CN102443581A - 用于检测p53基因表达的引物对及其应用 - Google Patents
用于检测p53基因表达的引物对及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测p53基因表达的引物对及其应用。本发明提供了序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的特异引物对。所述特异引物对可用于制备检测p53基因表达的试剂盒，并用于检测p53基因表达情况。本发明引物对的基础上，开发了检测p53基因的一步法RT-PCR方法，并优化了检测条件和检测体系。与传统免疫学和生物学检测方法相比，本发明提供的检测p53基因表达的方法具有特异性强、灵敏度高、快速简便、检测结果稳定等优点，更加适合于实际生产中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测p53基因表达的引物对及其应用。
背景技术
P53蛋白及其编码基因p53在人类、猴、鸡和鼠等动物中相继发现后，对其进行了基因定位，人类p53基因定位于17P13.1，鼠P53定位于11号染色体，进化程度迥异的动物中，p53有异常相似的基因结构，约20Kb长，都由11个外显子和10个内含子组成，第1个外显子不编码，外显子2、4、5、7、8、分别编码5个进化上高度保守的结构域，p53基因5个高度保守区即第13～19、117～142、171～192、236～258、270～286编码区。p53基因转录成2.5KbmRNA，编码393个氨基酸蛋白，分子量为53KD。
30年来人类对p53的认识从它是一种肿瘤病毒蛋白，发展为一个庞大的基因家族；从一种抑癌基因，发展到几十种抑癌基因群体；从一条单一细胞通路，发展成多种细胞信号网络；从一种促细胞凋亡的功能，发展出生长、生殖、发育、代谢、增殖、转移、免疫、转录、调控、干细胞等无数功能；从与肿瘤相关，发展与心血管、代谢、遗传、神经、免疫、老化等多学科、多疾病相关。
在遗传稳定性方面，p53具有重要意义，在肿瘤细胞中，有70％以上的p53基因发生了突变或者表达减少，这些质或量的变化使得p53不能正常行使人体的基因卫士和细胞卫士，因此建立检测p53表达量的RT-PCR的方法对检测遗传稳定性具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测p53基因表达的引物对及其应用。
本发明提供的引物对为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的特异引物对。
所述特异引物对可用于制备检测p53基因表达的试剂盒。
本发明还保护一种检测p53基因表达的试剂盒，包括所述特异引物对。所述试剂盒还可包括标准品；所述标准品为序列表的序列3所示的DNA。所述试剂盒还可包括RNA提取试剂、RNA反转录试剂和PCR扩增试剂。
所述特异引物对可用于检测p53基因表达。
本发明还保护一种检测p53基因表达的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的RNA；
(2)将RNA进行一步法RT-PCR；
(3)检测PCR产物，确定p53基因的表达情况。
所述p53基因为如下(a)或(b)或(c)：
(a)具有序列表的序列3自5’末端第158-1308位核苷酸的DNA；
(b)序列表的序列3所示的DNA；
(c)GENBANK ACCESSION NO.NM 001127233.1所示的DNA。
所述方法中，每10μL所述一步法RT-PCR的反应体系中含有序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA各5pmol。所述方法中，每10μL所述一步法RT-PCR的反应体系中含有待测样本的RNA 1μL。所述方法中，每10μL所述一步法RT-PCR的反应条件为：50℃30分钟；94℃2分钟；94℃45秒，55℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃10分钟。所述方法中，具体可采用蓝罡生物科技有限公司的产品目录号为LGAR001的试剂盒提取待测样本的RNA，采用TAKARA公司的产品目录号为DRR024AJ的试剂盒进行所述一步法RT-PCR。待测样本具体可为小鼠的各个组织，小鼠脾脏、肝脏或脑组织。
