CN1240028A - 检测抗p53抗体的测定方法 - Google Patents

检测抗p53抗体的测定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1240028A
CN1240028A CN97180373A CN97180373A CN1240028A CN 1240028 A CN1240028 A CN 1240028A CN 97180373 A CN97180373 A CN 97180373A CN 97180373 A CN97180373 A CN 97180373A CN 1240028 A CN1240028 A CN 1240028A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
antibody
sequence
sample
blood serum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN97180373A
Other languages
English (en)
Inventor
D·T·梅泰奇
S·J·斯旺森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Sharp and Dohme Corp
Original Assignee
Schering Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Schering Corp filed Critical Schering Corp
Publication of CN1240028A publication Critical patent/CN1240028A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/82—Translation products from oncogenes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明提供一种检测能结合p53蛋白的抗体的方法，该方法使用固定有p53肽的、表面等离子体振子共振生物传感器。

Description

检测抗p53抗体的测定方法
本专利申请要求获得于1996年10月7日提交的美国临时专利申请号60/028,533，根据联邦法规标题35，&119(e)所包含的利益。
发明领域
本发明涉及一种检测能与p53蛋白，特别是人的p53蛋白，结合的抗体的方法。
背景
野生型p53基因是一种编码细胞的野生型p53蛋白的肿瘤抑制基因。内源性野生型p53蛋白在多种癌细胞内，如乳腺癌细胞和肺癌细胞内，是缺乏的(或缺如或突变)，已经发现给缺乏内源性野生型p53蛋白的癌细胞施予野生型p53基因能通过抑制其肿瘤的表型用以治疗癌症。见美国专利5,532,220。
在实行p53基因治疗中，极希望在曝露于外源p53基因之前及后监测患者的血清样品，以确定应此种曝露的免疫原性反应是否增高。这可通过利用在血清样品中筛选能够结合p53的抗体的试验来完成。而且，由于有些癌症患者对他们生成的突变p53产生抗体，很需要有一种诊断试验来测定血清样品中存在的能结合p53的抗体。
在PCT专利出版物WO94/10306中Soussi等披露了一种试验方法，用生物素化的肽以酶联免疫吸附试验(ELISA)的形式检测患者血清样品中的p53抗体。然而，仍极期望提供一种新的、改进的检测p53抗体的试验方法。需要改进的主要方面如下：首先，急需一种更适于检测低亲和力抗体的试验方法。采用ELISA方法在这方面有困难，因为ELISA需要多次的温育步骤及随后的洗涤循环，在此过程中低亲和力抗体会被洗掉。其次，需要一种比使用ELISA方式的麻烦程度低的方法。第三，需要显著地缩短分析时间，最好是每样品少于10分钟，以便能进行高流通量的分析。如上所述，ELISA需要多次的温育步骤及随后的洗涤循环，因此试验中所使用的材料不能再生用于其后样品的分析。
发明概述
本发明能满足前述的需要，提供一种测定能与p53蛋白结合的抗体的方法，包括：
A)将一种肽直接固定在生物传感器中的传感芯片的流动池上，该肽能特异性地与抗p53的抗体相结合，
B)从待测患者获得血清样品并将此血清样品稀释在适当的缓冲液中，
C)使稀释的血清样品与固定化的肽接触，以及
D)用生物传感器测定抗体与固定化肽的结合。
在本发明的方法中，优选使用多数的选择的免疫原性肽，每一种肽直接固定在各自分别的流动池上。优选地，第一种肽选自p53蛋白的氨基端区域，第2种肽选自p53蛋白的羧基端区域。更优选地，本发明使用以下4种肽中的一种或多种(或与之具有基本序列同一性的肽)：
a)包含序列1(C11-35，相当于人p53蛋白残基11-35；H-CEPPLSQETFSDLWKLLPENVLSPL-酰胺)的一种肽，或与之具有基本序列同一性的一种肽；
b)包含序列2(C40-65，相当于人p53蛋白残基40-65：H-CMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPR-酰胺)的一种肽，或具有基本序列同一性的一种肽；
c)包含序列3(C346-370，相当于人p53蛋白残基346-370：H-EALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLK-酰胺)的一种肽，或具有基本序列同一性的一种肽；以及
d)包含序列4(C371-390，相当于人p53蛋白残基371-390：H-CSKKGQSTSRHKKLMFKTEGP-酰胺)的一种肽，或具有基本序列同一性的一种肽，
(以上列举序列采用标准的单字母氨基酸符号；见，如，Lehninger，Principles of Biochemistry，Worth Publishers，Inc第6版，1998，p.96)。
附图简述
图1以响应单位对稀释倍数作图，表示上述4种肽对正常人血清中抗体的相对灵敏度。
图2以响应单位对稀释倍数作图，表示上述4种肽对正常猪血清中抗体的相对灵敏度。
图3A及3B以图形描述正常人血清样品中抗体(对上述4种肽)的结合。图中缩写：NHS＝混合的正常人血清。POS＝羊多克隆抗体以1∶200稀释于混合正常人血清中。对于肽C11-35，均值为41.1，标准差(SD)为29.8；对于肽C40-65，均值为30.6，标准差为27.0；对于肽C346-370，均值为38.9；标准差为30.9；对于肽C371-390，均值为38.0，标准差为18.7。
图4A及4B以图形描述正常猪血清样品中抗体(对上述4种肽)的结合。图中，NPS＝混合正常猪血清，1∶40稀释，POS＝羊多克隆抗体以1∶200稀释于混合正常猪血清中。对于肽C11-35，均值为50.9，标准差17.7；对于肽C40-65，均值为52.9，标准差15.6；对于肽C346-370，均值为35.0，标准差16.6，对于肽C371-390，均值为38.8，标准差14.8。
发明详述
此处引用的一切参考文献均全文引入以供参考。
本发明方法中，选用的免疫原性肽直接固定在生物传感器的传感芯片的流动池上。以往的试验，例如Soussi等的试验所采用的ELISA方式利用固定化的链亲和素去捕获生物素化的肽，因此，肽的固定是间接的。此处例子(下文详述)中描述的优选实施方案中，直接固定技术包括使用胺及/或巯基化学法直接固定N-标记的半胱氨酸肽。
