CN106841616A - P53生物标记物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及p53生物标记物表达谱的鉴定，其中p53生物标记物表达谱能预测患有过度增生疾病(比如癌症)的患者对治疗的反应，还涉及它们在用抗过度增生疾病的基因治疗来治疗所述患者的方法中的用途。

Description

P53生物标记物
本申请是2009年1月26日提交的同名发明专利申请200980108333.3的分案申请。
【技术领域】
本发明总的涉及瘤学和癌症治疗领域。它更具体的关注于预测抗过度增生疾病治疗功效的因子的评估。
【背景技术】
癌症在大多数国家是主要的致死病因，导致全世界在医疗保健上花费数十亿美元。现在确定许多癌症至少部分是由于基因异常引起的，基因异常或者引起引发癌症的基因(称作“致癌基因”)的过表达，或者源于保护基因(通常称作“瘤抑制”基因)丧失功能的突变。例如p53，53kD大小的核磷蛋白质，调控细胞增生。p53基因的突变和染色体17p(基因位于该处)上等位基因的缺失，是人类恶性瘤中鉴定的最频繁的变异。所述p53蛋白进化上是高度保守的，并且在大部分正常组织中表达(尽管以低水平表达)。野生型p53已被证明涉及细胞周期调控(Mercer,1992)，转录调控(Fields and Jang,1990；Mietz et al.,1992)，DNA复制(Wilcock and Lane,1991；Bargonetti et al.,1991)和凋亡的诱导(Yonish-Rouach et al.,1991；Shaw et al.,1992)。
已知各种突变的p53等位基因发生单个碱基置换导致具有相当不同生长调控特性的蛋白质的合成，并最终引起恶性瘤(Hollstein et al.,1991)。事实上，p53基因已被发现其在普通人类癌症中是最频繁突变的基因(Hollstein et al.,1991；Weinberg,1991)，p53的突变尤其和那些与吸烟有关的癌症相关(Hollstein et al.,1991；Zakut-Houri etal.,1985)。乳腺瘤中p53的过表达也已被报道(Casey et al.,1991)。然而，有趣的是，p53的有益功效并不限于含有突变的p53分子的癌症。在一系列论文中，Clayman等人(1995)证明表达野生型p53分子的癌细胞的生长也受到病毒载体中p53表达的抑制。
综合这些发现，相当的努力被投入p53基因治疗。把p53通过逆转录病毒递送给人类已在前些时候被报道(Roth et al.,1996)。其中，含有野生型p53基因的逆转录病毒载体受到β-肌动蛋白启动子的调控，通过直接注射将其用于介导野生型p53基因转移给9个患有非小细胞肺癌的患者。直到治疗后5个月临床上没有观测到明显的载体相关的毒效应。原位杂交和DNA聚合酶链式反应表明在治疗后活组织检查中存在载体-p53序列。凋亡(程序性细胞死亡)在治疗后活组织检查中比在治疗前活组织检查中更加频繁。三个患者中发现瘤退化，另外三个患者瘤生长稳定。类似的研究已被实施用腺病毒递送p53给患有头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)的患者(Clayman et al.,1998)。手术和基因转移相关的发病率是最低的，总体结果为Ad-p53基因转移作为晚期头颈部鳞状细胞患者的手术辅助治疗提供了初步支持。
对p53功能异常在瘤增殖和治疗抗性中的关键作用理解的进展为研发p53基因治疗用于SCCHN和其他癌症提供了基本原理(Hartwell and Kastan,1994；Kastan et al.,1995；Edelman and Nemunaitis,2003；Ahomadegbe et al.,1995；Ganly et al.,2000；Zhang et al.,1995；Clayman et al.,1995；Clayman et al.,1998；Clayman et al.,1999；Swisher et al.,1999；Nemunaitis et al.,2000；Peng,2005)。例如，AdvexinTM(Ad5CMV-p53,INGN 201)含有复制缺陷的腺病毒类型5载体，所述载体含有正常的p53瘤抑制基因作为其治疗性成份。
然而，尽管基因治疗是成功的，但目前仍不清楚为什么有些患者对p53和其他疗法有反应而其他患者则没有。这仍然需要确定将最受益于这种治疗的具体的患者亚群。
几个临床上影响治疗反应和存活期的预后因子已在患有复发的SCCHN的患者中得到鉴定(Argiris et al.,2004；Pivot et al.,2001；Recondo et al.,1991)。近来分子生物标记物更多地被用于预测预后。然而，关于使用p53生物标记物进行预测预后，该领域以相矛盾数据为特征，一些研究表明p53生物标记物预测结果的能力(Recondo et al.,1991；Gallo et al.,1995；Mulder et al.,1995；Sarkis et al.,1995；Sauter et al.,1995；Stenmark-Askmalm et al.,1995；Matsumura et al.,1996；McKaig et al.,1998；Nemunaitis et al.,1991)，而另一些研究表明p53生物标记物不预测患者结果(Kyzas etal.,2005)。事实上，头颈癌症中的最大研究之一，结合涉及3388个患者的42项研究结果的综合分析表明p53生物标记物状态和临床结果之间没有显著的统计学相关性(Kyzas etal.,2005)。
因此，需要合适地定义能更可靠地预测患者结果的p53生物标记物表达谱，来指导现行治疗方法的适当使用，并评估新治疗方法的功效。
【发明内容】
因此，根据本发明，这里提供预测患瘤的人受试者对p53基因治疗的有利反应的方法：(a)测定所述瘤的瘤细胞是否含至少一个野生型p53等位基因；和/或(b)测定所述瘤的瘤细胞是否以高于表达正常p53的非瘤细胞中表达的水平表达p53蛋白。
在某些方面，本发明人已测定所述瘤细胞(i)含至少一个野生型p53等位基因，和/或(ii)表达不高于表达正常p53的非瘤细胞中表达水平的p53蛋白，和/或(iii)表达升高水平的p53蛋白，定义为高于表达正常p53的非瘤细胞中表达的水平，其中所述p53蛋白不抑制野生型p53的功能，则(i)～(iii)中的任一项会预测所述受试者会对所述p53基因治疗有有利反应。所述p53基因治疗可以是包含使用p53基因或p53通路中涉及的基因的基因治疗，例如，AdvexinTM。
在某些实施方式中，如果所述瘤细胞被发现(1)不含至少一个野生型p53等位基因，和/或(2)含2个突变的p53等位基因，和/或(3)以高于由表达正常p53的正常细胞表达的水平表达突变的p53蛋白，且所述突变的p53抑制所述野生型p53的功能，例如，具有完整的四聚化区域的DNA结合域上含错意点突变的突变体，则其指示对所述p53基因治疗的不良反应。显性抑制突变的其他类型为本领域内所知，并且其他类型也可通过功能分析而被鉴定(Resnick et al.,2003)。通过这些显性失活突变的免疫组织学测定的高水平表达也可以指示对治疗的不良反应。
升高的p53水平的评估可以用多种技术进行，包括通过瘤细胞中p53的抗体检测来测量p53蛋白的水平(例如，使用免疫组织化学(IHC)这些免疫检测可检测)。或者，p53转录可以通过(例如)使用定量PCR或RT-PCR而被扩增并在细胞中测量，来评估p53的过表达或增长水平。然而，预计几乎任何p53的分析检测都可被校正(通过和足量表达p53的非瘤细胞中的p53检测比较)以用于本发明，例如，ELISA、免疫测定、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定、凝胶电泳、蛋白印迹分析或原位杂交测定。
野生型p53等位基因和突变基因结构的存在可以使用原位杂交、RNA印迹或核酸酶保护，或者使用各种基于和多种探针杂交的基因分型技术，例如，测序、基因阵列或基因芯片来测定。基因组序列具体在所述瘤的瘤细胞中扩增，所述瘤细胞可被石蜡包埋。
所述瘤可以是良性瘤生长(例如，良性前列腺增生、口腔白斑、结肠息肉、食管癌前生长或良性病变)。所述瘤可以是癌，比如口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、呼吸道癌、泌尿生殖器癌、胃肠道癌、中枢或外周神经系统组织癌、内分泌或神经内分泌癌或造血细胞癌、神经胶质瘤、肉瘤、癌、淋巴瘤、黑色素瘤、纤维瘤、脑膜瘤、脑癌、口咽癌、鼻咽癌、肾癌、胆囊癌、前列腺癌、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞癌、李弗劳明瘤、甲状腺癌、甲状旁腺癌、垂体瘤、肾上腺瘤、成骨性肉瘤、I型和II型多发性神经内分泌瘤、乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食管癌、气管癌、皮肤癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。例如，瘤可以是鳞状细胞癌(SCCHN)，更具体的是复发的SCCHN。
对所述治疗的有利反应可以包括：瘤尺寸或负荷减小、瘤生长的阻断、瘤相关疼痛减少、瘤相关病理的减少、瘤相关症状的减少、瘤非进行、增加的无病间期、增加的至进行时间、缓解的诱导、转移的减少、或增长的患者存活期。“瘤反应”更具体指瘤生长控制(瘤生长控制(TGC)定义为尺寸上完全(CR)和部分(PR)减小>50％或病症稳定(SD)；TGC＝CR+PR+SD)或瘤尺寸减小>10％。
在某些实施方式中，还提供方法，其还被定义为包括下列步骤：(a)测定所述瘤细胞是否含2个野生型p53等位基因；且如果是，则(b)给所述受试者施用p53基因治疗。在另一些实施方式中，所述方法也可被定义为包括下列步骤：(a)测定所述瘤细胞是否含至少一个野生型p53等位基因，及所述瘤细胞是否不过表达p53蛋白；且如果是，则(b)给所述受试者施用p53基因治疗。在另一些实施方式中，所述方法可以被定义为包括下列步骤：(a)测定所述瘤细胞是否不含p53突变等位基因；且如果是，则(b)给所述受试者施用p53基因治疗。在另一些实施方式中，所述方法可以被定义为包括下列步骤：(a)测定所述瘤细胞是否不过表达p53突变蛋白，所述p53突变蛋白抑制野生型p53的功能；且如果是，则(b)给所述受试者施用p53基因治疗。
在另一些实施方式中，所述方法还被定义为包括下列步骤：(a)测定所述瘤细胞是否过表达p53蛋白，所述p53蛋白不抑制野生型p53的功能；且如果是，则(b)给所述受试者施用p53基因治疗。在另一些实施方式中，所述方法还被定义为包括下列步骤：(a)测定所述瘤细胞是否过表达突变的p53蛋白，且所述突变的p53抑制野生型p53的功能；且如果是，则(b)给所述受试者施用p53基因治疗之外的治疗。在另一些实施方式中，所述方法还被定义为包括下列步骤：(a)测定所述瘤细胞是否不含至少一个野生型p53等位基因；且如果是，则(b)给所述受试者施用p53基因治疗之外的治疗。在另一些实施方式中，所述方法还被定义为包括下列步骤：(a)测定所述瘤细胞是否含2个突变的p53等位基因；且如果是，则(b)给所述受试者施用p53基因治疗之外的治疗。所述其他治疗可以是甲氨蝶呤。
在某些方面，所述方法还包括第二抗瘤治疗。所述第二抗瘤治疗可以是：手术治疗、化学治疗、放射治疗、冷冻治疗、高温疗法、光疗法、放射消融治疗、激素治疗、免疫治疗、小分子疗法、受体激酶抑制剂治疗和生物治疗，如单克隆抗体、siRNA、反义寡核苷酸、核酶或基因治疗。
所述生物治疗可以是基因治疗，比如抑癌基因治疗，细胞死亡的蛋白质基因治疗，细胞周期调控基因治疗，细胞因子基因治疗，毒素基因治疗，免疫基因治疗，自杀基因治疗，前药基因治疗，抗细胞增殖基因治疗，酶基因治疗或抗血管生成因子基因治疗。
所述抑癌基因治疗可以是：APC、CYLD、HIN-1、KRAS2b、p16、p19、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、PTEN、FHIT、Rb、子宫珠蛋白、Skp2、BRCA-1、BRCA-2、CHK2、CDKN2A、DCC、DPC4、MADR2/JV18、MEN1、MEN2、MTS1、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、CFTR、C-CAM、CTS-1、zac1、ras、MMAC1、FCC、MCC、FUS1、基因26(CACNA2D2)、PL6、β*(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6或基因21(NPRL2)。所述促凋亡蛋白治疗可以是：mda7、CD95、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、Bax、Bag-1、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak、MKP-7、PARP、bad、bcl-2、MST1、bbc3、Sax、BIK或BID。所述细胞周期调控治疗可以是：反义致癌基因，致癌基因的siRNA、致癌基因单链抗体或致癌基因核酶。所述细胞因子治疗可以是：GM-CSF、G-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、TNF-β或PDGF。所述抗血管生成治疗可以是：血管生成抑素、内皮抑素、阿瓦斯丁或反义物，siRNA、单链抗体、针对促血管新生因子的核酶。
所述癌细胞可能有正常的p53基因和/或蛋白结构，或者有异常的p53基因和/或蛋白结构。例如，所述p53基因可能生成等同于野生型p53蛋白的p53蛋白。在另一些实施方式中，p53蛋白中可存在突变(例如，截短，删除，置换，反式显性突变等)。所述p53基因可能含有至少一个野生型p53等位基因(例如，呈现正确的启动子，内含子，外显子和方向)或者所述p53基因可能含有突变的等位基因(例如，错义，删除，置换，重排等)。
在某些实施方式中，所述基因治疗可以通过非病毒载体递送。所述非病毒载体可被包封在脂质媒质中(例如，脂质体)。所述媒质可以是纳米颗粒。所述基因治疗可通过病毒载体递送(例如，反转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、痘病毒载体、多瘤病毒载体、慢病毒载体、或疱疹病毒载体)。
所述p53基因治疗可为局部区域基因治疗。所述局部区域基因治疗可包括局部基因治疗。所述局部基因治疗可以包括所述瘤的直接注射、瘤血管的注射、区域性基因治疗、或施用到瘤相关淋巴管或导管内。所述施用可包括腹膜内、胸膜内、囊内、或鞘内施用。所述区域性基因治疗可包括施用到与所述瘤相关的肢的血管系统。
某些实施方式还包括试剂盒，其含：p53抗体或探针，其用于检测瘤样品中p53蛋白的量；及多个探针，其用于测定p53基因或转录物结构。所述试剂盒用于测定瘤细胞是否含有至少一个野生型p53等位基因和所述瘤的瘤细胞是否以高于表达正常p53的非瘤细胞中表达的水平表达p53蛋白，以此预测对p53基因治疗的有利反应。
本文所述的“p53”是指野生型或突变(例如，反式显性，错意等)的p53蛋白。
认为本文所述的任何方法或组合物都能用于本文所述的任何其他方法或组合物中。
权利要求和/或说明书中使用的“a”或“an”在与术语“包含”联用时意为“一种/一个”，但是它也要和“一个或多个/一种或多种”或“至少一个/至少一种”的意思一致。术语“约”通常意味这设定数值±5％。权利要求中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指示只涉及两者中的一个或两者是相互排斥的，即使公开支持的定义只是指二者选其一和“和/或”。
本发明的其他目标、特征和优势将在下列详细描述中变的清晰。然而，应知道所述的详细描述和特定的实施例(虽然指示本发明具体的实施方式)仅是以说明的方式给出，因为通过此详细描述，涵盖在本发明精神和范围之内的各种变化和修饰对本领域技术人员而言是显而易见的。
【附图说明】
下列附图形成本说明书的一部分，并被包括用于进一步展示本发明的某些方面。通过参考一个或多个这些附图，并结合本文的具体实施方式的详细描述，本发明可以被更好地理解。
图1.的作用机制
图2.对治疗的抗瘤反应谱
图3.实施治疗后李弗劳明瘤的衰老/稳定疾病反应。对李弗劳明瘤患者骨盆瘤进行PET扫描，显示治疗后注射的瘤(箭头)完全缓解。伴随的CT扫描表明稳定的病症而没有瘤的减小。临床上，瘤反应和减少的骨盆痛和下肢水肿相伴(Senzer,2007)。
图4.实施治疗后复发的头颈部瘤的凋亡/瘤减小反应。对复发的SCCHN患者进行CT扫描，显示治疗后注射的瘤(箭头)尺寸的减小和完全缓解。
图5.单一治疗-ITT群T301后，瘤生长控制和增长的存活期的相关性
图6.单一治疗-ITT群T201后，瘤生长控制和增长的存活期的相关性
图7.单一治疗-ITT群T301+T201后，瘤生长控制和增长的存活期的相关性
图8.单一治疗-ITT群T301+T201后，瘤减小≥10％和增长的存活期的相关性
图9.单一治疗-ITT群T301+T201后，瘤减小≥50％和增长的存活期的相关性
图10.p53失活机制和相应的p53测序和免疫组织化学生物标记物表达谱。
图11.由mdm-2/4的野生型p53的失活被治疗逆转。具有野生型p53序列的瘤中，通过上调p53抑制因子mdm-2和mdm-4，正常的内源性p53被失活。通过提供的正常p53的增加水平能逆转mdm-2/4的抑制。
图12.大多数p53突变在DNA结合结构域中。
图13.DNA结合结构域突变通过形成不会结合DNA的四聚物而使p53失活。
图14.突变的p53的低水平表达是对功效有利的p53生物标记物表达谱。
图15.突变的p53的高水平表达是对功效不利的显性抑制p53生物标记物表达谱。
图16.具有阻断的p53瘤抑制的患者群。
图17.复发的SCCHN癌症(T301)中对功效有利和不利的p53表达谱预示存活益处。有利的-高水平的野生型p53；低水平的突变的p53；低水平的野生型p53。不利的-高水平突变的p53。
图18.复发的SCCHN癌症(T301+T201)中对功效有利和不利的p53表达谱预示存活益处。有利的-高水平的野生型p53；低水平的突变的p53；低水平的野生型p53。不利的-高水平突变的p53。
图19.复发的SCCHN癌症中对功效有利和不利的p53表达谱不预示甲氨喋呤的结果。有利的-高水平的野生型p53；低水平的突变的p53；低水平的野生型p53。不利的-高水平突变的p53。
图20.复发的SCCHN癌症(T301)中对功效有利和不利的p53表达谱预示存活益处。有利的-高水平的野生型p53；低水平的突变的p53；低水平的野生型p53。不利的-高水平突变的p53。
图21.复发的SCCHN癌症中甲氨喋呤对具有对功效不利的p53表达谱的患者是有效的。有利的-高水平的野生型p53；低水平的突变的p53；低水平的野生型p53。不利的-高水平突变的p53。
【实施方式】
【I.本发明】
如本文所讨论，在临床水平上的基因治疗研究已经超过了十年，包括大量癌症治疗试验。总体而言，随着超过传统治疗方法的益处的增多，该方法的成功是有希望的。然而，就大部分抗癌治疗而言，仍实质需要改善那些最可能受益于基因治疗或其他治疗功效的患者群的鉴定。
以前的p53生物标记物表达谱的评估不足以完全预测所述治疗反应或预后，因为它们不能鉴别具有功能的正常p53蛋白的所有情况，而这是预测和预后测定的关键。之前的申请偏离本发明的教导，前者通常考虑检测异常升高的p53蛋白或p53基因突变，但不包括把有功能的正常p53蛋白作为预测或预后标记物。本发明人意外地发现p53表达量和基因突变状态的正确组合和应用是鉴别正常功能的p53蛋白的存在来预测p53基因治疗的治疗反应所必需的。这一意外结果指示了为什么先前利用p53免疫组织化学或测序分析的尝试会产生相矛盾的结果，这些结果和这些p53生物标记物表达谱能否常规地预测治疗反应和预后相关。
这里，本发明人提供使用p53生物标记物表达谱组合来预测患者对癌症治疗的有利反应或程度的方法。在具体的实施方式中，所述癌症治疗是基因治疗，例如，治疗之类的腺病毒p53基因治疗。
【A.p53瘤生物标记物表达谱预测对p53基因治疗的反应】
本发明人发现所述下列瘤生物标记物组合通常预测有利反应和预后结果：(1)高水平的正常p53蛋白(例如，对野生型p53序列免疫组织化学呈阳性)；(2)低水平的p53蛋白(免疫组织化学阴性)伴随检测出至少一个正常等位基因和一个异常的p53基因序列(当存在一个正常的p53等位基因和一个异常的等位基因时可以观测到免疫组织化学阴性，报道于Trkova等人(2003))。或(3)低水平的正常p53蛋白(对野生型p53序列免疫组织化学呈阴性)。这些生物标记物表达谱中的每一个通常都定义这一情况，即正常的p53基因可能被活化。就这一点而言，将导致正常的p53基因表达上升的p53基因治疗将有助于治疗功效，并克服由下文所述的MDM2、MDM4类抑制物或p53显性抑制突变蛋白的低水平表达介导的p53失活。用复制缺陷型腺病毒载体单独转导细胞也可以在含有野生型p53基因的细胞中诱导野生型p53的表达(Mcpake et al.,1999)。
正常的p53基因结构被定义为等同于在表达p53的非瘤正常细胞中的p53基因结构的p53基因结构。野生型p53等位基因具有和p53非瘤正常细胞中的p53基因相同的DNA序列。p53蛋白升高的水平或p53的过表达被定义为高于表达正常p53的非瘤细胞中表达水平的水平。p53蛋白的正常水平被定义为不高于正常p53的非瘤细胞中表达水平的水平。
【1.升高的p53水平和正常的p53基因预示有利反应】
高水平的p53表达组合正常的p53基因型(由野生型p53等位基因组成)指示存在高水平的正常的p53。已知这些瘤中很多具有升高水平的抑制p53活性的MDM2或MDM4(Valentin-Vega et al.,2007)。然而，Valenitn-Vega等人(2007)并没教导这一情况和任何有利的预后益处相关，而只有本发明教导了这一点。本发明表明当这些瘤暴露于治疗剂，这些制剂诱导应激反应并进而上调p53表达或者递送额外的如同的野生型p53，或者下调如同nutlins的p53抑制物，所述抑制被克服，并且瘤抑制通路随后被激活，引起治疗功效和治疗反应，例如瘤尺寸的减小等。
【2.低水平的p53和正常的p53基因预示有利反应】
在p53的免疫组织化学评估揭示具有正常的p53基因序列(由野生型p53等位基因构成)的低表达时会出现类似的情况。这些瘤或者没有p53缺陷或者它们也许有上调的类似MDM2或MDM4的p53抑制物或者可能有其他阻断p53的方法(Valentin-Vega et al.,2007)。然而，Valenitn-Vega等人(2007)没有教导这一情况和任何有利的预后益处相关，而只有本发明由此教导。在具有低水平正常的p53蛋白表达谱的患者中，施用野生型p53和/或施用引起p53应激反应的上调或如同nutlins的p53抑制物引起下调的p53基因治疗，相对于它的抑制剂将增加正常p53的表达，并克服所述p53抑制物而产生治疗的瘤抑制效应。
【3.低p53水平和异常的p53基因预示有利反应】
Poeta(2007)、Olivier(2006)和Soussi(2006)教导突变的p53基因(能够抑制正常的p53的活性)的存在是预测不良临床结果的一种情况。这些事例中普遍在具有完整四聚化结构域的DNA结合域上有p53突变，导致突变的p53能够结合正常的p53并使其失活。这些突变被称作显性抑制p53突变或失活或阻断突变。然而，他们单独存在(如通过基因测序方法检测)不足以正确地预测结果，这报道于Poeta(2007)、Olivier(2006)和Soussi(2006)，由于它们没有考虑这些抑制蛋白的水平，而这些蛋白能使另一个正常的p53等位基因(当它存在时)失活。除了这些失活或显性抑制突变的存在，其表达水平对确定其对正常p53的影响而言是重要的。本发明公开，如果存在p53蛋白的低水平表达，失活的p53突变的存在与对p53治疗的不良反应无关。
Trkova等人(2003)已经报道了具有突变的p53序列和通过免疫组织学评估的低p53水平的患者经常含有另一个正常的p53基因。然而，Trkova等人(2003)没有教导这一情况和任何有利的预后益处有关，而这仅在本发明中公开。
【4.高p53水平和异常的p53基因】
如上文所述，仅存在突变的p53基因不足以预测对癌症治疗的不良的临床反应。本发明公开了那些允许还是阻止正常的p53功能的情况是通过p53量和基因测序分析的组合得到的p53生物标记物表达谱进行预测和预后应用的关键因素。如果这些p53突变以高水平表达，并且是能抑制正常的p53功能的阻断突变，即使存在野生型p53基因，例如具有完整四聚化结构域的DNA结合域的显性抑制突变导致突变的p53能够结合正常的p53并使其失活，这些情况更可能和p53基因治疗的不良反应有关，因为通过治疗引进或诱导的正常p53功能被高水平的损坏性p53突变阻断。这些突变类型(具有完整四聚化能力的DNA结合域上的错意突变)约占了p53突变的80％，并且当瘤细胞中这些突变的p53基因编码的p53蛋白以高水平表达时，它们将和对治疗的不良反应有关。
然而，在表达高p53和突变的p53的瘤细胞中，如果这些突变不是抑制野生型p53功能的突变，例如，截短的四聚化结构域的突变导致突变的p53不能结合正常的p53而使其失活，这些瘤细胞能对p53基因治疗产生有利反应。
总体而言，和上述p53生物标记物表达谱分析相比，所有以前的p53生物标记物评估方法(Kyzas et al.,2005；George et al.,2007；Olivier et al.,2006；Geisler etal.,2002；Poeta et al.,2007；Soussi et al.,2006)都仅教导部分识别所述关键因素，这些因素需要一致并特异地预测治疗结果。所有那些单独依靠免疫组织化学(Geisler etal.,2002)或单独依靠基因测序分析(Poeta et al.,2007,Soussi et al.,2006,Olivieret al.,2006)的方法错失了重要的关于正常或异常p53蛋白存在或水平的信息，而这些信息正是正确预后或预测决定的关键。组合p53免疫组织化学和基因测序分析的研究(Kyzaset al.,2005；George et al.,2007)也组合了不足、不完全或者不正确地得出关于这些评估的预测能力的错误结论的信息。
