WO2006093128A1 - 抗メグシンモノクローナル抗体 - Google Patents

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WO2006093128A1
WO2006093128A1 PCT/JP2006/303710 JP2006303710W WO2006093128A1 WO 2006093128 A1 WO2006093128 A1 WO 2006093128A1 JP 2006303710 W JP2006303710 W JP 2006303710W WO 2006093128 A1 WO2006093128 A1 WO 2006093128A1
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Toshio Miyata
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Tokai University Educational System
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/38—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against protease inhibitors of peptide structure
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy

Definitions

  • the present invention relates to a monoclonal antibody that selectively binds to a specific serpin (serine protease inhibitor), that is, a specific epitope of Megsin, a method for producing the same, and glomerular injury using the monoclonal antibody And a composition for diagnosis or Z.
  • serpin serine protease inhibitor
  • Renal failure is a pathological condition that ultimately leads to kidney disease patients.
  • the cause and history are not uniform, and many cases of renal failure occur due to diseases other than the original kidney such as drug addiction, infections, malignant tumors, diabetes, lupus nephritis, etc., leading to renal failure.
  • Kidney transplantation is the only treatment for end-stage renal failure where the blood filtration and detoxification of the kidneys do not function at all.
  • Japan it is difficult to say that the transplantation system for transplanted kidneys is well established.
  • social awareness of transplantation therapy itself has not progressed.
  • the number of kidney transplant cases in Japan is only 700 cases per year, and this figure has not increased in recent years. Therefore, dialysis is the only treatment for renal replacement therapy.
  • the number of end-stage renal failure dialysis patients in Japan is estimated to be approximately 210,000, and the number of patients per population is the first in the world.
  • the average treatment cost per person is about 6 million yen per year, which is one of the main reasons for the pressure on the medical insurance system.
  • the patient is restrained for dialysis treatment for 2 to 3 days a week and 4 to 6 hours a day, the social burden on the patient himself is great.
  • the present inventors have identified renal mesane as a tissue deeply related to functions such as the onset and progression of renal diseases. We focused on the Guim cells. It is well known that mesangial cells are organ-specific cells that are not found outside the kidney and play an important role in maintaining the structure and function of the glomeruli.
  • the present inventors considered that it is possible to detect a highly expressed gene group specific to mesangial cells by clarifying the profile of the gene group expressed in mesangial cells. From there, it is also possible to determine the gene group involved in the state of renal disease, and to find clues to elucidate the molecular mechanism of renal disease, making it possible to develop diagnostic methods and treatments for new renal diseases based on it. I thought. Therefore, the present inventors have clarified the gene expression pattern of mesangial cells and attempted to analyze the cell characteristics at the gene level.
  • Non-patent Document 1 First, for the purpose of quantitatively analyzing genes expressed in mesangial cells, the present inventors extracted cultured human mesangial cell force mRNA to prepare a 3'-directed cDNA library. Large-scale DNA sequencing and database analysis of gene fragments inserted into clones were performed (Non-patent Document 1).
  • megsin a gene consisting of 2,249 bp in total length, named megsin, was isolated as a gene that is particularly strongly expressed in mesangial cells.
  • megsin protein consisting of 380 amino acids, which encodes the full-length cDNA clone of megsin.
  • amino acids by FASTA program A homology search was performed.
  • the amino acid sequence of the megsin protein includes a consensus within the reactive loop site that is important as the bioactive center site of the serine protease inhibitor (SERPIN) superfamily (Non-patent Documents 2 to 6). It was found that a sequence (EEGTEATAATZ SEQ ID NO: 3) similar to the sequence (EEGTEAAAATZ SEQ ID NO: 2) exists.
  • megsin has a structural feature of serpin and, like other serpins, there is a reactive loop region (P17-P5 ': EEGTEATAATGSNIVEKQLPQSZ SEQ ID NO: 4) that is an active site (non-patented). Reference 7). From these facts, it was clarified that the protein belongs to human megsin protein serine (Non-patent Document 7). A patent application was filed for these findings (Patent Document 1).
  • megsin has a biologically important effect on the function of mesangyum.
  • single genetic manipulation of megsin can generate early mesangial lesions present in experimental and human glomerulonephritis.
  • megsin has also been reported to be involved in the development of mesangial proliferative glomerulonephritis in animal individuals.
  • kidney damage at an early stage is important to prevent the transition to renal failure and to avoid insurance financial pressure from dialysis treatment.
  • the present inventors considered that it is necessary to measure a specific protein closely related to a disease state in order to determine a definite diagnosis and severity of a renal disease. Therefore, the present inventors focused on the megsin gene and megsin protein, and established a renal function evaluation method comprising measuring megsin protein in a biological sample using a megsin peptide antibody (Patent Literature). 3).
  • Patent Document 1 International Publication No. 99/15652
  • Patent Document 2 International Publication No. 01/24628
  • Patent Document 3 International Publication No. 00/57189
  • Non-patent literature l Yasuda, Y. et al., Kidney Int., 53: 154-158 (1998)
  • Non-Patent Document 2 Carrell, R.W. et al., Trends Biochem. Sci "10: 20 (1985)
  • Non-Patent Document 3 Carrell, R.W. et al, Cold Spring Harbor Symp.Quant. Biol, 52: 527 (1987)
  • Non-Patent Document 4 Kruithof, E.K.O. et al., Blood, 86: 4007 (1995)
  • Non-Patent Document 5 Potempa, J. et al., J. Biol. Chem., 269: 15957 (1994)
  • Non-Patent Document 6 Remold-0'Donnell. E., FEBS Lett., 315: 105 (1993)
  • Non-Patent Document 7 Miyata, T. et al., J. Clin. Invest., 102: 828-836 (1998)
  • Non-Patent Document 8 Suzuki, D. et al "J. Am. Soc. Nephrol, 10: 2606 (1999)
  • Non-Patent Document 9 Nangaku, M. et al., Kidney Int., 60: 641 (2001)
  • Non-Patent Document 10 Miyata, T. et al., J. Clin. Invest., 109: 585 (2002)
  • Non-Patent Document 11 Inagi R, Miyata T, Suzuki D, Toyoda M, Wada T, Ueda Y, Izuhara Y
  • a method for diagnosing glomerular injury using an anti-megsin protein antibody includes: This is an extremely useful tool for early diagnosis of kidney damage and determination of the degree of progression of the disease state.
  • An object of the present invention is to provide a disease state-specific diagnostic agent using an anti-megsin protein antibody.
  • the present inventors analyzed various tissues and cells by Northern plot and reverse transcription polymerase chain reaction, and megsin is weakly expressed in human fibroblasts, smooth muscle cells, endothelial cells, and keratinocytes. It was found to be particularly strongly expressed in mesangial cells. These findings are further discussed in situ hybridization (Miyata, T. et al., J. Clin. Invest., 102: 828 (1998), Suzuki, D. et al., J. Am. Soc. Nephrol). , 10: 2606 (1999)) and immunohistochemistry using megsin antibody (Inagi, R. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 286: 1098 (2001)).
  • the present inventors have previously obtained an antibody that recognizes megsin protein using a recombinant megsin protein as an immunogen.
  • monoclonal antibody 4F3 that recognizes an epitope different from the monoclonal antibody of the present invention.
  • the present inventors found a monoclonal antibody 2D12 that reacts with a megsin protein localized in glomerular mesangial cells, and determined its epitope (129-134: VDFTNHZ SEQ ID NO: 1).
  • monoclonal antibody 4F3 recognizes megsin protein localized in renal glomerular epithelial cells.
  • the localization pattern of megsin protein localized in glomerular epithelial cells also differs depending on the disease type. Therefore, the combination of monoclonal antibody 2D12 and 4F3 antibody of the present invention contributes to the classification of disease types.
  • a method for producing a monoclonal antibody or a fragment containing an antigen-binding region thereof comprising culturing the hybridoma 2D12 deposited as FERM BP-10527 and recovering the immunoglobulin contained in the culture.
  • a method for inspecting glomerular injury comprising the following steps.
  • a diagnostic agent for glomerular disorders comprising the monoclonal antibody according to [2] or a fragment containing the antigen-binding region thereof.
  • the monoclonal antibody 2D12 of the present invention reacts with a megsin protein localized in glomerular mesangial cells. Therefore, by comparing the staining pattern of kidney tissue using the antibody by means such as immunohistochemical staining, it becomes possible to diagnose the disease type of renal disease.
  • FIG. 1 is a photograph showing the isotype of monoclonal antibody 2D12 using the RoS IsoStrip kit.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of Western plotting showing the reactivity between monoclonal antibody 2D12 of the present invention and human megsin protein.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of Western plotting showing the reactivity between the monoclonal antibody 2D12 of the present invention and megsin proteins having different species differences.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of Western plotting showing the cross-reactivity between monoclonal antibody 2D12 of the present invention and serpin other than megsin protein.
  • FIG. 5 is a photograph showing the results of Western plotting showing the reactivity between the monoclonal antibody 2D12 of the present invention and a serine proteinase serpin complex.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of Western plotting showing the reactivity of the monoclonal antibody 2D12 of the present invention with megsin transgenic rat kidney tissue.
  • FIG. 7 is a photograph showing a stained image by immunohistochemical staining of normal kidney glomeruli with the monoclonal antibody 2D12 of the present invention.
  • FIG. 8 is a photograph showing a comparison of stained images of normal kidney glomeruli with and without secondary antibody.
  • FIG. 9 is a photograph showing an electron microscopic image obtained by immunohistochemical staining of normal kidney glomeruli with the monoclonal antibody 2D12 of the present invention.
  • the present inventors have found that monoclonal antibody 2D 12 that recognizes a specific region of megsin protein binds to megsin protein localized in normal kidney mesangial cells, and the binding to the same region is reduced in glomerular disorders. I found out. That is, the present invention relates to a monoclonal antibody that recognizes a specific region of a megsin protein.
  • the region recognized by the monoclonal antibody of the present invention refers to a region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence of megsin protein. Therefore, the monoclonal antibody of the present invention is a monoclonal antibody that recognizes an epitope composed of a peptide having the amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 1.
  • Monoclonal antibody strength The recognition of an epitope composed of a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 can be confirmed by epitope mapping. For example, in Examples 3 and 4, epitopes that are recognized by monoclonal antibodies are identified using peptides having various amino acid sequence capabilities.
  • a monoclonal antibody against megsin can be obtained by a known method using human megsin or its domain peptide as an immunogen. The method for obtaining the monoclonal antibody will be specifically described later.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by selecting the obtained monoclonal antibody based on the evaluation method as described above.
  • a hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention for example, a hybridoma 2D12 cell can be shown.
  • Hypridoma 2D12 is a hybridoma that produces a monoclonal antibody that recognizes 129-134 (VDFTNHZ SEQ ID NO: 1) in the amino acid sequence constituting the megsin protein.
  • Monoclonal antibody 2D12 produced by Hypridoma 2D12 reacts with megsin protein localized in renal mesangial cells.
  • High Pridoma 2D12 is a patent biological deposit center in the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, located at 1st, 1st, 1st, Tsukuba, 1-chome Tsukuba, Ibaraki, Japan on December 22, 2004.
  • the deposit number is FERM BP-10527 under the Budapest Treaty. The information specifying the deposit is described below.
  • the isotype of the monoclonal antibody produced by this Hypridoma 2D12 cell line was IgG2a in the H chain.
  • the present invention also encompasses class switch variants of the above-described antibodies, such as isotype IgG3, IgGl, IgG2b and other immunoglobulin subclass variants, and such variants are obtained by the method of Martin et al. (Martin, C. et al .: J. Immunol. Methods., 145: 1118, 1991).
