CN1153064C

CN1153064C - 富集稀少细胞的方法

Info

Publication number: CN1153064C
Application number: CNB971953058A
Authority: CN
Inventors: P・O・P・迪斯奥; P·O·P·迪斯奥; 列斯科; 王正品; 纳尔逊; S·A·列斯科; 帕丁; W·G·纳尔逊; A·W·帕丁
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 1996-04-05
Filing date: 1997-04-02
Publication date: 2004-06-09
Anticipated expiration: 2017-04-02
Also published as: CN1221492A; US5962237A; CA2251186A1; AU2438497A; WO1997038313A1; EP0891550A1; JP2000508171A; TW589380B; US20030119077A1

Abstract

本发明涉及富集含有稀少细胞和非稀少细胞的液体中稀少细胞的方法。富集的稀少细胞的例子包括前列腺癌细胞。

Description

富集稀少细胞的方法

本申请要求1996年4月5日申请的美国临时专利申请登记号No.60/014929的利益，该临时专利全文引作参考。

发明领域

本发明涉及富集含有稀少细胞和非稀少细胞混合物的液体中稀少细胞的方法，并且特别涉及从体液例如血液中富集稀少的非血细胞例如癌细胞的方法。

技术背景

过去几年间，人们在富集稀少细胞(例如用于下面的分离和表征)方面发生了兴趣。这可能至少部分归因于对稀少细胞例如癌细胞的识别能提供在诊断和/或治疗多种医学症状中有所帮助的信息。

富集癌细胞的企求部分基于癌症死亡大部分由于肿瘤转移而发生的认识。正因为如此，外周血中存在的癌细胞是癌细胞扩散的指征，而富集这样的癌细胞将有很大的诊断意义。这种需要对于前列腺癌特别急切，其中这种癌的大约2/3在诊断时是临床上定域的，但是这些中只有大约一半在手术中局限于前列腺。因此，几乎1/3至1/2癌症在第一次确诊时已经扩散到前列腺之外，如果有精确、高敏感度富集方法，癌症可以在任何早期被检测到。

关于早期检诊前列腺癌的大多数活性涉及使用血清前列腺特异性抗原(PSA)。但是，PSA是器官特异性的而不是癌特异性的，并且由正常的，良性的，和恶性的前列腺上皮产生。结果是作为检查前列腺癌的PSA阳性预兆值一般小于50％。

另外，外周血中癌细胞的最大水平据估计是10⁷个白细胞中2个。Fidler，癌症研究(Cancer Res.)， 50，6130(1990)。因此研究表明前列腺癌细胞在晚期疾病的人的血流中循环，难以检测这些少的循环着的癌细胞。

分离和检查癌细胞的方法包括例如使用免疫磁性小球和聚合酶链反应(例如Hardingham等， (Cancer Res.)， 53，3455(1993))，使用密度梯度凝胶(例如美国专利4255256)，或者使用密度梯度离心，接着免疫分离，来结合癌细胞(例如Griwatz等，免疫学方法(J.Immunol.Methods.)， 183，251-265(1995))。

一般情况下这些方法不令人满意，因为其缺乏分离血液样品中少的癌细胞的有效性和灵敏性。另外，这些方法可能提供低的细胞回收率，因为高度脆性癌细胞在分离过程中能被破坏和/或相对粘性癌细胞能在分离过程中变得不恰当粘连。

例如，常规方法利用“阳性选择”，其中稀少细胞与结合剂例如抗体结合，而且结合的稀少细胞从非稀少细胞中分离。然后，稀少细胞通过热或者其它适当的方法与抗体分离。这些方法能损害或破坏稀少细胞，使得难以检测和/或培养。另外，或者，一些方法涉及通过离心浓缩癌细胞。但是，一些癌细胞是脆性的和/或趋向于与它们所接触的表面粘连，因此这些方法也能损害或破坏稀少细胞，如上所述这是所不期望的。此外，一些方法在分离过程中提供“固定”细胞，因此使得它们不适合培养或PCR分析。

如上所述，存在从细胞群中富集稀少细胞的有效的高灵敏性的和高度再现性方法的需要。也有能最少破坏这些脆性的和/或粘性的稀少细胞的方法的需要。

本发明提供至少一些对于现有技术的缺点的改进。本发明的这些和其它优点从下面的描述而显而易见。

发明概述

本发明提供富集含有稀少细胞(优选是稀少的非血细胞)和非稀少细胞的液体中稀少细胞的方法。本方法的一个实施方案包括(a)使含有稀少细胞和非稀少细胞的液体进行密度梯度分离并产生含有提高浓度的稀少细胞的液体；(b)使具有提高浓度的稀少细胞的液体接触结合非稀少细胞的试剂；和(c)从液体中去除结合的非稀少细胞，从而富集液体中的稀少细胞。

本方法另一个实施方案包括(a)使液体进行密度梯度分离并产生含有提高浓度的稀少细胞的第一种液体和含有提高浓度的稀少细胞的第二种液体；(b)使所述第一种液体和第二种液体中的至少一种接触结合非稀少细胞的试剂；和(c)从第一种和/或第二种液体中去除结合的非稀少细胞，从而富集液体中的稀少细胞。一般情况下，从第一种和/或第二种液体中去除结合的非稀少细胞后，合并含有稀少细胞的第一种液体和第二种液体。

本发明实施方案也提供进一步处理稀少细胞的方法。例如可以鉴定和/或培养稀少细胞(例如癌细胞)。详细地说，在涉及鉴定的一些实施方案中，能够检测癌细胞中和/或癌细胞上特异性抗原。另外，或者可以检测特异性核酸的表达，而且，如果需要，能够检测染色体变化(例如非整倍性)。在一个实施方案中，鉴定方法包括结合染色(包括免疫细胞化学染色)和荧光原位杂交(FISH)。本发明实施方案也提供对患者癌细胞进行诊断，定期和监测的改进的方法。

本发明进一步提供适合作为癌细胞特别是前列腺癌细胞探针的一些核酸序列。本发明进一步提供含有通过不同方法分离的稀少细胞的组合物。

本发明进一步提供富集含有癌症细胞和非稀少细胞的体液样品中癌症细胞的方法，包括：

(a)获得含有癌症细胞和非稀少细胞的样品；

(b)使样品进行包含第一密度梯度和第二密度梯度的多密度梯度分离，其中第二梯度密度大于第一梯度密度，并产生含有提高浓度的第一密度的癌细胞的第一液体，和含有提高浓度的第二密度的癌细胞的第二液体，其中第二密度大于第一密度；

使样品进行多密度梯度分离包括产生血浆层，第一界面层，第一梯度层，第二界面层，第二梯度层，和细胞沉淀物；

其中产生的第一液体包括混合第一界面层和第一梯度层，并形成第一悬浮液，

其中产生的第二液体包括混合第二界面层和第二梯度层，并形成第二悬浮液，

(c)使所述的包含第二悬浮液的第二液体与结合非稀少细胞的结合剂接触；

(d)从第二液体中去除结合非稀少细胞，提供富集较大密度癌细胞的第二液体，和

(e)通过合并第一液体的第一密度的癌细胞和富集较大密度癌细胞的第二液体的较大密度的癌细胞的液体，制备一种富含第一密度的癌细胞和较大密度的癌细胞的液体。

本发明进一步提供检测包含癌和非稀少细胞的液体中癌细胞的方法，包括提供通过前述方法富集癌细胞的液体，分析所述液体以检测癌细胞，其中所述的检测方法包括：至少一种选自如下一组的方法：免疫细胞化学染色，核酸杂交和聚合酶链反应研究。

本发明进一步提供检测包含前列腺癌和非稀少细胞的液体中癌细胞的方法，包括提供通过前述方法富集前列腺癌细胞的液体，分析所述液体以检测癌细胞，其中所述的检测方法包括：至少一种选自如下一组的方法：免疫细胞化学染色，核酸杂交和聚合酶链反应研究。

附图的简要说明

图1是离心液体样品(例如血液)之前(左侧)和之后(右侧)的密度梯度柱示意图。离心后形成4个区域：血浆I，界面I，梯度I，和细胞沉淀物I。合并界面I和梯度I，提供含有提高浓度的稀少细胞的第一种液体，下文称之为收集I液体。可以合并血浆I和沉淀物I，并离心，形成具有4个区的另一个柱子。

图2A和2B是在单一密度梯度柱(图2A)或双密度梯度柱(图2B)上离心合并的血浆I和沉淀物I(来自图1)的示意图。该示意图详细描述了离心之前(左侧)和之后(右侧)的柱子。离心后形成4个区域：血浆II，界面II，梯度II，和细胞沉淀物II。合并界面II和梯度II，提供含有提高浓度的稀少细胞的第二种液体，下文称之为收集II液体。

图3是本发明另一个实施方案的示意图，其中可以用双密度梯度柱，在离心后形成6个区域。图3的左侧详细描述了该双密度梯度柱和离心前的液体样品(例如血液)，右侧详细说明了离心后的柱子。离心后形成6个区域：血浆，界面I，梯度I，界面II，梯度II，和沉淀物。合并界面I和梯度I，形成收集I液体，合并界面II和梯度II，形成收集II液体。收集I和II液体各自含有提高浓度的稀少细胞。

图4是例举的本发明阴性选择方法的实施方案的示意图。收集II液体与一种或几种抗非稀少细胞的第一抗体温育，所述抗体是例如对白血细胞和/或红细胞抗原特异性的抗体。含有第一抗体的收集II液体然后与结合例如磁珠载体的第二抗体温育。第一抗体结合非稀少细胞，第二抗体(结合磁珠)结合第一抗体。因此从液体中去除这些珠而提供了富集稀少细胞的液体，下文称之为收集III液体。

图5是各自含有稀少细胞的收集I和III液体可以合并的示意图。如果需要，该稀少细胞能用于细胞培养和/或玻片制备。

优选实施方案的详细描述

本发明提供富集含有稀少细胞和非稀少细胞的液体中稀少细胞的灵敏性的，经济的和可重复的方法。根据本发明，在产生一种含有提高浓度的稀少细胞的一种液体之前，使含有稀少细胞和非稀少细胞的液体进行密度梯度分离。使含有提高浓度的稀少细胞的液体进行“阴性选择方法”，包括使该液体接触结合非稀少细胞的试剂。然后从液体中分离结合的非稀少细胞，提供富集稀少细胞的液体。能进一步处理稀少细胞，例如鉴定，表征，和/或培养该细胞。例如，能鉴定和表征稀少细胞来检测一种或几种类型的癌症。本发明实施方案用以监测治疗中和治疗后癌症的发展或者消退，特别用以监测人前列腺癌。

