KR20110022622A - ＩｇＡ 신증의 검사 방법 및 검사 키트 - Google Patents

Abstract

피험자의 소변에서 유래하는 시료로부터 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원과 인간 IgA와의 복합체를 검출하는 복합체 검출 공정을 포함한 신질환 검사 방법이다. 본 발명의 신질환 검사 방법은, 상기 시료 중의 요단백질량에 대한 상기 복합체 검출 공정에서 검출된 상기 복합체 검출량의 비율에 기초하여 상기 신질환을 IgA 신증으로 판정하는 판정 공정을 더 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 신질환 검사 방법은 검출 감도 및 특이성이 양호하여 간편하고도 안전하게 신질환 (바람직하게는, IgA 신증)으로 판정할 수 있다.

Description

ＩｇＡ 신증의 검사 방법 및 검사 키트{IgA nephropathy detection method and detection kit}

본 발명은 IgA 신증의 검사 방법 및 검사 키트에 관한 것이다.

IgA 신증은 1968년 베르거 (Berger) 등에 의해 기재된 질환으로서, 당뇨병성 신증을 제외한 만성 사구체신염 중 가장 빈도가 높은 신질환이다 (예를 들면, 비특허문헌 1 참조). IgA 신증은 장기 예후 불량의 질환으로서, 투석 치료를 필요로 하는 말기 신부전 환자의 약 25%가 IgA 신증을 기인 질환으로 하는 것으로 추정된다. 종래 IgA 신증의 진행을 지연시키는 치료법은 있어도 치유시키는 치료법은 없었다. 그러나 최근 홋타 (堀田)들에 의해 조기에 치료를 개시하면 완전치유될 수 있는 치료법이 확립되었다.

한편 IgA 신증의 진단 방법은 「후생성 특정 질환 진행성 신장해 조사 연구반과 일본 신장학회의 공동위원회」에 의하면, 소변 검사 (지속적 현미경적 혈뇨, 지속적 또는 간헐적 단백뇨, 육안적 혈뇨), 혈액 검사 (혈청 IgA 값이 350mg/dl 이상)를 보조적 진단 기준으로 하고 확정 진단은 신생검에 의해 신사구체 메산지움 영역으로의 IgA의 침착을 증명하는 것을 유일한 방법으로 한다. 그러나 신생검은 1주일 정도의 입원을 필요로 하며 출혈이 많은 위험한 검사 방법이므로 수진율 (受診率)은 반드시 높다고는 볼 수 없다. 조기의 IgA 신증을 간편하고 안전한 방법으로 진단할 수 있는 검사 방법이 요구되고 있는 것이 현실이다.

또 IgA 신증의 진단 방법으로서 IgA-피브로넥틴 복합체를 사용하는 방법 등이 알려져 있는데 (예를 들면, 일본특개 제2000-241431호 공보, 일본특허 제2592121호 공보, Cederholm et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 85:4865-8, 1988 참조), 지금까지 실용화된 방법은 없었다.

본 발명의 과제는 검출 감도와 특이성이 양호하여 간편하고 안전하게 IgA 신증으로 판정할 수 있는 IgA 신증의 검사 방법 및 검사 키트를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 인간 신 (腎) 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 특이적인 항체를 제작하고, 그 항체를 사용하여 인간뇨 중의 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원과 IgA와의 복합체 검출량을 측정했을 때 건강인이나 IgA 신증 이외의 신질환 환자에 비해 IgA 신증 환자에게 상기 복합체가 더욱 높은 농도로 존재한다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 상기 과제를 해결하기 위한 구체적 수단은 이하와 같다.

본 발명의 제1 태양은, 피험자의 소변에서 유래하는 시료로부터 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원과 인간 IgA와의 복합체를 검출하는 복합체 검출 공정을 포함한 IgA 신증의 검사 방법이다. 상기 복합체 검출 공정은, 상기 시료와 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체 및 인간 IgA에 대한 항체를 접촉시키는 것을 포함하는 것이 바람직하다. 또 상기 복합체 검출 공정에서 검출된 복합체 검출량의, 피험자의 소변에서 유래하는 시료 중의 요단백질량에 대한 비율을 얻는 공정을 더 포함하는 것이 바람직하고, 상기 비율에 기초하여 IgA 신증으로 판정하는 판정 공정을 더 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 제2 태양은, 피험자의 소변에서 유래하는 시료로부터 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원과 인간 IgA와의 복합체를 검출하는 복합체 검출 공정을 포함한 신질환 검사 방법이다. 상기 복합체 검출 공정은, 상기 시료와 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체 및 인간 IgA에 대한 항체를 접촉시키는 것을 포함하는 것이 바람직하고, 상기 복합체 검출량에 기초하여 신질환으로 판정하는 공정을 더 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 제3 태양은, 피험자의 소변에서 유래하는 시료로부터 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원과 인간 IgA와의 복합체를 검출하는 복합체 검출 공정과, 상기 복합체 검출 공정에서 검출된 상기 복합체 검출량, 혹은 상기 시료 중의 요단백질량에 기초하여 신질환으로 판정하는 제1 판정 공정과, 상기 시료 중의 요단백질량에 대한 상기 복합체 검출 공정에서 검출된 상기 복합체 검출량의 비율에 기초하여 상기 신질환을 IgA 신증으로 판정하는 제2 판정 공정을 포함하는 IgA 신증의 검사 방법이다.

본 발명의 검사 방법에서의 상기 복합체 검출 공정은 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체와 인간 IgA에 대한 항체를 사용하는 면역 화학적 방법이 바람직하고 샌드위치법이 더욱 바람직하다.

본 발명의 제4 태양은, 피험자의 소변에서 유래하는 시료와, 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체 및 인간 IgA에 대한 항체를 접촉시키는 공정을 포함하는, 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원과 인간 IgA와의 복합체 검출 방법이다. 상기 복합체는, 상기 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체와 인간 IgA에 대한 항체를 사용하여 면역 화학적 방법으로 검출되는 것이 바람직하고 샌드위치법으로 검출되는 것이 더욱 바람직하다.

또 상기 피험자는 신질환을 발증하는 인간, 신질환을 발증한다고 의심받는 인간, 또는 신질환을 발증할 가능성이 있는 인간이 바람직하고, 상기 신질환은 IgA 신증이 더욱 바람직하다.

본 발명의 제5 태양은, 적어도 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체와 인간 IgA에 대한 항체를 포함한 신질환의 검사 키트이다. 상기 신질환은 IgA 신증인 것이 바람직하다.

본 발명에 의하면, 검출 감도와 특이성이 양호하여 간편하고 안전하게 IgA 신증으로 판정할 수 있는 IgA 신증의 검사 방법 및 검사 키트를 제공할 수 있다.