例如，George等人(2007)没有教导在他们的p53免疫组织学和p53测序分析的应用中有功能的p53基因/蛋白存在的重要性。他们涵盖了最好的预后种类中具有外显子5p53蛋白突变的高、低水平表达的患者。他们忽略了突变的外显子5p53蛋白的表达水平，并像维护那些具有正常p53基因构型的患者一样维护具有外显子5p53突变的患者。具有突变的外显子5p53蛋白高水平表达的患者的不良预后是不可根据George等人(2007)的教导预期或预测的，他们认为所有外显子5突变的情况都有良性预后，无论他们的p53表达水平。在p53的临床实验中，这些表达高水平的外显子5p53突变蛋白的患者中没有一个对治疗有反应，并且他们的中位值存活期近似于那些在其他DNA结合域外显子具有反式显性抑制突变的p53突变的患者的中位值存活期。George等人(2007)的研究的大部分情况中，外显子5突变体有p53蛋白低水平表达，当其反映低水平异常的p53突变蛋白时，他们却错误地称之为野生型。在他们的研究中，这些情况被综合用于分类，更少数高表达突变的外显子5p53蛋白的情况没有显著改变有利预后组的中位值存活期，他们是通过综合所有这些情况所确定的有利预后组，甚至大量患者具有正常水平的正常p53蛋白。因此，George等人(2007)没有教导该识别表达谱的重要性，其中正常的p53是无功能的，没有教导由可使正常p53失活的外显子5突变(如果存在)的p53反式显性抑制失活的p53蛋白的高水平的重要性。
这些结论还没有被了解或结合已有文献中推导出来，这可以由先前的研究没有利用或定义正确的组合来证明。本发明公开了正确和合适的蛋白表达和基因测序组合来鉴定有利和不利的p53表达谱，根据那些允许或阻止正常的p53功能的情况，如本文所述这些情况是p53生物标记物表达谱预测和预后应用的关键因素。
【B.通过对p53基因结构和表达水平的组合分析进行的p53生物标记物表达谱评估】
【1.p53基因结构的测定】
p53，最为了解的瘤抑制物，约390个氨基酸的磷蛋白，能在细分为5个结构域：N-端转录活化结构域(TAD)，其激活转录因子；富含脯氨酸的结构域，其对p53凋亡活性是重要的；结合中央DNA的核心结构域(DBD)，其含有一个锌原子和几个精氨酸(由外显子5～8编码)；同型寡聚化(四聚化)结构域(OD)，四聚化是体内p53活性所必要的；C-端，其涉及所述中央结构域的DNA结合的下调。
p53位于细胞的细胞核并且非常不稳定。损坏DNA的制剂通过翻译后机制诱导p53变的非常稳定，使其在细胞核的浓度显著增加。在响应DNA损伤的反应中p53抑制进程贯穿整个细胞周期，因此允许在基因组复制之前发生DNA修复。因此，p53通过起始凋亡来阻止损坏的遗传信息从一代细胞到下一代细胞的转移，如果对细胞的损坏是严重的。
如前文所述，p53的突变能够引起细胞发生致癌性转变，并且转染研究已经表明p53起瘤抑制物的作用，能在体外恢复癌细胞正常生长的部分水平。p53是转录因子，并且一旦活化，它能够抑制几个基因的转录，这几个基因涉及刺激细胞生长，并刺激参与细胞周期调控的其他基因的表达。
使癌症中p53失活的突变通常发生在DNA结合结构域。大部分这些DNA结合突变脱离完整的四聚化结构域，该结构域能和野生型p53分子四聚化，并且抑制异源四聚体结合其靶DNA序列的能力，因而在下游基因的转录活化中阻断正常p53的功能。因此具有DNA结合结构域突变(能和正常的p53寡聚化的突变)的p53对p53的功能有显性抑制突变效应。具有显性抑制效应的突变也可以用下文描述的功能分析加以证实。
在某些方面，因此有升高水平的p53的细胞是那些有p53错意突变、反式显性突变和功能获取突变的细胞(e.g.,de Vries et al.,2002)，这些突变导致p53的过表达或p53降解的下降。本发明人预计具体在患有高水平表达突变的p53蛋白的患者中，对于给定的p53过表达细胞，当用腺病毒p53转导时，将不容易产生足够的野生型p53来清除获得功能的内源性p53或反式显性等位基因的过表达效应，因此所述患者很可能是对p53基因治疗的不利反应者，其中所述突变的p53蛋白抑制野生型p53的功能，例如在外显子5～8DNA结合核心结构域和完整的四聚化结构域上有错意突变或反式显性突变的p53。不利反应的类似预测应用于不含野生型p53等位基因或含2个突变的p53等位基因的瘤细胞。对于被预言对p53基因治疗有不利反应的患者，本发明可以提供方法，包括给所述患者施用p53治疗之外的治疗，比如甲氨喋呤。
在某些其他方面，含至少野生型p53等位基因的细胞和/或没有高水平的阻断或抑制突变的p53的细胞将可能对p53基因治疗产生有利反应，正如通过p53生物标记物表达谱预测的那样。结合用于导入外源性野生型p53的p53基因治疗和腺病毒载体在内源性野生型p53诱导上的效应，将增加细胞中野生型p53的产量，并克服那些情况中的缺陷。
为了在瘤组织中检测p53基因结构，分离和评估瘤样品来说明可能存在于这些组织中的正常细胞的存在是有帮助的。浓缩组织制备瘤细胞的方法为本领域内所知。例如，组织可以分离自已被染色的石蜡包埋切片或冷冻切片，并用显微镜评估来测定瘤细胞的优势。癌细胞也可以用流式细胞术从正常的细胞中分离出来。这些和其他用于从正常细胞中分离瘤细胞的技术为本领域内众所周知。
如果瘤组织被正常细胞高度污染，通过测序技术和利用样品核酸序列的PCR扩增的芯片阵列仍容易达到突变的检测。样品中正常细胞的存在可使瘤细胞中正常p53等位基因的检测更加难以辨别。基于激光技术的显微解剖系统的最近发展已经大大解决了这一重要的问题。激光显微解剖是从染色的自细胞培养物的甲醛固定的切片、石蜡包埋切片和冰冻切片，甚至分裂中期细胞的单个染色体中分离特定细胞群(或单个细胞)的强有力的工具。由此产生的物质适用于广泛的下游分析，比如LOH(杂合子丢失)研究，mRNA水平上的基因表达分析和多种蛋白组学方法，比如2D凝胶分析，反向蛋白阵列和SELDI蛋白表达谱。单细胞PCR的应用也被预计用于避免正常的组织污染。
荧光原位杂交(FISH)和单核苷酸多态性阵列是检测瘤细胞中，甚至在含有瘤细胞和正常细胞混合物的样品中正常的p53等位基因存在的另外的方法(Yamamoto et al.,2007；Ross,et al.,2007,George et al.,2007；Flotho et al.,2007；Fitzgibbon etal.,2007；Melcher et al.,2007；Purdie et al.,2007；Kawamata et al.,2008；Lindbjerg et al.,2007；van Beers et al.,2006)。
点突变的检测可以通过瘤组织中存在的所述p53等位基因的分子克隆和用本领域内所熟知的技术测序等位基因来进行。或者，聚合酶链式反应可被用于从瘤组织中制备的基因组DNA中直接扩增p53基因序列。然后所述扩增序列的DNA序列可以被测定。聚合酶链式反应本身为本领域内所熟知。参见，例如，Saiki等人(1988)、美国专利No.4,683,202和4,683,195。
p53基因的具体缺失或截短也能被检测。例如，所述p53基因或附近的标记基因的限制性片段长度多态性(RFLP)探针能被用于评估p53等位基因的缺失或部分缺失。检测缺失或截短的其他技术(为本领域内所熟知)也能被使用。
或者，错配检测能被用于检测所述p53基因或它的mRNA产物的点突变。尽管这些技术没有测序技术灵敏，但它们能简易地用于大量瘤。错配剪切技术的例子是RNA酶保护方法，这详细报道于Winter等人(1985)、Meyers等人(1985)。
在类似的方式中，DNA探针能被用于检测错配，通过酶剪切或化学剪切。参见，例如，Cotton等人(1988)、Shenk等人(1975)。或者，错配可被检测，通过错配的双链体相对于正常的双链体有变异的电泳迁移率。参见，例如，Cariello(1988)。用RNA探针或DNA探针，所述细胞mRNA或DNA(可能含有突变)能在杂交之前用PCR扩增。
已用聚合酶链式反应扩增的源于瘤组织的p53基因的DNA序列也可以用等位基因特异性探针筛选到。这些探针是核酸寡聚物，每个都含有带有已知突变的p53基因序列的区域。例如，一个寡聚物可能约长30个核苷酸，相应于所述p53基因序列的一部分。在p53基因编码的第175个密码子的位置上，所述寡聚物编码丙氨酸，而不是野生型密码子缬氨酸。通过使用一系列这样的等位基因特异性探针，PCR扩增产物能被筛选到以鉴定先前鉴定的所述p53基因中突变的存在。可进行等位基因特异性探针与p53序列在例如尼龙膜上的杂交。特定探针的杂交指示了瘤组织中有和等位基因特异性探针相同突变的存在。
通过各种一系列高分辨率、高通量的微阵列平台的发展和应用，瘤细胞中p53基因结构变化的鉴定已被促进。实质上有两类阵列；那些携带源于克隆的核酸的PCR产物的阵列(例如，cDNA，BAC，粘粒)和那些使用寡核苷酸的阵列。它们各有优缺点，但现在很可能测量基因组范围DNA拷贝数异常和表达水平来得到瘤细胞中缺失、获得、扩增和同一样品中过量和不足表达的基因之间的相关性。提供瘤中mRNA水平评估的基因表达阵列已经引出外显子特异性阵列，该阵列能鉴定基因表达水平、选择剪接事件和mRNA加工改变。寡核苷酸阵列也被用于询查贯穿基因组的单核苷酸多态性(SNPs)来进行连锁和联合研究，并且这些已被用于定量拷贝数异常和杂合子的缺失事件。最终DNA测序阵列将允许染色体区域和整个基因组的再测序。
在本发明中，基于SNP的阵列和其他基因阵列或芯片被预计用于测定野生型p53等位基因的存在和突变的结构。单核苷酸多态性(SNP)指在DNA中的单个位点的变异，是基因组中最频繁的变异类型。例如，估计人类基因组中存在5百万～1千万个SNPs。由于SNPs在进化历程和种群内是高度保守的，SNPs表达谱作为优秀的用作研究的基因分型标记物。SNP阵列是研究整个基因组的有效工具。
另外，SNP阵列能被用于研究杂合子的缺失(LOH)。LOH是等位基因失衡的形式，该失衡源于等位基因的完全缺失或一个等位基因相对于另一个等位基因拷贝数的增加。相较于其他基于芯片的方法(例如，比较基因组杂交只能检测基因组的获取或缺失)，SNP阵列有额外的优势来检测由于单亲二体(UPD)的拷贝数中性LOH。UPD中，一对等位基因或整个染色体都来自单亲，没有引起另一亲本的等位基因的再复制(单亲＝来自父母中一方，二体＝复制的)。当所述野生型等位基因(例如来自母亲)是缺失的或取代所述两个杂合性等位基因(例如，来自母亲)的拷贝出现时，在疾病中这种构型的发生可能是病态的。SNP阵列的使用在癌症诊断中有巨大潜能，因为LOH是大部分人类癌症的主要特征。最近基于SNP阵列技术的研究已经表明不仅实体瘤(例如，胃癌、肝癌等)而且血液的恶性瘤(ALL、MDS、CML等)具有高比例的LOH，由于基因组缺失或UPD和基因组获取。在本发明中，使用高密度的SNP阵列来检测LOH以允许鉴定等位基因失衡的模式来测定野生型p53等位基因的存在(Lips et al.,2005；Lai et al.,2007)。
现行p53基因序列和单核苷酸多态性阵列的例子包括：p53基因芯片(Affymetrix,Santa Clara,CA)、Roche p53Ampli-芯片(Roche Molecular Systems,Pleasanton,CA)、基因芯片定位阵列(Affymetrix,Santa Clara,CA)、SNP阵列6.0(Affymetrix,Santa Clara,CA)、珠阵列(Illumina,San Diego,CA)等。
野生型p53基因的突变也可以基于所述p53基因野生型表达产物的突变来检测。这些表达产物包括mRNA和所述p53蛋白产物本身。点突变也可通过直接测序所述mRNA或经过由mRNA制成的cDNA的分子克隆来检测。所述克隆的cDNA序列可以用本领域内众所周知的DNA测序技术测定。所述cDNA也能通过聚合酶链式反应(PCR)来测序。
可使用单克隆抗体平板，其中涉及p53功能的每一个表位被单克隆抗体所代表。当所述平板中单克隆抗体结合的缺失或扰乱可指示所述p53蛋白和p53基因本身的突变改变。突变的p53基因或基因产物也可在身体样品中检测到，比如，血清，粪便或其他体液，例如尿和唾液。上文所述的用来组织中突变p53基因或基因产物检测的相同技术能用于其他身体样品。
【2.p53蛋白水平的评估】
各种患者参数，包括患者/病史/特征和分子特征(例如，癌性瘤中p53的过表达结合基因结构分析)可被用作预后因素来预测患者对诸如本发明中教导的癌症治疗(例如，腺病毒p53基因治疗)的有利的反应和程度。
增长的p53蛋白水平的评估可以是直接的，如在定量免疫组织化学(IHC)或其他基于抗体的检测中使用(蛋白印迹、FIA、放射免疫检测(RIA)、RIP、ELISA、免疫测定法、放射免疫法、荧光免疫分析、免疫检测，化学发光法检测，生物发光检测，凝胶电泳)，或者是间接的，通过定量这些基因的转录物(原位杂交、核酸保护、RNA印迹或PCR，包括RT-PCR)。
关于免疫组织学，正常细胞以低水平表达p53，所述低水平指当在光学显微镜下观测时，在小部分细胞中也不存在仅仅微弱的染色。在大部分所述瘤细胞中可视的细胞核染色的检出指示着升高的、过表达的，高水平p53蛋白的状态。
虽然不旨在受任何特定的理论束缚，本发明人提出，当瘤细胞表现出比肩于正常体细胞中的升高水平(比如升高的水平)的p53蛋白时，指示着所述p53瘤抑制通路中存在功能障碍，该通路是调控响应基因突变的细胞凋亡反应的关键通路。本发明人假定当通路中的某些连接点存在缺陷时，升高的p53水平反映了这一缺陷自身的存在。例如，已知当p53本身有缺陷(尤其在DNA结合域)(即产生“突变的”p53)时，并且这一缺陷产生功能异常的p53蛋白，该蛋白能和正常的p53蛋白四聚化，但不能结合DNA，正常p53蛋白的功能被阻断。相对于见于正常细胞中功能异常的蛋白，所述细胞过表达这些蛋白，徒劳地试图达到p53蛋白功能的“正常”水平。此外，和能表达功能水平的抑制瘤生长的正常p53的细胞相比，具有高水平的突变的能阻断正常p53功能的突变的p53的瘤细胞将具有选择优势。另外，在某些情况中，突变的p53蛋白也比野生型p53不易被降解或从细胞中清除，促使所述细胞中明显增加的p53含量。
已知升高水平的p53标志着所述p53瘤抑制通路的异常，并且与SCCHN癌中不良预后有关(Geisler et al.,2002)；然而，本发明公开了单以增长的p53蛋白水平不足以预测对癌症治疗的反应。在某一具体实施方式中，相较于正常的表达p53的非瘤组织，由于高水平的能阻断正常野生型p53功能的突变蛋白，p53升高水平的免疫组织化学染色检测提供对p53基因治疗更可能有不利反应的整体预测。的确，预计这一关系将在基因治疗事例或通常诱导p53介导的应激反应的其他药物中被很好地证明。
本发明人也提出具有升高的p53蛋白的瘤亚群更可能为有利的反应者。当缺陷发生在通路中任何一处时(例如，在通路中p53蛋白的上下游基因或基因元件中)，该缺陷也能导致通路的扰乱，并因而导致p53蛋白升高，再次推测为由于细胞试图弥补合适的p53通路活性的缺失或降低。的确，尽管事实上所有正常的体细胞都以几乎不可检测的水平表达p53蛋白(例如，只能用极其灵敏的技术检测，比如，RT-PCR)，但是已发现定义的瘤亚群具有升高的p53蛋白，即使存在野生型p53等位基因或正常的p53基因结构。在该情况中，p53功能经常被升高表达的如分子MDM2和MDM4之类的p53抑制物抑制。在这些具有升高的正常p53蛋白的瘤细胞中，刺激p53应激反应的治疗能有利地改变正常p53相对于p53抑制物水平的比例，引起正常p53活性的恢复和对治疗的有利反应。在缺乏任何正常p53的瘤或突变的p53已阻断如本发明中所述的反式显性效应的瘤中，正常的p53功能将不受影响，并且这些瘤将不易对p53基因治疗起有利反应，所述基因治疗通过p53依赖性通路(p53依赖性凋亡、衰老或细胞周期停滞)的活化发挥其作用。
有利反应者的另一种情况可用具有截短的四聚化结构域的升高的p53蛋白的瘤细胞例示。这些突变的蛋白不能和野生型p53蛋白四聚化来干扰它们的DNA结合，因此这些突变不能抑制野生型p53蛋白的功能。当另一个正常的p53等位基因存在或当外源性施用的正常的p53被递送到瘤时，这些瘤将对p53治疗起有利反应。
检测这些瘤抑制物(比如p53)的“升高水平”的最普遍和方便的方式选择这种技术，该技术对反映和检测所述通常见于癌细胞的蛋白水平足够灵敏，但对那些通常见于正常体细胞的蛋白水平不足够灵敏。免疫组织化学染色(“IHC”)技术包括一系列可应用的能被用于检测“升高水平”的p53的例示检测技术，并且因此特别适用于本发明(参见例如Ladner et al.,2000)。方便地，IHC技术通常不能足够灵敏地检测少量产生的p53蛋白，例如在正常的体细胞中，因此通常用于检测p53蛋白的升高水平。实践中结合本发明的特殊的优势在于，p53蛋白的IHC检测将通常不能分辨野生型和突变或异常的p53蛋白(特别在本发明的情况中，由于下方的抗体可被选择来检测大部分突变或者正常的p53蛋白)。在这些情况中，p53基因序列和拷贝数的同时检测被组合用来测定所述患者是否对p53基因治疗有p53表达谱有利或不利反应。
然而，本发明自然决不限于IHC技术的使用来鉴定和选择患有瘤的患者，这些患者具有升高的p53蛋白水平或p53通路中其他可测量的缺陷，因而本发明预期使用任何能辨别表现正常和异常的p53表达的细胞的技术。例子将包括检测技术，这些检测技术已合适地用于辨别p53mRNA表达和/或p53蛋白翻译水平的正常和异常水平。这些方法包括：(除了p53蛋白的免疫学检测)核酸杂交技术，例如，基因阵列和芯片，用于检测mRNA水平的差异，因此可以用于辨别p53mRNA水平。已知例示正常细胞和瘤细胞(以细胞系的形式)通常含有p53蛋白正常的或升高的水平，所述细胞包括诸如WI-38、CCD16和MRC-9，细胞系诸如SCC61、SCC173和SCC179，获得于普通提供者，比如ATCC和其他。
如前文所述，本发明公开了p53治疗，具体的是腺病毒p53治疗，可能在癌症患者亚群中起有利作用，这些患者具有升高的野生型p53水平及缺乏具有阻断活性的p53突变的高水平表达。相反，具有升高的阻断野生型p53蛋白的p53蛋白的瘤细胞对p53治疗有不良反应。这一分类综合考虑了蛋白水平、基因序列和基因拷贝数，提供了在升高的蛋白存在时治疗反应者的准确预测，而不是仅仅依靠升高的蛋白水平或单独突变分析的不完全的预后。
【3.突变的p53功能的鉴定】
能抑制野生型p53基因功能的突变能通过筛选野生型p53蛋白功能的缺失而被检出。尽管所述p53蛋白确实具有的所用功能仍待阐明，至少DNA结合功能是已知的。例如，p53蛋白结合SV40大的T抗原和腺病毒E1B抗原或其他知道的靶DNA序列。对本领域内熟练地技术人员而言，传统的方法可被用于检测p53蛋白结合能力的缺失，所述结合能力可结合任一或全部这些抗原或其他靶DNA，即使存在野生型p53蛋白，这指示着所述蛋白的突变变化，反映了其基因的突变变化，可能通过和野生型p53四聚化来阻断野生型p53的功能并阻止结合靶DNA。
过去十年中，实验性的功能检测也被用于为本领域内熟练的技术人员熟知的酵母和人类细胞，来测量p53突变蛋白的各种性能，包括：突变蛋白对位于p53反应元件控制之下的报告基因的反式激活活性；高于野生型蛋白的显性抑制效应；细胞周期停滞或凋亡的诱导；温度感受性；独立于或和野生型蛋白无关的突变蛋白的活性。最近，源于这些功能检测的结果已经通过万维网p53.iarc.fr/被整合到国际癌症研究署(IARC)的TP53数据库。该数据库提供结构数据和研究p53突变模式的分析工具(Peitjean et al.,2007；Resnick andInga,2003)。这些方法可用于鉴定那些p53突变，这些p53突变能发挥将抑制正常p53功能的显性抑制阻断效应。当该反式显性抑制p53突变以高水平表达或当细胞不能表达正常p53，例如没有正常的p53等位基因，这些情况对p53基因治疗有不利的结果。
【II.癌症治疗】
依照本发明的某些实施方式，申请人也提供用于预测对治疗性癌治疗和施用基于上文所述p53生物标记物表达谱的治疗的有利反应的方法。本发明更具体地涉及通过施用抗瘤治疗(比如p53基因治疗)治疗过度增生疾病。
【A.过度增生疾病】
过度增生疾病是和细胞异常生长或增生相关的疾病。所述过度增生疾病是可在受用者身上表现为损伤的疾病，例如瘤。所述瘤可以是良性瘤生长或癌。
本发明设想的用于治疗的例示瘤包括以下：鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺瘤、腺癌、皮革胃、胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、胰腺瘤、胆管上皮癌、肝细胞癌、腺样囊性癌、类癌瘤、催乳素瘤、嗜酸粒细胞腺瘤、何氏细胞腺瘤、肾细胞癌、子宫内膜样腺瘤、囊腺瘤、腹膜假粘液瘤、Warthin氏瘤、胸腺瘤、泡膜细胞瘤、颗粒细胞瘤、卵巢男性细胞瘤、Sertoli-Leydig细胞瘤、副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、血管球瘤、黑色素瘤、软组织肉瘤、结缔组织增生性小圆细胞瘤、纤维瘤、纤维肉瘤、粘液瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、肌瘤、肌肉瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、多形性腺瘤、肾母细胞瘤、勃勒纳瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、无性细胞瘤、生殖细胞瘤、胚胎性癌、卵黄囊瘤、畸胎瘤、皮样囊肿、绒毛膜癌、中肾瘤、血管瘤(hemangioma)、血管瘤(angioma)、血管肉瘤(hemangiosarcoma)、血管肉瘤(angiosarcoma)、血管内皮瘤、血管内皮瘤、卡波西氏肉瘤、血管外皮细胞瘤、淋巴管瘤、囊状淋巴管瘤、骨瘤、骨肉瘤、骨软骨瘤、软骨外生骨疣、软骨瘤、软骨肉瘤、巨细胞瘤、尤因肉瘤、牙源性瘤、成牙骨质细胞瘤、成釉细胞瘤、颅咽管瘤胶质瘤混合性寡星形细胞瘤、室管膜瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经上皮瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、神经纤维瘤病、神经鞘瘤、神经瘤、颗粒细胞瘤、腺泡状软组织肉瘤、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、淋巴肉瘤、霍奇金病、小淋巴细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、纵隔(胸腺)大细胞淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤、囊内大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织的结外边缘区B细胞淋巴瘤(MALT-淋巴瘤淋巴瘤)、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿、塞扎里综合征、外周血T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤、母细胞NK细胞淋巴瘤、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤、肥大细胞瘤、肥大细胞肉瘤、肥大细胞增生、肥大细胞白血病、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、组织细胞肉瘤、朗格汉斯细胞肉瘤树突状细胞肉瘤、滤泡树突细胞肉瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、淋巴瘤样肉芽肿、急性白血病、淋巴细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、浆细胞白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、B细胞幼淋巴细胞性白血病、T细胞幼淋巴细胞性白血病、前体B淋巴细胞白血病、前体T淋巴细胞白血病、急性红白血病、淋巴瘤细胞白血病、髓样白血病、髓性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性髓单核细胞性白血病、嗜碱性粒细胞白血病、嗜酸性粒细胞白血病、急性嗜碱性粒细胞白血病、急性髓样白血病、慢性髓性白血病、单核细胞性白血病、急性单核母细胞和单核细胞性白血病、急性巨核母细胞性白血病、急性髓样白血病和骨髓增生异常综合征、绿色瘤或髓样肉瘤、急性全骨髓增生与骨髓纤维化、毛细胞白血病、少年髓单核细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、真性红细胞增多症、骨髓增生性疾病、慢性特发性骨髓纤维化、自发性血小板增多、慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜酸性粒细胞白血病/嗜酸性细胞增多综合症、移植后淋巴组织增生性疾病、慢性骨髓增殖性疾病、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、慢性髓单核细胞白血病和骨髓增生异常综合征。
所述过度增生疾病或癌症可在初次诊断后或随后通过治疗性核酸或其他疗法或者两种或更多疗法治疗。过度增生疾病或癌症复发可定义为任何治疗(包括一次或多次手术、放射疗法或化学疗法)后患者再次出现或再次诊断有任何过度增生疾病或癌症。疾病复发的患者不必被视为无病的，但仅仅被视为在对首次治疗发生某种程度的临床反应之后，所述患者展现出复发的过度增生疾病或癌生长。所述临床反应可以是，但不限于：稳定的病症、瘤退行、瘤坏死、无可证实的癌、瘤尺寸或负荷减小、瘤生长的阻断、瘤相关疼痛减少、瘤相关病理的减少、瘤相关症状的减少、瘤非进行、增加的无病间期、增加的至进行时间、缓解的诱导、转移的减少、或增长的患者存活期。
【B.鳞状细胞癌】