在一个实施方案中，在产生含有提高浓度的稀少细胞的第一种溶液和含有提高浓度的稀少细胞的第二种溶液之前，将含有稀少细胞和非稀少细胞的液体进行密度梯度分离。使第一种液体和/或第二种液体进行阴性选择方法，包括使液体接触结合非稀少细胞的试剂。然后从液体中分离结合的非稀少细胞，提供富集稀少细胞的液体。

另外，因为根据本发明方法的实施方案能在最小胁迫脆性和/或粘性的那些细胞的同时进行，因此能基本上没有损害地回收稀少细胞。这是所特别期望的，因为活的回收的稀少细胞具有多种用途，例如用于全细胞和/或细胞培养的研究。而且，该方法实施方案使相同样品中不同形式的稀少细胞(例如“轻”和“重”稀少细胞)进行不同的处理，因此如果不是基本上全部，则使大部分稀少细胞回收而减少了在稀少细胞富集液体中非稀少细胞的存在。

本发明一个实施方案提供富集含有稀少细胞和非稀少细胞样品中稀少细胞的方法，包括(a)获得含有稀少细胞和非稀少细胞的样品；(b)使液体样品进行密度梯度分离并产生具有提高浓度的稀少细胞的液体；(c)使具有提高浓度的稀少细胞的液体与结合非稀少细胞的结合剂接触；(d)从液体中去除结合的非稀少细胞，提供富集稀少细胞的液体。优选的是，稀少细胞是癌细胞。在一些实施方案中，非稀少细胞包括血细胞，即白血细胞(白细胞)和/或红血细胞(红细胞)。

在本发明一个实施方案中，富集其中稀少非血细胞与非稀少细胞的比例至少是大约1∶100,000的含有稀少非血细胞和非稀少细胞的液体样品中稀少非血细胞的方法，包括(a)获得含有稀少非血细胞和非稀少细胞的液体样品；(b)使液体样品进行密度梯度分离并产生具有提高浓度的稀少非血细胞的第一液体(I)和具有提高浓度的稀少非血细胞的第二液体(II)；(c)使所述的第一液体(I)和所述的第二液体(II)中的至少一种与结合非稀少细胞的结合剂接触；(d)从第一液体(I)和/或第二液体(II)中去除结合的非稀少细胞，提供富集稀少非血细胞的第一液体(Ia)和/或富集稀少非血细胞的第二液体(IIa)。

在另一个实施方案中，富集其中稀少非血细胞与非稀少细胞的比例至少是大约1∶100000的含有稀少非血细胞和非稀少细胞的液体样品中稀少非血细胞的方法，包括(a)获得含有稀少非血细胞和非稀少细胞的样品；(b)使液体样品进行密度梯度分离并产生具有提高浓度的稀少非血细胞的液体；(c)使具有提高浓度的稀少非血细胞的液体与结合非稀少细胞的结合剂接触；(d)从液体中去除结合的非稀少细胞，提供富集稀少非血细胞的液体。

在本发明一个实施方案提供了富集血样中癌细胞的方法，包括(a)获得含有癌细胞的血样；(b)使血样进行密度梯度分离并产生具有第一密度的提高浓度的癌细胞的第一液体，和具有第二密度的提高浓度的癌细胞的第二液体，其中第二密度大于第一密度；(c)使所述第二液体与结合白细胞和/或红细胞的结合剂接触；(d)从第二液体中去除结合的白和/或红细胞，提供富集较大密度癌细胞的第二液体。在一些实施方案中，使含有第二密度的提高浓度的癌细胞的第二液体与结合白细胞和红细胞的结合剂接触，并且从液体中去除结合的血细胞，即白细胞和红细胞。在一个优选的实施方案中，具有不同密度的癌细胞是前列腺癌细胞。

根据本发明可以处理所有的含有稀少细胞和非稀少细胞的液体。本发明实施方案适用于富集其中稀少细胞与非稀少细胞的比例至少是大约1∶10,000的液体中的稀少细胞，并且特别适用于其中液体中稀少非血细胞与非稀少细胞的比例至少是大约1∶100,000的液体中的稀少细胞。根据本发明，与源样品中稀少细胞与非稀少细胞的比例相比，稀少细胞的浓度能够提高至少大约10倍，优选提高至少大约100倍，并且在一些实施方案中，提高至少大约500倍。

本发明，特别是要富集的细胞是癌细胞的一些实施方案，能提供从液体中回收的相对高水平的癌细胞。例如，发现以血样中癌细胞数为基础的70％这样高的回收率，或者更大。另外，一些实施方案提供足够高的灵敏性，使检测出每毫升血液(例如从20ml血样中)至少1.5个癌细胞。

本发明方法令人惊奇的和出人意料的是其在应用“阴性选择”时，能提供上述好处，所述“阴性选择”即是结合非稀少细胞，这是一种与常规方法即应用“阳性选择”即结合稀少细胞的方法正好相反的方法。

可以根据本发明进行的液体的例子包括体液，例如血液，尿液，唾液，淋巴液，脊液，精液，羊膜液，腔液，和组织提取液。

可以根据本发明富集的稀少细胞包括各种诊断或治疗所感兴趣的细胞，包括但不限于癌细胞。在其中要针对的液体包括体液的实施方案中，稀少细胞是存在于身体中，或者由身体产生，并且不是正常存在于体液中的细胞。例如，液体中的稀少细胞可以是癌细胞，而非稀少细胞可以是非癌细胞。在一个实施方案中，稀少细胞是稀少非血细胞，例如前列腺癌细胞。

当然，癌细胞可以包括来自众多不同癌的任何一种的细胞，包括但不限于那些上皮源的细胞。术语癌应该进一步理解为包括定位癌(例如定位于肿瘤中)和非定位癌。特别是包括膀胱癌，脑癌，乳腺癌，结肠癌，肾癌，肝癌，肺癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，直肠癌和胃癌这些是肉瘤形式的肿瘤(例如成纤维瘤或横纹肌瘤)，淋巴系统或脊髓谱系的生血肿瘤，或者另一种肿瘤包括但不限于黑素瘤，畸胎样瘤，成神经细胞瘤或者神经胶质瘤。

根据本发明，在进行阴性选择之前使含有稀少和非稀少细胞的液体进行密度梯度分离。这是有好处的，特别是对于其中稀少细胞是癌细胞的那些实施方案，因为一般情况下(例如使用的体液是例如血液)，大多数癌细胞的密度小于其它循环着的血细胞，例如具核的白细胞，因为与其它血细胞相比，这样的癌细胞大得多的事实，因此每单位的质量更轻。但是要说，一些癌细胞在自然界中是不均一的，一些类型的癌细胞能具有与具核白细胞相似的密度。因此，正如下面将更详细描述的，本发明的一些实施方案包括至少进行两次密度梯度分离，和/或使用一个或多个密度梯度柱子(即具有两个或多个密度梯度的柱子)，来进一步提高富集过程的效率。

密度梯度分离

一般情况下，密度梯度分离方法包括制备一层或多层梯度介质，其中梯度介质的密度应该高于要分离的稀少细胞的密度。一般情况下，将含有稀少细胞和非稀少细胞的液体置于梯度介质的上层(或者最上层梯度介质)，离心介质和液体，直到液体成分根据其各成分密度相互分离。

例如，用图1作参考，并且使用体液例如血液作为详细说明的含有稀少细胞和非稀少细胞的液体，离心后出现在离心试管中的内含物如下：血浆层(血浆I)，界面层(界面I)，密度梯度层(梯度I)，和沉淀物在试管底部的细胞沉淀物(沉淀物I)。界面层的一面是血浆层，另一面是密度梯度层。

以相对轻和重形式两者存在的稀少细胞(例如一些癌细胞，例如前列腺癌细胞)，将存在于界面层，邻接的密度梯度层，和细胞沉淀物中。一般情况下，较轻的癌细胞将位于界面层和梯度层，而相对较重的癌细胞将与白细胞和红细胞一起位于细胞沉淀物中。

根据本发明的实施方案，能制备含有提高浓度的“较轻”稀少细胞的第一悬浮液，和含有提高浓度的“较重”稀少细胞的第二悬浮液。这是有好处的，因为具有不同特征的稀少细胞能根据本发明进行不同处理，以提高稀少细胞的回收率并减少非稀少细胞的存在，同时使时更脆性的稀少细胞的应力最小化。详细地说，含有提高浓度的较重稀少细胞的悬浮液能暴露于结合非稀少细胞的试剂，并且能去除结合的非稀少细胞。但是，含有提高浓度的较轻稀少细胞(可以是更大，更脆和/或粘性的)的悬浮液不需要暴露给结合剂。

例如，再次使用图1作参考，含有提高浓度的较轻稀少细胞的第一悬浮液能通过去除界面层(界面I)，和优选与界面层邻接的密度梯度层部分(梯度I)，并将界面层和梯度层置于另一个试管中来制备。应该十分小心去除梯度层使得不碰到细胞沉淀物(沉淀物I)。一般情况下，大约2/3的邻接的梯度层被去除。

此后，用合适的稀释液例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)小心洗涤新的试管中的细胞，然后轻微离心(例如在大约200×g力下离心)。然后将该过程得到的细胞沉淀物悬浮于溶液中，形成含有提高浓度的稀少细胞的第一液体，在图1和5中称之为“收集I”液体。在形成收集I液体中使用的合适的溶液包括例如白蛋白溶液，例如1wt％牛血清白蛋白溶液。得到的其中相对轻的癌细胞占主要的细胞悬浮液(收集I液体)能用于多种目的，例如细胞鉴定，和/或培养，正如这里所更详细讨论的。如果需要，该液体能进行阴性选择方法，以结合液体中含有的非稀少细胞，并且能去除结合的细胞，以产生富集稀少细胞的液体。

在稀少细胞例如癌细胞相对重的情况下，或者含有相对轻和重的细胞的情况下，能制备含有提高浓度的稀少细胞(即相对重癌细胞)的第二悬浮液。例如，使用图1，2A，和2B作为参考，当富集相对轻细胞时不使用的血浆层(图1中的血浆I)和细胞沉淀物(图1中的沉淀物I)被去除，并合并在一个新的试管中，如图2A和2B左侧所示。该合并的血浆和沉淀物包括相对重的癌细胞以及红细胞和白细胞。接着，使合并物进行密度梯度分离过程。在一些实施方案中，在使合并物进行该分离过程之前，将合并物的密度调节到相对于大约源液样的密度。例如，在其中源样品包括血液的那些实施方案中，合并物的密度能通过加入血浆来调节。

