CN114341156A - 包封有肽的铁蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明提供可回避细胞膜的破坏、免疫原性和毒性的肽的递送手段。更具体来说，本发明提供以下的(1)～(3)：(1)包封有肽的铁蛋白，其中，肽由3～19个氨基酸残基构成，且满足下述条件：a）‑10.2≤X≤5.9，且445≤Y≤2524，在此，X表示pH9时的肽的电荷，Y表示肽的化学式量；(2)肽的细胞内递送剂，其中，包含上述包封有肽的铁蛋白；(3)上述包封有肽的铁蛋白的制造方法。

Description

包封有肽的铁蛋白

技术领域

本发明涉及包封有肽的铁蛋白等。

背景技术

以细胞内的蛋白质和核酸作为靶标且具有生理活性的肽被期待作为药物应用(非专利文献1)。但是，这些肽大多在细胞膜透过性上存在课题，对各种各样的向细胞内的递送技术进行着探讨。

报道有通过使目标肽包封于以脂质体为代表的纳米粒、微粒中，使脂质体与细胞膜融合，从而将目标肽递送至细胞内的方式(专利文献1)。此外，还报道有使其与具有细胞膜透过性的分子或肽融合，透过细胞、或者通过内体(endosome)摄入细胞内，将目标肽递送至细胞内的方式(非专利文献2)。

另外，铁蛋白是从动植物到微生物普遍存在的由多个单体构成的具有内腔的球状蛋白质。已知在人等动物中，作为构成铁蛋白的单体存在H链和L链这2种单体，而且铁蛋白是由24个单体构成的多聚体(大多数情况为H链和L链的混合物)，具有外径12nm的笼状形态并具有内径7nm的内腔。已知铁蛋白与生物体或细胞中的铁元素的稳态(homeostasis)密切相关，由于可在其内腔中保持铁，因此承担铁的运送、贮存等生理学功能的作用。此外，已知铁蛋白被摄入转铁蛋白受体递呈细胞内(非专利文献3)。

铁蛋白还被探讨作为在其内腔中包封低分子有机化合物的DDS载体(专利文献2)的应用，此外，也被用于电子器件的制作。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利第4515736号

专利文献2：中国专利申请公开第106110333号公报。

非专利文献

非专利文献1：Y.Hayashi et al.ACS Chem.Biol.2012；7(3)：607-613

非专利文献2：Z.Guo et al.Biomed Rep.2016；4(5)：528-534

非专利文献3：L.Li et al.Proc Natl Acad Sci USA.2010；107(8)：3505-10。

发明内容

发明所要解决的技术问题

如上所述，作为将目标肽递送至细胞内的实现方式，报道有使用脂质体或细胞透过性肽。然而，脂质体和细胞透过性肽通常在中性的pH区域内带正电，因此存在由于与细胞膜的相互作用而破坏细胞膜的课题。此外，关于脂质体，还存在脂质体会显示免疫原性和脂质体的代谢产物会显示毒性的课题。

因此，本发明的目的是提供可避免如上所述的细胞膜的破坏、免疫原性和毒性的肽的递送手段。

解决技术问题所采用的技术方案

本发明人等进行了认真研究，结果发现，可将规定的肽包封于铁蛋白，能够通过使用这样的规定的肽来制作包封有肽的铁蛋白，并且可通过使用这样的包封有肽的铁蛋白而将规定的肽递送至特定细胞的细胞内。

铁蛋白在中性的pH区域内带负电，并且介以转铁蛋白受体被纳入特定的细胞内。因此，通过使用包封有规定的肽的铁蛋白，从而在不破坏细胞膜的情况下，将规定的肽递送至细胞内，由此可解决上述课题。此外，铁蛋白为在人等哺乳动物中天然存在的天然蛋白质，因此通过使铁蛋白的种类(作为铁蛋白来源的哺乳动物种属)与施用包封有肽的铁蛋白的哺乳动物种属一致，从而可解决免疫原性的课题。另外，铁蛋白由天然氨基酸构成，天然氨基酸的代谢产物也是存在于生物体中的天然物质，由此可知天然氨基酸的代谢产物也不用担心细胞毒性，因此还可解决由代谢产物产生的细胞毒性的课题。

如上所述，本发明人等成功地解决了上述课题，完成了本发明。即，本发明如下：

[1]一种包封有肽的铁蛋白，其中，肽由3～19个氨基酸残基构成，且

满足下述条件：

a)-10.2≤X≤5.9，且445≤Y≤2524，

在此，X表示pH9时的肽的电荷，Y表示肽的化学式量；

[2]根据[1]的包封有肽的铁蛋白，其中，肽由4～16个氨基酸残基构成；

[3]根据[1]或[2]的包封有肽的铁蛋白，其中，肽满足下述条件：

b)-10.2≤X≤0.0，且445≤Y≤2524，或者

c)3.7≤X≤5.9，且445≤Y≤2524，

在此，X和Y与[1]中的相应符号的含义相同；

[4]一种肽的细胞内递送剂，其中，

包含包封有肽的铁蛋白，

肽由3～19个氨基酸残基构成，且

满足下述条件：

a)-10.2≤X≤5.9，且445≤Y≤2524，

在此，X表示pH9时的肽的电荷，Y表示肽的化学式量；

[5]根据[4]的递送剂，其中，肽被递送至人细胞的细胞内；

[6]根据[4]或[5]的递送剂，其中，肽被递送至癌细胞的细胞内；

[7]一种包封有肽的铁蛋白的制造方法，其中，包括：

1)在存在肽或不存在肽的条件下，将铁蛋白置于pH3.0以下的缓冲液中，使铁蛋白解离，以及

2)使解离后的铁蛋白和肽共存于pH5.0以上且10.0以下的缓冲液中，生成包封有肽的铁蛋白；

肽由3～19个氨基酸残基构成，且

满足下述条件：

a)-10.2≤X≤5.9，且445≤Y≤2524，

在此，X表示pH9时的肽的电荷，Y表示肽的化学式量。

发明的效果

本发明的包封有肽的铁蛋白可在不破坏细胞膜的情况下，将规定的肽递送至细胞内。本发明的包封有肽的铁蛋白也可回避免疫原性和由代谢产物产生的细胞毒性这两者。本发明的包封有肽的铁蛋白进而可将规定的肽特异性且再现性良好地递送至转铁蛋白受体递呈细胞(特别是转铁蛋白受体的表达量高的细胞)的细胞内。

附图的简单说明

图1是表示基于柱层析法确认铁蛋白(FTH)和肽(PKC-F)的复合物形成的图；

图2是表示针对包封于铁蛋白(FTH)中的肽(PKC-F)的LC-MS分析的结果的图；

图3是表示针对肽(PKC-F)的LC-MS分析的结果的图；

图4是表示包封有肽(PKC-F)的铁蛋白(FTH)的透射型电子显微镜(TEM)图像的图；

图5是表示未包封肽(PKC-F)的铁蛋白(FTH)、和包封有肽(PKC-F)的铁蛋白(FTH)的表面电荷的比较的图；

图6表示基于荧光激活细胞分选(FACS)测定在转铁蛋白受体(TfR)递呈细胞(SKBR-3细胞)内摄入肽(PKC-F)的测定结果的图。肽(PKC-F)以包封于铁蛋白(FTH)的状态(试验对象)、和仅肽(PKC-F)的状态(阴性对象)使用；

图7表示基于双光子激发荧光显微镜测定向转铁蛋白受体TfR递呈细胞(SKBR-3细胞)内摄入肽(PKC-F)的测定结果的图。肽(PKC-F)以包封于铁蛋白(FTH)的状态(试验对象)、和仅肽(PKC-F)的状态(阴性对象)使用；

图8是表示基于柱层析法确认铁蛋白(FTH)和肽(FAM-SV40)的复合物形成的图；

图9表示基于荧光激活细胞分选(FACS)测定向转铁蛋白受体(TfR)递呈细胞(SKBR-3细胞)内摄入肽(FAM-SV40)的测定结果的图。肽(FAM-SV40)以包封于铁蛋白(FTH)的状态(试验对象)、和仅肽(FAM-SV40)的状态(阴性对象)使用；

图10表示基于荧光激活细胞分选(FACS)来比较转铁蛋白受体TfR递呈细胞(TfR表达量多的SKBR-3细胞、和TfR表达量低的HEK293E细胞)间的肽(FAM-SV40)的摄入的图；

图11表示基于荧光激活细胞分选(FACS)来比较转铁蛋白受体TfR递呈细胞(TfR表达量多的SKBR-3细胞、和TfR表达量低的HEK293E细胞)间的肽(FAM-SV40)的摄入的图。图10的结果绘制于图11中；

图12是表示在进行了解缔合/重缔合工艺的情况下存在来源于包封有肽(ClAc-FHC)的铁蛋白(FTH)的肽(ClAc-FHC)的MS峰(A)、以及在未进行解缔合/重缔合工艺的情况下不存在该MS峰(B)的图；

图13是表示在进行了解缔合/重缔合工艺的情况下存在来源于包封有肽(EGFR、cyloRGDfV、或FGF3-FP16)的铁蛋白(FTH)的肽(EGFR、cyloRGDfV、或FGF3-FP16)的MS峰的图；