所述瘤具体可以是鳞状细胞癌(SCCHN)，更具体可以是复发的SCCHN。复发的SCCHN是最厉害的癌之一。这些瘤有非常高的致死率并引起剧烈的痛苦。复发的SCCHN瘤和标准的治疗导致患者毁容和明显的妨碍基本功能(比如吃、吞咽和呼吸)的病态。患者常常需要类似饲管和气管切开术等侵入性方法来提供营养和呼吸。不幸的是，这些疾病的现行治疗不幸是不充分的，并且引起相当的毒副作用，经常加剧瘤病态。大部分患者对标准的治疗没有反应，并且中位值存活期只有4～6个月。用于治疗的所有化学治疗剂(甲氨蝶呤，顺铂，5FU和紫杉烷类)都能引起加剧瘤病态的口腔粘膜炎。虽然单克隆抗体不引起口炎，但它能产生皮疹，并增加放射性坏死副作用。
除了传统治疗的不良的安全特性，治疗反应通常是短期的，并且几乎普遍需要额外治疗。因此，复发的SCCHN清楚地表示着可怕的未满足需要的医疗状况，需要额外的治疗，优选用那些不产生构成瘤病态毒性的制剂。
【C.p53基因治疗】
在一实施方式中，p53基因治疗被预期。自从90年代中期人类p53基因治疗已报道于文献。Roth等人(1996)报道了基于逆转录病毒的治疗，Clayman等人(1998)报道了腺病毒递送。美国专利5,747,469,6,017,524；6,143,290；6,410,010；6,511,847。美国申请2002/0077313和美国申请2002/0006914各自报道了用p53治疗患者的方法，并且以引用方式并入本文中。
预期对患者进行表达构件体的局部、区域(及局部-区域)或全身递送。一般认为该方法将提供临床益处，宽泛地定义为下列任何一项：减小原发瘤的尺寸、减少转移的发生或尺寸、减少或停止瘤生长、诱导缓解、复发间隔时间增加、减少瘤相关疼痛、抑制瘤细胞分裂、杀死瘤细胞、诱导瘤细胞凋亡、减少或消除瘤复发、和/或增加患者存活期。
所述p53基因治疗具体是作为单个制剂是有效的，并且它的抗瘤活性和递送的p53蛋白的表达相关，导致p53响应基因的表达随之改变。这些基因和它们的基因产物影响大范围的引起抗瘤效应的细胞进程。这些进程特性的理解对解释治疗后观测到的临床反应类型来说是关键的。
是以诱导细胞衰老作为其作用的关键机制的首批抗癌制剂的一种。细胞衰老的诱导引起“永久的细胞周期停滞”并在具有失活的p53的瘤中p53活性暂时恢复后被观测到。临床上，永久的细胞周期停滞的诱导和瘤生长的稳定化而不是瘤尺寸减小有关。动物瘤模型和人类临床试验已经清楚地证实治疗后细胞周期停滞/衰老被激活。p53也激活抗血管生成机制，这些机制也和瘤生长的稳定化而不是瘤尺寸减小有关。或者，凋亡或“程序性细胞死亡”是被p53恢复激活的另一个关键通路。关于临床瘤反应，预计在治疗后凋亡诱导引起瘤尺寸减小。这些关键的p53瘤抑制机制和它们的分子调节物，如图1所阐释。
通常，在p53活性恢复之后，瘤中所有3种治疗通路(细胞周期停滞-凋亡-抗血管生成)被诱导。单个瘤细胞可能激活细胞周期停滞/衰老或凋亡通路，并且在特定细胞中决定哪个通路被引发的因子目前仍不清楚。依靠这些机制中哪一个在所述瘤细胞中被主要诱导，将决定在治疗后所观测到的临床反应的特性。如图2阐释，预期一连串的抗瘤反应包括从瘤生长的稳定化到瘤完全根除，包括衰弱/稳定的病症(图3)和凋亡/瘤减小(图4)，取决于活化细胞衰老或凋亡途径的细胞的相对比例。
与治疗机制的这些考虑一致，增长的主要数据指示传统的基于尺寸上完全(CR)和部分(PR)减小≥50％的瘤反应标准临床上不能最佳鉴定和增长的存活期相关的有关反应(Lara et al.,2008)。Lara等人(2008)最近报道了3个随机的，涉及984名肺癌患者的对照的西南瘤学组(Southwest Oncology Group)临床实验的结果，指示CR、PR或稳定的病症定义的瘤生长控制(TGC)在预测存活期上明显优于传统的CR+PR定义。同样地，Choi和同事(2007)证明用计算机化断层显象(CT)所示的瘤尺寸减小≥10％和用正电子成象术(PET)所示的瘤反应高度相关，并且是经伊马替尼治疗的胃肠间质瘤中比标准的反应标准更加灵敏的存活益处的预测标准(Choi,2007；Benjamin,2007)。
因此，对于如的制剂，已知它们以诱导细胞周期停滞和衰老为重要的作用机制，基于瘤生长控制(TGC＝CR+PR+SD)或瘤尺寸减小≥10％的瘤反应定义更适用于定义预测治疗后增加的存活期的瘤反应。
【III.治疗基因】
在本发明的某些实施方式中，提供给患者施用p53基因治疗、p53基因治疗之外的治疗，或另一个基于所述患者p53生物标记物表达谱的抗瘤治疗的方法。所述方法可在某些方面使用治疗性核酸，并在所述p53基因治疗中使用特定的p53基因。
【A.治疗性核酸】
本文定义的“治疗性核酸”指能被施用给受试者用于治疗或预防疾病目的的核酸，本文中所述核酸是已知的或怀疑有益于过度增生疾病的治疗。治疗益处可通过所述核酸引起(例如)特定一种或多种基因表达的变化。特定一种或多种基因表达的变化可以是特定基因表达的抑制或增强。本发明的某些实施方式关注于治疗性核酸的施用。
本文所用的“核酸”通常指DNA、RNA分子(即，链)或它们的衍生物或类似物，包括核苷酸碱基。例如，核苷酸碱基包括发现于DNA(例如，腺嘌呤“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”或胞嘧啶“C”)或RNA(例如，A、G、尿嘧啶“U”或C)中的天然存在的嘌呤或嘧啶碱基。所述术语“核酸”包含术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”，每个作为所述“核酸”的子集。所述术语“寡核苷酸”是指长度在约8～约100个核苷酸碱基之间的分子。所述术语“多核苷酸”是指长度至少多于约100个核苷酸碱基的分子。
在某些实施方式中，“基因”是指转录的核酸。在某些方面，所述基因包括涉及转录或信息生成的调控序列。在具体的实施方式中，基因包含编码蛋白、多肽或肽的转录序列。如本领域内那些技术人员所理解，这一有功能的术语“基因”包括基因组序列、RNA或cDNA序列或更小的经改造的核酸片段，包括基因非转录部分的核酸片段，包括但不限于基因的非转录的启动子或增强子区域。更小的经改造的核酸片段可以表达或可适合表达蛋白、多肽、肽结构域、肽、融合蛋白、突变的多肽和/或诸如此类。
“基本上从其他编码序列分离”是指所关注的基因形成核酸片段的编码区域的一部分，所述片段不包含天然存在的编码核酸的大部分，比如大染色体片段或其他功能基因或cDNA编码区。当然，这指原始分离的核酸，并且不排除之后人工添加到核酸的基因或编码区域。
在具体实施方式中，所述治疗性核酸以核酸“表达构件体”的形式。在整个申请中，所述术语“表达构件体”是指包括任何核酸类型，该类型中所有或部分核酸能被转录。所述转录部分可以编码治疗的基因，该基因能被翻译成治疗的基因产物，比如蛋白，但不必是蛋白。在其他实施方式中所述转录部分可简单地作用来抑制或增加具体基因的表达。
在本发明的某些实施方式中，所述治疗性核酸编码“治疗性基因”。如本领域内那些技术人员所知，所述术语“治疗性基因”包括基因组序列、cDNA序列、更小的经改造的核酸片段，它们表达，也可适应表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白、突变体，所有这些都能给遭受过度增生疾病的患者提供临床益处。编码治疗性基因的所述治疗性核酸可包含约5个～约20,000个或更多连续核苷酸、核苷或碱基对的核酸序列。
患有不可切除的瘤的患者可以根据本发明被治疗。作为结果，瘤尺寸可能减小，或所述瘤血管可以改变而使所述瘤变为可切除的。如果这样，标准的手术切除可被允许。能和手术联用的另一个具体的施用模式是手术的瘤床的治疗。因此，或者在最初基因疗法治疗中，或者在随后的治疗中，可以用手术中的载体灌注所述切除的瘤床，并且在手术后，任选插入导管到所述手术位点。
【B.核酸的纯化和表达】
核酸可以用聚丙烯酰胺凝胶、氯化铯梯度离心、柱层析或以本领域内普通技术人员所知的任何其他方式纯化(例如Sambrook et al.,2001，通过引用并入本文)。在某些方面，本发明关注的核酸是分离的核酸。如本文所述的术语“分离的核酸”是指核酸分子(例如，RNA或DNA分子)，这些分子已被分离得无或别样无大多数细胞成分或体外反应成分，和/或一个或多个细胞中大量总基因组和转录的核酸。分离核酸的方法(例如，平衡密度离心法、电泳分离、柱层析)为本领域内技术人员所熟知。
根据本发明，期望在靶细胞中生产治疗性蛋白。表达通常需要在载体或表达盒中提供合适的信号，载体或表达盒中包含各种调控元件，比如源于病毒和/或哺乳动物源的增强子/启动子，能驱动宿主细胞中目的基因的表达。也可包括设计为优化信使RNA稳定性和在宿主细胞中可译性的元件。可合并药物选择标记物，以建立永久的稳定的细胞克隆。
病毒载体选择真核表达系统。包括腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、慢病毒及包括牛痘病毒的痘病毒和包括SV40的乳头瘤病毒。病毒载体可为复制缺陷的、有条件缺陷的或复制完全的。还预期是非病毒递送系统，包括基于脂质的媒质。
【C.载体和表达构件体】
使用的所述术语“载体”是指载质核酸分子，其中可插入有用于导入细胞的核酸序列，其在细胞中被复制和/或表达。核酸序列可以是“外源性的”或“异源性的”，外源性表示它是从外面进入细胞，所述载体可以被导入，异源性是指所述序列与细胞中序列同源，但在宿主细胞核酸的位置上通常没有发现所述序列。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒、植物病毒)和人工染色体(例如，YAC)。本领域内技术人员可用标准的重组技术很好地装备以构建载体(参见例如，Sambrook et al.,2001 and Ausubel et al.,1996，都通过引用并入本文)。
所述术语“表达载体”是指任一基因构件体类型，该基因构件体含编码能被转录的RNA的核酸。在某些情况中，RNA分子被翻译成蛋白、多肽或肽。表达载体可包含多种“控制序列”，这些控制序列指特定宿主细胞中可操作连接的编码序列转录和翻译所必需的核酸序列。除了控制转录和翻译的控制序列，载体和表达载体可以包含有其他功能的核酸序列，如下文所述。
为了表达p53或p53之外的治疗性基因，有必要提供表达载体。合适的核酸可通过标准的亚克隆技术插入到表达载体。这些载体的操作在本领域内众所周知。融合蛋白表达系统的示例是谷胱甘肽S-转移酶系统(Pharmacia,Piscataway,NJ)、麦芽糖结合蛋白系统(NEB,Beverley,MA)、FLAG系统(IBI,New Haven,CT)及6×组氨酸系统(Qiagen,Chatsworth,CA)。
在另一个实施方式中，使用的表达系统由杆状病毒多角体启动子驱动的表达系统。编码蛋白的基因能通过标准的技术操作来促进克隆到所述杆状病毒载体内。具体的杆状病毒载体是pBlueBac载体(Invitrogen,Sorrento,CA)。携带目的基因的载体用标准的方法转染到秋粘虫(Spodoptera frugiperda(Sf9))细胞中，所述细胞被培养并处理来生产重组蛋白。暴露于杆状病毒的哺乳动物细胞被感染并可只表达外源基因。该方法可转导所有细胞，并以剂量依赖的方式表达该基因。
也有各种提供合适媒质的真核载体，这些载体中可产生重组多肽。HSV已被用于组织培养以表达大量外源基因，及其内源性基因的高水平表达。例如，鸡卵清蛋白基因已用α启动子在HSV中表达。Herz和Roizman(1983)。lacZ基因也已在各种HSV启动子控制下表达。
在整个申请中，所述术语“表达构件体”是指包括任何包含编码基因产物的核酸的基因构件体类型，其中部分或全部核酸编码序列能被转录。所述转录物可被翻译成蛋白，但未必。因此，在某些实施方式中，表达包括基因的转录和RNA到基因产物的翻译。在其他实施方式中，表达只包括所述核酸的转录。
在具体的实施方式中，所述核酸受启动子的转录控制。“启动子”是指被细胞合成装置或导入的合成装置识别的DNA序列，为起始基因的特异转录所需。所述短语“受转录控制”是指启动子相对于核酸在正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶的起始和基因的表达。
本文使用的短语“启动子”是指一组在针对RNA聚合酶II的起始位点附近聚集的转录控制模块。关于启动子如何被组织的很多考虑来自几种病毒启动子的分析，包括对HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单元的分析。这些研究(随着最近更多的工作而增加)已经表明启动子由离散的功能模块组成，每个由约7～20个bp的DNA组成，且含有转录活化或抑制蛋白的一个或更多识别位点。
每个启动子中至少一个模块功能是定位RNA合成的起始位点。最熟知的例子是TATA盒，但是在一些缺少TATA盒的启动子(比如哺乳动物末端脱氧核苷酰转移酶基因的启动子、SV40晚期基因的启动子)中，覆盖起始位点的离散元件本身有助于固定起始位置。
附加的启动子元件调控转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30～110bp区域，尽管最近大量启动子已被证明在其起始位点下游含有功能元件。启动子元件之间的距离时常是可塑的，因此当元件是颠倒的或相对于另一个有移动时，启动子功能是保守的。在tk启动子中，启动子元件之间的距离增加到距原先50bp时活性开始下降。依赖所述启动子，似乎单个元件或者合作或者独立地发挥功能来激活转录。
使用具体的启动子来控制核酸的表达不被认为是决定性的，只要它能在靶细胞中表达核酸。因此，在人类细胞作为靶点中，它具体位于临近的并在启动子控制之下的核酸编码区域，该启动子能在人类细胞中被表达。一般而言，这一启动子可能包括人类或病毒启动子。
在各种其他实施方式中，人类巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子和劳斯肉瘤病毒长末端重复能被用于获得转基因的高水平表达。使用其他本领域内众所周知的病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子来实现转基因，也被期望提供高水平表达来满足预定目的。
增强子最初被测定为增加转录的基因元件，相距位于同一DNA分子的据启动子很远的位置上。这种长距离作用的能力在经典的原核转录调控研究中没有先例。随后的研究表明具有增强子活性的DNA区域结构组织上很像启动子。即是，它们由许多单个元件构成，每个能结合一个或多个转录蛋白。
增强子和启动子的基本区别是可操作的。增强子区域总体上必须能在远处刺激转录，这一需要不适用于启动子区域或其组分元件。另一方面，启动子必须有直接起始RNA在特定位点和特定方向上合成的一个或多个元件，而增强子没有这些特异性。启动子和增强子常常是重叠的或连续的，常常看起来有类似的模块组织。
另外，任何启动子/增强子组合(as per the Eukaryotic Promoter Data BaseEPDB)也能被用于驱动转基因的表达。T3、T7或SP6细胞质表达系统的使用是另一可能的实施方式。如果合适的细菌聚合酶被提供，真核细胞能支持由某些细菌启动子的细胞质转录，或者作为递送复合体的一部分，或者作为额外的基因表达构件体。
其通常包括多聚腺苷酸化信号以实现转录物的合适的多聚腺苷酸化。多聚腺苷酸化的特性并不被认为是本发明成功实施的关键，并且任何这些序列可被使用。具体的实施方式包括SV40多聚腺苷酸信号和牛生长激素多聚腺苷酸信号，它们是方便的，并深知其在各种靶细胞中的发挥良好的功能。也预计作为表达盒元件的是终止子。这些元件可以用于增强信息水平并使从所述基因盒到其他序列的通读最小化。
特异的起始信号也是编码序列的有效翻译所需的。这些信号包括ATG起始密码子和邻近的序列。外源的翻译控制信号，包括ATG起始密码子，也许需要被提供。本领域内普通的技术人员能容易地测定该信号并提供所述必需信号。众所周知，所述起始密码子必须是和所期望的编码序列的阅读框符合“符合阅读框”，以确保整个插入片段的翻译。外源性翻译控制信号和起始密码子可以是天然的也可是合成的。表达效率可以通过内含合适的转录增强子元件而被增强(Bittner et al.,1987)。
在本发明的各种实施方式中，所述表达构件体包含病毒或经改造的源于病毒基因组的构件体。某些病毒有能力经过受体介导的内吞作用进入细胞并整合到宿主细胞基因组中稳定并有效地表达病毒基因，这些能力使它们成为外源基因转染进入哺乳动物细胞的优良候选物(Ridgeway,1988；Nicolas and Rubenstein,1988；Baichwal and Sugden,1986；Temin,1986)。第一批用作载体的病毒是DNA病毒，包括乳多泡病毒(猿猴病毒40,牛乳头瘤病毒和多瘤)(Ridgeway,1988；Baichwal and Sugden,1986)及腺病毒(Ridgeway,1988；Baichwal and Sugden,1986)和腺伴随病毒。逆转录病毒也是优良基因转染载体(Nicolasand Rubenstein,1988；Temin,1986)，也包括痘病毒(Ridgeway,1988)和腺伴随病毒(Ridgeway,1988)。这些载体可用于(1)为了目的蛋白的表达体外转化细胞系，或(2)在基因治疗方案中体内或体外转化细胞以提供治疗性多肽。
【a.病毒载体】
病毒载体是利用病毒序列将核酸和可能的蛋白导入细胞中的表达构建体，某些病毒有能力经过受体介导的内吞作用感染细胞或进入细胞，并整合到宿主细胞基因组稳定并有效地表达病毒基因，这些能力使它们成为将外源核酸转移进入细胞(如，哺乳动物细胞)的优良候选物。本发明的载体成分可以是编码一种或多种候选物或其他此类成分，例如，免疫调节物或所述候选物的佐剂的病毒载体。可被用于递送本发明核酸的病毒载体的非限制性例子报道于下文。
腺病毒是无包膜的双链DNA病毒。病毒体由在蛋白衣壳内的DNA-蛋白核心构成。病毒结合特定的细胞受体，被内吞，所述基因组从核内体挤出并转运到细胞核。基因组约36kB，编码约36个基因。在细胞核中，所述“立即早期”E1A蛋白最初表达，这些蛋白诱导由E1B、E2、E3和E4转录单元编码的“延迟的早期”蛋白表达。感染后(p.i.)约1天时，病毒体在细胞核中装配，2～3天后细胞裂解并释放子代病毒。细胞裂解由E3 11.6K蛋白介导，该蛋白被重新命名为“腺病毒死亡蛋白”(ADP)。
腺病毒特别适合作为基因转移载体，由于其中型尺寸的基因组，易于操作，高滴度，广泛的靶细胞范围和高感染性。所述病毒基因组两端含有100～200碱基对的反向重复序列(ITRs)，这是病毒DNA复制和装配所必需的顺式元件。基因组的早期(E)和晚期(L)区域含有由病毒DNA复制的起始划分的不同转录单元。E1区域(E1A和E1B)编码负责病毒基因组和一些细胞基因的转录调控的蛋白。E2区域(E2A和E2B)的表达引起用于病毒DNA复制的蛋白合成。这些蛋白涉及DNA复制，晚期基因表达和宿主细胞关闭(Renan,1990)。晚期基因的产物(包括大部分病毒衣壳蛋白)只在主要的单独的最初转录进程之后表达，由主要晚期启动子(MLP)启动。所述MLP(位于16.8m.u.)在感染晚期特别有效，并且所有由此启动子启动的mRNA's具有5'-三联前导序列(TPL)，该前导序列使这些称为翻译用特定的mRNA's。
腺病毒可以是已知的51种不同血清型或亚型A～F中的任何一种。C亚类的5型腺病毒是人类腺病毒，其中大部分生物化学和遗传学信息已知，历史上已经被用于大部分使用腺病毒作为载体的制作。重组的腺病毒常常由穿梭载体和前病毒载体之间的同源重组产生。由于两种前病毒载体可能重组，野生型腺病毒可由该过程产生。因此，关键在于从单个噬菌斑中分离病毒的单克隆并检查其基因组结构。
用于基因治疗的病毒可以是复制完全的或者是复制缺陷的。复制缺陷的腺病毒载体的生成和增殖依靠辅助细胞系，原型是293细胞，通过用Ad5DNA片段转化人胚胎肾细胞来制备，该细胞系能组成性的表达E1蛋白(Graham et al.,1977)。然而，辅助细胞系可以源于人类细胞，比如人类胚胎肾细胞、肌肉细胞、造血细胞或其他人类胚胎间充质或上皮细胞。或者，所述辅助细胞可以源于其他允许人类腺病毒的哺乳动物细胞。这些细胞包括，例如，Vero细胞或其他猴胚胎间充质或上皮细胞。如前文所述，所述具体的辅助细胞系是293。
Racher等人(1995)已经公开了用于培养293细胞和繁殖腺病毒的改善的方法。在一形式中，天然的细胞聚集物通过接种单个细胞到1升经硅烷化处理的含有100～200ml培养基的旋转烧瓶(Techne,Cambridge,UK)中生长。然后以40rpm搅动，细胞活力用台盼蓝染色评估。在另一形式中，Fibra-Cel微载体(Bibby Sterlin,Stone,UK)(5g/l)如下使用。细胞接种液在5ml培养基中重悬，在250ml锥形烧瓶中添加到载体(50ml)并保持静置1～4小时，偶尔搅动。然后该培养基被50ml新鲜培养基取代并开始摇动。关于病毒生成，细胞被允许生长达到约80％汇合度，此后培养基被替换(达到终体积的25％)，然后以0.05MOI添加腺病毒。培养保持静置过夜，之后体积增加到100％，再开始摇动72小时。
腺病毒生长和操作为本领域内那些技术人员所知，并在体内和体外具有广泛的宿主范围。这类病毒可被高滴度获得，例如，109～1013噬菌斑形成单位/ml，并且它们具有高度感染性。腺病毒的生命周期不需要整合进入所述宿主细胞基因组。被腺病毒载体递送的外源基因是游离的，因此对宿主细胞的基因毒性较低。在用野生型腺病毒的疫苗接种研究中还没有副作用的报道(Couch et al.,1963；Top et al.,1971)，证明了它们作为体内基因转移载体的安全性和治疗潜能。
腺病毒载体已被用于真核基因表达(Levrero et al.,1991；Gomez-Foix et al.,1992)和疫苗研发(Grunhaus and Horwitz,1992；Graham and Prevec,1992)。动物研究已经表明重组的腺病毒可被用于基因治疗(Stratford-Perricaudet and Perricaudet,1991；Stratford-Perricaudet et al.,1990；Rich et al.,1993)。施用重组腺病毒到不同组织的研究包括气管灌注(Rosenfeld et al.,1991；Rosenfeld et al.,1992)、肌肉注射(Ragot et al.,1993)、外周静脉注射(Herz and Gerard,1993)和立体定向接种到脑(LeGal La Salle et al.,1993)。
如上所述，Ad载体基于重组的Ad，该Ad或是复制缺陷的或是复制完全的。通常的复制缺陷的Ad载体缺乏E1A和E1B基因(总称为E1)并在它们的位置上包含由启动子和mRNA前体加工信号构成的表达盒，该信号驱动外源基因表达。这些载体不能复制，由于它们缺乏诱导Ad基因表达和DNA复制所需要的E1A基因。另外，所述E3基因能被删除，因为它们不是培养的细胞中病毒复制必需的。本领域内认为复制缺陷的Ad载体具有的几个特征使它们次优用于治疗。例如，复制缺陷载体的生产需要它们在运输中提供E1A蛋白的补充细胞系中生长。
几个团体也已经提议用复制完全的Ad载体用于治疗用途。复制完全的载体保持复制必要的Ad基因，因而不需要补充细胞系来复制。复制完全的Ad载体裂解细胞是所述载体生命周期的天然部分。当所述载体被改造用于编码和表达外源蛋白时，复制完全的Ad载体具有优势。这些载体被期望随着载体复制可大大地提高体内编码的蛋白的合成。关于用作抗癌剂，理论上复制完全的病毒载体是有优势的，它们能够在瘤中复制和扩散，而不像复制缺陷载体的情况那样只在最初感染的细胞。
另一种方法是制备有条件复制完全的病毒。Onyx制药公司最近报道了基于腺病毒的抗癌症载体，其在非瘤细胞中是复制缺陷的，但在缺乏有功能的p53和/或视网膜神经胶质瘤(pRB)瘤抑制蛋白的瘤细胞中表现复制表型(美国专利5,677,178)。据报道，该表型可用重组的腺病毒实现，所述腺病毒在E1B区域含有突变，该突变使E1B-55K蛋白不能结合p53；和/或在E1A区域含有突变，该突变使编码的E1A蛋白(p289R或p243R)不能结合pRB和/或p300和/或p107。E1B-55K至少有两种独立的功能：结合并使瘤抑制蛋白p53失活；并且为Ad mRNA从细胞核的有效转运所必需。由于这些E1B和E1A病毒蛋白涉及使细胞进入S期，这为腺病毒DNA复制所需，并由于p53和pRB蛋白阻断细胞周期进程，Onyx报道的重组的腺病毒载体可以在p53和/或pRB缺陷的细胞中复制(许多癌细胞中的情况)，但不在具有野生型p53和/或pRB的细胞中复制。
另一个复制完全的腺病毒载体中E1B-55K基因被置换为单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(Wilder et al.,1999a)。构建该载体的团体报道载体与更昔洛韦的组合表现为在裸鼠模型中对人结肠癌有治疗效应(Wilder et al.,1999b)。然而，该载体缺乏ADP的基因，因此该载体裂解细胞和从细胞到细胞的扩散不如表达ADP的相当的载体有效。
也可以利用各种启动子系统来制备过表达p53的腺病毒载体。载体也可以是复制完全的或有条件复制的。其他版本的经改造的腺病毒包括：破坏E1A的能结合p300和/或Rb家族成员的能力，或缺乏至少一种E3蛋白表达的Ad载体，其中E3蛋白选自：6.7K、gp19K、RIDα(也称10.4K)；RIDβ(也称14.5K)和14.7K。由于野生型E3蛋白抑制免疫介导的发炎和/或Ad缺陷细胞的凋亡，缺乏一种或多种这些E3蛋白的重组的腺病毒可以刺激炎性和免疫细胞渗透到用腺病毒治疗的瘤，并且该宿主免疫应答将帮助摧毁瘤和已转移的瘤。E3区域的突变将损害其野生型功能，是感染病毒的细胞易于被宿主免疫系统攻击。这些病毒被详细报道于美国专利6,627,190。
其他腺病毒载体报道于美国专利5,670,488；5,747,869；5,932,210；5,981,225；6,069,134；6,136,594；6,143,290；6,210,939；6,296,845；6,410,010；和6,511,184；美国公开No.2002/0028785。
溶瘤病毒也被预期作为本发明的载体。本文定义的溶瘤病毒通常指较之正常细胞，更常杀死瘤或癌细胞的病毒。裂解病毒的示范例包括过表达ADP的腺病毒。这些腺病毒详细报道于美国专利申请20040213764、美国专利申请20020028785和美国专利申请系列No.09/351,778，每个都通过引用整体特别并入本申请的本章节和本申请的其他章节。裂解病毒的示范例在本说明书的别处被讨论。任一名本领域内普通的技术人员熟悉其他裂解病毒，这些病毒可用于药物组合物和本发明的方法中。