  • fragment containing an antigen binding region means a fragment having a partial force containing the antigen binding region of a monoclonal antibody.
  • F (ab '), Fab', Fab, Fv (v) means a fragment having a partial force containing the antigen binding region of a monoclonal antibody.
  • Antibody fragments such as /, ⁇ or dAb (single domain ant3 ⁇ 4ody) are included in the “fragment containing an antigen-binding region”.
  • F (ab ') and Fab' refer to immunoglobulin (monoclonal antibody), protein component
  • Pepsin which is a degrading enzyme, means an antibody fragment produced by treating with nopain or the like and digested before and after disulfide bonds existing between two H chains in the hinge region. For example, when IgG is treated with papain, it is cleaved upstream of the disulfide bond existing between the two heavy chains in the hinge region, resulting in V (light chain variable region) and C (light chain constant region). Region) force L chain and V (H chain variable region) binding y 1 ( ⁇ 1 region in H chain constant region)
  • a fragment containing an antigen-binding region can also be obtained by expressing DNA encoding the fragment.
  • cDNA encoding the antigen-binding region of an antibody can be amplified by PCR using the mRNA of the hyperidoma secreting the monoclonal antibody of the present invention as a saddle type.
  • the antigen-binding region of an antibody is composed of a highly variable complementarity determining region (CDR) and a relatively conserved frame region (FR)! Four FRs are arranged across three CDRs. Therefore, a cDNA encoding the entire variable region can be amplified using a primer encoding the N-terminal FR and a primer having a base sequence close to the variable region of the constant region and complementary to the portion.
  • the amino acid sequence encoded by the cDNA thus recovered may have a length different from that of the antibody fragment obtained by the enzymatic digestion described above. Furthermore, each molecule of VL and VH can be expressed as a single peptide via a linker to obtain scFv.
  • the structure of scFv is different from natural antibodies. However, if it contains an amino acid sequence including CDR and FR, the ability to bind to an antigen is maintained. Therefore, even a fragment having an amino acid sequence different from that of an antibody fragment obtained by enzymatic digestion, or a fragment having a different structure can be used as an antibody as long as the ability to bind to an antigen is maintained. That is, such an antibody fragment is also included in the fragment containing the antigen-binding region of the present invention.
  • the antibody fragment containing the antigen-binding region in the present invention can be bound to a labeling substance, an affinity substance, or can be used as a fusion protein, as long as the antigen-binding ability is maintained. .
  • These labeled antibody fragments and fusion proteins are included in the monoclonal antibody of the present invention.
  • the production of a monoclonal antibody against megsin protein requires megsin protein that can be used as an immunogenic antigen.
  • the megsin protein as an antigen can be obtained using a cultured cell such as a megsin protein-producing cell. Examples of megsin protein-producing cells include human kidney-derived cells.
  • This megsin protein-producing cell is cultured using a medium or culture method known in the art or substantially the same, and the megsin protein produced in the culture supernatant is subjected to, for example, ion exchange chromatography.
  • ion exchange chromatography Can be purified by chromatography and affinity chromatography using Z or polyclonal antibodies.
  • Recombinant megsin protein can also be used. Specifically, after transforming a host cell with a recombinant vector containing a gene fragment containing a base sequence encoding the amino acid sequence of megsin protein, this transformed host is cultured to obtain the amino acid sequence of megsin protein. Is produced, and the polypeptide is used as an immunogen.
  • Recombinant vectors containing megsin cDNA are prepared by ordinary gene recombination techniques, for example by insertion into plasmid vectors. As vectors, viruses such as vaccinia virus and baculovirus can be used in addition to plasmids and phages.
  • Hosts include prokaryotes such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, actinomycetes, etc., and commercially available cell lines such as various cells such as animal cells and CHO cells, and eukaryotes such as yeast, plant cells, and insect cells. Can be used.
  • prokaryotes include tributophan synthase operon and ratatosoperon.
  • promoters that can be used in eukaryotes include viral promoters, promoters for alcohol dehydrogenase, promoters for glycolytic enzymes, and the like.
  • the antigen can be obtained from various raw materials such as cultured cells, cultured tissues, transformed raw materials and other antigen-produced raw materials by using a conventionally known method such as salting out such as ammonium sulfate precipitation method, gel by sephadetus etc. Purification by filtration chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, dye gel chromatography, electrophoresis, dialysis, ultrafiltration, affinity chromatography, high performance liquid chromatography, etc. You can get it.
  • the megsin protein is a fragmented one, or a characteristic sequence region is selected based on the amino acid sequence deduced from the cloned and sequenced cDNA sequence, and the polypeptide is designed to chemistry.
  • the synthesized polypeptide fragment which may be a polypeptide fragment, is bound to various carrier proteins via an appropriate condensing agent to form a hapten-protein immunoconjugate, which is used to specify a specific fragment.
  • Monoclonal antibodies that can recognize only the sequence can also be designed.
  • a cysteine residue or the like is added to the polypeptide to be designed in advance so that an immunogenic conjugate can be easily prepared.
  • the present invention provides at least one monoclonal antibody that specifically binds to megsin protein localized in renal mesangial cells.
  • the monoclonal antibody according to the present invention is obtained by immunizing an animal using recombinant megsin as an immunogen, cell fusion between myeloma cells and antibody-producing cells, selection and monocloning of a hyperidoma, production of a monoclonal antibody, necessary Depending on the conditions, ascites can be produced by the following process.
  • the animal is immunized as follows, for example. Mammals such as rats and mice are immunized with human megsin protein purified according to a known method (Miyata, T. et al., J. Clin. Invest., 120: 828 (1998)). It is preferable to use an animal of the same strain as the partner's permanent proliferating cell for cell fusion.
  • the animal age is preferably 8-10 weeks for mice, for example. Sex may be either male or female.
  • a human immunoglobulin can be produced by using a transgenic animal in which an immunoglobulin gene is recombined with a human gene.
  • a method for obtaining a target reactive antibody using a transgenic animal in which the immunoglobulin gene is recombined with a human gene is known. I can get it like this
  • a immunoglobulin is a fully human immunoglobulin molecule, although it has gained animal power.
  • the immunization is carried out by mixing purified human megsin protein with an appropriate adjuvant (for example, Freund's complete adjuvant or hydroxyaluminum gel-pertussis vaccine, etc.) to obtain an emulsion, and then subcutaneously or abdominally Intravenous or intravenous administration. Thereafter, this immunization operation is performed 2 to 5 times at intervals of 1 to 2 weeks.
  • Final immunization is carried out by administering 0.5 to 2 g of human megsin protein into the peritoneal cavity of animals.
  • Polyclonal antibodies are obtained from the body fluids of animals immunized in this manner. Three to seven days after each immunization, blood is collected from the fundus venous plexus, and the antibody titer of the serum is measured. When the antibody titer rises sufficiently, antibody or antibody-producing cells are collected. The antibody titer against megsin can be measured by a technique such as ELISA. ELISA for measuring the antibody titer can be performed by adding serum to a plate coated with megsin and further collecting the labeled antibody against IgG of the immunized animal.
  • Examples of the adjuvant used together with the antigen include Freund's complete adjuvant, Ribi adjuvant, pertussis vaccine, BCG, ribosome, aluminum hydroxide, silica gel and the like.
  • animals such as mice such as Balb / c mice and FI mice can be used.
  • antibody-producing cells are also collected from animal forces immunized with human megsin protein.
  • Antibody-producing cells can be obtained from the spleen, lymph nodes, peripheral blood, etc., and the spleen is particularly preferable.
  • the spleen is aseptically removed, shredded in Minimal Essentia 1 Medium (MEM) medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical), disassembled with tweezers, and l, 200rpm x 5 minutes
  • MEM Minimal Essentia 1 Medium
  • the tumor cell line used prior to cell fusion can be selected, for example, from cell lines that do not produce immunoglobulins.
  • the ability to use any permanently proliferating cell as the partner's permanent proliferating cell to be fused is generally a myeloma cell (myeloma). I can. Permanently proliferating cells are preferably derived from the same animal species as the antibody-producing cells.
  • mice the following cell lines are known as bone tumor cell lines derived from 8-azaguanine resistant mice (Balb / c).
  • P3-X63Ag8-Ul P3-U1 (Current. Topics in Microbiol. Immunol, 81: 1, (1978))
  • SP2 / 0-Agl4 SP-2 / 0-Agl4 (SP-2) (Nature, 276: 269 (1978))
  • Cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed, for example, as follows.
  • the antibody-producing cells and the permanently proliferating cells obtained above are thoroughly washed with MEM medium or PBS, and mixed so that the number of cells is 5 to 10: 1.
  • HAT medium hyperxanthine normal medium of 100 ⁇ L / well to the culture plate (10- 4 M), thymidine (1.5 X 10- 5 M) and aminopterin (4 X 1 Medium) supplemented with 0 " 7 M), and further cultivate for 3 days. After that, remove half the volume of the culture supernatant every 3 days, add the same amount of HAT medium, and place in a 5% CO incubator.
  • HAT medium hyperxanthine normal medium of 100 ⁇ L / well to the culture plate (10- 4 M), thymidine (1.5 X 10- 5 M) and aminopterin (4 X 1 Medium) supplemented with 0 " 7 M
  • a hyperidoma culture supernatant is added to a solid phase on which megsin protein antigen is adsorbed directly or together with a carrier, and then an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or an enzyme is added.
  • the antibody titer can be measured by measuring the label.
  • the peptide having amino acid alignment ability described in SEQ ID NO: 1 can be used.
  • a hyperidoma that produces the monoclonal antibody of the present invention can be selected using a plate adsorbed with the peptide having the amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 1 as a solid phase.
  • a monoclonal antibody of the present invention can be produced by selecting an antibody whose binding is inhibited by a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 from monoclonal antibodies that bind to megsin protein. , You can also choose an hybridoma.
  • a microplate or the like is used for the solid phase.
  • the anti-immunoglobulin antibody when the cell used for cell fusion is a mouse, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used.
  • protein A can be added to detect the anti-megsin protein monoclonal antibody bound to the solid phase.
  • the antibody titer is measured by adding hypridoma culture supernatant to a solid phase adsorbed with anti-immunoglobulin antibody or protein A, and measuring megsin protein labeled with radioactive substances or enzymes. You can also.
  • a monoclonal antibody is produced by culturing the hyperidoma obtained as described above in vitro and in vivo.
  • the desired monoclonal antibody can be cultured in an appropriate medium such as an FCS-containing MEM medium or RPMI-1640 medium, and the culture supernatant can be obtained.
  • In vitro culture of the hyperidoma is preferably performed in a serum-free medium, and an optimal amount of antibody is given to the supernatant.
  • any animal is transplanted with a hybridoma.
  • the host animal for transplantation is preferably an animal of the same kind as the animal from which the spleen cells used for cell fusion were collected.
  • 2 to 4 ⁇ 10 6 anti-megsin protein monoclonal antibody-producing hybridoma cells obtained above are intraperitoneally administered to 8-10 week old Balb / c female mice treated with pristane.
  • the pristane treatment is performed, for example, by intraperitoneally administering 2,6,10,14-tetramethylpentadecane-pristane-0.5 mL and rearing for 2 weeks.
  • Ascites and culture supernatant are salted with 50% ammonium sulfate and dialyzed against PBS for 1-2 weeks.
  • the dialysis fraction is passed through a protein A sepharose column, and the IgG fraction is collected to obtain a purified monoclonal antibody.
  • This monoclonal antibody reacts specifically with megsin protein localized in renal glomerular epithelial cells.