도 1은, 소변 중의 IgA-6C4 인식 항원 복합체를 ELISA법으로 검출한 측정값의 분포도이다.
도 2는, 소변 중의 IgA-6C4 인식 항원 복합체를 ELISA법으로 검출한 측정값에 대한 ROC 해석 결과를 도시한 도면이다.
도 3은, 소변 중의 IgA-6C4 인식 항원 복합체를 ELISA법으로 검출한 측정값을 요단백 농도당으로 보정한 값의 분포도이다.
도 4는, 소변 중의 IgA-6C4 인식 항원 복합체를 ELISA법으로 검출한 측정값을 요단백 농도당으로 보정한 값에 대한 ROC 해석을 한 결과를 도시한 도면이다.
도 5는, 소변 중의 IgA-4H3 인식 항원 복합체를 ELISA법으로 검출한 측정값의 분포도이다.
도 6은, 소변 중의 IgA-4H3 인식 항원 복합체를 ELISA법으로 검출한 측정값에 대한 ROC 해석 결과를 도시한 도면이다.
도 7은, 소변 중의 IgA-4H3 인식 항원 복합체를 ELISA법으로 검출한 측정값을 요단백 농도당으로 보정한 값의 분포도이다.
도 8은, 소변 중의 IgA-4H3 인식 항원 복합체를 ELISA법으로 검출한 측정값을 요단백 농도당으로 보정한 값에 대한 ROC 해석 결과를 도시한 도면이다.

이하, 본 발명의 실시형태를 구체적으로 설명하는데 이들은 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.

본 발명의 신질환 검사 방법은, 피험자의 소변에서 유래하는 시료로부터 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원과 인간 IgA와의 복합체를 검출하는 복합체 검출 공정을 포함한 것이다. 상기 복합체를 소변에서 유래하는 시료로부터 검출함으로써 피험자의 신질환을 양호한 검출 감도와 양호한 특이성으로 검출할 수 있다. 아울러 상기 신질환은 IgA 신증과 IgA 신증 이외의 신질환을 포함한 것이다.

본 발명에서 상기 시료란, 피험자로부터 채취한 소변 자체여도 좋고, 채취한 소변에 통상 수행되는 희석, 농축 등의 처리를 한 것이어도 좋다. 본 발명에서는 인간으로부터 채취한 소변을 상법에 의해 희석한 소변 시료가 바람직하다.

또한 상기 피험자의 소변에서 유래하는 시료는, 상기 소변 시료를 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체 또는 인간 IgA에 대한 항체와 접촉시켜 얻어지는 것이어도 좋다.

또 본 발명에서의 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원이란, 인간 신 메산지움 배양 세포, 인간 신에서 분리한 메산지움 세포 및 이들로부터 추출된 세포 추출물에 존재하는 항원으로서, IgA와 복합체를 형성할 수 있고 신질환을 가진 피험자의 소변 중에 존재하는 항원이라면 특별히 제한은 없다. 그 중에서도 신질환 및 IgA 신증의 검출 특이성 관점에서 인간 신 메산지움 세포 이외의 사구체를 구성하는 세포에 유래하는 항원과 식별 가능한 항원이 바람직하고, 인간 근위세뇨관 상피세포에 유래하는 항원과 식별 가능한 항원이 더욱 바람직하다.

또 상기 세포 추출물은 인간 신 메산지움 배양 세포, 또는 인간 신에서 분리한 메산지움 세포에서 추출된 것이라면 특별히 제한은 없지만, 신질환 및 IgA 신증의 검출 특이성 관점에서 세포의 골격 성분 추출물인 것이 바람직하다.

상기 세포 추출물은 통상의 방법으로 조제할 수 있다. 예를 들면 ProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kit (Calbiochem 사제)를 사용하는 방법 등을 들 수 있다.

상기 복합체 검출 방법에 대해서는 특별히 제한은 없으며 통상 사용되는 단백질의 검출 방법을 적용할 수 있지만 검출되는 복합체를 정량 또는 반정량 가능한 방법인 것이 바람직하다.

본 발명에서 복합체 검출에 사용하는 장치에는 특별히 제한은 없고 복합체 검출 방법에 따라 적절히 선택할 수 있다. 구체적으로는 예를 들면 HPLC 기기, 질량 분석 기기 (질량분석법), 전기 영동 기기 (모세관 전기 영동 장치 등), 전자동 혹은 반자동 효소 면역 측정 기기, 셀 워셔, 전자동 혹은 반자동 화학 발광 면역 측정 기기, 발광 측정 장치, 전자동 혹은 반자동 전기 화학 발광 면역 측정 기기, 광학 측정 장치, 플레이트 리더, CCD 카메라, 전자동 혹은 반자동 형광 면역 측정 기기, 형광 측정 장치, 전자동 혹은 반자동 방사 면역 측정 기기, 액체 신틸레이션 카운터, 쿨터 카운터, 표면 플라즈몬 측정 장치, 블로팅 장치, 반사농도계 등을 들 수 있다.

본 발명에서는 검출 감도, 특이성 및 간편성 관점에서 상기 복합체에 대해 결합되는 항체를 사용하는 면역 화학적 방법인 것이 바람직하다. 본 명세서에서 「복합체에 대한 항체」란, 「복합체를 인식하는 항체」, 「복합체에 결합되는 항체」 등의 항체에서 통상 사용되는 의미로 사용되는 것이다. 즉, 상기 「복합체에 대한 항체」는 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원 및 인간 IgA로 이루어진 복합체 중 적어도 일부와 결합되어 새로운 복합체를 형성한다. 이하 「인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체」, 「인간 IgA에 대한 항체」등에 대해서도 동일하다.

본 발명에서의 면역 화학적 방법으로서는 통상 수행되는 방법을 특별한 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적으로는 예를 들면 효소 면역 측정법 (ELISA), 화학 발광 면역 측정법, 전기 화학 발광 면역 측정법, 흡광도 측정, 형광 항체법, 방사 면역 측정법 (RIA), 표면 플라즈몬 공명, 웨스턴블로팅법, 도트블롯팅법 등을 들 수 있다. 본 발명에서는 검출 감도, 특이성 및 간편성 관점에서 효소 면역 측정법 (ELISA)을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 면역 화학적 방법으로서는, 특이성과 간편성의 관점에서 상기 복합체 중의 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원을 인식하여 결합하는 항체와 상기 복합체 중의 IgA를 인식하여 결합하는 항체를 사용하는 샌드위치법이 바람직하다.