发明人发现直接固定法具有数种关键性的优势，包括对低亲和力抗体的检测要好得多(得到显著夺更加精确的分析)。此外，本发明显著地缩短分析时间，得以进行高流通量的分析。与以往的测定不同，本发明的测定法具有直接固定的特征，藉以下事实得以实现高流通量，即在分析了一个样品后，在此测定中所用过的材料能迅速再生用于以后样品的分析。本发明的直接固定技术允许用试剂，如HCl-SDS溶液(优选25mM HCl-0.25％SDS)进行快速而容易的洗涤。
本发明还提供一种测定方法只需要少量的血清，例如少于5μl，来进行一次分析。过去的测定采用ELISA型式的微量滴定板可能需要病人更多的血清，例如当需要鉴定病人生成的抗体特性时。在这方面，发明人也已发现他们的新方法能对测出的抗体进行同种型鉴定而不需要另外的样品。(Soussi等的测定方法为确定同种型需要多次使用样品)。
本发明方法中采用的优选肽选自以下：
a)肽C11-35，相当于人p53蛋白残基11-35；H-CEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPL-酰胺；
b)肽C40-65，相当于人p53蛋白残基40-65：H-CMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPR-酰胺；
c)肽C346-370，相当于人p53蛋白残基346-370：H-CEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLK-酰安；以及
d)肽C371-390，相当于人p53蛋白残基371-390：H-CSKKGQSTSRHKKLMFKTEGP-酰胺，
与上述肽具有基本序列同一性的肽也能在优选实施方案中使用。此外，“基本序列同一性”的含义是：当两种肽序列，进行最优方式对比时，譬如藉使用“缺失间隔加权”的GAP或BESTFIT程序，具有至少80％序列同一性，优选地至少90％序列同一性，更优选地至少95％序列同一性或更高。优选地，不同一的残基位置的差异是保守性氨基酸替换。例如，具有相似化学性质如电荷或极性的氨基酸的替换不大可能影响蛋白质的性质。这类例子包括谷氨酰胺替代天冬酰胺或谷氨酸替代天冬氨酸。
本发明的优选实施方案中多种被选择的免疫原性肽能得到直接固定，每种固定在各自分隔的流动池上。例如，第一个肽可选自p53蛋白的氨基端区，第二个肽可选自p53蛋白的羧基端区。在一个更为具体的例子中，第一个肽包含序列1(H-CEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPL-酰胺)，第二个肽包含序列4(H-CSKKGQSTSRHKKLMFKTEGP-酰胺)。此外，还可使用第三个肽，其包含序列2(H-CMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPR-酰胺)，第四个肽，其包含序列3(H-CEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLK-酰胺)。
本发明方法中也可使用磷酸化肽。特别是，丝氨酸残基可被磷酸丝氨酸残基替换，苏氨酸残基可被磷酸苏氨酸残基替换。作为例子，成功地应用于本发明方法的肽选自以下：
a)一种包含序列1的肽，或一种与之具有基本序列同一性的肽，其中肽内的所有丝氨酸残基被替换为磷酸丝氨酸残基；以及
b)一种包含序列3的肽，或一种与之具有基本序列同一性的肽，其中肽内的所有丝氨酸残基被替换为磷酸丝氨酸残基。
本发明所采用的生物传感器优选为BIAcore(Uppsalla，瑞典)的BIAcore 2000TM(以前可从Pharmacia获得)。BIAcore 2000TM以表面等离子体振子共振原理操作并可作高流通量分析，(见如，Hodgson，Bio/Technology vol.12 Jan，1994，生物传感器的综述)：其它生物传感器，如：BIAcore的BIA core X或Fisons的IAsys生物传感器可与本发明结合使用。在分析测定结果时，优选与每种肽结合的抗体量与生物传感器的信号成正比(如，BIAcore 2000TM生物传感器报告的响应单位)。
在执行本发明方法中，在将血清样品与固定化肽同时接触的步骤之前，优选用含有去垢剂P-20及羧甲基葡聚糖的HEPES缓冲盐溶液将待分析血清样品稀释为1∶2～1∶500 (更优选为1∶2～1∶500，更加优选稀释为1∶40)。
参考以下实例可以了解本发明的较宽范围，这个实例并不意味着此发明局限于特定的实施方案。
实例
此处叙述的特定实例中，每一种肽直接固定在BIAcore 2000TM(BIAcore，Uppsalla，瑞典)的传感器芯片分隔流动池的表面。血清样品进行稀释(在本例中，1∶40稀释于含去垢剂P-20及羧甲基葡聚糖的HEPES缓冲盐溶液)，并使之同时与每个固定肽进行结合。与每种肽结合的抗体量与仪器报告的响应单位成正比。这些流动池同时用25mMHCl-0.25％SDS再生，以除去结合的抗体，然后分析下一个样品。
以下数据表明，本发明测定法能精确地测出人和猪血清样品中的p53抗体，而且测定以自动化的形式进行，实现高流通量的样品的分析。一个传感器芯片可用以分析多个人员在药利前及药剂后的样品，并在每次测定的超始及终末同时分析一个阳性对照(如，来自Oncogene Sciences或相当者的羊多克隆抗p53抗体)和阴性对照(混合血清)。
判断样品存在抗人p53抗体“阳性”的起始标准为：1)对任一固定肽的结合超过阈值，2)证实这种结合是由于免疫球蛋白。或者，同种型试剂抗人IgGl，抗人IgG2，抗人IgG3，抗人IgG4，抗人IgA及抗人IgM(来自ICN或相当者可被加在序列中并监测其结合。一个人如果将其在给与含p53基因的递送运载体(如，载体)后所采样品与其本人在给药前的样品相比较，结合超过了阈值，后响应单位增高至少2倍，就可以认为他已产生了抗p53的抗体。(关于载体，Wills等描述了一种腺病毒p53基因治疗载体的构建，Human Gene Therapy 5：1079(1994))。II.合成肽的选择
以下合成肽(每一个用-N-末端半胱氨酸残基合成以促进偶联)选用于本例中的测定。
a)肽C11-35，相当于人p53蛋白残基11-35；H-CEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPL-酰胺(序列1)。
b)肽C40-65，相当于人p53蛋白残基40-65：H-CMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPR-酰胺(序列2)。
c)肽C346-370，相当于人p53蛋白残基346-370：H-CEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLK-酰胺(序列3)。
d)肽C371-390，相当于人p53蛋白残基371-390：H-CSKKGQSTSRHKKLMFKTEGP-酰胺(序列4)。III.合成肽的固定及再生稳定性
肽C371-390用氨基偶联固定。为此固定化，将肽在20mM硼酸缓冲液pH8中稀释至100μg/ml。其余三个肽用巯基偶联固定。肽C11-35在10mM醋酸钠缓冲液pH4中稀释至700μg/ml，肽C40-65在10mM醋酸钠缓冲液pH4中稀释至1mg/ml；肽C346-370在10mMMES缓冲液pH5中稀释至500μg/ml。