  • the antibody isotype a commercially available kit (Gibco BRL, Mouse Antibody Isotyping Kit, etc.) is used, or the Octa Mouth (double immunodiffusion) method (introduction to immunological experiments, biochemical experimental methods 15, academic societies) Published by Publishing Center, p. 74, 1981).
  • the amount of protein is calculated by the phosphorin method and absorbance at 280 nm (1.4 (OD280) immunoglobulin 1 mg / mL).
  • each hybridoma is transplanted into the abdominal cavity of an animal having the same tissue compatibility as that of an animal derived from myeloma cells and allowed to proliferate, or each mouse and ibridoma are transplanted into nude mice, etc.
  • Monoclonal antibodies can be obtained.
  • the animal can be administered intraperitoneally with a mineral oil such as pristane before transplanting the hyperpridoma.
  • Ascites fluid can be purified as it is or by a conventional method.
  • salting-out such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration using cefadex, ion exchange chromatography, electrophoresis, dialysis, ultrafiltration, affinity chromatography, high performance liquid chromatography, etc.
  • ELISA method enzyme immunoassay
  • the monoclonal antibody of the present invention can specifically bind to the 129-134 site of human megsin protein localized in renal mesangial cells.
  • the megsin protein is localized means that the megsin protein is present at a high concentration.
  • megsin protein which directly expresses mesangial cell force, but also megsin protein expressed in cells other than mesangial cells is secreted outside the cell, It includes cases where it accumulates in cells.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used for immunostaining such as tissue or cell staining, immunoprecipitation, immunoblotting, immunoassay such as competitive or noncompetitive immunoassay, radioimmunoassay, ELISA, latex agglutination method, protein It can be used for purification, affinity column, etc.
  • the monoclonal antibody of the present invention exhibits a characteristic staining pattern in kidney tissue having glomerular damage. Therefore, the monoclonal antibody of the present invention is particularly useful for immunostaining.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used as a labeled antibody for use in immunostaining.
  • enzymes, enzyme substrates, coenzymes, enzyme precursors, apo-enzymes, fluorescent substances, dye substances, chemiluminescent compounds, luminescent substances, chromogenic substances, magnetic substances, metal particles, radioactive substances, etc. can be used.
  • a reaction between a thiol group and a maleimide group a reaction between a pyridyldisulfide group and a thiol group, a reaction between an amino group and an aldehyde group, and the like can be used.
  • an antibody fragment containing a variable region can be labeled and used for immunostaining.
  • the present invention provides such a cell, an hybridoma cell line, an immunoassay and a test kit. Also provide. Furthermore, the present invention provides a monoclonal antibody that specifically recognizes megsin protein localized in mesangial cells, an immunoassay for the detection and quantification of megsin characterized by using this antibody, and the immunoassay. Provide a test kit for Since the monoclonal antibody of the present invention shows a characteristic staining pattern in renal tissue having glomerular damage, it is very useful for diagnosis of glomerular damage.
  • Renal tissue in a living body can be collected by renal biopsy.
  • the binding level of the anti-megsin protein antibody in the mesangial cells of the tissue specimen can be detected by immunostaining of mesangial cells.
  • a preferred antibody in the test method of the present invention is an antibody that recognizes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 as an epitope.
  • a monoclonal antibody produced by a hybridoma deposited as FERM BP-10527 can be shown.
  • the antibody used in the test method of the present invention is useful as a test reagent for glomerular injury.
  • the test reagent is a reagent used in vitro for the purpose of detecting or diagnosing glomerular damage. That is, the present invention provides a diagnostic agent for glomerular disorder comprising the monoclonal antibody or a fragment containing the antigen-binding region thereof.
  • the antibody constituting the test reagent or diagnostic agent of the present invention can be labeled for easy detection.
  • a method for labeling and detecting an antibody with a fluorescent molecule, a luminescent molecule, an enzyme molecule, or a binding ligand is known.
  • antibody binding can be detected by combining a second antibody that recognizes and binds to an antibody that binds to the tissue. When a second antibody is combined, it is the second antibody that is labeled.
  • the antibody may be combined with a component necessary for detection of a label, a blocking agent useful for blocking a tissue sample, a positive sample, a negative sample, or the like to form a kit for examining glomerular injury. it can.
  • a kit for diagnosing glomerular injury comprising the following elements is provided.
  • a frozen section of mesangial cells or a fixed specimen can be used as a control specimen constituting the kit of the present invention.
  • the control mesangial cells can also be obtained from kidney tissues collected from humans and cultured cell lines.
  • stained images of various renal tissues stained with the antibody of the present invention can be combined with the kit of the present invention. Specific examples include stained images of normal kidney or kidney tissue having glomerular damage. Renal tissues with glomerular disorders include those from patients with membranous nephropathy, minimal change nephrosis, IgA nephropathy, lupus nephritis, diabetic nephropathy and the like.
  • E. coli expression-purified human recombinant megsin protein 10 g (fluid 50 1) was used as an immunogen per mouse.
  • 50 1 complete Freund's adjuvant (SI GMA: Cat. No. F-5881) and purified megsin protein solution (10 ⁇ g / 50 ⁇ 1) to a 1 ml syringe (Terumo: SS-01T) And 21 gauge needle (Terumo: NN-2138S) were mixed until completely emulsion to obtain an immunogen.
  • Mice (Balb / c) were immunized by injecting the above immunogen into the peritoneal cavity using a 26 gauge injection needle (Terumo: NN-2613S). Immunization was performed once a week for a total of 4 times.
  • 50-1001 blood samples were collected from the inferior vein of the mouse and the antibody titer was confirmed by ELISA.
  • lymphocytes prepared from the isolated mouse spleen were fused with mouse myeloma cells (P3U1) using polyethylene glycol (Wako Pure Chemicals: 162-0915).
  • IB hyperxanthine, aminopterin, thymidine: h -ypoxanthine® thymidine® SIGMA H-0137 aminopterin® SIGMA A-5159.
  • the clones having high reactivity with the immunizing antigen were screened by ELISA using the culture supernatant of erythrocytes and hybridomas.
  • the clones selected in the primary screening were subjected to a limiting dilution method and cloned until a single clone was established to establish a monoclonal hyperpridoma strain (2D12).
  • E. coli expression purified megsin protein was adjusted to a concentration of 2 ⁇ g / ml in 0.1 M carbonate buffer pH 9.0, and dispensed 50 1 per well of a 96-well microtiter plate (Nunc: Cat. No442404). 25 Allowed to stand at ° C for 3 hours (sensitization). After removing the solution, 1% BSA (Bovine Serum Albumin) solution (0.1 M carbonate buffer pH 9.0), 200 / zl was dispensed and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour (blocking).
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • HRP Horseradish Peroxidase
  • the absorbance at 450 nm was measured using a microtiter plate reader (ARVO-SX, manufactured by Samurai Rack Co., Ltd.).
  • Megsin protein 0.1 / zg was electrophoresed on a 12.5% gel SDS-PAGE according to a conventional method.
  • the semi-dry transfer device Biocraft: Cat. No. BE-300
  • the migrated protein was transferred to an Immobilon-P transfer membrane (Millipore: Cat. No. IPVH 078 50).
  • the membrane was blocked with Block Ace (Dainippon Pharmaceutical: Cat. No. UK-B25) (25 ° C, 1 hour), and then reacted with the Hypridoma culture supernatant at 25 ° C for 1 hour.
  • IsoStrip kit (Roche: Cat. No. 1 493 027) was used. Specifically, the sample culture supernatant diluted 150-fold with PBS is placed in the test tube attached to the kit, and the sample dilution in the test tube is sucked up with the supplied Strip. A band appears at a position that matches the subclass. As a result, the subclass was IgG2a ( Figure 1).
  • Example 2 Examination of reactivity of monoclonal antibody by Western blotting method Western plot analysis was performed to verify the antigen specificity of this antibody (Fig. 2).
  • Anti-megsin antibody 2D12 reacted with human megsin protein expressed in E. coli and human megsin protein expressed in CHO cells.
  • E. coli expression fragmented megsins were mixed with an equal amount of 2x loading buffer (Daiichi Kagaku) and heated in a boiling bath for 5 minutes to obtain a sample solution.
  • the sample solution was electrophoresed on 15-25% polyacrylamide gel (Daiichi Kagaku) using SDS electrophoresis apparatus (Daiichi Kagaku) and Tris-Glycine buffer (Daiichi Kagaku).
  • the membrane was reacted at 4 ° C with monoclonal antibody 2D12 diluted with an antibody diluent. After that, alkaline phosphatase-labeled anti-mouse IgG antibody was added, reacted for 1 hour at room temperature, developed color with NBT-BCIP solution, and a band reacting with 2D12 antibody was confirmed.
  • a synthetic peptide is solid-phased on a Kobalink plate by the amine coupling method.
  • Kidney tissue was embedded in OCT (Miles) using dry ice / n-hexane. It was sliced into 8 ⁇ m using a cryomicrotome (Leica). Collect in MAS-coated slide glass (Matsunami Co., Ltd.) and immediately fix with 4% paraformaldehyde / 0.1M sodium phosphate, pH 7.4 for 30 minutes, then 0.1M lysine / 0.1M sodium phosphate, pH 7. 4 / 0.15M sodium chloride was used to inhibit free aldehyde groups.
  • Kidney tissue was embedded in OCT (Miles) using dry ice / n-hexane. It was sliced into 8 ⁇ m using a cryomicrotome (Leica). Collect in MAS-coated slide glass (Matsunami) and immediately fix with 4% paraformaldehyde / 0.1M sodium phosphate, pH 7.4 for 30 minutes, then 0.1M lysine / 0.1M sodium phosphate, pH 7. 4 / 0.15M sodium chloride was used to inhibit free aldehyde groups.
  • FIG. 1 The results of staining of normal kidney tissue by immunoelectron microscopy are shown in FIG.
  • the D12 antibody was shown to detect megsin localized in normal kidney tissue mesangial cells (mainly cytoplasm). In addition, it was revealed that the cytoplasm of mesangial cells, especially those that were separated from nuclear power, were positive.
  • a monoclonal antibody having a recognition epitope different from a known antibody recognizing megsin is provided.
  • the monoclonal antibody of the present invention By combining the monoclonal antibody of the present invention with these known antibodies, it is possible to analyze in detail the changes in megsin expression and localization. As a result, it contributes to the classification of various kidney disorders and disease types.