상기 샌드위치법은, 예를 들면 이하와 같이 수행할 수 있다. 상기 복합체와 결합되는 항체 (1차 항체)를 플레이트 등의 담체에 고상화한다. 통상 플레이트 등의 비특이적인 결합 부위를 막기 위해 카제인 등 단백질 혹은 계면활성제로 블로킹 조작을 한다. 이어서 소변에서 유래하는 시료 또는 피검 시료를 첨가하여 인큐베이션한다. 플레이트 등을 세정한 후 상기 복합체와 결합되는 항체로서 표지된 2차 항체를 첨가하여 인큐베이션 후 플레이트 등을 세정하여 표지를 검출하는 방법으로 수행할 수 있다.

본 발명에서는 검출 감도와 특이성 관점에서 상기 1차 항체 및 상기 2차 항체로서 상기 복합체에 결합되는 항체에서 선택되는 2종류의 항체를 사용하는 것이 바람직하고, 상기 1차 항체 및 상기 2차 항체 중 한쪽 항체로서 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체를 사용하고, 다른 쪽의 항체로서 인간 IgA에 대한 항체를 사용하는 것이 더욱 바람직하고, 상기 1차 항체로서 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체를 사용하고, 상기 2차 항체로서 인간 IgA에 대한 항체를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에서 상기 복합체에 결합되는 항체는 다클론 항체여도 좋고 단일클론 항체여도 좋지만 신질환의 검출 특이성 관점에서 단일클론 항체인 것이 바람직하다.

상기 복합체에 결합되는 항체는 통상 수행되는 방법에 의해 조제할 수 있다.

인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 다클론 항체는 통상의 제작 방법으로 얻을 수 있으며, 예를 들면 다음과 같이 하여 얻을 수 있다. 인간 신 메산지움 배양 세포, 인간 신에서 분리한 메산지움 세포, 또는 그 추출물을 토끼, 염소 등의 동물에 면역하여 혈청을 얻는다. 이것을 예를 들면, 황산암모늄 침전, 프로틴A, 프로틴G 칼럼, DEAE 이온교환 크로마토그래피, 인간 신 메산지움 세포의 추출물을 커플링한 친화성 칼럼 등에 의해 정제함으로써 조제할 수 있다.

본 발명에서는 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원 이외의 항원에 결합되는 항체를 통상 수행되는 방법, 예를 들면 흡수 조작 등에 의해 제거한 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 특이성이 더욱 높은 항체가 바람직하다.

또 예를 들면, 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 단일클론 항체라면 인간 신 메산지움 배양 세포, 인간 신에서 분리한 메산지움 세포 또는 그 추출물을 마우스 등의 작은 동물로 면역을 하여 동마우스에서 비장을 적출하고 이것을 으깨어 세포를 분리하고 마우스 골수종 (myeloma) 세포와 폴리에틸렌글리콜 등의 시약에 의해 융합시킴으로써 형성된 융합 세포 (하이브리도마) 중에서 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원과 결합되는 항체를 생산하는 클론을 선택한다. 이어서 선택한 하이브리도마를 마우스 복강 내에 이식하고 동마우스에서 복수를 회수하여 얻어진 단일클론 항체를, 예를 들면 황산암모늄 침전, 프로틴A, 프로틴G 칼럼, DEAE 이온교환 크로마토그래피, 인간 신 메산지움 세포의 추출물을 커플링한 친화성 칼럼 등에 의해 정제함으로써 조제할 수 있다.

상기 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 결합되는 단일클론 항체를 생산하는 클론의 선택에서는, 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 반응성이 높은 클론을 선택하는 것이 바람직하다. 또 이에 추가하여 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원 이외의 항원에도 결합되는 항체를 생산하는 클론을 제외하는 것이 바람직하다. 상기 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원 이외의 항원으로서는, 예를 들면 소변 중에 혼입될 가능성이 높은 세포로서 인간 신 메산지움 세포 이외의 세포에 유래하는 항원을 들 수 있으며 인간 근위세뇨관 상피세포에 유래하는 항원이 바람직하다.

본 발명의 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체로서는, 신질환 및 IgA 신증의 검출 특이성 관점에서 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 결합되고, 또한 소변 중에 혼입될 가능성이 높은 세포로서 인간 신 메산지움 세포 이외의 세포에 유래하는 항원에는 결합되지 않는 항체인 것이 바람직하고, 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 결합되고 또한 인간 근위세뇨관 상피세포에 유래하는 항원에는 결합되지 않는 항체인 것이 더욱 바람직하다.

아울러 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체는 상기와 같이 하여 얻어지는 마우스 등의 작은 동물에 유래하는 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 완전 인간 항체 등 어떤 것이어도 좋다.

인간 IgA에 대한 항체로서는, 상기 복합체 중의 IgA와 결합 가능한 항체라면 특별히 제한은 없으며 인간 IgA의 H쇄, J쇄, 분비편 (secretory component) 등 어느 하나를 인식하는 것이어도 좋다.

또 인간 IgA에 대한 항체는 다클론 항체여도 좋고 단일클론 항체여도 좋지만, 복합체 검출 특이성의 관점에서 인간 IgA에 대한 단일클론 항체인 것이 바람직하다.

상기 인간 IgA에 대한 단일클론 항체는 항원으로서 인간 IgA를 사용하여 상기 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체와 동일하게 조제할 수 있다. 또 인간 IgA에 대한 항체로서는 시판되는 항 인간 IgA 항체를 사용할 수도 있다.

아울러 인간 IgA에 대한 항체는 상기와 같이 하여 얻어지는 마우스 등 작은 동물에 유래하는 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 완전 인간 항체 중 어느 하나여도 좋다.

상기 표지로서는 특별한 제한 없이 주지의 표지를 사용할 수 있다. 예를 들면 효소, 화학 발광 물질, 전기 화학 발광 물질, 방사성 물질 등을 들 수 있다.

본 발명에서는 검출 감도와 간편성 관점에서 상기 표지로서 효소를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 효소로서는 물리적, 화학적 방법으로 정량 가능한 효소라면 특별히 제한은 없다. 예를 들면 알칼리포스파타아제, 양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP), 루시페라아제 등의 효소를 들 수 있다.

또 표지의 검출 방법은 표지를 정량 또는 반(半)정량 가능한 검출 방법이라면 특별히 제한은 없고 표지에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들면 흡광도, 발광 강도, 형광 강도, 방사선 계수 등을 들 수 있다.

표지를 정량 또는 반정량함으로써 상기 복합체를 정량 또는 반정량할 수 있다.

