JP5466822B2 - 炎症過程を決定するための方法およびこの治療のための医薬組成物 - Google Patents
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Description
炎症は、哺乳動物の結合組織および血管によって生じる外部または内因性の炎症刺激に対する生物の反応であり、この目的は、このような刺激を取り除きまたは不活性化すること、および一般的には創傷治癒とも呼ばれる刺激に起因する組織への損傷を修復することである。このような炎症のトリガーは、機械的刺激、例えば、圧力、または異物、他の物理的要因、例えば、電離放射線、UV光、温度の影響であるが、化学物質、例えば、酸、苛性アルカリ溶液、細菌毒素、アレルゲン、ならびに病原体、例えば、微生物、虫(worm)、および昆虫もまたトリガーである。それは、炎症過程および関連する疾患を制御するための適切な治療を可能にするための、このような炎症過程およびこれらの原因の正確の診断を必要とする生物における、このような炎症刺激の変動性のみならず、関連する炎症過程の変動性でもある。
本発明は、炎症過程および悪性疾患の細胞において、今日まで細胞内因子としてのみ知られていたタンパク質YB−1が発現されるのみならず、細胞によって分泌される、すなわち、細胞によって生物の細胞外液に分泌されるという本発明者らの驚くべき結果に基づく。このことは、炎症過程および悪性疾患の診断のためのマーカーとしてこのタンパク質を使用することの可能性を提供する。
下記において、実施例で使用される抗体を表に要約する。特に、抗体が、全長YB−1タンパク質のどの部分に対して作用するか、またはYB−1タンパク質のどのフラグメントに対して作用するかが示される。
MM−6単球細胞からの微小胞の回収およびYB−1の検出
MM−6単球細胞を、10%(v/v)FCS(ウシ胎仔血清)、2mM L−グルタミン、100μg/ml ストレプトマイシンおよび100U/ml ペニシリン−Gを含有するRPMI 1640培地中の懸濁培養として増殖させる。リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中での洗浄操作後、細胞を、リプミン(Lipumine)(商標)(PAA Laboratories GmbH,Pasching,Austria)を含有し、FCS添加なしのRPMI培地中に取り、および計数する。エッペンドルフ(Eppendorf)容器中で、2×106 MM−6細胞を、LPSおよびアデノシン三リン酸(1mM)(両方ともSigma Aldrich,St.Louis,USAより)とともに、図1および2に述べた濃度にて、37℃で4時間インキュベートする。続いて、細胞を含む培地を、細胞を沈殿させるために330×gで10分間遠心分離し、次いで、上清を2200×gで15分間再度遠心分離する。2回目の遠心分離後の上清を、タンパク質(微小胞を含む)の沈殿のために氷冷トリクロロ酢酸と混合し、−20℃で一晩保存し、続いて33,000×gで30分間の遠心分離および上清の廃棄を行う。ペレットを氷冷非変性エタノール(70%)で1回洗浄し、真空遠心分離で乾燥させる。
利用した溶液:
下部(分離)ゲル緩衝液(4×):1.5M Tris−HCl、pH 8.8
アクリル/ビスアクリル(30%):29.2g アクリルアミド、0.8g ビスアクリルアミド、70ml H2O
上部(濃縮)ゲル緩衝液(4×):0.5M Tris−HCl、pH 6.8
SPS(10%):90mlのH2O中10gのSDS
APS(10%):9mlのH2O中1gのペルオキソ二硫酸アンモニウム
電気泳動緩衝液(10×):30gのTris−HCl、144gのグリシン、10gのSDSを、H2Oで1000mlにし、全体をpH 8.3に調整
サンプル緩衝液(4×):2.4mlのH2O、2.4mlの下部ゲル緩衝液、2.0mlのグリセロール、2.0mlのSDS(10%)、200μlのブロモフェノールブルー溶液(1%)、40μlのEDTA溶液(0.5M)、1mlのβ−メルカプトエタノール
転写緩衝液:3.03gのトリズマベース、14.4gのグリシン、200mlのメタノールを、H2Oで2000mlにする
TTBS溶液:1916mlのH2O、60mlのNaCl溶液(5M)、20mlのTris溶液(1M、pH 8)、4mlのTween−20溶液(25%)。
抗体検出
転写後、膜をTTBS溶液で3×10分間洗浄し、2% BSA溶液(TTBSAに溶解)で室温で2時間ブロックし、および再度TTBS中で3×10分間洗浄する。続いて、膜を1:2000の希釈にて4℃で一晩、一次抗体とともにインキュベートする。異なる抗YB−1抗体を利用する(以下のリストを参照のこと)。さらなる洗浄操作後、膜を二次抗体とともにインキュベートする(以下のリストを参照のこと)。
