CN115181733A - 相对定量分析猪铁蛋白重链fth1的肽段组合物及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物、方法及试剂盒。相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物，包括第一肽段、第二肽段、第三肽段、第四肽段和第五肽段；第一肽段的氨基酸序列如SEQID NO:1所示；第二肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；第三肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；第四肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；第五肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。能够在蛋白水平上，快速高效的定量检测猪源FTH1，提高了猪源FTH1的检测通量和效率。相较于基于抗体的Western Blot法具有更强的特异性。
Description
技术领域
本申请涉及生化分析技术领域，尤其涉及一种相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物及应用。
背景技术
在养猪业中，当猪受到应激源刺激，体内氧化-抗氧化平衡系统被破坏，氧化自由基及其活性衍生物(Reactive oxygen species，ROS)急剧增加，造成机体的氧化应激。氧化应激可通过引起猪肝脏损伤导致机体健康水平和产品品质下降，给养猪业带来经济损失。
铁蛋白重链(ferritin heavy chain，FTH1)具有铁氧化酶活性，在猪体内铁的储存和运输中发挥重要作用，可将Fe2+氧化成Fe3+，清除亚铁离子介导的自由基反应，保护细胞免受氧化性损伤，控制猪的细胞稳态。在猪体内，铁对正常细胞生长、增殖和能量代谢至关重要，而过量的铁是有害的，例如过量Fe2+可以通过Fenton反应产生过量的ROS，打破猪的细胞中的氧化平衡，导致氧化应激，引起DNA、蛋白质和脂质等损伤。因此，FTH1蛋白与猪的氧化应激息息相关。
因此，亟需深入研究猪的铁蛋白重链FTH1的相对定量分析方法。
发明内容
有鉴于此，本申请的目的在于提出一种相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物及应用。
基于上述目的，本申请提供了一种相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物，包括第一肽段、第二肽段、第三肽段、第四肽段和第五肽段；
其中，所述第一肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述第二肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述第三肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述第四肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述第五肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
在其中一些实施例中，所述第一肽段的母离子为438.76m/z，子离子为763.43m/z，616.37m/z和503.28m/z，子离子对应的碰撞能量为27V；所述第二肽段的母离子为1187.04m/z，子离子为1374.69m/z，1261.61m/z和1132.56m/z，子离子对应的碰撞能量为27V；所述第三肽段的母离子为647.86m/z，子离子为839.50m/z，752.47m/z和284.17m/z，子离子对应的碰撞能量为27V；所述第四肽段的母离子为773.36m/z；子离子为1140.54m/z，1003.48m/z，875.42m/z，子离子对应的碰撞能量为27V；所述第五肽段的母离子为673.32m/z，子离子为1035.50m/z，922.41m/z和785.35m/z，子离子对应的碰撞能量为27V。
本申请实施例还提供一种相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的方法，应用如前任一项所述的肽段组合物，对猪铁蛋白重链FTH1进行相对定量分析。
在其中一些实施例中，所述对猪铁蛋白重链FTH1进行相对定量分析包括：
提供不同组别的待测猪组织样品，分别进行蛋白提取和蛋白酶解处理，得到不同组别的待测肽段；
通过液相色谱-质谱联用的方法对所述不同组别的肽段组合物，分别进行检测；
比较不同组别的肽段组合物的检测结果，以对不同组别的待测猪组织样品中FTH1进行相对定量。
在其中一些实施例中，所述液相色谱-质谱联用的测定条件如下：
色谱条件：色谱柱：C18柱；流动相A：0.1％的甲酸水溶液，流动相B：0.1％的甲酸乙腈水溶液；梯度洗脱程序：0～2min，5％～10％B液；2～45min，10％～30％B液；45～55min，30％～100％B液；55～60min，100％B液；流速：250～450nl/min；
