CN103409408A - 快速获取鹅铁蛋白重链基因编码区序列及定量检测其表达的方法及其引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速获取铁蛋白重链基因编码区序列及定量检测其表达的方法及其引物，包括以下步骤：提取鹅组织总RNA并反转录；设计FTH编码区序列引物FTH-L（SEQ ID NO:1-2）和检测FTH表达规律的引物FTH-S（SEQ ID NO:3-4）；通过RT-PCR扩增，产物回收纯化，目的基因连接和转化，阳性菌落的筛选和测序，获取FTH编码区序列，测序鉴定荧光定量PCR引物。该技术成本低、效率高，只需一次克隆即可获得完整编码区序列；并可快速、准确检测鹅不同组织和不同发育时期样品中FTH的表达规律，为阐明鹅FTH结构和功能，以及鹅机体内铁代谢机制的研究奠定了理论基础。

Description

快速获取鹅铁蛋白重链基因编码区序列及定量检测其表达的方法及其引物

技术领域

本发明涉及的是一种快速获取鹅铁蛋白重链基因编码区序列及定量检测其表达的方法及其引物。

背景技术

铁元素是细胞生长、增殖及维持生物机体机能活动所必需的微量元素之一，在细胞DNA合成、电子传递、氧气运输等过程中发挥重要作用。但是，如果铁超载可以潜在诱导氧自由基的生成，导致细胞损伤。因此，细胞铁稳态的维持和调节成为目前铁代谢研究方面的中心环节。铁蛋白（Ferritin）是一种保守性较高的多功能、多亚基蛋白，在维持细胞内铁稳态过程中发挥着双重作用：一方面如果细胞中铁含量增多，铁蛋白会螯合细胞质中的游离铁，细胞内过多的铁被封闭起来，细胞内铁的稳态得以维持，保护细胞免受游离金属的毒性作用；另一方如果当外源铁不足时，被铁蛋白存储的铁可以释放出来以供细胞利用。铁蛋白及其受体对于调控铁摄取、贮存以及维持细胞内正常铁浓度具有重要作用。铁蛋白含有重链亚基（ferrintin heavy chain, FTH）和轻链亚基（ferritin light chain, FTL），FTH负责结合Fe²⁺，催化铁氧化；FTL与铁的长期贮藏有关。研究表明，产蛋期鹅卵巢和肝脏组织FTH的表达水平均显著高于产蛋前期，提示FTH可能对鹅卵巢发育和功能具有重要的调控作用。然而，目前有关鹅FTH基因的结构和功能仍不清楚。

目前用于克隆较长目的基因的常用方法主要包括分段克隆和快速扩增cDNA末端技术（Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE）。分段克隆以目的基因保守区设计多对引物，每对引物所扩增的目的基因片段有重叠，然后将所有分段的片段进行克隆、测序、拼接，获得完整的目的片段。最后再以拼接序列为模板设计一对引物来验证所获得的基因是否为目的基因。RACE技术是基于PCR技术基础之上，分别在cDNA序列的3’末端和5’末端设计特定引物，然后进行克隆，从而获得cDNA全长序列的方法。总之，分段克隆和RACE技术都需要做许多次PCR和克隆工作，操作过程繁琐，工作量大，耗时长，且成本高。

半定量反转录－聚合酶链式反应（Semi-Quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction, SQRT-PCR）是指将mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，取等量的PCR产物，在同一块琼脂糖凝胶上进行电泳检测，然后通过比较电泳图中目的基因和内参基因条带的光密度值计算目的基因表达量（或拷贝数）的定量检测技术。SQRT-PCR技术采用的PCR反应终点法。因此，现有方法只能在PCR反应结束时，获得目的基因片段拷贝数，不能全程了解定量过程中的变化。由于受到半定量电泳操作的影响、凝胶成像系统和光密度分析的分辨率和准确性的限制，定量结果会出现较大偏差和误差，不能十分准确的检测目的基因表达量。

实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time Quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction， QRT-PCR）是指在PCR反应体系中加入荧光染料（如SYBR Green），随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，这个荧光染料所发出的信号也会随之发生变化，每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度的变化来监测产物量的变化，从而可以实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。QRT-PCR技术可以对整个PCR反应进行全程实时监测，因此具有结果可靠、准确性高等优点。

因此，为阐明鹅FTH基因的结构和功能，揭示鹅机体内铁代谢的分子调控机制，提高铁代谢相关研究的效率，降低研究成本、提高结果可靠性和准确性，建立简便、快速获取鹅FTH全长编码区序列及定量检测FTH基因表达的方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一在于针对上述技术不足提供一种快速获取鹅FTH基因编码区序列的方法，该方法操作简便、成本低、效率高。

为实现上述目的，本发明的技术方案为。

根据GenBank上原鸡FTH基因的编码序列设计并合成特异性引物FTH-L，其序列为：上游引物：5’GTTCCTGCGT CAACAGTGCT TGGAC3’；下游引物：5’TTATTGGATG GAGGGCAGTA CACA3’（如SEQ ID NO:1-2所示）；通过RT-PCR扩增，PCR产物的回收纯化，目的基因的连接和转化，阳性菌落的筛选和测序，获取FTH基因全长编码区序列；PCR反应参数设置：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30 cycles；72 ℃ 10 min。

本发明的目的之二在于提供一种快速定量检测鹅FTH基因表达规律的方法及其引物，该方法灵敏度高、特异性强、成本低并且操作简便。

为实现上述目的，本发明的技术方案为。

根据上述方法获取的FTH基因编码序列设计并合成特异性引物FTH-S，其序列为：上游引物：5’CAGGGTGGTG TTCGTGGCA3’；下游引物：5’CTGGATGAGC AGGTGAAGG3’（如SEQ ID NO:3-4所示）；通过RT-PCR扩增，实时荧光定量PCR构建FTH基因荧光定量PCR引物的标准曲线和溶解曲线，然后检测鹅不同部位和不同发育时期的组织样品中FTH表达量；PCR反应参数设置：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 cycles。

本发明专利公开了一种应用RT-PCR和基因克隆等常规分子生物学技术即可快速获取鹅FTH基因完整编码区序列的方法及其引物，该技术方案相比较分段克隆和RACE技术而言，工作量小、耗时短、只需克隆一次即可获得完整编码区序列，同时还具有成本低、效率高、结果准确的优势；同时本发明专利还建立了一套定量检测鹅FTH基因表达规律的方法及其引物，应用该技术方案及其引物，可快速、准确的对鹅不同组织、不同发育时期的样品进行定量检测，简化了试验操作过程、节约了试验经费、提高了检测效率。本发明专利为阐明鹅FTH基因结构和功能，以及鹅机体内铁代谢机制的研究奠定了理论基础。

附图说明

图1是FTH全长编码区序列RT-PCR扩增电泳图。Marker：DL2000 DNA Marker，该图片证实所设计的引物可扩增出821 bp的FTH基因的全长编码区序列。

图2是本发明FTH开放阅读框及其氨基酸序列图。图中小写字母表示cDNA序列，大写字母表示氨基酸序列。

图3是FTH荧光定量溶解曲线。该图片证实所设计FTH荧光定量引物的溶解曲线为单一峰，说明该引物的特异性良好，可以应用SYBR染料法进行准确定量。

图4是FTH荧光定量标准曲线。图中PCR反应效率为98.4 %，介于95 %和105 %之间；标准曲线的线性拟合程度为0.998，介于0.95和1之间，表明该PCR反应效率高并且标准曲线的线性拟合程度好。因此，所设计的FTH荧光定量PCR引物可以准确的检测目的基因表达量。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明的范围仅限于下述实施例。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1鹅FTH基因全长编码区序列的克隆。

四川白鹅卵巢组织总RNA提取的步骤如下。

（1）将鹅卵巢组织样品从-80 ℃冰箱中取出，在液氮中研磨后，将50~100 mg的组织样品置于含有1 mL RNAiso Plus（宝生物工程有限公司，大连）的Eppendorf管中，颠倒混匀后，室温静置10 min。

（2）4 ℃条件下，12, 000 g离心10 min，将上清液转入另一无RNA酶的Eppendorf管中，加入200 μL氯仿，振荡混匀后于冰盒上静置15 min。

（3）4 ℃条件下，12,000 g离心15 min，吸取上层水相，置于另一无RNA酶的Eppendorf管中，加入所吸取上清等体积（400~500 μL）的异丙醇混匀，冰盒上静置10 min。

（4）4 ℃条件下，12,000 g离心10 min，弃上清，加入1 mL的75 %乙醇，温和振荡，悬浮沉淀后，4 ℃条件下，8,000 g离心5 min，真空干燥后，用30 μL DEPC处理水溶解RNA样品。

反转录反应的步骤如下。

在一无菌无RNA酶的PCR管中加入9.0 μL的RNase Free dH₂O，1.0 μL的Oligo dT Primer（50 μM），1.0 μL的Random 6 mers（100 μM），4.0 μL的5×PrimeScript^? Buffer，4.0 μL的鹅卵巢组织总RNA，1.0 μL的PrimeScript? RT Enzyme Mix I，振荡混匀并瞬离后置于PCR仪中，37 ℃条件下放置15 min，然后85 ℃条件下放置5 s，将反转录反应所获得的模板cDNA置于-20 ℃冰箱保存备用。

PCR反应步骤如下。

根据GenBank上原鸡FTH基因编码序列设计并合成特异性引物FTH-L，引物序列为：FTH-L上游引物：5’GTTCCTGCGT CAACAGTGCT TGGAC3’；FTH-L下游引物：5’TTATTGGATG GAGGGCAGTA CACA3’。

在一无菌无RNA酶的PCR管中加入13.5 μL的灭菌去离子水，2.0 μL的FTH-L上游引物（10 μmol/L），2.0 μL的FTH-L下游引物（10 μmol/L），7.5 μL的模板cDNA，25.0 μL的Taq DNA Enzyme Master Mix，振荡混匀并瞬离后置于PCR仪中。扩增FTH全长编码区序列（FTH-L引物）的PCR反应循环参数为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30 cycles；72 ℃ 10 min。PCR反应结束后，取5 μL PCR产物在1.0 % 琼脂糖凝胶（含染料）电泳检测PCR结果。

PCR产物胶回收步骤如下。

（1）在紫外灯下将含目的片段条带迅速切下，胶块要切割成小块，置于1.5 mL的离心管中，加入300 μL Binding Buffer，置于60 ℃水浴8 min，待凝胶完全溶化后将琼脂糖凝胶溶液移入吸附柱，室温下12000 g离心1 min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱置于同一收集管中；在吸附柱中加入300 μL Binding Buffer，室温下12000 g离心1 min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

（2）在吸附柱中加入700 μL SPW Buffer，室温静置2 min后，室温下12000 g离心1 min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。再重复该步骤一次。将有吸附柱的空收集管13000 g离心1 min。

（3）把吸附柱移入一干净的1.5 mL离心管中，添加加50 μL DNA Elution Buffer，13000 g离心1.5 min。将1.5mL离心管中的回收产物贮存于-20℃中备用。

连接反应的步骤如下。

在一无菌无RNA酶的PCR管中加入4.5 μL的PCR回收产物，0.5 μL的pMD19-T载体，5.0 μL的SolutionⅠ，振荡混匀瞬时离心后，16 ℃水浴反应30 min。

转化步骤如下。

在融化的250 mL LB固体培养基中加入250 μL Amp （100 mg/mL），250 μL X-gal（20 mg/mL），25 μL IPTG（200 mg/mL），混匀后，铺制平板。取一支感受态细胞（100 μL），置于冰中解冻，加入连接反应液10 μL，混匀，在冰上放置30 min。42℃水浴中放置80 s，然后快速转移至冰浴中，使细胞冷却3 min，再加入预先保存在37℃的LB培养基800 μL（不含抗生素），混合后置于37℃摇床振荡培养1 h（220 r/min）。

室温下4000 g离心10 min，丢弃700 μL上清液，用移液器轻轻吹打悬浮沉淀，转移至37℃预热的LB培养基平板上，用涂布棒均匀涂布，置于室温直至（正置）液体被完全吸收，倒置于37℃的培养箱中培养16 h，即可观察到蓝白相间的菌落。

阳性克隆鉴定及测序步骤如下。

（1）将长有菌落的LB琼脂培养板于4℃放置2 h，观察菌落生长情况。按照1 mL的LB培养基添加1 μL氨苄青霉素（100 mg/mL）的比例配制培养液，每个1.5 mL EP管中加入1 mL培养液，用无菌牙签挑重组单菌落（白斑）接种于培养液中，37 ℃在摇床上以220 r/min中等摇速培养12 h。

（2）克隆FTH全长编码区序列（FTH-L引物）的菌落PCR反应循环参数为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30 cycles；72 ℃ 10 min。

反应结束后取PCR产物5 μL的 PCR产物1 %琼脂糖凝胶电泳，选取阳性克隆菌液送公司宝生物工程有限公司测序（大连）。

实验结果。

从四川白鹅卵巢组织中扩增出821 bp的目的基因条带，图3中目的基因条带清楚、明亮，表明本发明所设计的扩增FTH基因全长编码区序列的引物特异性强，PCR反应具有可行性。

实施例2定量检测鹅FTH基因表达规律的方法及其引物。

根据实施例1所获得的鹅FTH基因全长编码序列设计并合成实时荧光定量PCR反应的特异性引物FTH-S，引物序列为：FTH-S上游引物：5’CAGGGTGGTG TTCGTGGCA3’；FTH-S下游引物：5’CTGGATGAGC AGGTGAAGG3’。

在一无菌无RNA酶的PCR管中加入13.5 μL的灭菌去离子水，2.0 μL的FTH-L上游引物（10 μmol/L），2.0 μL的FTH-L下游引物（10 μmol/L），7.5 μL的模板cDNA（实施例1所获得的cDNA模板），25.0 μL的Taq DNA Enzyme Master Mix，振荡混匀并瞬离后置于PCR仪中。扩增短片段FTH（FTH-S引物）的PCR反应循环参数如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 cycles，72 ℃ 10 min。PCR反应结束后，取5 μL PCR产物在1.0 % 琼脂糖凝胶（含染料）电泳检测PCR结果。

PCR产物胶回收步骤如下。

（1）在紫外灯下将含目的片段条带迅速切下，胶块要切割成小块，置于1.5 mL的离心管中，加入300 μL Binding Buffer，置于60 ℃水浴8 min，待凝胶完全溶化后将琼脂糖凝胶溶液移入吸附柱，室温下12000 g离心1 min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱置于同一收集管中；在吸附柱中加入300 μL Binding Buffer，室温下12000 g离心1 min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

（2）在吸附柱中加入700 μL SPW Buffer，室温静置2 min后，室温下12000 g离心1 min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。再重复该步骤一次。将有吸附柱的空收集管13000 g离心1 min。

（3）把吸附柱移入一干净的1.5 mL离心管中，添加加50 μL DNA Elution Buffer，13000 g离心1.5 min。将1.5mL离心管中的回收产物贮存于-20℃中备用。

连接反应的步骤如下。

在一无菌无RNA酶的PCR管中加入4.5 μL的PCR回收产物，0.5 μL的pMD19-T载体，5.0 μL的SolutionⅠ，振荡混匀瞬时离心后，16 ℃水浴反应30 min。

转化步骤如下。

在融化的250 mL LB固体培养基中加入250 μL Amp （100 mg/mL），250 μL X-gal（20 mg/mL），25 μL IPTG（200 mg/mL），混匀后，铺制平板。取一支感受态细胞（100 μL），置于冰中解冻，加入连接反应液10 μL，混匀，在冰上放置30 min。42℃水浴中放置80 s，然后快速转移至冰浴中，使细胞冷却3 min，再加入预先保存在37℃的LB培养基800 μL（不含抗生素），混合后置于37℃摇床振荡培养1 h（220 r/min）。

室温下4000 g离心10 min，丢弃700 μL上清液，用移液器轻轻吹打悬浮沉淀，转移至37℃预热的LB培养基平板上，用涂布棒均匀涂布，置于室温直至（正置）液体被完全吸收，倒置于37℃的培养箱中培养16 h，即可观察到蓝白相间的菌落。

阳性克隆鉴定及测序步骤如下。

（1）将长有菌落的LB琼脂培养板于4℃放置2 h，观察菌落生长情况。按照1 mL的LB培养基添加1 μL氨苄青霉素（100 mg/mL）的比例配制培养液，每个1.5 mL EP管中加入1 mL培养液，用无菌牙签挑重组单菌落（白斑）接种于培养液中，37 ℃在摇床上以220 r/min中等摇速培养12 h。

（2）克隆短片段FTH（FTH-S引物）的菌落PCR反应循环参数为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 cycles，72 ℃ 10 min。

（3）反应结束后取PCR产物5 μL的 PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳，选取阳性克隆菌液送公司测序。

荧光定量标准曲线制备的步骤如下。

（1）将AxyPrep质粒DNA提取试剂盒中的RNase A全部加入到Buffer S1 中，混合均匀，4 ℃贮存。取4 mL在LB培养基中培养过夜的菌液，12,000 g离心1 min，弃上清，加250 μL Buffer S1 悬浮细菌沉淀，再加250 μL Buffer S2，上下翻转4次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，再加350 μL Buffer S3，上下翻转混合8次，12,000 g离心10 min。

（2）吸取上述步骤离心后的上清液并转移到制备管（置于试剂盒内提供的2 mL离心管中），12,000 g离心1 min，弃滤液，将制备管置回离心管，加500 μL Buffer W1，12,000 g离心1 min，弃滤液，再将制备管置回离心管，加700 μL Buffer W2，12,000 g离心1 min，弃滤液。

（3）以同样的方法再用700 μL Buffer W2洗涤一次，弃滤液，将制备管置回2 mL离心管中，12,000 g离心1 min，再将制备管移入新的1.5 mL离心管中，在制备管膜中央加80 μL Eluent或去离子水，室温静置1 min，12,000 g离心1 min，获得FTH-S质粒样品。

（4）取5 μL质粒，1.0 %的琼脂糖/EtBr凝胶电泳分析抽提质粒的质量，其余质粒置于-20 ℃冰箱中保存备用。

（5）把提取好的FTH-S质粒原液进行10倍系列稀释，稀释到原液的10^-3~10^-7倍，以FTH-S质粒作模板进行荧光定量PCR，制备标准曲线。荧光定量PCR反应体系：总体积25 μL，灭菌去离子H₂O，4.25 μL，FTH-S上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，FTH-S下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，质粒DNA模板（50 ng/μL）1.0 μL，SYBR 荧光染料6.25 μL。PCR 反应程序为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s（采集荧光信号），40个循环，绘制溶解曲线。

实时荧光定量PCR步骤如下。

荧光定量PCR反应体系：总体积25 μL，灭菌去离子H₂O，4.25 μL，FTH-S上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，FTH-S下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，cDNA模板（50 ng/μL）1.0 μL，SYBR 荧光染料6.25 μL。PCR 反应程序为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s（采集荧光信号），40个循环，绘制溶解曲线。

定量检测鹅不同组织或不同发育时期鹅组织样品中FTH的表达量，根据荧光定量PCR检测出目的基因的Ct值，利用Excel和SAS 9.2统计分析软件进行数据整理和统计分析。鹅组织样品中FTH基因表达量的计算方法采用2^-△△Ct法。

实验结果。

溶解曲线呈现单一峰，说明实时荧光定量PCR引物的特异性良好，可以应用SYBR染料法进行准确的定量检测，见图3。标准曲线的R²=0.998，表示所构建标准曲线的线性拟合程度良好；标准曲线的E=98.4 %，表示实时荧光定量PCR反应效率高，该PCR反应可以准确的检测目的基因的表达量，见图4。总之，本发明建立的定量检测FTH基因表达规律的方法及其引物具有快速、简便、结果准确的优势。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  申请人

 

<120>  快速获取鹅铁蛋白重链基因编码区序列及定量检测其表达的方法及其引物

 

<130> 

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  25

<212>  DNA

<213>  FTH-L Forward

 

<400>  1

gttcctgcgt caacagtgct tggac                                             25

 

 

<210>  2

<211>  24

<212>  DNA

<213>  FTH-L Reverse

 

<400>  2

ttattggatg gagggcagta caca                                              24

 

 

<210>  3

<211>  19

<212>  DNA

<213>  FTH-S Forward

 

<400>  3

cagggtggtg ttcgtggca                                                    19

 

 

<210>  4

<211>  19

<212>  DNA

<213>  FTH-S Reverse

 

<400>  4

ctggatgagc aggtgaagg                                                    19

 

 

<210>  5

<211>  821

<212>  DNA

<213>  FTH全长编码区序列

 