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Abstract

　メサンギウム細胞に発現するメグシンタンパク質と反応するモノクローナル抗体およびその用途が提供された。例えば本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫組織染色などの手段によってメサンギウム細胞に局在しているメグシンタンパク質の染色強度を測定することにより、腎障害の病型診断が可能となった。

Description

明 細 書
抗メグシンモノクローナル抗体
技術分野
[0001] 本発明は、特定のセルピン（セリンプロテアーゼインヒビター）、すなわちメグシン (M egsin)の特定のェピトープに対して選択的に結合するモノクローナル抗体とその製造 法、および該モノクローナル抗体を用いる糸球体障害の診断方法、および Zまたは 診断のための組成物に関する。
背景技術
[0002] 腎不全は、腎疾患患者が最終的に至る病態である。その原因や経歴は一様ではな ぐ薬物中毒、感染症、悪性腫瘍、糖尿病、ループス腎炎などの本来腎臓以外の病 変により、腎障害が発症し、腎不全に至る場合も数多くみられる。
[0003] 腎臓の血液濾過作用や解毒作用が全く機能しない末期腎不全においては、腎移 植が唯一の治療手段である。しかし我が国においては、移植腎の供給体制が十分に 整備されているとは言い難い。また、移植療法自体に対する社会的認知も進んでい ない。我が国の腎移植例は、年間 700余症例に過ぎず、この数値はここ数年増加して いない。ゆえに腎代用療法としては透析療法が唯一の治療法であるのが現状である
[0004] 現在、我が国の末期腎不全透析患者は推定約 21万人を数え、人口あたりの患者 数では世界第一位である。一人あたりの平均的な治療費は年間約 600万円を必要と し、医療保険制度を圧迫する大きな原因のひとつとされている。また、毎週 2〜3日、 1 日 4〜6時間を透析治療のために拘束されることから、患者本人の社会的負担も大き い。
[0005] さらに、近年の人口の高齢ィ匕に伴い透析患者年齢も上昇しつつある。このため、腎 疾患を早期に診断し、治療し、腎不全への進展を防ぐ診断薬や薬剤の必要性が認 識されている。しかし、腎疾患領域は、創薬のための標的分子などの情報研究基盤 に乏しぐ有効な診断薬や医薬品が誕生しないのが現状である。
[0006] 本発明者らは、腎疾患の発症および進展等の機能に深く係わる組織として腎メサン ギゥム細胞に着目した。メサンギゥム細胞は腎臓以外では見られない臓器特異的な 細胞で、腎糸球体の構造や機能保持に重要な役割を担っていることはよく知られて いる。
[0007] また、糸球体障害時にはメサンギゥム細胞自身の増殖ゃメサンギサム細胞力 分泌 される細胞外マトリックスの増加などが認められることから、疾患の発症および進展に も深く関与する細胞であると推測されている。これらのことから腎疾患の分子メカニズ ムを解明するには、まずメサンギゥム細胞の生物学的特性を解明することが不可欠と 考えられる。しかし、メサンギゥム細胞に関する遺伝子レベルの特異性は明らかにさ れていなかった。
[0008] ヒトの生体内には約 60兆個もの細胞が存在し、これらは同一のゲノム DNAを有して いるが、個々の細胞、ひいては臓器が異なった生物学的性質を有するのは各細胞 や臓器に特異的に発現する遺伝子によるものと考えられている。
[0009] 本発明者らは、メサンギゥム細胞に発現する遺伝子群のプロファイルを明らかにす れば、メサンギゥム細胞に特異的な高発現遺伝子群を検出することが可能であると考 えた。そして、その中から腎疾患の状態に関与する遺伝子群を決定することもでき、 腎疾患の分子メカニズムを解明する糸口も見つかり、それに基づいた新しい腎疾患 の診断法や治療法の開発も可能になると考えた。そこで、本発明者らは、メサンギゥ ム細胞の遺伝子発現パターンを明らかにし、その細胞特性を遺伝子レベルで解析す ることを試みた。
[0010] まず本発明者らは、メサンギゥム細胞に発現する遺伝子を定量的に解析することを 目的として、培養ヒトメサンギゥム細胞力 mRNAを抽出して、 3'-directed cDNAライブ ラリーを作製した。そして、クローンに挿入された遺伝子断片の大規模 DNA配列決定 およびデータベース解析を施行した (非特許文献 1)。
[0011] その結果、メサンギゥム細胞で特に強く発現する遺伝子として、メグシンと命名した 全長 2,249bpからなる遺伝子を単離した。そして、メグシンの全長 cDNAクローンがコ ードする 380個のアミノ酸力 なるメグシンタンパク質を単離、取得することに成功した
[0012] 更に、 SwissProtアミノ酸配列データベースを用いて FASTAプログラムによるアミノ酸 ホモロジ一検索を行った。そして、メグシンタンパク質のアミノ酸配列中にセリンプロテ ァーゼインヒビター（セルピン： SERPIN)スーパーファミリー（非特許文献 2〜6)の生理 活性中心部位として重要な反応性ループ領域 (reactive loop site)内のコンセンサス 配列（EEGTEAAAATZ配列番号： 2)に類似の配列（EEGTEATAATZ配列番号： 3) が存在して 、ることを見出した。
[0013] すなわち、メグシンは、セルピンの構造的特徴を有し、他のセルピンと同様に活性 部位である反応性ループ領域（P17- P5'： EEGTEATAATGSNIVEKQLPQSZ配列番 号: 4)が存在する（非特許文献 7)。これらのことより、ヒトメグシンタンパク質力 セルピ ンに属するタンパク質であることを明らかにした (非特許文献 7)。そしてこれらの知見 を特許出願した (特許文献 1)。
[0014] また、 IgA腎症患者や糖尿病性腎症患者と健常人とで腎臓組織中のメグシンの発 現量を比較すると、 IgA腎症患者や糖尿病性腎症患者にぉ 、てメグシンの発現量が 有意に多い (非特許文献 7、 8)。また、ラットを用いた実験的メサンギゥム増殖性糸球 体腎炎モデル (Thy-1腎炎モデル）において、同様なメグシン発現量の上昇が認めら れた (非特許文献 9)。このことからメグシンの発現カ サンギゥム細胞の機能異常に 伴い変化し、疾患の発症および進展に深く関与していることが明らかになった。
[0015] メサンギゥムの機能におけるメグシンの役割をさらに理解するために、本発明者らは マウスゲノムでヒトメグシンの cDNAを過剰発現させた。 2系統のメグシントランスジェ- ックマウスが得られ、それらは、進行性のメサンギゥム基質の拡大、メサンギゥム細胞 の増殖、および免疫複合体沈着物の増加を示した (非特許文献 10、特許文献 2)。
[0016] これらの知見は、メグシンが、メサンギゥムの機能に生物学的に重要な影響を及ぼ すことを示している。興味深いことに、メグシンの単一遺伝子操作は、実験的およびヒ ト糸球体腎炎に存在する初期的なメサンギゥム病変を発生させることができる。このよ うに、動物個体においても、メグシンはメサンギゥム増殖性糸球体腎炎の発症に関与 することが報告されている。
[0017] 一方、腎障害においては、末期即ち腎不全近くになるまで顕著な自覚症状が現れ ないことから、その発生が見過ごされ易ぐ発症した時点では既に腎臓は回復不可能 なダメージを受けている場合が多い。従って、自覚症状の発現をみる前に、できる限 り初期の段階で腎障害を発見することが、腎不全への移行を防ぐために、また、透析 治療による保険財政圧迫を避けるためにも大切である。
[0018] 本発明者らは、腎疾患の確定診断および重症度を判定するためには、病態と密接 に関連した特異的なタンパク質を測定する必要があると考えた。そこで、本発明者ら は、前記メグシン遺伝子およびメグシンタンパク質に着目し、メグシンペプチド抗体を 用いた生体試料中のメグシンタンパク質を測定することからなる腎機能評価方法を確 立した (特許文献 3)。
特許文献 1：国際公開公報 99/15652号公報
特許文献 2：国際公開公報 01/24628号公報
特許文献 3：国際公開公報 00/57189号公報
非特許文献 l :Yasuda, Y. et al.， Kidney Int., 53: 154-158 (1998)
非特許文献 2 : Carrell, R.W. et al.， Trends Biochem. Sci" 10: 20 (1985)
非特許文献 3 : Carrell, R. W. et al, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, 52: 527 (1987)
非特許文献 4 : Kruithof, E. K. O. et al., Blood, 86: 4007 (1995)
非特許文献 5 : Potempa, J. et al., J. Biol. Chem., 269: 15957 (1994)
非特許文献 6 : Remold-0'Donnell. E.， FEBS Lett., 315: 105 (1993)
非特許文献 7 : Miyata, T. et al., J. Clin. Invest., 102: 828-836 (1998)
非特許文献 8 : Suzuki, D. et al" J. Am. Soc. Nephrol, 10: 2606 (1999)
非特許文献 9 : Nangaku, M. et al., Kidney Int., 60: 641 (2001)
非特許文献 10 : Miyata, T. et al., J. Clin. Invest., 109: 585 (2002)
非特許文献 11 : Inagi R, Miyata T, Suzuki D, Toyoda M, Wada T, Ueda Y, Izuhara Y
, Sakai H.Nangaku M, Kurokawa K. Specific tissue distribution of megsin, a novel se rpin, in the glomerulus and its up— regulation in IgA nephropathy. Biochem Biophys
Res Commun 2001; 286: 1098-106
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0019] 以上述べたように、抗メグシンタンパク質抗体を用いた糸球体障害の診断方法は、 腎障害の早期診断および病態の進展度の判定に極めて有用な手段である。本発明 の目的は、抗メグシンタンパク質抗体を利用して、病態特異的な診断剤を提供するこ とである。
課題を解決するための手段
[0020] 本発明者らは、様々な組織および細胞をノーザンプロットおよび逆転写ポリメラーゼ 連鎖反応で分析したところ、メグシンは、ヒト繊維芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、ケ ラチノサイトでは発現が弱ぐメサンギゥム細胞で特に強く発現していることが判った。 これらの知見はさらに in situハイブリダィゼーシヨン（Miyata, T. et al., J. Clin. Invest. , 102: 828 (1998)、 Suzuki, D. et al., J. Am. Soc. Nephrol, 10: 2606 (1999))およびメ グシン抗体を用いた免疫組織化学法（Inagi, R. et al., Biochem. Biophys. Res. Com mun., 286: 1098 (2001))により確認された。
[0021] 従って、メグシンタンパク質に対し、特異性に優れた抗体 (モノクローナル抗体)を 見出し、特定することは、腎障害の生物学的性質の解明、腎疾患の原因の究明、ひ いては、腎疾患の治療、診断等に有効である。
[0022] 本発明者らはこれまでに、組換えメグシンタンパク質を免疫原に用いてメグシンタン ノ ク質を認識する抗体を得ている。例えば、本発明のモノクローナル抗体と異なるェ ピトープを認識するモノクローナル抗体 4F3である。本発明において、本発明者らは、 糸球体メサンギゥム細胞に局在するメグシンタンパク質と反応するモノクローナル抗 体 2D12を見出し、そのェピトープ（129-134:VDFTNHZ配列番号： 1)を決定した。
[0023] 一方、モノクローナル抗体 4F3は、腎糸球体上皮細胞に局在するメグシンタンパク 質を認識する。また、糸球体上皮細胞に局在するメグシンタンパク質の局在パターン も病型によって異なる。よって、本発明のモノクローナル抗体 2D12と 4F3抗体とを組み 合わせることで、病型の分類に貢献する。