免疫:8週齢のBALB/cマウスを、精製した抗原(rYB−1タンパク質、Mertens et al.,The Journal of Biological Chemistry,1997,Vol.272,No.36,p.22905−22912を参照のこと)で免疫した。投薬量は150μg/マウスである。初回免疫のために、抗原を完全フロイントアジュバント(CFA;Sigma)(油中水エマルジョン、Hurn and Chantler,1980)中で乳化し、300μlの量でマウスに皮下注射する。免疫前に、血液をマウスの尾静脈から取り出す(免疫前血清)。初回免疫の4週間後、血液をマウスから取り出す(免疫血清)。これらの血清中の抗体力価を、半定量的エンザイムイムノアッセイ(スロットブロット)で決定する。高い抗体力価を有するマウスを、初回免疫の6から8週間後免疫し、および2週間後に再度免疫する(ブースター免疫)。このようにして、PBS中の100μgのrYB−1を、動物に静脈内注射する。最終免疫の3から5日後に、融合がもたらされる。
図1Aにおいて、全長YB−1(52kDa)の分泌の誘導は、1ng/ml LPSを加えたときに明確になる(レーン4)。より低い濃度(10−2から10−1ng/ml)およびより高い濃度(10から104ng/ml)は、例えば、104ng/mlのLPS濃度において見ることができるように(レーン8)、分泌なしまたは低い分泌のみをもたらす。
本実験において、E.coli中で組換え的に調製したYB−1(rYB−1)、核YB−1(NE)、およびMM−6細胞のLPS刺激に際して分泌されたYB−1(LPS/上清)の間の分子量の違いを調べる。
N末端(抗N(AB7)、1:2000の希釈で利用されるSanta Cruzからの抗YB−1抗体);および
全長YB−1タンパク質(抗w(AB3;上記を参照のこと、Mertens P.R.et al.,The Journal of Biological Chemistry,1997,Vol.272,Nr.36,p.22905−22912)(さらなる詳細については、実施例1を参照のこと)。核細胞抽出物の回収は、以下においてより詳細に記載される。
利用される溶液:
低張性緩衝液:10mM HEPES pH 7.9、1.5mM MgCl2、10mM KCl、0.2mM PMSF、0.5mM DTT、1mM オルトバナジン酸ナトリウム。
図3において示されるウェスタンブロットのゲル中の最初の列は陰性対照として働く(すなわち、一次抗体を使用しなかった)。分泌型YB−1のより低い移動度(レーン1、5、および8)が、核起源のYB−1(レーン3、6、および9)と比較して見い出される。原核細胞によって調製されたYB−1(rYB−1)は、この46kDaの分子量によってのみならず、これがより高分子量のバンド(88kDa)として検出することができるという事実によってもまた、真核生物によって調製されたYB−1(LPS/上清;52kDa)から区別され(レーン4、7、および10)、これは、最も可能性が高いこととしては、ホモマルチマー化によってである。加えて、38kDa、36kDa、35kDa、33kDa、および22kDaのサイズを有するフラグメントを検出することができる。加えて、全長YB−1タンパク質に対して調製した抗体を用いて、25kDaフラグメントが組換えYB−1を用いて検出することができる(レーン7)。
以下の実施例は、条件的にHA−YB−1を発現するメサンギウム細胞株の細胞が、PDGF−Bを用いる刺激に際して、YB−1およびYB−1のフラグメントを分泌することを示す。この実験は、分泌型のYB−1タンパク質が、YB−1が属する低温ショックタンパク質のファミリーの異なるメンバーではないことをさらに実証する。
実施例4から5および7から8は、試験した患者の臨床的画像を用いて細胞によるYB−1タンパク質およびYB−1タンパク質のフラグメントの分泌の補正を例証する。これらの実施例は、患者における炎症過程に対する明瞭な指摘について、細胞によるYB−1およびこのフラグメントの分泌のパターンを利用することの可能性を示す。従って、患者における炎症性疾患の起源および経過を、より良好に決定することができる。
