CN103834722B - 适用于结肠癌普查的核心基因芯片及探针 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种适用于结肠癌普查的核心基因芯片及探针。它解决了现有技术检测准确率较低等技术问题。适用于结肠癌普查的核心基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的一组探针，该组探针包括序列表中SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列。一组适用于基因芯片方式普查结肠癌的核心基因探针，其特征在于，它包括序列表中SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列。本发明的优点在于：1、早期诊断结肠癌变成可能，癌症患者的存活率大大的提高。2、芯片技术的推广使结肠癌的普查从临床体检的水平走向分子诊断的水平，普查水平和质量大大提高。3、芯片分子诊断技术在结肠癌的推广使癌症的普查从被动普查变成主动预测和早期治疗。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及基因芯片，尤其是涉及一种适用于结肠癌普查的核心基因芯片及探针。
背景技术
结肠癌是指结肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性病变，是常见的恶性肿瘤之一。结肠癌起病隐匿，早期常无明显的临床表现，病情发展较慢，出现明显的症状时大多已到了中晚期，死亡率仅次于肺癌和肝癌，占我国恶性肿瘤第三位。到2020年前，全球癌症发病率将增加50%，即每年将新增1500万癌症患者，且20%的新发癌症患者在中国。全球20%的新发癌症病人在中国，24%的癌症死亡病人在中国。目前我国每死亡5人，即有1人死于癌症；而在0～64岁人口中，每死亡4人，即有1人死于癌症。我国近20年来癌症发病率、死亡率及年轻化呈现“三线”走高的趋势，每分钟就有6人确诊为癌症。数据显示，除了基因遗传之外，环境污染、生活压力大、不良饮食习惯等生活细节，成为癌症发病的重要诱因。
结肠癌亦是我国常见的恶性肿瘤之一，随着我国人民生活水平的提高和饮食等生活方式的转变，结肠癌的发病率呈不断上升趋势，年递增4.71％，远超2％的国际水平，从1982年的7/10万升至目前的30.7/10万，局部地区甚至超过发达国家的水平。大规模人群普查资料表明,35岁以上的人群中,结直肠癌的发病率约为24～32/10万，早期结直肠癌根治术后,患者5年存活率可达90%以上,而晚期癌5年存活率不足10%。根据美国近30年的统计,20世纪70年代的结直肠癌死亡率为28/10万,2000年为20/10万,下降了29%,其主要原因为近二、三十年来美国大力开展无症状人群普查,检出了大量“早期癌”并对癌前病变进行干预治疗。可见，早期发现结直肠癌对于治愈有很重要的意义。
结肠癌的特点是癌变呈渐进性并且与年龄密切相关，一般在40-70岁之间高发，癌变间期长达10-20年，这样漫长的发病周期给了我们早期发现结肠癌的良好机会，目前临床上常用的结肠癌的普查方法主要是结肠镜检查，粪便潜血检查及粪便DNA基因检查结合受检者的临床症状，例如长期性的腹痛，便秘和便血等等。但是这些检查方法的缺点是只能检查出中晚期的结肠癌，此外检查的通量有限，目前不太适合大规模的检查。
随着人类基因组计划的完成，个体化基因组学在临床上的应用深入，以基因技术为基础的分子诊断方法开始在癌症诊断特别是早期诊断方面开始进入实际应用，目前已开展结肠癌分子诊断的主要技术有：以检测结肠癌基因突变为目的的基因测序技术；以PCR技术为主的癌变基因试剂盒检测癌胚抗原，APC基因和P53基因等等；结肠癌肿瘤组织标志物等等。
目前看来，上述各种检测的灵敏度都不够理想，主要是检测的灵敏度不够高，或检测的基因数目比较少。基因芯片检测技术依然是目前较理想的检测手段，高通量，快速和可控制的成本。基因芯片（genechip）也叫DNA芯片、DNA微阵列（DNA microarray），是20世纪90年代发展起来的技术，其主要原理是：在玻片等固相载体上以微点阵的形式固定各种基因探针，组成二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描，对每一个探针上的荧光信号进行检测，从而应用核酸杂交的原理来检测待检样品中的目的基因。该方法具有操作简单，自动化程度高，高通量等特点，检测靶分子种类多、效率高、结果客观性强，基因芯片技术可实现对生物样品快速，高通量地进行检测和医学诊断。
但是，现有的基因芯片特别是用于肿瘤分子诊断的芯片都存在两个明显的设计缺显，第一，很多科技公司要么在一张芯片上罗列了几百甚至上千个基因，这样不仅制作基因芯片成本高，而且在检测过程中容易造成成本过高，分析时造成较高的假阳性率，使基因芯片的方法在临床肿瘤的检测中的推广打了很大的折扣；第二，所检测的基因选择不合理，使检测癌症的灵敏度达不到临床要求。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种检测准确率高的适用于结肠癌普查的核心基因芯片。
本发明的另一目的是针对上述问题，提供一种检测准确率高的一组适用于基因芯片方式普查结肠癌的核心基因探针。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本适用于结肠癌普查的核心基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的一组探针，其特征在于，该组探针包括序列表中SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列。