본 발명의 복합체 검출 공정을, 효소 면역 측정법 (ELISA)을 사용하여 표지의 검출을 흡광도로 수행할 경우, 본 발명에 바람직하게 사용되는 상기 복합체를 검출하는 측정 장치로서는, 복합체에 결합된 표지에 의해 생긴 색소의 흡광도를 측정 가능한 흡광도 측정 장치로서, 표지에 의해 생긴 색소를 포함한 시료를 재치하는 시료 재치부와, 상기 시료에 광을 조사하는 광조사부와, 상기 시료로부터의 반사광 및 투과광 중 적어도 어느 하나를 수광하고 수광한 광량을 측정하는 광량 측정부를 구비한 흡광도 측정 장치를 들 수 있다.

본 발명에서는 검체 (피험자의 소변에서 유래하는 시료)에 포함되는 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원과 인간 IgA와의 복합체와 결합된 표지에 의해 생긴 색소에, 상기 광조사부에 의해 광을 조사하고 상기 색소의 흡광도를 광량 측정부에 의해 정량화함으로써 검체 내에서의 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원과 인간 IgA와의 복합체 존재량을 측정할 수 있다.

또 상기 표지의 검출을 흡광도 대신에 검체로부터의 발광을 검출함으로써 수행할 수도 있다. 그 경우에는 상기 흡광도 측정 장치 대신에 복합체에 결합된 표지 자체 또는 반응액 중의 표지의 기질에서 발생되는 광을 측정할 수 있는 측정 장치로서, 표지를 포함한 시료를 재치하는 시료 재치부와, 상기 시료로부터의 발광을 수광하여 수광한 광량을 측정하는 광량 측정부를 구비한 측정 장치를 들 수 있다.

본 발명에서는 검체 (피험자의 소변에서 유래하는 시료)에 포함되는 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원과 인간 IgA와의 복합체와 결합된 표지를 포함한 시료에서 발생된 광을 상기 광량 측정부에 의해 정량화함으로써 검체 내에서의 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원과 인간 IgA와의 복합체 존재량을 측정할 수 있다.

본 발명의 신질환 검사 방법은, 상기 소변에서 유래하는 시료 중에 포함되는 상기 복합체 검출량에 기초하여 신질환으로 판정하는 판정 공정을 포함한 것이 바람직하다. 본 발명에서의 상기 복합체 검출량으로서는, 상기 소변에서 유래하는 시료 중에 포함되는 상기 복합체 농도 또는 거기에 대응하는 정량값 또는 반정량값이라면 특별히 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들면 상기 복합체 검출량을 직접적으로 측정한 측정값, 상기 복합체 검출량을 표지의 검출을 통해 간접적으로 측정한 측정값 등을 들 수 있다.

또 본 발명의 신질환 검사 방법에서 IgA 신증을 검사할 경우, IgA 신증으로 판정할 때 사용하는 복합체 검출량은, 피험자의 소변에서 유래하는 시료 중의 총 (總) 요단백질량에 대한 복합체 검출량의 비율이 바람직하다. 상기 비율은 복합체 검출량의 측정값을 피험자의 소변에서 유래하는 시료 중의 총 요단백질량의 측정값으로 나누어 얻어지는 것이어도 좋고, 총 요단백질량에 대한 상대값으로서 얻어지는 복합체 검출량이어도 좋다. 상기 비율에 기초하여 판정함으로써 더욱 높은 감도와 특이성으로 IgA 신증으로 판정할 수 있다.

아울러 총 요단백질량을 측정하는 피험자의 소변에서 유래하는 시료는 동일 피험자로부터 얻어지는 것이라면 상기 복합체 검출에 사용하는 소변에서 유래하는 시료와는 다른 시료여도 좋다.

본 발명의 신질환 검사 방법에서의 판정 공정은, 피험자의 소변에서 유래하는 시료로부터의 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원과 인간 IgA와의 복합체 검출량과, 대조가 되는 정상인의 소변에서 유래하는 시료로부터의 상기 복합체 검출량을 비교하는 공정과, 상기 피험자의 소변에서 유래하는 시료 중의 상기 복합체 검출량이 대조가 되는 정상인의 소변에서 유래하는 시료 중의 상기 복합체 검출량보다도 큰 경우와 신질환을 관련시키는 공정을 포함하는 것이 바람직하다.

여기에서 대조가 되는 정상인이란, 신질환을 발증하지 않는다는 것이 사전에 판명된 개체를 의미한다. 또 검출량이 크다는 것은, 정상인과 신질환 환자를 구별하기 위해 설정된 정상 검출량 (컷오프 값) 보다는 피험자에 유래하는 상기 복합체 검출량이 큰 것이다.

상기 컷오프 값은, 예를 들면 신질환 환자의 소변에서 유래하는 시료군에서의 상기 복합체 검출량과, 대조가 되는 정상체군의 소변에서 유래하는 시료군에서의 상기 복합체 검출량에 대하여 ROC 해석 등을 수행함으로써 설정할 수 있다. ROC 해석은, 예를 들면 질병의 검사 방법의 검출능, 진단 능력을 평가할 수 있는 해석 방법으로서, 예를 들면 일본 임상 검사 자동화 학회 회지 「임상 검사의 진단적 유용성 평가 메뉴얼」 Ver.1.3 (2004.9.1), Vol.29 Suppl.1 (통권 제154호) (2004년 9월 1일 발행)에 기재된 해석 방법이다.

또 컷오프 값은, 예를 들면 정상인의 검출 레벨의 평균치에 표준편차를 2배 혹은 3배한 값을 가산한 값으로서 정할 수도 있고, 또한 감도 (검출율)·특이성 (위양성률의 낮음)을 균형있게 만족하는 값으로 적절하게 결정할 수 있다.

본 발명의 신질환으로서는, 예를 들면 IgA 신증 (IgAN), 막성 신증 (MN), 루프스 신염 (SLE), 국소성 사구체 경화증 (FGS), 미소 변화군 네프로제 증후군 (MCNS), 당뇨병성 신증 (DMN), 아밀로이드증, 유전성 신증 (Alport), 소각(burn-out) IgA 신증 (IgA 신증의 자연관해(寬解) 상태), 막성 증식성 사구체 신염 (MPGN), 항호중구 세포질 항체 (ANCA) 관련 신염, 비박 (菲薄) 기저막 증후군 (TBMD), 신경화증 등을 들 수 있다.

본 발명의 신질환 검사 방법은 소변 중의 상기 복합체를 검출함으로써 IgA 신증을 비롯한 여러가지 신질환을 검출할 수 있다.