肽的固定化总结于表1。(表1～7一起放在节X之后)。表1的数据表明肽的固定化有变异性。这种变异并不影响测定的精确性(在下文节V中讨论)。这些数据提示：很重要的是要核实所固定的肽量是以结合1∶200稀释的阳性对照抗体。以25mM HCl和0.25％SDS再生中的稳定性的数据(表1)说明固定肽表面至少在147个再生循环中是稳定的，因为在经过多个再生循环后阳性对照平行测定的结合，对所有肽来说，都在20.4％变异系数(“CV”)内。IV.线性/灵敏度
藉测定不同稀释度的羊阳性对照抗体，并将响应单位对样品稀释倍数作图测定了本试验方法的线性。(BIAcore 2000TM生物传感器的1000响应单位(或共振单位)相当于1ng/mm2，见，如，BIAcore方法手册)。如图1所示，稀释于混合正常人血清中的阳性对照的响应在1∶10的起始稀释度直至1∶2560稀释度依赖于抗体浓度。C346-370肽被阳性对照的识别不象其它三种肽那样强。这些数据表明测定方法在将近2-10g浓度的范围内是灵敏的。图2的数据显示羊阳性对照稀释于混合正常猪血清中的灵敏度是相似的。在两种血清中，阳性对照与C11-35肽的反应最强，按其反应性依次为C40-65肽，C371-390肽，最后是识别较弱的C346-370肽。
此处需要指出，低亲和力抗体比高亲和力抗体特征性地具有更迅速的解离速率，按照本发明这种速率能在生物传感器上监测。(与之相反，ELISA只能测出在最后测定相中存在的抗体量而不能监测解离的发生)。V.精确度
测定人和猪血清样品试验的精确度，是将羊抗p53阳性对照抗体(Oncogene Sciences)以三种稀释度(1∶50，1∶100和1∶200)稀释于2.5％混合正常人血清和混合正常猪血清(稀释于含去垢剂P-20及可溶性羧甲基葡聚糖的HEPES缓冲盐溶液中)。然后在同一次测定中检测多份样品(测定内精确度)并在多次测定中进行检测(测定间精确度)。每一稀释度每天至少测4份样品，共5天。人血清样品的测定内精确度的结果见表2，测定间精确度的结果见表3。猪血清样品的测定内和测定间精确度的结果分别见表4及5。
人血清测定内精确度分析的样品中每一稀释度的阳性对照与每一种肽结合所得结果的变异系数在2％范围内。人血清测定间精确度分析的样品，对于能被阳性对照完全识别的各种稀释度的三种肽，变异系数在16.3％的范围内。对肽C346-370的变异系数的范围为22.6％～37.7％，因此此测定法对这种肽来说，由于多克隆羊抗体对此肽的低结合力，精确度较低。
猪血清测定内精确度分析的样品分析的变异系数为2.6％～16.1％。测定间精确度分析样品的变异系数均在3.6％-17.0％的范围内。
总起来看，这些结果说明本测定法对猪和人两种血清样品都是精确的。而且，与肽的固定相关连的变异对本测定法的测定间精确度没有明显影响，因为这些结果是用表1所述的多次固定而获得的。VI.阈值的测定
为测定与合成肽结合的阈值(对一个稀释样品判定为存在能结合p53的抗体阳性)，对正常人志愿者和正常猪血清样品进行了分析。例如，上述例子中的样品用含有羧甲基萄聚糖和去垢剂P-20的HEPES缓冲盐溶液进行1∶40稀释以减少非特异性结合。正常人血清样品的结合情况见图3A及3B。阳性样品与每种肽的结合阈值如下，C11-35＝131.5；C40-65＝130.4；C346-370＝111.6；C371-390＝94.1。阈值的定义为：正常人血清样品的结合(在一特定的血清样品的稀释度)的均值+3×标准差。任一样器对任一固定肽的结合超过阈值便可判定为具有抗人p53抗体活性。
正常猪血清样品的结合见图4A及4B。对于每种肽的阈值如下：C11-35＝104.1；C40-65＝99.6；C346-370＝84.9；以及C371-390＝83.1。阈值的定义同样为：从正常猪样品观察到的结合的均值+3×标准差。
如果符合以下条件则判定样品中能结合人p53的抗体是阳性的：1)对任一固定肽的结合高于阈值，以及2)这种结合是因免疫球蛋白引起的(藉将抗-种属免疫球蛋白加到捕获的抗-p53抗体中引起结合的增加可以确证)。
此外，如果发生以下情况，可以判定个体已对含p53的载体的处理生成了抗体：1)对任一固定肽的结合超过阈值，2)运种结合是因免疫球蛋白引起的(藉将抗-种属免疫球蛋白加到捕获的血清组分中引起结合的增加可以确证)，以及3)在施与载体后所得样品与施与前样品相比，其结合至少增加2倍。
(总之，人或猪的血清样品若能与4种合成肽中的任一种结合超过阈值，而且这种结合可用抗-种属特异免疫球蛋白增加结合的方法证实是由免疫球蛋白引起的，便可判定为阳性)。VII.特异性
本测定法的特异性是用加入一系列抗体和细胞因子于2.5％混合猪血清中并监测其对4种固定肽中每一种的结合来测定的。除了羊抗p53阳性对照抗体外，没有一种测试化合物显示对任一种固定肽有任何结合。这些结果表明本测定法对于抗人p53抗体是特异的。VIII.冻融的影响
为测定样品经多次冻融循环后是否还能用于再测定，用100％混合正常人血清制备的多份羊阳性对照抗体稀释物在分析抗p53抗体之前经受1～5次冻融循环。分析结果见表6，说明抗体样品经过至少5次冻融循环是稳定的。这些数据说明样品可以重新分析至少4次而不影响所得结果。IX.选择的癌症患者血清的反应性
测试了一些癌症患者的血清样品。如表7所示，2/7样品被检定出含有能与人p53结合的抗体。检定方法是重新测试最初为阳性的样品，并测试对合成肽的结合是否能被重复以及在加入抗人IgG/IgA/IgM(Kirkegaard与Perry，Gaithersburg，MD)(或相应物)后结合是否增加。X.总结
此处包含的数据表明本发明测定法是精确的，灵敏的，特异的，且不受多次冻融循环的影响。
表1    肽固定化的重复性和稳定性
                   固定化肽量，响应单位固化日期           C11-35 C40-65  C346-370 C371-390第1天               1175   871     1006      1051第14天               515   415      682      1607第18天               833   528      866      1072第19天               514   286      838      1593第22天               529   638      655      1493
  均值         713.2 547.6    809.4    1363.2
  标准值       291.8 223.1    143.8     279.0
  变异系数      40.9  40.7    17.8       20.5再生后肽的稳定性再生循环数        C11-35 C40-65  C346-370 C371-390
  2           3715.8  1519.2   68.6     712.2
  53          4866.5  1671.1   77.9     838.1
  147         4147.7  2189.9   51.4     745.6
  均值        4243.3  1791.4   66.0     765.3
  标准差       581.3   354.0   13.4      65.2
  变异系数      13.7    19.8   20.4       8.5稳定性的测定是在用25mM HCl及0.25％SDS多次再生循环后，将羊抗p53抗体以1∶50稀释于2.5％正常混合人血清进行多等份测定。表2    正常人血清的测定内精确度