图14是表示在进行了解缔合/重缔合工艺的情况下存在来源于包封有肽(Hymenistatin I、Ex10、或ανβ6)的铁蛋白(FTH)的肽(Hymenistatin I、Ex10、或ανβ6)的MS峰的图；

图15是表示在进行了解缔合/重缔合工艺的情况下存在来源于包封有肽(NRP-1-2、Murepavadin、或Pakti-L1)的铁蛋白(FTH)的肽(NRP-1-2、Murepavadin、或Pakti-L1)的MS峰的图；

图16是表示在进行了解缔合/重缔合工艺的情况下存在来源于包封有肽(NS、GRP78-3、或FBP0032)的铁蛋白(FTH)的肽(NS、GRP78-3、或FBP0032)的MS峰的图；

图17是表示在进行了解缔合/重缔合工艺的情况下存在来源于包封有肽(FBP0033)的铁蛋白(FTH)的肽(FBP0033)的MS峰的图；

图18是关于能否用铁蛋白(FTH)包封各种肽，表示肽的pH9时的肽的电荷与肽的化学式量之间的相关性的图(试验数3次)。●：3次均再现性良好地确认了包封的肽；△：可确认包封的情况为2次以下的肽；×：1次也未能确认包封的肽。即，可将满足a)-10.2≤pH9时的肽的电荷(X)≤5.9、且445≤肽的化学式量(Y)≤2524的条件的肽包封于铁蛋白中。此外，在满足上述条件的肽中，满足b)-10.2≤X≤0.0、且445≤Y≤2524、或者c)3.7≤X≤5.9、且445≤Y≤2524的条件的肽可再现性良好地包封于铁蛋白中；

图19是表示基于柱层析法确认铁蛋白(FTL)和肽(PKC-F)的复合物形成的图。

具体实施方式

本发明提供一种包封有肽的铁蛋白，其中，肽由3～19个氨基酸残基构成，且

满足下述条件：

a)-10.2≤X≤5.9，且445≤Y≤2524，

在此，X表示pH9时的肽的电荷，Y表示肽的化学式量。

构成肽的氨基酸只要是具有氨基和羧基这两者的化合物就无特别限定。例如，构成肽的氨基酸可以是构成蛋白质的天然氨基酸(20种L-α-氨基酸)，也可以是不构成蛋白质的非天然氨基酸。作为天然氨基酸，可举出例如：L-丙氨酸(A)、L-天冬酰胺(N)、L-半胱氨酸(C)、L-谷氨酰胺(Q)、L-异亮氨酸(I)、L-亮氨酸(L)、L-蛋氨酸(M)、L-苯丙氨酸(F)、L-脯氨酸(P)、L-丝氨酸(S)、L-苏氨酸(T)、L-色氨酸(W)、L-酪氨酸(Y)、L-缬氨酸(V)、L-天冬氨酸(D)、L-谷氨酸(E)、L-精氨酸(R)、L-组氨酸(H)、L-赖氨酸(K)、及甘氨酸(G)。作为非天然氨基酸，可使用例如L-型或D-型的任意的非天然氨基酸(例如，α-氨基酸、β-氨基酸、及γ-氨基酸)。更具体来说，作为非天然氨基酸，可举出例如：2,4-二氨基丁酸(Dab)、2,3-二氨基丙酸(Dap)、鸟氨酸、高组氨酸、高苯丙氨酸、环亮氨酸、1-氨基环己烷羧酸、羧基环丙胺、2-氨基环己烷羧酸、1-氨基环丁烷羧酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、焦谷氨酰胺、青霉胺、高氨基酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、7-氨基庚酸、4-氨基-3-羟基丁酸、5-氨基乙酰丙酸、D-2-氨基己二酸、以及上述天然氨基酸和非天然氨基酸的修饰化合物(例如，N-甲基化等的N-烷基化化合物、苄氧羰基氨基化化合物、叔丁氧基羰基化化合物、9-芴基甲氧基羰基化化合物和叠氮化化合物)。

对于肽而言，可仅由天然氨基酸构成，也可仅由非天然氨基酸构成，还可由天然氨基酸和非天然氨基酸的混合物构成。肽还可以是N末端氨基和C末端羧基被保护的肽，或者是未被保护的肽。作为N-末端氨基的保护基，可举出例如：烷基羰基(酰基)(例如乙酰基、丙氧基、叔丁氧基羰基等丁氧基羰基)、烷氧基羰基(例如芴基甲氧基羰基)、芳氧基羰基、芳基烷基(芳烷基)氧基羰基(例如苄氧基羰基)。作为C-末端羧基的保护基，可举出例如可形成酯或酰胺的基团。作为可形成酯或酰胺的基团，可举出例如烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基)、芳氧基(例如苯氧基、萘氧基)、芳烷基氧基(例如苄氧基)、氨基。

肽的主链由酰胺键和碳链构成。作为碳链，可举出例如：亚烷基(例如，亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基等C1～C6亚烷基)、亚环烷基(例如，亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环己基、亚环庚基、亚环辛基等C3～C8亚环烷基)、亚芳基(例如，亚苯基、亚萘基等C6～C12亚芳基)。或者，肽的主链可按照包含除酰胺键以外的键结构、和/或除碳链以外的链结构的方式构成。作为除酰胺键以外的键结构，可举出例如N-烷基酰胺键(例如，N-甲基酰胺键、N-乙基酰胺键等的在氮原子上具有C1～C6烷基的酰胺键)、酯键、醚键、二硫键、硫醚键、和硫酯键。作为除碳链以外的链结构，可举出例如包含杂环(例如，噁唑、甲基噁唑、噻唑、三唑)的结构。

此外，肽可具有直链状或支链状、或者环状的结构。例如，具有环状结构的肽可以是N末端氨基酸残基和C末端氨基酸残基经由酰胺键而环化的肽。此外，包含多个(例如，2个)半胱氨酸残基的肽可通过经由位于半胱氨酸残基的侧链的硫醇基而形成二硫键，从而形成环状的结构。进而，即使是包含1个半胱氨酸残基的肽，也可通过与N末端氨基酸残基或C末端氨基酸残基中的任一个结合，从而形成环状的结构。

构成肽的氨基酸残基数为3～19个。构成肽的氨基酸残基数可较好是4个以上。构成肽的氨基酸残基数还可以是18个以下，较好是17个以下，更好是16个以下。更具体来说，构成肽的氨基酸残基数可以是3～18个、3～17个、3～16个、4～18个、4～17个或4～16个。

本发明中，包封于铁蛋白中的肽如图18所示，满足下述条件：

a)-10.2≤X≤5.9，且445≤Y≤2524，

在此，X表示pH9时的肽的电荷，Y表示肽的化学式量。

肽的化学式量的值可基于肽的组成式作为原子量与原子数的积的总和而求得。

pH9时的肽的电荷可利用ChemAxon(O.Toure等,Oil Gas Sci.Technol.2013,68,281-297.)进行评价(参照实施例)，但在不希望利用ChemAxon进行评价的情况下(例如，利用ChemAxon的评价困难或者使用缺乏准确性的非常特殊的肽的情况下)，可通过L.Settimo等,Pharm.Res.2014,31,1082-1095.中所记载的实验性方法进行评价。

不希望本发明受理论约束，但作为满足上述条件的肽被包封于铁蛋白内的理由，可认为如下。

(1)希望满足-10.2≤X的条件的理由

在pH高于pH5的水溶液中铁蛋白带较强的负电荷。因此，可认为用于铁蛋白的包封的溶液的pH(例如，pH9)时，从中性至带正电荷的分子容易包封于铁蛋白，带较强的负电荷的分子难以包封于铁蛋白。因此，可认为-10.2＞X的带较强的负电荷的肽由于与铁蛋白的电性相斥，难以包封于铁蛋白。另一方面，对于-10.2≤X的肽而言，铁蛋白形成笼状的超分子结构的力比肽-铁蛋白间的负电荷的相斥作用力更强，因此有包封于铁蛋白内的可能性。

(2)希望满足X≤5.9的条件的理由

对于带过强的正电荷的肽而言，肽会因电相互作用而吸附于铁蛋白的内外，妨碍铁蛋白形成笼状结构，可能会不被包封。此外，带较强的正电荷的肽容易凝集，形成无法包封于铁蛋白内的尺寸的粒子，可能会不被包封。

(3)希望满足445≤Y的条件的理由

化学式量过小的肽可能会在铁蛋白形成笼状结构的过程中从铁蛋白内部通过扩散而流出，难以被包封。

(4)希望满足Y≤2524的条件的理由

铁蛋白内腔的直径为7nm，因化学式量大，故可认为体积大的分子难以被包封于铁蛋白。

从与采用铁蛋白的肽的包封相关的再现性提高等的观点来看，肽较好是满足下述条件：

b)-10.2≤X≤0.0，且445≤Y≤2524，或者

c)3.7≤X≤5.9，且445≤Y≤2524。

(5)将0.0＜X＜3.7除外的理由

对于化学式量大至一定程度且带电量不太多的肽而言，肽分子自身凝集，形成无法包封于铁蛋白内的尺寸的粒子，因此可认为难以被包封于铁蛋白。

本发明中，作为铁蛋白，可使用来源于各种动物的铁蛋白。作为铁蛋白所源于的动物，可举出例如哺乳动物或鸟类(例如，鸡)，较好是哺乳动物。作为哺乳动物，可举出例如灵长类(例如，人、猴、黑猩猩)、啮齿类(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔)、家畜和使役用的哺乳动物(例如，牛、猪、绵羊、山羊、马)。