본 발명의 IgA 신증의 검사 방법은, 피험자의 소변에서 유래하는 시료로부터 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원과 인간 IgA와의 복합체를 검출하는 복합체 검출 공정과, 상기 복합체 검출 공정에서 검출된 상기 복합체 검출량, 혹은 피험자의 소변에서 유래하는 시료 중의 요단백질량에 기초하여 신질환으로 판정하는 제1 판정 공정과, 피험자의 소변에서 유래하는 시료 중의 요단백질량에 대한 상기 복합체 검출 공정에서 검출된 상기 복합체 검출량의 비율에 기초하여 상기 신질환을 IgA 신증으로 판정하는 제2 판정 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

소변에서 유래하는 시료 중의 총 단백질량에 대한 상기 복합체 검출량의 비율에 기초하여 IgA 신증으로 판정함으로써 고감도이면서 고특이적으로서 치료 개입에 의해 완전관해가 얻어지는 초기 단계에서도 간편하고 안전하게 IgA 신증을 판정할 수 있다.

본 발명의 복합체 검출 공정은, 상기 신질환 검사 방법에서의 복합체 검출 공정과 동일하다.

또 요단백질량의 검출 방법으로서는, 소변에서 유래하는 시료 중의 총 단백질량을 측정할 수 있다면 특별한 제한 없이 통상 수행되는 소변에서 유래하는 시료 중의 단백질 검출 방법을 적용할 수 있다. 예를 들면 가나이 미츠마사 등 저의 「임상 검사법 개요 개정판 제32판」, 173∼174페이지, 2005년에 기재된 방법을 적용할 수 있다.

본 발명의 제1 판정 공정에서, 상기 복합체 검출 공정에서 검출된 상기 복합체 검출량에 기초하여 신질환으로 판정하는 공정은 상기 신질환 검사 방법에서의 판정 공정과 동일하다.

또 상기 소변에서 유래하는 시료 중의 요단백질량에 기초하여 신질환으로 판정하는 공정은, 정상인과 신질환 환자를 구별하기 위해 설정된 정상 검출량 (컷오프 값)보다도, 피험자의 소변에서 유래하는 시료 중의 요단백질량이 큰 경우와 신질환을 관련시키는 공정을 포함하는 것이 바람직하다.

여기에서 요단백질량의 정상 검출량은 통상의 방법으로 설정할 수 있다.

본 발명의 제2 판정 공정은, 피험자의 소변에서 유래하는 시료 중의 상기 복합체 검출량의 상기 시료 중의 총 단백질량에 대한 비율 (복합체/총단백질)과, 대조가 되는 IgA 신증 이외의 신질환 환자의 소변에서 유래하는 시료 중의 상기 복합체 검출량의 상기 시료 중의 총 단백질량에 대한 비율을 비교하는 공정과, 상기 피험자의 소변에서 유래하는 시료 중의 상기 복합체 검출량의 상기 시료 중의 총 단백질량에 대한 비율이 대조가 되는 IgA 신증 이외의 신질환 환자의 소변에서 유래하는 시료 중의 상기 복합체 검출량의 상기 시료 중의 총 단백질량에 대한 비율보다도 큰 경우와 IgA 신증을 관련시키는 공정을 포함하는 것이 바람직하다.

여기에서 비율이 크다는 것은, IgA 신증과 IgA 신증 이외의 신질환을 구별하기 위해 설정된 컷오프 값보다도 피험자에 유래하는 상기 복합체 검출량 비율이 크다는 것이다.

상기 컷오프 값은 상술한 신질환 검사 방법에서의 컷오프 값과 동일하게 설정할 수 있지만, 검출 특이성의 관점에서 ROC 해석 결과에 기초하여 컷오프 값을 설정하는 것이 바람직하다.

본 발명의 IgA 신증의 검사 방법은 소변 중의 상기 복합체 검출량과 총 단백질량을 측정하고 상기 총 단백질량에 대한 상기 복합체 검출량의 비율에 기초하여 IgA 신증을 검출할 수 있기 때문에 간편하고 안전한 IgA 신증의 검사 방법이다.

본 발명의 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원과 인간 IgA와의 복합체 검출 방법은, 피험자의 소변에서 유래하는 시료와, 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체 및 인간 IgA에 대한 항체를 접촉시키는 공정을 포함한다. 이로써 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원과 인간 IgA와의 복합체를 고감도 및 높은 특이성으로 검출할 수 있다.

본 발명의 복합체 검출 방법에는 상기 신질환 검사 방법의 복합체 검출 공정에서 설명한 사항을 동일하게 적용할 수 있다.

또 상기 피험자는 신질환을 발증하는 인간, 신질환을 발증한다고 의심받는 인간, 또는 신질환을 발증할 가능성이 인간인 것이 바람직하다. 여기에서 말하는 신질환을 발증할 가능성이 있는 인간이란, 신질환을 발증하는 인간 또는 신질환을 발증한다고 의심받는 인간 어느 쪽도 아닌 모든 인간을 말한다. 또 상기 신질환은 IgA 신증이 더욱 바람직하다.

본 발명의 신질환의 검사 키트는, 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체 중 적어도 1종류와, 인간 IgA에 대한 항체 중 적어도 1종류을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체와 인간 IgA에 대한 항체를 사용하여 소변에서 유래하는 시료 중의 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원과 인간 IgA와의 복합체를 검출함으로써 양호한 검출 감도와 특이성으로 신질환으로 판정할 수 있게 된다.

본 발명의 신질환의 검사 키트는, 상기 항체에 추가하여 피험자의 소변에서 유래하는 시료와, 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체 및 인간 IgA에 대한 항체를 접촉시켜 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원과 인간 IgA와의 복합체를 검출하고 그 검출량과 신질환을 관련시키는 것이 기재된 취급설명서를 더 포함하는 것이 바람직하다.

또 본 발명의 신질환의 검사 키트는 IgA 신증의 검사용으로서 바람직하게 사용할 수 있다.

일본출원번호 제2008-144883호의 개시는 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 반영된다.

본 명세서에 기재된 모든 문헌, 일본특허출원 및 기술규격은 각각의 문헌, 특허출원 및 기술규격이 참조에 의해 반영되는 것이 구체적으로 각각에 기록된 경우와 동일한 정도로 본 명세서에 참조에 의해 반영된다.

<실시예>

이하 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예로 한정되지 않는다. 아울러 특별히 예고가 없는 한 「%」는 질량 기준이다.

[실시예 1]

<인간 신 메산지움 세포 항원 인식 단일클론 항체의 취득>

정상 인간 신 메산지움 세포 (Cryo NHMC: Cambrex 사)를 배양하고 그 세포 또는 그 세포 골격 성분 추출 분획을 면역원으로 하여 BALB/c 마우스 (암컷)에 면역하였다. 면역원에 대한 항체가가 상승한 것을 확인하고 그 비장 세포를 P3U-1세포와 세포 융합하여 하이브리도마를 제작하였다. 하이브리도마의 첫번째 스크리닝은, 2종류의 면역 항원 (정상 인간 신 메산지움 세포 또는 그 세포 골격 성분 추출 분획)을 마이크로 플레이트의 컵에 고상화한 EIA법에 의해 수행하여 양쪽 혹은 어느 한쪽의 항원에 대해 높은 발색값을 나타낸 하이브리도마를 선택하였다. 아울러 세포 골격 성분 추출 분획은 ProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kit (Calbiochem 사제)를 사용하여 조제하였다.