分离过程的结果是和前面一样，离心试管中的内含物出现4层。例如，图2A和2B右侧所示血浆层(血浆II)，含有癌细胞和一些白细胞和红细胞的界面层(界面II)，密度梯度层(梯度II)，和底部的细胞沉淀物(沉淀物II)。

界面层(界面II)和，优选地，与界面层邻接的密度梯度层部分(梯度II)被移取并放置在新的试管中。此后，用合适的稀释剂例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)小心冲洗新的试管中的细胞，然后，一般情况下，轻轻离心。然后将该过程产生的细胞沉淀物悬浮于溶液中，形成含有提高浓度的稀少细胞(以及一些白细胞和红细胞)的第二液体，如图2A，2B右侧和图4左侧称之为“收集II”的液体。在形成收集II液体中使用的合适的溶液包括白蛋白溶液，例如1wt.％牛血清白蛋白溶液。得到的细胞悬浮液(收集II液体)一般使进行阴性选择过程，如下面标题“阴性选择”部分中将更详细描述的。

在另一个实施方案中，例如，如图3所示，能利用多密度梯度柱来提供多界面层和梯度层，并且可以合并合适的层并处理，来提供含有提高浓度的稀少细胞的一种或几种液体。

例如，如图3所示梯度柱子的实施方案能被用来提供收集I液体和收集II液体，其中各液体含有提高浓度的稀少细胞。详细地说，象血液这样的体液能被放置于梯度柱子的上层，其中上梯度密度层(梯度I)具有小于下层(梯度II)的密度。离心后，试管内含物出现下面的情况：血浆层(血浆)，第一界面层(界面I)，第一密度梯度层(梯度I)，第二界面层(界面II)，第二密度梯度层(梯度II)，和试管底部存留的细胞沉淀物(沉淀物)

一般情况下，一些较轻的稀少细胞会位于界面I和梯度I层，而一些较重的稀少细胞会位于界面II和梯度II层。在一个实施方案中(再次使用图3作参考)，合并界面I和梯度I层，以提供收集I液体，并且合并界面II和梯度II层，以提供收集II液体。如果需要，如上所述能使用稀释剂和/或形成悬浮液。能使收集I液体和/或收集II液体进行阴性选择过程以结合液体中所含有的非稀少细胞，去除结合了的细胞以产生富集稀少细胞的液体。

进行密度梯度分离的多种密度梯度介质和方法适合于进行本发明。因此，能使用单个和/或多个密度柱子，并且能使用任何适当组合的介质密度。当然，根据本发明的密度梯度分离也能用连续的和/或不连续的梯度进行。根据要处理的液体和所感兴趣的细胞使用不同的介质和方案。能进行任何次数的密度梯度分离，来提供一种或几种含有提高浓度的稀少细胞的液体。梯度基质或介质也能包括一种或几种添加剂，例如来提供期望的密度或粘度。此外，或者另外，添加剂能提供例如密度分离过程中的非稀少细胞的结块和/或凝集。

在一些实施方案中，例如分离相对密的稀少细胞例如密的前列腺癌细胞的实施方案，FICOLL 400^TM是优选的介质。介质一般在相对高密度和相对低粘度的溶液中与一种化合物例如间叠氮基酸钠(sodiummetrizoate)和二叠氮基酸钠(sodium diatrizoate)结合使用。

为了举例，在其中液体包括血液的一些实施方案中，能使用含有细胞凝集或结块试剂例如甲基纤维素，ISOPAQUE^TM，葡聚糖，和FICOLL^TM的密度梯度。Bhat，N .M.Immuno.Meth.，158，277-280(1993)。ISOPAQUE^TM是N-甲基-3，5-二乙酰基氨基-2，4，6-三碘代苯甲酸钠。FICOLL^TM(精细化学和科学公司，Westbury，纽约)是通过蔗糖和表氯醇共聚合制备的合成的高分子。这些试剂引起红细胞结块，因此能用来从红细胞中分离白细胞。

PERCOLL^TM(从Pharmacia获得)密度梯度也适合于本发明目的。PERCOLL^TM是胶体聚乙烯吡咯烷酮包被的二氧化硅，其在20℃具有pH8.9±0.3，密度是1.13±0.005g/ml，粘度在20℃是10±5cps。

下面章节描述使用PERCOLL^TM来提供任何合适的密度的密度梯度介质。应该明白其它介质和制备方法也是合适的，并且本领域技术人员能容易确定。通过将下面的成分混合制备PERCOLL^TM的贮存液：90ml PERCOLL^TM，9ml 10×Hanks平衡盐溶液(没有钙，镁和苯酚红的HBSS)，1ml HEPES缓冲液(pH7.3)，和0.40ml 1M HCl。得到的溶液的pH是7.4。如下能获得具有各种详述密度的介质。具有1.070g/ml密度的介质能通过混合24体积PERCOLL^TM贮存液和20体积1×HBSS而获得。具有1.079g/ml密度的介质能通过混合27体积PERCOLL^TM贮存液和15.9体积1×HBSS而获得。具有1.088g/ml密度的介质能通过混合23体积PERCOLL^TM贮存液和10体积1×HBSS而获得。

在将其置于密度梯度柱子上之前用合适的稀释剂稀释含有稀少细胞和非稀少细胞的液体是有好处的，特别是对于其中液体包括血液的那些实施方案。能使用对于本领域技术人员来说是已知的所有的适当的稀释剂。这样的稀释剂的例子包括缓冲液，例如生理缓冲液，例如Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲盐水(PBS)，和盐溶液，例如可以购得的平衡盐溶液，例如Hanks平衡盐溶液(HBSS)，Earls平衡盐溶液，Geys平衡盐溶液等等。对于稀释血液来说PBS是优选的稀释剂。

液体能用上述稀释剂稀释到任何期望的比例。但是一般情况下，在其中液体是血液的实施方案中，以大约0.1∶大约10(血液∶稀释剂)的体积比稀释，以大约0.5∶大约5(血液∶稀释剂)的体积比是有好处的，优选大约1∶大约2(血液∶稀释剂)的体积比。

在液样置于柱子上后，离心柱子和样品。一般在任何合适的离心试管中进行离心，并且以合适的力和进行合适长的时间，使得较轻稀少细胞从较重非稀少细胞和其它物质中分离出来。在一些实施方案中，离心力一般在大约300×g至大约600×g力的范围内，优选大约350×g至大约450×g。当然，在其它实施方案中，离心能在比上述更大或更小的力下进行。

离心能进行任何合适长的时间。在一些实施方案中，离心力一般进行大约1分钟至大约60分钟，大约10分钟至大约50分钟是有好处的，优选进行大约20分钟至大约40分钟。在其中血液是要处理的液体的情况下，离心优选在大约400×g力下进行大约30分钟。

尽管本领域技术人员能够确定合适的密度，但是在富集血液中前列腺癌细胞具体情况下，梯度介质(凝胶)应该具有不小于大约1.06g/ml的密度，更优选不小于大约1.068g/ml。在涉及富集前列腺癌细胞并且使用双密度梯度的实施方案中，双梯度应该包括具有大约1.06g/ml至大约1.10g/ml密度的层，优选大约1.077g/ml至大约1.083g/ml。

本发明方法的实施方案涉及富集在液体例如血液中循环的多种类型的癌细胞。例如，如下所述，培养来自传统的肝癌G₂细胞系的细胞，并且将已知数目放置到正常人血液中。这些样品以各种密度梯度离心。发现具有1.068g/ml密度的密度梯度是从中回收加入的80％肝癌细胞的梯度层。也发现肝癌细胞是非常粘的和脆的。据信这些肝癌细胞具有与LNCaP系前列腺癌细胞相似的密度。

阴性选择

如上文所述，阴性选择方法包括使含有稀少细胞和非稀少细胞的液体与结合非稀少细胞的试剂接触，并且从液体中去除结合的非稀少细胞。去除结合的非稀少细胞得到富集稀少细胞的液体。

例如，上面任何实施方案中所述的收集II液体能包括较重稀少细胞，以及可能具有相似密度的非稀少细胞(例如一些白细胞和红细胞)。因此，收集II液体能使与结合这些非稀少细胞的试剂结合。去除结合的非稀少细胞得到富集稀少细胞的液体，在图5中以“收集III”代表。

根据本发明实施方案，结合非稀少细胞的试剂一般包括一种或几种抗体，优选特异性结合非稀少细胞的单克隆抗体。多种抗体适合进行本发明，其可以从任何来源产生。例如，在一些实施方案中，例如，其中含有稀少细胞和非稀少细胞的液体包括血细胞，合适的结合剂包括特异性结合一种或几种正常白细胞表面抗原和/或红细胞表面抗原的抗体。或者，或另外，结合剂可以包括例如抗-人抗体，例如特异性结合人正常白细胞和/或红细胞的抗体。

阴性选择方法包括“直接”和“非直接”方案。例如，直接阴性选择方法的一个例子包括使用与载体结合的抗体，其中抗体结合非稀少细胞。非直接阴性选择方法的一个例子包括使用结合非稀少细胞的“第一”抗体，和结合“第一”抗体的“第二”抗体(即结合于载体的抗体)。优选的是，第一抗体和第二抗体来自不同种类的动物。多种第一和第二抗体是合适的，并且能购买到。

期望使用载体(例如象小球这样的颗粒，更优选微珠)，因为其使抗体-非稀少细胞结合物或第二抗体-第一抗体-非稀少细胞结合物更容易从液体中去除。本领域公知的微珠可以由任何合适的材料制成，包括塑料和磁性材料，优选磁性微珠，更优选超顺磁微珠。各种各样的合适的载体，特别是象微珠这样的颗粒(其上有或没有结合抗体)是可购买到的。可以使用本领域技术人员公知的能从液体中去除载体(例如颗粒)的任何分离方法和体系。

在直接阴性选择方法的一个实施方案中，含有提高浓度的稀少细胞的液体(例如收集II液体)与结合载体颗粒的抗-人抗体的混合物接触。然后将这样产生的液体在合适的温度下孵育适当时间，这样有效地基本上完成抗体与非稀少细胞的结合。孵育的温度和时间不同，孵育优选在略低于室温的温度下进行，更优选在大约4℃，进行大约5分钟至60分钟，优选进行大约10分钟至大约50分钟。

孵育期间，抗体/载体颗粒和细胞优选例如通过使用合适的混合或振荡装置小心混合。根据本领域公知的来从液体中分离具有与抗体结合的非稀少细胞的载体颗粒/抗体。详细地说，在其中载体颗粒是顺磁性微珠的实施方案中，可以使用磁性颗粒浓缩器进行分离。合适的浓缩器可以购得，例如从Dynal，Inc.(Lake Success，N.Y.)购得。