质谱条件：正离子模式采集数据；一级质谱扫描范围：300-1800m/z，质谱分辨率：60000(m/z 200)，AGC target：3e6，Maximum IT：200ms；MS2scans：20；Isolation window：1.6Th，质谱分辨率：30000(m/z 200)，AGC target：3e6，Maximum IT：120ms，MS2Activation Type：HCD，碰撞能量：27V。
在其中一些实施例中，还包括，在所述待测肽段中掺入同位素标记的内标肽段对所述待测肽段进行定量分析。
在其中一些实施例中，所述同位素标记的内标肽段为PRTC：SAAGAFGPELSR(13C6 15N4,+10Da)。
本申请实施例还提供一种用于相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的试剂盒，所述试剂盒中含有用于检测如前任一项所述的肽段组合物的试剂。
在其中一些实施例中，所述试剂包括第一肽段标准品、第二肽段标准品、第三肽段标准品、第四肽段标准品、第五肽段标准品、蛋白提取试剂和蛋白酶解试剂。
从上面所述可以看出，本申请提供的相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物、方法及试剂盒，通过包含第一肽段、第二肽段、第三肽段、第四肽段和第五肽段的肽段组合物，能够在蛋白水平上，使用液质联用仪特异检测并对FTH1定量分析，能够快速高效的定量检测猪源FTH1，提高了猪源FTH1的检测通量和效率。相较于基于抗体的Western Blot法具有更强的特异性，避免了制备FTH1单克隆抗体的繁琐步骤，冗长周期和高昂费用，还避免了制备FTH1多克隆抗体的交叉反应较为严重，成功率低等问题。
附图说明
为了更清楚地说明本申请或相关技术中的技术方案，下面将对实施例或相关技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例的相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的方法的流程图；
图2为实施例2中第一肽段IFLQDIK的二级质谱图；
图3为实施例2中的第二肽段NDPHLCDFIETHYLDEQVK的二级质谱图；
图4为实施例2中的第三肽段NVNQSLLELHK二级质谱图；
图5为实施例2中的第四肽段QNYHQDSEAAINR的二级质谱图；
图6为实施例2中的第五肽段YFLHQSHEER的二级质谱图；
图7为实施例2中的各处理组和对照组的FTH1蛋白相对定量结果箱线图；
图8为对比例2中的各处理组和对照组的FTH1蛋白相对定量结果箱线图。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本申请进一步详细说明。
需要说明的是，除非另外定义，本申请实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本申请所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本申请实施例中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
在养猪业中，猪体内过度蓄积的ROS主要攻击脂质、蛋白质和核酸等生物大分子，导致细胞成分损伤，结构和功能改变，且脂质过氧化连锁反应还可破坏生物膜结构及功能，从而加剧氧化损伤和细胞凋亡。因此，氧化应激产生的ROS可引起炎症反应并造成肝脏脂质氧化，导致脂肪浸润、肝脏肿大，造成脂肪肝、肝纤维化等疾病的发生，损害猪的健康。
一些判断FTH1在体内相对含量的分析方法主要包括在基因水平和蛋白水平上进行分析。基因水平上进行分析主要是在mRNA水平上进行比较，例如通过提取组织体内RNA后反转录后形成cDNA，根据FTH1的基因设计特异性引物对对反转录后的cDNA模板进行扩增，使用荧光实时定量PCR技术对模板中FTH1的转录水平进行比较分析。然而，针对该种mRNA水平上的比较，由于基因转录后，往往还需经历剪切和拼接等调控才能表达成FTH1蛋白，因此在转录水平上表达量的分析并不能真实反应其基因产物蛋白的表达量。而在蛋白水平上分析FTH1，通常会采用酶联免疫法、Western Blot、组织原位杂交等方法，然而这些检测方法都需要高质量的抗体特异识别FTH1。而现在市场上的制备抗体的抗原蛋白通常源于人、小鼠和大鼠等模式生物，无法在蛋白水平上定量分析猪铁蛋白重链FTH1的表达量。
建立在蛋白水平定量分析猪FTH1的方法，可以通过制备识别猪FTH1的特异性强的抗体，例如单克隆抗体和多克隆抗体等。然而单克隆抗体存在制备周期很长且费用高等问题；而多克隆抗体虽然费用较低，但是交叉反应较为严重且成功率很低。
因此，目前对于猪源FTH1的分析，存在检测不够准确，且抗体制备复杂费用高等问题。
基于此，本申请实施例提供了相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物及应用，能够通过肽段组合物对猪铁蛋白重链FTH1在蛋白水平上进行相对定量分析，在一定程度上解决目前对于猪源FTH1的分析，存在检测不够准确，且抗体制备复杂费用高等问题。
表1示出了本申请实施例提供的相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物。