              对每种肽的结合，响应单位
             C11-35  C40-65 C346-370 C371-390阳性对照1∶50    5131.4  1819.3   126.4   1114.7
             5049.6  1836.2   124.5   1126.8
             5152.1  1870.3   125.3   1152.2
             5054.7  1860.2   124.9   1148.3
均值         5097.0  1846.5   125.3   1135.5
标准差         52.5    23.1     0.8     17.8
变异系数％      1.0     1.3     0.7      1.6
均值         2606.3   983.8    65.9    555.8
标准差         35.5    14.3     0.4      5.1
变异系数％      1.4     1.5     0.6      0.9阳性对照         1295.4   488.9      36    275.11∶200
             1292.4   486.4      36    274.4
             1305.9   483.4    35.6    274.9
均值         1290.6   490.9    35.8    276.3标准差          15.7      9.5     0.3      3.1变异系数％         1.2      1.9     0.8      1.1表3    正常人血清的测定间精确度
                      对每种肽的结合，响应单位
                C11-35    C40-65   C346-370   C371-390阳性对照1∶50第1天  4345.9    1708.9     71.2       782.4
         第2天  4674.3    1856.7     72.6       805.4
         第3天  3204.0    1928.7      AA        989.0
         第4天  4284.8    2027.5     89.7      1001.5
         第5天  5097.0    1846.5    125.3      1135.5
均值            4321.2    1873.7     89.7       942.8
标准差           702.9     117.1     25.2       147.8
变异系数          16.3       6.3     28.1        15.7阳性对照1∶100第1天 2518.7     991.1     44.0       452.1
          第2天 2251.9     918.3     43.6       441.0
          第3天 1907.5     842.6      AA        479.8
          第4天 2148.9     854.5     43.4       480.7
          第5天 2606.3     983.8     65.9       555.8
均值            2286.7     918.1     49.2       481.9
标准差           282.8      69.6     11.1        44.8
变异系数          12.4       7.6     22.6         9.3阳性对照1∶200第1天 1285.6     588.1     27.1       257.0
          第2天 1272.9     587.3     23.6       243.5
          第3天  975.3     511.1      AA        240.2
          第4天  941.5     496.2     13.1       232.9
          第5天 1290.6     490.9     35.8       276.3
均值            1153.2     534.7     24.9       250.0
标准差           178.3      48.9      9.4        17.1
变异系数          15.5       9.2      37.7        6.8AA＝分析错误，数据未采用表中列举的均值代表每天4个平行样共5天的平均值。表4    正常猪血清测定内精确度
             C11-35    C40-65  C346-370   C371-390阳性对照1∶50    3948.9    2342.9     140.1    1435.1
             3603.7    2323.8     135.5    1395.1
             3639.9    2472.0     129.1    1395.3
             3693.5    2377.7     128.6    1360.9
             3277.1    2096.1     121.5    1264.6
             2574.5    1741.4     113.0    1148.1
均值         3456.3    2225.7     128.0    1333.2
标准差        482.5     267.8       9.7     107.5
变异系数       14.0      12.0       7.6       8.1阳性对照1∶100   1901.0    1168.1      77.3     691.5
             1722.6    1079.6      74.6     662.2
             1921.7    1175.2      71.6     673.7
             1755.3    1154.9      69.5     665.5
             1948.9    1094.4      69.1     653.3
             1949.0    1073.0      68.2     642.1
均值         1866.4    1124.2      71.7     664.7
标准差        100.9      46.8       3.6      17.0
变异系数        5.4       4.2       5.0       2.6阳性对照1∶200    922.9     579.3      48.1     349.3
              958.0     552.8      46.9     337.4