在非直接阴性选择方法的实施方案中，含有提高浓度的稀少细胞的液体(例如收集II液体)与第一抗体例如抗-人抗体的混合物接触。这些第一抗体不与载体结合。然后如上文对于直接方法所述孵育得到的混合物。此后，该液体与第二抗体接触，其中第二抗体与载体颗粒结合。选择这些第二抗体，使对于第一抗体是特异性的。如上文对于直接阴性选择方法所述，能例如通过使用磁性颗粒浓缩器来从液体中分离其上现在也含有结合的第一抗体/非稀少细胞的载体颗粒/第二抗体。

如上所述，在一些实施方案中，优选使用超顺磁颗粒。举例的超顺磁微珠具有大约10^-9cgs单位至大约10^-7cgs单位的磁化率，优选大约8×10^-9cgs单位至大约10^-7cgs单位。下面描述了涉及使用磁性颗粒浓缩器从液体中分离顺磁性(或超顺磁性)颗粒的一个实施方案。当液体被放置在由磁性颗粒浓缩器产生的磁场中时，使顺磁性颗粒接触并保持紧贴试管壁，接近磁性颗粒浓缩器的磁铁，提供从稀少细胞(未结合的)分离非稀少细胞(与顺磁性颗粒结合)。根据本发明富集的稀少细胞基本上没有非稀少细胞杂质。例如，在从血液中分离癌细胞的情况下，发现癌细胞几乎完全从具核的白细胞分离出。这是有好处的，因为如果存在具核的白细胞，则会干扰细胞鉴定，特别是对于其中使用聚合酶链反应(PCR)方法的一些实施方案。

对于其中含有稀少细胞和非稀少细胞的液体是血液的一些实施方案，期望使用结合白细胞(白细胞)和/或红细胞(红细胞)的抗体。合适的白细胞抗体的例子包括人和抗人白细胞CD抗体，例如CD2，CD3，CD4，CD5，CD7，CD8，CD11a，CD11b，CD11c，CD14，CD15，CD16，CD19，CD20，CD28，CD36，CD42a，CD43，CD44，CD45，CD45R，CD45RA，CD45RB，CD45RO，CD57，和CD61抗体等。优选定靶于人CD45，CD3，CD19，CD14和CD36的抗体。例如，当使用CD45特异性抗体时，其识别CD45白细胞共有抗原(LCA)族，其至少由4个存在于白细胞谱系细胞上的同种型膜糖蛋白(220，205，190，180kD)组成。当然，也包括人和抗-人红细胞抗体。

为了例举直接阴性分离实施方案，含有稀少细胞的液体可以与抗-人CD45，抗-人CD19，抗-人CD14抗-人CD3抗体的混合物(例如小鼠抗-人CD45IgG，小鼠抗-人CD19IgG，小鼠抗-人CD14IgG，和小鼠抗-人CD3IgG的混合物)接触。任意地，合适的抗-人红细胞抗体(例如血型糖蛋白A)也可以包括在抗体混合物中。在一个实施方案中，抗体在混合物暴露于含有稀少细胞的液体之前与磁性颗粒结合，并且如上所述用磁性颗粒浓缩器从液体中去除颗粒。

为了例举其中使用小鼠抗-人CD45IgG抗体为第一抗体的非直接阴性分离实施方案，第二抗体可以是抗-小鼠IgG抗体。使用前第二抗体可以与颗粒结合，并且如上所述从含有稀少细胞的液体中去除颗粒。

根据本发明的实施方案，提供从血液中富集癌细胞的药盒，包括至少第一和第二梯度密度介质，其中第一梯度密度介质具有至少大约1.067g/ml的密度，第二梯度密度介质具有至少大约1.077g/ml的密度，其中该药盒进一步包括载体颗粒，和至少一种能结合比癌细胞更密集的细胞的细胞表面抗原的抗体。在更优选的实施方案中，第一梯度密度介质具有大约1.068g/ml至大约1.077g/ml的密度，第二梯度密度介质具有大约1.077g/ml至大约1.085g/ml的密度。

在本发明另一个药盒实施方案中，药盒可以包括一个或几个核酸探针(在下文标题是“富集的稀少细胞的进一步处理”的章节中描述)和/或一种或几种抗体。如果需要，这样的药盒也可以包括一种或几种梯度密度介质。

富集的稀少细胞的进一步处理

如上所述，含有稀少细胞和非稀少细胞的液体可以被处理以提供多种液体，其各自含有提高浓度的稀少细胞。含有提高浓度的稀少细胞的一种或几种液体可以使其与结合剂结合来结合非稀少细胞，以提供一种或几种富集稀少细胞的液体。如果需要，可以合并液体。例如可以合并两种富集稀少细胞的液体，或者富集稀少细胞的液体可以与含有提高浓度的稀少细胞但是没有与结合剂接触的液体合并。

本发明实施方案提供适合各种各样目的的一种或几种稀少血细胞富集液体。

根据本发明方法的实施方案也提供了处理或使用富集的稀少细胞，例如，来鉴定，表征，和/或培养稀少细胞。另外，该方法用于诊断癌，特别是人前列腺癌，也用来监测癌症的发展，或消退，特别是在治疗期间或治疗之后。

本发明进一步提供通过上述任何方法从含有富集癌细胞的患者血液中鉴别患者血液中癌细胞的方法，和使用任何合适的方案和体系鉴别细胞。

本发明实施方案也提供用来制备医疗产品，包括但不限于疫苗。

细胞能通过任何合适的方法制备(例如，用于鉴定，表征，和/或培养)。一般情况下，用于鉴定和/或表征稀少细胞的方法的实施方案包括制备含有富集细胞的悬浮液，将细胞的悬浮液转移给显微镜载玻片(例如制备涂片)，并且用光学显微镜检查该涂片。在直接的涂片方法中，优选避免通过离心力堆积癌细胞或者将这些堆积的细胞通过机械方法再分布。

另一方面，如果小心沉降或离心这些细胞，并且在小心去除上清液之后，疏松的沉降的细胞能通过小体积液体(大约1-10μl)再悬浮，然后，直接转移到载玻片(例如用于鉴定)或者转移到培养基上(例如用于培养)。将细胞转移到载玻片上的一个方法包括将沉降的细胞悬浮于BSA溶液中，并将细胞细胞旋压(cytospinning)到载玻片上，例如通过使用商购的Megafunnel^TM大体积样品槽(Shandon)。

如果需要，可以通过加入固定剂(例如乙醇)来固定沉降的细胞，从而使细胞更加抗损害。这是有好处的，因为固定的细胞能容易地转移给载玻片。但是，因为细胞被固定，其不能培养或者用于PCR研究。

如果需要，用于制备用来鉴定的细胞的机械收集方法应该避免使细胞暴露给离心力。例如，溶液中少量的细胞可以有益地从悬浮液中收集并沉淀物在膜上，同时进行小心的抽吸。液体将通过膜的孔，并且在膜上收集细胞。这些细胞通过将含有细胞的膜表面放到载玻片上而转移给载玻片。

多种技术适于鉴定和/或表征稀少细胞。另外，本发明实施方案可以包括鉴定和/或表征单一样品中多种类型的稀少细胞，例如不同的癌细胞类型。合适的技术包括，例如，用单抗的免疫细胞化学染色，核酸杂交(包括原位杂交)和聚合酶链反应(PCR)研究。该技术包括使用“鸡尾酒”抗体和/或探针。

详细地说，在其中稀少细胞是上皮源细胞例如前列腺癌细胞时，其可以通过用特异性结合例如PSA(前列腺特异性抗原)，PSMA(前列腺特异性膜抗原)，PSAP(前列腺特异性酸磷酸酶)，细胞角蛋白，或者白蛋白的单抗对其免疫化学染色来鉴定。尽管PSA广泛用于鉴定前列腺细胞活性，但是有一些前列腺细胞分泌很少或者不分泌PSA。因此，在一些实施方案中，期望或者，或另外使用特异性结合PSMA的抗体。

当然，也可以用核酸杂交方法鉴定和/或表征稀少细胞。例如，在其中稀少细胞是肝癌细胞的一些实施方案中，合适的核酸探针包括例如特异性结合血清白蛋白mRNA和甲胎蛋白mRNA的寡聚物探针。或者，在其中稀少细胞是前列腺癌细胞的一些实施方案中，合适的核酸探针包括特异于例如PSA，PSMA，染色体7，染色体8，和/或染色体18的那些。如上所述，有一些前列腺细胞分泌很少或者不分泌PSA。因此，PSA的探针可能比PSMA的探针更小灵敏性。

下文更详细描述详细说明的特异于编码PSA的mRNA，特异于编码PSMA的mRNA，和特异于染色体7，8，和/或18的着丝区的探针。这些探针特别适合于原位杂交。

有代表性的特异于PSMA(前列腺特异性膜抗原)mRNA的探针包括：

SEQ.ID.No.1：TGGCTGTGCG CTGGGGCGCT GGTGCTGGCGGGTGGCTTCT TTCTCCTCGG CTTCCTCTTC GGGTGGTTTA TA，

SEQ.ID.No.2：AGTGTCTATG AAACATATGA GTTGGTGGAAAAGTTTTATG ATCCAATGTT，和

SEQ ID.No.6：GTGTTTGAGC TAGCCAATTC CATAGTGCTCCCTTTTGATT GTCGAGATTA.

有代表性的特异于PSA(前列腺特异性抗原)mRNA的探针包括：

SEQ ID.No.3：GGTCCTCACA GCTGCCCACT GCATCAGGAACAAAAGCGTG ATCTTGCTGG GTCGGCACAG，

SEQ ID.No.4：CGCTGGACAG GGGGCAAAAG CACCTGCTCGGGTGATTCTG GGGGCCCACT TGTCTGTAAT，

SEQ ID.No.7：TCTTCCTCAC CCTGTCCGTG ACGTGGATTGGTGCTGCACC CCTCATCCTG TCTCGGATTG，和

SEQ ID.No.8：CAGGCTGGGG CAGCATTGAA CCAGAGGAGTTCTTGACCCC AAAGAAACTT CAGTGTGTGG.

有代表性的特异于染色体7，8，和/或18的着丝区中竞争序列的探针包括：

SEQ ID.No.5：GCTGTGGCAT TTTCAGGTGG AGATTTCAAGCGATTTGAGG ACAATTGCAG(染色体7).