请参阅表1，本申请实施例提供了相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物，包括第一肽段、第二肽段、第三肽段、第四肽段和第五肽段。其中，所述第一肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述第二肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述第三肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述第四肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述第五肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
表1相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物
本申请实施例提供的相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物，包括第一肽段、第二肽段、第三肽段、第四肽段和第五肽段，能够在蛋白水平上，使用液质联用仪特异检测并对FTH1定量分析，能够快速高效的定量检测猪源FTH1，提高了猪源FTH1的检测通量和效率。相较于基于抗体的Western Blot法具有更强的特异性，避免了制备FTH1单克隆抗体的繁琐步骤，冗长周期和高昂费用，还避免了制备FTH1多克隆抗体的交叉反应较为严重，成功率低等问题。
表2示出了本申请实施例提供的相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物的质荷比信息。
表2相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物的质荷比信息
请参阅表2，本申请实施例提供的对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物中，所述第一肽段的母离子为438.76m/z，子离子为763.43m/z，616.37m/z和503.28m/z，子离子对应的碰撞能量为27V。所述第二肽段的母离子为1187.04m/z，子离子为1374.69m/z，1261.61m/z和1132.56m/z，子离子对应的碰撞能量为27V；所述第三肽段的母离子为647.86m/z，子离子为839.50m/z，752.47m/z和284.17m/z，子离子对应的碰撞能量为27V；所述第四肽段的母离子为773.36m/z；子离子为1140.54m/z，1003.48m/z，875.42m/z，子离子对应的碰撞能量为27V；所述第五肽段的母离子为673.32m/z，子离子为1035.50m/z，922.41m/z和785.35m/z，子离子对应的碰撞能量为27V。该肽段组合物的母离子和子离子的质荷比及碰撞能量等，可以用于高效液相色谱-串联质谱(High performance liquidchromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)分析方法中的肽段分离和信号采集。
基于同一发明构思，本申请实施例还提供一种用于相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的试剂盒，所述试剂盒含有用于检测如前任一项所述的肽段组合物的试剂。
在一些实施例中，所述试剂可以包括第一肽段标准品、第二肽段标准品、第三肽段标准品、第四肽段标准品、第五肽段标准品、蛋白提取试剂和蛋白酶解试剂。
其中，蛋白提取试剂可以为领域的常用蛋白裂解液，例如SDT蛋白裂解液。蛋白酶解试剂可以为领域的常用蛋白酶解试剂，例如二硫苏糖醇溶液、碘乙酰胺溶液和胰蛋白酶液等。
上述实施例的试剂盒用于实现前述任一实施例中相应的相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物的检测，并且具有相应的肽段组合物实施例的有益效果，在此不再赘述。
基于同一发明构思，本申请实施例还提供一种相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的方法，应用如前任意实施例所述的肽段组合物，对猪铁蛋白重链FTH1进行相对定量分析。
图1示出了本申请实施例的相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的方法的流程图。
如图1所示，本申请实施例提供的相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的方法，可以包括：
S100，提供不同组别的待测猪组织样品，分别进行蛋白提取和蛋白酶解处理，以得到不同组别的待测肽段；
S200，通过液相色谱-质谱联用的方法对所述不同组别的肽段组合物，分别进行检测；
S300，比较不同组别的肽段组合物的检测结果，以对不同组别的待测猪组织样品中FTH1进行相对定量。
在一些实施例中，在步骤S100中，所述蛋白提取可以包括：采用SDT裂解液提取所述待测猪组织样品中的蛋白，得到蛋白提取物，并进行蛋白质定量。
在一些实施例中，所述蛋白酶解处理可以包括：对所得蛋白提取物依次采用二硫苏糖醇处理打开二硫键，采用乙酰胺处理封闭蛋白质内部的游离巯基，并采用胰蛋白酶酶切处理，得到肽段。