              872.8     572.4      42.7     335.2
              916.1     544.4      42.7     330.3
              742.7     412.4      39.2     287.2
              615.6     397.5      35.9     270.9均值              838.0     509.8      42.6     318.4标准差            132.3      82.3       4.6      31.5变异系数           15.8      16.1      10.8      9.9表5    正常猪血清测定间精确度
                  C11-35    C40-65   C346-370   C371-390阳性对照1∶50第1天    3456.3    2225.7    128.0     1333.2
         第2天    4724.4    2809.9    144.2     1369.6
         第3天    4675.3    1766.7    134.2     1093.5
         第4天    4167.3    2473.8    132.3     1282.4
         第5天    4090.3    2517.8    136.1     1351.4
均值              4222.7    2358.8    134.9     1286.0
标准差             515.9     390.6      6.0      112.4
变异系数            12.2      16.6      4.4        8.7阳性对照1∶100第1天   1866.4    1124.2     71.7      664.7
          第2天   2284.7    1301.6     77.7      706.9
          第3天   2115.9     916.5     71.0      530.1
          第4天   2117.5    1175.3     73.2      612.9
          第5天   2075.6    1212.9     74.7      685.8
均值              2092.0    1146.1     73.7      640.1
标准差             149.6     143.8      2.7       70.7
变异系数             7.2      12.5      3.6       11.0阳性对照1∶200第1天    838.0     509.8     42.6      318.4
          第2天   1119.5     619.6     43.7      344.0
          第3天   1078.1     476.9     42.6      281.5
          第4天   1083.7     619.8     60.7      306.5
          第5天   1118.1     573.5     43.3      296.6
均值              1047.5     559.9     46.6      309.4
标准差             118.6      64.7      7.9       23.6
变异系数            11.3      11.6     17.0        7.6表6    冻融循环对样品稳定性的影响
                   对特定肽的结合，响应单位冻融循环数    C11-35   C40-65   C346-370   C371-390循环1          808.0    236.3    10.0       850.9循环2          898.3    251.4    11.9       930.4循环3         1016.7    281.7    13.1      1063.8循环4          915.1    254.2    11.2       943.1循环5          910.9    239.8    10.6       911.5变异系数         8.1      7.1    10.8         8.3变动百分率      12.7      1.5     6.0         7.1均值           909.8    252.7    11.3       939.9标准差          74.1     17.9     1.2        77.7变异系数         8.1      7.1    10.8         8.3表7癌症患者血清样品的筛查
与固定肽的结合，响应单位    与抗人IgG/IgM/IgA的结合，响应单位患者编号    C11-35    C40-65    C346-370   C371-390    C11-35   C40-65  C346-370   C371-390
1       0         31.9      0          13.9
2       771.0     203.6     16.4       442.22(重复)     814.0     157.3     10.8       438.2       222.3    56.4    14.0        131.7
3       56.1      83.4      27.4       135.23(重复)     0         70.3      11.3       92.7         37.7    12.4     8.9            0
4       203.5     218.9     3.3        04(重复)     192.0     180.3     0          11.9         74.1    74.8       0          2.6
5       34.8      155.3     1.1        59.65(重复)     37.9      133.4     0          70.0         73.7    15.4    10.1         22.7
6       113.8     118.9     49.4       62.2