针对着丝粒的探针可以用来测定细胞中染色体的数目，例如测定非整倍性。例如对于染色体7的着丝粒的探针能被用来计数细胞中染色体7的数目。正常细胞应该是二倍体的，因此显示出两个染色的探针“点迹”。从二倍体状态偏离(即1，3，4或更大数目的染色体7)将指示染色体的非整倍性或不正常数目，而这是癌症/瘤病症的非常强有力的指征。

对于染色体8着丝粒的合适的探针可以购得，例如从Vvsis.Inc.(Downer Grove.IL)购得。

对于染色体18着丝粒的合适的探针是SEQ ID.No.9：GTACTCACAC TAAGAGAATT GAACCACCGT。Meyne等，分子生物学方法，33：原位杂交方法(Methods in Molecular Biology，33：In Situ Hybridization Protocols)，Choo，H.K.(编著)，63-74(1994)。该序列能被转换成更长序列。例如其能被转化成SEQ.ID.No.10：ATGTGTGTAC TCACACTAAG AGAATTGAAC CACCGTTTTGAA。尽管能使用大约20-大约60个核苷酸序列长度，但是优选长度是42。

当然，稀少细胞也能通过聚合酶链反应(PCR)技术鉴定。可以使用对于本领域技术人员公知的所有PCR技术和合适的探针。

本发明进一步提供通过任何上述方法鉴定含有来自患者血液的富集癌细胞的患者血液中的癌细胞的方法，并且使细胞进行原位杂交，包括原位杂交中的荧光法(FISH)。合适的探针包括上述那些探针。另外，其中使用的例举的原位杂交方法和探针公开于例如Meyne等，分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)，33卷，如上面作为参考。

详细地说，FISH探针可以用脱氧核糖核苷酸基单位，或者2’-O-甲基核糖基核苷酸基单位，或者由甲基磷酸骨架或硫代磷酸核苷酸基骨架组成的非离子类似物合成。合适的探针包括寡脱氧核糖核苷酸探针，并且优选用荧光残基标记的那些。可以使用任何合适的荧光残基。因此，荧光染料例如荧光素(绿)，cy3(红)，cy5(远红)，cy7(红外)，和德克萨斯红可以是标记物。双重和三重原位杂交也可以通过在上述条件下使用mRNA和着丝粒(区别标记)的结合物进行。高度严格清洗后，细胞的核可以用荧光DNA染料例如DAPI(二脒基苯基吲哚)或PI(碘化丙啶)复染。染色的细胞可以用任何合适的荧光显微镜分析特异性mRNA和非整倍性。合适的体系和方法包括使用荧光显微镜，包括例如Callahan等 Cytometry 13，453-461(1992)，和Lesko等细胞研究快讯(Exp.Cell Res.)219，499-506(1995)中描述的那些。

检测癌细胞核中非整倍性的一个替代的方法是首先进行特异性免疫细胞染色(例如通过染色PSA，PSMA，PSAP，或白蛋白)并使抗体和抗原交联，接着用荧光标记的着丝粒探针原位杂交。

检测上皮癌细胞的一个方法包括特异性免疫化学染色(例如通过特异性结合该细胞所表达的细胞角蛋白的细胞角蛋白抗体)，然后使抗体和抗原后固定和/或交联，接着原位杂交，用于检测特异性mRNA和染色体非整倍性。

为了进行FISH，通过将载玻片浸于室温下稀盐酸溶液中，例如0.1NHCl中，浸大约20分钟，使所有DNA和RNA残基变性，以在将细胞放在载玻片上之前清洗载玻片。该盐酸溶液应该含有0.1％TritonX100表面活性剂。然后用PBS冲洗载玻片。

稀少细胞例如癌细胞可以通过任何合适的方法如上面讨论的方法载于载玻片上。然后通过依次浸入75％乙醇，85％乙醇和95％乙醇，每次乙醇浸入大约2分钟，来使载玻片脱水。

例举的FISH鸡尾酒包括200ng各PSMA和PSA探针以及250ng染色体7着丝粒探针，向载玻片加入10μl原位杂交缓冲液(对于寡聚物探针用25％甲酰胺4×SSC，和对于商购探针用50％甲酰胺和1×SSC)。然后用盖玻片盖住细胞，载玻片周围使用橡胶泥并密封。载玻片应该保持在烘箱(例如80℃，大约5分钟)中使变性，然后孵育，例如在42℃孵育大约3小时。然后例如用1×SSC冲洗细胞，在65℃冲洗大约10分钟。这些细胞接着用合适的染料例如二脒基苯基吲哚(DAPI)染色，然后在合适的显微镜下检测。

本发明的实施方案进一步包括培养稀少细胞。例如稀少细胞例如癌细胞可以如上富集，并且接着与合适的培养基接触放置。一般情况下，为了进行细胞培养，将细胞放在灭菌膜过滤器中。

可以使用本领域技术人员公知的所有合适的膜过滤器。合适的膜的例子包括微孔膜。这些膜具有任何合适的孔度，优选孔度是大约0.2μm至大约15μm，更优选15μm。合适的微孔膜的例子包括尼龙6，尼龙46，尼龙66和硝基纤维素膜。合适的膜是商购的。

在载于膜之上之前细胞不被固定。然后细胞载于其上的膜一般放在含有培养基的胶原包被的培养皿中，细胞与胶原包被的表面接触。可以使用本领域技术人员公知的任何合适的培养基。培养基的例子是补加有1％血清和附加因子的PFMR-4R(Peehl，组织培养方法杂志(J. of Tissue Culture Methods)，9，53-60(1985))。其它合适的培养基的例子包括RPMI 1640，Coon’s f12，Dulbecco’s Modified EagleMedium，McCoy’s Medium等。

细胞培养可以通过本领域技术人员公知的合适的方法监测。例如，前列腺癌细胞生长可以通过使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测定分泌到培养基中的PSA分泌来监测，而肝细胞生长可以用ELISA通过测定白蛋白或甲胎蛋白分泌来监测。

培养的细胞具有多种其它的用途。例如，这些细胞能用来提供医疗产品，包括但不限于疫苗。

本发明进一步提供诊断癌症特别是人前列腺癌的方法，该方法包括如上所述富集并鉴定来自患者血液的癌细胞。

本发明进一步提供定期(stage)人癌症的方法，特别是定期人前列腺癌的方法。例如，在一个实施方案中，如上处理怀疑患癌症患者的血液以富集前列腺癌细胞(如果存在)。然后进行使用寡核苷酸引物的加强的逆转录酶(RT)聚合酶链反应(PCR)测定。因为本发明的方法在富集细胞中是高效的，在一些实施方案中，能够在6,000,000细胞中鉴定1个癌细胞，本发明方法比文献中报道的方法灵敏得多，文献说能在100000个淋巴细胞中检测一个产生PSA的细胞(Katz等， Urology，43，765-775(1994))和在1百万个细胞中检测一个细胞(Israeli等，癌症研究(Cancer Research)，54，6306-6310(1994))。另外，本发明方法鉴定PSA-合成的癌细胞，以及非-PSA-合成的癌细胞。

本发明进一步提供癌症在治疗期间或之后的发展或消退的监测方法，并且发现对于人前列腺癌特别有用。该方法包括随时间反复提取血样，并如上所述从怀疑患癌症的患者血液中富集，分离，并且接着鉴定癌细胞(如果存在)。从其加强的灵敏性来看，本发明实施方案特别适用于通过分离并检测患者血液中的癌细胞而监测各种癌症治疗的效果。

下面的实施例进一步详细说明本发明，但是当然不应该认为在任何方面限制其范围。在所有的下面的实施例中，使用装备有冷却的电荷偶联装置(CCD)照相机和使另外区别检测荧光素cy3，cy5，和cy7荧光信号的过滤管自动Zeiss Axiovert 35落射荧光显微镜鉴定富集细胞。该照相机具有计算机控制快门。计算机也控制显微镜载玻片时相的移动。

显微镜设置在自动模式，并且使用多波长曝光。通过A至D变换器成像到计算机上。计算机以数字形式处理和记录。

实施例1

该实施例详细说明前列腺癌细胞和肝癌细胞的密度测定，以提高在选择用于本发明实施的合适的密度梯度方面的效率。通过测定癌细胞在培养基和梯度介质的界面处的回收百分率来测定密度梯度柱子中癌细胞的密度。

PERCOLL^TM贮存液(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)通过将9份PERCOLL^TM加入到1份(V/V)1.5M氯化钠溶液中而制备。用生理盐水调节PERCOLL^TM溶液的渗透摩尔浓度。通过加入蒸馏水或盐水最终调节到需要的渗透摩尔浓度。可以从下面的计算式计算PERCOLL^TM贮存液的密度：

V_{X} = V_{O} \frac{{(P}_{O} - P 1)}{(P 1 - P 10)}

P 1 = \frac{V_{O} P_{O} + V_{X} P 10}{V_{X} + V_{O}}

其中

V_X＝稀释介质的体积(ml)

V_O＝PERCOLL^TM的体积(ml)

P_O＝PERCOLL^TM的密度(1.130±0.005g/ml)

P₁₀＝1.5M氯化钠的密度＝1.058g/ml

2.5M蔗糖的密度＝1.316g/ml

P₁＝产生的贮存液的密度(g/ml)

因此，对于盐水中的贮存液PERCOLL^TM，，P1＝1.123g/ml，对于蔗糖中的贮存液PERCOLL^TM，，P1＝1.149g/ml。

PERCOLL^TM贮存液可以通过用用于细胞分离的0.15M盐水(密度＝1.008g/ml)进行稀释而稀释到较低密度。下面的计算式能用来计算需要获得期望密度溶液的体积。

Vy = Vi \frac{(P 1 - P)}{(P - Py)}

其中

V_Y＝稀释介质的体积(ml)

V_i＝贮存液PERCOLL^TM的体积(ml)

P1＝贮存液的密度(g/ml)

P_Y＝稀释介质的密度(g/ml)

P＝产生的稀释溶液的密度(g/ml)

表1.制备用于测定癌细胞密度的几种密度的PERCOLL^TM溶液

贮存液 0.15M NaCl 溶液密度

CP1＝1.123(g/m) (ml) (g/ml)

70 28 1.090

60 40 1.077

50 47 1.067

40 56 1.056

30 69 1.043

20 80 1.031

如下测定癌细胞密度：

从供应商(例如美国典型培养物中心)获得使用的癌细胞系。在37℃下，在有10％FBS和5％CO₂的RPMI中培养LNCaP，TSU，和肝癌G₂细胞系。5ml培养基中的细胞置于5ml已知密度的单一PERCOLL^TM溶液上形成一层，并且在室温下以400×g离心20分钟。收集所有的可见沉淀物之上的界面和PERCOLL^TM溶液。计数该悬浮液中的细胞数并且用于计算回收率。数据在表2中给出。

表2.癌细胞的密度测定

密度回收率(％)