也即，蛋白酶处理包括：
采用二硫苏糖醇处理蛋白提取物以打开二硫键，得到第一产物；
采用乙酰胺处理所述第一产物，以封闭蛋白质内部的游离巯基，得到第二产物；
采用胰蛋白酶酶切所述第二产物。
在一些实施例中，在步骤S200中，可以包括：
筛选相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物；
靶向鉴定所述肽段组合物，并通过同位素标记内标进行校正。
在一些实施例中，可以通过高效液相色谱-质谱联用方法筛选相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物。其中，高效液相色谱-质谱联用方法的条件如下：
色谱条件：色谱柱：C18柱；流动相A：0.1％的乙腈水溶液，流动相B：0.1％的甲酸乙腈水溶液；梯度洗脱程序：0～2min，5％～10％B液；2～45min，10％～30％B液；45～55min，30％～100％B液；55～60min，100％B液；流速：250～450nl/min；
质谱条件：正离子模式采集数据；一级质谱扫描范围：300-1800m/z，一级质谱分辨率：60000(m/z 200)，AGC target：3e6，一级Maximum IT：50ms；二级质谱分析：MS2 scans：20；Isolation window：1.6Th，二级质谱分辨率：15000(m/z 200)，AGC target：1e5，二级Maximum IT：50ms，MS2 Activation Type：HCD，碰撞能量：27V。
在一些实施例中，采用上述的筛选相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物的方法重复筛选三次以上，使相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的方法的具有可靠的可重现性。并通过对质谱分析所得的肽段色谱峰等信息的比对筛选与计算，获得用于实现蛋白准确相对定量的特异性肽段信息。
通过以上操作对混合样品中FTH1蛋白的肽段序列进行靶向监测，能够建立和优化数据采集方法，确定目标蛋白FTH1的特异性肽段能够通过已建立的数据采集模式鉴定到，并初步评估各技术重复之间信号响应的一致性。确定能够获得序列为IFLQDIK、NDPHLCDFIETHYLDEQVK、NVNQSLLELHK、QNYHQDSEAAINR、YFLHQSHEER的五条特异肽段(也即获得如表1所示的用于相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物)。同时获得五条特异肽段的子母离子对的质荷比信息和碰撞能量等(也即获得如表2所示的相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物的质荷比信息)。
在一些实施例中，靶向鉴定所述肽段组合物，并通过同位素标记内标进行校正具体可以包括：
分别取步骤S100中不同组别的待测肽段预设量，掺入等量重同位素标记的内标肽段进行检测，采用LC/MS/MS分离肽段和信号采集。在该步骤中，即可得到目标肽段平行反应监测结果。该结果可以包含肽段色谱峰、原始峰面积及原始峰面积的对比柱状图等信息。
高效液相色谱-质谱联用方法的条件为
色谱条件：色谱柱：C18柱；流动相A：0.1％的乙腈水溶液，流动相B：0.1％的甲酸乙腈水溶液甲酸的乙腈溶液；梯度洗脱程序：0～2min，5％～10％B液；2～45min，10％～30％B液；45～55min，30％～100％B液；55～60min，100％B液；流速：250～450nl/min；
质谱条件：正离子模式采集数据；一级质谱扫描范围：300-1800m/z，质谱分辨率：60000(m/z 200)，AGC target：3e6，Maximum IT：200ms；MS2 scans：20；Isolation window：1.6Th，二级质谱分辨率：30000(m/z 200)，AGC target：3e6，Maximum IT：120ms，MS2Activation Type：HCD，碰撞能量：27V。
设置特异多肽的五个子母离子质荷比信息对分别为：m/z438.76为IFLQDIK的母离子，碎裂产生的子离子为m/z 763.43，m/z 616.37，m/z 503.28；m/z 1187.04为NDPHLCDFIETHYLDEQVK的母离子，碎裂产生的子离子为m/z 1374.69，m/z 1261.61，m/z1132.56；m/z 647.86为NVNQSLLELHK的母离子，碎裂产生的子离子为m/z 839.50，m/z752.47，m/z 284.17；m/z 773.36为QNYHQDSEAAINR的母离子，碎裂产生的子离子为m/z1140.54，m/z1003.48，m/z 875.42；m/z 673.32为YFLHQSHEER的母离子，碎裂产生的子离子为m/z 1035.50，m/z 922.41，m/z 785.35。
在一些实施例中，所述同位素标记的内标肽段可以为PRTC：SAAGAFGPELSR(13C6 15N4,+10Da)。
在步骤S300中，通过对平行反应监测所获得的肽段色谱峰、原始峰面积及原始峰面积的对比柱状图等进行分析，并比较不同组别的肽段组合物的检测结果，即可对不同组别的待测猪组织样品中FTH1进行相对定量。
