백혈병의 발병시에 TrkA 발현이 미치는 영향을 규명하고자 하였다. 이를 위하여, 2143명의 환자로부터 얻어진 시료에서 TrkA 발현수준을 각각 측정하고, 이를 환자의 증상별, 조직별, 암종별로 구분하여 비교하였다(도 1). 도 1은 백혈병 세포와 정상인의 세포에서 TrkA의 발현수준이 서로 상이함을 나타내는 그래프 및 사진이다.
도 1의 A는 정상인(n=74)의 골수세포에서 발현되는 TrkA의 평균 발현수준과 각 증상별 환자의 골수세포에서 발현되는 TrkA의 평균 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 이때, 각 증상은 급성 림프구성 백혈병(Acute lymphoblastic leukemia, ALL) 환자(n=750), 급성 골수성 백혈병(Acute myeloid leukemia, AML) 환자(n=542), 만성 림프구성 백혈병(Chronic lymphocytic leukemia, CLL) 환자(n=448), 만성 골수성 백혈병(Chronic myeloid leukemia, CML) 환자(n=76) 및 척수형성이상증(myelodysplasic syndrome, MDS) 환자(n=76)를 대상으로 하였다. 도 1의 A에서 보듯이, 백혈병에 속하는 ALL, AML 및 CML 뿐만 아니라 MDS에서는 정상인보다도 TrkA의 발현수준이 증가한 반면, CLL 환자에서는 정상인 보다도 TrkA의 발현수준이 감소함을 확인하였다.
도 1의 B는 정상인(n=74)의 골수세포에서 발현되는 TrkA의 평균 발현수준과 ALL 환자(n=174)의 B-cell, B-cell childhood, Pro-B 및 T-cell에서 발현되는 TrkA의 평균 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1의 B에서 보듯이, TrkA 발현수준은 정상인 시료에 비하여, B-cell ALL 및 Pro-B ALL에서는 유의하게 상향 조절되었으나, B-cell childhood ALL 및 T-cell ALL에서는 감소함을 확인하여, TrkA 발현수준이 ALL의 아형에 따라 달라짐을 확인하였다.
도 1의 C는 MDS로부터 유래된 AML의 초기 단계의 환자와 MDS로부터 전개된 이차 AML 환자에서 TrkA의 발현수준을 나타내는 사진으로서, 내부대조군으로서 내재적 GAPDH mRNA 수준을 사용하였다. 도 1의 C에서 보듯이, 정상적인 골수시료(normal bone marrow samples, NBM)에 비하여, 대부분의 AML 환자에서 TrkA의 발현수준이 증가하였고, MDS로부터 유래된 AML의 초기 단계의 환자 뿐만 아니라 MDS로부터 전개된 이차 AML 환자에서도 TrkA의 발현수준이 증가하였으므로, MDS의 진행 및 이로 인한 병증의 심화에 TrkA가 중요한 역할을 수행할 것으로 분석되었다.
도 1의 D는 다양한 종류의 백혈병 세포주로부터 발현되는 TrkA의 mRNA 수준과 정상적인 골수시료(NBM)에서 발현되는 TrkA의 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 이때, 인간 백혈병 세포주로는 Jurkat, CCRF-HSB2, CCRF-SB, HL-60, K562, KU812, Meg01, ML-1, NB4 및 U937을 사용하고, 상기 각 세포주는 10% 열-불활성화시킨 소태아혈청을 첨가한 RPMI 1640(Gibco) 배지를 사용하여, 5% 습도를 유지한 37℃ CO2 인큐베이터에서 배양하였으며, 내부대조군으로서 내재적 18S mRNA를 사용하였고, 상기 18S mRNA의 검출에 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다.
18S F: 5'-ACCGCAGCTAGGAATAATGGA-3'(서열번호 1)
18S R: 5'-GCCTCAGTTCCGAAAACCA-3'(서열번호 2)
도 1의 D에서 보듯이, NBM에서는 TrkA의 mRNA가 거의 검출되지 않았으나, 다양한 벽혈병 세포주에서는 상대적으로 높은 수준으로 TrkA의 mRNA가 검출됨을 확인하였다.