[0024] メグシンペプチドに対するモノクローナル抗体 (WO 00/57189)や、メグシンタンパク 質の反応性ループ領域（P17- P5'： EEGTEATAATGSNIVEKQLPQSZ配列番号： 4) 内のェピトープと特異的に結合する抗体 (WO 03/084998)は公知である。し力し、い ずれも病型との関連性は知られていない。更に、糸球体障害時にメサンギゥム細胞 に局在するメグシンタンパク質に対する反応性にっ 、ての知見は確認されて 、なか つた。本発明によるモノクローナル抗体は、正常時と糸球体障害時においてメサンギ ゥム細胞に局在するメグシンタンパク質と異なる結合性を示す。すなわち、本発明は 以下のモノクローナル抗体、ならびにその用途に関する。
[1] FERM BP- 10527として寄託されたハイブリドーマ 2D12。
〔2〕 FERM BP-10527として寄託されたハイブリドーマ 2D12が産生するモノクローナル 抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
[3] FERM BP- 10527として寄託されたハイブリドーマ 2D12を培養し、培養物に含まれ るィムノグロブリンを回収する工程を含む、モノクローナル抗体、またはその抗原結合 領域を含む断片の製造方法。
〔4〕以下の工程を含む糸球体障害の検査方法。
(1)生体力 採取された腎臓組織標本におけるメサンギゥム細胞に対する〔2〕に記載 のモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片の結合レベルを測定す る工程、および
(2)正常腎組織と比較して、抗メグシンタンパク質抗体の結合レベルが低下して!/、る 場合に、糸球体障害が検出される工程
[5]〔2〕に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を含む 糸球体障害の診断剤。
発明の効果
[0025] 本発明のモノクローナル抗体 2D12は、糸球体メサンギゥム細胞に局在するメグシン タンパク質と反応する。よって、例えば免疫組織染色などの手段により、該抗体を用 いた腎組織の染色パターンを比較することにより、腎疾患の病型診断が可能となる。 図面の簡単な説明
[0026] [図 l]Roche社製 IsoStrip kitを用いたモノクローナル抗体 2D12のアイソタイプを示す 写真である。
[図 2]本発明のモノクローナル抗体 2D12とヒトメグシンタンパク質との反応性を表す、 ウェスタンプロット法の結果を示す写真である。
[図 3]本発明のモノクローナル抗体 2D12と種差の異なるメグシンタンパク質との反応 性を表す、ウェスタンプロット法の結果を示す写真である。 [図 4]本発明のモノクローナル抗体 2D12とメグシンタンパク質以外のセルピンとの交 差反応性を表す、ウェスタンプロット法の結果を示す写真である。
[図 5]本発明のモノクローナル抗体 2D12とセリンプロテア一ゼ'セルピン複合体との反 応性を表す、ウェスタンプロット法の結果を示す写真である。
[図 6]本発明のモノクローナル抗体 2D12のメグシントランスジエニックラット腎臓組織と の反応性を表す、ウェスタンプロット法の結果を示す写真である。
[図 7]本発明のモノクローナル抗体 2D12による、正常腎糸球体の免疫組織染色によ る染色像を示す写真である。
[図 8]—次抗体の有無による、正常腎糸球体の染色像の比較を示す写真である。
[図 9]本発明のモノクローナル抗体 2D12による、正常腎糸球体の免疫組織染色によ る電子顕微鏡像を示す写真である。
発明を実施するための最良の形態
[0027] 本発明者らは、メグシンタンパク質の特定の領域を認識するモノクローナル抗体 2D 12が、正常腎メサンギゥム細胞に局在するメグシンタンパク質と結合し、糸球体障害 において同じ領域に対する結合が低下することを見出した。すなわち本発明は、メグ シンタンパク質の特定の領域を認識するモノクローナル抗体に関する。本発明のモノ クローナル抗体が認識する領域は、メグシンタンパク質のアミノ酸配列中、特に配列 番号： 1に記載のアミノ酸配列からなる領域をいう。従って本発明のモノクローナル抗 体は、配列番号： 1に記載のアミノ酸配列力 なるペプチドによって構成されるェピト ープを認識するモノクローナル抗体である。
[0028] モノクローナル抗体力 配列番号： 1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドによつ て構成されるェピトープを認識することは、ェピトープマッピングによって確認すること ができる。たとえば実施例 3および 4においては、様々なアミノ酸配列力もなるぺプチ ドを用いて、モノクローナル抗体が認識するェピトープを特定して 、る。
[0029] メグシンに対するモノクローナル抗体は、ヒトのメグシンまたはそのドメインペプチド を免疫原として、公知の方法によって得ることができる。モノクローナル抗体の取得方 法は、後に具体的に述べる。得られたモノクローナル抗体を、上記のような評価方法 に基づいて選択することによって、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。 [0030] 本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして、たとえばノヽイブリドー マ 2D12細胞を示すことができる。ハイプリドーマ 2D12は、メグシンタンパク質を構成す るアミノ酸配列中、 129-134 (VDFTNHZ配列番号： 1)を認識するモノクローナル抗 体を産生するハイブリドーマである。ハイプリドーマ 2D12が産生するモノクローナル抗 体 2D 12は、腎メサンギゥム細胞に局在するメグシンタンパク質と反応する。
[0031] ハイプリドーマ 2D12は、 2004年 12月 22日付けで日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1 番 1号中央第 6に所在の独立行政法人産業技術総合研究所内特許生物寄託センタ 一に対して、ブダペスト条約に基づいて受託番号 FERM BP-10527として寄託されて いる。以下に、寄託を特定する情報を記載する。
(a)寄託機関の名称'あて名
名称:独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
あて名：日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 1号中央第 6 (郵便番号 305-8566)
(b)寄託日：平成 16年 12月 22日
(c)受託番号： FERM BP-10527
[0032] このハイプリドーマ 2D12細胞株が産生するモノクローナル抗体のアイソタイプは、 H 鎖は IgG2aであった。本発明はまた、上記抗体のクラススィッチ変異体、例えば、アイ ソタイプ IgG3、 IgGl、 IgG2bおよびその他の免疫グロブリンサブクラスに属する変異体 等を包合し、その様な変異体は、 Martinらの方法により作成することができる (Martin, C. et al.:J.Immunol.Methods. , 145:1118,1991)。
[0033] 本発明にお ヽて、「抗原結合領域を含む断片」とは、モノクローナル抗体の抗原結 合領域を含む一部分力もなる断片を意味する。具体的には F(ab')、 Fab'、 Fab, Fv (v
2
ariable fragment of antibody)、 sFv、 dsFv(disulphide stabilised Fv)める！/、 ίま dAb (sing le domain ant¾ody)などの抗体断片が、「抗原結合領域を含む断片」に含まれる。
[0034] ここで、「F(ab')」及び「Fab'」とは、ィムノグロブリン（モノクローナル抗体）を、蛋白分
2
解酵素であるペプシンある 、はノパイン等で処理することにより製造され、ヒンジ領域 中の 2本の H鎖間に存在するジスルフイド結合の前後で消化されて生成される抗体 断片を意味する。例えば、 IgGをパパインで処理すると、ヒンジ領域中の 2本の H鎖間 に存在するジスルフイド結合の上流で切断されて V (L鎖可変領域)と C (L鎖定常領 域)力 なる L鎖、及び V (H鎖可変領域)とじ y 1 (H鎖定常領域中の γ 1領域)とか
Η Η
らなる Η鎖フラグメントが C末端領域でジスルフイド結合により結合した相同な 2つの 抗体フラグメントを製造することができる。これら 2つの相同な抗体断片を各々 Fab'と いう。また IgGをペプシンで処理すると、ヒンジ領域中の 2本の H鎖間に存在するジス ルフイド結合の下流で切断されて前記 2つの Fab'がヒンジ領域でつながったものより やや大きい抗体フラグメントを製造することができる。この抗体断片は、 F(ab')と呼ば
2 れる。
[0035] 抗原結合領域を含む断片は、当該断片をコードする DNAを発現させることによって 得ることもできる。たとえば、本発明のモノクローナル抗体を分泌するハイプリドーマ の mRNAを铸型として、抗体の抗原結合領域をコードする cDNAを PCRによって増幅 することができる。抗体の抗原結合領域は、可変性の高い相補性決定領域 (CDR)と、 比較的保存性の高 、フレーム領域 (FR)によって構成されて!、る。 4つの FRが 3つの C DRをはさんで配置されている。そのため、 N末端の FRをコードする部分と、定常領域 の可変領域に近 、部分に相補的な塩基配列を有するプライマーを使って、可変領 域全体をコードする cDNAを増幅することができる。
[0036] このようにして回収される cDNAがコードするアミノ酸配列は、先に述べた酵素的な 消化によって得られる抗体断片とは異なる長さを有する可能性がある。更に、それぞ れ 1分子の VLと VHをリンカ一を介して 1本のペプチドとして発現させることによって、 s cFvとすることもできる。 scFvの構造は天然の抗体とは異なっている。し力し、 CDRと F Rを含むアミノ酸配列を含んでいれば、抗原との結合能は維持される。したがって、酵 素的な消化によって得られる抗体断片と異なるアミノ酸配列力もなる断片、あるいは 異なる構造を持つ断片であっても、抗原との結合能を維持する限り、抗体として利用 することができる。つまりこのような抗体断片も、本発明の抗原結合領域を含む断片 に含まれる。
更に本発明における抗原結合領域を含む抗体の断片は、抗原との結合能を維持 する限り、必要に応じて、標識物質や、親和性物質と結合させたり、あるいは融合蛋 白質とすることができる。これらの標識された抗体断片や融合蛋白質は、本発明のモ ノクローナル抗体に含まれる。 [0037] メグシンタンパク質に対するモノクローナル抗体の作製には、免疫原性抗原として 使用できるメグシンタンパク質が必要である。抗原としてのメグシンタンパク質は、培 養細胞、例えばメグシンタンパク質産生細胞を用いて得ることができる。メグシンタン パク質産生細胞としては、例えばヒト腎由来細胞等が挙げられる。このメグシンタンパ ク質産生細胞は、当該分野で知られた、あるいはそれらと実質的に同様な培地や培 養方法を用いて培養し、培養上清中に産生されるメグシンタンパク質を例えばイオン 交換クロマトグラフィーおよび Zまたはポリクローナル抗体を使用したァフィ-ティーク 口マトグラフィ一により精製することができる。
[0038] また、組換えメグシンタンパク質も用いることができる。具体的には、メグシンタンパ ク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子断片を含む組換えベクター により宿主細胞を形質転換した後、この形質転換宿主を培養して、メグシンタンパク 質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを製造し、該ポリペプチドを免疫原として使用す るものである。メグシンの cDNAを含む組換えベクターは、通常の遺伝子組換え手法 により、例えばプラスミドベクターに挿入することによって作製される。ベクターとして は、プラスミドやファージの他に、ワクシニアウィルス、バキュロウィルス等のウィルスも 使用できる。