已知在人等动物中，作为构成铁蛋白的铁蛋白单体存在铁蛋白H链和L链这2种单体，而且铁蛋白是由24个单体构成的多聚体(大多数情况为H链和L链的混合物)。因此，本发明中，可使用：仅由铁蛋白H链构成的铁蛋白、仅由铁蛋白L链构成的铁蛋白、以及由铁蛋白H链和L链的混合物构成的铁蛋白。

作为铁蛋白单体，可使用天然铁蛋白单体、或者具有24聚体形成能力的其基因重组铁蛋白单体中的任一种。例如，基因重组铁蛋白单体可在构成铁蛋白单体的6个α-螺旋间的柔性连接区(flexible linker region)中进行修饰。作为这样的基因重组铁蛋白单体，可举出例如：在构成铁蛋白单体的6个α-螺旋中的从N末端起数第1个与第2个之间、第2个与第3个之间、第3个与第4个之间、第4个与第5个之间、或者第5个与第6个之间的柔性连接区中插入有功能性肽的铁蛋白单体(参照例如美国专利申请公开第2016/0060307号；Jae OgJeon et al.,ACS Nano(2013),7(9),7462-7471；Sooji Kim et al.,Biomacromolecules(2016),17(3),1150-1159；Young Ji Kang et al.,Biomacromolecules(2012),13(12),4057-4064)。例如，人铁蛋白H链(SEQ ID NO:1)和人铁蛋白L链(SEQ ID NO:2)中，6个α-螺旋中的从N末端起数第1～6个α-螺旋如表1所示。因此，人铁蛋白H链(SEQ ID NO:1)的柔性连接区为第1个与第2个之间的柔性连接区(由第43～49位的氨基酸残基形成的区域)、第2个与第3个之间的柔性连接区(由第78～96位的氨基酸残基形成的区域)、第3个与第4个之间的柔性连接区(由第125～127位的氨基酸残基形成的区域)、第4个与第5个之间的柔性连接区(第138位的氨基酸残基的位置)、或第5个与第6个之间的柔性连接区(第160～164位的氨基酸残基的区域)。此外，人铁蛋白L链(SEQ ID NO:2)的柔性连接区为第1个与第2个之间的柔性连接区(由第38～45位的氨基酸残基形成的区域)、第2个与第3个之间的柔性连接区(由第74～92位的氨基酸残基形成的区域)、第3个与第4个之间的柔性连接区(由第121～123位的氨基酸残基形成的区域)、第4个与第5个之间的柔性连接区(第134位的氨基酸残基的位置)、或第5个与第6个之间的柔性连接区(第155～159位的氨基酸残基的区域)。

[表A]

表A.铁蛋白的α-螺旋的位置

α-螺旋的分类基于Int J Mol Sci.2011；12(8)：5406-5421。

基因重组铁蛋白单体还可在其N末端区域和/或C末端区域中进行修饰。铁蛋白单体的N末端在多聚体的表面上露出，其C末端不会在表面上露出。因此，在铁蛋白单体的N末端添加的肽部分会在多聚体的表面露出，可与存在于多聚体外部的靶材(目标材料)相互作用(例如，国际公开第2006/126595号)。另一方面，铁蛋白单体的C末端可通过修饰其氨基酸残基而与包封于铁蛋白内腔中的有机化合物相互作用(例如，Y.J.Kang,Biomacromolecules.2012,vol.13(12),4057)。作为这样的基因重组铁蛋白单体，可举出例如在N末端或C末端添加有功能性肽的铁蛋白单体。

从临床应用的观点来看，铁蛋白较好是人铁蛋白。作为人铁蛋白，可使用：仅由人铁蛋白H链构成的人铁蛋白、仅由人铁蛋白L链构成的人铁蛋白、以及由人铁蛋白H链和L链的混合物构成的人铁蛋白。

优选地，人铁蛋白H链可以是以下蛋白质：

(A1)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质；

(B1)包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中包括选自氨基酸残基的取代、缺失、插入及添加中的1个或数个氨基酸残基的修饰的氨基酸序列，且具有24聚体形成能力的蛋白质；或者

(C1)包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，且具有24聚体形成能力的蛋白质。

优选地，人铁蛋白L链可以是以下蛋白质：

(A2)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质；

(B2)包含在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中包括选自氨基酸残基的取代、缺失、插入及添加中的1个或数个氨基酸残基的修饰的氨基酸序列，且具有24聚体形成能力的蛋白质；或者

(C2)包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，且具有24聚体形成能力的蛋白质。

上述(B1)和(B2)中，通过选自氨基酸残基的缺失、取代、添加及插入中的1、2、3或4种修饰，可改变1个或数个氨基酸残基。氨基酸残基的修饰可被引入至氨基酸序列中的1个区域，也可被引入至多个不同的区域。术语“1个或数个”表示不会大幅损害蛋白质活性的个数。术语“1个或数个”所示的数量例如为1～50个，较好是1～40个，更好是1～30个，进一步更好是1～20个，特别好是1～10个或1～5个(例如1个、2个、3个、4个或5个)。

上述(C1)和(C2)中，蛋白质的同一性％的计算可通过算法blastp进行。更具体来说，多肽的同一性％的计算可使用National Center for Biotechnology Information(NCBI)(国立生物技术信息中心)所提供的算法blastp中默认设定的评分参数(Matrix(矩阵):BLOSUM62；Gap Costs(空位罚分):Existence(存在)＝11 Extension(延伸)＝1；Compositional Adjustments(组成调整):Conditional compositional score matrixadjustment(条件组成打分矩阵调整))来进行。

氨基酸序列中应引入突变的氨基酸残基的位置，对于本领域技术人员不言自明，可进一步参考序列比对来确定(特别规定)。具体来说，本领域技术人员可以1)比较多个氨基酸序列，2)明确相对保守的区域和相对不保守的区域，接着3)由相对保守的区域和相对不保守的区域可分别预测能对功能发挥重要作用的区域和不能对功能发挥重要作用的区域，所以能够识别结构和功能的相关性。因此，本领域技术人员可通过利用序列比对来确定在氨基酸序列中应引入突变的位置，还可并用已知的二级结构和三级结构信息来确定在氨基酸序列中应引入突变的氨基酸残基的位置。优选地，作为突变的引入部位，可利用上述柔性连接区、以及N末端和C末端区域。

在通过取代使氨基酸残基突变的情况下，氨基酸残基的取代可以是保守性取代。在本说明书中使用的情况下，术语“保守性取代”是指将规定的氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基进行取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在该领域中周知。例如，作为这样的家族，可举出：具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有非电荷性(不带电荷)极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、具有β位分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)、具有含羟基(例如醇性、酚性)侧链的氨基酸(例如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)、及具有含硫侧链的氨基酸(例如半胱氨酸、蛋氨酸)。较好的是，氨基酸的保守性取代可以是：天冬氨酸与谷氨酸之间的取代；精氨酸、赖氨酸和组氨酸之间的取代；色氨酸与苯丙氨酸之间的取代；苯丙氨酸与缬氨酸之间的取代；亮氨酸、异亮氨酸和丙氨酸之间的取代；以及，甘氨酸与丙氨酸之间的取代。

基因重组铁蛋白单体还可以是包含功能性肽的基因重组铁蛋白单体。作为功能性肽，可使用能够在与目标蛋白质融合的情况下赋予目标蛋白质以任意的功能的肽。作为这样的功能性肽，可举出具有对生物有机分子的结合能力的肽、蛋白酶降解性肽、稳定化肽、细胞透过性肽。

作为生物有机分子，可举出例如：蛋白质(例如寡肽或多肽)、核酸(例如DNA或RNA、或者核苷、核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸)、糖类(例如单糖、寡糖或多糖)、脂质。生物有机分子还可以是细胞表面抗原(例如癌抗原、心脏病标志物、糖尿病标志物、神经系统疾病标志物、免疫性疾病标志物、炎症标志物、激素、传染病标志物)。生物有机分子还可以是疾病抗原(例如癌抗原、心脏病标志物、糖尿病标志物、神经系统疾病标志物、免疫性疾病标志物、炎症标志物、激素、传染病标志物)。作为具有对这样的生物有机分子的结合能力的肽，报道有各种肽。例如，报道有：具有对蛋白质的结合能力的肽(参照例如F.Danhier等，Mol.Pharmaceutics，2012，第9卷，第11期，第2961页；C-H.Wu等，Sci.Transl.Med.，2015，第7卷，第290期，290-91；L.Vannucci等，Int.J.Nanomedicine，2012，第7卷，第1489页；J.Cutrera等，Mol.Ther.，2011，第19(8)卷，第1468页；R.Liu等，Adv.Drug Deliv.Rev.，2017，第110-111卷，第13页)、具有对核酸的结合能力的肽(参照例如R.Tan等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1995，第92卷，第5282页；R.Tan等，Cell，1993，第73卷，第1031页；R.Talanian等，Biochemistry，1992，第31卷，第6871页)、具有对糖类的结合能力的肽(参照例如K.Oldenburg等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1992，第89卷，第12期，第5393-5397页；K.Yamamoto等，J.Biochem.,1992，第111卷，第436页；A.Baimiev等，Mol.Biol.(莫斯科)，2005，第39卷，第1期，第90页)、具有对脂质的结合能力的肽(参照例如O.Kruse等，BZ.Naturforsch.，1995，第50c卷，第380页；O.Silva等，Sci.Rep.，2016，第6卷，27128；A.Filoteo等，J.Biol.Chem.，1992，第267卷，第17期，第11800页)等的各种肽。