선택한 하이브리도마는 한계 희석법으로 단일클론으로 한 후 이들을 사용하여 인간 신 메산지움 세포에 특이적인 하이브리도마를 선택하기 위해 두번째 스크리닝을 수행하였다. 하이브리도마의 두번째 스크리닝은 후술하는 ELISA법을 사용하여 고상으로 정상 인간 신 메산지움 세포 또는 그 세포 골격 성분 추출 분획을 사용한 것에 반응하고, 대조용으로 배양한 정상 인간 근위세뇨관 상피세포 (Cryo RPTEC: Cambrex사) 또는 그 세포 골격 성분 추출 분획을 고상으로 한 것에는 반응하지 않는 클론을 선택하였다.

ELISA법은 다음과 같이 수행하였다. 정상 인간 신 메산지움 세포와 정상 인간 근위세뇨관 상피세포의 각각 4000 cells/200㎕를 폴리소프 컵 (NUNC 사제)에 주입하여 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 컵을 PBS (pH7.2)로 5회 세정한 후 0.05% 글루타르알데히드 용액 100㎕/well을 주입하여 실온에서 30분간 반응시켰다. 컵을 세정액 (50mM Tris/HCl (pH7.5), 150mM NaCl, 0.01% Tween20)으로 5회 세정 후 블로킹액 (10% 정상 토끼 혈청 (Pel-Freeze), 50mM Tris/HCl (pH7.5), 0.15M NaCl, 10mM-EDTA-2Na, 0.01% Tween20, 0.1% NaN₃)을 150㎕/well 주입 후 실온에서 2시간 또는 4℃에서 1일 이상 블로킹하였다 (이하, 「항체 스크리닝용 컵」이라고 한다).

한편 정상 인간 신 메산지움 세포와 정상 인간 근위세뇨관 상피세포의 골격 성분 추출 분획은 각각 10㎍/㎖농도로 50mM Tris/HCl (pH7.5), 0.15M NaCl로 희석한 후 폴리소프 컵 (NUNC 사제)에 50㎕/well 주입하였다. 컵을 습윤 박스에 넣고 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. 코팅 후의 조작은 전술한 항체 스크리닝용 컵과 동일하게 수행하였다.

4종류의 항체 스크리닝용 컵을 각각 세정액 (50mM Tris/HCl (pH7.5), 150mM NaCl, 0.01% Tween20)으로 3회 세정하고 하이브리도마 배양 상청액을 50㎕/well 주입하여 실온에서 1시간 반응하였다. 세정액 (50mM Tris/HCl (pH7.5), 150mM NaCl, 0.01% Tween20)으로 3회 세정 후 0.2M Na₂HPO₄/0.1M 구연산으로 완충화 (pH5.4)한 25% 정상 토끼 혈청 (Pel-Freeze)으로 희석한 2종류의 표지 항체 (HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG (Zymed 사제: 1000배 희석), HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG1 (Zymed 사제: 4000배 희석)을 50㎕/well 주입하고 실온에서 1시간 반응하였다. 세정액으로 3회 세정 후 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA (SIGMA 사제)를 100㎕/well 주입하고 실온에서 30분 반응하였다. 0.5M H₂SO₄를 100㎕/well 주입하여 반응을 정지시킨 후 OD (450-650㎚)를 측정하였다. 본 측정 결과에서 특히 HRP-Anti-Mouse IgG1에서 정상 인간 신 메산지움 세포 및 그 세포 골격 성분 추출 분획의 양쪽 혹은 그 중 한쪽에서 높은 발색값을 나타내고, 또한 정상 인간 근위세뇨관 상피세포 및 그 세포 골격 성분 추출 분획 중 모두에서 낮은 발색값을 나타낸 클론을 선택하였다.

<단일클론 항체의 반응 특성의 확인>

상기에서 취득한 하이브리도마를 배양하고 그 세포를 마우스 복강에 이식하여 얻어진 복수로부터 PROSEP-A (MILLIPORE 사제)에 의해 IgG를 정제하였다. 정제 단일클론 항체의 특이성은 상기 스크리닝에 사용한 ELISA법과 같은 방법으로 특이성을 확인하였다.

정제 단일클론 항체 5종 (4H3-1D12-1D2, 4H3-2E7-1D2, 6C4-6A8-1B4, 14E11-2G7-1B2, 11A11-2F9-1G3)은 모두 고상으로 정상 인간 메산지움 세포 또는 세포 골격 성분 추출 분획에 대해서는 높은 발색값을 나타내고, 대조용의 정상 인간 근위세뇨관 상피세포 (Cryo RPTEC: Cambrex사) 또는 그 세포 골격 성분 추출 분획을 고상으로 한 것에서는 낮은 발색값만 나타났다.

다음으로 정상 인간 신 메산지움 세포의 골격 성분 추출 분획을 SDS-PAGE에 걸어 니트로셀룰로스 필터 (Schleicher&Schuell 사제, BA85)에 블로팅하였다. 필터를 블로킹액 (50mM Tris-HCl (pH7.5), 150mM NaCl, 5% 스킴밀크, 0.01% Tween20, 0.1% NaN₃)에 침지하여 4℃에서 하룻밤 진탕한 후 블로킹액을 교환하고 취득한 단일클론 항체 각 클론의 배양 상청액을 더하여 실온에서 2시간 진탕하고 세정액으로 3회 세정하였다. 세정액에 2차 항체의 HRP 표지 항 마우스 IgG (Zymed Laboratories,Inc. 사제)를 1/1000 농도로 더하여 실온에서 1시간 진탕하고 세정액으로 3회 세정한 후 발색액 (8.3mM Tris-HCl (pH6.5), 125mM NaCl, 0.05% 4-Chloro-1-Naphtol, 0.01% H₂O₂)을 더하여 발색시켰다.

상기 웨스턴 블로팅 해석 실험 결과 클론 4H3와 6C4는 인간 신 메산지움 세포의 골격 성분 추출 분획의 다른 분자량의 성분과 반응하였다. 클론 4H3와 6C4는 인간 신 메산지움 세포의 다른 항원을 인식한다고 생각된다.