(g/ml) LNCaP TSU 肝癌G₂

1.031 10.0 10.0 10.0

1.043 20.5 15.0 17.0

1.056 25.0 20.5 24.0

1.067 76.0 84.5 85.0

1.077 76.5 98.5 98.0

1.090 76.0 98.5 98.0

从表2可以看出，使用密度是1.067g/ml的梯度回收了76％至85％的癌细胞。对于肝癌G₂和TSU细胞，使用密度是1.077g/ml的梯度获得另外的13％至14％的细胞回收率。对于LNCaP细胞在较高密度发现没有附加的细胞回收率。

实施例2

该实施例详细说明了使用单一密度梯度柱分离前列腺癌细胞的方法。

将20ml新鲜血液取样到两个试管中。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)以1∶2稀释血液。30ml含有2.3×10⁵个LNCaP细胞(前列腺癌细胞)的稀释的血液在15ml具有1.068g/ml密度的PERCOLL^TM梯度(图1中的梯度I)上形成一层。该梯度柱子在室温下以400×g离心20分钟。

小心地将血浆和PERCOLL^TM介质之间的界面处的细胞移取到一个新的试管中。向新的试管中加入40mlPBS并且混合。PBS稀释的细胞以250×g离心5分钟。得到的沉淀物悬浮于50μl 0.1％牛血清白蛋白(BSA)溶液中。

将这样制备的细胞悬浮液点涂在载玻片上，每种悬浮液各用10μl。使载玻片风干2小时。细胞用95％乙醇固定15分钟，然后用改良的Carnoy’s固定剂固定10分钟。载玻片在4℃下在75％乙醇中贮存直到使用。

上面的试验重复9次以上，每次用新鲜的血样。10次试验中前列腺癌细胞的平均回收率是76-86％。

实施例3

该实施例详细说明了使用较高单一密度梯度柱分离前列腺癌细胞的方法(参见图1和2A)。

来自实施例2的1.068g/ml密度梯度(图1中的梯度I)沉淀物物再悬浮于来自实施例2的血浆级分，并且在含有密度是1.083g/ml的10mlFICOLL^TM介质(图2A中的梯度II)的较高密度梯度柱子上形成一层。该密度梯度柱子在室温下以400×g离心20分钟。

用细胞移液管小心地将血浆和具有1.083g/ml密度的介质之间的界面处的细胞取出并放在新试管中。向界面细胞加入40mlPBS并混合。然后以250×g离心PBS稀释的细胞。得到的沉淀物悬浮于0.5ml0.1％重量的BSA溶液中。用光学显微镜计数白细胞。

分别向细胞悬浮液中加入30μl小鼠抗-人CD45，CD19，CD3，CD14单克隆抗体(Sigma Chemical Co.)和10μl血型糖蛋白A单抗(Dako，Inc.)，并且试管在冰上孵育30分钟。离心细胞悬浮液并吸出上清液。细胞沉淀物物再悬浮于8×10⁷个包被抗-小鼠IgG抗体磁性珠(Dynal，Inc.)的2mlPBS-BSA中。细胞和珠在4℃下孵育30分钟，同时以10rpm/分钟旋转试管。用磁性颗粒浓缩器取出细胞-单抗-小鼠IgG-磁珠复合物。残留的细胞收集在载玻片上。制备载玻片，并且如上文实施例2所述固定细胞。

实施例4

该实施例详细说明了用于从血液中分离前列腺癌细胞的实施例2所描述的方法的效率。

使血样进行实施例1提出的过程，除了离心20分钟而不是30分钟。

测定总的细胞数，界面处的细胞数，梯度底部的细胞数，测定损失的细胞数。数据在表3中列出。

表3.使用单一密度梯度分离前列腺癌细胞的效率

前列腺癌细胞系

LNCaP P100 TSU wt

总细胞数 2.3×10⁵ 1.00×10⁷

界面处细胞数 1.75×10⁵ 8.45×10⁸

(％收率) (76％) (84.5％)

底部细胞数 Few cells 1.50×10⁵

(较高密度细胞％) (～1.0％) (15％)

损失的细胞数^* 5.5×10⁴ 5.00×10⁴

(％损失) (23％) (0.5％)

*包括粘在试管壁上的细胞和在分离和冲洗过程中破碎的细胞。

实施例5

该实施例详细说明了用于从血液中分离前列腺癌细胞的实施例3所描述的方法的效率。

使血样进行实施例2提出的过程，除了离心20分钟。

测定总的细胞数，界面处的细胞数，梯度底部的细胞数，测定损失的细胞数。数据在表4中列出。

表4.使用第二密度(1.083g/ml)梯度分离前列腺癌细胞的效率

前列腺癌细胞系

LNCaP P100 TSU wt

总细胞数^* 2.3×10³ 1.50×10⁴

界面处细胞数 1.87×10³ 1.45×10⁴

(％收率) (81.3％) (96.6％)

底部的细胞数没有测定没有测定

(较高密度细胞％) (～0％) (～0％)

损失的细胞数^** 4.5×10² 5.00×10²

(％损失) (～18.7％) (～3.4％)

*细胞悬浮液是从单一梯度(1.068g/ml)分离的底部收集的。

**包括粘在试管壁上的细胞和在分离和冲洗过程中破碎的细胞。

实施例6

该实施例详细说明了培养癌细胞的方法。计数LNCaP细胞，并加入到正常成人血液中。实施例2和3中详细说明的方法用于分离该人工血液中的LNCaP细胞。从人工血液中分离的LNCaP细胞在补加了10％血清和附加因子的RPMI1640培养基中培养。每3天变换一次培养基。培养的细胞显示出阳性免疫染色PSA和PSAP，并且每个瓶中的细胞数随着在培养基中的时间而增加。

实施例7

该实施例详细说明通过荧光原位杂交(FISH)用PSA-MRNA，PSMA-mRNA和染色体着丝粒探针从患者血液中鉴定LNCaP细胞或前列腺癌细胞。

合成特异于PSA-mRNA，PSMA-mRNA和染色体7和18的着丝粒的寡核苷酸探针，并且与荧光染料例如荧光素，cy3和cy5缀合。染色体着丝粒8的探针从商业来源获得(Vysis)。

室温下，通过实施例1和2中描述的方法分离，固定和贮存的癌细胞在0.1M盐酸-0.1％Triton X-100溶液中预处理30分钟，并且在一系列级别的75％，85％和95％乙醇中脱水，每级脱水2分钟。样品空气风干。

FISH“鸡尾酒”包括FISH缓冲液，其主要包括25％甲酰胺和4XSS(用于寡聚物探针)或者50％甲酰胺和1XSSC(用于商业探针)，20μg/mlPSA-mRNA探针和PSMA-mRNA探针，和25μg/ml染色体7，8和18着丝粒探针。向各载玻片加入10μlFIAH“鸡尾酒”，盖上盖玻片。样品在80℃变性10分钟，并且在42℃保温2小时。载玻片在70℃在1XSSC中冲洗10分钟。10μl含有0.2μg/ml二脒基苯基吲哚(DAPI)的不变色固定培养基被用来计数染色。计数染色后，在荧光显微镜下检查样品。染色体7着丝粒(其是多倍体)显示出绿染色，其核用DAPI染成蓝色。

染色体8着丝粒(其是四倍体)显示出黄染色，其核用DAPI染成蓝色。

计数染色体着丝粒，数据在表5中列出。

表5.来自培养物和来自从癌症患者血液分离的癌细胞的LNCaP细胞核中染色体7和8的非整倍性

细胞序号染色体着丝粒7 染色体着丝粒8

LNCaP 患者 LNCaP 患者

癌细胞癌细胞

1 14 8 14 8

2 4 8 4 8

3 7 4 7 4

4 4 4 4 4

5 4 4 3 3

6 4 8 4 8

7 4 8 4 8

8 5 4 3 3

9 8 3 7 4

10 2 4 3 4

实施例8

该实施例详细描述了通过免疫细胞化学染色，以及通过染色体着丝粒7和8检测鉴定患者血液中的LNCaP细胞或前列腺癌细胞。通过实施例2和3中描述的方法富集，分离，固定和贮存的癌细胞用抗PSA和PAP第一抗体通过免疫细胞化学染色，并且第二抗体通过荧光染料缀合。免疫细胞化学染色后，样品在室温下用1％多聚甲醛处理10分钟。多聚甲醛处理提供荧光原位杂交(FISH)之前癌细胞的后固定，以及使抗体和抗原交联，使复合物在FISH过程期间更稳定。室温下，载玻片通过0.1M盐酸-0.1％Triton X-100溶液预处理20分钟，然后在75％，85％和95％乙醇中脱水，每级脱水2分钟。样品空气风干。

制备FISH鸡尾酒液体用于染色体着丝粒7和8染色。FISH“鸡尾酒”包括FISH缓冲液，其含有50％甲酰胺和2XSS，染色体着丝粒7和8DNA探针通过荧光染料缀合。覆盖10μlFIAH“鸡尾酒”和盖玻片的细胞在80℃变性10分钟，并且在42℃保温2小时。载玻片在60℃在1XSSC中冲洗10分钟。10μl含有0.2μg/ml DAPI的不变色(antifade)固定培养基被用来计数染色。在荧光显微镜下检查样品。

对于前列腺特异性抗原(PSA)对LNCaP细胞免疫荧光染色显示出绿色，代表细胞质中PSA抗体的免疫反应。

LNCaP细胞对于细胞核显示出免疫荧光，和蓝染色(DAPI)显示的一样。

用前列腺特异性酸性磷酸酶(PSAP)抗体通过免疫细胞化学染色的LNCaP细胞显示出在细胞质中的染色，而蓝色染色显示用DAPI染色的核。

来自前列腺癌患者血液的前列腺细胞用PSA抗体通过免疫化学在细胞质中染色(绿色)，然后通过FISH用染色体着丝粒7(蓝)和染色体着丝粒8(红)探针在核中染色。

实施例9

该实施例详细说明通过实施例2和3描述的方法富集和分离癌细胞的效率。

以不同比例的白细胞(WBC)与LNCaP细胞用LNCaP细胞重建血液样品。表6和7列出的细胞回收数据证明癌细胞是可以以高回收百分率回收的。

表6.从重组血液回收LNCaP细胞

WBC∶LNCaP WBC LNCaP 回收LNCaP，

计数％

500∶1 2.76×10⁷ 6.5×10⁴ 5.5×10⁴ 84.6

1000∶1 2.76×10⁷ 3.2×10⁴ 2.7×10⁴ 84.6

10000∶1 2.76×10⁷ 3.2×10³ 2.8×10³ 86.2

0∶20000(对照) 0 2.3×10⁵ 1.8×10⁵ 78.3

表7.重组血液中前列腺癌细胞(LNCaP)的回收

样品序号血量 WBC计数 LNCaP细胞计数收率

51-9B3329 9.0ml 1.57×10⁸ ～100 85 85％

51-5B3320 9.0ml 1.47×10⁸ ～100 80 80％

51-0B3340 9.0ml 1.78×10⁸ ～100 97 97％

51-0B3337 9.0ml 1.70×10⁸ ～100 95 95％

51-0B3314 9.0ml 6.64×10⁷ ～100 82 82％

51-7B3333 9.0ml 1.26×10⁸ ～100 94 94％

51-0B3323 9.0ml 1.09×10⁸ ～100 90 90％

51-6B3339 9.0ml 7.84×10⁷ ～100 96 96％

51-2B3330 9.0ml 2.32×10⁸ ～100 75 75％

51-8B3310 9.0ml 1.59×10⁸ ～100 90 90％

N＝10 9.0ml 1.42×10⁸ ～100 88.4 88.4％

从重组血液分离的LNCaP细胞具有小于1％的源WBC浓度。污染成分有如下顺序：单细胞＞淋巴细胞＞嗜伊红性粒细胞。发现从重组血液分离的LNCaP细胞在RPMI1640培养基中生长。通过3天后变换培养基能降低WBC污染。