作为功能性肽使用蛋白酶降解性肽的情况下，可举出例如胱天蛋白酶(caspase)和组织蛋白酶等半胱氨酸蛋白酶(D.McIlwain1等，Cold Spring Harb Perspect Biol.，2013，第5卷，a008656；V.Stoka等，IUBMB Life，2005，第57卷，第4-5期，第347页)、胶原酶(G.Lee等，Eur J Pharm Biopharm.，2007，第67卷，第3期，第646页)、凝血酶和Xa因子(R.Jenny等，Protein Expr.Purif.,2003，第31卷，第1页；H.Xu等，J.Virol.,2010，第84卷，第2期，第1076页)、来源于病毒的蛋白酶(C.Byrd等，Drug Dev.Res.，2006，第67卷，第501页)。

作为蛋白酶降解性肽，报道有各种肽(参照例如E.Lee等，Adv.Funct.Mater.，2015，第25卷，第1279页；G.Lee等，Eur J Pharm Biopharm.，2007，第67卷，第3期，第646页；Y.Kang等，Biomacromolecules，2012，第13卷，第12期，第4057页；R.Talanian等，J.Biol.Chem.，1997，第272卷，第9677页；Jenny等，Protein Expr.Purif.，2003，第31卷，第1页；H.Xu等，J.Virol.，2010，第84卷，第2期，第1076页)。因此，本发明中，可使用这样的肽、或它们的突变肽(例如，1、2、3、4或5个氨基酸残基的保守性取代等突变)、或者具有1个或多个这样的肽、或它们的突变肽的氨基酸序列的肽作为蛋白酶降解性肽。

作为稳定化肽，报道有各种肽(参照例如X.Meng等，Nanoscale，2011，第3卷，第3期，第977页；E.Falvo等，Biomacromolecules，2016，第17卷，第2期，第514页)。因此，本发明中，可使用这样的肽、或它们的突变肽(例如，1、2、3、4或5个氨基酸残基的保守性取代等突变)、或者具有1个或多个这样的肽、或它们的突变肽的氨基酸序列的肽作为稳定化肽。

作为细胞透过性肽，报道有各种肽(参照例如Z.Guo等，Biomed.Rep.，2016，第4卷，第5期，第528页)。因此，本发明中，可使用这样的肽、或它们的突变肽(例如，1、2、3、4或5个氨基酸残基的保守性取代等突变)、或者具有1个或多个这样的肽、或它们的突变肽的氨基酸序列的肽作为细胞透过性肽。

作为功能性肽，较好是具有对生物有机分子的结合能力的肽。作为具有对生物有机分子的结合能力的肽，更好是具有对蛋白质的结合能力的肽。

本发明还提供包含上述的包封有肽的铁蛋白的肽递送剂。

本发明的肽递送剂可经由铁蛋白与转铁蛋白受体递呈细胞之间的相互作用，将包封有肽的铁蛋白中的肽递送至转铁蛋白受体递呈细胞的内部。作为转铁蛋白受体递呈细胞，可举出例如：存在于表皮基底层、胰腺内分泌组织、脑下垂体、胎盘、大脑皮质(脑内皮质)、纹状体、肾脏近曲小管、食道、宫颈管、胃粘膜上皮、胸部上皮等组织和部位的细胞，以及红细胞、成红细胞、脑毛细血管内皮细胞、肝细胞、库普弗细胞、海马神经元等细胞。作为转铁蛋白受体递呈细胞，可使用来源于任意的哺乳动物的细胞。作为这样的哺乳动物，可举出例如：灵长类(例如，人、猴、黑猩猩)、啮齿类(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔)、家畜和使役用的哺乳动物(例如，牛、猪、绵羊、山羊、马)。从临床应用的观点来看，哺乳动物较好是人。

本发明的肽递送剂还可将肽递送至所有转铁蛋白受体递呈细胞的内部，但能够更加特异性且再现性良好地将肽递送至转铁蛋白受体的表达量高的细胞的内部。因此，作为转铁蛋白受体递呈细胞，较好是转铁蛋白受体的表达量高的细胞。作为转铁蛋白受体的表达量高的细胞，可举出例如：上述的转铁蛋白受体递呈细胞中存在于表皮基底层、胰腺内分泌组织、脑下垂体、胎盘等组织和部位的细胞，以及红细胞、成红细胞、脑毛细血管内皮细胞、肝细胞、库普弗细胞等细胞。

特定的实施方式中，转铁蛋白受体递呈细胞可以是会成为特定疾病的原因的细胞。作为这样的特定疾病，可举出例如癌症、白血病、恶性淋巴瘤，较好是癌症。作为癌症，可举出例如：乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、肺癌(例如，鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌等非小细胞癌、以及小细胞癌)、消化系统癌症(例如，胃癌、小肠癌、大肠癌、直肠癌)、胰腺癌、肾癌、胸腺癌、脾癌、甲状腺癌、肾上腺癌、前列腺癌、膀胱癌、骨癌、皮肤癌、脑肿瘤、黑色素瘤，较好是乳腺癌。因此，本发明的肽递送剂在这样的特定疾病的预防或治疗中有用。

此外，本发明还提供包含下述1)和2)的上述的包封有肽的铁蛋白的制造方法：

1)将铁蛋白置于pH3.0以下的缓冲液中，使铁蛋白解离(解缔合工艺)，以及

2)使解离后的铁蛋白和肽共存于pH5.0以上且10.0以下的缓冲液中，生成包封有肽的铁蛋白(重缔合工艺)。

上述1)中，通过将铁蛋白置于pH3.0以下的缓冲液中，可使铁蛋白(24聚体)解缔合(脱会合)成铁蛋白单体。铁蛋白在缓冲液中的放置可在存在肽或不存在肽的条件下进行。铁蛋白在缓冲液中的放置在不存在肽的条件下进行时，在上述2)之前将肽添加于缓冲液中。

作为缓冲液，可使用能够应对pH3.0以下的酸性条件的任意的缓冲液。作为这样的缓冲液，可举出例如甘氨酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、碳酸缓冲液、硼酸缓冲液、酒石酸缓冲液、MES(2-吗啉基乙磺酸)缓冲液。

1)中所用的缓冲液的pH较好是2.8以下，更好是2.6以下，进一步更好是2.5以下。pH的测定可通过使用pH分析仪(LAQUA，F-72，Horiba)和pH电极(9680S-10D)在25℃下的测量来进行。

铁蛋白在pH3.0以下的缓冲液中的放置时间只要是铁蛋白的解缔合所需的时间，则无特别限定。更具体来说，这样的时间也根据pH等条件而不同，但从包封有肽的铁蛋白的制作效率和包封有肽的铁蛋白的制作时间的缩短等观点来看，例如为1分钟～10小时，较好是2分钟～5小时，更好是3分钟～2小时，进一步更好是4分钟～1小时，特别好是5～30分钟。

1)结束后，可通过缓冲液的更换、或者缓冲液或碱的追加，来进行2)的操作。例如，缓冲液的更换可通过以下方式进行：中和并放置1)的操作后的缓冲液，接着回收包含解离后的铁蛋白和肽的上清液后，与pH5.0以上且10.0以下的缓冲液混合。作为pH5.0以上且10.0以下的缓冲液，可举出例如Tris缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、碳酸缓冲液、甘氨酸缓冲液。

2)中所用的缓冲液的pH较好是pH5.0以上且9.5以下，更好是pH5.0以上且9.2以下，进一步更好是pH5.0以上且9.0以下。

解离后的铁蛋白和肽在缓冲液中的放置时间只要是铁蛋白的重缔合(复性)所需的时间，则无特别限定。更具体来说，这样的时间也根据pH等条件而不同，但从包封有肽的铁蛋白的制作效率和包封有肽的铁蛋白的制作时间的缩短等观点来看，例如为10分钟～72小时，较好是20分钟～48小时，进一步更好是30分钟～24小时。

实施例

以下，示出实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限定于以下的实施例。

＜实施例1：铁蛋白的制备＞

对编码人源铁蛋白H链(FTH(SEQ ID NO:1))的DNA进行了全合成。以全合成的DNA为模板，以5’-GAAGGAGATATACATATGACGACCGCGTCCACCTCG-3’(SEQ ID NO:3)和5’-CTCGAATTCGGATCCTTAGCTTTCATTATCACTGTC-3’(SEQ ID NO:4)为引物进行了PCR。此外，以pET20(默克公司)为模板，以5’-TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC-3’(SEQ ID NO:5)和5’-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3’(SEQ ID NO:6)为引物进行了PCR。将分别得到的PCR产物用Wizard DNA纯化系统(Clean-Up System)(普洛麦格(Promega)公司)纯化后，以In-Fusion HD克隆试剂盒(Cloning Kit)(Takara Bio株式会社)在50℃下进行15分钟的In-Fusion酶处理，从而构建了携带有编码FTH的基因的表达质粒(pET20-FTH)。