腺伴随病毒(AAV)是用于本发明的方法的优良载体系统，由于它具有整合高频率并能感染不分裂的细胞，因而使它有用于(例如)在组织培养(Muzyczka,1992)或体内基因的到哺乳动物细胞的递送。AAV具有广泛的感染宿主范围(Tratschin et al.,1984；Laughlin et al.,1986；Lebkowski et al.,1988；McLaughlin et al.,1988)。关于生成和rAAV载体使用的细节报道于美国专利5,139,941和4,797,368，每个都通过引用并入本文。
逆转录病毒有望作为治疗性载体，由于它们能整合它们的基因到宿主基因组，转移大量外源遗传物质，感染广泛的物种和细胞类型并能在特定细胞系中装配(Miller,1992)。
为了构建逆转录病毒载体，在某些病毒序列的位置上，核酸被插入到病毒基因组以生成复制缺陷的病毒。为了生成病毒体，包含gag、pol和env基因但没有LTR和装配组件的装配细胞系被构建(Mann et al.,1983)。当包含cDNA的重组质粒，连同逆转录病毒的LTR和装配序列被导入到特定细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀)，装配序列允许重组质粒的RNA转录物被装配进病毒颗粒，然后被分泌到培养基中(Nicolas and Rubenstein,1988；Temin,1986；Mann et al.,1983)。然后含有重组逆转录病毒的培养基被收集，任选浓缩，用于基因转移。逆转录病毒载体能感染广泛的各种细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞分裂(Paskind et al.,1975)。
慢病毒是复合的逆转录病毒，除了普通的逆转录病毒基因gag、pol和env，还包括其他调控或结构功能的基因。慢病毒载体在本领域内众所周知(例如，参见Naldini etal.,1996；Zufferey et al.,1997；Blomer et al.,1997；美国专利6,013,516和5,994,136)。
重组的慢病毒载体能感染不分裂的细胞，并能用于体内和体外基因转移和核酸序列的表达。例如，重组的慢病毒能感染不分裂的细胞，其中合适的宿主细胞能被两种或更多具有装配功能元件(称为gag、pol、env，以及rev和tat)的载体转染，报道于美国专利5,994,136，通过引用并入本文。可以通过连接包膜蛋白和抗体或靶向特定细胞类型的特定配体来靶向重组病毒。通过将目标序列(包括调控区)随着另一编码特定靶细胞上的受体的配体的基因插入病毒载体(例如，所述载体现在是靶特异性的)。
在治疗神经系统紊乱上已对单纯疱疹病毒(HSV)产生了相当的兴趣，由于它对神经细胞的向性，但考虑到其广泛的宿主范围，这一载体也能用于其他组织。使HSV作为优良载体的另一个因素是其基因组的尺寸和组织结构。由于HSV较大，并有多个基因或表达盒，比其他更小的病毒系统更少有问题。此外，不同的病毒控制序列具有不同的性能(时间、长度等)，使之可能比其他系统更大程度地控制表达。它的另一个优势在于该病毒具有相对较少的重叠信息，更易于基因操作。
HSV也相对易于操作并能生长到高滴度。因此，递送很少是问题，在体积上需要达到足够的MOI并较少需要重复给药。HSV作为基因治疗载体的综述见于Glorioso等人(1995)。
HSV分为亚型1和2，是有包膜的病毒，是人类遭遇的最普遍的感染剂，世界范围内感染了数百万受试者。大的、复合的双链DNA基因组编码许多不同的基因产物，其中一些源于剪接的转录物。除了病毒体和包膜结构成分，该病毒编码很多其他蛋白，包括蛋白酶、核糖核苷酸还原酶、DNA聚合酶、ssDNA结合蛋白、解旋酶/引物酶、依赖于DNA的ATP酶、dUTP酶和其他。
HSV基因分为几组，它们的表达是协同调控的并在随后的级联模式中是有序的(Honess and Roizman,1974；Honess and Roizman 1975)。α基因的表达，是感染后第一批被表达的基因，由病毒体第16蛋白或α-反式诱导因子增强(Post et al.,1981；Battersonand Roizman,1983)。β基因的表达需要有功能的α基因产物，最特别是ICP4，由α4基因编码(DeLuca et al.,1985)。γ基因，编码大部分病毒体结构蛋白的异源基因的组，需要用于最优表达的病毒DNA合成的起始(Hollan et al.,1980)。
在基因组复合性中，很多涉及HSV的生命周期。除了裂解周期，其能导致病毒颗粒的合成，最后细胞死亡，所述病毒能进入潜伏的状态，其中病毒基因组维持在神经的神经节中，直到一些还未确定的信号引发裂解周期再现。HSV的无毒突变体已被研发，并被容易地用于基因治疗领域(美国专利5,672,344)。
痘苗病毒载体已被广泛使用，因为它们容易被构建，获得相对高水平的表达，广泛的宿主范围和携带大容量DNA。牛痘含有约186kb的线性双链DNA基因组，表现出明显的“A-T”偏好。基因组侧翼有约10.5kb的反向末端重复。大部分必要基因似乎定位在中心区域，在痘病毒中非常高度保守。预计牛痘病毒中开放阅读框的数目为150～200。尽管两条链都能编码，但阅读框的广泛重叠并不普遍。
至少25kb能被插入到牛痘病毒基因组中(Smith and Moss,1983)。原型牛痘载体经过同源重组含有插入到病毒胸苷激酶基因的转基因。基于tk-表型选择载体。脑心肌炎病毒的非翻译前导序列的内含物，表达水平比传统载体的高些，在24小时内转基因蓄积10％或更多感染的细胞蛋白(Elroy-Stein et al.,1989)。
待递送的核酸可被装封在感染的病毒中，该病毒已被改造表达特定结合配体。因而所述病毒颗粒将特异结合靶细胞的同源受体，并递送内含物给所述细胞。基于逆转录病毒的化学修饰，通过化学添加乳糖残基到病毒包膜开发了旨在允许逆转录病毒特异性靶向的新方法。该修饰通过唾液酸糖蛋白受体允许肝细胞特异性感染。
设计了靶向重组逆转录病毒的另一个方法，其中使用了针对逆转录病毒包膜蛋白和针对特定细胞受体的生物素化抗体。使用链霉亲和素将所述抗体和生物素成分偶联(Roux et al.,1989)。使用针对I型和II型主要组织相容性复合体抗原的抗体，他们证明各种人类细胞的感染，用专宿病毒体外钻孔那些表面抗原(Roux et al.,1989)。
【b.非病毒递送】
基于脂质的非病毒制剂提供可以替代病毒的基因治疗。尽管许多细胞培养研究已经证明了基于脂质的非病毒基因转染，但通过基于脂质的制剂进行全身的基因递送仍受限制。基于脂质的非病毒的基因递送的主要限制在于包含非病毒递送媒质的阳离子脂质的毒性作用。脂质体的体内毒性部分解释了体内和体外基因转染结果的矛盾。造成这一矛盾结果的另一个因素是，脂质体在血清蛋白存在和缺失时的稳定性不同。脂质体和血清蛋白的相互作用对脂质体的稳定性有显著影响(Yang and Huang,1997)。阳离子脂质体吸引并结合带负电荷的血清蛋白。血清蛋白包被的脂质体或者被溶解，或者被巨噬细胞摄入以使它们从血液循环中清除。现行体内脂质体递送的方法使用雾化吸入、皮下、皮内、瘤内或颅内注射，以避免血液循环中阳离子脂质相关的毒性与稳定性问题。脂质体和血浆蛋白的相互作用是体外、(Felgner et al.,1987)和体内(Zhu et al.,1993；Philip et al.,1993；Solodin et al.,1995；Thierry et al.,1995；Tsukamoto et al.,1995；Aksentijevichet al.,1996)基因转移效率不同的主要原因。
最近在脂质体制剂中的进步已经提高了体内基因转移的效率(Templeton etal.1997；WO 98/07408，通过引用并入本文)。由等摩尔比例的1,2-双(油酰基氧基)-3-(三甲铵基)丙烷(DOTAP)和胆固醇组成的新的脂质体制剂在体内显着提高全身的基因转移，约150倍。据称所述DOTAP：胆固醇脂质制剂形成一独特的称为“夹心脂质体”的结构。该制剂被报道“夹心的”DNA在凹入的双层或“瓶”结构之间。这些脂质体的有利特性包括正电到负电荷或ρ，胆固醇胶体稳定化，二维的DNA包装和增加的血清稳定性。
脂质制剂的生产通常在(I)逆相蒸发(II)脱水，补液(III)洗涤剂透析及(IV)薄膜水化后，通过超声降解法或脂质体混合物的连续挤压制备。一旦被制备，脂质结构可被用于包裹在血液循环中是有毒的(化学治疗剂)或不稳定的(核酸)的化合物。脂质体包裹已为该化合物引起较低毒性和较长血清半衰期(Gabizon et al.,1990)。在治疗过度增生疾病的具体治疗中，数种疾病治疗使用基于脂质的基因转移策略来增强传统的或建立的新治疗。
脂质体是多孔结构的，以脂质双层和内部含水介质为特征。多室脂质体有多个被含水介质分割的脂质层。当脂质悬浮于过多的水溶液中时，它们能自发形成。所述脂质成分在形成特定结构之前发生自身重排，该结构在脂质双层间内含水和溶解的溶质(Ghosh andBachhawat,1991)。亲脂性分子或具有亲脂性区域的分子可也能溶于或结合于脂质双层。
脂质体能携带有生物活性的核酸，这些核酸是完全隔离的。脂质体可能含有一种或更多核酸，并被施用给哺乳动物宿主来有效递送它的内含物给靶细胞。所述脂质体可含有DOTAP和胆固醇或胆固醇衍生物。在某些实施方式中，DOTAP相对胆固醇、胆固醇衍生物或胆固醇混合物的比例是约10:1～约1:10、约9:1～约1:9、约8:1～约1:8、约7:1～约1:7、约6:1～约1:6、约5:1～约1:5、约4:1～约1:4、约3:1～1:3、2:1～1:2和1:1。在另一些实施方式中，DOTAP和/或胆固醇浓度是约1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、25mM或30mM。DOTAP和/或胆固醇浓度可在约1mM～约20mM、1mM～约18mM、1mM～约16mM、约1mM～约14mM，约1mM～约12mM、约1mM～约10mM、1～8mM、2～7mM、3～6mM和4～5mM。在本发明中胆固醇衍生物可以容易地替代胆固醇或和胆固醇混合。许多胆固醇衍生物为熟练的技术人员所知。例子包括但不限于乙酸胆固醇和油酸胆固醇。胆固醇混合物指含有至少一个胆固醇或胆固醇衍生物的组合物。
可使用膜或滤器排除所述制剂，且这可进行多次。所述技术为本领域技术人员所熟知，例如在Martin(1990)中。可进行挤压以均一化制剂或限制其尺寸。某些实施方式中涉及的制备脂质体的方法是加热、超声处理及通过递减孔尺寸的滤器顺序挤压脂质，由此导致小、稳定脂质体结构形成。此制剂仅产生合适且统一尺寸的脂质体复合物脂质体，其在结构上稳定，且产生最大活性。
例如，预期在本发明的某些实施方式中DOTAP:胆固醇脂质体用Templeton等人(1997；通过引用并入本文)的方法制备。因此，在一实施方式中，DOTAP(阳离子脂质)和胆固醇(中性脂质)等摩尔浓度混合。然后粉末状的脂质混合物溶于氯仿，溶液形成薄膜，干燥，然后薄膜在含5％右旋糖(w/v)的溶液中水化达到终浓度为20mM DOTAP和20mM胆固醇。水化的薄膜在50℃水中旋转水浴45分钟，然后35℃另外水浴10分钟并于室温静置过夜。第二天所述混合物在50℃超声处理5分钟。超声处理的混合物被转移到试管，并在50℃加热10分钟。该混合物通过减小孔径(1μm、0.45μm、0.2μm、0.1μm)的注射过滤器连续挤压。
也预计其他脂质体制剂和制备方法可被结合给予期望的DOTAP:胆固醇脂质体特性。制备用于核酸递送的基于脂质的制剂的方法报道于Saravolac等人(WO 99/18933)。细节是方法，其中特异制备脂质组合物，以包裹核酸。在另一个脂质体制剂中，双亲性媒质称为溶剂稀释微载体(SDMC)能使特定分子整合到脂质媒质的双层(美国专利5,879,703)。所述SDMCs能被用于递送脂多糖，核酸等等。当然，任何其他脂质体制备方法能被熟练地技术人员使用来获得本发明中期望的脂质体制剂。
为本领域内技术人员所知的递送基因到瘤的其他制剂也用于本发明。本发明也包括用于核酸表达构件体局部递送的纳米颗粒的脂质体制剂。例如，所述脂质体制剂可含有DOTAP和胆固醇。这一包含核酸表达构件体的制剂的例子列于下文。
阳离子脂质(DOTAP)可与中性脂质胆固醇(Chol)以等摩尔浓度混合(AvantiLipids)。混合的粉末状脂质能在1-L圆底烧瓶中溶解于HPLC-级氯仿(Mallinckrodt,Chesterfield,Mo.)。溶解后，30℃下溶液在Buchi旋转蒸发器中旋转30分钟形成薄膜。然后含有薄脂膜的烧瓶真空干燥15分钟。一旦完全干燥，薄膜可在含5％右旋糖的水溶液(D5W)中水化达到终浓度为20mM DOTAP和20mM胆固醇，称为20mM DOTAP:胆固醇。水化的脂膜在50℃水中旋转水浴45分钟，然后另外在35℃水浴10分钟。然后混合物被允许放在石蜡封口的烧瓶中室温过夜，然后50℃低频率超声降解5分钟(Lab-Line,TranSonic 820/H)。超声处理后，混合物被转移到试管并在50℃加热10分钟。该混合物通过Whatman(Kent,UK)减小孔径(1.0μm、0.45μm、0.2μm、0.1μm)的注射过滤器连续挤压。Whatman Anotop过滤器，0.2μm和0.1μm，也可被使用。经过挤压，所述脂质体能于4℃储存在氩气中。
将质粒DNA形式的核酸表达构件体，例如150μg可被稀释于D5W。储存的脂质体也可稀释于D5W的分离的溶液。然后等体积的DNA溶液和脂质体溶液被混合达到终浓度(例如)150μg DNA/300μl体积(2.5μg/5μl)。稀释和混合可在室温下进行。然后可用自动移液器枪头将DNA溶液迅速添加到脂质体溶液表面。然后可将所述DNA:脂质体混合物在移液器枪头中迅速上下混合2次以生成DOTAP:胆固醇核酸表达构件体复合体。
用所述说明书中的教导和本领域内那些技术人员已知的知识，可以进行检验测定DOTAP:胆固醇核酸表达复合体的颗粒大小。例如，DOTAP:胆固醇核酸表达构件体复合体的颗粒大小可用N4-Coulter颗粒尺寸分析器(Beckman-Coulter)测定。关于这一测定，在颗粒大小测定之前，应将5μl新制备的复合体被稀释在1ml水中。另外，分析中也可采用所述复合体在O.D.400nm的分光光度计测量。关于该分析，5μl样品可稀释在95μl D5W中使终体积达到100μl。应用上述制备技术和尺寸分析方法应能证实复合体的大小在374～400nm之间。
纳米胶囊通常能用稳定并可再生的方式包裹化合物。为了避免细胞内过度负荷的副作用，这些超微粒子(大小约0.1μm)应被设计为能在体内被降解的多聚体。符合这些要求的可生物降解的多烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒被预期用于本发明，并且这些颗粒能被轻易制备。可和本发明的方法和组合物联用的并适合纳米颗粒使用的方法包括美国专利6,555,376、美国专利6,797,704、美国专利申请20050143336、美国专利申请20050196343和美国专利申请20050260276，每个都通过引用整体特别并入本文中。以美国专利公开20050143336为例，其提供纳米颗粒制剂的例子，该颗粒以核酸的形式含有瘤抑制基因，比如p53和FUS-1，这些核酸与阳离子脂质(比如DOTAP)或中性脂质(比如DOPE)复合形成脂质体。
【2.载体递送和细胞转化】
现行发明中用于细胞器、细胞、组织或机体转化的合适的核酸递送方法被认为包括几乎任一种能导入核酸(例如，DNA)到细胞器、细胞、组织或机体的方法，如本文所述或如本领域内任一普通的技术人员所知。这些方法包括但不限于DNA的直接递送，比如离体转染(Wilson et al.,1989；Nabel et al.,1989)，注射(美国专利5,994,624,5,981,274,5,945,100,5,780,448,5,736,524,5,702,932,5,656,610,5,589,466和5,580,859，每个都通过引用并入本文)，包括显微注射(Harland and Weintraub,1985；美国专利5,789,215，通过引用并入本文)，电穿孔(美国专利5,384,253，通过引用并入本文；Tur-Kaspa et al.,1986；Potter et al.,1984)，磷酸钙沉淀(Graham and Van Der Eb,1973；Chen andOkayama,1987；Rippe et al.,1990)；用DEAE-右旋糖酐后使用聚乙二醇(Gopal,1985)；直接超声加载(Fechheimer et al.,1987)；脂质体介导的转染(Nicolau and Sene,1982；Fraley et al.,1979；Nicolau et al.,1987；Wong et al.,1980；Kaneda et al.,1989；Kato et al.,1991)和受体介导的转染(Wu and Wu,1987；Wu and Wu,1988)；微粒轰炸(WO94/09699和WO 95/06128；美国专利5,610,042；5,322,783,5,563,055,5,550,318,5,538,877和5,538,880，每个都通过引用并入本文)；碳化硅纤维搅动(Kaeppler et al.,1990；美国专利5,302,523和5,464,765，每个都通过引用并入本文)；和这些方法的任意组合。
【3.表达系统】
各种表达系统表现为包含至少部分或全部上述组合物。基于原核和/或真核的系统能被用于本发明来生产核酸序列，或它们的同源多肽、蛋白和肽。许多这些系统可商业化并广泛使用。
昆虫细胞/杆状病毒系统能制备高水平的异源核酸片段的蛋白表达，例如报道于美国专利5,871,986、4,879,236，都通过引用并入本文，其可以购买，例如，来自的2.0和来自的BacPackTM BaculovirusExpression System。
其他表达系统例子包括的Complete ControlTM InducibleMammalian Expression System，其涉及合成的蜕化素诱导的受体，或它的pET表达系统，大肠杆菌表达系统。可诱导表达系统的另一个例子可从得到，其携带T-RexTM(调控四环素的表达)系统，是使用全长CMV启动子的可诱导的哺乳动物表达系统。也提供酵母表达系统，称作甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)的表达系统，其被设计于在甲基营养型酵母甲醇毕赤酵母中重组蛋白的高水平生产。本领域内技术人员知道怎样表达载体，比如表达构件体，来生产核酸序列或其同源的多肽、蛋白或肽。
预期治疗性基因可以是“过表达的”，即，以相对细胞中天然表达增加的水平表达。该过表达可用各种方法评估，包括放射性标记和/或蛋白纯化。然而，预期使用简单而直接的方法，例如，那些涉及SDS/PAGE和蛋白染色或蛋白印记，随后进行定量分析，比如所得到的凝胶或印记的光密度扫描。重组蛋白、多肽或肽水平相对于天然细胞中水平的特异性增长指示为过表达，即是特异的蛋白、多肽或肽相对于宿主细胞生产的其他蛋白的相对丰度，例如，在凝胶上可见。
在某些实施方式中，表达的蛋白质序列在宿主细胞内形成内涵体，裂解该宿主细胞，例如，通过细胞匀浆器破裂，冲洗和/或离心从可溶的细胞成分中分离浓密的内涵体和细胞膜。该离心可在合适的条件下进行，其中通过将糖(比如，蔗糖)合并到缓冲液中，浓密的内涵体被选择性地富集，并以选定的速度离心。内涵体可以溶解于含有高浓度(例如，8M)尿素或促溶剂(比如还原剂(比如，β-巯基乙醇、DTT(二硫苏糖醇))存在下的盐酸胍)的溶液中，然后再折叠为更期望的构象，这为本领域内普通的技术人员所知。
治疗性基因的核酸和蛋白序列已经在先前报道，并可见于为本领域内普通技术人员所知的电脑数据库。其中一个数据库是美国生物信息学中心的Genbank和GenPept数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/)。这些已知基因的编码区域可以被扩增和/或表达，通过用本文所公开的技术或本领域内那些普通技术人员所知的任何技术。另外，肽序列可以用本领域内那些普通技术人员所知的方法合成，比如使用自动的肽合成机器进行肽合成，比如可从Applied Biosystems(Foster City,CA)得到的机器。
【IV.联合瘤治疗】
根据本发明的某些方面，一个或更多治疗可被使用给患者以联合的益处。这些治疗包括辐射、化疗、手术、细胞因子、免疫治疗、生物治疗、毒素、药物、饮食、或基因疗法。例子如下文所述。
为了杀死癌细胞，减缓它们的生长或达到上述的任何临床终点，可以对癌细胞或瘤接触第一p53基因治疗并结合第二抗癌治疗。这两种形式可以对于杀死或抑制癌细胞的增生，或者达到理想的临床终点，包括增长的患者存活期来说有效组合量提供。该过程可涉及同时用两种形式接触癌细胞或瘤。这也可以通过用单独包括两种制剂的组合物或药物制剂接触癌细胞或瘤，或者通过用两种不同的组合物或制剂接触癌细胞或瘤，同时，其中一个组合物包括第一基因治疗，另一个包括第二治疗。
或者，所述第一p53基因治疗可先于或晚于第二治疗，二者间隔从几分钟到几周。在两种形式分别施用给癌细胞或瘤的实施方式中，通常保证明显的功效时间周期在每次递送时间之间不停止，如此以致二者都仍能对癌细胞或瘤发挥有利的组合效应。在某些例子中，预计用两种形式在彼此间隔约12～24小时内接触细胞，更具体的为在约6～12小时内，只有约12小时的延迟时间最为具体。但在某些情况下，期望显著延长治疗的时间周期，在各个施用之间有几天(2、3、4、5、6或7)到几周(1、2、3、4、5、6、7或8)时间。
可以想见各个形式多于一次的施用将是期望的。可以使用各种组合，其中第一基因治疗是“A”，第二治疗是“B”：
A/B/A B/A/B A/B/A A/A/B A/B/B B/A/A B/B/B/A B/A/B/B
B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A
B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B
【A.编码治疗性基因的治疗性核酸】
如上文所述，在本发明的各种实施方式中需要对患者提供治疗性基因，旨在治疗过度增生疾病。本申请中所述术语“基因治疗”可定义为递送治疗性基因或其他治疗性核酸给有需要的患者，用于治疗过度增生疾病或治疗这一症状，即如不治疗将导致过度增生疾病。包含在“治疗性基因”定义之内的是“生物功能等同”的治疗性基因。因此，和等同于或功能等同于治疗性基因氨基酸的氨基酸有约70％～约99％同源性的序列将是这些序列，其中这些序列是提供保持了蛋白的生物活性的生物功能等同物。治疗性基因的种类包括抑癌基因、细胞周期调节物、促凋亡基因、细胞因子、毒素、抗血管生成因子、抑制癌基因的分子、促血管生成因子、生长因子、反义转录物、核酶和RNAi。
治疗性基因的例子包括但不限于：Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶、mda7、fus、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、ADP、p53、ABLI、BLC1、BLC6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS2、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3、YES、MADH4、RB1、TP53、WT1、TNF、BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、ApoAI、ApoAIV、ApoE、Rap1A、胞嘧啶脱氨酶、Fab、ScFv、BRCA2、zac1、ATM、HIC-1、DPC-4、FHIT、PTEN、ING1、NOEY1、NOEY2、OVCA1、MADR2、53BP2、IRF-1、Rb、zac1、DBCCR-1、rks-3、COX-1、TFPI、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、VEGF、FGF、凝血酶敏感素、BAI-1、GDAIF或MCC。
治疗性基因的其他例子包括编码酶的基因。例子包括但不限于，ACP脱氢酶、ACP羟化酶、ADP-葡萄糖磷酸化酶、ATP酶、乙醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、环氧合酶、脱羧酶、糊精酶、酯酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、透明纸酸合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、GTP酶、解旋酶、半纤维素酶、透明质酸酶、整合酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂肪氧化酶、裂合酶、溶菌酶、果胶酯酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、果胶酶、蛋白酶、肽酶、支链淀粉酶、重组酶、逆转录酶、拓扑异构酶、木聚糖酶、报告基因、白介素或细胞因子。
另一些治疗性基因的例子包括编码以下酶的基因：氨甲酰合成酶I、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合成酶、精氨基琥珀酸裂合酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、低密度脂蛋白受体、胆色素原脱氨酶、因子VIII、因子IX、胱硫醚-β-合酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰辅酶A脱氢酶、丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、戊二酰辅酶A脱氢酶、胰岛素、β-葡萄糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H-蛋白、T-蛋白、门克斯病铜转运ATP酶、威尔森氏症铜转运ATP酶、胞嘧啶脱氨酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、半乳糖-1-磷酸盐尿苷酰转移酶、苯丙氨酸羟化酶、葡萄糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、α-L-艾杜糖苷、葡萄糖-6磷酸脱氢酶、HSV胸苷激酶或人类胸苷激酶。