따라서, 도 1의 A 내지 D의 결과에서 보듯이, TrkA의 발현수준은 백혈병 세포에서 비정상적으로 증가하거나 또는 감소하였으므로, 이로부터 TrkA가 백혈병의 발병에 중요한 역할을 수행할 것으로 분석되었다.
실시예 2: 백혈병 세포의 성장과 TrkA 의 상관관계 분석
실시예 2-1: TrkA 의 shRNA 가 도입된 백혈병 세포에서 TrkA 의 발현수준 억제
상기 실시예 1의 결과로부터 백혈병 세포에서 TrkA의 발현수준이 비정상적으로 증가함을 알 수 있었으므로, TrkA의 발현을 억제할 경우 백혈병 세포에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 하였다.
이를 위하여, 인간 TrkA에 대해 2개의 shRNA를 코딩한 올리고뉴클레오티드를 다음과 같이 각각 설계하였다.
TrkA #1-shRNA(서열번호 3)
5'-CCGGGGTCAAGATTGGTGATTTTCTCGAG AAAATCACCAATCTTGACCTTTTTG-3'
TrkA #2-shRNA(서열번호 4)
5'-CCGGGCTCATGGTCTTCGAGTATCTCGAG ATACTCGAAGACCATGAGCTTTTTG-3'
이어, 상기 설계한 각각의 올리고뉴클레오티드를 pLKO 렌티바이러스 벡터에 삽입하여 클로닝하였다. 또한 대조군으로서, 알려진 인간 코딩 cDNA의 어떤 것과도 일치하지 않는 올리고뉴클레오티드를 pLKO 렌티바이러스 벡터에 삽입하여 클로닝하였다.
상기 클로닝된 대조군, TrkA #1-shRNA 및 TrkA #2-shRNA를 백혈병 세포주인 K562 세포주에 도입하고, RT-PCR 방법을 이용하여 각 K562 세포주에서 발현되는 TrkA의 발현수준을 비교하였다(도 2의 A). 이때, RT-PCR 방법은 각 세포주로부터 총 RNA를 수득하고, 이를 대상으로 역전사 PCR을 수행하여 각각의 cDNA를 수득한 다음, 상기 수득한 cDNA와 하기의 프라이머를 사용한 PCR을 진행하는 방식으로 수행하였다. 이때, 내부 대조군으로는 GAPDH의 발현수준을 사용하였고, 이때 사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다.
TrkA F: 5'-GAAAACTGTGCAGGGCCTCTC-3'(서열번호 5)
TrkA R: 5'-GCTTCTGTTCAGGCACTCCG-3'(서열번호 6)
GAPDH F: 5'-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3'(서열번호 7)
GAPDH R: 5'-CTTCTCCATGGTGGTGAAGA-3'(서열번호 8)
도 2의 A는 K562 세포주에 도입된 대조군, TrkA #1-shRNA 및 TrkA #2-shRNA에 의해 변화된 TrkA의 발현수준을 나타내는 전기영동사진이다. 도 2의 A에서 보듯이, 대조군에 비하여 TrkA의 shRNA가 도입된 K562 세포주에서는 TrkA의 발현수준이 급격히 감소함을 확인하였다.
실시예 2-2: TrkA 의 shRNA 가 도입된 백혈병 세포의 증식수준 변화
상기 실시예 2-1에서 사용한 대조군, TrkA #1-shRNA 및 TrkA #2-shRNA가 도입된 K562 세포주의 세포수 변화를 측정하였다(도 2의 B).
도 2의 B는 대조군, TrkA #1-shRNA 및 TrkA #2-shRNA가 도입된 K562 세포주의 세포수 변화를 배양시간의 경과에 따라 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2의 B에서 보듯이, 대조군이 도입된 K562 세포주에 비하여, TrkA의 shRNA가 도입된 K562 세포주에서는 세포의 증식수준이 감소함을 확인하였다.