具体地，采用Skyline软件对原始文件进行数据分析，可以选择肽段丰度较高且尽可能连续的3个子离子进行定量分析首先对目标肽段的子离子峰面积(也即，步骤S200中得到的目标肽段的子离子峰面积)进行整合，得到肽段在样品中的原始峰面积；然后使用重同位素标记的内标肽段峰面积(也即，步骤S200中得到的目标肽段的子离子峰面积)进行校正，得到每段肽在不同组别的样品中的相对表达量信息；最后计算每组样品中目标肽段的相对表达量平均值，并做统计学分析。目标蛋白表达量分析根据每个目标蛋白的对应肽段在不同样品组间的相对表达量，进一步计算得到目标蛋白在不同样品组中的相对表达量差异。具体的计算为现有技术，例如可以通过Skyline软件实现，因此此处不再赘述详细的计算步骤等。
上述实施例的方法用于实现前述任一实施例中相应的相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物的检测，并且具有相应的肽段组合物实施例的有益效果，在此不再赘述。
需要说明的是，上述对本申请的一些实施例进行了描述。其它实施例在所附权利要求书的范围内。在一些情况下，在权利要求书中记载的动作或步骤可以按照不同于上述实施例中的顺序来执行并且仍然可以实现期望的结果。另外，在附图中描绘的过程不一定要求示出的特定顺序或者连续顺序才能实现期望的结果。在某些实施方式中，多任务处理和并行处理也是可以的或者可能是有利的。
下面结合具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物的筛选
1、FTH1蛋白提取：分别取敌草快诱导氧化应激处理组(DQ)、抗氧化剂硫辛酸处理组(LA)、敌草快+硫辛酸处理组(DL)及对照组(CK)的猪肝脏组织样品加入适量SDT裂解液，转移至预先装有适量石英砂的2ml离心管中，应用匀浆仪进行匀浆破碎(24×2，6.0M/S，60s，两次)。然后超声(100W，工作10s，间歇10s，循环10次)，沸水浴10min。14000g离心10min，取上清采用10kD超滤膜过滤，收集滤液。采用BCA法进行蛋白质定量。分装样品，-80℃保存。每个组别分别含有4个生物学重复样本。
2、蛋白酶解：各处理组及对照组中，每个组的样品分别取约200ug蛋白，加二硫苏糖醇(DTT)至终浓度100mM打开二硫键，沸水浴15min，冷却至室温，加入200μL尿素缓冲液(UA buffer，8M Urea，150mM Tris-HCl，pH8.0)混匀，转至10KD超滤管中，离心14000g30min。加入200μl UA buffer离心14000g 30min，弃滤液。加入100μL碘代乙酰胺(IAA，50mMIAA in UA)烷基化封闭蛋白质内部的游离巯基，600rpm振荡1min，避光室温30min，离心14000g 20min。加入100μL UA buffer，离心14000g 20min重复3次。加入100μL NH4HCO3buffer(50mM)，离心14000g 20min重复2次。加入40μLNH4HCO3 buffer(含胰蛋白酶Trypsin，加酶比例1：50)进行酶切，600rpm振荡1min，37℃16h。更换新的收集管，离心14000g 15min。加入40μL NH4HCO3buffer(50mM)离心14000g 30min，收集滤液。酶解后的肽段脱盐冻干，然后用0.1％甲酸(FA)复溶，OD280测定肽段浓度。
3、筛选目标蛋白的特异性肽段并建立数据采集方法：首先，从步骤2中的每个组的多个重复中随机选取一例样品，分别取适量酶解后肽段，等量混合成一个样品；取1ug混合肽段，采用HPLC系统进行高效液相色谱分离；缓冲液A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)；色谱柱以95％的A液平衡；样品经Trap Column(100μm*50mm,5μm-C18，Dr.Maisch phases，r25.aq)，Analytical Column(180μm*150mm,3μm-C18，Dr.Maisch phases，r23.aq)流速为300nl/min；液相分离梯度如下：0分钟-2分钟，B液线性梯度从5％到10％，2分钟-45分钟，B液线性梯度从10％到30％；45分钟-55分钟，B液线性梯度从30％到100％；55分钟-60分钟，B液线性梯度维持100％。而后，用Q-Exactive HF质谱仪通过平行反应监测方法进行靶向定性分析；分析时长：60min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300-1800m/z，一级质谱分辨率：60000(m/z 200)，AGC target：3e6，一级MaximumIT：50ms；肽段二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描(full scan)后触发采集20个二级质谱图谱(MS2 scan)，二级质谱分辨率：15000(m/z200)，AGC target：1e5，二级Maximum IT：50ms，MS2 Activation Type：HCD，Isolation window：1.6Th，Normalizedcollision energy：27；LC-MS/MS采取靶向shotgun扫描模式，对目标蛋白的候选肽段进行MS2扫描。
试验结果