治疗性基因也包括编码激素的基因。例子包括但不限于编码下列激素的基因：生长激素、催乳激素、胎盘催乳素、黄体激素、卵泡刺激素、绒毛膜促性腺激素、促甲状腺激素、瘦素、促肾上腺皮质激素、血管紧张素I、血管紧张素II、β-内啡肽、β-黑素细胞刺激素、胆囊收缩素、内皮素1、甘丙肽、抑胃肽、胰高血糖素、胰岛素、促脂解素、神经垂体素运载蛋白、生长抑素、降钙素、降钙素基因相关肽、β-降钙素基因相关肽、高钙血症恶性因子、甲状旁腺激素相关蛋白、甲状旁腺激素相关蛋白、胰高血糖素样肽、胰抑素、胰肽、肽YY、PHM、分泌素、血管活性肠肽、催产素、加压素、加压催产素、脑啡肽酰胺、metorphinamide、α-黑素细胞刺激素、心钠素、糊精、淀粉样蛋白P成分、促肾上腺皮质激素释放激素、生长激素释放因子、促黄体激素释放激素、神经肽Y、K物质、P物质、或促甲状腺激素释放激素。
治疗性基因的其他例子包括编码存在于过度增生疾病组织的抗原的基因，该抗原能用于引起对该组织的免疫应答。抗癌免疫治疗在本领域内众所周知，例如，更多的细节在PCT申请WO0333029,WO0208436,WO0231168和WO0285287，每个都通过引用整体特别并入本文。
还有其他治疗性基因是编码抑制分子的基因，比如反义核酸、核酶、siRNA和单链抗体。这些分子能被方便地用于抑制过度增生基因，比如，癌基因、细胞增生和促血管生成因子的诱导物。
【1.编码瘤抑制物的核酸】
“瘤抑制物”是指多肽，当其存在于细胞中，降低细胞的致瘤性、恶性、或过度增生表型。编码瘤抑制物基因氨基酸序列的核酸序列包括瘤抑制基因的全长核酸序列，和源于全长序列的任一长度的非全长序列。还应了解所述序列包括天然序列的简并密码子或在特异宿主细胞中被导入提供密码子优选的序列。
本文定义的“瘤抑制基因”通常指降低细胞的致瘤性、恶性、或过度增生表型的核酸序列。因此，瘤抑制物基因在别的健康细胞中正常表达的缺失、突变或扰乱增加了细胞变为瘤状态的可能性，或导致细胞变为瘤状态。相反，当有功能的瘤抑制基因或蛋白存在于细胞中，它的存在抑制了细胞的致瘤性、恶性、或过度增生表型。该定义内的瘤抑制核酸的例子包括但不限于，APC、CYLD、HIN-1、KRAS2b、p16、p19、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、PTEN、Rb、子宫珠蛋白、Skp2、BRCA-1、BRCA-2、CHK2、CDKN2A、DCC、DPC4、MADR2/JV18、FHIT、MEN1、MEN2、MTS1、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、CFTR、C-CAM、CTS-1、zac1、scFV、ras、MMAC1、FCC、MCC、基因26(CACNA2D2)、PL6、β*(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、基因21(NPRL2)或编码SEM A3多肽和FUS1的基因。其他例示瘤抑制基因报道于瘤抑制基因数据库(www.cise.ufl.edu/～yy1/HTML-TSGDB/Homepage.html)，通过引用并入本文。该数据库，本文通过引用特别并入到这里和本申请的所有其他章节。编码瘤抑制基因的核酸，如上所述，包括瘤抑制基因，或其核酸衍生物(例如，cDNAs、cRNAs、mRNAs，和其中编码各个瘤抑制物氨基酸序列活性片段的子序列)，和包含这些序列的载体。本领域内普通的技术人员熟悉能用于本发明的瘤抑制基因。
【2.编码单链抗体的核酸】
在本发明的某些实施方式中，本文所述药物组合物和装置的核酸编码单链抗体。单链抗体报道于美国专利4,946,778和5,888,773，每个都通过引用并入本文。
【3.编码细胞因子的核酸】
所述术语“细胞因子”是由一种细胞群释放的作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白的通称。“细胞因子氨基酸序列”是指多肽，当其存在于细胞中时，保持细胞因子的一些或全部功能。编码细胞因子氨基酸序列的核酸序列包括细胞因子的全长核酸序列和源于全长序列的任一长度的非全长序列。还应理解，如上所述，所诉序列包括天然序列的简并密码子或在特异宿主细胞中被倒入提供密码子优选的序列。
这些细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子、生长因子和传统的多肽激素。所述细胞因子包括生长激素，比如，人生长激素、N-蛋氨酰人类生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原；糖蛋白激素，比如卵泡刺激素(FSH)、甲状腺刺激激素(TSH)和促黄体生成素(LH)；肝细胞生长因子；前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、瘤坏死因子-α及-β；缪勒(氏)管抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽；抑制素、激活素、囊内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，比如NGF-β、血小板生长因子；转化生长因子(TGFs)，比如TGF-α和TGF-β；类岛素样生长因子-I和II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，比如干扰素-α、-β、-γ；集落刺激因子(CSF)，比如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，比如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-24(MDA-7)、LIF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、kit-配体或FLT-3。
【4.编码促凋亡基因/程序性细胞死亡调控物的核酸】
凋亡，或程序性细胞死亡，是正常胚胎发育，维持成体组织中稳态和抑制癌发生的必要过程(Kerr et al.,1972)。Bcl-2蛋白家族和ICE样蛋白酶已被证明是某些系统中重要的凋亡调节剂和效应物。发现Bcl-2蛋白与滤泡性淋巴瘤相关，在控制凋亡和促进细胞响应各种凋亡刺激而存活中有重要作用(Bakhshi et al.,1985；Cleary and Sklar,1985；Cleary et al.,1986；Tsujimoto et al.,1985；Tsujimoto and Croce,1986)。现在认为进化保守的Bcl-2蛋白是相关蛋白家族的一员，这些蛋白被划分为死亡激动剂或死亡拮抗剂。
随后的发现表明Bcl-2发挥抑制各种刺激引发的细胞死亡的作用。同样，现已知存在Bcl-2细胞死亡调控蛋白家族，这些蛋白有着共同的结构和序列同源性。已发现这些不同的家族成员或与Bcl-2具有相似功能(BclXL，BclW，BclS，Mcl-1，A1，Bfl-1)，或与Bcl-2功能相反而促进细胞死亡。后者称为促凋亡基因，编码诱导或维持凋亡至活化形式的蛋白。本发明预计任何促凋亡基因氨基酸序列的内含物为本领域内那些普通技术人员所知。例示促凋亡基因包括CD95、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、Bax、Bag-1、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak、MKP-7、PERP、bad、bcl-2、MST1、bbc3、Sax、BIK、BID和mda7。本领域内普通技术人员熟悉促凋亡基因和本文未特别列出的其他这些基因，这些基因能用于本发明的方法和组合物中。
编码促凋亡基因氨基酸序列的核酸包括促凋亡基因或它们的核酸衍生物(例如，cDNAs、cRNAs、mRNAs，和其中编码各促凋亡氨基酸序列活性片段的子序列)，和包含这些序列的载体。“促凋亡基因氨基酸序列”是指多肽，当其存在于细胞中时，诱导或促进凋亡。
【5.编码血管生成抑制剂的核酸】
血管生成抑制剂包括血管生成抑制因子和内皮抑素。血管生成抑制因子是约200氨基酸的多肽。它产生于纤溶酶原的断裂，所述纤溶酶原是溶解血栓的重要血浆蛋白质。血管生成抑制因子结合暴露于细胞表面嵌入在质膜中的ATP合酶的亚基。在最近发现之前，仅知ATP合酶为线粒体蛋白。内皮抑素是184个氨基酸的多肽。它是发现于XVIII型(Mulder etal.,1995)胶原蛋白的C端的球状结构域，所述XVIII型胶原蛋白是发现于血管上的胶原蛋白，从亲体分子的切下。
血管生成抑制剂也包括抑制剂或促血管生成因子，比如反义核酸、核酶、siRNAs和单链抗体，这些报道于本文的别处。上皮细胞在其表面表达跨膜蛋白，称为整合素，它们通过所述整合素把自己锚定在细胞外基质。结果是瘤上的新血管表达血管整合素，称为αv/β3，其没有发现于正常组织的旧血管中。直接针对所述αv/β3血管整合素的单克隆抗体，在小鼠中减小瘤而不伤害它们。在人类2期临床试验中，已在减小实体瘤而不引起有害副作用上表现出一些前景。
【6.编码细胞增生诱导物的核酸】
诱导细胞增生的蛋白还可据其功能分为各类。所有这些蛋白的通性是它们能调控细胞增生。例如，PDGF形式，sis癌基因，是分泌的生长因子。致癌基因很少是源于编码生长因子的基因，并且目前为止，sis是已知仅有的自然发生的致癌的生长因子。
蛋白质FMS、ErbA、ErbB和neu是生长因子受体。这些受体的突变引起调控功能的丧失。例如，影响Neu受体蛋白跨膜结构域的点突变产生neu致癌基因。erbA致癌基因源于甲状腺激素的细胞内受体。修饰的致癌的ErbA受体被认为其和内源性甲状腺激素受体竞争，引起生长失控。
最大一类致癌基因包括所述信号转导蛋白(例如，Src、Abl和Ras)。蛋白Src是细胞质蛋白酪氨酸激酶，在某些情况下它从原癌基因形式转化到致癌基因，源于酪氨酸残基527上突变。相反，在一例子中，GTP酶蛋白ras从原癌基因到致癌基因的转化，源于其序列第12氨基酸上缬氨酸到甘氨酸的突变，降低了ras GTP酶活性。
蛋白质Jun、Fos和Myc是在细胞核上直接发挥它们作为转录因子作用的蛋白质。
反义核酸方法利用核酸趋向和互补序列配对这一事实。说道互补，它意味着多核苷酸是那些能根据标准的Watson-Crick互补规则碱基配对的多核苷酸。即是，DNA中较大的嘌呤将和较小的嘧啶碱基配对来形成鸟嘌呤和胞嘧啶配对(G:C)，腺嘌呤和胸腺嘧啶配对(A:T)，或在RNA中为腺嘌呤和尿嘧啶配对(A:U)的组合。内含的稀有碱基，比如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤和其他杂交序列中不干扰配对的碱基。
具有多核苷酸的靶双链(ds)DNA引起三螺旋形成；靶向RNA将引起双螺旋形成。反义多核苷酸，当导入到靶细胞中，特异结合它们的靶多核苷酸并干扰其转录、RNA加工、转运、翻译和/或稳定性。反义RNA构建体或编码这些反义RNA的DNA在宿主细胞中可能被用于在体外或者在体内抑制基因的转录或翻译或二者都有，比如在宿主动物内，包括人受试者。在本发明的其他实施方式中，预计用于细胞增生特定诱导物的siRNAs、核酶和单链抗体治疗能被用于阻止细胞增生诱导物的表达，并因此对癌症患者提供临床益处。
【7.其他基于核酸的治疗】
反义构件体可被设计用于结合启动子和其他调控区域、外显子、内含子或甚至基因的外显子-内含子交界。预计最有效的反义构件体将包括外显子/内含子剪接点的互补区。因此，有人提议一个具体的实施方式包括具有外显子/内含子剪接点互补区内50～200碱基的反义构件体。已观测到一些外显子序列能被包含于没有严重影响其靶选择性的构件体。包含的外显子物质的量变化取决于具体使用的外显子和内含子序列。可以简单通过体外检测所述构件体来容易地检测是否包含过多外显子DNA，以确定正常的细胞功能是否被影响或具有互补序列的相关基因的表达是否被影响。
如上所述，“互补”或“反义”是指在其全长上有充分互补的多核苷酸序列，并且很少有碱基错配。例如，长为15个碱基的序列，当其在13或14个位置上有互补核苷酸时可以被称为互补的。自然，完全互补的序列是指序列在全长中完全互补并且没有碱基错配的序列。其他具有较低同源性的序列也是预期的。例如，可设计具有有限的高度同源的区域，但也含有非同源区域(例如，核酶，见下文)的反义构件体。这些分子，尽管只有低于50％的同源性，但仍能在合适的条件下结合靶序列。
结合部分基因组DNA和cDNA或合成序列来生成特异的构件体是有利的。例如，期望内含子存在与最终的构件体中，需要使用基因组的克隆。所述cDNA或合成的多核苷酸可提供更多方便的限制性内切酶酶切位点来保留所诉构件体部分，因此将用于其余序列。
在本发明的某些实施方式中，本文所述药物组合物和装置的核酸是核酶。尽管传统上蛋白已用于核酸的催化，但另一种大分子在该研究中已表现为有用。核酶是RNA-蛋白复合体，以位点特异的模式切割核酸。核酶有具有内切酶活性的特异的催化结构域(Kimand Cook,1987；Gerlach et al.,1987；Forster and Symons,1987)。例如，大量核酶加速具有高度特异性的磷酸酯转移反应，通常在寡核苷酸底物的几个磷酸酯中的仅一处断裂(Cook et al.,1981；Michel and Westhof,1990；Reinhold-Hurek and Shub,1992)。该特异性归因于需要在化学反应之前，底物通过特异的碱基配对相互作用结合核酶的内部指导序列(“IGS”)。
核酶催化最初被视为涉及核酸的序列特异切割/连接反应的一部分(Joyce,1989；Cook et al.,1981)。例如，美国专利5,354,855报道某些核酶能用作比已知核酸酶具有更高序列特异性的内切酶。并具有接近于DNA限制性内切酶的特异性。因此，序列特异的核酶介导的基因表达的抑制可特别适合于治疗应用(Scanlon et al.,1991；Sarver et al.,1990)。最近，报道了核酶在一些应用了所述核酶的细胞系中引发基因变化，所述改变的基因包括致癌基因H-ras、c-fos和HIV基因。大部分该研究涉及靶mRNA的修饰，基于由特异核酶断裂的特异突变的密码子。
在本发明的某些实施方式中，本文所述的药物组合物的治疗性核酸是RNAi。RNA干扰(也称为“RNA-介导的干扰”或RNAi)是降低或消除基因表达的机制。双链RNA(dsRNA)已被观测到能介导降低反应，这是多步骤进程。dsRNA激活转录后基因表达监控机制，该机制表面功能为保护细胞远离病毒感染并具有转座活性(Fire et al.,1998；Grishok et al.,2000；Ketting et al.,1999；Lin and Avery et al.,1999；Montgomery et al.,1998；Sharp and Zamore,2000；Tabara et al.,1999)。这些机制靶向用于破坏的成熟的活化，使dsRNA-互补的mRNA。RNAi为基因功能的研究提供主要的实验优势。这些优势包括非常高的特异性，易于移动穿过细胞膜，并靶基因的延长的下调(Fire et al.,1998；Grishok etal.,2000；Ketting et al.,1999；Lin and Avery et al.,1999；Montgomery et al.,1998；Sharp et al.,1999；Sharp and Zamore,2000；Tabara et al.,1999)。此外，dsRNA已被证明在广泛的系统范围中使基因沉默，包括植物、原生动物、真菌、线虫、锥虫、果蝇和哺乳动物(Grishok et al.,2000；Sharp et al.,1999；Sharp and Zamore,2000；Elbashiret al.,2001)。通常认为RNAi在转录后作用，靶向用于降解的RNA转录物。似乎细胞核和细胞质RNA都能被靶向(Bosher and Labouesse,2000)。
已知核糖核酸内切酶生成两类调控记忆表达的小的调控RNAs：小干扰RNAs(siRNAs)和微RNAs(miRNAs)(Bernstein et al.,2001；Grishok et al.,2001；Hutvgneret al.,2001；Ketting et al.,2001；Knight and Bass,2001)。在动物中，siRNAs直接靶向mRNA的断裂(Elbashir et al.,2001)，而miRNAs阻断mRNA的翻译(Lee et al.,1993；Reinhart et al.,2000；Brennecke et al.,2003；Xu et al.,2003)。最近资料提示，将siRNAs和miRNAs并入到类似或甚至等同的蛋白复合体中，mRNA破坏对翻译调控的关键决定因素是小RNA和其靶mRNA的序列互补程度(Hutvgner and Zamore,2002；Mourelatos etal.,2002；Zeng et al.,2002；Doench et al.,2003；Saxena et al.,2003；Zeng et al.,2003)。许多已知的miRNA序列和它们在基因组或染色体中的位置见于www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/help/summary.shtml。
siRNAs必须被这样设计以使它们在抑制目的基因的表达中是特异的和有效的。选择靶序列(即，那些存在于一个或多个所述目的基因中的序列，其中siRNAs指导降解机理)的方法旨在避免可能干扰siRNAs指导功能的序列，尽管其包含特异于一个或多个基因的序列。通常，长度约21～23个核苷酸的siRNA靶序列是最有效的。该长度反映了源于上述更长的RNAs加工的消化产物的长度(Montgomery et al.,1998)。
siRNAs的制备主要通过化学直接合成；通过较长的双链RNAs暴露于果蝇胚胎裂解物的加工；或通过源于S2细胞的体外系统。细胞裂解或体外加工的使用还可涉及随后从裂解物等分离短的、21～23个核苷酸siRNAs，使该加工有些累赘和昂贵。通过制备两条单链RNA-寡聚物，随后将两条单链寡聚物退火形成双链RNA来进行化学合成。化学合成的方法多种多样。非限制性例子报道于美国专利5,889,136、4,415,723和4,458,066(通过引用特别并入本文)和Wincott等人(1995)。
另外几个siRNA序列的修饰已被建议使用，用于改变它们的稳定性或提高它们的效力。据推测，具有双核苷酸突出的合成的互补的21聚体RNAs(例如，19个互补核苷酸+3'非互补的二聚体)可以提供最大水平的抑制。这些方法主要使用两个(2'脱氧的)胸苷核苷酸作为双核苷酸突出部分的序列。这些双核苷酸突出部分通常写作dTdT以区分于通常位于RNA内部的核苷酸。文献已经表明dT突出的使用主要出于降低化学合成RNAs费用的需要而激发。据推测dTdT突出可能比UU突出更稳定，尽管可用的数据表明和具有UU突出的siRNA相比，dTdT突出的稳定性只有轻微(<20％)的提高。
WO 99/32619和WO 01/68836表明siRNA中使用的RNA可被化学或酶法合成。这些文献都通过引用整体并入本文。这些文献中预期的酶法合成是用细胞的RNA聚合酶或噬菌体RNA聚合酶(例如，T3、T7、SP6)，经过表达构件体的使用和生产，这为本领域内所知。例如，见于美国专利5,795,715。预期的构件体提供生成RNAs的模板，该RNA含有等同于部分靶基因的核苷酸序列。这些参考文献中提供的等同序列的长度至少25个碱基，并且长度可以达到400或更多个碱基。该参考文献的重要方面是作者预计消化较长的dsRNAs为21～25聚体长度，伴随有能体内转化dsRNAs到siRNAs的内源性核酸酶复合体。他们并没有报道或提出有体外合成和使用转录的21～25聚体dsRNAs的数据。化学或酶法合成的dsRNAs在RNA干扰使用中预期的特性没有区别。
同样，WO 00/44914，通过引用并入本文，表明单链RNA能用酶法或部分/全部有机合成来制备。单链RNA具体从DNA模板的PCR产物中用酶法合成，克隆的cDNA模板和RNA产物具体是cDNA的完全转录物，其可包含数百个核苷酸。WO 01/36646，通过引用并入本文，对siRNA合成的方式没有做出限制，提出RNA可在体内或体外合成，用手工和/或自动的程序。该文献也提出体外合成可以是化学的或酶学的，例如用克隆的RNA聚合酶(例如，T3、T7、SP6)用于内源性DNA(或cDNA)模板的转录，或二者混合物的转录。同样，化学或酶法合成的siRNA在RNA干扰使用中预期的特性没有区别。
美国专利5,795,715报道了两个互补DNA序列链在单个反义混合物中同时转录，其中所述两个转录物立即杂交。使用的模板具体在40和100个碱基对之间，并且在每一端都装备有启动子序列。所述模板具体附着于固体表面。用RNA聚合酶转录后，所产生的dsRNA片段可用于检测和/或分析核酸靶序列。
美国专利申请20050203047报道了通过RNA干扰调控基因表达的方法，其把siRNA或miRNA序列并入到编码序列的转移RNA(tRNA)。所述包含siRNA或miRNA序列的tRNA可被并入到核酸表达构件体以使该序列从表达的tRNA剪接。所述siRNA或miRNA序列可被放置在和未加工的tRNA转录物相关的内含子内，或被放置在所述tRNA转录物的任一端。
核酸可用本领域内普通技术人员所知的任一技术制备，比如，化学合成法、酶法生产或生物生产。合成的核酸(例如，合成的寡核苷酸)的非限制性例子包括体外化学合成的核酸，化学合成使用磷酸三酯、亚磷酸盐、亚磷酰胺化学物质和固相技术(比如报道于EP266 032，通过引用并入本文)，或通过脱氧核苷H-膦酸酯中间物，报道于Froehler等人(1986)和美国专利5,705,629，每个都通过引用并入本文。寡核苷酸合成的各种机制可被使用，这些方法报道于美国专利4,659,774；4,816,571；5,141,813；5,264,566；4,959,463；5,428,148；5,554,744；5,574,146；5,602,244，每个都通过引用并入本文。
酶学制备核酸的非限制性例子包括用酶在诸如PCRTM等(例如参见美国专利4,683,202和4,682,195，每个都通过引用并入本文)扩增反应中制备的核酸，或者报道于美国专利5,645,897(每个都通过引用并入本文)的寡核苷酸的合成。生物制备核酸的非限制性例子包括在活细胞中制备(例如，复制)的重组核酸，比如在细菌中复制的重组DNA载体(例如参见Sambrook et al.2001，通过引用并入本文)。
【B.其他治疗】
【1.手术】
约60％癌症患者将经历某种类型的手术，包括预防、诊断或分期、治疗性和姑息性手术。治疗性手术是可和其他治疗联用的癌症治疗，其他治疗比如本发明的治疗、化疗、放疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或替代疗法。
治疗性手术包括切除术，其中全部或部分癌组织被机械去除、切离和/或破坏。瘤切除术涉及至少肉体上去除部分瘤。除了瘤切除术，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电手术、和显微控制手术(莫氏手术)。还预计本发明可联同表皮癌，初癌或正常组织附带物切除使用。
先于手术或者部分或全部癌细胞、组织、或瘤的部分切除后的瘤内注射可在身体上形成腔洞。治疗的实施可通过灌注，直接注射或这些部位局部施用以额外的抗癌治疗。这些治疗可以是重复的，例如，每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可以是剂量变化的。
【2.化学治疗】
根据本发明可使用很多化学治疗剂。所述术语“化学治疗”是指治疗癌症药物的使用。“化学治疗剂”用于表示在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些制剂或药物根据它们在细胞内的活化模式被分类，例如，它们是否和在某一阶段影响细胞周期。或者，制剂可根据其能直接交联DNA，嵌入到DNA，或通过影响核酸合成引起染色体和有丝分裂畸变来表征。大部分化学治疗剂分数为下列门类：烷化剂、抗代谢药物、抗瘤抗生素、有丝分裂抑制剂和亚硝基脲。
【a.烷化剂】
烷化剂是直接和基因组DNA相互作用以阻止癌细胞增生的药物。这类化学治疗药物代表影响细胞周期所有阶段的药物，就是说，它们不是阶段特异性的。烷化剂能被用于治疗慢性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤，及特别是乳腺癌、肺癌和卵巢癌。它们包括：白消安、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺(环磷酰胺)、达卡巴嗪、异环磷酰胺、氮芥(氮芥)和美法仑。曲格列酮可结合任何一个或多个这些烷化剂用于治疗癌症，其中一些如下文所述。
【b.抗代谢药物】
抗代谢药物扰乱DNA和RNA的合成。不同于烷化剂，它们特异性影响细胞周期的S期。它们已用于治疗慢性白血病，还有乳腺癌、卵巢癌和胃肠道癌。抗代谢药物包括5氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C方案)、氟达拉滨、吉西他滨、和甲氨蝶呤。
5氟尿嘧啶(5-FU)的化学名称为5-氟-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮。它的作用机制被认为是通过阻断脱氧尿苷酸到胸苷酸的甲基化反应。因此，5-FU干扰脱氧核糖核酸(DNA)的合成，并较少程度地抑制核糖核酸(RNA)的形成。由于DNA和RNA为细胞分裂和增生所必需，认为5-FU的作用能引起胸甘缺陷导致细胞死亡。因此，5-FU的作用被用于迅速分裂的细胞，而迅速分裂是转移的癌的特征。
【c.抗瘤抗生素】
抗瘤抗生素兼有抗微生物活性和细胞毒性。这些药物还通过化学性抑制酶来干扰DNA和有丝分裂或改变细胞膜。这些制剂不是阶段特异的，因此它们能在细胞周期的所有阶段发挥作用。因此，它们广泛地用于各种癌症。抗瘤抗生素的例子包括博莱霉素、更生霉素、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、和伊达比星，其中一些更是在下文详细讨论。临床上广泛使用于瘤治疗的这些化合物被用静脉团注法施用，以25～75mg/m2剂量、间隔期21天施用阿霉素，以35～100mg/m2的剂量静脉注射或口服依托泊苷。