7       32.3      22.1      16.5       7.2患者编号    结果1    阴性    (对任一肽的起始活性不超过阈值)2    阳性    (与3/4肽起反应，确定为抗体)3    阴性    (对肽4的起始活性不能被肯定为抗体)4    阳性    (对2/4肽起反应，确定为抗体)5    阴性    (对肽2的起始活性不能被肯定为抗体)6    阴性    (对任一肽的起始活性不超过阈值)7    阴性    (对任一肽的起始活性不超过阈值)注：阳性样品指与任一肽的结合超过阈值，且结合是由抗体引起的阈值：C11-35＝1315；C40-65＝130.4；C346-370＝111.6；C371-390＝94.1Any RU＜0时写作0I.  按本发明优选实施方案固定p53肽的具体方法材料：1.  BIAcore 2000生物传感器@25℃2.  符合以下人p53蛋白氨基酸序列并加有N-末端半胱氨酸残基的四种
肽：
(a)C11-35A.A.H-CEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPL-酰胺(分子量＝2969.42)
储存液：制备于20mM NaOAc pH4中1-2mg/ml；加以等分，储存于-20℃。
工作溶液：将储存液以20mM NaOAc pH4稀释成700μg/ml。
(b)C40-65A.A.H-CMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPR-酰胺(分子量＝3121.4)
储存液：制备新鲜的2mg/ml于去离子水中，激烈涡旋；以20mMNaOAc pH4将储存液1∶2筛释；涡旋。
工作溶液：将新鲜储存液用20mM NaOAc pH4稀释至1mg/ml；涡旋。
(c)C346-370A.A.H-CEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLK-酰胺(分子量＝2719.02)
储存液：以20mM MES pH6.5，制备2-3mg/ml的储存液，涡旋；加以等分，储存于-20℃。
工作溶液：将储存液以20mM MES pH5稀释至500μg/ml；涡旋。
(d)C371-390A.A.H-CSKKGQSTSRHKKLMFKTEGP-酰胺(分子量＝2376.8)
储存液：以20mM MES pH6.5制备1-2mg/ml，涡旋，等分并储存于-20℃。
工作溶液：将储存液用20mM硼酸盐pH8稀释至100μg/ml，涡旋。3.  传感芯片CM5-(研究级或经认证的)-BIAcore4.  氨基偶联试剂包括：
氨基偶联试剂盒-BIAcore(编码BR-1000-50)，组成为：
NHS：N-羟琥珀酰亚胺，11.5mg/ml
EDC：N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺，75mg/ml
1M乙醇胺-HCl pH85.  巯基偶联试剂
NHS及EDC：见上文氨基偶联试剂盒(Pharmacia Biosensor)
100mM硼酸钠pH8.5：Fisher或相当者
PDEA：Pharmacia Biosenser(编号BR-1000-58)。将0.036克溶于2.0ml 0.1M硼酸盐pH8.5，配成80mM PDEA(注：必须在使用前现配，并于配成后2小时弃去)(又注：可以使用其它相当试剂(PDEA之外的试剂将活性二硫化物基团导入氨基)。
甲酸：Aldrich或相当者
甲酸钠：Aldrich或相当者，制备100mM甲酸盐溶液，将0.061克甲酸钠溶于25ml去离子水，用甲酸调pH至4.3
氯化钠(NaCl)：Fisher或相当者；
半胱氨酸：Sigma Chemical或相当者；配制50mM半胱氨酸/1M氯化钠溶液，将0.061克半胱氨酸及0.5844克NaCl溶于10.0ml 0.1M甲酸盐pH4.3(注：必须在用前即刻配制-配后2小时弃去)6.  BlAcore流动缓冲液(HBSw/P-20)
含P-20表面活性剂的HEPES缓冲盐溶液(每升)：
2.38克HEPES(Fisher或相当者)
8.77克NaCl(Fisher或相当者)
1.27克EDTA(Sigma或相当者)
0.5ml P-20(BIAcore-Cat#BR-1000-54)
调pH至pH7.4，用NaOH
0.2μm滤膜过滤
脱气15分钟
必要时重测pH并调至7.47.  再生溶液(25mM HCl/0.25％SDS)
50mM HCl，由1M HCl浓溶液配制(Anachemia或相当者)
0.5％SDS(BIAcore-BIAdesorb溶液1Cat#BR-1002-22)
将1份50mM HCl以1份0.5％SDS稀释。
方法：1.  使用BIA2000用巯基偶联化学法及以下条件，将C11-35肽固定在FCl上，C40-65肽在FC2以及C346-370肽在FC3上；-流速＝10μl/分
-NHS/EDC＝20μl
-PDEA＝40μl
-肽＝50μl(C40-65肽：注入100μl)
-半胱氨酸/1M NaCl＝40μl
-25mM HCl/0.25％SDS＝10μl2.  使用BIA2000，用NHS/EDC氨基偶联化学法及以下条件，将C371-390肽固定在FC4上：
-流速＝5μl/分
-NHS/EDC＝10μl
-C371-390肽＝35μl
-乙醇胺＝35μl
-25mM HCl/0.25％SDS＝10μlII.  检测血清中p53抗体的方法
材料：1.  样品稀释剂：HBSw/P-20及CM-D；
HEPES缓冲盐溶液含有1mg/ml羧甲基葡聚糖(Fluka或相当者)2.  再生溶液-25mM HCl/0.25％SDS；每日新鲜配制3.  Micro-fuge滤膜，消毒，0.2μm(MSI-Cat#CFA02015sm或相当者)4.  阴性对照：与分析样品矩阵配对的血清，0.2μ过滤。5.  阳性对照：羊多克隆抗p53抗体(Oncogene Sci-Cat#AB-7)1∶100稀释于阴性对照。6.  血清样品：1∶40稀释于样品稀释剂，0.2μm过滤。
流程：1.  制备阴性对照，将与待分析样品稀释物配对的血清稀释于样品稀释剂中(如，上例以1∶40稀释)。2.  制备阳性对照，将羊抗p53抗体1∶100稀释于阴性对照血清。3.  将未知样品稀释于样品稀释剂，0.2μm过滤(如，上例为1∶40稀释)。4.  用BIAcore 2000按以下方法分析样品与对照：
流速：10μl/分
流动池：1，2，3，4
流动径：FC1，2，3，4
未知样品体积：40μl
报告点：距基线4.5分。
再生溶液：10μl5.  运行自动化方法，数据以每个样品及对照测得的响应单位(RU)的形式收集。
数据分析：
对每种肽测得的样品响应单位(RU)根据以下标准定为“阳性”：
1-如果此特定样品稀释度的样品RU低于4种肽中每种肽的阈值，则此样品判定为“阴性”。
2-如果此特定样品稀释度的样品RU大于或等于该肽的RU阈值，则此样品进行重复测定。
3-在加入抗种属特异性抗体证实测得的RU增高是由于抗体后，复测样品得到肯定。
4-如果抗种属特异性抗体的RU大于50RU，样品判定为p53抗体“阳性”。
(或者，如样品有限，肯定抗种属特异性抗体或同种型试剂可在起始血清样品已结合后加入(在加入再生溶液之前))。
对于熟练技术者，本发明的修饰和变动会是很明白的。此处描述的特定实施方案只提供为一种例子，本发明不应当解释为局限于此。
序列表(1)一般信息：(i)申请人：Schering Corporation(ii)发明名称：检测抗p53抗体的测定方法(iii)序列数：4(iv)通讯地址
(A)收件人：Schering-Ploush Corporation
(B)街道：2000 Galloping Hill Road
(C)城市：Kenilworth
(D)州：New Jersey
(E)国家：USA
(F)编码：07033  (v)计算机可读形式