上述的适用于结肠癌普查的核心基因芯片中，如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列包括12个结肠癌检测基因，12个结肠癌检测基因探针序列如下：APC探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2所述；P53探针序列包括两条，分别如SEQ IDNO：3-SEQ ID NO：4所述；K-ras探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：6所述；PI3CA探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：7-SEQ ID NO：8所述；MLH1探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：9-SEQ ID NO：10所述；POLE探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：11-SEQ ID NO：12所述；SMAD4探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：14所述；ARID1A探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：15-SEQ ID NO：16所述；FAM123B探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：17-SEQ ID NO：18所述；β-Catenin探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：19-SEQ ID NO：20所述；SOX9探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：21-SEQ IDNO：22所述；TCF7L1探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：23-SEQ ID NO：24所述。
在上述的适用于结肠癌普查的核心基因芯片中，该组探针还包括序列表中SEQ IDNO：25-SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列。
在上述的适用于结肠癌普查的核心基因芯片中，如SEQ ID NO：25-SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列包括8个看家基因，8个看家基因探针序列如下：18SRNA探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：25-SEQ ID NO：26所述；ACTB探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：27-SEQ ID NO：28所述；GAPDH探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：29-SEQ ID NO：30所述；HPRT1探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：31-SEQ ID NO：32所述；B2M探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：33-SEQ ID NO：34所述；RPL27探针序列包括两条，分别如SEQ IDNO：35-SEQ ID NO：36所述。
在上述的适用于结肠癌普查的核心基因芯片中，所述的固相载体上具有24列乘16行微阵列，其中1-6行中每一行的1-24列为序列表中SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列的排列；15-16行中每一行的1-24列为序列表中SEQ ID NO：25-SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列的重复排列；上述24列乘16行微阵列中1-12行为所检的6个样本的排列，13-14行为正常对照的所检样本，15-16行为看家基因对照的样本。
在上述的适用于结肠癌普查的核心基因芯片中，所述的固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯或载玻片中的任意一种。
一组适用于基因芯片方式普查结肠癌的核心基因探针，其特征在于，它包括序列表中SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列。
与现有的技术相比，本发明的优点在于：1、早期诊断结肠癌变成可能，对早期发现的可疑授检者进行跟踪、随访，定期做身体检查；癌症患者的存活率大大的提高。2、芯片技术的推广使结肠癌的普查从临床体检的水平走向分子诊断的水平，普查水平和质量大大提高。3、芯片分子诊断技术在结肠癌的推广使癌症的普查从被动普查变成主动预测和早期治疗，极大的节省医药成本。4、采用基因芯片检测基技术能够帮助医生更加透彻的了解癌变的分子机理，对合理有效的治疗有极大的指导意义。
附图说明
图1是本发明提供的微阵列结构示意图。
具体实施方式
如图1所示，本适用于结肠癌普查的核心基因芯片包括固相载体和固定在固相载体上的一组探针，其特征在于，该组探针包括序列表中SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列。如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列包括12个结肠癌检测基因，12个结肠癌检测基因探针序列如下：APC探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：1-SEQ IDNO：2所述；P53探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4所述；K-ras探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：6所述；PI3CA探针序列包括两条，分别如SEQ IDNO：7-SEQ ID NO：8所述；MLH1探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：9-SEQ ID NO：10所述；POLE探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：11-SEQ ID NO：12所述；SMAD4探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：14所述；ARID1A探针序列包括两条，分别如SEQ IDNO：15-SEQ ID NO：16所述；FAM123B探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：17-SEQ ID NO：18所述；β-Catenin探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：19-SEQ ID NO：20所述；SOX9探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：21-SEQ ID NO：22所述；TCF7L1探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：23-SEQ ID NO：24所述。