【d.有丝分裂抑制剂】
有丝分裂抑制剂植物类碱和其他抑制细胞分裂或有丝分裂所需的蛋白合成的天然制剂。它们在细胞周期的特定阶段起作用。有丝分裂抑制剂包括多西紫杉醇、依托泊苷(VP16)、紫杉醇、泰索、泰索帝、长春碱、长春新碱和长春瑞滨。
【e.亚硝基脲】
亚硝基脲，类似于烷化剂，抑制DNA修复蛋白。它们用于治疗非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、恶性黑色素瘤，还有脑瘤。例子包括卡莫司汀和洛莫司汀。
【f.其他制剂】
可被使用的其他制剂包括贝伐单抗(商品名：阿瓦斯丁)、吉非替尼(易瑞沙)、曲妥单抗(赫赛汀)、西妥昔单抗(爱必妥)、panitumumab硼替佐米和格列卫。此外，生长因子抑制剂和小分子激酶抑制剂也有用于本发明。所有治疗报道于：瘤学原理与实践(7th Ed.，2004)和临床瘤学((3rd Ed.,2004)通过引用并入本文。同样，下列附加的治疗也被包含。
通常，免疫治疗依靠免疫效应细胞和分子对靶位作用并破坏癌细胞。例如，所述免疫效应物可以是特异于某些瘤细胞表面标记物的抗体。所述抗体可单独作用为治疗的效应物或者它可结合其他细胞来实际产生细胞杀伤。抗体也可以和药物或毒物(化疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并仅严格作用于为靶向制剂。或者，效应物可以是携带直接或间接和靶瘤细胞相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞。
因此，免疫治疗可被用作联合治疗的一部分，结合p53基因治疗。联合治疗的一般方法如下文所述。通常，瘤细胞一定有一些可用于靶向(即是，不存在于大部分其他细胞)的标记物。存在许多瘤标记物并且任何这些标记物可适用于本发明情况中的靶向。普遍的瘤标记物包括癌胚抗原、前列腺特异抗原、尿瘤相关抗原、胎儿抗原、酪氨酸酶(P97)、gp68、TAG-72、HMFG、Sialyl Lewis抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erb B和p155。此外，p53本身可以是免疫治疗靶位。参见美国公开2005/0171045，通过引用并入本文。
瘤坏死因子是糖蛋白，能杀死某些种类癌细胞，激活细胞因子产生，激活巨噬细胞和囊内皮细胞，促进胶原蛋白和胶原酶产生，是炎症介质，也是感染性休克的调节剂，并且促进代谢、发烧和睡眠。一些感染性制剂通过刺激TNF生成而引起瘤退化。当单独以有效剂量使用时，TNF可以是相当毒的，因此最优的治疗方案可能将结合其他药物低剂量使用TNF。它的免疫抑制作用通过γ-干扰素得到加强，因此这一联用是潜在危险的。TNF和干扰素-α的结合使用被发现具有抗癌活性。
根据本文报道的方法性激素可用于治疗癌症。尽管本文报道的方法并不限于特定的癌症治疗，但激素的使用对乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌(子宫内层)有益。这些激素的例子是雌激素、抗雌激素、孕酮、和雄激素。
皮质类固醇激素用于某些类型癌症(淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤)的治疗。皮质类固醇激素能增加其他化学治疗剂的功效，因此，它们经常用于联合治疗。泼尼松和地塞米松是皮质类固醇激素的例子。
【3.放射疗法】
放射疗法，也称作放射治疗，是用电离辐射治疗癌症和其他疾病。电离辐射积存的能量伤害或破坏局部被治疗的细胞，通过损坏它们的遗传物质，使这些细胞不可能继续生长。尽管辐射伤害癌细胞和正常细胞，但后者能适当地修复自身和功能。放射疗法可用于治疗局部实体瘤，比如皮肤癌、舌癌、喉癌、脑癌、乳腺癌、或子宫颈癌。它也能用于治疗白血病和淋巴瘤(分别是血液形成细胞和淋巴系统的癌症)。
根据本发明使用的放射治疗包括但不限于使用γ-射线、X-射线和/或直接递送放射性同位素给瘤细胞。DNA损伤因素的其他形式预期有，比如微波和UV-辐射。所有这些因素最可能对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复、染色体的装配和维持有广泛地损伤。X-射线的剂量范围为延长的时间周期(3～4周)内每日50～200伦琴，单独剂量是2000～6000伦琴。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、辐射释放的强度和类型和瘤细胞的摄入。
放射疗法包括使用放射性标记的抗体递送放射性剂量直接到癌位点(放射免疫治疗)。抗体是高度特异的蛋白，这些蛋白源于体内对存在抗原(被免疫系统认作外物的物质)的反应。一些瘤细胞包含引发特定瘤抗体产生的特定抗原。大批这些抗体能被在实验室中制备并且附着放射性物质(该过程称为放射标记)。一旦注入到体内，所述抗体活化结合癌细胞，该细胞被辐射的细胞杀伤(细胞毒素)作用破坏。该方法可使辐射对健康细胞损伤的危险最小化。
立体顺式放射治疗使用同一放射治疗机制，直线加速器，作为正常的放射治疗但金属块被放在X-射线光束的路径上来改变它的形状以和所述癌症匹配。这确保较高的辐射剂量被施用给瘤。周围健康的细胞和附近的结构接收较低的辐射剂量，因此副作用的可能性被降低。称为多叶式准直仪的设备被研发并被用作代替金属块。所述多叶式准直仪含有许多固定于直线加速器的金属板。每一层能被调整以使放射光束能适合于金属块不需要的治疗领域。放射治疗仪的精确位置对立体顺式放射治疗非常重要，并且在每次治疗之前，特定扫描仪被用于检测患者内脏器官的位置。
高分辨率的强度调节放射治疗也使用多叶式准直仪。在该治疗中，当治疗被实施，多叶式准直仪图层被移动。该方法有可能达到更加准确的治疗光束的形状，并允许放射治疗的剂量在整个治疗中是恒定的。
尽管调查研究已经表明立体顺式放射治疗和强度调节放射治疗可以降低放射治疗的副作用，有可能如此精确地改变治疗区域可以终止微观的癌细胞，仅治疗区域是被破坏的。这意味着在这些专门的放射治疗中，未来癌症复发的风险较高。立体定向放射治疗用于治疗脑瘤。该技术从不同的角度直接施用放射治疗以使给瘤的剂量非常高而影响周围健康组织的剂量非常低。治疗前，用电脑进行几个扫描分析以确保放射治疗是精确靶向的，并且当接受放射治疗时，患者的头用特制的框保持不动。几个剂量可被考虑。
用于脑部和其他瘤的立体放射-手术(伽玛刀)不使用刀，而从数百个不同角度使用非常精确靶向的伽玛放射治疗光束。只是一次放射治疗需要花费约4～5个小时。这个治疗中将有特制的金属框附着在患者头上。然后几个扫描和X-射线可被启动找到需要治疗的精确的区域。在脑瘤的放射治疗期间，患者在他们的头上戴大头盔。该头盔上有数百个洞以允许放射治疗光束穿过。相关方法允许用于在身体其他部位瘤的治疗。
科学家也正在寻找增加放射治疗功效的方法。两种调查的药物类型正在被研究它们对射线处理的细胞的影响。放射致敏剂使瘤细胞更易受到伤害，而辐射防护药品保护正常的组织免受辐射的影响。过热，加热的使用，也正在研究其在对辐射敏感的组织中的功效。
【V.实施例】
下述实施例包括进一步列举本发明的各个方面。本领域内那些技术人员应明晰所述实施例中公开的遵从代表技术的技术和/或本发明人公开的组合物，在本发明的实践中运行良好，因此能被考虑组成为其实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域内那些技术人员应知道，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可在公开的具体的实施方式中做出许多改变，仍取得相同或类似的结果。
【实施例1.治疗有优于标准治疗获得的总体存活期】
有局部区域复发的SCCHN患者常常经历大量瘤相关的病症。在该患者类群中，控制局部进程和保护功能的改善治疗的需要不可被过度强调。在先前放射治疗已失效并认为不能手术切除的患者中，化疗被认为是标准的治疗方法。复发瘤治疗的主要目标是缓解症状。
几个化学治疗和靶向分子的单一治疗方案已被用于复发的SCCHN的标准护理中，和相比的结果总结于下表。和标准治疗的总中位值存活期相似(约5～6个月)，超过历史上没有治疗的中位值存活期(约3～4个月)(美国Product Label,美国Product Label,2007)。
表1:SCCHN中(ITT群)单一治疗研究的中位值存活期
重要的是，-治疗的患者的8.5个月的中位值存活期优于传统治疗的总体存活期(约5～6个月)，所述-治疗的患者具有指示功效的p53生物标记物表达谱。然而，生物标记物表达谱期望用来预示功效而不能预示甲氨喋呤功效。此外，和通常化合物瘤病症的标准治疗相比，有更高的安全性特征。这些治疗的重要优势被分类并详细报道于下面章节。
【实施例2.比标准治疗有更高的安全性特征】
所述安全性数据汇编自超过400个患者的数千个施用例，证明是非常良好容许的抗癌治疗，并且大部分不利事件是局部性质的、自我限制的和/或遵从支持疗法治疗。该副作用特性不同于全身化疗和单克隆抗体治疗的副作用，化疗和单克隆抗体治疗的不利事件通常是剂量限制的，并且能潜在地发展成更加威胁生命的后遗症，而不是治疗中观测到的局部的、通常自我限制的事件。被证明在男性和女性中都是安全的，并且跨越剂量的广泛年龄范围。在不利事件表达谱中，临床上没有观测到显著的性别或年龄差异。
相关的严重不利事件率非常低。对施以的SCCHN患者而言，最频繁报道的不利事件是发烧(全体SCCHN患者的2.9％)。对于处于III期SCCHN研究治疗的患者，相关的严重不利事件包括呼吸困难(6.6％)和发烧(4.9％)。对SCCHN患者而言，最频繁报道的3或4级事件(不管因果关系)是注射位点疼痛和一般疼痛。在III期研究中，3或4级事件通常涉及注射的局部施用(注射位点疼痛)，并且这些事件通常是自我限制的和/或遵从在注射前预防性局部麻醉剂渗透到所述位点，和使用非甾体的抗炎药和不需处方可以出售的止痛药物。在治疗患者上3或4级实验室变化发生率也低。在所有SCCHN研究中共49(18.9％)个经治疗患者被报道从基线的3或4级的实验室变化。
在同一研究中，更多甲氨喋呤的患者报道有3或4级事件，均和全身性甲氨喋呤施用有关(口炎、肺炎、白细胞减少)。甲氨喋呤治疗相关的全身性不利事件可能引起潜在的威胁生命的后遗症，和治疗中观测到的局部的，通常自我限制的事件相比，是潜在更加危险的。此外，不出所料，在处于III期SCCHN研究治疗的甲氨喋呤患者中，观测到较高的3或4级实验室事件发生率(39.5％)，而同一研究中治疗的患者发生率只有(19.2％)。这些事件包括白细胞减少(甲氨蝶呤患者的12.1％)、中性粒细胞减少(12.1％)和淋巴细胞减小(25.6％)。对处于III期研究的甲氨蝶呤患者而言，观测到相对于其有较高的口炎、恶心、肺炎、感觉异常、白细胞减少和粒细胞减少发生率。甲氨喋呤治疗具有复杂的瘤病症，包括引起这些患者营养摄入不良和严重的体重减轻，和处于III期SCCHN研究治疗的患者相比，观测到在甲氨喋呤患者中，和该治疗相关的口炎和恶心的发生率较高。
重要的是，已知全身性不利事件和实验室异常和甲氨喋呤治疗的使用相关，和治疗中观测到的局部的，通常自我限制的事件相比，是潜在更加危险的，并有威胁生命的后遗症。就这一点而言，没有患者死于治疗，然而，III期复发的SCCHN研究中，一人死于白细胞减少症，归因于甲氨喋呤。此外，该研究中施以甲氨喋呤arm的患者被允许因为毒性而减少剂量，对于甲氨喋呤患者，这可能阻止个体中严重不利事件的较高发生率。
当伴随用于“其他”瘤类型的治疗时，这些瘤包括局部晚期乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌(CRC)、或晚期非小细胞肺癌(NSCLC)，施用的IT不加剧普通施用的化学治疗剂(多西紫杉醇、阿霉素或顺铂)或放射治疗的毒性。为接受放射或化疗同时施以的患者提供的安全性数据证明，结合这些治疗方式具有可接受的安全性。重要的是，当这些常用的制剂与联用时，没有观测到它们毒性的增加。
因此，所述非常有利的临床安全性指示是高度安全的，并且当以2×1012病毒颗粒剂量施用给患有复发或难治的SCCHN的患者时，是良好容许的治疗。不利事件通常是自我限制的，和/或遵从预防性局部麻醉剂处理的，以及使用非甾体的抗炎药和不需处方可以出售的止痛药物。该良好容许的安全性特征与已知的和传统的复发的SCCHN全身治疗相关的全身的不利事件形成对比，这些全身治疗比治疗中观测到的局部的，通常自身限制的事件，能潜在地发展成更加威胁生命的后遗症，。
【实施例3.在对标准治疗耐受的复发的SCCHN患者中，反应者有统计学上显著增长的存活期】
【瘤生长控制反应和治疗后统计学上显著增长的存活期相关】
和Lara等人(2008)的发现一致，在T301和T201 ITT群的关键实验中，在对其他治疗耐受的复发的SCCHN患者中，相较于没有瘤生长控制(CR+PR+SD)反应的患者，治疗使具有该反应的患者的存活期有非常显著的增加。
在3期关键实验T301中，和没有TGC反应的患者相比，具有该反应的患者的存活期有统计学上显著增加(中位值存活期TGC反应患者为7.6个月，相对于没有该反应的患者2.9个月，p＝0.0002)。这些结果显示于图5的Kaplan-Meier分析中。
类似结果也在关键实验T201中观测到，并且和没有TGC反应的患者相比，具有该反应的患者的存活期有统计学上显著增加(中位值存活期TGC反应患者为6.7个月，相对于没有该反应的患者3.6个月，p＝0.0269)。这些结果显示于图6的Kaplan-Meier分析中。
结合T301和T201关键临床试验ITT患者群(该群包含175名经治疗的患者)的类似结果揭示了，和没有TGC反应的患者相比，具有该反应的患者的存活期有统计学上极显著增加(TGC反应患者的中位值存活期为7.0个月，相对于没有该反应的患者3.0个月，p<0.0001)。这些结果显示于图7的Kaplan-Meier分析中。
表2总结了这些分析的结果，并提供相应的在关键的3期T301研究中患者用甲氨喋呤治疗的数据。甲氨喋呤治疗的患者也表现有TGC反应患者的中位值存活期的增加(7.5个月)，而无反应患者为3.8个月，但通过对数秩分析，没有显著差异(p＝0.1560)。这些数据清晰地表明具有TGC反应的患者在治疗后有统计学上显著的存活期益处。这一重要的功效结果在治疗的两个独立的随机对照试验中被证明有高统计学显著性，该治疗用于晚期具有有限替代疗法选择的复发的SCCHN患者。
表2.治疗的复发的SCCHN-ITT群中瘤生长控制和存活期的相关性
增加的存活期和由Choi标准(2007)定义的瘤反应(瘤尺寸减小≥10％)的相关性分析也证明了在结合T301和T201关键临床试验ITT患者群(该群包含175名经治疗的患者)中，和没有反应的患者相比，具有该反应的患者的存活期有统计学上极显著增加(瘤减小≥10％患者的中位值存活期为11.2个月，相对于无反应者5.1个月，p＝0.0010)。这些结果显示于图8的Kaplan-Meier分析中。
瘤反应的传统定义(瘤大小减小≥50％)也证明了在结合T301和T201关键临床试验ITT(N＝175)治疗的患者中，和没有反应的患者相比，具有该反应的患者的存活期有统计学上极显著增加。瘤减小>50％反应者的中位值存活期为41.0个月，相对于无反应者5.8个月(p＝0.0049)(图9)。
如表3所示，由瘤减小>10％和>50％定义的瘤反应之间的类似相关性也在用甲氨喋呤治疗的ITT群中观测到。在治疗的群和甲氨喋呤治疗的群中，具有TGC反应的患者的百分比是类似的(甲氨喋呤＝53.3％)。正如它们已知的作用机制所期望的，群中有较高比例的TGC反应者具有细胞周期停滞/衰老反应，而甲氨喋呤群中伴随瘤大小的减小，具有较高比例的凋亡反应。有趣的是，伴随瘤凋亡反应导致瘤大小减小≥50％的治疗的患者有非凡的中位值存活期，达到41个月，而伴随类似瘤大小减小反应的甲氨喋呤治疗的患者的中位值存活期为14.4个月。
表3.在复发的SCCHN-ITT群中瘤反应和存活期的相关性
总之，这些数据提供和甲氨喋呤对复发的SCCHN患者有效的确实证据。由各种标准定义的两种制剂的瘤反应清晰地证明和无反应者相比，反应患者有统计学上显著增加的存活期。复发的SCCHN患者不会出现自然康复，因而这些群中观测到的瘤大小的减小归因于这些治疗制剂。和Lara等人(2007)和Choi等人(2007)报道的重要的原理一致，和传统的瘤大小减小≥50％的标准相比，由瘤生长控制或瘤大小减小≥10％定义的两种制剂的瘤反应是更敏感的存活期增加的预报因素。
重要的是要认识到，关于未满足SCCHN复发患者的医疗需求，鉴定具有功效的附加制剂是关键的，伴随现存疗法的治疗失败几乎是普遍。这些制剂中相对功效的比较是第二个问题，该问题可能影响这些制剂施用的顺序。用于治疗中制剂选择的另一个重要因素是潜在的毒性，并且已清晰地证明的安全性比传统的治疗有优势。在选择大部分用于SCCHN复发患者的合适的治疗中，另一个决定因素是可能预示所用治疗的治疗功效的生物标记物。如下所述，p53生物标记物表达谱能预示功效，并指示受益于和甲氨喋呤的患者有不同的分子特征。这些发现在指导对单个患者进行和甲氨喋呤治疗有重要意义。
【实施例4.基于作用机制的生物标记物预示功效并鉴别最可能受益于治疗的伴随增加的瘤反应和存活期的患者，但不能预示其他治疗的功效】
FDA的关键路径计划和美国卫生及公共服务部瘤学生物标记质量创新部门已经鼓励鉴别新的预示治疗功效的临床和分子生物标记物，来指导新疗法最合适的应用并促进药物审批。这些创新的寻求已经引起在复发的头颈部鳞状细胞癌中鉴定p53生物标记物表达谱预示的功效，报道于本报告中。
预示功效的生物标记物表达谱基于通过序列分析评估p53基因构型和用免疫组织化学测定其蛋白水平的表达。这些p53生物标记物评估首先报道于在SCCHN患者中1期临床试验INT-002的结果，由Clayman等人(1998)实施并报道，并且随后被并入到关键临床试验方法和统计分析计划中。预示功效的p53表达谱与已知的下文所述的瘤p53失活和作用机制一致。
图9表示瘤p53失活的两个主要机制和与这些不同p53异常类型相关的p53基因测序和免疫组织化学特性。基因突变导致的p53失活和突变的p53基因序列相关，该突变的p53基因序列产生异常的p53蛋白，可以高水平或低水平表达，如通过免疫组织化学测定(图10，左图)。或者，当所述p53抑制物mdm-2或mdm-4上调引起的p53失活(图10，右图)，所述p53基因序列是野生型的，并且正常的p53蛋白可以高水平或低水平表达，如通过免疫组织化学测定。
【对功效有利的p53生物标记物表达谱】
在具有野生型p53基因序列的瘤中，p53通常由于p53抑制物mdm-2和/或mdm-4上调而失活(Valentin-Vega et al.,2007)。这些发现已经被证实于SCCHN复发患者的关键试验中，93％(27/29评估的患者)的患者具有野生型p53基因序列，也具有mdm-2和/或mdm-4的上调。具有野生型p53基因序列的p53生物标记物表达谱被Clayman等人(1998)发现是对功效有利的。如图11所示，结合由递送的正常p53和瘤产生的内源性野生型p53足以克服mdm-2/mdm-4的抑制。
瘤p53失活的另一个主要机制是通过p53基因突变引起p53功能丧失。如图12所示，绝大部分p53突变(>80％)发生在p53分子的DNA结合结构域。
有功能的p53是一四聚物，需要4个正常的p53分子结合，它们通过它们的四聚化区域相结合。所述四聚物正常结合DNA并随后调控其他负责瘤抑制的基因的表达。如下文图13所示，在DNA结合结构域具有突变的p53没有功能，由于这些四聚物不能结合DNA。
具有突变的p53序列和低水平p53蛋白表达(通过免疫组织化学测定，≤50％阳性瘤细胞)的p53生物标记物表达谱被发现是对功效有利的。如下文图14所示，当瘤具有低水平表达的突变的p53时，能提供足量正常的p53来形成有功能的四聚物并恢复p53瘤抑制。
【对功效不利的p53生物标记物表达谱】
相反，具有突变的p53序列和高水平p53蛋白表达(通过免疫组织化学测定，>50％阳性瘤细胞)的p53生物标记物表达谱对是功效不利的。这一观察符合这些具有p53蛋白高水平表达的显性抑制效应的生物标记物表达谱，这些p53蛋白具有DNA结合结构域突变，已知其能抑制递送的正常p53。如图15所示，在DNA结合结构域具有突变的p53能通过形成无功能的异四聚物来抑制正常的p53，该四聚物是正常的p53分子和突变的p53分子的混合物。这是在DNA结合结构域有p53突变的显性抑制效应的基础，当它们以高水平表达时(通过免疫组织化学测定，>50％阳性瘤细胞)。
因此，递送的正常p53在瘤中被在DNA结合结构域突变的p53蛋白的高水平表达所抑制。这些“显性抑制的”p53生物标记物表达谱的特征为在DNA结合结构域有p53序列突变，并通过免疫组织化学测定有高水平的p53蛋白，这被期望是对功效不利的。
总之，野生型p53基因构型的存在和显性抑制的p53突变蛋白高水平表达的缺失被期望是有效的预示。这些有利和不利的p53生物标记物表达谱符合已知的上文所述的作用和瘤p53失活的机制。表4概括了对功效有利和不利的p53生物标记物表达谱的特征，通过结合p53测序和免疫组织化学评估测定。相关p53蛋白的特性和功效与p53失活的机制也被列出。
表4.p53生物标记物表达谱对功效的有利和不利特征
的作用机制是旨在恢复p53功能，并且预示功效的p53生物标记物表达谱被表示在关键试验数据分析中鉴定具有瘤反应和存活期增加的患者。预示功效的生物标记物表达谱基于通过序列分析对p53基因构型评估和通过免疫组织化学测定其蛋白表达水平。野生型p53基因构型的存在和显性抑制效应的p53突变蛋白高水平表达的缺失预示功效。图16表明这些基于p53序列和免疫组织化学评估的有利和不利的p53表达谱。
约75％SCCHN复发患者具有对功效有利的p53生物标记物表达谱，而25％的患者具有不利表达谱。如上文所述，在用治疗的患者中，瘤反应和增加的存活期有统计上显著相关性。根据已知的瘤p53失活和上述的功效的机制，本发明人期望具有有利的p53生物标记物表达谱的患者，相较于具有不利的p53表达谱的患者，他们中TGC反应和增加的中位值存活期具有统计显著的相关性。这些是精确的结果，该结果被发现具有高的统计显著性，如下文所述。
重要的是，这些p53生物标记物表达谱不能预测随后的甲氨喋呤治疗的结果，这指示它们不是任一治疗形式的预后标记物。此外，受益于和甲氨喋呤的患者的分子特征被发现是不同的，互补的，这对指导用这些制剂治疗SCCHN复发患者有重要意义。
【SCCHN复发患者中功效的p53生物标记物表达谱预示瘤生长控制】
如表5所示，对功效有利的p53表达谱和治疗后的TGC反应有高度统计学显著相关性。具有对功效有利的p53表达谱的治疗的患者中，有非常高比例的患者有TGC反应(79％)，而具有对功效不利表达谱的患者中只有25％有TGC反应(p＝0.004Fisher’s精确检定)。
表5.复发的SCCHN癌症中功效p53生物标记物表达谱预示瘤生长控制
对和甲氨喋呤治疗的TGC反应中p53突变状态的比较揭示了它们分子特征的差异，该分子特征指示了SCCHN复发患者的不同群中的有利效应。如表6所示，甲氨喋呤TGC反应和突变的p53相关，而相反的情况出现于反应者，后者倾向于具有较高比例的野生型p53表达谱。
表6.和甲氨喋呤(MTX)治疗后，不同患者群中出现的瘤生长控制
【复发的SCCHN中，对功效有利和不利的p53生物标记物表达谱预示存活期益处，但不能预示甲氨喋呤的功效】
如图17所示，T3013期关键实验p53生物标记物分析揭示了相较于具有不利表达谱的患者，具有对功效有利p53表达谱的患者在治疗后，具有统计学上显著增加的存活期(中位值存活期7.2个月相对于2.7个月；对数秩检测p<0.0001)。
当结合来自关键实验T201和T301的生物标记物的存活期数据，也得到类似结果，如图18所示。所述结合的T201和T301关键实验p53生物标记物分析揭示了相较于具有不利表达谱的患者，具有对功效有利p53表达谱的患者在治疗后，具有统计学上显著增加的存活期(中位值存活期8.5个月相对于2.8个月；对数秩检测p＝0.0017)。该发现指示这些p53生物标记物能预示最可能受益于治疗的患者。这些有利或不利的p53生物标记物表达谱符合已知的如上文所述的作用和瘤p53失活的机制。
重要的是，这些p53生物标记物表达谱不能预示3期关键T301实验中甲氨喋呤的功效，如图19所示。这些结果指示预示的功效的p53生物标记物表达谱不是通用的预后特征，通用的预后特征是指能预示任一治疗的结果，而不是专门预示结果。这些结果并不意外，因为这些预示的生物标记物是根据已知的p53失活和功效的机制研发的。
【p53生物标记物表达谱对施用和甲氨喋呤治疗的SCCHN复发患者的管理的意义】
这些p53生物标记物分析的结果对施用和甲氨喋呤治疗的SCCHN复发患者(他们对顺铂和紫杉烷耐受)的管理有重要意义。如图20所示，通过对数秩检测(p＝0.0003)显示和甲氨喋呤治疗的患者的存活期有统计学上显著差异，根据对功效有利和不利的表达谱。
这些群的中位值存活期范围为，在预示对功效有利表达谱的治疗的患者中为7.2个月，而在对功效不利表达谱的治疗的患者中为2.7个月。在对功效有利或不利表达谱的甲氨喋呤治疗的患者中，观测到他们的中位值存活期中间值分别为4.3个月和6.0个月。如上所述，根据功效的p53预示表达谱，甲氨喋呤治疗的患者的中位值存活期，没有统计差异性。
因此，上文得出的功效和安全性数据支持使用用于SCCHN复发患者的治疗，这些患者具有对功效有利的p53表达谱，并对顺铂和紫杉烷类耐受。具有TGC反应的SCCHN复发患者在治疗后，有统计学上显著增加的存活期，并且预示功效的p53生物标记物进而TGC反应相关，并具有高的统计显著性。此外，具有对功效有利的p53生物标记物表达谱的患者和具有不利的p53表达谱的患者相比，在治疗后，具有统计学上显著增加的存活期。这些生物标记物不预示甲氨喋呤的功效，并且指示和甲氨喋呤在互补的SCCHN复发患者的亚群中提供TGC和增加的存活期。相比甲氨蝶呤的优良的完全性特征还支持的选择，用于治疗具有对功效有利的p53表达谱的复发的SCCHN患者。
相反，相同的数据分析指示具有对功效不利的p53生物标记物表达谱的患者不大可能受益于治疗，并且应该对这些患者考虑替代性治疗。图21指示了甲氨喋呤在具有对功效不利的p53生物标记物表达谱的患者中是有效的，和对具有对功效不利的p53表达谱的患者施用治疗相比，对他们施用甲氨喋呤治疗后得到统计学上显著增加的存活期(中位值存活期6.0个月对比2.7个月；对数秩检测p＝0.0112)。