(A)介质形式：软盘
(B)计算机：Macintosh
(C)操作系统：75.3(vi)现申请数据：
(A)申请号：
(B)申请日：
(C)分类：(vii)在先申请数据：
(A)申请号：US 60/028,533
(B)申请日：1996，10，7(viii)律师代理人信息：
(A)姓名：Gould，James M
(B)注册号：33，702
(C)参考/文档号：JB0672(ix)电信信息：
(A)电话：908-298-5024
(B)传真：908-298-5388(2)序列1的信息：(i)序列特征：
(A)长度：26个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：序列1：Cys Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu1               5                  10                  15Leu Pro Glu Asn Ash Val Leu Ser Pro Leu
         20                  25(2)序列2的信息：
(i)序列特征
(A)长度：27个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：序列2：Cys Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp lle Glu Gln Trp Phe1                       5              10              15Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro Arg
         20                  25(2)序列3的信息：(i)序列特征：
(A)长度：26个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：序列3：Cys Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly1                   5              10                  15Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys
         20                  25(2)序列4的信息：(i)序列特征：
(A)长度：21个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：序列4：Cys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe1               5                  10                  15Lys Thr Glu Gly Pro
         20

Claims (15)

1.  一种检测能与p53蛋白结合的抗体的方法，包括：
A)将肽直接固定在生物传感器的传感芯片的流动池上，所述肽能与抗p53抗体特异结合，
B)从待查患者取得血清样品，并将血清样品稀释于适宜的缓冲液中，
C)使稀释的血清样品与固定化肽接触，以及
D)用生物传感器测量抗体与固定化肽的结合。
2.  权利要求1的方法，其中在步骤A中，多种所选择的免疫原性肽每个直接固定在各自分隔的流动池上。
3.  权利要求2的方法，其中第一个肽选自p53蛋白的氨基端区，第二个肽选自p53蛋白的羧基端区。
4.  权利要求1的方法，其中肽选自：
a)一种包含序列1的肽，或一种与之具有基本序列同一性的肽；
b)一种包含序列2的肽，或一种与之具有基本序列同一性的肽；
c)一种包含序列3的肽，或一种与之具有基本序列同一性的肽；以及
d)一种包含序列4的肽，或一种与之具有基本序列同一性的肽。
5.  权利要求3的方法，其中第一种肽包含序列1，第二种肽包含序列4。
6.  权利要求5的方法，更进一步包含第三种含序列2的肽，及第四种含序列3的肽。
7.  权利要求1的方法，其中肽具有磷酸丝氨酸残基。
8.  权利要求1的方法，其中肽具有磷酸苏氨酸残基。
9.  权利要求5的方法，其中第一种肽用巯基偶联固定。
10.  权利要求5的方法，其中第二种肽用氨基偶联固定。
11.  权利要求6的方法，其中第一、三及四种肽用巯基偶联固定，第二种肽用氨基偶联固定。
12.  权利要求1的方法，其中血清样品同时与多种固定肽接触。
13.  权利要求1的方法，其中在将稀释的血清样品与4种固定肽同时接触之前，将血清样品用含有P-20及羧甲基葡聚糖的HEPES缓冲盐溶液稀释1∶2～1∶50。
14.  权利要求2的方法，其中与每种肽结合的抗体量与生物传感器报告的响应单位成正比。
15.  权利要求1的方法，其中固定在流动池上的肽用HCl-SDS溶液除去已结合的抗体而再生，用于分析以后的血清样品。
CN97180373A 1996-10-07 1997-10-01 检测抗p53抗体的测定方法 Pending CN1240028A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2853396P 1996-10-07 1996-10-07
US60/028,533 1996-10-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1240028A true CN1240028A (zh) 1999-12-29

Family

ID=21843977

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN97180373A Pending CN1240028A (zh) 1996-10-07 1997-10-01 检测抗p53抗体的测定方法

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP0929811A1 (zh)
JP (1) JP2001502419A (zh)
KR (1) KR20000048833A (zh)
CN (1) CN1240028A (zh)
AU (1) AU4583397A (zh)
BR (1) BR9712504A (zh)
CA (1) CA2267200A1 (zh)
HU (1) HUP9904222A3 (zh)
IL (1) IL129323A0 (zh)
NZ (1) NZ334809A (zh)
WO (1) WO1998015834A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106841616A (zh) * 2008-01-25 2017-06-13 茂体外尔公司 P53生物标记物
CN107001453A (zh) * 2014-09-30 2017-08-01 戴尔戴莫有限公司 结合人p53线性表位的抗体及其诊断应用

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999067376A1 (en) * 1998-06-25 1999-12-29 Institut Pasteur Exhaustive analysis of viral protein interactions by two-hybrid screens and selection of correctly folded viral interacting polypeptides