该组探针还包括序列表中SEQ ID NO：25-SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列。如SEQID NO：25-SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列包括8个看家基因，8个看家基因探针序列如下：18SRNA探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：25-SEQ ID NO：26所述；ACTB探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：27-SEQ ID NO：28所述；GAPDH探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：29-SEQ ID NO：30所述；HPRT1探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：31-SEQ ID NO：32所述；B2M探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：33-SEQ ID NO：34所述；RPL27探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：35-SEQ ID NO：36所述。
固相载体上具有24列乘16行微阵列，其中1-6行中每一行的1-24列为序列表中SEQID NO：1-SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列的排列；15-16行中每一行的1-24列为序列表中SEQ ID NO：25-SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列的重复排列；上述24列乘16行微阵列中1-12行为所检的6个样本的排列，13-14行为正常对照的所检样本，15-16行为看家基因对照的样本。固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯或载玻片中的任意一种。
本发明中每个基因的芯片探针包含可以引导所检测的基因进行扩增的一对核苷酸引物，引物长度不超过30个碱基，所引导扩增的产物一般不超过130个核苷酸，以利于核酸扩增的效果，每对引物都进行了优化组合，其CG含量合理，不会出现引物二聚体的现象。每一个要检测的基因都有4个重复检测位点，以获得至少3-4次的基因扩增结果，取3次最为接近的扩增结果计算其Ct值，然后对比正常与受检者的基因表达差异，实现肿瘤核心基因表达状况风险和发病可能性的评估，同时结合其他检测结果做出最终诊断。
一组适用于基因芯片方式普查结肠癌的核心基因探针，其特征在于，它包括序列表中SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列。
本发明人认识到人类肿瘤的发生是有肿瘤遗传基因（10-15%）和后天发生的体细胞突变基因（85-90%），肿瘤的基因主要是肿瘤的140个核心驱动基因（driver genes）和上千个随客基因（passenger genes），他们主要介导12个主要的肿瘤细胞信号转导通路及肿瘤在体内生长的特殊微环境的特点，结合发明人在长期大量芯片科研应用中的经验发明设计了选择关键的核心肿瘤基因做为结肠癌的全新基因芯片的方法和设计方法。本发明包括检测导致结肠癌基因突变频率最高的12个基因（60-90%），在一张384微孔板的面积上能够同时检测6份病人的标本，每份标本的每个基因包括4个重复检测点，同时比较正常人和受检者的基因表达差异特征，最后通过比较统计分析P值的显著差异来推算出肿瘤特别是早期结肠癌的发生概率，为结肠癌的分子检测提供了高敏感高通量的方法。
12个结肠癌检测基因如下：
APC基因MIM:611731；
P53基因MIM:191170；
K-ras基因MIM:190070；
PI3CA基因MIM:171834；
MLH1基因MIM:120436；
POLE基因MIM:174762；
SMAD4基因MIM:600993；
ARID1A基因MIM:603024；
FAM123B基因MIM:300647；
β-Catenin基因MIM:607758；
SOX9基因MIM:608160；
TCF7L1基因MIM:604652。
6个看家基因如下：
18SRNA基因MIM:359724；
ACTB基因MIM:102630；
GAPDH MIM:138400；
HPRT1基因MIM:308000；
B2M基因MIM:109700；
RPL27基因MIM:607526。
表1：本发明中结肠癌检测基因检测核酸扩增的序列列表：
| 结肠癌检测基因 | 探针 | 探针 |
| APC | Tgcgagaagttggaagtgtg | tcagtgcaatgtgctgacaa |
| P53 | tttgggtctttgaacccttg | ccacaacaaaacaccagtgc |
| K-ras | gtcaatcggtgactgtgtgg | gaactgcagtgcacctttca |
| MLH1 | cagaggaagatggtcccaaa | caggttcccttcctcatcaa |
| POLE | accctgactgtccaaacctg | acgtctgagctccctgaaaa |
| SMAD4 | gatacgtggacccttctgga | acctttgcctatgtgcaacc |
| FAM123B | gggaatgccactgtgagttt | tcagagtcagagctgcagga |
| β-catenin | acctttcccatcatcgtgag | aatccactggtgaaccaagc |
| SOX9 | cccttcaacctcccacacta | tggtggtcggtgtagtcgta |
| TCF7L1 | gagtcggagaaccagagcag | tgtcctgaggccttctcact |
| 18SRNA | TGTGCCGCTAGAGGTGAAATT | TGGCAAATGCTTTCGCTTT |
| ACTB | gatgagattggcatggcttt | caccttcaccgttccagttt |
| GAPDH | acagtcagccgcatcttctt | acgaccaaatccgttgactc |
| HPRT1 | gaccagtcaacaggggacat | ctgcattgttttgccagtgt |