<신질환의 검출>

∼ELISA법에 의한 IgA-6C4 인식 항원 복합체의 검출∼

6C4-6A8-1B4 항체 (이하, 「6C4」라고 한다)를 PROSEP-A (MILLIPORE 사제)로 정제 후 다시 50mM Tris/HCl (pH7.5), 0.15M NaCl로 투석하여 정제한 정제 항체를 5㎍/㎖∼10㎍/㎖ 농도로 50mM Tris/HCl (pH7.5), 0.15M NaCl에 희석한 후 폴리소프 컵 (NUNC 사제)에 50㎕/well 주입하였다. 컵을 습윤 박스에 넣어 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. 코팅 후 세정액 (50mM Tris/HCl (pH7.5), 150mM NaCl, 0.01% Tween20)으로 3회 세정하고 블로킹액 (50% N102 (일본유지 사제), 25mM Tris/HCl (pH7.5), 75mM NaCl, 2% 블럭 에이스 (다이닛폰스미토모제약 사제))를 150㎕/well 주입 후 실온에서 2시간 또는 4℃에서 1일 이상 블로킹하였다 (이하, 「6C4 코팅 컵」이라고 한다).

6C4 코팅 컵을 세정액 (50mM Tris/HCl (pH7.5), 150mM NaCl, 0.01% Tween20)으로 3회 세정하고 검체 희석액 (50% N102 (일본유지 사제), 50mM Tris/HCl (pH7.5), 150mM NaCl, 2% 블럭 에이스 (다이닛폰스미토모제약 사제))로 50배 희석한 소변 검체를 50㎕/well 주입하여 실온에서 1시간 반응하였다. 세정액 (50mM Tris/HCl (pH7.5), 150mM NaCl, 0.01% Tween20)으로 3회 세정후 Can Get Signal 2 (TOYOBO 사제)로 3000배 희석한 HRP-GOAT Anti-Human IgA (Zymed 사제)를 50㎕/well 주입하고 실온에서 1시간 반응하였다. 세정액으로 3회 세정후 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA (SIGMA 사제)를 100㎕/well 주입하고 실온에서 30분 반응하였다. 0.5M H₂SO₄를 100㎕/well 주입하여 반응을 정지시킨 후 OD (450-650㎚)을 측정하였다. IgA 신증 환자 95 예를 포함한 신질환 환자 146 예와 건강인 (정상인) 28 예에 대해서 측정한 결과를 도 1에 도시한다.

도 1에서 블랭크를 공제한 값을 비교함으로써 IgA 신증 환자 95 예를 포함한 신질환 환자 146 예와 건강인 (정상인) 28 예를 유의미하게 구별할 수 있는 결과를 얻을 수 있었다.

또 신질환 환자 146 예와 건강인 28 예에 대해서 ROC 해석을 했을 때, 도 2에 도시한 ROC 곡선을 얻을 수 있었다. ROC 곡선으로부터 구한 컷오프 값은 0.155였다. 그 컷오프 값으로부터 신질환 환자 146 예와 건강인 28 예의 양성율을 구한 결과를 표 1에 나타낸다. 표 1에 나타낸 것처럼 신질환 환자 146 예 중 양성 132 예 (90.4%), 건강인 28 예 중 양성 2 예 (7.1%)로서, 양자를 유의미하게 구별할 수 있었다. 그 때의 감도는 90.4%, 특이도 (특이성)는 92.9%, 진단 효율은 90.8%였다.

	신질환 환자	건강인
검체수	146	28
양성수	132	2
양성율	90.4%	7.1%

<IgA 신증의 검출>

다음으로 복합체 검출량이 상기 컷오프 값 이상의 발색값을 나타낸 검체에 대해서 피로갈롤레드법에 의해 소변 중의 단백 농도를 정량하였다. 상기에서 검출했 IgA-6C4 인식 항원 복합체 검출량 (도 1에 도시한 값)을 소변 중의 단백 농도로 나누어 소변 중의 단백량당의 복합체 검출량을 산출한 결과를 도 3에 도시하였다. 도 3으로부터 IgA 신증 환자 83 예와 IgA 신증 이외의 신질환 환자 48 예를 유의미하게 구별할 수 있다는 것을 알 수 있다.

또 IgA 신증 환자 83 예와 IgA 신증 이외의 신질환 환자 48 예에 대해서 ROC 해석을 수행했을 때, 도 4에 도시한 ROC 곡선을 얻을 수 있었다. ROC 곡선으로부터 구한 컷오프 값은 4509였다. 그 컷오프 값으로부터 IgA 신증 환자 83 예와 IgA 신증 이외의 신질환 환자 48 예의 양성율을 구한 결과를 표 2에 나타내었다. 표 2로부터 IgA 신증 환자 83 예 중 양성 61 예 (73.5%), IgA 신증 이외의 신질환 환자 48 예 중 양성 10 예 (20.8%)로서, 양자를 유의미하게 구별할 수 있다는 것을 알 수 있다. 그 때의 감도는 73.5%, 특이도는 79. 2%, 진단 효율은 75.6%였다.

	IgA 신증	IgA 신증 이외의 신질환
검체수	83	48
양성수	61	10
양성율	73.5%	20.8%

[실시예 2]

<신질환의 검출>

∼ELISA법에 의한 IgA-4H3 인식 항원 복합체의 검출∼

H3-1D12-1D2 항체 (이하, 「4H3」라고 한다)를 PROSEP-A (MILLIPORE 사제)로 정제 후 50mM Tris/HCl (pH7.5), 0.15M NaCl로 투석한 정제 항체를 5㎍/㎖∼10㎍/㎖ 농도로 50mM Tris/HCl (pH7.5), 0.15M NaCl로 희석한 후 폴리소프 컵 (NUNC 사제)에 50㎕/well 주입하였다. 컵을 습윤 박스에 넣어 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. 코팅 후 세정액 (50mM Tris/HCl (pH7.5), 150mM NaCl, 0.01% Tween20)으로 3회 세정하고 블로킹액 (50% N102 (일본유지 사제), 25mM Tris/HCl (pH7.5), 75mM NaCl, 2% 블럭 에이스 (다이닛폰스미토모제약 사제))를 150㎕/well 주입 후 실온에서 2시간 또는 4℃에서 1일 이상 블로킹하였다 (이하, 「4H3 코팅 컵」이라고 한다).