따라서, 백혈병 세포에서 TrkA의 발현은 백혈병 세포의 증식에 직접적인 영향을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 2-3: 백혈병 세포의 증식수준에 대한 Trk 신호전달 억제제의 효과
상기 실시예 2-2의 결과로부터, TrkA의 발현수준이 감소할 경우, 백혈병 세포주의 증식이 억제됨을 확인하였으므로, 이러한 효과가 TrkA의 발현수준 감소에 의한 것인지, 아니면 TrkA의 신호전달 수준의 감소에 의한 것인지를 확인하기 위하여, Trk 신호전달 억제제를 백혈병 세포주에 처리하고, 상기 백혈병 세포주의 증식 수준의 변화를 분석하였다.
구체적으로, Trk 신호전달 과정에 포함되는 타이로신 키나제의 억제제인 K252a를 K562 세포주에 100nM의 용량으로 처리하고, 5일동안 배양하면서, 그의 증식수준을 K252a가 처리되지 않은 K562 세포주의 것과 비교하였다(도 2의 C). 이때, K252a가 처리되지 않은 K562 세포주에는 K252a 대신에 DMSO를 처리하였다.
도 2의 C는 Trk 신호전달 억제제의 처리에 의한 백혈병 세포주의 증식수준의 변화를 배양시간의 경과에 따라 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2의 C에서 보듯이, Trk 신호전달 억제제인 K252a를 처리할 경우에는 백혈병 세포주의 증식이 현저하게 감소함을 확인하였다.
따라서, 백혈병 세포에서 TrkA의 발현수준이 감소되면, TrkA의 신호전달 수준이 감소되어 백혈병의 증식이 억제됨을 알 수 있었다.
실시예 2-4: TrkA 발현이 PI3K/Akt/mTOR 경로에 영향
TrkA에 의한 백혈병 세포의 성장촉진을 뒷받침하는 작용기작을 이해하기 위하여, TrkA 발현이 PI3K/Akt/mTOR 경로에 영향을 미치는 지의 여부를 확인하였다.
구체적으로, 대조군, TrkA #1-shRNA 및 TrkA #2-shRNA가 도입된 K562 세포주를 대상으로 인산화된 mTOR(P-mTOR), mTOR, 인산화된 Akt(P-Akt) 및 Akt의 단백질 수준을 면역블럿 분석법을 이용하여 측정하였다. 또한, mTOR의 수준감소가 전사수준에서 유발되는 것인지를 확인하기 위하여, 상기 각각의 K562 세포주로부터 총 RNA를 수득하고, 이를 이용한 RT-PCR 분석을 수행하여 mTOR의 mRNA 수준을 비교하였다(도 2의 D). 이때, 면역블럿 분석의 대조군으로는 ß-액틴을 사용하고, mRNA 수준분석의 대조군으로는 GAPDH를 사용하였으며, 사용되는 프라이머는 다음과 같다.
mTOR F: 5'-GCACATTGACTTTGGGGACT-3'(서열번호 9)
mTOR R: 5'-ACTGGCCAGCAGAGTAGGAA-3'(서열번호 10)
도 2의 D는 TrkA의 발현을 억제하는 shRNA로 처리된 백혈병 세포주에서 생산되는 인산화되거나 또는 인산화되지 않은 mTOR 및 Akt의 단백질 수준과, mTOR의 mRNA 수준을 나타내는 사진이다. 도 2의 D에서 보듯이, TrkA의 발현을 억제하는 shRNA로 처리된 백혈병 세포주에서는 인산화된 단백질의 수준이 감소하였고, mTOR의 경우에는 인산화되지 않은 단백질의 수준까지도 감소함을 확인하였다. 또한, TrkA의 발현을 억제하는 shRNA로 처리된 백혈병 세포주에서는 mTOR의 mRNA 수준이 감소하므로, TrkA의 신호전달이 억제되면 mTOR의 발현이 전사수준에서 억제됨을 알 수 있었다.