モノクローナル抗体「Deutschland」(AB4)を、ウェスタンブロッティングにおいてYB−1を検出するために使用した。このモノクローナル抗体は、8kDa、16kDa、および23kDaのより小さなフラグメントは認識しない。腎臓移植が行われた後で、尿サンプルを、検査した6例の患者(A−F)において連続的に収集する。患者AおよびBにおいては、図9のARとして示されるように、生検によって確認された移植拒絶(AR)が存在する。患者CおよびDにおいては、拒絶反応も、いかなる他の合併症も存在しない(ARなし)。患者EおよびFにおいては、拒絶反応は存在しなかったが、他の合併症(合併症、φAR)、例えば、腹膜炎およびカテーテル関連敗血症が存在した。YB−1およびこのフラグメントの存在の決定と並行して、サイトカインおよび拒絶反応についての他のマーカータンパク質もまた決定した。
図10Aから見ることができるように、標準的なプロトコールに従ってバフィーコートを用いて健常なドナーの血液から得られた原発性ヒト単球およびマクロファージもまた、LPSとのインキュベーションに際してYB−1を分泌し始める。このブロットにおいて、完全なYB−1タンパク質に対して調製されたポリクローナル抗体(AB3)を検出のために利用した。
図11は、健常被験体(レーン1から3)、劇症性敗血症を有する2例の患者について(レーン4および5)、ならびに異なる組織系および組織学の転移している腫瘍疾患を有する8例の患者について(レーン6から13)の血清中でのYB−1の免疫学的検出を示す。診断には、膵臓癌(Pa.−CA)、非小細胞気管支癌(NSC−BC)、直腸癌(Re.−CA)、乳癌(Ma.−CA)、喉頭癌(La.−CA)、および原発性腫瘍の検出を伴わない腺癌(Ad.−CA)が含まれる。レーン14および15において、膵臓癌を有する腫瘍患者からのサンプルを再度適用する。レーン14において、インキュベーションはYB−1に対する一次抗体を用いて行い、レーン15において、インキュベーションは、二次抗体に起因する非特異的バンドを検出するために二次抗体を用いて独占的に行った。50kDaおよび26kDaにおける2つの弱い非特異的バンドが見い出される。全長YB−1タンパク質に対して指向されるポリクローナル抗体(AB3)を使用することによって、全長YB−1(52kDa)および28kDaにおけるYB−1フラグメントの第2の主要なバンドを検出できる。すべてのサンプル中で見られるこれらのYB−1フラグメントに加えて、約14kDaのサイズを有する小さなYB−1フラグメントがすべての腫瘍患者において検出できるが、劇症性敗血症を有する患者においてはそれほど明確には検出されない(レーン4)。従って、より高い濃度でのこのフラグメントの検出は、腫瘍疾患の存在を結論付けることを可能にする。
ヒトケラチノサイトは、ペニシリンおよびアムホテリシンBが加えられたPBS溶液で皮膚サンプルを3回洗浄することによって成体ドナーの皮膚生検から得られる。サンプルを70%エタノールで洗浄し、1cm2の小片に切断する。表皮をカゼイン分解性ディスパーゼ(dispase)(50U/ml、Collaborative、Bedford,MA,USA)との37℃で2時間のインキュベーションによって分離する。0.25mg/mlトリプシン/EDTA (Cambrex,Walkersville,MD,USA)中での37℃、30分間のインキュベーション後、ケラチノサイトは、注意深いピペッティングによって、単細胞懸濁物として遊離する。トリプシン中和溶液(TNS,Cambrex,Walkersville,MD,USA)でトリプシンを中和した後、細胞をKGM培地(Cambrex,Walkersville,MD,USA)に取り、細胞培養フラスコに播種し、およびこの中で培養する。
実験の結果を図13に示す。通常の血清を含まない培地を加えるときには、ケラチノサイトは作製された創傷に移動するのに対して(行:培地)、組換えYB−1で処理した細胞においては細胞の有意な移動は存在しない(行:rYB−1(50ng))。細菌中で発現されたYB−1サンプルが10分間にわたり95℃に加熱され、続いてケラチノサイト培養に加えられる場合、細胞の移動は観察することができ、このことは、阻害効果がリポポリサッカリドによって引き起こされることを意味しない(行:不活性化RYB−1(100ng))。