实施例10

该实施例详细说明通过结合免疫细胞化学染色和细胞角蛋白单抗，FISH与染色体着丝粒7和18探针，和PSMAmRNA探针鉴定患者血液中的LNCaP细胞或前列腺癌细胞。

样品在室温下用100％丙酮固定2-3分钟。载玻片经空气风干，并且在室温下保存的载玻片盒中。载玻片在室温下在0.1MTris洗涤缓冲液中孵育10分钟，并且从载玻片表面取出液体。向载玻片上加入25μlFITC缀合的抗-细胞角蛋白(CAM5.2)单克隆抗体(Becton-Dickinson，San Jose，CA；Cat.347653)(1∶2稀释)。载玻片与盖玻片在37℃潮湿的箱中孵育1小时。揭开载玻片，并且载玻片在室温下在0.1MTris洗涤缓冲液中洗涤10分钟。然后载玻片在黑暗地方空气风干。

制备1％多聚甲醛与0.1M MgCl₂，并且在冰上预冷却。将1.0ml1％多聚甲醛滴加到样品区。样品在室温下固定2-5小时。从载玻片表面去除固定剂，该载玻片在室温下空气风干。

根据如下制备FISH混合物(每份样品)：

FISH缓冲液(Oncor) 9.0μl

Cy3-染色体着丝粒探针18 28ng 0.5μl

Cy3缀合的PSMA-mRNA探针 25ng 0.5μl

Cy5-PSA-mRNA探针 25ng 0.5μl

Cy5-染色体着丝粒探针7 28ng 0.5μl

Cy5-染色体着丝粒探针8 28ng 0.5μl

FISH混合物加入到样品区。加上盖玻片并用橡胶泥密封。样品在85℃变性7分钟，并且载玻片在42℃保温2小时。载玻片在60℃在1XSSC中冲洗5分钟，并且样品在室温下空气风干。样品用DAPI计数染色，在荧光显微镜下检查载玻片。

结果总结于表8。

表8.用细胞角蛋白免疫细胞化学染色和前列腺特异性膜抗原(PSMA)mRNA探针和染色体着丝粒8和18探针的荧光原位杂交(FISH)以及DAPI核染色(阳性染色百分比)检测5种前列腺癌细胞系

癌细胞系免疫细胞化学 PSMA-mRNA 染色&18 DAPI

LNCaP 100％ 100％ aneuploid(95-100％) 100％

TSU-PRI 100％ 100％ aneuploid(95-100％) 100％

DUMS 100％ 100％ aneuploid(95-100％) 100％

PC-3 100％ 100％ aneuploid(95-100％) 100％

PPC-1 (-) (-) aneuploid(95-100％) 100％

前列腺癌细胞用Cy3缀合的前列腺特异性膜抗原(PSMA)mRNA探针在细胞质中染色。该细胞在荧光素缀合的人7染色体着丝粒探针染色的核中显示出4个浅绿色染色体着丝粒7信号。核用蓝DAPI染色。

另一种前列腺癌细胞在细胞质中具有浅绿色细胞角蛋白染色和在DAPI染色的核中染色体8同源多倍性信号(4个红点)。白细胞显示具有2个染色体8信号(正常染色体数目)的蓝核。

实施例11

该实施例详细说明通过使用实施例2的方法从晚期前列腺癌患者的血液中成功分离和鉴定前列腺癌细胞。

表9中列出患者数，收集的血液的体积，分离的前列腺癌细胞的数目。

表9.从晚期前列腺癌患者的血液中收集前列腺癌细胞

患者序号血量(ml) 前列腺癌细胞

(N＝13) (计数)

PC253 10 200

PC254 20 140

PC255 27 260

PC256 9 6

PC257 27 90

PC258 15 40

PC259 27 没有测定

PC260 22 旋压失败

PC261^* 15 没有测定

PC262^* 15 没有测定

PC263 7.5 没有测定

PC264 16 没有测定

PC265 9 20

*对照样品来自正常成年血液

实施例12

该实施例详细说明通过从晚期前列腺癌患者的血液中成功分离和鉴定前列腺癌细胞(参见实施例10中的方法)。

在试验I中，是平行研究，相同的样品分成两个等份，并且用相同的方法处理。表10中列出患者数，收集的血液的体积，分离的前列腺癌细胞的数目。平行研究的结论是分离过程是可重复的。

在试验II中，是贮存研究，相同的样品分成两个等份，并且用相同的方法处理。A组中的样品在24小时内处理，B组中的样品在72小时4℃贮存之后处理。表11中列出患者数，收集的血液样品的体积，分离的前列腺癌细胞的数目。贮存研究的结论是癌细胞一般在72小时贮存之后不保持。在其中细胞在72小时贮存之后保持的情况下，癌细胞是较小大小(大约单细胞大小)，但是细胞质中有非常典型的且非常强的细胞角蛋白体系染色。

表10.从晚期癌症患者血液中检测前列腺癌细胞

试验I：

序号 PSA量血液总计No.

(U/L) (ml)

#1 58 19.9 20 3 4 7

#2 58 81.1 18 2 3 5

#3 72 76.0 18 5 4 9

#4 66 44.9 15 2 2 4

#5 69 ＜0.1 20 1 2 3

#6 ？ 18.6 18 2 2 4

#7 63 388.2 20 2 3 5

#8 78 212.6 20 6 4 10

#9 74 379.1 20 1 5 16

1聚族 2聚族

#10 67 61.7 20 2 1 3

#11 71 182.6 20 1 1 2

#12 42 4.4 20 0 0 0

#13 53 85.7 20 8 7 15

#14 59 37.7 20 0 0 0

#15 59 6.1 20 0 0 0

#16 58 337.3 15 5 5 10

#17 67 14.69 20 0 1 1

#18 81 17.5 20 11 12 23

#19 72 9.7 20 0 0 0

#20 81 61 20 1 2 3

#21 54 43 20 3 4 7

#22 61 ＜0.1 18 0 0 0

#23 69 1.15 20 0 0 0

#24 61 44.3 18 0 0 0

#25 61 25.1 16 1 1 2

*相同的样品分成两个等份，并且用相同的方法处理。

表11.从晚期癌症患者血液中检测前列腺癌细胞

试验II：

序号年龄 PSA量血液癌细胞总计No.

(U/L) (ml)

A组 B组

#18 81 100 16 12 12 24^**

#26 58 44 20 0 0 0

#27 72 ？ 15 0 0 0

#1 58 52.6 20 2 0 2

#2 68.3 72 20 3 0 3

#7 63 381.5 20 2 0 2

#13 53 26.2 20 4 0 4

#16 58 23.2 20 0 0 0

#25 61 24.1 20 2 0 2

#27 58 14.6 20 1 0 1

**癌细胞是较小大小(大约单细胞大小)，但是细胞质中有非常典型的且非常强的细胞角蛋白体系染色。

实施例13

该实施例详细描述使用单一密度梯度柱子分离前列腺癌细胞的方法。

使血样进行实施例2列出的过程，除了密度是1.068g/ml的梯度柱子的离心在室温下以400×g进行30分钟，而不是20分钟。如实施例2所述制备载玻片。

试验重复9次以上，每次用新鲜的血样。10次试验中前列腺癌细胞的平均回收率是70-80％。

实施例14

该实施例详细描述使用双密度梯度柱子分离前列腺癌细胞的方法。

将来自实施例13的密度梯度的沉淀物再悬浮于来自实施例13的血浆级分，在含有具有1.083g/ml密度的10ml FICOLL^TM基质和具有1.077g/ml密度的5ml FICOLL^TM基质的双密度梯度柱子上形成一层。悬浮液在柱子上形成层，使得其与低密度基质接触，而低密度基质与高密度基质接触。因此用图2B左侧为参考，梯度III具有1.077g/ml密度，梯度II具有1.083g/ml密度。密度梯度柱子在室温下以400×g离心。

用图2B右侧为参考，用细胞移液管小心取出界面(血浆和梯度II和III之间的界面II)处的细胞，并放在新的试管中。再向新的试管中加入40mlPBS并混合。然后PBS稀释的细胞以250×g离心。得到的沉淀物物悬浮于2ml 0.1wt.％BSA溶液中，使用光学显微镜计数白细胞。

将CD45-Dynal珠加入到上述细胞悬浮液中(对于每一WBC使用大约3个珠)。轻柔振荡下，细胞悬浮液与Dynal珠在4℃下孵育30分钟。含有细胞和珠的试管被放置在磁性颗粒浓缩器(Dynal Corp.)中，并且将悬浮液中的细胞移液到没有珠的新的试管中，并且通过磁性颗粒浓缩器将吸附的血细胞保持在试管中。

该细胞悬浮液以250×g离心。获得的沉淀物再悬浮于30μl1wt.％BSA溶液中。这样制备的细胞悬浮液点涂在载玻片上，每次用10μl悬浮液。使载玻片在空气中风干2小时。细胞用95％乙醇固定10-15分钟，然后用改良的Carnoy’s固定剂固定。