한편, Trk 신호전달 억제제를 처리한 백혈병 세포주에서도 동일한 효과를 얻을 수 있는지를 확인하고자, K252a로 처리하지 않거나 또는 처리한 K562 세포주를 대상으로 인산화된 mTOR(P-mTOR), mTOR, 인산화된 Akt(P-Akt) 및 Akt의 단백질 수준을 면역블럿 분석법을 이용하여 측정하였다. 또한, mTOR의 수준감소가 전사수준에서 유발되는 것인지를 확인하기 위하여, 상기 각각의 K562 세포주로부터 총 RNA를 수득하고, 이를 이용한 RT-PCR 분석을 수행하여 mTOR의 mRNA 수준을 비교하였다(도 2의 E). 이때, 면역블럿 분석의 대조군으로는 ß-액틴을 사용하고, mRNA 수준분석의 대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
도 2의 E는 Trk 신호전달 억제제로 처리된 백혈병 세포주에서 생산되는 인산화되거나 또는 인산화되지 않은 mTOR 및 Akt의 단백질 수준과, mTOR의 mRNA 수준을 나타내는 사진이다. 도 2의 E에서 보듯이, Trk 신호전달 억제제로 처리된 백혈병 세포주에서는 인산화된 단백질의 수준이 감소하였고, mTOR의 경우에는 인산화되지 않은 단백질의 수준까지도 감소함을 확인하였다. 또한, Trk 신호전달 억제제를 처리한 백혈병 세포주에서는 mTOR의 mRNA 수준이 감소하므로, TrkA의 신호전달이 억제되면 mTOR의 발현이 전사수준에서 억제됨을 다시 한번 알 수 있었다.
실시예 3: PLK -1과 Twist -1의 발현에 대한 TrkA 의 효과
백혈병의 발병초기에 활성화되는 조절인자 중에서, AML에서 과발현되는 PLK-1과 CML에서 과발현되는 Twist-1의 발현수준에 미치는 TrkA의 효과를 분석하고자 하였다.
실시예 3-1: TrkA - shRNA 가 도입된 백혈병 세포주에서 PLK -1의 발현수준 변화
대조군, TrkA #1-shRNA 및 TrkA #2-shRNA가 도입된 K562 세포주를 대상으로 PLK-1의 mRNA 수준을 정량분석하였다(도 3의 A). 이때, PLK-1의 mRNA 수준의 정량분석에 사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다:
PLK-1 F: 5'-GGCAACCTTTTCCTGAATGA-3'(서열번호 11)
PLK-1 R: 5'-TCCCACACAGGGTCCTTCTTC-3'(서열번호 12)
도 3의 A는 TrkA-shRNA가 도입된 K562 세포주에서 PLK-1의 mRNA 수준의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 3의 A에서 보듯이, TrkA-shRNA가 도입된 K562 세포주에서는 PLK-1의 mRNA 수준이 감소함을 확인하였다.
실시예 3-2: TrkA-shRNA가 도입된 백혈병 세포주에서 Twist-1의 발현수준 변화
대조군, TrkA #1-shRNA 및 TrkA #2-shRNA가 도입된 K562 세포주를 대상으로 Twist-1의 mRNA 수준을 정량분석하였다(도 3의 B). 이때, Twist-1의 mRNA 수준의 정량분석에 사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다:
Twist-1 F: 5'-CGACGAGCTGGACTCCAAG-3'(서열번호 13)
Twist-1 R: 5'-CCTCCATCCTCCAGACCGA-3'(서열번호 14)
도 3의 B는 TrkA-shRNA가 도입된 K562 세포주에서 Twist-1의 mRNA 수준의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 3의 B에서 보듯이, TrkA-shRNA가 도입된 K562 세포주에서는 Twist-1의 mRNA 수준이 감소함을 확인하였다.
실시예 3-3: Trk 타이로신 키나제의 억제제가 처리된 백혈병 세포주에서 PLK-1의 발현수준 변화
K562 세포주 및 Trk 타이로신 키나제의 억제제인 K252a로 처리한 K562 세포주를 대상으로 PLK-1의 mRNA 수준을 측정하였다(도 3의 C).
도 3의 C는 Trk 타이로신 키나제의 억제제가 처리된 K562 세포주에서 PLK-1의 mRNA 수준의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 3의 C에서 보듯이, Trk 타이로신 키나제의 억제제가 처리된 K562 세포주에서는 PLK-1의 mRNA 수준이 감소함을 확인하였다.