该结果符合上述和甲氨喋呤的TGC反应者中p53分子表达谱的差异，该差异指示甲氨喋呤反应者和突变的p53表达谱相关，而反应者和野生型p53基因型相关。总之，所述瘤反应、存活期、p53生物标记物分析都指示和甲氨喋呤具有对SCCHN复发患者有效的确实证据，这些患者对顺铂和紫杉烷类耐受，并且或甲氨喋呤的合适治疗可通过对功效有利或不利的p53生物标记物表达谱的测定来指导。
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本文公开，无需过多实验就可制备和实施本文公开及权利要求要求保护的所有组合物和方法。尽管通过优选实施方式描述了本发明的组合物和方法，但本领域技术人员明晰，在不脱离本发明的概念，精神和范围的前提下，可对本文所述组合物、方法、步骤或方法步骤的顺序做出改变。更具体而言，显然可用某些化学和生理学上相关的制剂代替本文所说的制剂，并取得相同或类似的结果。所有本领域技术人员明晰的类似替代和修饰都在随附的权利要求中定义的本发明的精神，范围和概念之内。
【VI.参考文献】
所述下了参考文献，一定程度上提供了例示过程或其他对本文上述的细节补充，将它们通过引用特别并入本文。
美国专利4,415,723
美国专利4,458,066
美国专利4,659,774
美国专利4,682,195
美国专利4,683,202
美国专利4,797,368
美国专利4,816,571
美国专利4,879,236
美国专利4,946,778
美国专利4,959,463
美国专利5,139,941
美国专利5,141,813
美国专利5,264,566
美国专利5,302,523
美国专利5,322,783
美国专利5,354,855
美国专利5,384,253
美国专利5,428,148
美国专利5,464,765
美国专利5,538,877
美国专利5,538,880
美国专利5,550,318
美国专利5,554,744
美国专利5,563,055
美国专利5,574,146
美国专利5,580,859
美国专利5,589,466
美国专利5,602,244
美国专利5,610,042
美国专利5,645,897
美国专利5,656,610
美国专利5,670,488
美国专利5,672,344
美国专利5,677,178
美国专利5,702,932
美国专利5,705,629
美国专利5,736,524
美国专利5,747,469
美国专利5,747,869
美国专利5,780,448
美国专利5,789,215
美国专利5,795,715
美国专利5,871,986
美国专利5,879,703
美国专利5,888,773
美国专利5,889,136
美国专利5,932,210
美国专利5,945,100
美国专利5,981,225
美国专利5,981,274
美国专利5,994,136
美国专利5,994,624
美国专利6,013,516
美国专利6,017,524
美国专利6,069,134
美国专利6,136,594
美国专利6,143,290
美国专利6,210,939
美国专利6,296,845
美国专利6,410,010
美国专利6,511,184
美国专利6,511,847
美国专利6,555,376
美国专利6,627,190
美国专利6,797,704
美国专利申请2005/0171045
美国专利申请2004/0213764
美国专利申请2002/0077313
美国专利申请2002/0028785
美国专利申请2002/0006914
美国专利申请20050143336
美国专利申请20050196343
美国专利申请20050203047
美国专利申请20050260276
美国申请系列09/351,778
Ahomadegbe et al.,Oncogene,10(6):1217-1227,1995.
Aksentijevich et al.,Hum.Gene Ther.,7(9):1111-1122,1996.
Argiris et al.,Cancer,101(10):2222-2229,2004.
Ausubel et al.,In:Current Protocols in Molecular Biology,John,Wiley&Sons,Inc,New York,1996.
Baichwal and Sugden,In:Gene Transfer,Kucherlapati(Ed.),NY,PlenumPress,117-148,1986.
Bakhshi et al.,Cell,41(3):899-906,1985.
Bargonetti et al.,Cell,65(6):1083-1091,1991.
Batterson and Roizman,J.Virol.,46(2):371-377,1983.
Bernstein et al.,Nature,409:363-366,2001.
Bittner et al.,Methods in Enzymol,153:516-544,1987.
Blomer et al.,J.Virol.,71(9):6641-6649,1997.
Bosher and Labouesse,Nat.Cell.Biol.,2:E31-E36,2000.
Brennecke et al.,Cell,113:25-36,2003.
Cancer:Principles and Practice of Oncology(7th Ed.),2004.
Cancer:Principles and Practice of Oncology Single Volume(CD-ROM),Devita et al.(Eds.),Lippencott,2001.
Cariello,Human Genetics,42:726,1988.
Casey et al.,Oncogene,6(10):1791-1797,1991.
Chen and Okayama,Mol.Cell Biol.,7(8):2745-2752,1987.
Clayman et al.,Cancer Res.,55(14):1-6,1995.
Clayman et al.,Clin.Cancer Res.,5(7):1715-1722,1999.
Clayman et al.,J.Clin.Oncol.,16(6):2221-2232,1998.
Cleary and Sklar,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(21):7439-7443,1985.
Cleary et al.,J.Exp.Med.,164(1):315-320,1986.
Clinical Oncology(3rd Ed.),Martin(Eds.),2004.
Cook et al.,Cell,27:487-496,1981.
Cotton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:4397,1988.
Couch et al.,Am.Rev.Resp.Dis.,88:394-403,1963.
Dameron et al.Science 265:1582-1584,1994.
De Vries et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.99(5):2948-53,2002.
DeLuca et al.,J.Virol.,56(2):558-570,1985.
Doench et al.,Genes Dev.,17:438-442,2003.
Edelman and Nemunaitis,Curr.Opin.Mol.Ther.,5(6):611-617,2003.
Elbashir et al.,EMBO J.,20:6877-6888,2001.
Elbashir et al.,Genes Dev.,5(2):188-200,2001.
Elroy-Stein et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86(16):6126-6130,1989.
EP 266 032
U.S.Product Label,2007
Fechheimer,et al.,Proc Natl.Acad.Sci.USA,84:8463-8467,1987.
Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84(21):7413-7417,1987.
Fields and Jang,Science,249(4972):1046-1049,1990.
Fire et al.,Nature,391(6669):806-811,1998.
Fitzgibbon et al.,Leukemia,21(7):1514-20,2007.
Flotho et al.,Oncogene,26(39):5816-21,2007.
Forster and Symons,Cell,49(2):211-220,1987.
Fraley et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:3348-3352,1979.
Froehler et al.,Nucleic Acids Res.,14(13):5399-5407,1986.
Gabizon et al.,Cancer Res.,50(19):6371-6378,1990.
Gallo et al.,Cancer,75(8):2037-2044,1995.
Ganly et al.,Br.J.Cancer,82(2):392-398,2000.
Geisler et al.,Clinical Cancer Research,8:3445-3453,2002.
George et al.,J.Clinical Oncology,25(34):5352-5358,2007.
George et al.,PLoS ONE,2(2):e255,2007.
Gerlach et al.,Nature(London),328:802-805,1987.
Ghosh and Bachhawat,In:Liver Diseases,Targeted Diagnosis and TherapyUsing Specific Receptors and Ligands,Wu et al.(Eds.),Marcel Dekker,NY,87-104,1991.
Glorioso et al.,Mol.Biotechnol.,4(1):87-99,1995.
Gomez-Foix et al.,J.Biol.Chem.,267:25129-25134,1992.
Gopal,Mol.Cell Biol.,5:1188-1190,1985.
Graham and Prevec,Biotechnology,20:363-390,1992.
Graham and Van Der Eb,Virology,52:456-467,1973.
Graham et al,J.General Virology,36:59-74,1977.
Grishok et al.,Cell,106:23-34,2001.
Grishok et al.,Science,287:2494-2497,2000.
Grunhaus and Horwitz,Seminar in Virology,3:237-252,1992.
Harland and Weintraub,J.Cell Biol.,101(3):1094-1099,1985.
Hartwell and Kastan,Science,266(5192):1821-1828,1994.
Herz and Gerard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2812-2816,1993.
Herz and Roizman,Cell,33(1):145-151,1983.
Holland and Holland,J Biol Chem,255(6):2596-605,1980.
Hollstein et al.,Science,253(5015):49-53,1991.
Honess and Roizman,J.Virol.,14(1):8-19,1974.
Honess and Roizman,J.Virol.,16(5):1308-1326,1975.
Hutvgner and Zamore,Science,297:2056-2060,2002.
Hutvgner et al.,Science,293:834-838,2001.
Joyce,Nature,338:217-244,1989.
Kaeppler et al.,Plant Cell Reports,9:415-418,1990.
Kaneda et al.,Science,243:375-378,1989.
Kastan et al.,Cancer Metastasis Rev.,14(1):3-15,1995.
Kato et al,J.Biol.Chem.,266:3361-3364,1991.
Kawamata et al.,Blood,111(2):776-84,2008.
Kerr et al.,Br.J.Cancer,26(4):239-257,1972.
Ketting et al.,Genes Dev.,15(20):2654-2659,2001.
Ketting et al.,Cell,99(2):133-141,1999.
Kim and Cook,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84(24):8788-8792,1987.
Knight and Bass,Science,293:2269-2271,2001.
Kyzas et al.,J.Natl.Cancer Inst.,97(14):1043-1055,2005.
Ladner et al.Cancer Res.60:3493-503,2000.
Lai et al.,Genes,Chromosones,Cancer,46:532-542,2007.
Lara et al.,Journal of Clinical Oncology,26:463-467,2008.Laughlin etal.,J.Virol.,60(2):515-524,1986.
Le Gal La Salle et al.,Science,259:988-990,1993.
Lebkowski et al.,Mol.Cell.Biol.,8(10):3988-3996,1988.
Lee et al.,Cell,75:843-854,1993.
Levrero et al.,Gene,101:195-202,1991.
Lin and Avery,Nature,402:128-129,1999.
Lindbjerg et al.,Carcinogenesis,28(1):38-48,2007.
Lips et al.,Cancer Res.,65(22):10188-10191,2005.
Mann et al.,Cell,33:153-159,1983.
Martin et al.,Nature,345(6277):739-743,1990.
Matsumura et al.,Oncology,53(4):308-312,1996.
McKaig et al.,Head Neck,20(3):250-265,1998.
McLaughlin et al.,J.Virol.,62(6):1963-1973,1988.
McPake et al.,Cancer Res.,59:4247-4251,1999
Melcher et al.,Cytogenet Genome Res.,118(2-4):214-21,2007.
Mercer,Critic.Rev.Eukar.Gene Express.2:251-263,1992.
Meyers et al.,Science,230:1242,1985.
Michel and Westhof,J.Mol.Biol.,216:585-610,1990.
Mietz et al.,EMBO J.,11(13):5013-5020,1992.
Miller et al.,Am.J.Clin.Oncol.,15(3):216-221,1992.
Montgomery et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:15502-15507,1998.
Mourelatos et al.,Genes.Dev.,16:720-728,2002.
Mulder et al.,Br.J.Cancer,71(6):1257-1262,1995.
Muzyczka,Curr.Topics Microbiol.Immunol.,158:97-129,1992.
Nabel et al.,Science,244(4910):1342-1344,1989.
Naldini et al.,Science,272(5259):263-267,1996.
Nemunaitis et al.,J.Clin.Oncol.,18(3):609-622,2000.
Nemunaitis et al.,N.Engl.J.Med.,324(25):1773-1778,1991.
Nicolas and Rubenstein,In:Vectors:A survey of molecular cloningvectors and their uses,Rodriguez and Denhardt(Eds.),Stoneham:Butterworth,494-513,1988.
Nicolau and Sene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190,1982.
Nicolau et al.,Methods Enzymol.,149:157-176,1987.
Olivier et al.,Clin.Cancer Res.,12(4):1157-1167,2006.
Paskind et al.,Virology,67:242-248,1975.
PCT申请WO 00/44914
PCT申请WO 01/36646
PCT申请WO 01/68836
PCT申请WO 02/08436
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PCT申请WO 98/07408
PCT申请WO 99/18933
PCT申请WO 99/32619
Peitjean et al.,Oncogene,26:2157-2165,2007.
Peng,Hum.Gene Ther.,16(9):1016-1027,2005.
Philip et al.,J.Biol.Chem.,268(22):16087-16090,1993.
Pivot et al.,Oncology,61(3):197-204,2001.
Poeta et al.,NE J.Medicine,357(25):2552-2561,2007.
Post et al.,Cell,24(2):555-65,1981.
Potter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:7161-7165,1984.
Purdie et al.,Genes Chromosomes Cancer,46(7):661-9,2007.
Racher et al.,Biotechnology Techniques,9:169-174,1995.
Ragot et al.,Nature,361:647-650,1993.
Recondo et al.,Laryngoscope,101(5):494-501,1991.
Reinhart et al.,Nature,403:901-906,2000.
Reinhold-Hurek and Shub,Nature,357:173-176,1992.
Renan,Radiother.Oncol.,19:197-218,1990.
Resnick and Inga,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100(17):9934-9939,2003.
Rich et al.,Hum.Gene Ther.,4:461-476,1993.
Ridgeway,In:Vectors:A survey of molecular cloning vectors and theiruses,Rodriguez and Denhardt(Eds.),Stoneham:Butterworth,467-492,1988.
Rippe et al.,Mol.Cell Biol.,10:689-695,1990.
Rosenfeld et al.,Science,252:431-434,1991.
Rosenfeld,et al.,Cell,68:143-155,1992.
Ross,et al.,1:Clin.Cancer Res.,13(16):4777-85,2007.
Roth et al.,Nat Med.,2(9):985-991,1996.
Roux et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9079-9083,1989.
Saiki et al.,Science,239:487,1988.
Sambrook et al.,In:Molecular cloning,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY,2001.
Sarkis et al.,J.Clin.Oncol.,13(6):1384-1390,1995.
Sarver et al.,Science,247:1222-1225,1990.
Sauter et al.,J.Surg.Oncol.,58(4):269-273,1995.
Saxena et al.,J.Biol.Chem.,278:44312-44319,2003.
Scanlon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:10591-10595,1991.
Sharp and Zamore,Science,287:2431-2433,2000.
Sharp,Genes Dev.,13:139-141,1999.
Shaw et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89(10):4495-4499,1992.
Shenk et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,72:989,1975.
Smith and Moss,Gene,25(1):21-28,1983.
Solodin et al.,Biochemistry,34(41):13537-13544,1995.
Souissi et al.,Nat.Rev.Cancer,6:83-90,2006.
Stenmark-Askmalm et al.,Br.J.Cancer,72(3):715-719,1995.
Stratford-Perricaudet and Perricaudet,In:Human Gene Transfer,Eds,Cohen-Haguenauer and Boiron,John Libbey Eurotext,France,51-61,1991.
Stratford-Perricaudet et al.,Hum.Gene.Ther.,1:241-256,1990.
Swisher et al.,J.Natl.Cancer Inst.,91(9):763-771,1999.
Tabara et al.,Cell,99(2):123-132,1999.
U.S.Product Label
Temin,In:Gene Transfer,Kucherlapati(Ed.),NY,Plenum Press,149-188,1986.
Templeton et al.,Nat.Biotechnol.,15(7):647-652,1997.
Thierry et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92(21):9742-9746,1995.
Top et al.,J.Infect.Dis.,124:155-160,1971.
Tratschin et al.,Mol.Cell.Biol.,4:2072-2081,1984.
Trkova et al.,Cancer Gene.Cytogen.,145:60-64,2003.
Tsujimoto and Croce,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83(14):5214-5218,1986.
Tsujimoto et al.,Science,228(4706):1440-1443,1985.
Tsukamoto et al.,Nat.Genet.,9(3):243-248,1995.
Tur-Kaspa et al.,Mol.Cell Biol.,6:716-718,1986.
Valentin-Vega et al.,Hum.Pathol.,38(10):1553-1562,2007.
van Beers et al.,Br.J.Cancer,94(2),333-337,2006.
Weinberg,Science,254(5035):1138-1146,1991.
Wilcock and Lane,Nature,349(6308):429-431,1991.
Wilder et al.,Cancer Res.,59:410-413,1999a.
Wilder et al.,Gene Therapy,6:57-62,1999b.