通过对质谱分析所得的肽段色谱峰等信息的比对筛选与计算，确定在所有组别(即处理组和对照组)中均能够获得表1中的相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物的序列信息，且确定在所有组别中均能够得到表2中的相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物的质荷比信息，并确定相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的方法的具体步骤和个步骤的具体参数条件等。
实施例2在敌草快诱导氧化应激育肥猪模型的肝脏FTH1蛋白相对性定量中的应用
1、FTH1蛋白提取：分别取敌草快诱导氧化应激处理组(DQ)、抗氧化剂硫辛酸处理组(LA)、敌草快+硫辛酸处理组(DL)及对照组(CK)的猪肝脏组织样品加入适量SDT裂解液，转移至预先装有适量石英砂的2ml离心管中，应用匀浆仪进行匀浆破碎(24×2，6.0M/S，60s，两次)。然后超声(100W，工作10s，间歇10s，循环10次)，沸水浴10min。14000g离心10min，取上清采用10kD超滤膜过滤，收集滤液。采用BCA法进行蛋白质定量。分装样品，-80℃保存。每个组别分别含有4个生物学重复样本。
2、蛋白酶解：各处理组及对照组中，每个组的样品分别取约200ug蛋白，加二硫苏糖醇(DTT)至终浓度100mM打开二硫键，沸水浴15min，冷却至室温，加入200μL尿素缓冲液(UA buffer，8M Urea，150mM Tris-HCl，pH8.0)混匀，转至10KD超滤管中，离心14000g30min。加入200μl UA buffer离心14000g 30min，弃滤液。加入100μL碘代乙酰胺(IAA，50mMIAA in UA)烷基化封闭蛋白质内部的游离巯基，600rpm振荡1min，避光室温30min，离心14000g 20min。加入100μL UA buffer，离心14000g 20min重复3次。加入100μL NH4HCO3buffer(50mM)，离心14000g 20min重复2次。加入40μLNH4HCO3 buffer(含胰蛋白酶Trypsin，加酶比例1：50)进行酶切，600rpm振荡1min，37℃16h。更换新的收集管，离心14000g 15min。加入40μL NH4HCO3buffer(50mM)离心14000g 30min，收集滤液。酶解后的肽段脱盐冻干，然后用0.1％甲酸(FA)复溶，OD280测定肽段浓度。
3、靶向鉴定目标蛋白特异性肽段并通过同位素内标进行校正：首先，将步骤2中的各组的多个重复中的每个样品各取约1ug肽段，分别掺入20fmol重同位素标记的内标肽段(PRTC：SAAGAFGPELSR)进行检测，采用HPLC系统对多肽进行高效液相色谱分离；缓冲液A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)；色谱柱以95％的A液平衡；样品进样到色谱分析柱进行梯度分离，流速300nl/min；液相分离梯度如下：0分钟-2分钟，B液线性梯度从5％到10％，2分钟-45分钟，B液线性梯度从10％到30％；45分钟-55分钟，B液线性梯度从30％到100％；55分钟-60分钟，B液线性梯度维持100％。高效液相色谱分离后，对鉴定到的目标蛋白的五条目标肽段用Q-Exactive HF质谱仪进行平行反应监测质谱分析，分析时长：60min，检测模式：正离子；一级质谱扫描范围：300-1800m/z，质谱分辨率：60000(m/z200)，AGC target：3e6，Maximum IT：200ms；每次一级MS扫描(full MS scan)后根据Inclusion list采集20个平行反应监测扫描(MS2 scans)，Isolation window：1.6Th，质谱分辨率：30000(m/z 200)，AGC target：3e6，Maximum IT：120ms，MS2 ActivationType：HCD，Normalized collision energy：27。
设置特异多肽的五个子母离子质荷比信息对分别为：m/z438.76为IFLQDIK的母离子，碎裂产生的子离子为m/z 763.43，m/z 616.37，m/z 503.28；m/z 1187.04为NDPHLCDFIETHYLDEQVK的母离子，碎裂产生的子离子为m/z 1374.69，m/z 1261.61，m/z1132.56；m/z 647.86为NVNQSLLELHK的母离子，碎裂产生的子离子为m/z 839.50，m/z752.47，m/z 284.17；m/z 773.36为QNYHQDSEAAINR的母离子，碎裂产生的子离子为m/z1140.54，m/z1003.48，m/z 875.42；m/z 673.32为YFLHQSHEER的母离子，碎裂产生的子离子为m/z 1035.50，m/z 922.41，m/z 785.35。
4、目标肽段平行反应监测结果分析：对平行反应监测所获得的目标蛋白特异性肽段数据进行分析，其中包含肽段色谱峰、原始峰面积及原始峰面积的对比柱状图等信息。选择肽段丰度较高且尽可能连续的3个子离子进行定量分析。首先对目标肽段的子离子峰面积进行整合，得到肽段在样品中的原始峰面积；然后使用重同位素标记的内标肽段峰面积进行校正，得到每段肽在不同样品中的相对表达量信息；最后计算每组样品中目标肽段的相对表达量平均值，并做统计学分析。目标蛋白表达量分析根据每个目标蛋白的对应肽段在不同样品组间的相对表达量，进一步计算得到目标蛋白在不同样品组中的相对表达量差异。