실시예 3-4: Trk 타이로신 키나제의 억제제가 처리된 백혈병 세포주에서 Twist-1의 발현수준 변화
K562 세포주 및 Trk 타이로신 키나제의 억제제인 K252a로 처리한 K562 세포주를 대상으로 Twist-1의 mRNA 수준을 측정하였다(도 3의 D).
도 3의 D는 Trk 타이로신 키나제의 억제제가 처리된 K562 세포주에서 Twist-1의 mRNA 수준의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 3의 D에서 보듯이, Trk 타이로신 키나제의 억제제가 처리된 K562 세포주에서는 Twist-1의 mRNA 수준이 감소함을 확인하였다.
실시예 4: 백혈병 세포의 세포자멸과 TrkA 의 상관관계 분석
상기 실시예 2-1에서 사용한 대조군, TrkA #1-shRNA 및 TrkA #2-shRNA가 도입된 K562 세포주에서, 캐스파제-3 및 이의 기질로 사용되는 PARP의 수준을 비교하였다(도 4의 A).
도 4의 A는 대조군, TrkA #1-shRNA 및 TrkA #2-shRNA가 도입된 K562 세포주에서, 캐스파제-3 및 PARP의 수준을 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 4의 A에서 보듯이, 대조군이 도입된 K562 세포주에 비하여, TrkA의 shRNA가 도입된 K562 세포주에서는 캐스파제-3가 높은 수준으로 활성화 되어, 이의 기질인 PARP의 수준이 감소함을 확인하였다.
또한, Trk 신호전달 억제제를 처리할 경우에도 동일한 효과를 나타내는지를 확인하기 위하여, Trk 신호전달 과정에 포함되는 타이로신 키나제의 억제제인 K252a를 K562 세포주에 100nM의 용량으로 처리하고, 상기 각 세포주에서 캐스파제-3 및 이의 기질로 사용되는 PARP의 수준을 비교하였으며(도 4의 B), K562 세포주의 생존율을 MTT 분석법으로 측정하고, 이를 K252a가 처리되지 않은 K562 세포주의 것과 비교하였다(도 4의 C). 이때, K252a가 처리되지 않은 K562 세포주에는 K252a 대신에 DMSO를 처리하였다.
도 4의 B는 Trk 신호전달 억제제를 처리한 백혈병 세포주에서 캐스파제-3 및 PARP의 수준을 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 4의 B에서 보듯이, Trk 신호전달 억제제가 처리되지 않은 K562 세포주에 비하여, Trk 신호전달 억제제가 처리된 K562 세포주에서는 캐스파제-3가 높은 수준으로 활성화 되어, 이의 기질인 PARP의 수준이 감소함을 확인하였다.
도 4의 C는 Trk 신호전달 억제제의 처리에 의한 백혈병 세포주의 생존율의 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4의 C에서 보듯이, Trk 신호전달 억제제인 K252a를 처리할 경우에는 백혈병 세포주의 생존율이 현저하게 감소함을 확인하였다.
아울러, TrkA에 의한 백혈병 세포주의 세포자멸 억제와 관련된 특징을 규명하기 위하여, 아넥신 V(annexin V)를 이용한 유세포 분석을 수행하였다.
구체적으로, K562 세포주 및 K252a로 처리한 K562 세포주를 1×106 세포/㎖의 밀도로 60 ㎜ 배양용기에 분주하고, CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양한 다음, 아넥신-V 아폽토시스 탐색 키트(BD Pharmingen™)를 이용하여 사멸된 세포를 표지하였으며, FACS Calibur 시스템(Becton Dickinson, CA, 미국)을 이용하여 유세포 분석 데이터를 수득하였고, 상기 데이터를 컴퓨터 프로그램 Win MDI 2.8에 적용하여 분석하였다(도 4의 D).
도 4의 D는 Trk 신호전달 억제제의 처리에 의한 백혈병 세포주의 세포자멸 수준을 비교한 결과를 나타내는 히스토그램 및 그래프이다. 도 4의 D에서 보듯이, Trk 신호전달 억제제를 처리한 경우에는 백혈병 세포의 세포자멸이 급격히 증가함을 알 수 있었다.