Wilson et al.,Science,244:1344-1346,1989.
Wincott et al.,Nucleic Acids Res.,23(14):2677-2684,1995.
Winter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:7575,1985.
Wong et al.,Gene,10:87-94,1980.
Wu and Wu,Biochemistry,27:887-892,1988.
Wu and Wu,J.Biol.Chem.,262:4429-4432,1987.
Xu et al.,Curr.Biol.,13:790-795,2003.
Yamamoto et al.,1:Am J Hum Genet.81(1):114-26,2007.
Yang and Huang,Gene Therapy,4(9):950-960,1997.
Yonish-Rouach et al.,Nature,352(6333):345-347,1991.
Zakut-Houri et al.,EMBO J.,4(5):1251-1255,1985.
Zeng et al.,Mol.Cell,9:1327-1333,2002.
Zeng et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:9779-9784,2003.
Zhang et al.,Hum.Gene Ther.,6(2):155-164,1995.
Zhu et al.,Science,261(5118):209-211,1993.
Zufferey et al.,Nat.Biotechnol.,15(9):871-875,1997.
本说明书还包括以下内容：
1.预测患瘤的人受试者对p53基因治疗的有利反应的方法：
(a)测定所述瘤的瘤细胞是否含至少一个野生型p53等位基因；和/或
(b)测定所述瘤的瘤细胞是否以高于表达正常p53的非瘤细胞中表达的水平表达p53蛋白；
其中如果所述细胞被发现
(i)含至少一个野生型p53等位基因，和/或
(ii)表达不高于表达正常p53的非瘤细胞中表达的水平的p53蛋白，和/或
(iii)表达升高水平的p53蛋白，定义为高于表达正常p53的非瘤细胞中表达的水平，其中所述p53蛋白不抑制所述野生型p53的功能，
则(i)～(iii)中的任一项会预测所述受试者会具有对所述治疗的有利反应。
2.实施方式1的方法，其中，
如果所述瘤细胞被发现
(A)不含至少一个野生型p53等位基因，和/或
(B)含2个突变的p53等位基因，和/或
(C)以高于由表达正常p53的正常细胞表达的水平表达突变的p53蛋白，且所述突变的p53抑制所述野生型p53的功能，
则其指示对所述治疗的不良反应。
3.实施方式46～48的方法，其中所述其他治疗是甲氨蝶呤。
4.实施方式1的方法，其中步骤(a)包括p53的抗体检测。
5.实施方式1的方法，其中步骤(a)包括免疫组织化学。
6.实施方式1的方法，其中步骤(a)包括：ELISA、免疫测定、放射免疫测定(RIA)、免疫放射定量测定、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定、凝胶电泳、蛋白印迹分析或原位杂交测定。
7.实施方式1的方法，其中步骤(a)包括扩增p53转录物。
8.实施方式7的方法，其中所述扩增包括PCR或RT-PCR。
9.实施方式1的方法，其中步骤(a)包括：原位杂交、RNA印迹或核酸酶保护。
10.实施方式1的方法，其中步骤(b)包括：测序、基因阵列或基因芯片。
11.实施方式10的方法，其中在所述瘤的瘤细胞中扩增基因组序列。
12.实施方式11的方法，其中所述瘤细胞经石蜡包埋。
13.实施方式2的方法，其中所述突变的p53包括DNA结合突变。
14.实施方式1和41～45的方法，其中所述p53基因治疗是AdvexinTM。
15.实施方式1的方法，其中所述瘤是良性瘤生长。
16.实施方式15的方法，其中所述良性瘤生长是良性前列腺增生、口腔白斑、结肠息肉、食管癌前生长或良性病变。
17.实施方式1的方法，其中所述瘤是癌。
18.实施方式17的方法，其中所述癌是口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、呼吸道癌、泌尿生殖器癌、胃肠道癌、中枢或外周神经系统组织癌、内分泌或神经内分泌癌或造血细胞癌、神经胶质瘤、肉瘤、癌、淋巴瘤、黑色素瘤、纤维瘤、脑膜瘤、脑癌、口咽癌、鼻咽癌、肾癌、胆囊癌、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞癌、李弗劳明瘤、甲状腺癌、甲状旁腺癌、垂体瘤、肾上腺瘤、成骨性肉瘤、I型和II型多发性神经内分泌瘤、乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食管癌、气管癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。
19.实施方式18的方法，其中所述癌是鳞状细胞癌(SCCHN)。
20.实施方式1的方法，还包括第二抗瘤治疗。
21.实施方式20的方法，其中所述第二抗瘤治疗是基因治疗。
22.实施方式20的方法，其中所述第二抗瘤治疗是化学治疗。
23.实施方式20的方法，其中所述第二抗瘤治疗是放射治疗。
24.实施方式20的方法，其中所述第二抗瘤治疗是细胞因子治疗。
25.实施方式20的方法，其中所述第二抗瘤治疗是抗血管形成治疗。
26.实施方式1的方法，其中所述p53基因治疗通过非病毒载体递送。
27.实施方式26的方法，其中所述非病毒载体被包封在脂质媒质中。
28.实施方式27的方法，其中所述脂质媒质是脂质体。
29.实施方式28的方法，其中所述媒质是纳米颗粒。
30.实施方式1的方法，其中所述p53基因治疗通过病毒载体递送。
31.实施方式30的方法，其中所述病毒载体是反转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、痘病毒载体、多瘤病毒载体、慢病毒载体、或疱疹病毒载体。
32.实施方式1的方法，其中所述p53基因治疗是局部区域基因治疗。
33.实施方式32的方法，其中所述局部区域基因治疗包括局部基因治疗。
34.实施方式33的方法，其中所述局部基因治疗包括所述瘤的直接注射。
35.实施方式34的方法，其中所述局部基因治疗包括瘤血管的注射。
36.实施方式32的方法，其中所述局部区域基因治疗包括区域性基因治疗。
37.实施方式36的方法，其中所述区域性基因治疗包括施用到瘤相关淋巴管或导管内。
38.实施方式37的方法，其中所述施用包括腹膜内、胸膜内、囊内、或鞘内施用。
39.实施方式36的方法，其中所述区域性基因治疗包括施用到与所述瘤相关的肢的血管系统中。
40.实施方式1的方法，其中对所述治疗的有利反应包括：瘤尺寸或负荷减小、瘤生长的阻断、瘤相关疼痛减少、瘤相关病理的减少、瘤相关症状的减少、瘤非进行、增加的无病间期、增加的至进行时间、缓解的诱导、转移的减少、或增长的患者存活期。
41.实施方式1的方法，还被定义为包括下列步骤：
(a)测定所述瘤细胞是否含2个野生型p53等位基因；且如果是，则
(b)给所述受试者施用p53基因治疗。
42.实施方式1的方法，还被定义为包括下列步骤：
(a)测定所述瘤细胞是否含至少一个野生型p53等位基因，及所述瘤细胞是否不过表达p53蛋白；且如果是，则
(b)给所述受试者施用p53基因治疗。
43.实施方式1的方法，还被定义为包括下列步骤：
(a)测定所述瘤细胞是否不含p53突变等位基因；且如果是，则
(b)给所述受试者施用p53基因治疗。
44.实施方式1的方法，还被定义为包括下列步骤：
(a)测定所述瘤细胞是否不过表达p53突变蛋白，所述p53突变蛋白抑制野生型p53的功能；且如果是，则
(b)给所述受试者施用p53基因治疗。
45.实施方式1的方法，还被定义为包括下列步骤：
(a)测定所述瘤细胞是否过表达p53蛋白，所述p53蛋白不抑制野生型p53的功能；且如果是，则
(b)给所述受试者施用p53基因治疗。
46.实施方式1的方法，还被定义为包括下列步骤：
(a)测定所述瘤细胞是否过表达突变的p53蛋白，且所述突变的p53抑制野生型p53的功能；且如果是，则
(b)给所述受试者施用p53基因治疗之外的治疗。
47.实施方式1的方法，还被定义为包括下列步骤：
(a)测定所述瘤细胞是否不含至少一个野生型p53等位基因；且如果是，则
(b)给所述受试者施用p53基因治疗之外的治疗。
48.实施方式1的方法，还被定义为包括下列步骤：
(a)测定所述瘤细胞是否含2个突变的p53等位基因；且如果是，则
(b)给所述受试者施用p53基因治疗之外的治疗。
49.实施方式1的方法，还包括从所述患者获得含瘤细胞的生物样品。
50.试剂盒，其含：
(a)检测瘤样品中p53蛋白的量的p53抗体或探针；
(b)测定p53基因或转录物结构的多种探针。

Claims (19)

1.p53基因在制备用于p53基因治疗的药物中的用途，所述p53基因治疗用于患瘤的人受试者，其中所述瘤的瘤细胞包含至少一种野生型p53等位基因。
2.权利要求1的用途，其中所述p53基因治疗的p53基因含于非病毒载体中。
3.权利要求2的用途，其中所述非病毒载体被包封在脂质媒质中。
4.权利要求3的用途，其中所述脂质媒质是脂质体或纳米颗粒。
5.权利要求1的用途，其中所述p53基因治疗的p53基因含于病毒载体中。
6.权利要求5的用途，其中所述病毒载体是反转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、痘病毒载体、多瘤病毒载体、慢病毒载体、或疱疹病毒载体。
7.权利要求1的用途，其中所述瘤是良性瘤生长。
8.权利要求1的用途，其中所述瘤是良性前列腺增生、口腔白斑、结肠息肉、食管癌前生长或良性病变。
9.权利要求1的用途，其中所述瘤是癌。
10.权利要求1的用途，其中所述瘤是口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、呼吸道癌、泌尿生殖器癌、胃肠道癌、中枢或外周神经系统组织癌、内分泌或神经内分泌癌或造血细胞癌、神经胶质瘤、肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、纤维瘤、脑膜瘤、脑癌、肾癌、胆囊癌、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞癌、李弗劳明瘤、甲状腺癌、甲状旁腺癌、垂体瘤、肾上腺瘤、成骨性肉瘤、I型和II型多发性神经内分泌瘤、乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食管癌、气管癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。
11.权利要求1的用途，其中瘤样品中p53蛋白的量通过下列来检测：ELISA、免疫测定、放射免疫测定(RIA)、免疫放射定量测定、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定、凝胶电泳、蛋白印迹分析或原位杂交测定。
12.权利要求1的用途，其中通过扩增p53转录物来测定所述瘤的瘤细胞是否具有突变的p53基因。
13.权利要求12的用途，其中所述扩增包括PCR或RT-PCR。
14.权利要求1的用途，其中通过原位杂交、RNA印迹或核酸酶保护来测定所述瘤的瘤细胞是否具有突变的p53基因。
15.权利要求1的用途，其中通过测序、基因阵列或基因芯片来测定所述瘤的瘤细胞是否具有突变的p53基因。
16.权利要求1的用途，其中所述p53基因治疗是AdvexinTM。
17.权利要求9的用途，其中所述癌是鳞状细胞癌(SCCHN)。
18.权利要求1～17中任一项的用途，其中所述受试者显示对所述治疗的有利反应，所述有利反应包括：瘤尺寸或负荷减小、瘤生长的阻断、瘤相关疼痛减少、瘤相关病理的减少、瘤相关症状的减少、瘤非进展、增加的无病间期、增加的至进展时间、缓解的诱导、转移的减少、或增长的患者存活期。
19.测定p53基因及其表达水平的试剂用于制备预测患瘤的人受试者对p53基因治疗的有利反应的试剂盒的用途，所述预测通过下列过程实施：
(a)测定所述瘤的瘤细胞是否含至少一个野生型p53等位基因；和/或
(b)测定所述瘤的瘤细胞是否以高于表达正常p53的非瘤细胞中表达的水平表达p53蛋白；
其中如果所述细胞被发现
(i)含至少一个野生型p53等位基因，和/或
(ii)表达不高于表达正常p53的非瘤细胞中表达的水平的p53蛋白，和/或
(iii)表达升高水平的p53蛋白，定义为高于表达正常p53的非瘤细胞中表达的水平，其中所述p53蛋白不抑制所述野生型p53的功能，
则(i)～(iii)中的任一项会预测所述受试者会具有对所述治疗的有利反应。
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PL (1) PL2245464T3 (zh)
WO (1) WO2009094647A2 (zh)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101623985B1 (ko) 2007-03-28 2016-05-25 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 스티칭된 폴리펩티드
RU2582678C2 (ru) 2010-08-13 2016-04-27 Эйлерон Терапьютикс, Инк. Пептидомиметические макроциклы
CN102443581A (zh) * 2010-10-09 2012-05-09 清华大学 用于检测p53基因表达的引物对及其应用
TWI643868B (zh) 2011-10-18 2018-12-11 艾利倫治療公司 擬肽巨環化合物
CN104080926B (zh) 2011-10-28 2019-04-23 米伦纽姆医药公司 对nedd8活化酶(nae)抑制剂的反应的生物标记
CA2864120A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Aileron Therapeutics, Inc. Triazole-crosslinked and thioether-crosslinked peptidomimetic macrocycles
WO2013123266A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles
CA2863788A1 (en) * 2012-02-17 2013-08-22 Pharmacophotonics, Inc. Compositions and methods for monitoring biometric indicators
SG11201503052RA (en) 2012-11-01 2015-05-28 Aileron Therapeutics Inc Disubstituted amino acids and methods of preparation and use thereof
CN103834722B (zh) * 2013-06-19 2016-09-21 珠海华信解码医学科技有限公司 适用于结肠癌普查的核心基因芯片及探针
US10471120B2 (en) 2014-09-24 2019-11-12 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles and uses thereof
MX2017003819A (es) 2014-09-24 2017-06-15 Aileron Therapeutics Inc Macrociclos peptidomimeticos y formulaciones de los mismos.
GB201417281D0 (en) * 2014-09-30 2014-11-12 Ge Healthcare Uk Ltd Methods and devices relating to the detection of oral cancer biomarkers
CN107614003A (zh) 2015-03-20 2018-01-19 艾瑞朗医疗公司 拟肽大环化合物及其用途
CN105112377B (zh) * 2015-09-25 2018-10-30 福州迈新生物技术开发有限公司 一株分泌抗p53单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
US20210094991A1 (en) 2018-03-19 2021-04-01 Multivir Inc. Methods and compositions comprising tumor suppressor gene therapy and cd122/cd132 agonists for the treatment of cancer
WO2021113644A1 (en) 2019-12-05 2021-06-10 Multivir Inc. Combinations comprising a cd8+ t cell enhancer, an immune checkpoint inhibitor and radiotherapy for targeted and abscopal effects for the treatment of cancer

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1240028A (zh) * 1996-10-07 1999-12-29 先灵公司 检测抗p53抗体的测定方法
CN1281512A (zh) * 1997-12-12 2001-01-24 昂尼克斯药物公司 p53+肿瘤细胞的选择性杀伤和诊断
WO2006132675A2 (en) * 2004-12-20 2006-12-14 University Of South Florida Xiap-targeted prostate cancer therapy
CN1957092A (zh) * 2004-02-23 2007-05-02 诺瓦提斯公司 P53野生型作为使用与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂治疗的生物标志
WO2007090125A2 (en) * 2006-01-30 2007-08-09 Introgen Therapeutics, Inc. Prognostic factors for anti-hyperproliferative disease gene therapy

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4415723A (en) 1982-03-19 1983-11-15 General Electric Company Randomly branched aromatic polycarbonate from triphenol
US4879236A (en) 1984-05-16 1989-11-07 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4682195A (en) 1985-09-30 1987-07-21 General Electric Company Insulated gate device with configured emitter contact pad
US4959463A (en) 1985-10-15 1990-09-25 Genentech, Inc. Intermediates
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US4659774A (en) 1985-11-01 1987-04-21 American Hoechst Corporation Support for solid-phase oligonucleotide synthesis
EP0266032A1 (en) 1986-08-29 1988-05-04 Beecham Group Plc Modified fibrinolytic enzyme
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US4816571A (en) 1987-06-04 1989-03-28 Applied Biosystems, Inc. Chemical capping by phosphitylation during oligonucleotide synthesis
US5672344A (en) 1987-12-30 1997-09-30 The Regents Of The University Of Michigan Viral-mediated gene transfer system
US5602244A (en) 1988-05-26 1997-02-11 Competitive Technologies, Inc. Polynucleotide phosphorodithioate compounds
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5527676A (en) * 1989-03-29 1996-06-18 The Johns Hopkins University Detection of loss of the wild-type P53 gene and kits therefor
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5141813A (en) 1989-08-28 1992-08-25 Clontech Laboratories, Inc. Multifunctional controlled pore glass reagent for solid phase oligonucleotide synthesis
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US5670488A (en) 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
US5747469A (en) * 1991-03-06 1998-05-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
US6410010B1 (en) 1992-10-13 2002-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant P53 adenovirus compositions
WO1992015680A1 (en) 1991-03-06 1992-09-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
US6013638A (en) 1991-10-02 2000-01-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adenovirus comprising deletions on the E1A, E1B and E3 regions for transfer of genes to the lung
US5610042A (en) 1991-10-07 1997-03-11 Ciba-Geigy Corporation Methods for stable transformation of wheat
FR2685346B1 (fr) 1991-12-18 1994-02-11 Cis Bio International Procede de preparation d'arn double-brin, et ses applications.
DE4204650C1 (zh) 1992-02-15 1993-07-08 Hoffmeister, Helmut, Dr., 4400 Muenster, De
US5428148A (en) 1992-04-24 1995-06-27 Beckman Instruments, Inc. N4 - acylated cytidinyl compounds useful in oligonucleotide synthesis
US5702932A (en) 1992-07-20 1997-12-30 University Of Florida Microinjection methods to transform arthropods with exogenous DNA
BR9306802A (pt) 1992-07-27 1998-12-08 Pioneer Hi Bred Int Processo independente de genótipos para produção de planta de soja transgénica e processo de regeneração de plantas de soja a partir de nodos cotiledonais
GB9222888D0 (en) 1992-10-30 1992-12-16 British Tech Group Tomography
US5846945A (en) 1993-02-16 1998-12-08 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia
EP0688206B1 (en) 1993-02-26 2000-05-03 Fountain Pharmaceuticals, Inc. Vaccine delivery system and shelf-stable precursor solution for remote encapsulation of active ingredients
US6210939B1 (en) 1993-10-25 2001-04-03 Canji, Inc. Recombinant adenoviral vector and methods of use
TW442569B (en) 1993-10-25 2001-06-23 Canji Inc Recombinant adenoviral vector
US20020010144A1 (en) 1994-04-29 2002-01-24 Robert Sobol Enhancing the sensitivity of tumor cells to therapies
US5656610A (en) 1994-06-21 1997-08-12 University Of Southern California Producing a protein in a mammal by injection of a DNA-sequence into the tongue
US5888773A (en) 1994-08-17 1999-03-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of producing single-chain Fv molecules
US5574146A (en) 1994-08-30 1996-11-12 Beckman Instruments, Inc. Oligonucleotide synthesis with substituted aryl carboxylic acids as activators
US5554744A (en) 1994-09-23 1996-09-10 Hybridon, Inc. Method for loading solid supports for nucleic acid synthesis
US5871986A (en) 1994-09-23 1999-02-16 The General Hospital Corporation Use of a baculovirus to express and exogenous gene in a mammalian cell
US5736524A (en) 1994-11-14 1998-04-07 Merck & Co.,. Inc. Polynucleotide tuberculosis vaccine
US5889136A (en) 1995-06-09 1999-03-30 The Regents Of The University Of Colorado Orthoester protecting groups in RNA synthesis
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US5705629A (en) 1995-10-20 1998-01-06 Hybridon, Inc. Methods for H-phosphonate synthesis of mono- and oligonucleotides
US5780448A (en) 1995-11-07 1998-07-14 Ottawa Civic Hospital Loeb Research DNA-based vaccination of fish
CA2238829A1 (en) 1995-11-30 1997-06-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the diagnosis and treatment of cancer
US5636172A (en) 1995-12-22 1997-06-03 Micron Technology, Inc. Reduced pitch laser redundancy fuse bank structure
US5945100A (en) 1996-07-31 1999-08-31 Fbp Corporation Tumor delivery vehicles
US6413544B1 (en) 1996-08-19 2002-07-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Liposome complexes for increased systemic delivery
US5981274A (en) 1996-09-18 1999-11-09 Tyrrell; D. Lorne J. Recombinant hepatitis virus vectors
WO1999018933A2 (en) 1997-10-10 1999-04-22 Inex Pharmaceuticals Corporation Methods for encapsulating nucleic acids in lipid bilayers
US5994624A (en) 1997-10-20 1999-11-30 Cotton Incorporated In planta method for the production of transgenic plants
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US5981225A (en) 1998-04-16 1999-11-09 Baylor College Of Medicine Gene transfer vector, recombinant adenovirus particles containing the same, method for producing the same and method of use of the same
CA2361201A1 (en) 1999-01-28 2000-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
CA2367692A1 (en) 1999-03-15 2000-09-21 Introgen Therapeutics, Inc. Dendritic cells transduced with a wild-type self gene elicit potent antitumor immune responses
US6627190B2 (en) 1999-07-12 2003-09-30 Saint Louis University Recombinant adenovirus vectors that are replication-competent in tert-expressing cells
AU2001245793A1 (en) 2000-03-16 2001-09-24 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and compositions for rna interference
US6511184B2 (en) 2000-04-05 2003-01-28 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Color image display apparatus
AU2001280674A1 (en) 2000-07-20 2002-02-05 Genstar Therapeutics Corporation Mini-adenoviral vector system for vaccination
US6797704B2 (en) 2000-10-06 2004-09-28 The Johns Hopkins University Systemic delivery of compounds through non-invasive bladder administration
WO2002031168A2 (en) 2000-10-10 2002-04-18 Genstar Therapeutics Minimal adenoviral vector and recombinant vaccines based thereon
AU2002256274A1 (en) 2001-04-18 2002-11-05 Genstar Therapeutics Corp. Minimal adenoviral vectors for immunization
IN192520B (zh) 2001-08-01 2004-04-24 Univ Delhi
CA2463996A1 (en) 2001-10-16 2003-04-24 Magnum Therapeutics, Inc. Replication competent dual-ad vectors for vaccine and immunotherapy applications
WO2004087930A1 (en) 2003-03-28 2004-10-14 Saint Louis University Adenovirus replication-competent vectors expressing trail
WO2005086896A2 (en) 2004-03-10 2005-09-22 Ulrich Thomann Delivery vectors for short interfering rna, micro-rna and antisense rna
US20050227918A1 (en) * 2004-04-07 2005-10-13 Farrell Paul J Method for assaying susceptibility to cancer therapy in a subject by assaying for tumors of P53
US8065093B2 (en) * 2004-10-06 2011-11-22 Agency For Science, Technology, And Research Methods, systems, and compositions for classification, prognosis, and diagnosis of cancers

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1240028A (zh) * 1996-10-07 1999-12-29 先灵公司 检测抗p53抗体的测定方法
CN1281512A (zh) * 1997-12-12 2001-01-24 昂尼克斯药物公司 p53+肿瘤细胞的选择性杀伤和诊断
CN1957092A (zh) * 2004-02-23 2007-05-02 诺瓦提斯公司 P53野生型作为使用与细胞毒剂组合的mTOR抑制剂治疗的生物标志
WO2006132675A2 (en) * 2004-12-20 2006-12-14 University Of South Florida Xiap-targeted prostate cancer therapy
WO2007090125A2 (en) * 2006-01-30 2007-08-09 Introgen Therapeutics, Inc. Prognostic factors for anti-hyperproliferative disease gene therapy

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GARY L. CLAYMAN, ET AL: "Adenovirus-Mediated p53 Gene Transfer in Patients With Advanced Recurrent Head and Neck Squamous Cell Carcinoma", 《JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY》 *
LISA S. ST. JOHN,,ET AL: "Endogenous p53 gene status predicts the response of human squamous cell carcinomas to wild-type p53", 《CANCER GENE THERAPY》 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2009206225A1 (en) 2009-07-30
MX356866B (es) 2018-06-18
WO2009094647A2 (en) 2009-07-30
CA2713232A1 (en) 2009-07-30
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US20180156803A1 (en) 2018-06-07
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BRPI0907637A8 (pt) 2018-01-02
CN106841616B (zh) 2019-06-04
EP2245464B1 (en) 2016-12-14
US9746471B2 (en) 2017-08-29
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JP2011512521A (ja) 2011-04-21
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EP2245464A4 (en) 2011-06-29
AU2009206225B2 (en) 2015-04-23
JP2014222225A (ja) 2014-11-27
US10883993B2 (en) 2021-01-05
DK2245464T3 (en) 2017-02-20
CN102066937A (zh) 2011-05-18
EP3159696A1 (en) 2017-04-26
ES2617598T3 (es) 2017-06-19
US20110097389A1 (en) 2011-04-28
MX2010008168A (es) 2011-02-24
CA2713232C (en) 2020-05-05
EP2245464A2 (en) 2010-11-03
BRPI0907637A2 (pt) 2015-07-21

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