试验结果：见图2～7。其中，敌草快+硫辛酸(DL)处理组中，第一肽段IFLQDIK的二级质谱图如图2所示，第二肽段NDPHLCDFIETHYLDEQVK的二级质谱图如图3所示，第三肽段NVNQSLLELHK二级质谱图如图4所示，第四肽段QNYHQDSEAAINR的二级质谱图如图5所示，第五肽段YFLHQSHEER的二级质谱图如图6所示。
图7中DQ为敌草快诱导氧化应激处理组(DQ)中FTH1蛋白相对于对照组(CK)中FTH1蛋白的相对定量结果。LA为抗氧化剂硫辛酸处理组(LA)中FTH1蛋白相对于对照组(CK)中FTH1蛋白的相对定量结果。DL为敌草快+硫辛酸处理组(DL)中FTH1蛋白相对于对照组(CK)中FTH1蛋白的相对定量结果。CK为对照组(CK)中FTH1蛋白相较于三个处理组(敌草快诱导氧化应激处理组(DQ)、抗氧化剂硫辛酸处理组(LA)和敌草快+硫辛酸处理组(DL))中FTH1蛋白的平均值的相对定量结果。
对比例1
与实施例2中的区别在于，基于LC-MS/MS方法，采用TMT(Tandem Mass Tag)蛋白质同位素标记定量技术，根据Thermo公司TMT蛋白标记试剂盒的具体操作说明，对酶解后的肽段进行检测。
具体地，酶解后的肽段通过实施例2中的步骤1和步骤2得到。
试验结果：见图8。
图8中DQ为敌草快诱导氧化应激处理组(DQ)中FTH1蛋白相对于对照组(CK)中FTH1蛋白的相对定量结果。LA为抗氧化剂硫辛酸处理组(LA)中FTH1蛋白相对于对照组(CK)中FTH1蛋白的相对定量结果。DL为敌草快+硫辛酸处理组(DL)中FTH1蛋白相对于对照组(CK)中FTH1蛋白的相对定量结果。CK为对照组(CK)中FTH1蛋白相较于三个处理组(敌草快诱导氧化应激处理组(DQ)、抗氧化剂硫辛酸处理组(LA)和敌草快+硫辛酸处理组(DL))中FTH1蛋白的平均值的相对定量结果。
将实施例2和对比例1的相对定量结果箱线图，即图7和图8，进行比较，可以看出，实施例2中鉴定到的FTH1蛋白在不同处理组之间的变化趋势与对比例1中鉴定到的FTH1蛋白在不同处理组之间的变化趋势具有一致性。说明，本申请实施例的包括第一肽段、第二肽段、第三肽段、第四肽段和第五肽段的相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物，具有良好的准确性，且该肽段组合物能够靶向鉴定猪铁蛋白重链FTH1的目标肽段组合物，相较于现有的体外标记的检测方法，例如TMT(Tandem Mass Tag)蛋白质同位素标记定量技术的高通量鉴定猪所有蛋白，具有更高的灵敏度。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本公开的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本公开实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
尽管已经结合了本公开的具体实施例对本公开进行了描述，但是根据前面的描述，这些实施例的很多替换、修改和变型对本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
本公开实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本公开实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物及应用
<130> FI220393
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 第一肽段的氨基酸序列
<400> 1
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys
1 5
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 第二肽段的氨基酸序列
<400> 2
Asn Asp Pro His Leu Cys Asp Phe Lie Glu Thr His Tyr Leu Asp Glu Gln Val Lys
1 5 10 15
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 第三肽段的氨基酸序列
<400> 3
Asn Val Asn Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys
1 5 10
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 第四肽段的氨基酸序列
<400> 4
Gln Asn Tyr His Gln Asp Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 第五肽段的氨基酸序列
<400> 5
Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
1 5 10
Claims (9)