[0039] 宿主としては、例えば大腸菌、枯草菌、放線菌等の原核生物、ならびに各種細胞、 例えば動物細胞、 CHO細胞等の市販の細胞株ならびに酵母、植物細胞、昆虫細胞 等の真核生物を用いることができる。また、原核生物に使用できるプロモーターとして は、例えばトリブトファン合成酵素オペロン、ラタトースォペロン等を用いることができ る。真核生物に使用できるプロモーターとしては、例えば、ウィルスプロモーター、ァ ルコールデヒドロゲナーゼに対するプロモーター、解糖系酵素に対するプロモーター 等がある。また、マルチクロー-ングサイト、プロモーター、耐性遺伝子、複製開始点 、ターミネータ一、リボソーム結合部位等を有する市販のベクターあるいはプラスミドも 使用することができる。耐性遺伝子には、テトラサイクリン、アンピシリン、ネオマイシン に対するもの等がある。この様にして調製されたメグシンタンパク質は、更に免疫原 性コンジュゲートとしてもよいが、そのまま適当なアジュバントと混合して動物を免疫 するのに使用できる。 [0040] このように、抗原は、各種原料、例えば培養細胞、培養組織、形質転換細胞等の抗 原産生原料から従来公知の方法、例えば硫酸アンモニゥム沈殿法等の塩析、セファ デッタス等によるゲル濾過クロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎 水性クロマトグラフィー法、色素ゲルクロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外 濾過法、ァフィユティークロマトグラフィー法および高速液体クロマトグラフィー法等に より精製して得ることがでさる。
[0041] さらに、メグシンタンパク質は、それを断片化したもの、あるいはクローユングされ、 配列決定された cDNA配列から推定されるアミノ酸配列に基づき特徴的な配列領域 を選び、ポリペプチドをデザインして化学合成し、得られたポリペプチド断片であって もよぐその断片を適当な縮合剤を介して種々の担体蛋白質類と結合させてハプテ ン-蛋白質の免疫コンジュゲートとし、これを用いて特定の配列のみを認識できるモノ クローナル抗体をデザインすることもできる。デザインされるポリペプチドには予めシ スティン残基等を付加し、免疫原性コンジュゲートの調製を容易にできるようにするこ とがでさる。
[0042] 本発明では腎メサンギゥム細胞に局在するメグシンタンパク質に特異的に結合する 少なくとも 1種のモノクローナル抗体を提供する。本発明にカゝかるモノクローナル抗体 は、組換えメグシンを免疫原として動物を免役した後、ミエローマ細胞と抗体産生細 胞との細胞融合、ハイプリドーマの選択およびモノクローン化、モノクローナル抗体の 製造、必要に応じて腹水化と 、つた工程で作製できる。
[0043] 動物の免疫は、例えば次のように行う。公知の方法（Miyata, T. et al.， J. Clin. Inves t.， 120: 828 (1998))に従って精製したヒトメグシンタンパク質をラット、マウスなどの哺 乳類動物に免疫する。哺乳類動物は細胞融合する際の相手の永久増殖性細胞と同 系統の動物を用いるのが好ましい。動物の週令は、例えばマウスでは 8〜10週令が 好適である。性は雌雄何れでも構わない。
[0044] 免疫動物として、ィムノグロブリン遺伝子をヒトの遺伝子に組み換えたトランスジェ- ック動物を用いることにより、ヒトのィムノグロブリンを産生させることもできる。ィムノグ ロブリン遺伝子をヒトの遺伝子に組み換えたトランスジエニック動物を用いて、 目的と する反応性を有する抗体を得る方法は公知である。このようにして得ることができるィ ムノグロブリンは、動物力 得られたものながら、完全にヒトのィムノグロブリン分子で ある。
[0045] 免疫の方法は、精製したヒトメグシンタンパク質を適当なアジュバント（例えばフロイ ント完全アジュバントまたは水酸ィ匕アルミニウムゲル-百日咳菌ワクチンなど）と混合し ェマルジヨンとした後、動物の皮下、腹腔内、静脈内などに投与する。以後、この免 疫操作を 1〜2週間間隔で 2〜5回行う。最終免疫は、 0.5〜2 gのヒトメグシンタンパク 質を動物の腹腔内に投与することにより行う。
[0046] このようにして免疫した動物の体液からは、ポリクローナル抗体が得られる。各免疫 操作後 3〜7日後に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を測定し、抗体価が充 分上昇したとき、抗体または抗体産生細胞を採取する。メグシンに対する抗体価は、 ELISA等の手法によって測定することができる。抗体価を測定するための ELISAは、メ グシンをコートしたプレートに血清を加え、更に免疫動物の IgGに対する標識抗体を カロえることにより実施することができる。
[0047] 抗原と共に用いられるアジュバントとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビ アジュバント、百日咳ワクチン、 BCG、リボソーム、水酸化アルミニウム、シリカゲル等 が挙げられる。免疫は、例えば Balb/cマウス、 FIマウス等のマウスをはじめとする動物 を使用することができる。
[0048] 上記のようにヒトメグシンタンパク質で免疫した動物力も抗体産生細胞を採取する。
抗体産生細胞は、脾臓、リンパ節、末梢血など力 得ることができるが、特に脾臓が 好ましい。例えば、最終免疫の 3〜4日後に脾臓を無菌的に摘出し、 Minimal Essentia 1 Medium (MEM)培地（日水製薬製）中で細断し、ピンセットで解し、 l,200rpm X 5分 間の条件で遠心分離させた後、上清を除き、トリス-塩酸緩衝液 (PH7.65)で 1〜2分 間処理して赤血球を除去し、さらに MEM培地で 3回洗浄して細胞融合用脾臓細胞を 得る。
[0049] 細胞融合前には、まず使用される腫瘍細胞株の調製をしておく必要がある。細胞 融合前に使用される腫瘍細胞株は、たとえば免疫グロブリンを産生しない細胞株から 選択することができる。融合される相手方の永久増殖性細胞には、永久増殖性を有 する任意の細胞を用いることができる力 一般的には骨髄腫細胞 (ミエローマ）が用 いられる。永久増殖性細胞は抗体産生細胞と同種の動物由来のものを用いるのが望 ましい。
[0050] 例えばマウスの場合、 8-ァザグァニン耐性マウス (Balb/c)由来骨腫瘍細胞株として 次のような細胞株が知られて 、る。
P3-X63Ag8-Ul (P3-U1) (Current. Topics in Microbiol. Immunol, 81: 1, (1978))
P3/NS1/1— Ag4— 1 (NS— 1) (Eur. J. Immunol., 6: 511 (1976))
SP2/0-Agl4 (SP-2) (Nature, 276: 269 (1978))
P3- X63- Ag8653 (653) (J. Immunol, 123: 1548 (1979))
P3- X63- Ag8 (X63) (Nature, 256: 495 (1975))
[0051] これらの永久増殖性細胞株は、 8-ァザグァニン培地（RPMI-1640培地にグルタミン
(1.5mM)、 2-メルカプトエタノール（5 X 10— 5M)、ゲンタマイシン（10 μ g/mL)およびゥ シ胎児血清 (FCS、 CLS製）（10%)をカ卩えた正常培地に、さらに 8-ァザグァニン（15 g/mL)を加えた培地)で継代培養し、細胞融合の 3〜4日前に正常培地に継代し、融 合当日 2 X 107個以上の細胞数を確保する。
[0052] 抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合は例えば次のように行う。上記で得ら れた抗体産生細胞および永久増殖性細胞を MEM培地または PBSでよく洗浄し、細胞 数が 5〜10 : 1の比になるように混合する。 l,200rpm X 5分間遠心分離した後、上清を 除き、沈殿した細胞群をよく解した後、攪拌しながら 37°Cに保ちつつ、細胞融合剤と してポリエチレングリコール- 1000 (PEG-1000) l〜4g、 MEM培地 l〜4mLおよび細胞 融合促進剤としてジメチルスルホキシド 0.5〜1.0mLの混液 0.1〜1.0mL/108個細胞を 加えて細胞融合を起こさせる。
[0053] その後、 10分毎に MEM培地 3mLを数回添カ卩し、 MEM培地を全量が 50mLになるよう に加えて希釈し、細胞融合を停止させる。次に、遠心分離（l,500rpm X 5分間）して上 清を除去し、緩やかに細胞を解した後、正常培地（RPMI-1640培地、 10%FCS) 100m Lをカ卩え、メスピペットによるピペッティングで緩やかに細胞を懸濁する。
[0054] この懸濁液を 96ゥエルの培養用プレートに 100 μ L/wellずつ分注し、 5%COインキ
2 ュベータ一中、 37°Cで 3〜5日間培養する。培養プレートに 100 μ L/wellの HAT培地（ 正常培地にヒポキサンチン（10— 4M)、チミジン（1.5 X 10— 5M)およびアミノプテリン（4 X 1 0"7M)を添加した培地）を加え、さらに 3日間培養する。以後 3日間毎に培養上清の半 容量を除去し、新たに同量の HAT培地を加え、 5%COインキュベータ一中、 37°Cで
2
約 2週間培養する。
[0055] 融合細胞がコロニー状に生育しているのが認められるゥエルについて、上清の半 容量を除去し、 HT培地 (HAT培地力もアミノプテリンを除いたもの）を同量カ卩え、 4日 間培養する。培養上清の一部を採取し、前述の ELISAによりメグシンタンパク質に対 する抗体価を測定する。
[0056] より具体的には、例えばメグシンタンパク質抗原を直接又は担体と共に吸着させた 固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗 免疫グロブリン抗体を加え、標識を測定することによって抗体価を測定することができ る。本発明のモノクローナル抗体を得るための抗原としては、配列番号： 1に記載のァ ミノ酸配列力もなるペプチドを用いることができる。より具体的には、配列番号： 1に記 載のアミノ酸配列力 なるペプチドを吸着させたプレートを固相として、本発明のモノ クローナル抗体を産生するハイプリドーマを選択することができる。あるいは、メグシン タンパク質に結合するモノクローナル抗体の中から、配列番号： 1に記載のアミノ酸配 列からなるペプチドによってその結合が阻害される抗体を選択することにより、本発 明のモノクローナル抗体を産生するノ、イブリドーマを選択することも出来る。 固相に は、マイクロプレート等が用いられる。また抗免疫グロブリン抗体としては、細胞融合 に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる。その 他、標識抗体に代えて、プロテイン Aを加え、固相に結合した抗メグシンタンパク質モ ノクローナル抗体を検出することもできる。更に、抗免疫グロブリン抗体またはプロテ イン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素など で標識したメグシンタンパク質をカ卩えることによって、抗体価を測定することもできる。
[0057] メグシンタンパク質に反応する抗体の産生が観察されたゥエルにつき、限界希釈法 によりクローユングを 4回繰り返し、安定したメグシンタンパク質の抗体価を示すものを 抗メグシンタンパク質モノクローナル抗体産生ハイプリドーマ株として選択する。また 、糸球体障害を有する腎組織には、特有の染色パターンが見られる。従って、さらに 好ましくは、糸球体障害を有する腎組織を染色した結果、染色パターンが糸球体障 害に特有なパターンを示す抗体を産生するハイブリドーマ株を選択する。
[0058] 上記のようにして得られたハイプリドーマを in vitroおよび in vivoで培養することによ りモノクローナル抗体を産生させる。所望のモノクローナル抗体を、 FCS含有 MEM培 地、 RPMI-1640培地等の適当な培地中で培養し、その培養上清力 得ることができる 。ハイプリドーマの in vitroでの培養は、好ましくは無血清培地中で行われ、至適量の 抗体をその上清に与える。
[0059] in vivoで培養する場合、任意の動物にノヽイブリドーマを移植する。移植のための宿 主動物は、細胞融合に用いた脾臓細胞を採取した動物と同種の動物を使用するの が好ましい。例えば、プリスタン処理をした 8〜10週令の Balb/c雌マウスに上記で得ら れた抗メグシンタンパク質モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞の 2〜4 X 106個 /匹腹腔内投与する。プリスタン処理は、たとえば 2,6, 10, 14-テトラメチルペンタデカン -プリスタン- 0.5mLを腹腔内投与し、 2週間飼育することにより行われる。 2〜3週間で マウスの腹腔内にモノクローナル抗体を高濃度に含んだ腹水が貯留し腹部が肥大し てくる。このマウス力 腹水を採取し、遠心分離 (3,000rpm X 5分間）して固形分を除 去し、 IgGを精製する。