또한, K562 세포주 및 TrkA #1-shRNA와 TrkA #2-shRNA가 도입된 K562 세포주를 사용하여 아넥신 V(annexin V)를 이용한 유세포 분석을 수행하였다(도 4의 E).
도 4의 E는 TrkA의 발현을 억제하는 shRNA의 처리에 의한 백혈병 세포주의 세포자멸 수준을 비교한 결과를 나타내는 히스토그램 및 그래프이다. 도 4의 E에서 보듯이, TrkA의 발현을 억제하는 shRNA를 처리한 경우에는 백혈병 세포의 세포자멸이 급격히 증가함을 알 수 있었다.
따라서, 상기 결과를 종합하면, 백혈병 세포에서 TrkA는 세포자멸을 억제하는 역할을 수행하고, 이는 TrkA의 신호전달에 의해 나타내는 효과임을 알 수 있었다.
<110> Gachon University of Industry-Academic cooperation Foundation <120> Composition for diagnosis of leukemia using TrkA <130> PA130694/KR <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 accgcagcta ggaataatgg a 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcctcagttc cgaaaacca 19 <210> 3 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TrkA #1-shRNA <400> 3 ccggggtcaa gattggtgat tttctcgaga aaatcaccaa tcttgacctt tttg 54 <210> 4 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TrkA #2-shRNA <400> 4 ccgggctcat ggtcttcgag tatctcgaga tactcgaaga ccatgagctt tttg 54 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gaaaactgtg cagggcctct c 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcttctgttc aggcactccg 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gaccccttca ttgacctcaa c 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cttctccatg gtggtgaaga 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gcacattgac tttggggact 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 actggccagc agagtaggaa 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ggcaaccttt tcctgaatga 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tcccacacag ggtccttctt c 21 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cgacgagctg gactccaag 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cctccatcct ccagaccga 19

Claims (24)

  1. TrkA를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL) 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인, 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL) 진단용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 프라이머는 서열번호 5 및 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 쌍인 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL) 진단용 조성물.
  5. 삭제
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL) 진단용 키트.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것인 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL) 진단용 키트.
  8. (a) 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)의 발병이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 TrkA를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 정상 대조군의 시료로부터 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL) 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  9. 삭제
  10. 제8항에 있어서,
    상기 유전자의 mRNA 수준은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 분석법(DNA chip technology assay)에 의하여 측정되는 것인 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 단백질의 수준은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 측정되는 것인 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. (a) 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이 발병된 실험동물의 시료로부터 TrkA를 코딩하는 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계;
    (b) 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 상기 실험동물에 투여하는 단계;
    (c) 상기 (b)단계에서 후보물질이 투여된 실험동물의 시료로부터 TrkA를 코딩하는 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및,
    (d) 상기 (a) 단계에서 측정된 TrkA 유전자의 발현수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준과 상기 (c)단계에서 측정된 수준을 비교하여, 상기 (a)단계에서 측정된 수준에 비하여 상기 (c)단계에서 측정된 수준이 유의한 차이를 나타내는 경우, 상기 후보물질을 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)의 발병을 방지하는 예방용 제제 또는 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 치료하는 치료용 제제로서 사용할 수 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)의 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 백혈병이 급성 림프구성 백혈병(ALL)인 경우에는, 상기 (a)단계에서 측정된 수준에 비하여 상기 (c)단계에서 측정된 수준이 유의하게 낮은 수준을 나타낼 때, 상기 후보물질을 치료용 제제로서 사용할 수 있는 것으로 판정하는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 백혈병이 만성 림프구성 백혈병(CLL)인 경우에는,상기 (a)단계에서 측정된 수준에 비하여 상기 (c)단계에서 측정된 수준이 유의하게 높은 수준을 나타낼 때, 상기 후보물질을 치료용 제제로서 사용할 수 있는 것으로 판정하는 것인 방법.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. TrkA 유전자의 발현을 억제하는 서열번호 3 또는 4의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 shRNA 발현 벡터 또는 이로부터 발현된 shRNA를 포함하는 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  21. 삭제
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  23. 삭제
  24. 삭제
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