| B2M | gtgctcgcgctactctctct | tctctgctggatgacgtgag |
| RPL27 | ccctggaagaggggatagtc | tgtagagcacagcacccttg |
本发明可以使结肠癌的基因检测更加全面准确，而所检测的基因数目却不超过15个，不仅可以显著的降低基因芯片的设计和生产成本，还可以增加结肠癌的检测灵敏度，简化实验操作过程和费用。采用本发明的方案，对早期结肠癌的主要驱动基因全都覆盖了，阳性检出率可以高达60-90%，虽然结肠癌的检出率会有个体差异，但是由于结肠癌基因覆盖全面，所选的基因都是最新的研究成果，所以癌症检出率会高达60-90%，加上每张芯片可以同时检查6个表本，一台高通量萤光PCR仪一次可以运行4块芯片，2小时的检测量是24个标本，按一天8小时算，一台qPCR仪可以检测100个标本，可以说这种芯片的检验量是很大的，其临床实用意义相当显著。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管本文较多地使用了术语，但并不排除使用其它术语的可能性。使用这些术语仅仅是为了更方便地描述和解释本发明的本质；把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。
Claims (6)
1.一种适用于结肠癌普查的核心基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的一组探针，其特征在于，该组探针包括序列表中SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列，
如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列包括12个结肠癌检测基因，12个结肠癌检测基因探针序列如下：APC探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2所述；P53探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4所述；K-ras探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：6所述；PI3CA探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：7-SEQID NO：8所述；MLH1探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：9-SEQ ID NO：10所述；POLE探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：11-SEQ ID NO：12所述；SMAD4探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：14所述；ARID1A探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：15-SEQID NO：16所述；FAM123B探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：17-SEQ ID NO：18所述；β-Catenin探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：19-SEQ ID NO：20所述；SOX9探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：21-SEQ ID NO：22所述；TCF7L1探针序列包括两条，分别如SEQ IDNO：23-SEQ ID NO：24所述。
2.根据权利要求1所述的适用于结肠癌普查的核心基因芯片，其特征在于，该组探针还包括序列表中SEQ ID NO：25-SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的适用于结肠癌普查的核心基因芯片，其特征在于，如SEQ IDNO：25-SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列包括6个看家基因，6个看家基因探针序列如下：18SRNA探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：25-SEQ ID NO：26所述；ACTB探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：27-SEQ ID NO：28所述；GAPDH探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：29-SEQ ID NO：30所述；HPRT1探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：31-SEQ ID NO：32所述；B2M探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：33-SEQ ID NO：34所述；RPL27探针序列包括两条，分别如SEQ ID NO：35-SEQ ID NO：36所述。
4.根据权利要求3所述的适用于结肠癌普查的核心基因芯片，其特征在于，所述的固相载体上具有24列乘16行微阵列，其中1-6行中每一行的1-24列为序列表中SEQ ID NO：1-SEQID NO：24所示的核苷酸序列的排列；15-16行中每一行的1-24列为序列表中SEQ ID NO：25-SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列的重复排列；上述24列乘16行微阵列中1-12行为所检的6个样本的排列，13-14行为正常对照的所检样本，15-16行为看家基因对照的样本。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的适用于结肠癌普查的核心基因芯片，其特征在于，所述的固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯或载玻片中的任意一种。
6.一组适用于基因芯片方式普查结肠癌的核心基因探针，其特征在于，它包括序列表中SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列。
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