4H3 코팅 컵을 세정액 (50mM Tris/HCl (pH7.5), 150mM NaCl, 0.01% Tween20)으로 3회 세정하고 검체 희석액 (50% N102 (일본유지 사제), 50mM Tris/HCl (pH7.5), 150mM NaCl, 2% 블럭 에이스 (다이닛폰스미토모제약 사제))로 50배 희석한 소변 검체를 50㎕/well 주입하여 실온에서 1시간 반응하였다. 세정액 (50mM Tris/HCl (pH7.5), 150mM NaCl, 0.01% Tween20)으로 3회 세정후 Can Get Signal2 (TOYOBO 사제)로 3000배 희석한 HRP-GOAT Anti-Human IgA (Zymed 사제)를 50㎕/well주입하여 실온에서 1시간 반응하였다. 세정액으로 3회 세정 후 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA (SIGMA 사제)를 100㎕/well 주입하고 실온에서 30분 반응하였다. 0.5M H₂SO₄를 100㎕/well 주입하여 반응을 정지시킨 후 OD (450-650㎚)를 측정하였다. IgA 신증 환자 95 예를 포함한 신질환 환자 149 예와 건강인 28 예에 대해서 측정한 결과를 도 5에 도시한다.

도 5에서 블랭크를 공제한 값을 비교함으로써 IgA 신증 환자 95 예를 포함한 신질환 환자 149 예와 건강인 28 예를 유의미하게 구별할 수 있는 결과를 얻을 수 있었다.

또 신질환 환자 149 예와 건강인 28 예에 대해서 ROC 해석을 한 결과, 도 6에 도시한 ROC 곡선을 얻을 수 있었다. ROC 곡선으로부터 구한 컷오프 값은 0.192였다. 그 컷오프 값으로부터 신질환 환자 149 예와 건강인 28 예의 양성율을 구한 결과를 표 3에 나타낸다. 표 3으로부터 신질환 환자 149 예 중 양성 147 예 (98.7%), 건강인 28 예 중 양성 1 예 (3.6%)로서, 양자를 유의미하게 구별할 수 있었다. 그 때의 감도는 98.7%, 특이도는 96.4%, 진단 효율은 98.3%였다.

	신질환 환자	건강인
검체수	149	28
양성수	147	1
양성율	98.7%	3.6%

<IgA 신증의 검출>

다음으로 컷오프 값 이상의 발색값을 나타낸 검체에 대해서 피로갈롤레드법에 의해 소변 중의 단백 농도를 정량하였다. 상기에서 검출한 IgA-4H3 인식 항원 복합체 검출량 (도 5에 도시한 값)을 소변 중 단백 농도로 나누어 소변 중의 단백량당의 복합체 검출량을 산출한 결과를 도 7에 도시하였다. 도 7로부터 IgA 신증 환자 92 예와 IgA 신증 이외의 신질환 환자 54 예를 유의미하게 구별할 수 있다는 것을 알 수 있다.

또 IgA 신증 환자 92 예와 IgA 신증 이외의 신질환 환자 54 예에 대해서 ROC 해석을 한 결과, 도 8에 도시한 ROC 곡선을 얻을 수 있었다. ROC 곡선으로부터 구한 컷오프 값은 15.07이었다. 그 컷오프 값으로부터 IgA 신증 환자 92 예와 IgA 신증 이외의 신질환 환자 54 예의 양성율을 구한 결과를 표 4에 나타낸다. 표 4로부터, IgA 신증 환자 92 예 중 양성 71 예 (77. 2%), IgA 신증 이외의 신질환 환자 48 예 중 양성 14 예 (25.9%)로서, 양자를 유의미하게 구별할 수 있었다. 그 때의 감도는 77. 2%, 특이도는 74.1%, 진단 효율은 76.0%였다.

	IgA 신증	IgA 신증 이외의 신질환
검체수	92	54
양성수	71	14
양성율	77.2%	25.9%

상기로부터, 소변 중에 존재하는 인간 IgA와 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원의 복합체를 검출함으로써 건강인과 신증 환자를 식별할 수 있다는 것을 알 수 있다.

또 소변 중에 존재하는 인간 IgA와 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원의 복합체 요단백 농도당의 검출량을 측정함으로써 IgA 신증과 그 밖의 신질환을 식별할 수 있다는 것을 알 수 있다.

Claims (17)

1. 피험자의 소변에서 유래하는 시료로부터, 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원과 인간 IgA와의 복합체를 검출하는 복합체 검출 공정을 포함하는 IgA 신증의 검사 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 복합체 검출 공정은, 상기 시료와 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체 및 인간 IgA에 대한 항체를 접촉시키는 것을 포함하는 검사 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 복합체 검출 공정에서 검출된 복합체 검출량의, 피험자의 소변에서 유래하는 시료 중의 요단백질량에 대한 비율을 얻는 공정을 더 포함하는 검사 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 비율에 기초하여 IgA 신증으로 판정하는 판정 공정을 더 포함하는 검사 방법.
5. 피험자의 소변에서 유래하는 시료로부터, 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원과 인간 IgA와의 복합체를 검출하는 복합체 검출 공정을 포함하는 신질환 검사 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 복합체 검출 공정은 상기 시료와, 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체 및 인간 IgA에 대한 항체를 접촉시키는 것을 포함하는 검사 방법.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 복합체 검출량에 기초하여 신질환으로 판정하는 판정 공정을 더 포함하는 검사 방법.
8. 피험자의 소변에서 유래하는 시료로부터 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원과 인간 IgA와의 복합체를 검출하는 복합체 검출 공정,
   상기 복합체 검출 공정에서 검출된 상기 복합체 검출량 혹은 상기 시료 중의 요단백질량에 기초하여 신질환으로 판정하는 제1 판정 공정,
   상기 시료 중의 요단백질량에 대한 상기 복합체 검출 공정에서 검출된 상기 복합체 검출량의 비율에 기초하여 상기 신질환을 IgA 신증으로 판정하는 제2 판정 공정을 포함한 IgA 신증의 검사 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복합체 검출 공정은 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체와 인간 IgA에 대한 항체를 사용하는 면역 화학적 방법인 검사 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 면역 화학적 방법은 샌드위치법인 검사 방법.
11. 피험자의 소변에서 유래하는 시료와, 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체 및 인간 IgA에 대한 항체를 접촉시키는 공정을 포함하는, 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원과 인간 IgA와의 복합체 검출 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 복합체는 상기 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체와 인간 IgA에 대한 항체를 사용하여 면역 화학적 방법으로 검출되는 검출 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 면역 화학적 방법은 샌드위치법인 검출 방법.
14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자는 신질환을 발증하는 인간, 신질환을 발증한다고 의심받는 인간, 또는 신질환을 발증할 가능성이 있는 인간인 검출 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 신질환은 IgA 신증인 검출 방법.
16. 적어도 인간 신 메산지움 세포에서 유래하는 항원에 대한 항체와 인간 IgA에 대한 항체를 포함한 신질환의 검사 키트.
17. 제16항에 있어서, 상기 신질환은 IgA 신증인 검사 키트.

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