本发明公开了用于检测p53基因表达的特异引物对。在特异引物对的基础上，开发了检测p53基因的一步法RT-PCR方法，并优化了检测条件和检测体系。与传统免疫学和生物学检测方法相比，本发明提供的检测p53基因表达的方法具有特异性强、灵敏度高、快速简便、检测结果稳定等优点，更加适合于实际生产中的应用。
附图说明
图1为RNA纯化体系选择；1：RNA液；2：RNA液的2倍稀释液；3：RNA液的10倍稀释液；4：RNA液的20倍稀释液；5：RNA液的50倍稀释液；6：RNA液的100倍稀释液。
图2为优化PCR反应循环数；1：RNA液；2：RNA液的10倍稀释液；3：RNA液的100倍稀释液。
图3为优化引物浓度；1：RNA液；2：RNA液的10倍稀释液；3：RNA液的100倍稀释液。
图4为优化RNA模板量；1：RNA液；2：RNA液的10倍稀释液；3：RNA液的100倍稀释液。
图5为采用优化后的各个参数后得到的标准图谱；1：RNA液；2：RNA液的10倍稀释液；3：RNA液的100倍稀释液。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。C57小鼠：购自北京维通利华实验动物技术有限公司。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、特异引物对的设计
设计一对用于检测p53基因表达量的特异引物对如下：
P53-A1(上游引物)：5’-TGAAGCCCTCCGAGTGTC-3’；
P53-A2(下游引物)：5’-TCGGGTGGCTCATAAGGT-3’。
实施例2、特异引物对应用时相关参数的选择
实施例中，均采用序列表的序列3所示DNA作为PCR体系中的阳性对照模板。
一、RNA纯化体系选择
1、分别采用TRIZOL法(TRIZOL Reagent，Invitrogen，Cat no：15596-018，Lotno：13706)和RNA抽提试剂盒(蓝罡生物科技有限公司产品：LGAR001，动物组织总RNA纯化试剂盒)提取C57小鼠脾脏的RNA。C57小鼠脾脏的质量为0.1g，获得RNA的浓度在3000ng/μL-42000ng/μL之间。
2、用50μL DEPC水溶解提取的RNA，进一步稀释成为1μg/μL RNA溶液。
3、将1μg/μL RNA溶液分别进行2倍、10倍、20倍、50倍、100倍稀释，得到各个浓度的稀释液。
4、以0.4μL稀释液为模板，采用One step RT-PCR试剂盒(TAKARA公司，目录号DRR024AJ)和实施例1的特异引物对进行一步法RT-PCR，PCR反应体系见表1，PCR反应条件见表2。
表1一步法RNA PCR反应体系
| 10×one step RNA PCR Buffer | 1μL |
| 25mM MgCl2 | 2μL |
| 10mM dNTP | 1μL |
| RNase inhibitor(40u/μL) | 0.2μL |
| AMV RTase XL(5u/μL) | 0.2μL |
| AMV optimized Taq(5u/μL) | 0.2μL |
| P53-A1 | 0.4μL |
| P53-A2 | 0.4μL |
| RNA | 0.4μL |
| DEPC H2O | 4.2μL |
| 共计 | 10μL |
表1中的10μL反应体系中，含有P53-A1和P53-A2各10pmol。
表2PCR反应条件
PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳图见图1，目标条带1151bp。RNA试剂盒提取RNA纯度更高，且PCR扩增产物量与稀释倍数之间线性关系更好，而且方法稳定，便于实际生产中的应用。因此，在后面的实验中采用RNA抽提试剂盒(蓝罡生物科技有限公司产品：LGAR001，动物组织总RNA纯化试剂盒)提取样本RNA。
二、优化PCR反应循环数
1、采用RNA抽提试剂盒(蓝罡生物科技有限公司产品：LGAR001，动物组织总RNA纯化试剂盒)提取C57小鼠脾脏的RNA。
2、用DEPC水溶解步骤1提取的RNA，得到1μg/μL浓度的RNA溶液。
3、将RNA液分别进行10倍、100倍稀释，得到稀释液。
4、分别将RNA溶液、10倍稀释液和100倍稀释液作为模板分别进行20个循环数和30个循环数的一步法RT-PCR反应，采用One step RT-PCR试剂盒和实施例1的特异引物对，PCR反应体系见表1，除循环数以外的PCR反应条件见表2。
PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳图见图2，目标条带1151bp。20个循环数的扩增产物条带很弱。当进行30个循环时，扩增产物的条带明暗随着其稀释陪数的增加逐渐变弱，有很好的线性关系。因此，优选使用30个循环数。
三、优化引物浓度
引物的量影响检测体系的灵敏度。引物量过多会造成引物二聚体，影响电泳结果；引物量过少会影响检测体系的灵敏度，扩增产物量太少。
1、采用RNA抽提试剂盒(蓝罡生物科技有限公司产品：LGAR001，动物组织总RNA纯化试剂盒)提取C57小鼠脾脏的RNA。
2、用DEPC水溶解步骤1提取的RNA，得到1μg/μL浓度的RNA溶液。
3、将RNA液分别进行10倍、100倍稀释，得到稀释液。
4、分别将RNA溶液、10倍稀释液和100倍稀释液作为模板，采用One step RT-PCR试剂盒和实施例1的特异引物对进行一步法RT-PCR反应；PCR反应条件见表2；PCR反应体系见表3。针对每种模板，分别采用三种引物浓度如下：表3中的10μL反应体系中，含有P53-A1和P53-A2各10pmol；表3中的10μL反应体系中，含有P53-A1和P53-A2各5pmol；表3中的10μL反应体系中，含有P53-A1和P53-A2各3pmol。
表3一步法RNA PCR反应体系
| 10×one step RNA PCR Buffer | 1μL |
| 25mM MgCl2 | 2μL |
| 10mM dNTP | 1μL |
| RNase inhibitor(40u/μL) | 0.2μL |
| AMV RTase XL(5u/μL) | 0.2μL |
| AMV optimized Taq(5u/μL) | 0.2μL |
| P53-A1 | 0.4μL |
| P53-A2 | 0.4μL |
| RNA | 0.4μL |
| DEPC H2O | 4.2μL |
| 共计 | 10μL |
PCR产物的1μg/μL琼脂糖凝胶电泳图见图3，目标条带1151bp。引物含量为5pmol时，扩增产物量及其线性梯度均为最好。因此，优选使用5pmol的引物使用量。
四、优化RNA模板量
RNA模板量影响检测体系的好坏，RNA使用量少扩增产物量太少，RNA使用量过多PCR反应达到饱和，扩增产物和样品稀释倍数之间的线性关系不好。
1、采用RNA抽提试剂盒(蓝罡生物科技有限公司产品：LGAR001，动物组织总RNA纯化试剂盒)提取C57小鼠脾脏的RNA。
2、用DEPC水溶解步骤1提取的RNA，得到1μg/μL浓度的RNA溶液。
3、将RNA液分别进行10倍、100倍稀释，得到稀释液。
4、分别将RNA溶液、10倍稀释液和100倍稀释液作为模板，采用One step RT-PCR试剂盒和实施例1的特异引物对进行一步法RT-PCR反应；PCR反应体系见表4，PCR反应条件见表2。
表4一步法RNA PCR反应体系
| 10×one step RNA PCR Buffer | 1μL |
| 25mM MgCl2 | 2μL |
| 10mM dNTP | 1μL |
| RNase inhibitor(40u/μL) | 0.2μL |
| AMV RTase XL(5u/μL) | 0.2μL |
| AMV optimized Taq(5u/μL) | 0.2μL |
| P53-A1 | 0.4μL |
| P53-A2 | 0.4μL |
| RNA | 0.4μL或1μL |
| DEPC H2O | 4.2μL或3.6μL |
| 共计 | 10μL |
表4中的10μL反应体系中，含有P53-A1和P53-A2各5pmol。
PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳图见图4，目标条带1151bp。RNA模板为1μL时，扩增产物条带明显，且扩增产物和样品稀释倍数之间的线性关系比较好。因此，优选使用1μL RNA为模板。
五、优化后的反应参数
通过优化样本RNA纯化系统、引物浓度、RNA模板量、一步法RT-PCR反应循环数，最终确定了标准化的检测系统如下：(1)使用RNA抽提试剂盒提取样本RNA；(2)一步法RT-PCR反应体系使用5pmol/L引物；(3)一步法RT-PCR反应体系使用1μL RNA模板；(4)一步法RT-PCR反应体系使用30个循环数。
1、采用RNA抽提试剂盒(蓝罡生物科技有限公司产品：LGAR001，动物组织总RNA纯化试剂盒)提取实验样本(C57小鼠脾脏)的RNA。
2、用DEPC水溶解步骤1提取的RNA，得到为浓度1μg/μL的RNA溶液。
3、将RNA溶液分别进行10倍、100倍稀释，得到稀释液。
4、分别将RNA溶液、10倍稀释液和100倍稀释液作为模板，采用One step RT-PCR试剂盒和实施例1的特异引物对进行一步法RT-PCR反应；PCR反应体系见表5，PCR反应条件见表2。
表5一步法RNA PCR反应体系
| 10×one step RNA PCR Buffer | 1μL |
| 25mM MgCl2 | 2μL |
| 10mM dNTP | 1μL |
| RNase inhibitor(40u/μL) | 0.2μL |
| AMV RTase XL(5u/μL) | 0.2μL |
| AMV optimized Taq(5u/μL) | 0.2μL |
| P53-A1 | 0.4μL |
| P53-A2 | 0.4μL |
| RNA | 1μL |
| DEPC H2O | 3.6μL |
| 共计 | 10μL |
表4中的10μL反应体系中，含有P53-A1和P53-A2各5pmol。
PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳图见图5，目标条带1151bp。
Claims (10)
1.序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的特异引物对。
2.权利要求1所述特异引物对在制备检测p53基因表达的试剂盒中的应用；所述p53基因为如下(a)或(b)或(c)：
(a)具有序列表的序列3自5’末端第158-1308位核苷酸的DNA；
(b)序列表的序列3所示的DNA；
(c)GENBANK ACCESSION NO.NM_001127233.1所示的DNA。
3.检测p53基因表达的试剂盒，包括权利要求1所述特异引物对；
所述p53基因为如下(a)或(b)或(c)：
(a)具有序列表的序列3自5’末端第158-1308位核苷酸的DNA；
(b)序列表的序列3所示的DNA；
(c)GENBANK ACCESSION NO.NM_001127233.1所示的DNA。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括标准品；所述标准品为序列表的序列3所示的DNA。
5.如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括RNA提取试剂、RNA反转录试剂和PCR扩增试剂。
6.权利要求1所述特异引物对在检测p53基因表达中的应用；所述p53基因为如下(a)或(b)或(c)：
(a)具有序列表的序列3自5’末端第158-1308位核苷酸的DNA；
(b)序列表的序列3所示的DNA；
(c)GENBANK ACCESSION NO.NM_001127233.1所示的DNA。
7.一种检测p53基因表达的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的RNA；
(2)将RNA进行一步法RT-PCR；
(3)检测PCR产物，确定p53基因的表达情况；
所述p53基因为如下(a)或(b)或(c)：
(a)具有序列表的序列3自5’末端第158-1308位核苷酸的DNA；
(b)序列表的序列3所示的DNA；
(c)GENBANK ACCESSION NO.NM_001127233.1所示的DNA。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：每10μL所述一步法RT-PCR的反应体系中含有序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA各5pmol。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：每10μL所述一步法RT-PCR的反应条件为：50℃30分钟；94℃2分钟；94℃45秒，55℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃10分钟。
10.如权利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于：采用蓝罡生物科技有限公司的产品目录号为LGAR001的试剂盒提取待测样本的RNA；采用TAKARA公司的产品目录号为DRR024AJ的试剂盒进行所述一步法RT-PCR。
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