本実験において、「特異的」YB−1フラグメントは、モノクローナル抗体を用いて、腫瘍患者の血清およびIgA腎炎を有する患者の尿において検出した(図10B)。生成したモノクローナル抗体「Italien」(AB8、表1を参照のこと)を用いて、転移している腎臓癌を有する腫瘍患者の血清(TM20)および進行性IgA腎炎を有する患者からの尿(K)を検査した。200kDa周辺の高分子量バンドに加えて、52kDaおよび28kDaの相対分子量を有するバンドもまた、非変性サンプル緩衝液(メルカプトエタノールおよびEDTAを含まない)中で観察される。変性条件下では(メルカプトエタノールおよびEDTAを含む)、異なるポリクローナル抗YB−1抗体を用いて以前に観察され、16kDaの相対サイズを有するバンドが腫瘍疾患についての血清中で、または23kDaの相対サイズを有するバンドが進行性のIgA腎炎についての尿中で検出できる。特異的YB−1結合を有さない対照抗体を用いると(「Grossbritannien」、AB9、上記の表を参照のこと)、および抗マウス二次抗体(AB5)単独を用いると、16kDaおよび23kDaのバンドは検出不可能である。
ヘマグルチニン(HA)で標識したNOTCH3(EGF)(すなわち、NOTCH−3受容体の細胞外EGF−含有ドメイン)およびGFPまたはYB−1−GFPを、HEK293T細胞で同時発現させる。細胞溶解物を、抗HA−抗体を用いる免疫沈殿に供し、SDS−PAGEによって分離し、および抗HA抗体を用いて検出する(レーン1から3)。発現したタンパク質N3(EGF)は、このようにして検出することができる(レーン2および3)。さらに、細胞溶解物は、抗GFPまたは抗HA抗体を用いる免疫沈殿にそれぞれ供し、続いて、抗GFP抗体を用いて検出する。レーン9において、同時免疫沈殿したYB−1−GFPを見ることができる。2つのタンパク質の内の1つのみがそれぞれ発現された、対応する対照実験は陰性である(レーン5および7)。「I.P.」は、免疫沈殿を表し、「ブロット」はタンパク質の分離後のウェスタンブロッティングによる検出を意味する。
Claims (10)
- 哺乳動物におけるIgA腎症のインビトロ検出方法であって、前記IgA腎症の検出が、
前記哺乳動物からの細胞外液の試料中におけるYB−1タンパク質および/またはこのフラグメントの少なくとも1つの存在について調べる前記試料の検査;および
YB−1タンパク質および/またはこのフラグメントの少なくとも1つが前記試料中に存在する場合、前記試料中における前記YB−1タンパク質およびこのフラグメントの分泌パターンの決定
を含み、
前記フラグメントは、8kDa、16kDa、23kDa、28kDa、30kDa、32kDa、35kDa、および前記サイズのいずれかの±5kDaの群から選択されるサイズを有する少なくとも1つのフラグメントであり、
YB−1およびこのフラグメントの少なくとも1つの存在は、前記哺乳動物がIgA腎症を有することを示す、
前記検出方法。 - 分泌パターンの決定が、HPLCを用いたフラグメント定量により、またはウェスタンブロッティングを用いたバンド分析により行われる、請求項1に記載の検出方法。
- IgA腎症についての一連の検定から確立された分泌パターンと決定された分泌パターンとを相関させることをさらに含む、請求項1に記載の検出方法。
- 前記試料が、抗体を用いてYB−1タンパク質および/またはこのフラグメントの少なくとも1つの存在を調べるために検査される、請求項1に記載の検出方法。
- ポリクローナル抗体が前記抗体として使用される、請求項4に記載の検出方法。
- モノクローナル抗体が前記抗体として使用される、請求項4に記載の検出方法。
- ヒトが前記哺乳動物として選択される、請求項1に記載の検出方法。
- 前記細胞外液が、血液、尿、血漿、および血清からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項1に記載の検出方法。
- 前記細胞外液が尿である、請求項8に記載の検出方法。
- 哺乳動物における悪性腫瘍のインビトロ検出方法であって、前記悪性腫瘍の検出が、
前記哺乳動物からの細胞外液の試料中におけるYB−1タンパク質および/またはこのフラグメントの少なくとも1つの存在について調べる前記試料の検査;および
YB−1タンパク質および/またはこのフラグメントの少なくとも1つが前記試料中に存在する場合、前記試料中における前記YB−1タンパク質およびこのフラグメントの分泌パターンの決定
を含み、
前記フラグメントは、8kDa、16kDa、23kDa、28kDa、30kDa、32kDa、35kDa、および前記サイズのいずれかの±5kDaの群から選択されるサイズを有する少なくとも1つのフラグメントであり、
前記悪性腫瘍は、膵癌、直腸癌、胃癌、結腸癌、乳癌、悪性黒色腫、腎細胞癌、喉頭癌、卵巣癌、前立腺癌、気管支癌などの固形腫瘍からなる群より選択され、
YB−1およびこのフラグメントの少なくとも1つの存在は、前記哺乳動物が前記悪性腫瘍を有することを示す、
前記検出方法。
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