[0060] 腹水や培養上清を 50%硫酸アンモ-ゥムを用いて塩祈し、 PBSで 1〜2週間透析す る。この透析画分をプロテイン Aセファロースカラムに通し、 IgG画分を集め、精製モノ クローナル抗体を得る。このモノクローナル抗体は、腎糸球体上皮細胞に局在するメ グシンタンパク質と特異的に反応する。
[0061] 抗体のアイソタイプは、市販のキット（Gibco BRL製、 Mouse Antibody Isotyping Kit 等)を用いるか、またはォクタ口ニイ（二重免疫拡散)法 (免疫学実験入門，生物化学 実験法 15,学会出版センター刊， 74頁， 1981年）により決定した。タンパク質量は、フ オーリン法および 280nmにおける吸光度（1.4 (OD280)ィムノグロブリン lmg/mL)により 算出する。
[0062] 大量のモノクローナル抗体を得るにはノ、イブリドーマの腹水化を利用することがで きる。この場合、ミエローマ細胞由来の動物と同系の組織適合性のある動物の腹腔 内に各ハイブリドーマを移植し、増殖させるか、あるいはヌードマウスなどに各ノ、イブ リドーマを移植し、腹水中に産生されたモノクローナル抗体を得ることができる。 [0063] 動物は、ハイプリドーマを移植する前にプリスタンなどの鉱物油を腹腔内に投与し ておくことができる。腹水液はそのままあるいは常法により精製することができる。例え ば、硫酸アンモ-ゥム沈殿法などの塩析、セフアデックス等によるゲル濾過法、イオン 交換クロマトグラフィー、電気泳動、透析、限外濾過法、ァフィユティークロマトグラフィ 一、高速液体クロマトグラフィー法等により精製することができる。上記のようにして得 られたモノクローナル抗体の特性は、例えば、酵素免疫測定法 (ELISA法)等により明 らかにすることができる。
[0064] 本発明のモノクローナル抗体は、腎メサンギゥム細胞に局在するヒトメグシンタンパ ク質の 129-134の部位と特異的に結合することができる。
[0065] 本発明にお 、て「メグシンタンパク質が局在する」とは、メグシンタンパク質が高濃度 で存在している状態にあることを表している。また、「腎メサンギゥム細胞に局在する」 という場合は、メサンギゥム細胞力も直接発現されるメグシンタンパク質のみならず、メ サンギゥム細胞以外の細胞で発現したメグシンタンパク質が細胞外に分泌され、メサ ンギゥム細胞中に蓄積される場合も含む。
[0066] 本発明のモノクローナル抗体は、免疫染色、例えば組織あるいは細胞染色、免疫 沈降、ィムノブロット、ィムノアツセィ、例えば競合型または非競合型ィムノアツセィ、ラ ジォィムノアツセィ、 ELISA、ラテックス凝集法、蛋白精製、ァフィユティーカラム等に 使用することができる。特に本発明のモノクローナル抗体は、糸球体障害を有する腎 組織において特有の染色パターンを示す。従って本発明のモノクローナル抗体は、 特に免疫染色に有用である。
[0067] 本発明のモノクローナル抗体は、免疫染色に用いるために標識抗体とすることがで きる。抗体を標識化するものとして、酵素、酵素基質、補酵素、酵素前駆体、アポ酵 素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、発光物質、発色物質、磁気物 質、金属粒子、放射性物質等を用いることができる。標識するには、チオール基とマ レイミド基の反応、ピリジルジスルフイド基とチオール基の反応、ァミノ基とアルデヒド 基の反応等を利用することができる。また、可変領域を含む抗体断片を標識して免 疫染色に使用することもできる。
[0068] 従って、本発明は、この様なノ、イブリドーマ細胞系、ィムノアッセィおよび検査キット をも提供する。さらに、本発明はメサンギゥム細胞に局在するメグシンタンパク質を特 異的に認識するモノクローナル抗体、この抗体を用いることを特徴とするメグシンの検 出ならびに定量のためのィムノアツセィ、およびこのィムノアツセィを実施するための 検査キットを提供する。本発明のモノクローナル抗体は、糸球体障害を有する腎組織 において特有の染色パターンを示すことから、糸球体障害の病型診断に非常に有用 である。
[0069] 生体の腎組織は、腎生検によって採取することができる。一方、組織標本のメサン ギゥム細胞における抗メグシンタンパク質抗体の結合レベルは、メサンギゥム細胞の 免疫染色によって検出することができる。本発明の検査方法において好ましい抗体 は、配列番号： 1に記載のアミノ酸配列をェピトープとして認識する抗体である。この ような抗体として、たとえば FERM BP-10527として寄託されたハイブリドーマが産生す るモノクローナル抗体を示すことができる。
[0070] 本発明の検査方法に用いられる前記抗体は、糸球体障害の検査用試薬として有 用である。本発明において、検査用試薬とは、糸球体障害の検出、あるいは診断を 目的として生体外 (in vitro)で用いられる試薬である。すなわち本発明は、前記モノク ローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を含む糸球体障害の診断剤を 提供する。
本発明の検査用試薬あるいは診断剤を構成する抗体は、検出を容易にするために 標識しておくことができる。たとえば、蛍光分子、発光分子、酵素分子、あるいは結合 性リガンド等によって抗体を標識し、検出する方法が公知である。あるいは、組織に 結合する抗体を認識して結合する第 2抗体を組み合わせて、抗体の結合を検出する こともできる。第 2抗体を組み合わせる場合には、標識されるのは第 2抗体である。
[0071] 前記抗体は、標識の検出に必要な成分、組織標本のブロッキングに有用なブロッ キング剤、陽性標本、あるいは陰性標本等と組み合わせて、糸球体障害の検査用キ ットとすることができる。本発明の好ましい態様において、次の要素を含む、糸球体障 害の診断用キットが提供される。
(1)本発明のモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、および
(2)正常腎メサンギゥム細胞および糸球体腎障害を有する腎のメサンギゥム細胞の、 いずれか、または両方を含む対照標本
本発明のキットを構成する対照標本には、メサンギゥム細胞の凍結切片や固定標 本を利用することができる。対照とするメサンギゥム細胞は、ヒトから採取された腎組 織や、培養細胞株力も得ることができる。更に、本発明のキットには、本発明の抗体 によって染色された種々の腎組織の染色画像を組み合わせることもできる。具体的 には、正常腎、あるいは糸球体障害を有する腎組織の染色画像が挙げられる。糸球 体障害を有する腎組織には、膜性腎症ゃ微小変化型ネフローゼ、 IgA腎症、ループ ス腎炎、糖尿病性腎症などの患者腎組織が含まれる。疾患の進行度に応じた代表 的な染色画像を予め組み合わせることにより、キットの利用者の判定を助けることが できる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0072] 以下、実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。
〔実施例 1〕モノクローナル抗体の作製
a.免疫原の調製と免疫方法
大腸菌発現精製ヒトリコンビナントメグシン蛋白 10 g (液量 50 1)をマウスの 1回あ たりの免疫原として用いた。 1.5mlチューブで、 50 1のフロイント完全アジュバント（SI GMA社： Cat.No.F- 5881)と精製メグシン蛋白溶液（10 μ g/50 μ 1)を lmlシリンジ (テル モ社： SS- 01T)と 21ゲージ注射針（テルモ社: NN- 2138S)を用いて、完全にェマルジョ ン化するまで混合し、免疫原とした。マウス (Balb/c)に対し、腹腔に上記免疫原を 26 ゲージ注射針 (テルモ社: NN-2613S)を使用して注射し、免疫を行った。免疫は 1週間 ごとに 1回、合計 4回行った。 4回目の免疫の際、抗体力価をチェックするため、マウス の眼下静脈蒼より 50-100 1採血し、 ELISA法により抗体力価の確認を行った。
[0073] b.モノクローナルハイプリドーマの作製
十分な抗体力価の確認後、摘出したマウス脾臓より調整したリンパ細胞をポリェチ レングリコール（和光純薬： 162-0915)を用い、マウスミエローマ細胞（P3U1)と細胞融 合させた。ノ、イブリドーマの選別は、 HAT (ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン: h -ypoxanthineゝ thymidineゝ SIGMA社 H- 0137 aminopterinゝ SIGMA社 A- 5159)選 択で行った。ノ、イブリドーマの培養上清を用いた ELISA法により、免疫抗原に対して 反応性の高いクローンのスクリーニングを行った。 1次スクリーニングで選択したクロー ンについては限界希釈法を用い、単一のクローンになるまでクローユング作業を行い 、モノクローナルなハイプリドーマ株（2D12)を榭立した。
[0074] c.l次スクリーニング (ELISA実施方法）
大腸菌発現精製メグシン蛋白質を 0.1M炭酸緩衝液 pH9.0にて 2 μ g/mlの濃度とし、 96穴マイクロタイタープレート（Nunc社： Cat.No442404)の 1穴あたり 50 1づっ分注し 、 25°C、 3時間静置した (感作)。溶液を除去後、 1% BSA(Bovine Serum Albumin)溶液 (0.1M炭酸緩衝液 pH9.0)、 200 /z lを分注し、 25°C、 1時間静置した（ブロッキング)。 ブロッキング溶液を除去後、スクリーニングに供するハイプリドーマ上清、あるいはマ ウス血清溶液を 50 1を各穴に分注し、 25°C、 1時間静置した（1次反応)。溶液を除去 後、 0.13M NaCl添加 50mMリン酸緩衝液、 pH7.2(以下： PBS)で洗浄した。各穴にホ ースラディッシュ ·ペルォキシダーゼ（Horseradish Peroxidase： HRP)標識ャギ抗マウ ス IgG(H+L)抗体 (MBL社： Cat.No.330)溶液を 50 1づっ分注し、 25°C、 1時間静置し た（2次反応)。溶液を除去後、 0.13M NaCl添加 50mMリン酸緩衝液、 pH7.2で洗浄し た。 0.8mM TMB (テトラメチルベンジジン： 3 , 5,5 Tetramethylbenzidine :同仁化学 研究所製： Cat.No.T039)溶液を 1ゥヱルあたり 50 μ 1添加し、 30°Cで 5〜20分間発色さ せた (発色反応)。 1.5N H SOを 1ゥエルあたり 50 1ずつ加えて発色反応を停止させ
2 4
、マイクロタイタープレートリーダー（ヮラック社製: ARVO-SX)を用いて、 450nmにお ける吸光度を測定した。
[0075] d.ウェスタンブロッテイング方法
メグシン蛋白質 0.1 /z gを 12.5%ゲル SDS-PAGEで定法に従い電気泳動を行った。セ ミドライトランスファー装置 (バイオクラフト社: Cat.No.BE-300)を用い、泳動された蛋 白を Immobilon-Pトランスファーメンブレン（ミリポア社： Cat.No. IPVH 078 50)に転写 した。転写後のメンブレンをブロックエース (大日本製薬： Cat.No.UK- B25)にてブロッ キング (25°C、 1時間）後、ハイプリドーマ培養上清と 25°C、 1時間反応させた。 PBSでメ ンブレンを洗浄後、ホースラディッシュ 'ペルォキシダーゼ（Horseradish Peroxidase : HRP)標識ャギ抗マウス IgG(H+L)抗体 (MBL社： Cat.No.330)とメンブレンを 25°C、 1時 間反応させた。 PBSでメンブレンを洗浄後 ECL Western Blotting kit (アマシャムバイ ォ社： Cat.No.RPN2109)を用いて化学発光させ、それを Hyperfilm ECL (アマシャムバ ィォ社： Cat.No.RPN2103K)に焼付け、検出を行った。
[0076] e.免疫沈降