实施例15

该实施例详细说明了从血液中分离前列腺癌细胞的实施例13详述的方法的效率。

使血样进行实施例14列出的过程，除了双密度梯度柱子离心进行20分钟而不是30分钟。

测定总细胞数，界面处细胞数，底部的细胞数和损失的细胞数，表12中列出了数据。

表12.使用双密度梯度分离前列腺癌细胞。

前列腺癌细胞系LNCaP P100 TSU wt

％里面处细胞^* ～1％ 14.5％

％底部细胞^* 0 ～1％

％损失细胞^* 0 0

*该柱子含有从1.068g/ml梯度柱子“渗漏”的癌细胞。

实施例16

该实施例详细说明了使用双密度梯度柱子富集前列腺癌细胞。

将20ml新鲜血液取样到两个试管中。用PBS以1∶2稀释血液。30ml稀释的血液在如图3左侧所示的具有10ml 1.068g/ml密度的Histopaque^TM(Sigma Che mical Co.)上层和10ml 1.068g/ml密度的Histopaque^TM下层的双密度梯度柱子上形成一层。该柱子在室温下以400×g离心30分钟，形成如图3右侧所示6层。

离心后，小心地将界面I和梯度I移取到另一个试管中。也小心地将界面II和梯度II移取到另一个试管中。

向含有界面I和梯度I的试管中加入40mlPBS并且混合。PBS稀释的细胞以250×g离心5分钟。得到的沉淀物物悬浮于50μl 1％BSA溶液中，形成细胞悬浮液，其被点涂到载玻片上。该载玻片空气风干至少2小时。细胞用95％乙醇固定15分钟，然后用改良的Carnoy’s固定剂固定10分钟。载玻片在4℃下在75％乙醇中贮存直到使用。

如上所述也小心取出界面II和梯度II到新的试管中。向新的试管中加入40mlPBS并且混合。PBS稀释的细胞以250×g离心5分钟。得到的沉淀物物悬浮于2ml 1％BSA溶液中。将CD45-Dynal珠加入到细胞悬浮液中(对于每个白细胞使用大约3-10个珠)。轻柔旋转下，细胞悬浮液与Dynal珠在4℃下孵育30分钟。

含有细胞和珠的试管被放置在Dynal磁性颗粒浓缩器(DynalCorp.)中，操作浓缩器以吸附珠并且将血细胞吸附到试管壁上。

含有癌细胞的悬浮液被移取到另一个试管，如上所述制备载玻片。

实施例17

该实施例详细说明了从血液中分离前列腺癌细胞的实施例16中所描述的方法的效率。实施例16中所描述的方法被重复9次以上，每次使用含有LNCaP细胞的新鲜血样。前列腺癌细胞从界面I和梯度I的平均回收率是大约70-80％。前列腺癌细胞从界面II和梯度II的平均回收率是大约5-10％。

该申请中列出的所有的核酸序列在5’-3’排列中给出。

这里引用的所有的参考包括专利和公开物在这里全文引作参考。

关于一些优选的实施方案和方法本发明已经进行了描述和公开，但是这不是要将本发明范围限制到这些具体的实施方案。而是要覆盖本发明精神和范围内的所有变化的实施方案和改变。

序列表

(1)一般信息：

(i)申请人：Ts’o，Paul O.P.

Wang，Zheng-Pin

Lesko，Stephen A.

Nelson，William G.

Partin，Alan W.

(ii)发明题目：富集稀少细胞的方法

(iii)序列数：10

(iv)通讯地址

(A)住址：Leydig，Voit & Mayer，Ltd.

(B)街道：700 Thirteenth St.，NW

(C)城市：Washington

(D)州：DC

(E)国家：US

(F)邮编：20005

(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：Floppy盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release #1.0，版#1.30

(vi)当前申请数据：

(A)申请号：WO

(B)申请日：

(C)分类：

(vii)先前申请数据：

(A)申请号：US 60-014929

(B)申请日：05-APR-1996

(C)分类：

(viii)代理人/事务所信息

(A)名字：Jay，Jeremy M.

(B)登记号：33587

(C)：73378

(ix)电讯信息：

(A)电话：202-737-6770

(B)电传：202-737-6776

(2)SEQ ID NO.1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：72碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO.1：

TGGCTGTGCG CTGGGGCGCT GGTGCTGGCG GGTGGCTTCT TTCTCCTCGG CTTCCTCTTC 60

GGGTGGTTTA TA 72

(2)SEQ ID NO.2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：50碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO.2：

AGTGTCTATG AAACATATGA GTTGGTGGAA AAGTTTTATG ATCCAATGTT 50

(2)SEQ ID NO.3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：60碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO.3：

GGTCCTCACA GCTGCCCACT GCATCAAA CAAAAGCGTG ATCTTGCTGG GTCGGCACAG 60

(2)SEQ ID NO.4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：60碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO.4：

CGCTGGACAG GGGGCAAAAG CACCTGCTCG GGTGATTCTG GGGGCCCACT TGTCTGTAAT 60

(2)SEQ ID NO.5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：50碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：核酸(合成的DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO.5：

GCTGTGGCAT TTTCAGGTGG AGATTTTCAAG CGATTTGAGG ACAATTGCAG 50

(2)SEQ ID NO.6的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：50碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：核酸(合成的DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO.6：

GTGTTTGAGC TAGCCAATTC CAATGTGCTC CCTTTTGATT GTCGAGATTA 50

(2)SEQ ID NO.7的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：60碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO.7：

TCTTCCTCAC CCTGTCCGTG ACGTGGATTG GTGCTGCACC CCTCATCCTG TCTCGGATTG 60

(2)SEQ ID NO.8的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：60碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO.8：

CAGGCTGGGG CAGCATTGAA CCAGAGGAGT TCTTGACCCC AAAGAAACTT CAGTGTGTGG 60

(2)SEQ ID NO.9的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：30碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(x)公开信息：

(A)作者：Meyne，Julianne

Moyzis，Robert K.

(B)标题：原位杂交方法

(C)期刊：Meth.in Mol.Biol.

(D)卷：33

(F)页：63-74

(G)日期：1994

(xi)序列描述：SEQ ID NO.9：

GTACTCACAC TAAGAGAATT GAACCACCGT 30

(2)SEQ ID NO.10的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：42碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO.10：

ATGTGTGTAC TCACACTAAG AGAATTGAAC CACCGTTTTG AA 42

Claims

1.富集含有癌症细胞和非稀少细胞的体液样品中癌症细胞的方法，包括：

(a)获得含有癌症细胞和非稀少细胞的样品；

2.权利要求1的方法，其中所述癌细胞在所述方法过程中是存活的。

3.权利要求2的方法，其中所述癌细胞是上皮细胞。

4.权利要求3的方法，其中所述上皮细胞是前列腺癌细胞。

5.权利要求4的方法，进一步包括使用前列腺细胞表达的至少一种前列腺特异性标记表征前列腺细胞。

6.权利要求5的方法，包括检测至少一种前列腺特异性抗原和前列腺特异性膜抗原。

7.权利要求4的方法，进一步包括使用前列腺细胞表达的细胞角蛋白蛋白质标记表征前列腺细胞。

8.权利要求6的方法，其中至少一种前列腺特异性抗原和前列腺特异性膜抗原用特异性结合所述抗原的mRNA的核酸探针检测。

9.权利要求8的方法，其中所述探针选自由SEQ.ID.Nos.1，2，和6组成的组。

10.权利要求8的方法，其中所述探针选自由SEQ.ID.Nos.3，4，7和8组成的组。

11.权利要求6的方法，其中至少一种前列腺特异性抗原和前列腺特异性膜抗原用特异性结合所述抗原的抗体检测。

12.权利要求3的方法，进一步包括用至少一种着丝粒特异性标记表征上皮细胞的染色体倍性态。

13.权利要求12的方法，其中着丝粒特异性标记包括特异性结合着丝粒DNA互补序列的核酸探针。

14.权利要求13的方法，其中所述探针包括SEQ.ID.No.5。

15.权利要求13的方法，其中所述探针包括SEQ.ID.No.10。

16.权利要求1的方法，其中所述的结合剂包含一种抗体。

17.权利要求16的方法，其中所述结合剂包括至少两种来自动物的能结合不同非稀少细胞抗原的第一抗体。

18.权利要求16的方法，其中所述结合剂包括来自动物的结合非稀少细胞的第一抗体，来自不同于第一抗体的另一物种的第二抗抗体，其中所述第二抗抗体结合第一抗体。

19.权利要求17的方法，其中至少两种第一抗体能结合人非稀少细胞抗原，结合剂进一步包括能结合两种第一抗体的第二抗体，其中第一抗体来自于与第二抗体不同的物种。

20.权利要求1的方法，其中使样品进行密度梯度分离，包括使用至少一种具有不小于大约1.06g/ml密度的密度梯度介质。

21.权利要求3的方法，进一步包含检测癌细胞中染色体的数目。

22.权利要求4的方法，进一步包含检测前列腺癌细胞中染色体的数目

23.权利要求21的方法，包括测定稀少癌细胞中非整倍性的存在。

24.权利要求3的方法，包括将癌细胞的浓度，与液体样品中的癌细胞相对于非稀少细胞的浓度相比，提高至少约500倍。

25.权利要求1的方法，其中癌细胞是人肝细胞，肝细胞瘤细胞，或肝癌细胞。

26.权利要求1的方法，其中的液体是血。

27.权利要求1的方法，包括使含有提高浓度的第二密度的癌细胞的第二液体与结合白细胞和红细胞的结合剂接触，从第二液体中去除结合的白细胞和结合的红细胞，提供富集较大密度癌细胞的第二液体。

28.权利要求1的方法，其中细胞在所述方法过程中是存活的。

29.权利要求1的方法，其中非稀少细胞包括血细胞。

30.权利要求29的方法，其中血细胞包括白细胞和红细胞。

31.权利要求1的方法，其中第一密度梯度具有约1.068g/ml至约1.077g/mL，第二密度梯度具有约1.077g/mL至约1.085g/mL的密度。

32.权利要求3的方法，其中上皮细胞癌细胞包含乳腺癌细胞。

33.权利要求3的方法，其中上皮细胞癌细胞包含肾癌细胞。

34.权利要求1的方法，其中将第二液体与结合剂结合包括将白细胞和/或红细胞与磁珠结合。

35.检测包含癌和非稀少细胞的液体中癌细胞的方法，包括提供通过权利要求1的方法富集癌细胞的液体，分析所述液体以检测癌细胞，其中所述的检测方法包括至少一种选自如下一组的方法：免疫细胞化学染色，核酸杂交和聚合酶链反应研究。

36.检测包含前列腺癌和非稀少细胞的液体中癌细胞的方法，包括提供通过权利要求4的方法富集前列腺癌细胞的液体，分析所述液体以检测癌细胞，其中所述的检测方法包括至少一种选自如下一组的方法：免疫细胞化学染色，核酸杂交和聚合酶链反应研究。