AUPP932199A0 (en) * 1999-03-19 1999-04-15 St Vincent's Hospital Sydney Limited Anti-p53 antibodies
CN1217194C (zh) * 2001-01-04 2005-08-31 上海数康生物科技有限公司 蛋白芯片及其制备方法和使用方法
EP1403640B1 (en) * 2001-05-07 2007-12-05 HiPep Laboratories Peptide-immobilized baseboard and method of assaying target protein using the same
KR20030092462A (ko) * 2002-05-30 2003-12-06 박영미 암의 진행 정도를 진단하는 방법 및 키트
EP1969363B1 (en) * 2005-12-22 2016-11-30 Abbott Molecular Inc. Methods and marker combinations for screening for predisposition to lung cancer
JP6119607B2 (ja) * 2011-09-20 2017-04-26 コニカミノルタ株式会社 検体希釈用液、それを用いたキットおよび蛍光測定方法
WO2013116455A1 (en) * 2012-01-31 2013-08-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Improved sensitivity and specificity for ovarian cancer
CN112964870B (zh) * 2021-02-03 2024-01-26 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 一种基于spr生物传感器的流感病毒快速检测方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2698367B1 (fr) * 1992-11-02 1995-02-17 Eurobio Lab Fragments de la protéine p53 et leurs utilisations dans la détection et le suivi d'états pathologiques.
IL108726A (en) * 1994-02-22 1999-12-31 Yissum Res Dev Co Electrobiochemical method and system for the determination of an analyte which is a member of a recognition pair in a liquid medium and electrodes therefor

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106841616A (zh) * 2008-01-25 2017-06-13 茂体外尔公司 P53生物标记物
US10883993B2 (en) 2008-01-25 2021-01-05 Multivir Inc. P53 biomarkers
CN107001453A (zh) * 2014-09-30 2017-08-01 戴尔戴莫有限公司 结合人p53线性表位的抗体及其诊断应用
CN107001453B (zh) * 2014-09-30 2021-07-20 戴尔戴莫有限公司 结合人p53线性表位的抗体及其诊断应用

Also Published As

Publication number Publication date
HUP9904222A3 (en) 2000-08-28
WO1998015834A1 (en) 1998-04-16
AU4583397A (en) 1998-05-05
NZ334809A (en) 2000-12-22
BR9712504A (pt) 1999-10-19
CA2267200A1 (en) 1998-04-16
EP0929811A1 (en) 1999-07-21
HUP9904222A2 (hu) 2000-04-28
JP2001502419A (ja) 2001-02-20
IL129323A0 (en) 2000-02-17
KR20000048833A (ko) 2000-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN86103610A (zh) 免疫复合物的检测方法和步骤
CN101048662A (zh) 阿尔茨海默氏病的检验方法及诊断试剂
CN1217189C (zh) 测定全血样品中白细胞个数的方法
CN1308684C (zh) 滞留层析和蛋白质芯片排列在生物学和医学上的应用
CN1153064C (zh) 富集稀少细胞的方法
CN1227532C (zh) 高灵敏度的免疫检测方法
CN1267452C (zh) 单克隆抗体、抗原和恶性疾病的诊断和治疗
CN1215333C (zh) 凝聚免疫分析法及其试剂
CN1610831A (zh) 通过检测肿瘤发生和转移相关蛋白的糖基化变化诊断癌症的方法及使用其诊断癌症的试剂盒
CN1285001A (zh) 同时鉴定新型生物靶和用于药物开发的引导结构的方法
CN1926433A (zh) 用于检测psa的可活化游离形式的方法及其用于诊断前列腺的良性病理学和前列腺的腺癌的用途
CN1240028A (zh) 检测抗p53抗体的测定方法
CN1969189A (zh) 非特异性反应被抑制的免疫学测定方法和试剂
CN1100994C (zh) 基于检测谷光甘肽s转移酶的一种或多种同功酶来评估器官状态的快速测定法
CN1759319A (zh) 生物液中肾上腺髓质素原中间区域部分肽的诊断检测,和实施这样的检测的免疫检测方法
CN1163753C (zh) 测定抗体的方法及抗体测定装置
CN1703624A (zh) 用于检测mhc－ⅰ类和mhc－ⅱ类结合肽的方法和体系
CN1511258A (zh) 神经退行性疾病的监控方法和所用试剂盒
CN1743849A (zh) 一种多肿瘤标志物并行检测的方法及试剂盒
CN1877330A (zh) 丙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫诊断试剂盒及其制备方法
CN1729398A (zh) 心血管疾病的检测
CN101062939A (zh) 检测肝癌岩藻糖基化高尔基蛋白gp73的装置及试剂盒
CN1880959A (zh) 一种指示高剂量钩状效应的方法
CN1590409A (zh) 针对sars冠状病毒n蛋白抗原的抗体及其在sars冠状病毒或者其抗原检测中的用途
CN1016647B (zh) 抗前s抗体检测法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication