CN114354333A - 一种尿液样本的前处理方法、保存方法、自动化处理系统及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种尿液样本的前处理方法、保存方法、自动化处理系统及检测方法，涉及生物检测技术领域，该前处理方法包括将经过蛋白裂解后的尿液样本进行还原烷基化处理，然后进行蛋白富集、酶解；蛋白富集是采用PVDF过滤板对还原烷基化处理后的样本进行蛋白富集。本发明还提供了尿液样本的自动化处理系统及样本自动化处理方法，该处理系统极大程度上降低了人们的劳动强度，有利于加快尿液样本处理的处理效率，满足高通量、自动化的蛋白质组学前处理需求，适应当前临床需求的重现性和通量。

Description

一种尿液样本的前处理方法、保存方法、自动化处理系统及检 测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种尿液样本的前处理方法、保存方法、自动化处理系统及检测方法。
背景技术
尿液中蛋白质种类和数量的变化携带有泌尿系统疾病发生、发展及预后的多种信息，而尿液蛋白质组学是诠释尿液蛋白所携带信息的最有效的方法之一。在临床应用领域，常常需要多中心、大样品来进行研究分析，以便得到更准确的结果。而尿液样本由于体积大、蛋白浓度差异大以及存在细菌等微生物特征，因此如何优化临床尿液样本的保存是如今亟需解决的问题之一。
尿液样本具有收集简单、无创、快速等优势，在科学研究等领域获得了广泛的运用。但是尿液样本同样面临如何更长时间的保存、如何简化运送等难题，若其中一个环节质量控制的效果不好，均可能会影响蛋白检测结果的可靠性。常规条件下，尿液样本都是临床采集随后进行检测，或者存放于尿管中存放在样品库，但这样会占用冰箱中较大体积，不利于保存。此外，尿液中存在很多干扰化合物，如尿酸，肌酐，氨等非蛋白氮化合物、硫酸盐等，导致尿液的酸碱度变动很大，会加速尿液的腐化；同时，尿液中会存在细菌，在长期保存中细菌仍然存在活性，导致尿液中的蛋白质有被细菌分解的可能，影响最终结果的可靠性。而目前已有研究者提出，将尿液中的蛋白保存于膜上，这样就便于运输、占空间小、且可保存至少半年以上，但这里用到的膜材料面积也较大，约40mm左右，且保存尿液蛋白的操作只能单个样本进行，无法进行高通量处理，这就限制了膜材料保存尿蛋白的临床使用。
蛋白质组学(proteomics)，是以蛋白质组为研究对象，研究尿液、血清或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。1997年HEINE等用高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱(high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-MS，HPLC-ESI-MS)技术鉴定出了34个蛋白质，并获得了正常人尿蛋白片段图谱。随后，LEE等采用质谱技术在尿液中鉴定出600种蛋白质分子，扩展了尿蛋白组数据库；随后，ADACHI等应用线性离子阱质谱(linear ion trap-orbitrap，LTQ-Orbitrap)技术鉴定出1543种尿蛋白；ALEX等应用二维凝胶电泳(Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)+LTQ-Orbitrap&LC-MS/MS对正常人尿蛋白组分做了更为全面的分析，鉴定出2362种蛋白分子。
在过去的二十年中，基于质谱(MS)的方法已成为首选方法用于高可信度和深度覆盖的定量生物样品中的蛋白质，并极大地促进了生物体内的信号转导网络的注释，阐明蛋白质在不同生理病理状态下的相互作用，改善对疾病机理的诊断和分子理解。典型的蛋白质组学实验流程主要从蛋白质裂解(从样本中提取出蛋白质)、蛋白含量测定(测定溶液中蛋白质含量)、还原/烷基化(打开二硫键，使蛋白分子尽量从球状变成链状，增加蛋白质的溶解性，然后烷基化试剂与蛋白游离巯基结合，暴露出尽可能多的酶切位点)、蛋白酶解(胰蛋白酶将蛋白质样品消化成多个肽段)、脱盐(去除肽段溶液存在的无机盐成分并对肽段进行富集和浓缩冻干)、最后进行色谱-质谱检测分析。
自从进入了精准医学时代，蛋白质组学的发展也朝着精准医学临床应用的方向在不断发展。因此，如何快速提高检测通量成了目前组学的重点研究方向之一。其中，从临床样本中提取蛋白质、得到蛋白溶液进行含量测定、还原烷基化、蛋白酶解、肽段脱盐与富集，以上流程都属于蛋白质组学中的传统手动样品处理阶段，传统手动前处理实验流程速度慢、环节多且费力，整个流程耗时8-18小时不等，通常情况下，实验员无法在一个工作日内完成一批样本的前处理流程，也不容易提供满足当前临床需求的重现性和通量，因此高通量、自动化的蛋白质组学前处理流程已经是整个行业内急需的创新技术之一。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种尿液样本的前处理方法、保存方法、自动化处理系统及检测方法以解决上述技术问题。
临床样本的保存决定了整个项目的质量，而样本前处理流程是整个蛋白质组学分析流程中至关重要的一步，决定着整个样品分析的灵敏度和精确度，因此，本发明致力于寻找更高效的尿液样本保存方法和高通量、自动化的样本蛋白质前处理方法，以期提高整个项目的质量同时降低蛋白质在前处理过程中的损失、提高实验的重现性和稳定性，并提高整个实验流程的性能和通量。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种尿液样本的保存方法，其包括：将经过蛋白裂解后的尿液样本进行还原烷基化处理，然后进行蛋白富集；
蛋白富集是采用PVDF过滤板对还原烷基化处理后的样本进行蛋白富集；
蛋白裂解采用的裂解液与待裂解的尿液样本的混合体积比为1:0.1～9。
发明人发现，与FASP膜的物理截留蛋白效果不同，本发明提供的处理方法采用PVDF膜将蛋白质吸附到膜表面，理论上，PVDF过滤板中每孔PVDF膜可以吸附20-25μg蛋白(不同尺寸的过滤板或过滤管可以对应不同的蛋白吸附量)，因此，可以将尿液样本中蛋白保留在PVDF过滤板上，让尿液蛋白以固体的形式保存起来。发明人通过实验验证，选择PVDF过滤板进行尿液蛋白保存，方法较为可靠，且在1年内能够保证稳定的尿蛋白数量和质量。上述PVDF过滤板可选自市售的MultiScreen HTS IP。厂家为Millipore，型号为MSIPS451。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述裂解液选自如下物质中的至少一种：尿素、硫脲、盐酸胍、三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸、苯甲基磺酰氟、十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠和3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS，CAS号75621-03-3)。例如：尿素和CHAPS的组合。
在一种可选的实施方式中，裂解液选自尿素，且尿素在待裂解的尿液样本中的终浓度为1M-5M。例如1M、1.5M、2M、2.5M、3M、3.5M、4M、4.5M或5M。
发明人发现，裂解液作为变性剂可以使蛋白变性，具有重新折叠并促进蛋白溶解的作用，但裂解液浓度过高，会导致蛋白与PVDF膜正电结合的亲和力降低，导致膜上吸附的蛋白量下降。而且当尿素的浓度高于一定浓度，也可能对PVDF过滤板的性能产生影响。发明人通过实验验证证实，蛋白裂解液浓度过高，会导致PVDF膜材料吸附蛋白的效率产生影响，仅有较少或基本没有蛋白被吸附于PVDF膜上，导致后续的上机无法检测到蛋白。
在本发明应用较佳的实施方式中，当尿素在待裂解的尿液样本中的终浓度为3M时，PVDF膜材料吸附蛋白的效率整体最佳。
在一种可选的实施方式中，裂解液采用的稀释液选自如下物质中的至少一种：碳酸氢铵、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液(Tris-HCl)、磷酸盐溶液(PBS)。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述蛋白富集前，还包括对PVDF过滤板进行活化，活化后用裂解液进行平衡，然后将还原烷基化处理后的样本转移至平衡后的PVDF过滤板上进行蛋白富集。
通过活化可以去除PVDF膜自身残留的化学物质，避免PVDF膜自身残留的化学物质对于尿蛋白的吸附和检测产生干扰。
在一种可选的实施方式中，活化采用的活化剂为醇类物质。醇类物质可以把PVDF膜从疏水性状态转变成亲水性状态，同时活化了PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，从而提高了尿液样本中肽段和蛋白检测的数量和质量。在其他实施方式中，包括不限于通过相似相溶的原理采用的活化剂对PVDF过滤板进行活化。
活化采用的活化剂可以选自甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇中的至少一种。
平衡采用的试剂可以为蛋白裂解液。
上述还原烷基化包括还原和烷基化两个步骤，可参照现有的还原烷基化的步骤进行，具体不进行限制，在一些实施例中，还原烷基化采用的试剂可以选自二硫苏糖醇、碘乙酰胺、氯乙酰胺、三(2-羧乙基)膦盐酸盐中的至少一种。
上述蛋白富集后的PVDF过滤板可以直接进行尿蛋白的保存，如直接置于-80℃～-20℃下进行保存。
在本发明应用较佳的实施方式中，蛋白富集后的PVDF过滤板对尿蛋白进行保存时，置于-80℃下进行保存，保存效果最佳。
本发明还提供了一种尿液样本的前处理方法，其包括：将经过蛋白裂解后的尿液样本进行还原烷基化处理，然后进行蛋白富集，富集后再进行酶解，浓缩冻干。
蛋白富集是采用PVDF过滤板对还原烷基化处理后的样本进行蛋白富集。
蛋白裂解采用的裂解液与待裂解的尿液样本的混合体积比为1:0.1～9。
PVDF过滤板包括不限于：含有PVDF过滤膜的96孔板或384孔板。需要说明的是，这里的96孔板或384孔板是指具备96个过滤管或384个过滤管的过滤板，只是其过滤管的结构同常规的96孔板或384孔板中的“孔”。
本发明提供的前处理方法将整个尿液前处理流程周期控制在4小时以内，而且能够同时进行96份或更多通量样本的前处理，具有处理效率高的极大技术优势。具体的，由于每孔PVDF膜可以吸附20-25μg蛋白，因此在后续的前处理流程中蛋白定量检测环节可以省去，同时，在利用PVDF过滤板进行蛋白吸附后，在蛋白富集环节中加入了多次清洗和离心操作，使得蛋白样本中原始存在的干扰物质(如无机盐、尿沉渣、细胞、细菌及碎片)被去除，已经起到了脱盐的效果。因此，相较于传统蛋白质组学实验流程，本申请省去了蛋白定量和脱盐环节，显著缩短了样本的前处理时间，并且降低了成本。进一步地，本申请的前处理方法采用多孔板的PVDF膜，可以一次性处理96份或更多份的尿液样本，从而克服了FASP的通量限制，因此提供了一种高通量的尿液样本前处理方法，可应用于尿液样本的自动化蛋白质组学分析应用。
上述尿液样本包括不限于：动物(不含人)尿液样本、离体的尿液样本。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述酶解后还包括收集PVDF过滤板中的滤液。
在一种可选的实施方式中，酶解采用酶为胰蛋白酶和赖氨酸酶；酶解是在震荡条件下进行；在一种可选的实施方式中，酶解时间为1-18h。
可选地，根据样品蛋白量与蛋白酶(Trypsin、LysC)质量比按照1：10～100的比例混合，将蛋白酶解成多个小的肽段。
在一种可选的实施方式中，蛋白富集包括：将还原烷基化处理后的样本加入PVDF过滤板，离心后，用洗脱液清洗离心获得的样本。具体地，还原烷基化以打开蛋白结构中二硫键并与蛋白游离巯基结合，从而暴露出尽可能多的酶切位点，以便于后续的酶切应用。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述裂解液选自如下物质中的至少一种：尿素、硫脲、盐酸胍、三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸、苯甲基磺酰氟、十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠和3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐。3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐的CAS号为75621-03-3，缩写为CHAPS。
在一种可选的实施方式中，裂解液选自尿素，且尿素在待裂解的尿液样本中的终浓度为1M-5M。
发明人发现，在传统的FASP方法进行尿液样本前处理时，使用的蛋白裂解液常为8M尿素，但是当8M尿素在裂解完尿液中蛋白后，再与PVDF过滤板接触时，会严重降低蛋白与PVDF膜材料正电结合的亲和力，导致膜吸附蛋白的效率严重降低，甚至不与蛋白结合，所以必须降低尿素溶剂的浓度，才能使PVDF过滤板发挥蛋白吸附的功能。因此，本发明根据PVDF材料对尿素溶剂浓度严格要求的特性，以及FASP方法在蛋白质前处理流程中的存在的杂质去除干净和整个体系溶液体积较小的优势，将PVDF过滤板运用到FASP前处理方法中，同时优化了尿素溶剂的浓度，开发出一套快速、干净的尿液蛋白质组学前处理方法。
本发明还提供了一种尿液样本的自动化处理系统，其包括尿液样本储存单元、处理液供应单元、PVDF过滤板供应单元、吸样单元、蛋白收集单元和酶储存单元，且尿液样本储存单元、处理液供应单元、PVDF过滤板供应单元、吸样单元、蛋白收集单元和酶储存单元均电连接于控制终端实现自动化控制。
在一种可选的实施方式中，上述控制终端为电脑。上述吸样单元包括不限于排枪等。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述处理系统还包括裂解反应容器供应单元、摇床、浓缩仪和PCR板。
处理液供应单元包括裂解液供应单元、还原剂供应单元、烷基化试剂供应单元、终止烷基化反应试剂供应单元、洗脱液供应单元、活化剂供应单元和复溶溶剂供应单元。处理液供应单元可以是12道槽，每一道槽中设置不同的试剂供应单元。
本发明还提供了一种采用上述的尿液样本的自动化处理系统对尿液样本处理的方法，其包括：
(1)蛋白裂解：采用吸样单元从尿液样本储存单元取待测尿液样本至裂解反应容器中，通过吸样单元从处理液供应单元中吸取裂解液至裂解反应容器中进行蛋白裂解；
(2)还原烷基化：通过吸样单元从处理液供应单元中吸取还原剂至裂解反应容器中进行还原反应，再通过吸样单元从处理液供应单元中吸取烷基化试剂至裂解反应容器中进行烷基化反应，反应后通过吸样单元从处理液供应单元中吸取终止烷基化反应试剂至裂解反应容器中终止烷基化反应；
(3)蛋白富集：通过吸样单元从处理液供应单元中吸取活化剂至PVDF过滤板，对PVDF过滤板进行活化，再通过吸样单元从处理液供应单元中吸取裂解液至PVDF过滤板，对PVDF过滤板进行平衡，然后通过吸样单元将还原烷基化处理后的产物加入PVDF过滤板中，离心；
(4)蛋白酶解：通过吸样单元从酶储存液单元中吸取酶反应液至PVDF过滤板中进行酶解反应，再通过吸样单元从处理液供应单元中吸取洗脱液至PVDF过滤板中对酶解反应产物进行洗脱，然后将洗脱液合并。
(5)浓缩冻干：将洗脱液进行浓缩冻干。
在一种可选的实施方式中，上述蛋白裂解是在恒温混匀摇床上进行，1000rpm转速涡旋混匀。
在一种可选的实施方式中，上述还原反应、烷基化反应以及终止烷基化反应均在1000rpm转速涡旋条件下进行，例如在还原反应过程中，室温反应20min，烷基化反应过程中，室温反应20min，终止烷基化反应反应过程中，室温反应1min。
本发明还提供了一种对尿液样本进行质谱检测的方法，方法以非疾病的诊断为目的，其包括：先采用上述方法对尿液样本进行处理，然后利用质谱仪进行肽段检测；
设置流动相A为含0.05-0.2％甲酸的水溶液，流动相B为含0.05-0.2％甲酸的80％乙腈，进行梯度洗脱，流速为200-300nl/min，柱温为30-55℃；
优选地，所述梯度洗脱的程序为：1-6min，1％-8％B，6-30min，8-99％B；
设置质谱参数包括：质谱全扫分辨率为240,000或120,000或70,000或60,000或45,000或30,000或17,500或15,000或7,500@m/z 200，AGC为1E5～3E6，最大离子进样时间为10～100ms，扫描范围为m/z 200-2000，标准化碰撞能量为15～27％，二级质谱扫描分辨率为240,000或120,000或70,000或60,000或45,000或30,000或17,500或15,000或7,500@m/z 200，扫描范围为m/z 200-2000，AGC为1E5～1E6，最大离子进样时间为10～100ms，动态排除时间为10～40s，电荷价态选择2+～8+。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种尿液样本的保存方法，选择PVDF过滤板进行尿液蛋白保存，能够在1年内能够保证稳定的尿蛋白数量和质量。
本发明提供了一种尿液样本的前处理方法，该方法在缩短样本前处理时间的情况下，显著提高了蛋白的吸附率，有利于提高尿液蛋白质组学分析的有效性和准确性。
本发明还提供了尿液样本的自动化处理系统及样本自动化处理方法，该处理系统极大程度上降低了人们的劳动强度，有利于加快尿液样本处理的处理效率，满足高通量、自动化的蛋白质组学前处理需求，适应当前临床需求的重现性和通量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为尿液样本保存及前处理流程；
图2为尿液样本保存及蛋白质组学自动化前处理的软件操作界面；
图3为尿液样本保存及蛋白质组学自动化前处理的工作站内部结构(1-恒温混匀摇床；2-200μL枪头；3-PCR板；4-50μL枪头；5-PCR板；6-低温盘；7-12道槽；8-0.5mL96孔板；9-PVDF过滤板)；
图4为全部样本蛋白分布排序图；
图5为样本蛋白鉴定结果统计图；
图6为不同浓度的尿素对应的蛋白及其肽段鉴定统计图，黑色为蛋白鉴定数量，灰色为肽段鉴定数量；
图7为不同保存时间对应的蛋白及其肽段鉴定统计图，黑色为蛋白鉴定数量，灰色为肽段鉴定数量。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
对比例1
一种尿液样本(ABCD尿液样本均来自健康志愿者)的前处理方法(参照图1所示)，其包括以下步骤。
(1)蛋白裂解
A样本：取同一尿液样本100μL，加入300μL 8M尿素(稀释剂：50mM碳酸氢铵)，尿素终浓度为6M，涡旋混匀，提取蛋白。
(2)还原烷基化
在蛋白裂解后的产物加入二硫苏糖醇至终浓度10mM，室温反应20min；在还原后的产物中加入碘乙酰胺(烷基化)至终浓度20mM，暗处反应20min；对烷基化后的产物中加入等体积的二硫苏糖醇以中和烷基化反应中过量的碘乙酰胺。
(3)蛋白富集
在PVDF过滤板中加入200μL 70％乙醇，1000g离心，进行PVDF过滤板活化；在活化后的PVDF过滤板中加入200μL 6M尿素(稀释剂：50mM碳酸氢铵)，1000g离心，进行PVDF过滤板平衡；然后将样品转移入PVDF过滤板，1000g离心；最后加入50mM碳酸氢铵溶液清洗样本，1000g离心。
(4)蛋白酶解
加入100μL 50mM碳酸氢铵溶液和1μg混合的胰蛋白酶(Trypsin)和赖氨酸酶(LysC)，37℃震荡孵育2h，孵育结束后，1000g离心1分钟，收集滤液；再加入150μL 40％乙腈(含有0.1％甲酸)洗脱肽段，然后将洗脱液进行合并。
(5)浓缩冻干
将收集得到的洗脱液置于真空离心浓缩仪中进行浓缩冻干。
对比例2
尿素法结合传统前处理操作流程如下。
D样本进行如下处理：取300μL尿液样品，按照尿液：甲醇＝1:5(V/V)加入1500μL预冷甲醇；涡旋20s，-20℃静置1.5h；4℃，12000g离心10min，弃上清；80％乙醇洗沉淀1次，浓缩仪内干燥；用50μL尿素溶液重溶样品，采用BSA法(PierceTM BCA蛋白检测试剂盒，品牌：赛默飞，货号：23227)测蛋白浓度，根据BSA法测试的蛋白浓度，取10μg蛋白到96孔板中，用8M尿素补至50μL的总体积；二硫苏糖醇至终浓度10mM，室温反应20min；加入碘乙酰胺至终浓度20mM，暗处反应20min；再加入等量的二硫苏糖醇中和过多的碘乙酰胺；再加入1μg混合的胰蛋白酶(Trypsin)和赖氨酸酶(LysC)，37℃震荡孵育2h，孵育结束后，加入150μL 50mM碳酸氢铵将尿素稀释到2M以下；向反应体系中加入20μL10％三氟乙酸，终止反应；随后进行脱盐操作。
脱盐操作如下：先加入100μL甲醇到脱盐孔板中，600g，离心1min；加入0.2％三氟乙酸/80％乙腈100μL，600g，离心1min；加入0.2％三氟乙酸/水200μL，600g，离心1min；加入样品，600g，离心1min，重复一次；加入0.2％三氟乙酸/水200μL，600g，离心1min冲洗；加入0.2％三氟乙酸/80％乙腈100μL，600g，离心1min洗脱；收集滤液进行浓缩冻干。
实施例1
一种尿液样本的前处理方法，大致与对比例1相同，区别在于蛋白裂解液浓度的不同，区别如下。
B样本：取同一尿液样本200μL，加入200μL 8M尿素(稀释剂：50mM碳酸氢铵)，尿素终浓度为4M，涡旋混匀，提取蛋白。
实施例2
一种尿液样本的前处理方法，大致与对比例1相同，区别在于蛋白裂解液浓度的不同，区别如下。
C样本：取同一尿液样本300μL，加入200μL 8M尿素(稀释剂为：50mM碳酸氢铵)，尿素终浓度为3M，涡旋混匀，提取蛋白。
实施例3
一种尿液样本的保存方法(参照图1所示)，其包括以下步骤。
(1)蛋白裂解
取同一尿液样本(C样本)300μL，(稀释剂为：50mM碳酸氢铵)，尿素终浓度为3M，涡旋混匀，提取蛋白。
(2)还原烷基化
将蛋白裂解后的产物中加入二硫苏糖醇至终浓度10mM，室温反应20min；在还原后的产物中加入碘乙酰胺(烷基化)至终浓度20mM，暗处反应20min；对烷基化后的产物中加入等体积的二硫苏糖醇以中和烷基化反应中过量的碘乙酰胺。
(3)蛋白富集
在PVDF过滤板中加入200μL 70％乙醇，1000g离心，进行PVDF过滤板活化；在活化后的PVDF过滤板中加入200μL 3M尿素(稀释剂为：50mM碳酸氢铵)，1000g离心，进行PVDF过滤板平衡；然后将样品转移入PVDF过滤板，1000g离心；最后加入50mM碳酸氢铵溶液清洗样本，1000g离心1min。
将保存于PVDF过滤板中的尿蛋白样本置于-80℃条件下储存1个月。
实施例4
本实施例提供了一种尿液样本的保存方法(参照图1所示)，与实施例3相比，区别仅在于保存周期，本实施例是将保存于PVDF过滤板中的尿蛋白样本置于-80℃条件下储存3个月。
实施例5
本实施例提供了一种尿液样本的保存方法(参照图1所示)，与实施例3相比，区别仅在于保存周期，本实施例是将保存于PVDF过滤板中的尿蛋白样本置于-80℃条件下储存5个月。
实施例6
本实施例提供了一种尿液样本的保存方法(参照图1所示)，与实施例3相比，区别仅在于保存周期，本实施例是将保存于PVDF过滤板中的尿蛋白样本置于-80℃条件下储存7个月。
实施例7
本实施例提供了一种尿液样本的保存方法(参照图1所示)，与实施例3相比，区别仅在于保存周期，本实施例是将保存于PVDF过滤板中的尿蛋白样本置于-80℃条件下储存9个月。
实施例8
本实施例提供了一种尿液样本的保存方法(参照图1所示)，与实施例3相比，区别仅在于保存周期，本实施例是将保存于PVDF过滤板中的尿蛋白样本置于-80℃条件下储存12个月。
实施例9
本实施例提供了一种尿液样本的自动化处理系统，具体将临床尿液样本蛋白质组学前处理流程整合进入自动化工作站中，整个自动化流程可以分为5个部分：蛋白裂解、还原烷基化、蛋白富集、蛋白酶切和浓缩冻干。
自动化处理系统包括尿液样本储存单元、处理液供应单元、PVDF过滤板供应单元、吸样单元、蛋白收集单元和酶储存单元，且尿液样本储存单元、处理液供应单元、PVDF过滤板供应单元、吸样单元、蛋白收集单元和酶储存单元均电连接于控制终端实现自动化控制。
上述处理系统还包括裂解反应容器供应单元、摇床、浓缩仪和PCR板。
处理液供应单元包括裂解液供应单元、还原剂供应单元、烷基化试剂供应单元、终止烷基化反应试剂供应单元、洗脱液供应单元和活化剂供应单元和复溶溶剂供应单元。处理液供应单元可以是12道槽，每一道槽中设置不同的试剂供应单元。
本实施例中，上述控制终端为电脑。通过控制终端实现自动供液、洗脱、上样、震荡、富集等功能。
具体地，尿液样本的自动化处理系统进行尿液样本的自动化处理流程如下，更具体的前处理实验流程如表1所示：
第一步-蛋白裂解(同实施例2)：自动移取尿液样本300μL置于0.5mL 96孔板中并放置在1号位的恒温混匀摇床上，再从7号位的12道槽(即为处理液供应单元)第1列(A1)中吸取200μL 8M尿素(稀释剂：50mM碳酸氢铵)分别加入1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中，1000rpm转速涡旋混匀，提取蛋白；
第二步-还原烷基化：从7号位的12道槽第2列(A2)中吸取10μL 0.5M二硫苏糖醇分别加入1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中至终浓度10mM，1000rpm转速涡旋混匀，室温反应20min；从7号位的12道槽第3列(A3)中吸取20μL 0.5M碘乙酰胺分别加入1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中至终浓度20mM，1000rpm转速涡旋混匀，暗处反应20min；再从7号位的12道槽第2列(A2)中吸取10μL 0.5M二硫苏糖醇分别加入1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中，1000rpm转速涡旋混匀1min，中和过多的碘乙酰胺；
第三步-蛋白富集：从7号位的12道槽第4列(A4)中吸取200μL 70％乙醇分别加入9号位的PVDF-96孔板(即PVDF过滤板)中，1000g离心，进行PVDF过滤板活化；在从7号位的12道槽第4列(A5)中吸取200μL3M尿素(稀释剂：50mM碳酸氢铵)分别加入9号位的PVDF过滤板中，1000g离心，进行PVDF过滤板平衡；然后将1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中还原烷基化完成的样品转移入9号位的PVDF过滤板，1000g离心；最后从7号位的12道槽第6列(A6)中吸取100μL 50mM碳酸氢铵溶液清洗样本，1000g离心；
第四步-蛋白酶切：从6号位的低温盘(即酶储存单元)中第1列吸取100μL 50mM碳酸氢铵溶液和1μg混合的胰蛋白酶(Trypsin)和赖氨酸酶(LysC)，分别加入9号位的PVDF过滤板中，然后将9号位的PVDF过滤板转换至1号位的恒温混匀摇床上，进行37℃、1000rpm转速震荡孵育2h，孵育结束后，1000g离心1min，收集肽段滤液；再从7号位的12道槽第7列(A7)中吸取150μL 40％乙腈(含0.1％甲酸)溶剂，加入9号位的PVDF过滤板中进行洗脱，1000g离心1min，合并全部的洗脱液；
第五步-浓缩冻干：将收集得到的洗脱液置于真空离心浓缩仪中进行浓缩冻干。
根据质谱检测的需要，本申请自动化处理系统可进一步用于复溶操作：将浓缩冻干的肽段样本置于工作站的1号位的恒温混匀摇床上，从7号位的12道槽第8列(A8)中吸取20μL 0.1％甲酸水溶剂，1000rpm转速涡旋混匀1min，进行肽段复溶，复溶完成后，从1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中分别移取15μL上清液进入3号位的PCR板中，等待质谱检测分析进行肽段检测。
表1自动化处理流程
Figure BDA0003474110390000161
Figure BDA0003474110390000171
Figure BDA0003474110390000181
本实施例中的色谱和质谱检测参数如下：
上机检测液相参数：设置流动相A为含0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的80％乙腈，梯度洗脱条件如表2所示，色谱柱为AcclaimTM PepMapTM 100 C18色谱柱(Thermo Fisher,0.075mm,20mm)，柱温为55℃。
表2梯度洗脱表
Figure BDA0003474110390000182
上机检测质谱参数：质谱全扫分辨率为60,000@m/z 200，AGC为3E6，最大离子进样时间为100ms，扫描范围为m/z 200-2000，标准化碰撞能量为27％，二级质谱扫描分辨率为15,000@m/z 200，扫描范围为m/z 200-2000，AGC为1E6，最大离子进样时间为50ms，动态排除时间为40s，电荷价态选择2+-8+。
样本检测完成后，对全部样本的定量强度(intensity)进行统计分析(图4)，结果显示所有样本定量结果跨越6个数量级，intensity(Log 10)从较低的4到较高的10都能够检测到肽段强度，且intensity分布稳定，表明数据覆盖深度较广，可用于后期分析。
样本的蛋白鉴定数量统计如图5，样品鉴定到的蛋白绝大部分分布在1000和2500区间，鉴定数量相对稳定。
实验例1
用0.1％甲酸水溶液将实施例1～2以及对比例1-2中的ABCD样本全部复溶到同样的1μg/μL浓度，待质谱检测分析进行肽段检测。
上机检测液相参数：流动相A为含0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的80％乙腈。梯度洗脱条件如表2所示，色谱柱为AcclaimTM PepMapTM 100 C18色谱柱(ThermoFisher,0.075mm,20mm)，柱温为55℃；上机检测质谱参数：质谱全扫分辨率为60,000@m/z200，AGC为3E6，最大离子进样时间为100ms，扫描范围为m/z 200-2000，标准化碰撞能量为27％，二级质谱扫描分辨率为15,000@m/z 200，扫描范围为m/z 200-2000，AGC为1E6，最大离子进样时间为50ms，动态排除时间为40s，电荷价态选择2+-8+。
如图6所示，与D样本(尿素法结合传统前处理操作流程)相比，A样本(尿素终浓度为6M)的质谱谱图已经明显没有肽段被检测出；B样本(尿素浓度为4M)的质谱谱图比A样本稍微多点肽段信息；C样本(尿素浓度为3M)有较多的峰被检测到，且检测趋势与传统的前处理方法(D样本)趋于一致。将谱图进行查库，对检测到的肽段信息进行蛋白鉴定，鉴定统计结果如图6所示。因此，选择PVDF过滤板结合终浓度为3M的尿素对尿液样本进行蛋白质组学前处理，既克服了传统FASP法在进行蛋白样本前处理时，无法进行高通量样本处理的缺陷，同时能够提高尿液样本中蛋白检测结果。
实验例2
本实验例验证本发明提供的尿液样本保存方法获得的样本的稳定性。
保存期满后，向0个月(即蛋白裂解后立即进行后续前处理操作)、1个月(即实施例3蛋白富集完，尿蛋白保存于PVDF过滤板中1个月后)、3个月(即实施例4蛋白富集完，尿蛋白保存于PVDF过滤板中3个月后)、5个月(即实施例5蛋白富集完，尿蛋白保存于PVDF过滤板中5个月后)、7个月(即实施例6蛋白富集完，尿蛋白保存于PVDF过滤板中7个月后)、9个月(即实施例7蛋白富集完，尿蛋白保存于PVDF过滤板中9个月后)、12个月(即实施例8蛋白富集完，尿蛋白保存于PVDF过滤板中12个月后)的样本中分别加入二硫苏糖醇至终浓度10mM，室温反应20min；加入碘乙酰胺至终浓度20mM，暗处反应20min；再加入等量的二硫苏糖醇中和过多的碘乙酰胺；加入200μL 70％乙醇，1000g离心，进行PVDF过滤板活化；加入200μL 3M尿素(稀释剂：50mM碳酸氢铵)，1000g离心，进行PVDF过滤板平衡；然后将样品转移入PVDF过滤板，1000g离心；最后加入50mM碳酸氢铵溶液清洗样本，1000g离心；加入100μL 50mM碳酸氢铵溶液和1μg混合的胰蛋白酶(Trypsin)和赖氨酸酶(LysC)，37℃震荡孵育2h，孵育结束后，1000g离心1分钟，收集滤液；再加入150μL 40％乙腈(含有0.1％甲酸)洗脱肽段；将滤液进行合并和浓缩冻干，用0.1％甲酸水溶液复溶到1μg/μL，待质谱检测分析进行肽段检测。
上机检测液相参数：设置流动相A为含0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的80％乙腈。梯度洗脱程序如表2所示，色谱柱为AcclaimTM PepMapTM 100 C18色谱柱(Thermo Fisher,0.075mm,20mm)，柱温为55℃。
上机检测质谱参数：质谱全扫分辨率为60,000@m/z 200，AGC为3E6，最大离子进样时间为100ms，扫描范围为m/z 200-2000，标准化碰撞能量为27％，二级质谱扫描分辨率为15,000@m/z 200，扫描范围为m/z 200-2000，AGC为1E6，最大离子进样时间为50ms，动态排除时间为40s，电荷价态选择2+～8+。
本实验例中蛋白检测的统计结果如图7，从蛋白检测统计结果图发现，尿蛋白保存于PVDF过滤板中12个月内，上机检测出的蛋白数量和肽段数量较稳定，一直维持在1500个蛋白和12000个肽段范围内，波动并不明显。因此，本发明提供的尿液样本保存方法较为可靠，且在1年内能够保证稳定的蛋白数量和质量。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种尿液样本的保存方法，其特征在于，其包括：将经过蛋白裂解后的尿液样本进行还原烷基化处理，然后进行蛋白富集；
所述蛋白富集是采用PVDF过滤板对还原烷基化处理后的样本进行蛋白富集；
所述蛋白裂解采用的裂解液与待裂解的尿液样本的混合体积比为1:0.1～9。
2.根据权利要求1所述的尿液样本的保存方法，其特征在于，所述裂解液选自如下物质中的至少一种：尿素、硫脲、盐酸胍、三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸、苯甲基磺酰氟、十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠和3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐；
优选地，所述裂解液选自尿素，且所述尿素在所述待裂解的尿液样本中的终浓度为1M-5M；
优选地，所述蛋白裂解液采用的稀释液选自如下物质中的至少一种：碳酸氢铵、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、磷酸盐溶液。
3.根据权利要求1或2所述的尿液样本的保存方法，其特征在于，所述蛋白富集前，还包括对所述PVDF过滤板进行活化，活化后用所述裂解液进行平衡，然后将所述还原烷基化处理后的样本转移至平衡后的PVDF过滤板上进行蛋白富集；
优选地，所述活化采用的活化剂为醇类物质。
4.一种尿液样本的前处理方法，其特征在于，其包括：将经过蛋白裂解后的尿液样本进行还原烷基化处理，然后进行蛋白富集，富集后再进行酶解，浓缩冻干；
所述蛋白富集是采用PVDF过滤板对还原烷基化处理后的样本进行蛋白富集；
所述蛋白裂解采用的裂解液与待裂解的尿液样本的混合体积比为1:0.1～9。
5.根据权利要求4所述的尿液样本的前处理方法，其特征在于，所述酶解后还包括收集PVDF过滤板中的滤液；
优选地，所述酶解采用酶为胰蛋白酶和赖氨酸酶；
优选地，所述酶解时间为1-18h；
优选地，所述蛋白富集包括：将还原烷基化处理后的样本加入PVDF过滤板，离心后，用洗脱液清洗离心获得的样本。
6.根据权利要求4所述的尿液样本的前处理方法，其特征在于，所述裂解液选自如下物质中的至少一种：尿素、硫脲、盐酸胍、三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸、苯甲基磺酰氟、十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠和3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐；
优选地，所述裂解液选自尿素，且所述尿素在所述待裂解的尿液样本中的终浓度为1M-5M。
7.一种尿液样本的自动化处理系统，其特征在于，其包括尿液样本储存单元、处理液供应单元、PVDF过滤板供应单元、吸样单元、蛋白收集单元和酶储存单元，且所述尿液样本储存单元、处理液供应单元、PVDF过滤板供应单元、吸样单元、蛋白收集单元和酶储存单元均电连接于控制终端实现自动化控制。
8.根据权利要求7所述的尿液样本的自动化处理系统，其特征在于，所述处理系统还包括裂解反应容器供应单元、摇床、浓缩仪和PCR板；
所述处理液供应单元包括裂解液供应单元、还原剂供应单元、烷基化试剂供应单元、终止烷基化反应试剂供应单元、活化剂供应单元、洗脱液供应单元和复溶溶剂供应单元。
9.一种采用权利要求7-8任一项所述的尿液样本的自动化处理系统对尿液样本处理的方法，其特征在于，其包括：
(1)蛋白裂解：采用吸样单元从尿液样本储存单元取待测尿液样本至裂解反应容器中，通过吸样单元从处理液供应单元中吸取裂解液至裂解反应容器中进行蛋白裂解；
(2)还原烷基化：通过吸样单元从处理液供应单元中吸取还原剂至所述裂解反应容器中进行还原反应，再通过吸样单元从处理液供应单元中吸取烷基化试剂至所述裂解反应容器中进行烷基化反应，然后通过吸样单元从处理液供应单元中吸取终止烷基化反应试剂终止烷基化反应；
(3)蛋白富集：通过吸样单元从处理液供应单元中吸取活化剂至PVDF过滤板，对PVDF过滤板进行活化，再通过吸样单元从处理液供应单元中吸取裂解液至PVDF过滤板，对PVDF过滤板进行平衡，然后通过吸样单元将还原烷基化处理后的产物加入所述PVDF过滤板中，离心；
(4)蛋白酶解：通过吸样单元从酶储存单元中吸取酶反应液至所述PVDF过滤板中进行酶解反应，再通过吸样单元从处理液供应单元中吸取洗脱液至PVDF过滤板中对酶解反应产物进行洗脱，然后将洗脱液合并；
(5)浓缩冻干：将所述洗脱液进行浓缩冻干。
10.一种对尿液样本进行质谱检测的方法，所述方法以非疾病的诊断为目的，其特征在于，其包括：先采用权利要求9所述的方法对尿液样本进行前处理，然后利用质谱仪进行肽段检测；
设置流动相A为含0.05-0.2％甲酸的水溶液，流动相B为含0.05-0.2％甲酸的80％乙腈，进行梯度洗脱，流速为200-300nl/min，柱温为30-55℃；
优选地，所述梯度洗脱的程序为：1-6min，1％-8％B，6-30min，8-99％B；
设置质谱参数包括：质谱全扫分辨率为240,000或120,000或70,000或60,000或45,000或30,000或17,500或15,000或7,500@m/z 200，AGC为1E5～3E6，最大离子进样时间为10～100ms，扫描范围为m/z 200-2000，标准化碰撞能量为15～27％，二级质谱扫描分辨率为240,000或120,000或70,000或60,000或45,000或30,000或17,500或15,000或7,500@m/z200，扫描范围为m/z 200-2000，AGC为1E5～1E6，最大离子进样时间为10～100ms，动态排除时间为10～40s，电荷价态选择2+～8+。
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