接着，将导入了构建的pET20-FTH的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)在100ml的LB培养基(包含10g/l的细菌用胰蛋白胨(Bacto-typtone)、5g/l的细菌用酵母提取物(Bacto-yeast extract)、5g/l的NaCl、100mg/l的氨苄西林)中于37℃进行了24小时的烧瓶培养。将所得的菌体进行超声波破碎后，将上清液于60℃加热20分钟。将加热后得到的上清液注入用50mM的TrisHCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPerp Q HP柱(GE医疗(GEHealthcare)公司)，用含0mM至500mM NaCl的50mM TrisHCl缓冲液(pH8.0)施以盐浓度梯度，从而分离纯化目标蛋白质。将含该蛋白质的溶液的溶剂通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤而置换为10mM的TrisHCl缓冲液(pH8.0)。将该溶液注入用10mM的TrisHCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR柱(GE医疗公司)，根据尺寸来分离纯化FTH。将含该FTH的溶液通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤进行浓缩，使用蛋白质测试用CBB溶液(Nacalai Tesque株式会社)，以牛白蛋白为标准确定了含有蛋白质的浓度。结果是，每100ml培养液，可以得到1ml含有5mg/ml的FTH的溶液。应予说明，pH的测定使用pH分析仪(LAQUA，F-72，Horiba)和pH电极(9680S-10D)在25℃下进行。

＜实施例2：经荧光修饰的肽的包封研究(1)＞

针对使用铁蛋白的肽递送，尝试了包封有以荧光染料荧光素(FAM)进行了修饰的肽(5(6)-FAM-RFARKGALRQKNVHEVKN(SEQ ID NO:9)，PKC-F，化学式量2524，表3)的FTH的构建。

将包含终浓度5mg/ml的FTH(化学式量509421)和终浓度0.5mM的肽的50mM甘氨酸盐酸盐缓冲液(pH2.3)0.5ml在室温下放置15分钟。然后，加入1M的Tris盐酸盐缓冲液(pH9.0)50μl进行中和，在室温下放置3小时。放置后，进行离心分离(15000rpm，1分钟)后，回收上清液，用10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)将容量增加至3ml。将该溶液注入用10mM的TrisHCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR柱(GE医疗公司)，以1.3ml/分钟的流速，根据尺寸来分离纯化24聚体的FTH。将经纯化的铁蛋白使用以10mM的Tris HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPrep 16/60Sephacryl S-300 HR柱(GE医疗公司)以0.5ml/分钟的流速进行了分析，结果是，在与FTH的峰相同的位置确认到仅FTH时未确认到的480nm的吸光，可知FTH与肽形成了复合物(图1)。

将该含FTH的溶液通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤浓缩至0.25ml。通过LC-MS分析确认到溶液中含有肽。为了LC-MS分析，向样品溶液50μl中加入1M甘氨酸盐酸盐缓冲液(pH2.3)50μl并在室温下放置15分钟。向该溶液中加入900μl的乙醇，剧烈搅拌后，通过离心分离(15000rpm，5分钟)回收上清液。对该上清液进行了分析。本次，作为LC-MS，使用LCMS-2020(株式会社岛津制作所)，柱使用Inertsil(注册商标)ODS-3、粒径2μm、2.1mm×50mm(GL science)。接着，将供于柱的样品10μl按照溶液A(0.1％甲酸/99.9％乙腈)与溶液B(50％水/50％乙腈)的混合比从95比5变成95比5的条件以0.2ml/分钟的流速用10分钟进行洗脱。此外，使用蛋白质测试CBB溶液(Nacalai Tesque株式会社)以牛白蛋白为标准确定了含有蛋白质的浓度。此外，由被PKC-F修饰的荧光染料FAM的480nm的吸光确定了包封的肽的浓度。

其结果是，通过LC-MS的分析，确认了铁蛋白包封的肽(图2)与标准品肽(图3)的保留时间相同，均为3.9分钟，MS图谱也为同等，确认了通过铁蛋白包封操作、PKC-F未被分解而是被包封。并且，可以得到包含4.3mg/ml(8.5μM)的FTH和0.18mg/ml(72μM)的肽的溶液0.25ml。根据此时的摩尔比，每1个铁蛋白中包封有平均8.5个的PKC-F。

＜实施例3：包封有经荧光修饰的肽的铁蛋白的形状＞

如图4所示，通过基于3％磷钨酸染色的透射型电子显微镜(TEM)图像确认了经纯化的包封有PKC-F的FTH显示为笼状形状。此时的包封有肽的FTH的直径为12nm，与天然型人铁蛋白为相同的尺寸，可知铁蛋白的高级结构未因包封肽而大幅破坏。

接着，将该包封有PKC-F的FTH复合物按照终浓度以FTH量计成为0.1g/l的条件分别悬浮于终浓度50mM的磷酸缓冲液(pH6或7)、乙酸缓冲液(pH4或5)、或者Tris盐酸盐缓冲液(pH8)，在该缓冲液中，通过Zetasizer Nano ZS(马尔文(Malvern)公司)测定了25℃时的表面电荷。测定如下进行：将样品750μl加入DTS1070样品池，以材料(Material)设定(RI：1.450，吸收：0.001)、分散剂(Dispersant)设定(温度：25℃，粘度：0.8872cP，RI：1.330，介电常数：78.5)、斯莫鲁霍夫斯基(Smoluchowski)模型(Fκa值：1.50)。其结果是，未进行肽包封处理的FTH与包封有PKC-F的FTH复合物的表面电荷为同等，可知并未通过肽吸附于FTH表面而复合化(图5)。

＜实施例4：使用经荧光修饰的包封有肽的铁蛋白的细胞摄入试验(1)＞

使用所得的包封有PKC-F的FTH，对基于铁蛋白的PKC-F向细胞内的转运性进行了评价。

在向评价用培养基(Opti-MEM^TM(赛默飞世尔科技公司)+1％非必需氨基酸溶液(赛默飞世尔科技公司)+1％青霉素-链霉素(Nacalai Tesque株式会社))中按照终浓度成为100nM(PKC-F浓度0.86μM)、200nM(PKC-F浓度1.72μM)或400nM(PKC-F浓度3.44μM)的条件分别添加包封有PKC-F的FTH而成的培养基100μl中，添加来源于人乳腺癌的SKBR-3细胞(20000细胞/孔，96孔板)，在37℃进行了培养。该SKBR-3细胞表达转铁蛋白受体TfR。此外，作为阴性对照，采用以终浓度0.86μM、1.72μM或3.44μM添加FTH未包封的肽而成的培养基同样地对SKBR-3细胞进行了培养。分别培养24小时后，用磷酸缓冲生理盐水100μl清洗2次，在胰蛋白酶(Trypsin)-EDTA(西格玛奥德里奇公司)50μl中于37℃放置10分钟。然后，加入Opti-MEM^TM培养基100μl，将细胞转移至荧光激活细胞分选(FACS)用板，以400×g离心分离5分钟。将各细胞悬浮于FACS用缓冲液(Attune^TM Focusing Fluid，赛默飞世尔科技公司)，通过FACS(Attune NxT，赛默飞世尔科技公司)进行了分析。

其结果是，包封有PKC-F的FTH的情形确认了依赖于浓度的荧光强度的变化(图6)，提示向细胞的摄入量依赖于浓度而增加。

通过双光子激发荧光显微镜(CQ-1，横川电机株式会社)对以同样的条件制备的细胞进行了观察，结果是，仅包封有PKC-F的FTH可观察到细胞内的荧光，可以确认依赖于浓度的包封有PKC-F的FTH向细胞的摄入(图7)。另一方面，未包封于铁蛋白内的PKC-F没有确认到向细胞内的转运。

由上可知，通过用FTH包封，可将肽递送至TfR递呈细胞内。

＜实施例5：经荧光修饰的肽的包封研究(2)＞

为了考察使用铁蛋白的肽递送的通用性，尝试了使除PKC-F以外的肽包封于铁蛋白并向细胞内转运。

首先，尝试了包封经荧光修饰的2种肽[(5(6)-FAM-CGGPKKKRKVG(SEQ ID NO:10)、FAM-SV40、化学式量1516，和5(6)-FAM-CGGKRPAAIKKAGQAKKKKG(SEQ ID NO:11)、FAM-Np、化学式量384)]的FTH的构建。将包含终浓度5mg/ml的FTH(化学式量509421)和终浓度0.5mM的肽的50mM甘氨酸盐酸盐缓冲液(pH2.3)0.5ml在室温下放置15分钟。然后，加入的1M的Tris盐酸盐缓冲液(pH9.0)50μl进行中和，在室温下放置3小时。放置后，离心分离(15000rpm，1分钟)后，回收上清液，用10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)将容量增加至3ml。将该溶液使用以D-PBS(-)(富士胶片和光纯药株式会社)平衡化的HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR柱(GE医疗公司)以0.5ml/分钟的流速根据尺寸来分离纯化24聚体的FTH。此时，进行了FAM-SV40的包封操作的铁蛋白，在与铁蛋白24聚体相同的洗脱位置确认到430nm的吸光，提示在铁蛋白内包封有FAM-SV40(图8)。但是，进行了FAM-Np的包封操作的铁蛋白未确认到480nm的吸光，可知未包封FAM-Np。这提示根据物性等的不同，存在难以包封于铁蛋白的肽。

接着，对于经纯化的包封于铁蛋白的FAM-SV40肽量的定量，进行采用以480nm的吸光、铁蛋白量白蛋白为标准的CBB染色的定量。

其结果是，可以得到包含6.3mg/ml(12μM)的FTH和0.09mg/ml(30μM)的FAM-SV40肽的溶液0.3ml。根据此时的摩尔比，每1个铁蛋白中包封有平均2.5个的FAM-SV40。

＜实施例6：使用经荧光修饰的包封有肽的铁蛋白的细胞摄入试验(2)＞

对所得的包封有FAM-SV40的FTH的向细胞的摄入进行了评价。在向评价用培养基(Opti-MEM^TM(赛默飞世尔科技公司)+1％非必需氨基酸溶液(赛默飞世尔科技公司)+1％青霉素-链霉素(Nacalai Tesque株式会社))中按照终浓度成为100nM(FAM-SV40浓度250nM)、200nM(FAM-SV40浓度500nM)或400nM(FAM-SV40浓度1000nM)的条件分别添加包封有FAM-SV40的FTH而成的培养基100μl中，添加SKBR-3细胞(20000细胞/孔，96孔板)，在37℃进行了培养。此外，作为阴性对照，采用以终浓度250nM、500nM或1000nM添加FTH未包封的肽而成的培养基同样地对SKBR-3细胞进行了培养。分别培养24小时后，用磷酸缓冲生理盐水100μl清洗2次，在胰蛋白酶-EDTA(西格玛奥德里奇公司)50μl中于37℃放置10分钟。

然后，加入Opti-MEM^TM培养基100μl，将细胞转移至荧光激活细胞分选(FACS)用板，以400×g离心分离5分钟。将各细胞悬浮于FACS用缓冲液(Attune^TM Focusing Fluid，赛默飞世尔科技公司)，通过FACS(Attune NxT，赛默飞世尔科技公司)进行了分析。作为结果，仅包封有FAM-SV40的FTH可观察到依赖于浓度的荧光强度的上升，另一方面，仅FAM-SV40时未确认到荧光(图9)。

由上可知，通过包封于FTH，以往无法透过膜的肽也可递送至细胞内。

＜实施例7：基于TfR表达量的肽递送量的依赖性的确认＞

为了确认通过包封于铁蛋白而可将目标肽特异性地递送至转铁蛋白受体(TfR)递呈细胞，使用TfR的表达量不同的细胞株，对FTH的摄入效率的TfR依赖性进行了评价。

本次的评价中，使用了：TfR表达量多的细胞SKBR3(表达强度449.7TPM，参照数据库“The Human Protein Atlas(https://www.proteinatlas.org/)”)和作为TfR表达量少的细胞HEK293细胞(表达强度74.5TPM，参照数据库“The Human Protein Atlas”)的亚株的HEK293E细胞。

首先，使用PureLink(注册商标)RNA迷你试剂盒(赛默飞世尔科技公司)从SKBR3细胞和HEK293E细胞回收总RNA。将50ng的来源于各细胞的总RNA与2μL的SuperScript ^TMVILO^TM Master Mix(赛默飞世尔科技公司)混合，添加水至总量达到10μL。按照25℃下10分钟、42℃下60分钟、85℃下5分钟进行孵育后，添加115μL的水进行稀释，从而获得0.4ng/μL的cDNA溶液。向各cDNA溶液5μL中加入TaqMan(注册商标)Fast Advanced Master Mix(应用生物系统(Applied Biosystems)公司)、水4.8μL、25μM的引物混合物，制备定量PCR溶液。TfR基因用引物混合物是将正向引物(Forward)：TGGCAGTTCAGAATGATGGA(SEQ ID NO:26)、反向引物(Reverse)：AGGCTGAACCGGGTATATGA(SEQ ID NO:27)混合而使用。作为内标，对18SrRNA进行了定量。18S rRNA用基因用引物混合物是将正向引物：TGAGAAACGGCTACCACATC(SEQ ID NO:28)、反向引物：TTACAGGGCCTCGAAAGAGT(SEQ ID NO:29)混合而使用。通过定量PCR(StepOnePlus^TM系统，应用生物系统公司)，对TfR的mRNA的表达量进行了确认，结果是，SKBR3细胞的TfR表达量高达HEK293E细胞的3.2倍。

在向评价用培养基(Opti-MEM^TM(赛默飞世尔科技公司)+1％非必需氨基酸溶液(赛默飞世尔科技公司)+1％青霉素-链霉素(Nacalai Tesque株式会社))中按照终浓度成为0至800nM(FAM-SV40浓度2μM)的条件分别添加包封有FAM-SV40的FTH而成的培养基100μl中，添加各细胞(20000细胞/孔，96孔板)，在37℃进行了培养。分别培养24小时后，用磷酸缓冲生理盐水100μl清洗2次，在胰蛋白酶-EDTA(西格玛奥德里奇公司)50μl中于37℃放置10分钟。

然后，加入Opti-MEM^TM培养基100μl，将细胞转移至荧光激活细胞分选(FACS)用板，以400×g离心分离5分钟。将各细胞悬浮于FACS用缓冲液(Attune^TM Focusing Fluid，赛默飞世尔科技公司)，通过FACS(Attune NxT，赛默飞世尔科技公司)进行了分析。

其结果是，采用以100nM包含包封有FAM-SV40的FTH的培养基进行了培养的SKBR3细胞的90％以上发出荧光，提示几乎所有的细胞摄入了包封有FAM-SV40的FTH。另外，其比例为以同样的条件得到的HEK293E细胞的60倍(图10)。在HEK293E细胞的情况下，为了使90％以上的细胞发出荧光，需要采用以800nM以上的高浓度包含包封有FAM-SV40的FTH的培养基进行培养(图11)。这些结果提示TfR表达量多的细胞SKBR3更有效地将铁蛋白摄入细胞内。

即，可知通过包封于铁蛋白，可根据对象细胞的TfR表达量来控制目标肽向细胞内的递送量。

＜实施例8：可包封于铁蛋白的肽的探索(1)＞

通过解缔合/重缔合工艺进行了可包封于铁蛋白的肽的探索。解缔合/重缔合工艺中，将包含终浓度5mg/ml的FTH和终浓度0.5mM的肽的50mM甘氨酸盐酸盐缓冲液(pH2.3)1ml在室温下放置15分钟。然后，加入1M的Tris盐酸盐缓冲液(pH9.0)310μl进行中和，在室温下放置3小时。放置后，加入50mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8.0)1.2ml，进行离心分离(15000rpm，1分钟)后，将上清液2.5ml供于用50mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)平衡化的脱盐柱PD-10(Sephadex G-25填充品，GE医疗公司)，用3.0ml的50mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8.0)洗脱，将未被包封的肽与铁蛋白分离。将该溶液的全部量(3.0ml)通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤而浓缩至0.1ml。通过重复2次向该浓缩液中加入10ml的50mM的Tris盐酸盐缓冲液并浓缩的操作，除去用PD-10未能除尽的肽，获得样品溶液0.1ml。为了LC-MS分析，向样品溶液50μl中加入1M甘氨酸盐酸盐缓冲液(pH2.3)50μl并在室温下放置15分钟。向该溶液中加入900μl的乙醇，剧烈搅拌后，通过离心分离(15000rpm，5分钟)回收上清液。对该上清液进行了分析。本次，作为LC-MS，使用LCMS-2020(株式会社岛津制作所)，柱使用Inertsil(注册商标)ODS-3、粒径2μm、2.1mm×50mm(GL science)。接着，将供于柱的样品10μl按照溶液A(0.1％甲酸/99.9％乙腈)与溶液B(50％水/50％乙腈)的混合比从95比5变为95比5的条件以0.2ml/分钟的流速用10分钟进行洗脱。

本次用于包封研究的肽的一览示于表1。对于肽在铁蛋白中的包封，分别制备“进行了基于解缔合/重缔合工艺的在铁蛋白内包封肽的操作的样品”和“单纯将铁蛋白与肽混合而得的样品”，对通过LC-MS检出的肽量进行了比较。例如，ClAc-FHC在保留时间0.8分钟洗脱，解缔合/重缔合工艺的情况下在m/z＝445可确认到来源于ClAc-FHC(化学式量445)的峰(图12A)。但是，仅在未进行解缔合/重缔合工艺的单纯将肽与铁蛋白混合时，未能观察到该峰(图12B)。本次，通过解缔合/重缔合工艺包封有肽的FTH的LC-MS的结果示于图13至图17。

[表1]

表1.向铁蛋白内的包封研究中所使用的肽的结构信息

¹FBP0032和FBP0033中的X表示4-戊炔酸(4-pentynoic acid)。

²氨基酸残基数为3个以下的氨基酸序列、和包含D-氨基酸的氨基酸序列不需要记载序列编号(SEQ ID NO)，因此对于IE、ClAc-FHC和Murepavadin省略序列编号的记载

³获得途径如下：

A：委托Eurofins Genomics株式会社合成

B：从西格玛奥德里奇公司购入

C：使用了Syro I(Biotage公司)的固相合成

⁴环状结构通过肽的主链环化(即，N末端的氨基与C末端的羧基的酰胺键)(cyloRGDfV、Hymenistatin I、Murepavadin)、半胱氨酸残基的侧链中的硫原子(S)与N末端乙酰基中的碳原子的结合(Pakti-L1)、或者2个半胱氨酸残基的侧链中的2个硫原子(S)的二硫键(FBP0032和FBP0033)而构成。

⁵D-表示D型，Dab表示2,4-二氨基丁酸，Orn表示鸟氨酸。

本次评价的肽能否包封于铁蛋白中示于下述表2。

＜实施例9：可包封于铁蛋白的物性的研究＞

本次，关于包封于铁蛋白的肽和未能包封的肽，对下述的各物性值与肽能否包封于铁蛋白的相关关系进行了考察；

(1)肽的长度(链长)

(2)肽的化学式量

(3)疏水度(Hydrophobicity)

(4)GRAVY

(5)平均亲水度(Average of hydrophilicity)

(6)亲水性氨基酸在肽中所占的比例(Ratio of hydrophilic residues/totalnumber of residues)

(7)pH9时的肽的电荷。

上述(1)～(7)的物性值基于以下的方法确定。

(1)肽的长度(链长)

肽的长度基于构成肽的氨基酸残基的总数而确定。

(2)肽的化学式量

基于肽的组成式作为原子量与原子数的积的总和而确定。

(3)疏水度

肽的疏水度(Hydrophobicity)基于SSRCalc Hydrophobicity而算出(O.V.Krokhin Anal.Chem.(2006),78(22)7785-7795)。本次，用Prot pi(https://www.protpi.ch/Calculator/PeptideTool)，使用300埃C18柱、0.1％TFA洗脱条件的数据库而算出。

(4)GRAVY GRAVY(grand average of hydropathy，总平均亲水性)通过将各氨基酸残基的亲水值(hydropathy score)相加，再除以序列的长度来进行计算(J,Kyte andR.F.Doolittle,J Mol Biol.1982157(1)105-32.)。

[表2]

表2.各氨基酸残基的亲水值的例子

(5)平均亲水度

平均亲水度(Average of hydrophilicity)通过将各氨基酸残基的亲水度值(hydrophilicity score)相加，再除以序列的长度来进行计算(Hopp and Woods ProcNatl Acad Sci U S A.198178(6)3824-8.)。

[表3]

表3.各氨基酸残基的亲水度值的例子

(6)亲水性氨基酸在肽中所占的比例

亲水性氨基酸在肽中所占的比例(Ratio of hydrophilic residues/totalnumber of residues)通过评价构成肽的所有氨基酸中亲水性氨基酸(H、C、T、S、K、Q、E、D、N和R)所占的比例来确定。

(7)pH9时的肽的电荷

pH9时的肽的电荷通过对于包括构成肽的各氨基酸残基的侧链、修饰基团、N末端的氨基或其保护基、C末端的羧基或其保护基的所有官能团的电荷，分别用各官能团的解离常数(pKa)和电荷的正负以pH为9用下式算出。

[数学式1]

C：设定pH时的作为对象的肽的电荷

pH：设定pH

Ni：作为对象的肽所含的具有正电荷的侧链i的数量

pKai：作为对象的肽所含的具有正电荷的侧链i的pKa

Nj：作为对象的肽所含的具有负电荷的侧链j的数量

pKaj：作为对象的肽所含的具有负电荷的侧链j的pKa。

各氨基酸的pKa的评价采用ChemAxon(https://chemaxon.com/)(O.Toure等，OilGas Sci.Technol.2013，68，281-297.)。

[表4]

表4.各氨基酸残基的pKa值的例子

氨基酸	三字母代码	α-COOH	α-NH2	侧链<sup>*</sup>
					丙氨酸	Ala	2.5	9.5	-
精氨酸	Arg	2.4	9.1	12.4
					天冬酰胺	Asn	2.0	8.4	-
天冬氨酸	Asp	1.7	9.6	5.1
					半胱氨酸	Cys	2.4	9.1	10.2
谷氨酸	Glu	1.9	9.5	4.3
					谷氨酰胺	Gln	2.2	9.3	-
甘氨酸	Gly	2.3	9.2	-
					组氨酸	His	1.9	9.4	6.6
异亮氨酸	Ile	2.8	9.6	-
					亮氨酸	Leu	2.8	9.5	-
赖氨酸	Lys	2.7	9.4	10.3
					蛋氨酸	Met	2.5	9.5	-
苯丙氨酸	Phe	2.5	9.5	-
					脯氨酸	Pro	1.9	11.3	-
丝氨酸	Ser	2.0	8.9	-
					苏氨酸	Thr	2.2	9.0	-
色氨酸	Trp	2.5	9.4	-
					酪氨酸	Tyr	2.0	9.2	9.8
缬氨酸	Val	2.7	9.6
					鸟氨酸	Orn	2.7	9.4	10.3
2，3-二氨基丁酸	Dab	2.6	8.0	10.0

*不存在解离基团的情况下记作-

向铁蛋白内的包封研究中所使用的肽的上述各物性值与肽能否包封于铁蛋白的关系如下。

[表5]

表5.向铁蛋白内的包封研究中所使用的肽的各物性值

名称	(1)	(2)	(3)	(4)	(5)	(6)	(7)	能否包封
									E	2	260	1.2	0.5	0.6	50	-1.2	C
C1Ac-FHC	3	445	-	-	-	-	0.0	A
									EGFR	4	458	1.04	-2.05	0.6	50	-1.3	A
cyloRGDfV	5	575	-	-	-	-	0.0	B
									FGF3-FP16	7	928	26.17	-0.14	-0.3	43	1.8	B
Hymenistatin I	8	893	-	-	-	-	-0.1	B
									Ex10	10	1309	6.62	-3.5	3	100	-10.2	A
Rx10	10	1580	-4.26	-4.5	3	100	9.6	C
									FAM-SV40	11	1516	-	-	-	-	3.7	A
αvβ6	13	1413	23.89	-0.46	0.1	31	0.3	B
									NRP-1-2	14	1464	-0.41	-1.93	1.2	43	5.5	A
Murepavadin	14	1554	-	-	-	-	5.4	A
									Pakti-L1	14	1729	-	-	-	-	1.9	B
NS	16	1963	21.34	-1.01	0.4	44	4.6	A
									PKC-F	18	2524	-	-	-	-	3.9	A
GRP78-3	18	1976	31.43	-0.25	0.4	33	5.6	B
									FBP0032	19	2031	-	-	-	-	3.8	A
FBP0033	19	2096	-	-	-	-	5.9	A
									FAM-Np	20	2384	-	-	-	-	6.6	C

。

物性值(1)～(7)如上所述。

试验数为3次。A表示3次均确认包封的肽，B表示可确认包封的情况为2次以下的肽，C表示1次也未能确认包封的肽。

其结果是，在pH9.0时的电荷和化学式量的关系式与肽包封的难易度之间发现相关性(图18)。

即，可将满足a)-10.2≤pH9时的肽的电荷(X)≤5.9、且445≤肽的化学式量(Y)≤2524的条件的肽包封于铁蛋白(图18)。

此外，满足上述条件的肽中，满足b)-10.2≤X≤0.0、且445≤Y≤2524、或者c)3.7≤X≤5.9、且445≤Y≤2524的条件的肽可再现性良好地包封于铁蛋白(图18)。

<实施例10：铁蛋白的制备(2)>

对编码人源铁蛋白L链(FTL(SEQ ID NO：2))的DNA进行了全合成。以全合成的DNA为模板，以5’-GAAGGAGATATACATATGAGCTCCCAGATTCGTCAG-3’(SEQ ID NO：7)和5’-CTCGAATTCGGATCCTTAGTCGTGCTTGAGAGTGAG-3’(SEQ ID NO：8)为引物进行了PCR。此外，以pET20(默克公司)为模板，以5’-TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC-3’′(SEQ ID NO：5)和5’-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3’(SEQ ID NO：6)为引物进行了PCR。将分别得到的PCR产物用Wizard DNA纯化系统(普洛麦格公司)纯化后，以In-Fusion HD克隆试剂盒(Takara Bio株式会社)在50℃下进行了15分钟的In-Fusion酶处理，从而构建了携带有编码FTL的基因的表达质粒(pET20-FTL)。

接着，将导入了构建的pET20-FTL的大肠埃希氏菌BL21(DE3)在100ml的LB培养基(包含10g/l的细菌用胰蛋白胨(Bacto-typtone)、5g/l的细菌用酵母提取物(Bacto-yeastextract)、5g/l的NaCl、100mg/l的氨苄西林)中于37℃进行了24小时的烧瓶培养。将所得的菌体进行超声波破碎后，将上清液于60℃加热20分钟。将加热后得到的上清液注入用50mM的TrisHCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPerp Q HP柱(GE医疗公司)，用含0mM至500mM NaCl的50mM TrisHCl缓冲液(pH8.0)施以盐浓度梯度，从而分离纯化目标蛋白质。将含该蛋白质的溶液的溶剂通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤而置换为10mM的TrisHCl缓冲液(pH8.0)。将该溶液注入用10mM的TrisHCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPrep 26/60Sephacryl S-300HR柱(GE医疗公司)，根据尺寸来分离纯化FTL。将含该FTH的溶液通过采用Vivaspin 20-100K(GE医疗公司)的离心超滤进行浓缩，使用蛋白质测试CBB溶液(Nacalai Tesque株式会社)，以牛白蛋白为标准确定了含有蛋白质的浓度。结果是，每100ml培养液，可以得到1ml含有3mg/ml的FTL的溶液。

＜实施例11：经荧光修饰的肽的包封研究＞

构建了包封有以荧光染料荧光素(FAM)进行了修饰的肽(5(6)-FAM-RFARKGALRQKNVHEVKN(SEQ ID NO:9)，PKC-F，化学式量2524)的FTL。

将包含终浓度5mg/ml的FTL(化学式量480466)和终浓度0.5mM的肽的50mM甘氨酸盐酸盐缓冲液(pH2.3)0.5ml在室温下放置15分钟。然后，加入1M的Tris盐酸盐缓冲液(pH9.0)50μl进行中和，在室温下放置3小时。放置后，进行离心分离(15000rpm，1分钟)后，回收上清液，用10mM的Tris盐酸盐缓冲液(pH8)将容量增加至3ml。将该溶液注入以D-PBS(-)(富士胶片和光纯药株式会社)平衡化的HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR柱(GE医疗公司)，以1.3ml/分钟的流速根据尺寸来分离纯化24聚体的FTL。将经纯化的铁蛋白用以PBS平衡化的HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR柱(GE医疗公司)以0.5ml/分钟的流速进行了分析，结果是，在与FTL的峰相同的位置确认到仅FTL时未确认到的480nm的吸光，肽被包封于FTL(图19)。由上可知，FTL也可包封肽。

序列表

<110> 味之素株式会社

<120> 包封有肽的铁蛋白

<130> PAMA-21658

<150> JP2019-162119

<151> 2019-09-05

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 183

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp

1 5 10 15

Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala

35 40 45

Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg

50 55 60

Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg

65 70 75 80

Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser

85 90 95

Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn

100 105 110

Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro

115 120 125

His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys

130 135 140

Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly

145 150 155 160

Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu

165 170 175

Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser

180

<210> 2

<211> 175

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala

1 5 10 15

Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu

20 25 30

Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val

35 40 45

Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu

50 55 60

Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln

65 70 75 80

Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala

85 90 95

Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu

100 105 110

Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp

115 120 125

Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys

130 135 140

Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Pro Glu Ala

145 150 155 160

Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp

165 170 175

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAAGGAGATATACATATGACGACCGCGTCCACCTCG

<400> 3

gaaggagata tacatatgac gaccgcgtcc acctcg 36

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增编码人铁蛋白重链的DNA的引物

<400> 4

ctcgaattcg gatccttagc tttcattatc actgtc 36

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增载体pET20的引物

<400> 5

tttcatatgt atatctcctt cttaaagtta aac 33

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增载体pET20的引物

<400> 6

tttggatccg aattcgagct ccgtcg 26

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增编码人铁蛋白轻链的DNA的引物

<400> 7

gaaggagata tacatatgag ctcccagatt cgtcag 36

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增编码人铁蛋白轻链的DNA的引物

<400> 8

ctcgaattcg gatccttagt cgtgcttgag agtgag 36

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于测试在铁蛋白中的包封的肽PKC-F的氨基酸序列

<400> 9

Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ala Leu Arg Gln Lys Asn Val His Glu Val

1 5 10 15

Lys Asn

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于测试在铁蛋白中的包封的肽SV40的氨基酸序列

<400> 10

Cys Gly Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly

1 5 10

<210> 11

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于测试在铁蛋白中的包封的肽Np的氨基酸序列

<400> 11

Cys Gly Gly Lys Arg Pro Ala Ala Ile Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys

1 5 10 15

Lys Lys Lys Gly

20

<210> 12

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于测试在铁蛋白中的包封的肽EGFR的氨基酸序列

<400> 12

His Thr Ser Asp

1

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于测试在铁蛋白中的包封的肽cyloRGDfV的氨基酸序列

<400> 13

Arg Gly Asp Phe Val

1 5

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于测试在铁蛋白中的包封的肽FGF3-FP16的氨基酸序列

<400> 14

Val Leu Trp Leu Lys Asn Arg

1 5

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于测试在铁蛋白中的包封的肽Hymenistatin I的氨基酸序列

<400> 15

Pro Pro Tyr Val Pro Leu Ile Ile

1 5

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于测试在铁蛋白中的包封的肽Ex10的氨基酸序列

<400> 16

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu

1 5 10

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于测试在铁蛋白中的包封的肽Rx10的氨基酸序列

<400> 17

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 18

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于测试在铁蛋白中的包封的肽avb6的氨基酸序列

<400> 18

Ser Pro Arg Gly Asp Leu Ala Val Leu Gly His Lys Tyr

1 5 10

<210> 19

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于测试在铁蛋白中的包封的肽NRP-1-2的氨基酸序列

<400> 19

Gly Gly Lys Arg Pro Ala Arg Gly Gly Lys Arg Pro Ala Arg

1 5 10

<210> 20

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于测试在铁蛋白中的包封的肽Pakti-L1的氨基酸序列。

半胱氨酸残基侧链中的硫原子与乙酰基共价连接。

<400> 20

Tyr Ile Leu Val Arg Asn Arg Leu Leu Arg Val Asp Cys Gly

1 5 10

<210> 21

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于测试在铁蛋白中的包封的肽NS的氨基酸序列

<400> 21

Gln Met Ala Arg Ile Pro Lys Arg Leu Ala Arg His Gln Met Ala Arg

1 5 10 15

<210> 22

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于测试在铁蛋白中的包封的肽GRP78-3的氨基酸序列

<400> 22

Gly Ile Arg Leu Arg Gly Gly Ile Arg Leu Arg Gly Gly Ile Arg Leu

1 5 10 15

Arg Gly

<210> 23

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于测试在铁蛋白中的包封的肽FBP0032的氨基酸序列。

两个半胱氨酸残基通过二硫键共价连接。1位的X表示4-戊炔酸。

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 23

Xaa Gly Gln Lys Gly Cys Lys Lys Thr Pro Lys Leu Ala Ser Leu Ser

1 5 10 15

Cys Thr Gly Phe

20

<210> 24

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于测试在铁蛋白中的包封的肽FBP0033的氨基酸序列。

两个半胱氨酸残基通过二硫键共价连接。1位的X表示4-戊炔酸。

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 24

Xaa Gly Arg Pro Gly Cys Gly Pro Arg Lys Pro Arg Thr Pro Lys Lys

1 5 10 15

Cys Gly Ser His

20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增编码转铁蛋白受体(TfR)的DNA的引物

<400> 25

tggcagttca gaatgatgga 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增编码转铁蛋白受体(TfR)的DNA的引物

<400> 26

aggctgaacc gggtatatga 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增编码18S rRNA的DNA的引物

<400> 27

tgagaaacgg ctaccacatc 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增编码18S rRNA的DNA的引物

<400> 28

ttacagggcc tcgaaagagt 20

Claims (7)

1.一种包封有肽的铁蛋白，其中，

肽由3～19个氨基酸残基构成，并且

满足下述条件：

a）-10.2≤X≤5.9、且445≤Y≤2524，

在此，X表示pH 9时的肽的电荷，Y表示肽的化学式量。

2.根据权利要求1所述的包封有肽的铁蛋白，其中，肽由4～16个氨基酸残基构成。

3.根据权利要求1或2所述的包封有肽的铁蛋白，其中，

肽满足下述条件：

b）-10.2≤X≤0.0、且445≤Y≤2524；或者

c）3.7≤X≤5.9、且445≤Y≤2524，

在此，X和Y与权利要求1中的相应符号的含义相同。

4.一种肽的细胞内递送剂，其中，

包含包封有肽的铁蛋白，

肽由3～19个氨基酸残基构成，并且

满足下述条件：

a）-10.2≤X≤5.9、且445≤Y≤2524，

在此，X表示pH 9时的肽的电荷，Y表示肽的化学式量。

5.根据权利要求4所述的递送剂，其中，肽被递送至人细胞的细胞内。

6.根据权利要求4或5所述的递送剂，其中，肽被递送至癌细胞的细胞内。

7.一种包封有肽的铁蛋白的制造方法，其中，包括：

1）在存在肽或不存在肽的条件下，将铁蛋白放置于pH 3.0以下的缓冲液中，使铁蛋白解离；以及

2）使解离后的铁蛋白和肽共存于pH 5.0以上且10.0以下的缓冲液中，生成包封有肽的铁蛋白，

肽由3～19个氨基酸残基构成，并且

满足下述条件：

a）-10.2≤X≤5.9、且445≤Y≤2524，

在此，X表示pH 9时的肽的电荷，Y表示肽的化学式量。

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