<400>  5

gttcctgcgt caacagtgct tggacggaac cggccgcgct cgggcccgcc gcctcactac        60

 

caccaccagc cgcacaccga caccgcagcc tctcctctca cggcagcgcg atggctaccc       120

 

ctctctccca ggtgcgccag aactaccacc aggactgcga agcggccgtc aaccgccaga       180

 

tcaacctgga gctctacgcg tcctacgtgt acctcagcat gtcctactac tttgaccggg       240

 

atgatgtggc tctgaaaaac tttgccaagt acttcctgca ccagtcccac gaggaacgtg       300

 

agcatgctga gaagctgatg aagctgcaga atcagcgggg cggccgcatc ttcttgcagg       360

 

acatcaagaa accagatcgt gatgactggg agaatggact gacagcaatg gagtgcgccc       420

 

tgcacctgga gaagaacgtg aaccagtcgc tgttggagct gcacaaattg gcaactgaaa       480

 

agaatgaccc gcatctgtgt gacttcattg aaactcacta cctggatgag caggtgaagg       540

 

ccatcaagga gctgggcgac catgtgacca acctgcgcaa gatgggggca cccaagtatg       600

 

gcatggcaga gtacctcttc gacaagcaca ccctagggca cagtgacaat gagagctgaa       660

 

gtcttgccac gaacaccacc ctgtgggttt caggaagatt cctgctttac tgtccagcag       720

 

tgcatgcatc ttcagctatc tagataaaca gttctcttac tctgtaccaa atatcagcct       780

 

tcttttctct tgtgttttgt gtactgccct ccatccaata a                           821

 

 

<210>  6

<211>  182

<212>  PRT

<213>  FTH编码氨基酸序列

 

<400>  6

 

Met Ala Thr Pro Leu Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp Cys

1               5                   10                  15     

 

Glu Ala Ala Val Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser Tyr

            20                  25                  30         

 

Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu

        35                  40                  45             

 

Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg Glu

    50                  55                  60                 

 

His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile

65                  70                  75                  80 

 

Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Arg Asp Asp Trp Glu Asn Gly

                85                  90                  95     

 

Leu Thr Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn Gln

            100                 105                 110        

 

Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Glu Lys Asn Asp Pro His

        115                 120                 125            

 

Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asp Glu Gln Val Lys Ala

    130                 135                 140                

 

Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly Ala

145                 150                 155                 160

 

Pro Lys Tyr Gly Met Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu Gly

                165                 170                 175    

 

His Ser Asp Asn Glu Ser

            180         

 

Claims (4)

1.一种快速获取鹅铁蛋白重链基因编码区序列的方法，其特征在于，根据GenBank上原鸡FTH基因的编码区序列设计并合成特异性引物FTH-L，其序列为：上游引物：5’GTTCCTGCGT CAACAGTGCT TGGAC3’；下游引物：5’TTATTGGATG GAGGGCAGTA CACA3’（如SEQ ID NO:1-2所示）；通过RT-PCR扩增，PCR产物的回收纯化，目的基因的连接和转化，阳性菌落的筛选和测序，获取FTH基因全长编码区序列；PCR反应参数设置：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30 cycles；72 ℃ 10 min。

2.一种定量检测鹅铁蛋白重链基因表达的方法，其特征在于，根据权利要求1所述方法获取的FTH基因编码序列设计并合成特异性引物FTH-S，其序列为：上游引物：5’CAGGGTGGTG TTCGTGGCA3’；下游引物：5’CTGGATGAGC AGGTGAAGG3’（如SEQ ID NO:3-4所示）；通过RT-PCR扩增，实时荧光定量PCR构建FTH基因荧光定量PCR引物的标准曲线和溶解曲线，然后检测鹅不同部位和不同发育时期的组织样品中FTH表达量；PCR反应参数设置：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 cycles。

3.一种如权利要求1所述的快速获取鹅FTH基因编码区序列的方法，其特征在于：设计了采用常规RT-PCR方法进行一次克隆即可快速获得FTH基因编码区序列的基因特异性引物，其序列如SEQ ID NO:1-2所示。

4.一种采用权利要求2所述的快速、直观并准确测定鹅FTH基因在不同组织和不同发育时期表达规律的方法及其中所设计的引物，其序列如SEQ ID NO:3-4所示。

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