1.5mlエツペンチューブ中の rmp Protein A Sepharose Fast Flow (以下、ゲノレと呼 ぶ。アマシャムバイオ： Cat.No. 17-5138-01) 25 1に対して 500 1のハイブリドーマ培 養上清を添加し、室温で 1時間、緩やかに撹拌した。培養上清を除去後、 PBSでゲル を洗浄し、 10 μ g/ml in PBSのメグシン溶液 (PBS)を 50 μ 1/tubeに入れ、室温で 1時間 静置した。 PBSでゲルを洗浄後、 30 μ 1の SDS- PAGE Sample Buffer (レムリ法）を入れ 、 3分間煮沸処理を行った。その内の を上記の方法と同様に SDS-PAGEを行い 、ウェスタンブロッテイングを行った。蛋白の検出には 1次抗体に抗メグシンゥサギポリ クローナル抗体を用い、 2次抗体にはホースラディッシュ ·ペルォキシダーゼ（Horsera dish Peroxidase： HRP)標識ャギ抗ゥサギ IgG(H+L)抗体 (MBL社： Cat.No.458)を用い た。
[0077] f.抗体のサブクラス
IsoStrip kit (Roche社： Cat. No. 1 493 027)を用いて行った。具体的には、サンプル の培養上清を PBSで 150倍希釈したものをキット付属の試験管に入れ、付属の Stripで 試験管のサンプル希釈液を吸い上げる。サブクラスに合わせた位置にバンドが出る ので判定する。結果、サブクラスは IgG2aだった（図 1)。
[0078] 〔実施例 2〕ウェスタンブロッテイング法によるモノクローナル抗体の反応性の検討 ウェスタンプロット分析を行い、この抗体の抗原特異性を実証した（図 2)。抗メグシン 抗体 2D12は大腸菌で発現させたヒトメグシンタンパク質及び、 CHO細胞で発現させ たヒトメグシンタンパク質と反応した。
[0079] 同じくウェスタンプロット分析を行い、この抗体の種間交差反応性を検討した (図 3)
。大腸菌組み換えのラットメグシン及びマウスメグシンとは共に反応しな力つた。
[0080] 同じくウェスタンブロット分析を行い、この抗体の他のセルピンに対する交差反応性 を検討した（図 4)。 α 2-アンチプラスミン、 α 1-アンチトリプシン、アンチトロンビン、プ ラスミノーゲンァクチべ一ターインヒビター 1、大腸菌由来 MBP融合プラスミノーゲンァ クチベータ一インヒビター 2とは反応しな力つた。これらセルピンとの交差性は認めら れない。
[0081] 同じくウェスタンブロット分析を行い、この抗体のセリンプロテア一ゼ'セルピン複合 体に対する反応性を実証した（図 5)。メグシンリガンドの一つと考えられるプラスミンと の複合体を認識した。
[0082] 同じくウェスタンブロット分析を行い、この抗体のメグシントランスジエニックラット腎臓 組織との反応性を実証した（図 6)。野生型ラットの腎臓組織破砕液とは反応しなかつ たが、メグシントランスジヱ-ックラット（ホモ）の腎臓組織破砕液とは反応した。
[0083] 〔実施例 3〕ェピトープマッピング（1)ウェスタンブロッテイング法による検討
a.大腸菌発現断片化メグシン
以下に示す大腸菌発現断片化メグシンを作製した。
全長： 1 -380
5 10 : 322 380
2- 10 : 101 -380
3 10 : 169-380
4- 10 : 267-380
[0084] これらの大腸菌発現断片化メグシンを等量の 2x loading buffer (第一化学製）と混 和し、沸騰浴中で 5分間加熱したものをサンプル溶液とした。該サンプル溶液を SDS 電気泳動装置 (第一化学製)およびトリスーグリシン緩衝液 (第一化学製)を用いて 15 — 25%ポリアクリルアミドゲル (第一化学製)で電気泳動した。泳動中、プロット用に 3 MMろ紙 (Whattman製)を緩衝液 A (第一化学製）に 2枚、緩衝液 B (第一化学製）に 1 枚、緩衝液 C (第一化学製）に 3枚浸した。またポリビ-リデンジフルオライド膜 (PVDF 膜、 Millipore製)をメタノールに浸した後、精製水に浸しなじませた。タンパク質の!^ DF膜への転写は、電気泳動後装置力もゲルを取り出し、プロッター（フアルマシア製 )に陽極側から緩衝液 Aに浸した 2枚のろ紙、緩衝液 Bに浸した 1枚のろ紙、 PVDF膜、 ゲル、および、緩衝液 Cに浸した 3枚のろ紙を記載の順に置き、 80mAZゲルで 1.5時 間行った。転写後、 PVDF膜の一部を CBB染色した。また、 PVDF膜の一部をブロック エースと室温で 1時間浸透する事でブロッキングした。
[0085] ブロッキング後、該膜を抗体希釈液で希釈したモノクローナル抗体 2D12と 4°Cで一 晚反応させた。その後、アルカリフォスファターゼ標識抗マウス IgG抗体を加え、室温 で 1時間反応後、 NBT-BCIP溶液で発色させ、 2D12抗体と反応するバンドを確認した
[0086] [表 1] 大腸菌発現断片化メグシン 2D12の反応
1-380 〇
101-380 〇
169-380
267-380
322-380 以上の結果力 2D12抗体と反応する部位は 101-169にあることが確認できた。
[0087] b.トリプシン処理断片ィ匕メグシン
CHO細胞発現メグシン溶液にトリプシン溶液をカ卩ぇ (メグシン 0.5mg/ml、トリプシン 7800U/ml )反応させたものを用いて a.と同様にウェスタンブロッテイングを行い、 101- 169の付近にェピトープを持つ抗メグシンモノクローナル抗体の 4F3及び 5C6H6との 反応性を比較した結果、 2D12抗体のェピトープは 126-169と推定した。
[0088] 〔実施例 4〕ェピトープマッピング（2)コバリンクプレートを用いた ELISA を元に 10〜20残基のペプチドを常法により合成し、コバリンクプレートに固相し以下 の方法で ELISAを行った。
1)合成ペプチドをァミンカップリング法にてコバリンクプレートに固相する。
2)洗浄液で 2回洗浄後、 PBSで 4倍希釈したブロックエースをカ卩ぇブロッキングする。
3)プレートに希釈した抗体 100 1/wellカ卩え、室温、 2時間反応させる。
4)洗浄液で 4回洗浄後 POD標識抗マウス IgG抗体を 100 I/wellカ卩え、室温、 2時間 反応させる。
5)洗浄液で 4回洗浄後、 TMBを 100 I/wellカ卩え、室温、 30分反応させ吸光度を測 定する。
[0089] [表 2] ペプチド配列 2D12の反応
126-145 O
138-157 X
150-169 X
[0090] [表 3] ペプチド配列 2D12の反応
126-132 X
126-133 X
126-134 〇
126-135 〇
126-136 〇
126-137 〇
126-138 〇
126-139 〇
126-140 〇
126-141 〇
129-138 〇
130-138 X
131-138 X
以上の結果から 2D12抗体の認識するェピトープは 129-134であることが確認された [0091] 〔実施例 5〕酵素抗体法
腎組織をドライアイス/ n-へキサンを用いて、 OCT (マイルズ社）に包埋した。クライ ォミクロトーム (ライカ社)を用いて 8 μ mに薄切した。 MASコートスライドグラス (松浪社 )に採取して、すぐに 4%パラホルムアルデヒド /0.1Mリン酸ナトリウム， pH7.4で 30分 間固定したのちに、 0.1Mリジン /0.1Mリン酸ナトリウム ,pH7.4/0.15M塩化ナトリウムを 用いて自由アルデヒド基を阻害した。 detergentによる permealizationを行うことなぐ 5 %ャギ血清含 20mMリン酸ナトリウム ,pH7.4/0.15M塩化ナトリウム (PBS)で 2時間ブ ロッキング後、マウス抗ヒトメグシン抗血清と 4°Cにお 、て加湿チャンバ一内でー晚ィ ンキュペートした。 ABC法 (ベクター社)を用いて、ピオチンィ匕ャギ抗マウス IgGとアビ ジン ·ピオチン化ペルォキシダーゼ複合体で順に染色し、 0.02%ニッケルアンモ-ゥ ムと 0.025%塩化コバルト (和光純薬)を含む DAB反応液： 0.05%3,3'ジァミノべンジジ ン /0.01% H 0 /50mMトリス塩酸, pH7.2で発色した。エタノール'キシレン系列で脱水
2 2
してェンテラン (メルク社)で封入した。
[0092] 正常腎糸球体のメサンギゥム領域におけるメグシンの局在を確認した（図 7)。また、 2次抗体のみでは糸球体内の染色が認められないことから、 2D12抗体による特異的 な染色であることが示唆された（図 8)。但し、尿細管は 2次抗体による非特異的な染 色を認めた。
[0093] [実施例 6]免疫電顕法
腎組織をドライアイス/ n-へキサンを用いて、 OCT (マイルズ社）に包埋した。クライ ォミクロトーム (ライカ社)を用いて 8 μ mに薄切した。 MASコートスライドグラス (松浪社 )に採取して、すぐに 4%パラホルムアルデヒド /0.1Mリン酸ナトリウム， pH7.4で 30分 間固定したのちに、 0.1Mリジン /0.1Mリン酸ナトリウム ,pH7.4/0.15M塩化ナトリウムを 用いて自由アルデヒド基を阻害した。 detergentによる permealizationを行うことなぐ 5 %ャギ血清含 20mMリン酸ナトリウム ,pH7.4/0.15M塩化ナトリウム (PBS)で 2時間ブ ロッキング後、マウス抗ヒトメグシン抗血清と 4°Cにお 、て加湿チャンバ一内でー晚ィ ンキュペートした。 ABC法 (ベクター社)を用いて、ピオチンィ匕ャギ抗マウス IgGとアビ ジン ·ピオチン化ペルォキシダーゼ複合体で順に染色し、 0.02%ニッケルアンモ-ゥ ムと 0.025%塩化コバルト (和光純薬)を含む DAB反応液： 0.05%3,3'ジァミノべンジジ ン /0.01% Η 0 /50mMトリス塩酸, ρΗ7.2で発色した。 2.5 %グルタルアルデヒド /0.1Mリ
2 2
ン酸ナトリウム， pH7.4と 1 %オスミウム酸 /0.1Mリン酸ナトリウム, pH7.4 (EM Science) で後固定して、 0.1Mリン酸ナトリウム， pH7.4/0.15M塩ィ匕ナトリウムで洗浄後に、エタ ノール/アセトン系列で脱水の後に、エポック 812(応研商事）に熱重合で包埋した。 1ミ クロン切片を光顕観察して、位置決めをして、 0.1ミクロンに超ミクロトーム（LKB社)で 超薄切して、銅グリッドメッシュに採取した。酢酸ウランとクェン酸鉛 (メルク社)で電子 染色を行った後に、加速電圧 100kVで JEOL1010透過型電子顕微鏡で観察した。撮 影は BioScanデジタルカメラ（ガタン社）によった。
[0094] 免疫電顕法による正常腎組織の染色を結果を図 10に示した。 D12抗体は正常腎 組織メサンギゥム細胞（主に細胞質）に局在するメグシンを検出することが示された。 さらに、メサンギゥム細胞の細胞質、特に核力 離れた部位が陽性であることが明ら 力にされた。
産業上の利用可能性
[0095] 本発明によって、メグシンを認識する公知の抗体とは異なる認識ェピトープを有する モノクローナル抗体が提供された。本発明のモノクローナル抗体と、これらの公知の 抗体を組み合わせることによって、メグシンの発現や局在の変動をより詳細に解析す ることができる。その結果、各種の腎臓障害や病型の分類に貢献する。

Claims

請求の範囲
[1] FERM BP- 10527として寄託されたハイブリドーマ 2D12。
[2] FERM BP-10527として寄託されたハイブリドーマ 2D12が産生するモノクローナル抗 体、またはその抗原結合領域を含む断片。
[3] FERM BP-10527として寄託されたハイブリドーマ 2D12を培養し、培養物に含まれるィ ムノグロブリンを回収する工程を含む、モノクローナル抗体、またはその抗原結合領 域を含む断片の製造方法。
[4] 以下の工程を含む糸球体障害の検査方法。
(1)生体力 採取された腎臓組織標本におけるメサンギゥム細胞に対する請求項 2に 記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片の結合レベルを測 定する工程、および
(2)正常腎組織と比較して、抗メグシンタンパク質抗体の結合レベルが低下して!/、る 場合に、糸球体障害が検出される工程
[5] 請求項 2に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を含む 糸球体障害の診断剤。
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