1.相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物，其特征在于，包括第一肽段、第二肽段、第三肽段、第四肽段和第五肽段；
其中，所述第一肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述第二肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述第三肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述第四肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述第五肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
2.根据权利要求1所述的相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的肽段组合物，其特征在于，所述第一肽段的母离子为438.76m/z，子离子为763.43m/z，616.37m/z和503.28m/z，子离子对应的碰撞能量为27V；所述第二肽段的母离子为1187.04m/z，子离子为1374.69m/z，1261.61m/z和1132.56m/z，子离子对应的碰撞能量为27V；所述第三肽段的母离子为647.86m/z，子离子为839.50m/z，752.47m/z和284.17m/z，子离子对应的碰撞能量为27V；所述第四肽段的母离子为773.36m/z；子离子为1140.54m/z，1003.48m/z，875.42m/z，子离子对应的碰撞能量为27V；所述第五肽段的母离子为673.32m/z，子离子为1035.50m/z，922.41m/z和785.35m/z，子离子对应的碰撞能量为27V。
3.一种相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的方法，其特征在于，应用权利要求1～2任一项所述的肽段组合物，对猪铁蛋白重链FTH1进行相对定量分析。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述对猪铁蛋白重链FTH1进行相对定量分析包括：
提供不同组别的待测猪组织样品，分别进行蛋白提取和蛋白酶解处理，得到不同组别的待测肽段；
通过液相色谱-质谱联用的方法对所述不同组别的肽段组合物，分别进行检测；
比较不同组别的肽段组合物的检测结果，以对不同组别的待测猪组织样品中FTH1进行相对定量。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述液相色谱-质谱联用的测定条件如下：
色谱条件：色谱柱：C18柱；流动相A：0.1％的甲酸水溶液，流动相B：0.1％的甲酸乙腈水溶液；梯度洗脱程序：0～2min，5％～10％B液；2～45min，10％～30％B液；45～55min，30％～100％B液；55～60min，100％B液；流速：250～450nl/min；
质谱条件：正离子模式采集数据；一级质谱扫描范围：300-1800m/z，质谱分辨率：60000(m/z 200)，AGC target：3e6，MaximumIT：200ms；MS2 scans：20；Isolation window：1.6Th，质谱分辨率：30000(m/z 200)，AGC target：3e6，Maximum IT：120ms，MS2 ActivationType：HCD，碰撞能量：27V。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括，在所述待测肽段中掺入同位素标记的内标肽段。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述同位素标记的内标肽段为PRTC：SAAGAFGPELSR(13C6 15N4,+10Da)。
8.一种用于相对定量分析猪铁蛋白重链FTH1的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有用于检测权利要求1～2任一项所述的肽段组合物的试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括第一肽段标准品、第二肽段标准品、第三肽段标准品、第四肽段标准品、第五肽段标准品、蛋白提取试剂和蛋白酶解试剂。
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
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Inventor after: Gu Xianhong Inventor after: Gao Jie Inventor after: Hao Yue Inventor before: Gu Xianhong Inventor before: Gao Jie Inventor before: Hao Yue |
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| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |