WO2015016608A1 - 항체 및 핵산 결합 펩타이드를 포함하는 핵산 전달용 조성물 - Google Patents

항체 및 핵산 결합 펩타이드를 포함하는 핵산 전달용 조성물 Download PDF

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WO2015016608A1
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nucleic acid
antibody
acid binding
binding peptide
composition
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이정민
김민우
채수영
최은정
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삼성전자 주식회사
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    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components

Definitions

  • Nucleic acid delivery composition comprising antibody and nucleic acid binding peptide
  • a nucleic acid delivery composition comprising a nucleic acid binding peptide and an antibody comprising a bivalent amino acid and a hydrophobic amino acid, a nucleic acid complex nanoparticle comprising the nucleic acid delivery composition and the nucleic acid, and a nucleic acid delivery method using the nucleic acid delivery composition will be.
  • Gene transfer is a technology of changing a cell's characteristics by introducing a nucleic acid material such as DNA or RNA into a cell using a carrier and then expressing the introduced gene or RNA interference.
  • plasmid DNA When plasmid DNA is introduced, it is a technique that can promote the expression of new proteins by transcription and expression of the introduced DNA.
  • RNA interference is a technology that reduces or inhibits gene expression by introducing exogenous double-stranded RNA (dsRNA) into cells to specifically destroy or block specific messenger RNA (mRNA) (A. Fire et al. al., Nature, 391, 806-11, 1998).
  • dsRNA double-stranded RNA
  • mRNA messenger RNA
  • siRNA small interfering ribonucleic acids
  • miRNAs microribonucleic acids
  • siRNA is known to have various utility, such as drug screening, disease treatment because it shows a specific interference effect on the mRNA of a specific target.
  • the method of efficient and cell-specific delivery of RNA interference materials in clinical use remains a challenge to be solved.
  • Lipid-based, cationic low molecular-based, cationic polymer-based techniques and combinations thereof have been tried for intracellular delivery of small interfering ribonucleic acid (siRNA), but most have been applied as nonspecific delivery methods.
  • siRNA small interfering ribonucleic acid
  • As a method for improving this lipid-based, antibody fragments into which cell-specific substances have been introduced
  • Target delivery using base and polymer-based carriers has been attempted (Patent W0 2006/023491, US 2010/0209440, etc.), and the introduction of a targeting moiety has shown an improved s iRNA delivery effect.
  • nucleic acid delivery composition comprising an antibody and a nucleic acid binding peptide comprising a cationic amino acid and a hydrophobic amino acid.
  • Another example provides the use for nucleic acid delivery of antibodies and nucleic acid binding peptides comprising cationic and hydrophobic amino acids.
  • Another example provides a nucleic acid delivery method using the nucleic acid delivery composition.
  • nucleic acid complex comprising the nucleic acid delivery composition and a nucleic acid.
  • the present invention provides a novel nucleic acid delivery system that binds to a specific surface factor (antigen) of a specific cell, and the binding induces internalization into the cell, thereby effectively delivering the nucleic acid into the cell. It is related to efficient disease treatment technology using this.
  • the nucleic acid delivery system has a specific ratio of an antibody serving as a targeting transporter and a nucleic acid binding peptide serving as a stabilizing transporter to form a complex in the form of nanoparticulates upon binding to the nucleic acid.
  • Antibodies included as targeting carriers in the delivery system have high antigen specificity and therefore exhibit very high specific cell targets, as well as exhibit inherent biological activity (eg cancer growth inhibition and death). Synergistic effects with nucleic acids (eg, s iRNA) can be obtained.
  • nucleic acid binding peptide included as a stabilizing carrier is a functional group such as PEG, or is not introduced, can be combined with the nucleic acid to form a very stable complex, stable in vivo (eg blood) nanoparticles (nanopart icle ) Can be formed. .
  • a nucleic acid delivery composition comprising an antibody and a nucleic acid binding peptide according to an aspect of the present invention is a new novel nucleic acid delivery system in which two functional sites of targeting (antibody) and stabilization (pegylated nucleic acid binding peptide) are combined. Not only is the targeting and delivery efficiency of nucleic acids very high, but it also reliably protects nucleic acids even in environments with many nucleic acid destabilizing elements such as nucleases, and it is stable and uniform without nanoparticles aggregated in the blood. Make sure to keep the particles.
  • the nucleic acid delivery system does not disintegrate and aggregate in bloodemia even after systemic administration, such as intravenous injection, and forms a highly stable form of circulating lesion tissue (eg cancer). After binding to only target tissues, such as nucleic acids can be efficiently delivered into the cell through an internal i zat i on.
  • composition for nucleic acid delivery includes a stabilizer and targeted carrier.
  • the stabilizing carrier may be a nucleic acid binding peptide, and the nucleic acid binding peptide may be a nucleic acid binding peptide with or without a functional group such as PEG introduced therein, and the (second) nucleic acid binding peptide bound to an antibody described below. To distinguish, it may be referred to as 'first nucleic acid binding peptide 1 '.
  • the stabilizing carrier may be represented by way of example as shown in the following figure. have:
  • the targeting carrier may be an antibody or a conjugate in which a nucleic acid binding peptide is bound to the antibody, and the nucleic acid binding peptide may be a nucleic acid binding peptide with or without a functional group such as PEG. .
  • the nucleic acid binding peptide bound to the antibody in the targeting carrier is hereinafter referred to as 'second nucleic acid binding peptide' to distinguish it from the (first) nucleic acid binding peptide as the stabilizing carrier described above.
  • the targeting carrier may be exemplarily represented as in the following figure:
  • Nucleic acid binding peptides eg, PEG
  • Antibody or antigen binding fragment eg, scFvFc
  • the nucleic acid binding peptide serving as the stabilizing carrier is a nucleic acid and then Cationic amino acid capable of binding, and hydrophobic amino acid for enhancing the binding strength between the cationic amino acid and the nucleic acid and enhancement of stability.
  • the stabilizing carrier comprises a functional group, such as PEG (po lyethyl ene glyco l), so that the stability in the aqueous environment or in vivo environment can be enhanced so that the complex can be maintained in a uniformly dispersed form without coagulation with each other Can be.
  • PEG binding to peptides or proteins prevents peptides or proteins from being broken down by enzymes in the body or lost in organs such as the liver so that they can be retained for a long time in the body (increasing half-life). Can promote it.
  • the present invention binds a functional group such as PEG to a peptide or protein, so that the complexes form stable nanoparticles, and the nanoparticle complexes do not coagulate and precipitate (ant i -aggregat i on), It can be made to be uniformly dispersed and / or moved in an aqueous solution environment or body environment while maintaining the nano-size.
  • Example 3 when PEG is not bound, the complex in the form of nanoparticles is concaved in a salt solution environment similar to that of the body to form large-size aggregates, and thus it is not possible to maintain stable nanoparticle morphology.
  • the functional group such as PEG is bonded, the size of the nano range ( ⁇ or less) is maintained, and even if the concentration of the salt solution is high, the size difference can be confirmed.
  • the present invention by binding a functional group such as PEG to the peptide or protein, it is possible to obtain the effect of enhancing the stability (prevention of decomposition and increase of half-life) and increase the stability of the body (prevention of anticoagulant and maintaining uniform dispersibility in aqueous solution). It is one feature.
  • a functional group such as PEG it is possible to increase the cellular uptake of the complex.
  • the nucleic acid binding peptide is a peptide capable of forming an ion complex with a nucleic acid material such as DNA or RNA, and one cationic amino acid and tryptophan selected from the group consisting of arginine, lysine, ornithine, histidine, and the like. , Consisting of tyrosine, phenylalanine, leucine, etc. It may include one or more hydrophobic amino acids selected from the group.
  • the total number of amino acids included in the nucleic acid binding peptide molecule may be 2 to 100, specifically 10 to 60, and more specifically 15 to 40.
  • the cationic amino acid contained in the first nucleic acid binding peptide molecule serves to enable the formation of an ion complex with the nucleic acid by binding to the negative silver of the nucleic acid by electrostatic attraction.
  • the number of cationic amino acids in the nucleic acid binding peptide molecule may be 1 to 35, specifically 10 to 30, more specifically 15 to 25.
  • Each cationic amino acid may be the same or different from each other, and may be independently selected from the group consisting of arginine, lysine and histidine.
  • the hydrophobic amino acid in the nucleic acid binding peptide molecule serves to enhance the stability of the ionic complex with the nucleic acid in the aqueous solution, and also to enhance the intracellular delivery efficiency of the nucleic acid during nucleic acid delivery.
  • the hydrophobic amino acid may be one containing a benzene ring.
  • the content of the hydrophobic amino acid in the nucleic acid binding peptide molecule is 1 to 50% by weight, specifically 10 to 48% by weight, more specifically, based on the total nucleic acid binding peptide weight. It may be 15 to 45% by weight.
  • the hydrophobic amino acid is a hydrophobic amino acid including a benzene ring, may be one or more selected from the group consisting of tryptophan, tyrosine, phenylalanine, and the like, each of the hydrophobic amino acids included in the nucleic acid binding peptide may be the same or different from each other.
  • nucleic acid binding peptide molecule may be represented by the following formula (1):
  • X is a cationic amino acid
  • Z is a hydrophobic amino acid containing a 3 ⁇ 4 group, such as a benzene ring, and n is an integer of 1 to 20, specifically 2 to 10, as the number of units,
  • ⁇ is the number of cationic amino acids included in the unit, and is an integer from 1 to 10, specifically 1 to 5, where ⁇ represents the position of the unit.
  • q is the number of hydrophobic amino acids including the benzene ring contained in the unit, and is an integer of 1 to 10, specifically 1 to 5 (where n is the number of positions of the unit). Perception).
  • the pi, p2 ... pn and ql, q2 ... qn may be the same or different values for each unit,
  • Total amino acid length is 2-100, specifically 10-60, more specifically 15-40,
  • nucleic acid binding peptides of the above-described nucleic acid binding peptides not only form ion complexes by the electrostatic attraction between the cationic amino acid residues and the anion of the nucleic acid, but also the hydrophobic amino acid residues in the formed ion complexes improve the stability of the complex in the aqueous solution. It shows efficacy.
  • the nucleic acid binding peptides may further include one or more functional groups selected from the group consisting of PEG (polyethyleneglycol) at one end, both ends, or a bondable position.
  • PEG polyethyleneglycol
  • PEG polyethyleneglycol
  • the PEG has a mass average molecular weight of 100, for example. To 10,000, specifically, 500 to 5000.
  • the PEG may be functionalized by combining one or more reducing groups, such as one or two reducing groups, such as an aldehyde group. The reducing group can be liberated after PEG binds the nucleic acid binding peptide or antibody.
  • the molar ratio of the functional group (eg PEG) / nucleic acid binding peptide is 1 to 5, specifically 2 to 5, more specifically, to favor the production of the nucleic acid binding peptide to which the functional group is introduced. 3 to 5 can be reacted.
  • Antibodies that serve as targeting carriers may be pooled antibodies or fragments derived from the antibodies that specifically bind to an antigen expressed on the surface of a target cell in nucleic acid delivery. Unless stated otherwise in the present specification, an antibody is interpreted to mean an antigen binding fragment derived from the antibody together.
  • the antibody specifically binds to an antigen and internalizes the cell, thereby transferring the nucleic acid to be delivered into the cell, thereby increasing cell treatment efficiency, and may include a mouse antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, or a human antibody. Can be.
  • the antibody may be isolated from a living body or generated non -naturally, for example, recombinantly or synthetically generated.
  • the antigen-binding fragment derived from the antibody may be selected from the group consisting of scFV, (scFv) 2> scFvFc, Fab, Fab 'and F (ab') 2 derived from the antibody.
  • a composition for nucleic acid delivery and a composition of a second nucleic acid binding protein-antibody conjugate, 'antibody' or 'antibody as a targeting carrier' is a full form (full IgA form, full IgD form, full IgE form unless otherwise specified).
  • scFV, (scFv) 2 , scFvFc which are antigen-binding fragments derived from the antibody Fab, Fab 'and F (ab') 2 and the like are used to mean those selected from the group consisting of.
  • Antibodies included in the nucleic acid delivery composition to serve as a targeting carrier may be used without particular limitation so long as the antibody specifically binds to any one of all antigens expressed in the target nucleic acid delivery target cell.
  • the antibody may be an antibody in full form (full IgA form, full IgD form, full IgE form, full IgG form, full IgM form, such as full IgG form), and scFv, which is an antigen-binding fragment fragment derived from the antibody, scFvFc, (scFv) 2 Fab, Fab 'and may be selected from the group consisting of F (ab') 2 and the like.
  • the antibody may be a protein that is specifically expressed in all proteins in vivo, in particular, cancer cells or cancer tissues, such as various growth factors or receptor tyrosine kinase.
  • the antibody may be anti c-Met antibody, anti EGFR (Epi dermal growth factor receptor) antibody, anti HER2 (Human epidermal growth factor receptor 2) antibody, anti HER3 (Human e idermal growth factor receptor 3) antibody, anti VEGF (vascular)
  • One or more antibodies selected from the group consisting of Endothelial Cell Growth Factor) antibodies, anti-angiopoietin 2 antibodies, or the like, or scFv, scFvFc, (scFv) 2 , Fab, Fab '
  • it may be an antigen binding fragment selected from the group consisting of F (ab ') 2 and the like, but is not limited thereto.
  • the anti-c-Met antibody is a c-Met derived from mammals such as primates such as humans, monkeys, and rodents such as mice and rats, such as GenBank Accession Nos. It is an antibody which specifically recognizes c-Met which has the amino acid sequence provided in NP_000236, NP_001162100, NP_032617.2, NP_113705.1, etc.
  • the anti-EGFR antibody is an EGFR derived from a mammal such as a primate such as human or a primate, a rodent such as a mouse or a rat, such as GenBank Accession Nos. JQ739160, JQ739161, JQ739162, JQ739163, JQ739164, JQ739165, JQ739166, JQ739167, NM— 005228.3, ⁇ _201284.1, NM ⁇ 201282.1, or NM_201283.1, etc., encoded by the nucleotide sequence (mRNA).
  • mRNA nucleotide sequence
  • an antibody that recognizes EGFR as a specific product it may be at least one selected from the group consisting of Cetuximab, Panitumumab, and the like.
  • Anti-HER2 antibodies are derived from mammals such as humans, primates such as monkeys, rodents such as mice, rats, and the like, such as GenBank Accession Nos.
  • the anti-HER3 antibody is HER3 derived from mammals such as humans, primates of primates, rodents such as mice, rats, and the like, such as GenBank Accession Nos. It may be an antibody that specifically recognizes HER3 having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence (mRNA) provided in ⁇ _001982.2, ⁇ _001982.3, ⁇ _001005915.1, ⁇ _010153.1, ⁇ — 017218.2 or ⁇ _001103105.1, and the like.
  • mRNA nucleotide sequence
  • the anti-VEGF antibody is a VEGF derived from mammals such as primates such as humans, monkeys, and rodents such as mice and rats, such as GenBank Accession Number # _001025366.2. NM_001025367.2. NM '001025368.2. NM_001025369.2. NM_001025370.2. NM_001033756.2. NM_001171622.1. NM_001171623.1. M_001171624.1. M_001171625.1. NM_001171626.1. NM_001171627.1. ⁇ _001171628.1. NM_001171629.1. NM_001171630.1. NM_001204384.1. NM_001204385.1. Or an antibody that specifically recognizes VEGF encoded by a nucleotide sequence (mRNA) provided in NM_003376.5 or the like, such as, for example, avastin.
  • mRNA nucleotide sequence
  • the antibody as the targeting carrier has a form of a second nucleic acid binding protein ⁇ antibody conjugate, linked to the Crab nucleic acid binding peptide, separate from the (first) nucleic acid binding peptide used as the stabilizing carrier described above. It may be.
  • the second nucleic acid binding protein-antibody conjugate is characterized in that the second nucleic acid binding protein is the N terminus, C terminus, or both termini of the antibody (in the case of dimeric IgG antibody, the N terminus, C terminus, or both termini of one monomer). Or N, C, or both ends of each of the two monomers).
  • the second nucleic acid binding protein-antibody conjugate binds the second nucleic acid binding protein to the N terminus of the antibody (in the case of a dimeric form of IgG type antibody, the N terminus of one monomer or the N terminus of each of the two monomers). It may be.
  • the C2 nucleic acid binding protein-antibody conjugate may be one to four, or one to two, or one second nucleic acid binding protein per antibody.
  • the antibody is an antibody of the full form full IgA form, full IgD form, full IgE form, full IgG form, full IgM form (eg, full IgG form), and / or antibody fragments derived from the antibody.
  • scFv, scFvFc, (scFv) 2 , Fab, Fab 'and may be from the group consisting of F (ab') 2 and the like.
  • the crab 2 nucleic acid binding protein is PEG at one or both ends.
  • One or more functional groups selected from the group consisting of (polyethyleneglycol), etc. may be introduced to improve nucleic acid delivery efficiency and stability.
  • a functional group such as PEG
  • the second nucleic acid binding protein may bind to the antibody through the functional group (see FIG. 2).
  • the second nucleic acid binding protein-antibody conjugate structure may bind the second nucleic acid binding protein to the nucleic acid and bind the antibody to the nucleic acid, thereby exerting a more favorable effect on target delivery of the nucleic acid through the antibody. It may also contribute to the stability enhancing effect described above.
  • the type of peptide usable as the second nucleic acid binding peptide linked to the antibody is as described above in the nucleic acid binding peptide serving as a stabilizing carrier, and may be the same as or different from the first nucleic acid binding peptide serving as the stabilizing carrier.
  • the nucleic acid delivery composition is a nucleic acid binding to the antibody as described above
  • Peptides may be included in any ratio.
  • the content ratio between the antibody or the second nucleic acid binding protein as the targeting carrier—the antibody conjugate and the first nucleic acid binding protein as the stabilizing carrier is in a molar ratio of 1: 9 to 3: 7. (Targeting carrier mole: stabilizing carrier mole).
  • the second nucleic acid binding protein-antibody conjugate is one to four, or one to two second nucleic acid binding protein per antibody, or One may be bound, and the second nucleic acid binding protein may be bound to the N terminus, C terminus, or both termini of the antibody.
  • a content ratio molar ratio
  • the second nucleic acid binding protein may be bound to the N terminus, C terminus, or both termini of the antibody.
  • the composition for nucleic acid delivery not only has excellent targeting efficiency in nucleic acid delivery by including an antibody, but also includes a nucleic acid binding peptide containing a cationic amino acid and a hydrophobic amino acid. Since is excellent, it can be usefully used as a new nucleic acid carrier that can overcome the limitations of existing nucleic acid carriers.
  • nucleic acid complex comprising the nucleic acid delivery composition and a nucleic acid described above.
  • the antibody included in the nucleic acid complex as a component of the nucleic acid delivery composition is a complete antibody (ful l IgA form, ful l IgD form, ful l IgE form, ful l IgG form, ful l IgM form, for example, ful l IgG form).
  • It may be a system 2 nucleic acid binding peptide-antibody conjugate to which a 2 nucleic acid binding peptide is conjugated.
  • the complex has a nucleic acid located in the center thereof, and a nucleic acid binding peptide (including a first nucleic acid binding peptide as a stabilizing carrier and a second nucleic acid binding peptide bound to an antibody) electrostatically bound to the nucleic acid. Surrounding the nucleic acid, it may have a stable nanoparticle form of the antibody bound thereto.
  • the site where the cationic amino acid is distributed in the nucleic acid binding peptide is capable of binding by nucleic acid and electrostatic attraction, and one or more nucleic acid binding peptides may bind to the nucleic acid to form a nanoparticle-type complex surrounding the nucleic acid.
  • the antibody may bind to the nucleic acid binding peptide or to the nucleic acid through a second nucleic acid binding peptide (when the antibody is in the form of a second nucleic acid binding peptide-antibody conjugate) linked to the antibody (see FIG. 1).
  • the nucleic acid may be one or more selected from the group consisting of single- or double-stranded DNA, RNA, small interference RNA (siRNA), antisense-ligigonucleotide, shRNA, micro RNA (miR As) and the like.
  • RNA small interference RNA
  • shRNA small RNA
  • miR As micro RNA
  • the nucleic acid complex may be in the form of a uniform and stable nanoparticles.
  • the nanoparticles may have an average particle diameter of 100 nm or less, for example, 10 to 100 nm or 50 nm to 100 nm.
  • the amount of nucleic acid deliverable by the nucleic acid delivery composition, or the content of nucleic acid in the nucleic acid complex is 0.1 to 1 mole of nucleic acid per 1 mole of the nucleic acid delivery composition (targeting carrier + stabilizer), For example, it may be 0.1 to 0.5 moles.
  • the content ratio between the targeting carrier (antibody or second nucleic acid binding protein-antibody conjugate) and the stabilizing carrier (nucleic acid binding protein) in the nucleic acid delivery composition is in a molar ratio of 1: 9 to 3: 7 (targeting molar: stabilizing). Carrier mole).
  • Another example provides a nucleic acid delivery method comprising administering the nucleic acid complex to a patient.
  • the patient may be a mammal, such as a primate, such as a human or a monkey, a rat, a mouse, or a rodent, such as a rodent, or a cell (tissue) derived from the animal, a tissue, or a culture thereof, and delivery of nucleic acid contained in the complex. It may be an animal in need thereof or a cell or tissue derived therefrom.
  • the nucleic acid The delivery method may further comprise identifying a patient in need of delivery of said nucleic acid prior to said administering.
  • the nucleic acid complex may be administered orally or parenterally to a patient in need of administration of the nucleic acid, or may be treated in the cell or tissue.
  • the nucleic acid complex may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, which is commonly used in the formulation of drugs containing nucleic acids, lactose, dextrose, sucrose, sorbbi, manny, starch. , Acacia rubber, phosphate, alginate, gelatin, silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyridone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, Talc, magnesium stearate, mineral oil, etc. may be one or more selected from the group, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may also further include one or more selected from the group consisting of diluents, excipients, lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, and the like commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • Administration of the nucleic acid complex can be via an oral or parenteral route.
  • parenteral administration it can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, pulmonary administration and rectal administration.
  • oral administration because proteins or peptides are digested, oral compositions should be formulated to coat or protect the active agent from degradation in the stomach.
  • the nucleic acid complexes may also be formulated in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of extracts, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may be formulated as dispersants or stable for formulation. It may further include a topic.
  • the present invention is very effective in binding new nucleic acid (eg siRNA) to form a stable complex, specific cell specific delivery, new nucleic acid delivery It provides a system, which enables the delivery of new nucleic acid targets for clinical application.
  • new nucleic acid eg siRNA
  • Target delivery of nucleic acids delivery and function only to specific cells through targeting carriers
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a nucleic acid carrier according to one embodiment.
  • Figure 2 is a diagram schematically showing the manufacturing process of the antibody conjugate to which another nucleic acid binding peptide is introduced in one embodiment.
  • Figure 3 is a graph showing the size exclusion chromatography results after purification of the antibody conjugate introduced nucleic acid binding peptides according to one embodiment.
  • FIG. 4 is a graph showing a comparison of changes in nanoparticulate behavior according to NaCl concentrations of nucleic acid binding peptides before and after PEGylation (PEGylat ion) and small interfering ribonucleic acid (s iRNA) complexes.
  • PEGylat ion PEGylation
  • s iRNA small interfering ribonucleic acid
  • R3W nucleic acid binding peptide
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing the manufacturing process of nucleic acid binding peptide (R3WW) 6- PEG.
  • Figure 7 shows the results of the separation and purification of (R3WW) 6 — PEG using HPLC It is a graph.
  • FIG. 8 is a graph showing product levels tested with varying moles of PEG and (R3WW) 6 peptide.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of performing an ion exchange column for anti-Her2 scFVFc.
  • ALD-PEG—ALD MW 2000
  • lOSmol / ml in DMSCXDimethyl sulfoxide a molar ratio of 1 to 5 (PEG / (R3 ⁇ ) 6 peptide) at room temperature.
  • the animal cell culture process was performed as follows. Freestyle TM 293 'F cells (suspension human embryonal kidney eel Is, Cat. No.R790-07; Invi togen; hereinafter' HEK293F ') were added to 37 0 C and C0 in 1 L Erlenmeyer flasks at a concentration of 1.0X10 6 cel ls / ml. Incubated for 12 days under 2 8% culture conditions. DNA (1.250 mg) cloned into the pCEP4 vector was transfected into the HEK293F cells using Freestyle MAX reagent (Promega).
  • the transfected cells were a-cultured for two weeks, the Specifications, and every protein in 3-4 days> Collect the expression medium and replace it with a new medium, and was performed for cultured (medium: Gibco FreeStyle TM 293 Expression Medium; Invi trogen).
  • the ion exchange column performance of the anti-HER2 scFvFc is shown in FIG. 9. As shown in FIG. 9, when the 5-15% gradient of the B buffer was 7.5 minutes, it was confirmed that the anti-HER2 scFvFc was the most optimal condition to completely separate the impurities.
  • the PEGylated nucleic acid binding peptide [(R3 ′) 6 -PEG ′ ALD] prepared in Example 1 was conjugated to the N terminus of the separated and purified anti-Her2 scFvFc, and one scFvFc was conjugated. Only the conjugate into which (R3WW) 6- PEG-ALD was introduced was purified through affinity chromatography and silver exchange chromatography (FIG. 2). Reference) . Specifically, 10 micromoles (uM) of the purified and purified -Her2 scFvFc and (R3WW) 6- PEG-ALD (25 to 100 micromoles (uM)) prepared in Example 1 were mixed to obtain 4 0.
  • FIG. 3 The analysis result using the ion exchange chromatography (source 15S column) is shown in FIG. 3. Except that the amino acid sequence of the nucleic acid binding peptide was prepared as follows, the conjugate was prepared in the same manner as above, and the result of ion exchange chromatography analysis performed by the above-described method on the prepared conjugate was also shown in FIG. 3. :
  • R3W R RWRRRWRRRWRRRWRRRW (SEQ ID NO 6: Nucleic acid binding peptide of the scFvFc-R3W conjugate shown in FIG. 3).
  • the scFvFc [9Rd-scFvFc conjugate, (R3W) 6 -scFvFc conjugate, or (R3WW) 6 -scFvFc conjugate] conjugated to a nucleic acid binding peptide having a cationic amino acid R (Arg) is scFvFc ( Example 2. Since it has more cation than 1), it binds better to cation exchange resin and elutes at higher salt concentration, so that the product peak appears later, among which (R3 ⁇ ) 6 scFvFc conjugate The product peak was the last.
  • the (R3WW) 6 peptide prepared in Example 1 and siRNA were mixed at a molar ratio of 1: 5 and incubated at room temperature for 30 minutes to form a complex. Thereafter, each was incubated for 30 minutes in different concentrations (0, 75, 150, 300 nM) of NaCl solution. The size of the composite nanoparticles produced at this time was measured by DLS (Dynamic light scattering) equipment.
  • siRNA sequence is as follows:
  • Sense sequence 5'-CCU ACG CCA CCA AUU UCG U (dTdT) -3 '(SEQ ID NO: 2-dTdT)
  • Antisense sequence 5' -ACG AAA UUG GUG GCG UAG G (dTdT) -3 '(SEQ ID NO:
  • siRNA intracellular delivery efficiency of (R3WW) 6- PEG-scFvFc conjugates (targeting carriers) and (R3WW) 6- PEG (stabilizing carriers) was determined by using siRNA for Fluorescence-act ivated cel l sorting. ) was evaluated by analytical methods.
  • SK-BR-3 HER2 positive ive cells; accession number HTB-30
  • MCF7 HER2 negat ive cells; ATCC, accession number: HTB-22
  • R3WW 6- PEG-scFvFc conjugate
  • R3WW stabilizing vehicle; Example 1
  • a complex of the nucleic acid carrier and FITC-siRNA mixed in combination was prepared and used for testing.
  • the FITC-siRNA was prepared by labeling FITC (Fluorescein i sothiocyanate) at the 5 1 end of the siRNA of SEQ ID NO: 2 and 3 used in Example 3.
  • FITC Fluorescein i sothiocyanate
  • (R3WW) 6- PEG-scFvFc conjugate (Example 2.2) was mixed with the prepared FITC-siRNA in a molar ratio of 1: 1 (conjugated mole: mole of FITC siRNA) and then complexed for 30 minutes at room temperature.
  • (R3WW) 6- PEG peptide was added so that the molar ratio of the PEG—scFvFc conjugate was 1: 9 (target molar molar: molar stabilized carrier) and complexed further for 30 minutes at room temperature.
  • the obtained complexes were treated with the cells (SK-BR-3 and MCF7) prepared previously (complex treatment concentration: 20 nM or ⁇ based on siRNA concentration).
  • the cells were incubated at 37 ° C for 4 hours, harvested with trypsin, and removed with PBS / 0.3% (v / v) BSA ( P H 3.8) to remove complexes remaining on the cell surface without internal izat ion into the cells.
  • the cells were washed.
  • the FACS analysis was carried out with the cell solution on the PBS finally obtained (using the BD FACS Canister).
  • FIG. 5 it was confirmed that a large amount of s iRNA was introduced into the cell specifically to HER2 overexpressing cells (SK-BR-3) through the nucleic acid delivery system (complex).

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Abstract

양이온성 아미노산과 소수성 아미노산을 포함하는 핵산 결합 펩타이드 및 항체를 포함하는 안정화 전달체를 포함하는 핵산 전달용 조성물, 상기 핵산 전달용 조성물 및 핵산을 포함하는 핵산 복합체, 및 상기 핵산 전달용 조성물을 이용한 핵산 전달 방법이 제공된다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
항체 및 핵산 결합 펩타이드를 포함하는 핵산 전달용 조성물 【기술분야】
양이은성 아미노산과 소수성 아미노산을 포함하는 핵산 결합 펩타이드 및 항체를 포함하는 핵산 전달용 조성물, 상기 핵산 전달용 조성물 및 핵산을 포함하는 핵산 복합체 나노입자， 및 상기 핵산 전달용 조성물을 이용한 핵산 전달 방법에 관한 것이다.
【배경기술】
유전자 전달이란 DNA 또는 RNA와 같은 핵산 물질을 전달체를 이용하여 세포에 도입한 후 도입된 유전자의 발현 또는 RNA 간섭 등의 기능에 의하여 세포의 특성을 변화하는 기술이다. 환형 DNA (plasmid DNA)를 도입하는 경우 도입된 DNA의 전사 및 발현에 의하여 새로운 단백질의 발현을 도모할 수 있는 기술이다.
RNA 간섭 (RNA interference)은 외인성 이중가닥 RNA (dsRNA)를 세포내로 도입하여 특정 메신저 RNA (mRNA)를 특이적으로 파괴하거나 그 발현을 차단함으로써 유전자 발현을 감소 또는 억제 시키는 기술이다 (A. Fire et al. , Nature, 391， 806-11， 1998). 소간섭 리보핵산 (siRNA) 및 마이크로 리보핵산 (miRNAs)과 같은 특이적 형태의 RNA가 이러한 R A 간섭 효과를 보이는 것으로 알려져 있다. 특히 siRNA의 경우 특정 타겟의 mRNA에 특이적 간섭 효과를 보이기 때문에 약물 스크리닝, 질병 치료 등의 다양한 웅용성을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 임상 웅용에 있어서 상기 RNA 간섭 물질들을 효율적이고 세포 특이적으로 전달하는 방법은 여전히 해결해야 할 난제로 남아 있다.
소간섭 리보핵산 (siRNA)의 세포 내 전달을 위해 지질—기반， 양이온성 저분자-기반， 양이온성 폴리머 -기반 기술들과 이들의 조합 방식들이 다양하게 시도되어 왔으나 대부분 비특이적 전달방법으로 적용되었다. 이를 개선하기 위한 방법으로 세포 특이적 물질이 도입된 지질-기반， 항체절편- 기반 및 고분자-기반의 전달체를 이용한 표적 천달이 시도된 바 있으며 (공개특허 W0 2006/023491 , US 2010/0209440 등)， 타게팅 모이어티의 도입으로 보다 향상된 s iRNA 전달 효을을 보인 바 있다.
따라서， 소간섭 리보핵산 (s iRNA)의 성공적 임상 치료제로의 웅용을 위하여 보다 안정적인 소간섭 리보핵산 복합체를 형성하면서 동시에 매우 우수한 표적 전달 효을을 보이는 새로운 전달 시스템 개발이 절실한 실정이다. 뿐만 아니라, 소간섭 리보핵산 전달의 효과를 보다 극대화 시킬 수 있는 새로운 기능성 전달체 (생물학적 효능을 갖는 전달체)의 개발은 s iRNA를 이용한 질병 치료제 개발에 획기적 전환점을 가져올 것으로 기대된다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제]
일 예는 항체 및 양이온성 아미노산과 소수성 아미노산을 포함하는 핵산 결합 펩타이드를 포함하는 핵산 전달용 조성물을 제공한다.
또 다른 예는 항체 및 양이온성 아미노산과 소수성 아미노산을 포함하는 핵산 결합 펩타이드의 핵산 전달을 위한 용도를 제공한다.
또 다른 예는 상기 핵산 전달용 조성물을 이용하는 핵산 전달 방법을 제공한다.
또 다른 예는 상기 핵산 전달용 조성물 및 핵산을 포함하는 핵산 복합체를 제공한다.
【기술적 해결방법】
본 발명은 특정세포의 특이적 표면인자 (항원)에 결합하고， 상기의 결합이 세포 내로의 내재화 ( internal i zat i on)를 유도하며 이를 통하여 효과적으로 핵산을 세포 내로 전달할 수 있는 새로운 핵산 전달 시스템과 이를 이용한 효율적인 질병 치료 기술과 관련된 것이다.
상기 핵산 전달 시스템은 표적화 전달체로서 역할을 하는 항체와 안정화 전달체로서 역할을 하는 핵산 결합 펩타이드가 특정 비율로 흔합되어， 핵산과 결합 시 나노입자 (nanopart i cle) 형태의 복합체를 생성할 수 있다.
상기 전달 시스템에서 표적화 전달체로서 포함되는 항체는 높은 항원 특이성을 갖기 때문에 매우 우수한 특정세포 표적성을 보일 뿐만 아니라， 항체 고유의 생물학적 활성 (예 : 암 성장억제 및 사멸 등)을 나타낼 수 있으므로, 전달되는 핵산 (예컨대， s iRNA)과의 상승 효과를 얻을 수 있다. 또한, 안정화 전달체로서 포함되는 핵산 결합 펩타이드는 PEG 등의 작용기가 도입되거나 도입되지 않은 것으로， 핵산과 결합하여 매우 안정적인 복합체를 형성할 수 있으며， 생체내 (예컨대, 혈액)에서도 안정한 나노입자 (nanopart i c l e)를 형성할 수 있다. .
본 발명의 일 양상에 따른 항체와 핵산 결합 펩타이드를 포함하는 핵산 전달용 조성물은 표적화 (항체)와 안정화 (페길레이션 된 핵산 결합 펩타이드)의 두 기능성 부위가 결합된 새로운 새로운 개념의 핵산 전달 시스템으로， 핵산의 표적화 및 전달 효율이 매우 우수할 뿐 아니라， 핵산 분해 효소와 같은 핵산 불안정화 요소가 많은 환경에서도 핵산을 매우 안정하게 보호하고， 혈중에서 나노입자가 웅집 (aggregat i on)되지 않고 안정하게 균일한 입자를 유지할 수 있도록 한다. 따라서， 일 양상에 따른 핵산 전달 시스템 (핵산 전달용 조성물)은 정맥주사 등과 같이 전신투여 (systemi c de l ivery) 후에도 혈증에서 분해 및 응집되지 않고 매우 안정적 형태의 순환을 이루며 병변조직 (예컨대 암) 등의 표적 조직에만 결합된 후 세포내 내재화 과정 ( internal i zat i on)을 통하여 핵산을 세포 내에 효을적으로 전달할 수 있다.
일 예에서, 안정화 전달체와 표적화 전달체를 포함하는 핵산 전달용 조성물이 제공된다.
본 명세서에서， 안정화 전달체는 핵산 결합 펩타이드일 수 있으며， 상기 핵산 결합 펩타이드는 PEG 등의 작용기가 도입되거나 도입되지 않은 핵산 결합 펩타이드일 수 있고， 하기하는 항체에 결합된 (제 2) 핵산 결합 펩타이드와 구별하기 위하여， 이하 '제 1 핵산 결합 펩타이드1로 칭해질 수 있다. 상기 안정화 전달체는 아래의 그림과 같이 예시적으로 표현될 수 있다:
<안정화 전
Figure imgf000006_0001
' ： 핵산 결합 펩타이드; ' ： 작용기 (e.g.， PEG)) 상기 표적화 전달체는 항체 또는 항체에 핵산 결합 펩타이드가 결합되어 있는 접합체일 수 있으며, 상기 핵산 결합 펩타이드는 PEG 등의 작용기가 도입되거나 도입되지 않은 핵산 결합 펩타이드일 수 있다. 상기 표적화 전달체에서 항체에 결합된 핵산 결합 펩타이드는， 앞서 설명한 안정화 전달체로서의 (제 1) 핵산 결합 펩타이드와 구별하기 위하여, 이하 '제 2 핵산 결합 펩타이드'로 칭한다. 상기 표적화 전달체는 아래 그림과 같이 예시적으로 표현될 수 있다:
<표적화 전달체 >
Figure imgf000006_0002
또는
핵산 결합 펩타이드, (e.g. , PEG),
Figure imgf000006_0003
： 항체 또는 항원 결합 단편 (e.g. , scFvFc)).
상기 안정화 전달체 역할을 하는 핵산 결합 펩타이드는 핵산과 이은 결합이 가능한 양이온성 아미노산과 , 상기 양이온성 아미노산과 핵산과의 결합력 강화 및 안정성의 증진을 위한 소수성 아미노산을 포함한다. 또한， 상기 안정화 전달체는 작용기， 예컨대 PEG (po lyethyl ene glyco l )을 포함함으로써， 수용액 내 환경 또는 생체 내 환경에서의 안정성이 증진되어 복합체가 서로 웅집하지 않고 고르게 분산된 형태로 유지될 수 있도록 할 수 있다. 펩타이드 또는 단백질에 PEG가 결합 (페길레이션)함으로써 펩타이드나 단백질이 체내에서 효소들에 의해 분해되거나 간 등의 장기에서 손실되는 것을 방지하여 체내에서 오랜 기간 유지될 수 있도록 하여 (반감기 증가)， 체내 안전성을 증진시킬 수 있다. 여기에 더하여， 본 발명은 펩타이드 또는 단백질에 PEG 등의 작용기를 결합시킴으로써, 복합체가 안정한 나노입자를 형성하도록 하여， 나노입자 형태의 복합체가 서로 웅집하여 침전하지 않고 (ant i -aggregat i on) , 나노 사이즈를 유지하면서 수용액 환경 또는 체내 환경에서 균일하게 분산 및 /또는 이동될 수 있도록 할 수 있다. 실시예 3에서 보여지는 바와 같이, PEG가 결합하지 않은 경우에는 나노입자 형태의 복합체가 체내와 유사한 염 용액 환경에서 웅집되어 큰 사이즈의 응집체를 형성하여 안정한 나노 입자 형태를 유지할 수 없는 반면， 본원발명에서와 같이 PEG 등의 작용기가 결합된 경우 나노 범위 ( ΙΟΟηΜ 이하)의 크기를 유지하고， 염 용액의 농도가 높아짐에도 그 크기 차이가 크게 없음을 확인할 수 있다. 즉， 본 발명은 펩타이드 또는 단백질에 PEG 등의 작용기를 결합시킴으로써， 체내 안전성 증진 (분해 방지 및 반감기 증가)과 함께 체내 안정성 (웅집 방지 및 수용액내 균일한 분산성 유지) 증가 효과를 얻을 수 있음을 하나의 특징으로 한다. 또한， 이와 같은 PEG 등의 작용기를 결합에 의하여， 복합체의 세포내 흡수도 증가시킬 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 핵산 결합 펩타이드는 DNA 또는 RNA와 같은 핵산 물질과 이온복합체를 형성할 수 있는 펩타이드로서， 알지닌， 라이신， 오르니틴, 히스티딘 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 양이온성 아미노산 및 트립토판， 타이로신， 페닐알라닌, 루이신 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 소수성 아미노산을 포함하는 것일 수 있다.
상기 핵산 결합 펩타이드 분자에 포함된 아미노산의 총 개수는 2 내지 100개, 구체적으로 10 내지 60개， 보다 구체적으로 15 내지 40개 정도일 수 있다.
상기 제 1 핵산 결합 펩타이드 분자에 포함되는 양이온성 아미노산은 정전기적 인력에 의하여 핵산의 음이은과 결합하여 핵산과의 이온복합체 형성을 가능하게 하는 역할을 한다. 핵산과의 이온 복합체 형성에 보다 적합하도록 하기 위하여, 상기 핵산 결합 펩타이드 분자 내의 양이온성 아미노산의 수는 1 내지 35개， 구체적으로 10 내지 30개， 보다 구체적으로 15 내지 25개일 수 있다. 상기 각각의 양이온성 아미노산은 서로 동일하거나 상이할 수 있으며， 각각 독립적으로 아르기닌， 라이신 및 히스티딘으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 핵산 결합 펩타이드 분자 내의 소수성 아미노산은 수용액 내에서 핵산과의 이온 복합체의 안정성을 향상시키는 역할과 더불어， 핵산 전달시 핵산의 세포 내 전달 효율을 증진시키는 역할을 한다. 이러한 안정화 효능을 적절하게 나타내기 위하여， 상기 소수성 아미노산은 벤젠고리를 포함하는 것일 수 있다. 또한， 이러한 안정화 효능을 적절하게 나타내기 위하여， 상기 핵산 결합 펩타이드 분자 내의 소수성 아미노산의 함량은， 전체 핵산 결합 펩타이드 중량에 대하여， 1 내지 50 중량 ¾>, 구체적으로 10 내지 48 중량 %， 더욱 구체적으로 15 내지 45 중량 %일 수 있다. 상기 소수성 아미노산은 벤젠고리를 포함하는 소수성 아미노산으로, 트립토판， 타이로신， 페닐알라닌， 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며， 핵산 결합 펩타이드에 포함되는 각각의 소수성 아미노산은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
구체예에서， 상기 핵산 결합 펩타이드 분자는 다음의 화학식 1로 표현되는 것일 수 있다:
[화학식 1] . [ (X)pl(Z)ql] l-[ (X)p2(Z)q2]2... [ (X)p(n-1) (Z)q(n -l)]n-lᅳ [ (X)pn(Z)qn]n , 상기 식 중
X는 양이온성 아미노산이고，
Z는 아¾기, 예컨대， 벤젠고리를 포함하는 소수성 아미노산이고 n은 단위체의 개수로서 1 내지 20， 구체적으로 2 내지 10의 정수이고，
' ρΐ , ρ2...ρη '에서 ρ는 해당 단위체에 포함된 양이온성 아미노산의 개수로서 1 내지 10， 구체적으로 1 내지 5의 정수이고 (이 때 η은 해당 단위체가 몇 번째 위치인지 나타냄)，
' ql , q2...Qn '에서 q는 해당 단위체에 포함된 벤젠고리를 포함하는 소수성 아미노산의 개수로서 1 내지 10， 구체적으로 1 내지 5의 정수이고 (이 때 n은 해당 단위체가 몇 번째 위치인지 나타냄)，
상기 pi , p2...pn과 ql , q2...qn은 각 단위체마다 서로 같거나 상이한 수치일 수 있으며,
총 아미노산 길이는 2 내지 100개， 구체적으로 10 내지 60개， 보다 구체적으로 15 내지 40개이고，
X가 2개 이상 존재하는 경우 서로 같거나 상이한 아미노산일 수 있고， Z가 2개 이상 존재하는 경우 서로 같거나 상이한 아미노산일 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이， 상기의 핵산 결합 펩타이드는 양이온성 아미노산 잔기와 핵산의 음이온이 정전기적 인력에 의하여 이온복합체를 형성할 뿐만 아니라, 형성된 이온복합체에서 소수성 아미노산 잔기가 수용액 내에서 복합체의 안정성을 향상시키는 효능을 나타낸다.
또한， 상기 핵산 결합 펩타이드는 한쪽 말단， 양쪽 말단， 또는 결합 가능한 위치에 PEG (polyethyleneglycol ) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 작용기를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이， PEG 등의 작용기가 도입됨으로써， 핵산 전달 효율과 안정성을 보다 증진시킬 수 있다. 이 때 사용 가능한 PEG는 예컨대 질량평균분자량이 100 내지 10,000, 구체적으로 500 내지 5000 범위인 것일 수 있다. 일 구체예에서， 상기 PEG는 알데하이드기 등의 환원기가 하나 이상， 예컨대 하나 또는 두 개의 환원기가 결합되어 관능화된 것일 수 있다. 상기 환원기는 PEG가 핵산 결합 펩타이드 또는 항체와 결합한 후 유리될 수 있다. 작용기가 도입된 핵산 결합 펩타이드를 사용하는 경우， 작용기가 도입된 핵산 결합 펩타이드의 생성에 유리하도록， 작용기 (예컨대， PEG)/핵산 결합 펩타이드의 몰비를 1 내지 5， 구체적으로 2 내지 5， 보다 구체적으로 3 내지 5로 하여 반응시킬 수 있다.
표적화 전달체 역할을 하는 항체는 핵산 전달에 있어서의 표적 세포의 표면에 발현하는 항원에 특이적으로 결합하는 모은 항체 또는 상기 항체로부터 유래하는 단편일 수 있다. 본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한， 항체는 상기 항체로부터 유래하는 항원 결합 단편을 함께 의미하는 것으로 해석된다. 상기 항체는 항원과 특이적으로 결합하여， 세포 내로 내재화 (internalization)하예 전달 대상 핵산을 세포 내로 이동시켜， 세포 치료 효율을 증대시키는 것일 수 있으며， 마우스 항체， 키메릭 항체， 인간화 항체， 또는 인간 항체일 수 있다. 상기 항체는 생체로부터 분리되거나 비자연적 (non-natural ly)으로 생성된 것일 수 있으며， 예컨대， 재조합적 또는 합성적으로 생성된 것일 수 있다. 상기 항체로부터 유래하는 항원 결합 단편은 항체로부터 유래하는 scFV, (scFv)2> scFvFc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 명세서에서， "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서， 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 핵산 전달용 조성물 및 제 2 핵산 결합 단백질 -항체 접합체의 구성 성분인 '항체 ' 또는 '표적화 전달체로서 항체 '는 특별한 언급이 없는 한 완전한 형태 (full IgA form, full IgD form, full IgE form, full IgG form, full IgM form, 예컨대, full IgG form)의 항체, 및 /또는 상기 항체로부터 유래하는 항원 결합 단편인 scFV, (scFv)2, scFvFc, Fab, Fab' 및 F(ab')2 등으로 이루어진 군에서 선택된 것을 의미하는 것으로 사용된다.
핵산 전달용 조성물에 표적화 전달체 역할을 위하여 포함되는 항체는 표적하는 핵산 전달 표적 세포에서 발현하는 모든 항원 중 어느 하나에 특이적으로 결합하는 항체라면 특별한 제한 없이 모두 사용될 수 있다. 예컨대， 상기 항체는 완전한 형태 (full IgA form, full IgD form, full IgE form, full IgG form, full IgM form, 예컨대， full IgG form)의 항체， 및 상기 항체로부터 유래하는 항원 결합 단편 단편인 scFv, scFvFc, (scFv)2 Fab, Fab' 및 F(ab')2 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 항체는 생체 내 모든 단백질， 특히 암세포 또는 암조직에서 특이적으로 발현하는 단백질， 예컨대 각종 성장인자 또는 수용체 타이로신 카이네이즈 등을 항원으로 하는 것일 수 있다. 예컨대 상기 항체는 항 c-Met 항체, 항 EGFR(Epi dermal growth factor receptor) 항체， 항 HER2 (Human epidermal growth factor receptor 2) 항체， 항 HER3 (Human e idermal growth factor receptor 3) 항체， 항 VEGF( Vascular Endothelial Cell Growth Factor) 항체， 항 Ang2(angiopoietin 2) 항체, 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 항체 (full IgG form) , 또는 상기 항체로부터 유래하는 scFv, scFvFc, (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2 등으로 이루어진 군에서 선택된 항원 결합 단편일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항 c-Met 항체는 인간， 원숭이 등의 영장류， 마우스， 래트 등의 설치류 등과 같은 포유류로부터 유래하는 c-Met, 예컨대 GenBank Accession Nos. NP_000236, NP_001162100, NP_032617.2, NP_113705.1 등에 제공된 아미노산 서열을 갖는 c-Met을 특이적으로 인식하는 항체이다.
상기 항 EGFR 항체는 인간， 원승이 등의 영장류, 마우스， 래트 등의 설치류 등과 같은 포유류로부터 유래하는 EGFR, 예컨대 GenBank Accession Nos. JQ739160, JQ739161, JQ739162, JQ739163, JQ739164, JQ739165, JQ739166, JQ739167, NM— 005228.3， 匪_201284.1， NMᅳ 201282.1, 또는 NM_201283.1 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의해 암호화되는 EGFR을 특이작으로 인식하는 항체로서, 세특시맙 (Cetuximab), 패니투무맙 (Panitumumab) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
항 HER2 항체는 인간， 원숭이 등의 영장류， 마우스， 래트 등의 설치류 등과 같은 포유류로부터 유래하는 HER2, 예컨대 GenBank Accession Nos. NM 004448.2 (h雇 an), 丽_001003817 (mouse), 匪_017003 (rat) 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열 (m NA)에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 HER2를 특이적으로 인식하는 항체로서， 트라스투추맙 (Transtuzumab; Herceptin) , 페르투추맙 (Pertuzumab)， 트라스투추맙 엠탄신 (Trastuzumab emtansine: T-DM1) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 항 HER3 항체는 인간， 원승이 둥의 영장류， 마우스， 래트 등의 설치류 등과 같은 포유류로부터 유래하는 HER3, 예컨대 GenBank Accession Nos. ΝΜ_001982.2, ΝΜ_001982.3, ΝΜ_001005915.1, ΝΜ_010153.1, ΝΜ— 017218.2 또는 ΝΜ_001103105.1 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 HER3를 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.
상기 항 VEGF 항체는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스， 래트 등의 설치류 둥과 같은 포유류로부터 유래하는 VEGF, 예컨대 GenBank Accession Number 醒 _001025366.2. NM_001025367.2. NMᅳ 001025368.2. NM_001025369.2. NM_001025370.2. NM_001033756.2. NM_001171622.1. NM_001171623.1. M_001171624.1. M_001171625.1. NM_001171626.1. NM_001171627.1. 匪_001171628.1. NM_001171629.1. NM_001171630.1. NM_001204384.1. NM_001204385.1. 또는 NM_003376.5 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의해 암호화되는 VEGF를 특이적으로 인식하는 항체로서， 예컨대 아바스틴 (avastin) 등일 수 있다.
구체예에 있어서， 상기 표적화 전달체로서의 항체는， 앞서 설명한 안정화 전달체로서 사용된 (제 1) 핵산 결합 펩타이드와 별도로， 게 2 핵산 결합 펩타이드와 연결되어 제 2 핵산 결합 단백질ᅳ항체 접합체 형태를 갖는 것일 수 있다. 상기 제 2 핵산 결합 단백질ᅳ항체 접합체는 제 2 핵산 결합 단백질이 항체의 N 말단， C 말단 또는 양쪽 말단 모두 (다이머 형태의 IgG형 항체의 경우, 하나의 모노머의 N 말단， C 말단 또는 양쪽 말단 모두, 또는 두 개의 모노머 각각의 N 말단， C 말단 또는 양쪽 말단 모두)에 결합되어 있는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 제 2 핵산 결합 단백질 -항체 접합체는 제 2 핵산 결합 단백질이 항체의 N 말단 (다이머 형태의 IgG형 항체의 경우， 하나의 모노머의 N 말단， 또는 두 개의 모노머 각각의 N 말단)에 결합되어 있는 것일 수 있다. 상기 게 2 핵산 결합 단백질 -항체 접합체는 항체 1개 당 제 2 핵산 결합 단백질 1개 내지 4개， 또는 1개 내지 2개， 또는 1개가 결합된 것일 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이， 상기 항체는 완전한 형태 full IgA form, full IgD form, full IgE form, full IgG form, full IgM form, 예컨대, full IgG form)의 항체, 및 /또는 상기 항체로부터 유래하는 항체 단편인 scFv, scFvFc , (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2 등으로 이루어진 군에서 것일 수 있다.
상기 게 2 핵산 결합 단백질은 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 PEG
(polyethyleneglycol) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 작용기가 도입되어 핵산 전달 효율과 안정성이 보다 증진된 것일 수 있다. 상기 제 2 핵산 결합 단백질의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 PEG 등의 작용기가 도입된 경우， 상기 제 2 핵산 결합 단백질은 상기 작용기를 통하여 항체와 결합할 수 있다 (도 2 참조). 상기 제 2 핵산 결합 단백질 -항체 접합체 구조는 결합된 제 2 핵산 결합 단백질이 핵산과의 결합에 참여하여 핵산과 항체를 연결시켜줌으로써, 항체를 통한 핵산의 표적 전달에 보다 유리한 효과를 발휘할 수 있으며， 앞서 설명한 안정성 증진 효과에도 기여할 수 있다.
상기 항체에 연결된 제 2 핵산 결합 펩타이드로서 사용 가능한 펩타이드 종류는 앞서 안정화 전달체 역할을 하는 핵산 결합 펩타이드에서 설명한 바와 같으며， .상기 안정화 전달체 역할을 하는 제 1 핵산 결합 펩타이드와 동일하거나 상이한 것일 수 있다.
핵산 전달용 조성물은 상기한 바와 같은 항체와 핵산 결합 펩타이드를 소정의 비율로 포함할 수 있다. 예컨대， 핵산과 결합하여 나노입자를 형성하기에 적합하도록， 표적화 전달체로서의 항체 또는 제 2 핵산 결합 단백질—항체 접합체와 안정화 전달체로서의 제 1 핵산 결합 단백질 간의 함량비는 몰비로 1 :9 내지 3: 7(표적화 전달체 몰:안정화 전달체 몰)일 수 있다. 상기 표적화 전달체로서 제 2 핵산 결합 단백질- 항체 접합체가 사용되는 경우， 상기 제 2 핵산 결합 단백질 -항체 접합체는 항체 1개 당 제 2 핵산 결합 단백질 1개 내지 4개， 또는 1개 내지 2개， 또는 1개가 결합된 것일 수 있으며， 상기 제 2 핵산 결합 단백질은 항체의 N 말단, C 말단, 또는 양쪽 말단 모두에 결합된 것일 수 있다. 핵산 결합 펩타이드 (상기 표적화 전달체로서 제 2 핵산 결합 단백질 -항체 접합체가 사용되는 경우， 상기 접합체에 포함된 제 2 핵산 결합 단백질 포함)에 대한 항체의 함량비 (몰비율)로 표현하면 약 1/10 내지 3/10 (항체 몰 /핵산 결합 펩타이드 몰)범위일 수 있다.
상기한 바와 같이， 핵산 전달용 조성물은 항체를 포함함으로써 핵산 전달에 있어서 표적화 효율이 우수할 뿐 아니라, 양이온성 아미노산과 소수성 아미노산을 포함하는 핵산 결합 펩타이드를 포함함으로써， 핵산과의 결합력 및 핵산 안정화 효과가 우수하므로， 기존의 핵산 전달체의 한계점을 극복할 수 있는 새로운 핵산 전달체로 유용하게 사용될 수 있다.
다른 예는 상기한 핵산 전달용 조성물 및 핵산을 포함하는 핵산 복합체를 제공한다. 상기 핵산 복합체에 '핵산 전달용 조성물의 성분으로 포함된 항체는 완전한 항체 (ful l IgA form, ful l IgD form, ful l IgE form , ful l IgG form, ful l IgM form, 예컨대， ful l IgG form) , 상기 항체로부터 유래하는 scFv, scFvFc , (scFv)2 , Fab , Fab ' 및 F(ab ' )2 등으로 이루어진 군에서 선택된 항원 결합 단편, 또는 상기 항체 또는 항체로부터 유래하는 항원 결합 단편과 제 2 핵산 결합 펩타이드가 접합된 계 2 핵산 결합 펩타이드 -항체 접합체일 수 있다. 상기 복합체는 중심부에 핵산이 위치하고， 상기 핵산과 정전기적으로 결합한 핵산 결합 펩타이드 (안정화 전달체로서의 제 1 핵산 결합 펩타이드 및 항체에 결합된 제 2 핵산 결합 펩타이드 포함)가 핵산을 둘러싸고， 여기에 항체가 결합된 형태의 안정한 나노입자 형태를 갖는 것일 수 있다.
상기 핵산 결합 펩타이드의 양이온성 아미노산이 분포하는 부위는 핵산과 정전기적 인력에 의하여 결합이 가능하며, 하나 이상의 핵산 결합 펩타이드가 핵산과 결합하여 핵산을 둘러싸는 형태의 나노입자 형태의 복합체를 형성할 수 있다. 이 때， 항체는 상기 핵산 결합 펩타이드와 결합하거나， 항체에 연결된 제 2 핵산 결합 펩타이드 (항체가 제 2 핵산 결합 펩타이드 -항체 접합체 형태인 경우)를 통하여 핵산과 결합할 수 있다 (도 1 참조) .
상기 핵산은 단일가닥 또는 이중가닥 DNA, RNA, 소간섭 RNA (siRNA) , 안티센스 -을리고뉴클레오타이드， shRNA, 마이크로 RNA (miR As) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 핵산 복합체는 균일하고 안정한 나노입자 형태일 수 있다. 예컨대， 상기 나노입자는 평균 입경이 lOOnm 이하， 예컨대， 10 내지 lOOnm 또는 50nm 내지 lOOnm인 것일 수 있다.
핵산 전달 효율을 고려할 때， 상기 핵산 전달용 조성물에 의하여 전달 가능한 핵산의 양， 또는 상기 핵산 복합체 내의 핵산의 함량은 핵산 전달용 조성물 (표적화 전달체+안정화전달체) 1몰에 대하여 핵산 0.1 내지 1몰， 예컨대, 0.1 내지 0.5몰일 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이， 핵산 전달 조성물 내의 표적화 전달체 (항체 또는 제 2 핵산 결합 단백질 -항체 접합체)와 안정화 전달체 (핵산 결합 단백질) 간의 함량비는 몰비로 1 : 9 내지 3:7(표적화 전달체 몰:안정화 전달체 몰)일 수 있다.
또 다른 예는 상기 핵산 복합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 핵산 전달 방법을 제공한다.
상기 환자는 인간， 원숭이 등의 영장류， 래트， 마우스， 등의 설치류 등의 포유 동물 또는 상기 동물로부터 유래하는 (분리된) 세포， 조직， 또는 이의 배양물일 수 있으며， 상기 복합체에 포함된 핵산의 전달을 필요로 하는 동물 또는 이로부터 유래하는 세포 또는 조직일 수 있다. 상기 핵산 전달 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 상기 핵산의 전달을 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 핵산 복합체는 상기 핵산 투여를 필요로 하는 환자에게 경구 또는 비경구 적으로 투여되거나, 상기 세포 또는 조직에 처리될 수 있다. 상기 핵산 복합체는 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며， 상기 담체는 핵산을 포함하는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서， 락토스， 덱스트로스, 수크로스， 솔비를， 만니를, 전분, 아카시아 고무， 인산 칼슴， 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슴， 미세결정성 셀를로스, 폴리비닐피를리돈， 셀를로스， 물, 시럽， 메틸 셀를로스， 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트 , 활석， 스테아르산 마그네슘， 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 회석제， 부형제， 윤활제， 습윤제， 감미제， 향미제， 유화제, 현탁제， 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 핵산 복합체의 투여는 경구 또는 비경구 경로를 통할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입， 피하 주입, 근육 주입， 복강 주입， 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여， 폐내 투여 및 직장내 투여 둥으로 투여할 수 있다. 경구 투여시， 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도톡 제형화 되어야 한다.
또한 상기 핵산 복합체는 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제， 분말제， 과립제， 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며， 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
【유리한 효과】
본 발명은 매우 효과적으로 핵산 (예컨대， siRNA)와 결합하여 안정적 복합체를 형성하고， 특정세포 특이적 전달이 가능한, 새로운 핵산 전달 시스템을 제공하며, 이를 통하여 임상적으로 응용이 가능한 새로운 핵산 표적 전달이 가능하다.
본 발명의 개략적 효과는 다음과 같다.
- 핵산의 표적 전달: 표적화 전달체를 통해 특정세포에만 전달 및 기능 발휘
- 핵산 복합체 안정화: 안정화 전달체를 통해 핵산과의 안정한 복합체를 형성하고 혈액 내에서 안정한 나노입자로 유지 가능
- 생물학적 활성의 시너지: 표적화 전달체가 단순 표적성이 아닌 항체 고유의 생물학적 효능을 보유하므로， 핵산의 치료 효과와 함께 항체 고유의 효과와의 상승 작용 발생 가능.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 일 실시예에 따론 핵산 전달체의 개략도이다.
도 2는 일 실시예에 다른 핵산 결합 펩타이드가 도입된 항체 접합체의 제조 과정올 모식적으로 보여주는 그림이다.
도 3은 일 실시예에 따른 핵산 결합 펩타이드가 도입된 항체 접합체 정제 후 크기 배재 크로마토그래피 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 페길레이션 (PEGylat ion) 도입 전 후의 핵산 결합 펩타이드와 소간섭 리보핵산 (s iRNA) 복합체의 NaCl 농도별 나노 입자 (nano part i cle) 거동 변화를 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 5는 일 실시예에 따른 핵산 결합 펩타이드 (R3W)가 도입된 ant i-
HER2 scFvFc 항체 접합체와 R3而 -PEG의 1 : 9 (몰비) 흔합 전달체와 형광 s iRNA 복합체의 세포 특이적 전달 효능 평가 결과를 보여주는 그래프이다 ( R3W=RRRWR RWRRRW RWRRRWRRRW (서열번호 6 )，
R3WW=RRR WRRRWWRRRWWRRRWWRRRWWR RWW (서열번호 4)， PEG=polyethylene glycol (Mw = 2000) .
도 6은 핵산 결합 펩타이드 (R3WW)6-PEG의 제조 과정을 개략적으로 보여주는 개략도이다.
도 7은 HPLC를 이용한 (R3WW)6— PEG의 분리 및 정제 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8은 PEG와 (R3WW)6 펩타이드의 몰수를 다양하게 변화시키면서 시험한 생성물 수준을 보여주는 그래프이다.
도 9는 항 -Her2 scFVFc에 대한 이온교환 컬럼 수행 결과를 보여주는 그래프이다.
도 10은 (R3WW)6-PEG-scFVFc 접합체 [(R3 06-conj-scFvFc]의 분리 및 정제 과정을 보여준다.
도 11은 scFvFc 및 (R3WW)6-PEG-scFvFc 접합체의 HER2 항원에 대한 친화도 측정 결과를 보여준다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. [실시예 1] 핵산 결합 펩타이드 [(R3WW)6-PEG]의 제조
다음의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제조하였다:
RRRWWRRRWWRRRWWRRRWWRRRWWR RWW (서열번호 4)
[이하, '(R3WWV 또는 'R3WW'].
알데하이드기로 관능화된 PEG(MW 2000) (Aldehyde— functi onali zed PEG; ALD-PEG-ALD)를 이용한 환원성 아민 생성 반응 (reductive amination)을 통하여， 상기 합성된 펩타이드 [(R3WW)6]에 PEGCMW 2000)를 접합 (conjugation)시켰다. 구체적으로 DMSCXDimethyl sulfoxide)에 lOmol/ml 농도로 녹인 ALD-PEG—ALD (MW 2000)와 상기 합성된 (R3WW)6 펩타이드를 1 내지 5의 몰비 (PEG/(R3丽) 6 펩타이드)로 흔합하여 상온에서 3시간 반웅시킨 뒤， 고성능액체크로마토그래피 (HPLC)로 정제하여 페길레이션된 핵산 결합 펩타이드 [(R3WW)6-PEG-ALD]를 얻었다 (도 6 참조). 상기 얻어진 HPLC 결과를 도 7에 나타내었다 (이동상: ¾0 + 0. l (v/v) TFACtrif luoroacetic acid)/ACN(acetonitri le)+0.1%(v/v) TFA; JO IOnSA GN)IIW33¾Sd d1IAA5d3Hd 50)IV}1S 11)13 IdVd V)INSA Λ3 )ΝΈ\ aDHTAITASA AHAISNAb33 Hd¾I¾VNHA3
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상기 동물세포 배양 과정은 다음과 같이 수행하였다. Freestyle™ 293ᅳ F 세포 (suspension human embryonal kidney eel Is , Cat . no . R790-07； Invi togen; 이하 ' HEK293F ' )를 1.0X106 cel l s/ml의 농도로 1L 삼각 플라스크에서 370C 및 C02 8%의 배양 조건 하에서 12일 동안 배양하였다. 상기 pCEP4 백터에 클로닝한 DNA(1.250mg)를 Freestyle MAX 시약 (Promega)을 이용하여 상기 HEK293F 세포에 트랜스덱션시켰다. 상기 트랜스펙션된 세포를 ·2주 동안 배양하였으며， 3~4일에 한 번씩 단백질이 > 발현된 배지를 수거하고 새 배지로 교체하며 배양을 진행하였다 (배지: Gibco FreeStyle™ 293 Expression Medium; Invi trogen) .
친화 크로마토그래피와 (aff f ini ty chromatography, protein A column) 이온교환 크로마토그래피 '과정을 통하여 최종적으로 단백질 (scFvFc)올 분리하였다. 구체적으로, FPLC(Fast protein l iquid chromatography)를 이용하여 세포 배양액으로부터 단백질을 정제하였다. FPLC조건은 아래의 표 1과 같이 하여 정제를 진행하였다.
【표 1】
Figure imgf000020_0001
A 버퍼 : 20mM Tr is (pH8.5)+15% 글리세를
I EX ( Ionic B 버퍼 : 20mM Tris (PH8.5)+15% 글리세롤 + 1M NaCl
Exchange) → B 5-15% gradient
컬럼 Length： 80ml
(source 15Q f low rate: 4ml /min
column; GE fract ion size : 10ml
Healthcare) inject ion volume : 5ml
column: source 15Q 농축 후 최종 20mM 소듐 PBS (pH6.0)+15%글리세를
버퍼 Cent r icon 농죽
프로테인 A 컬럼으로 1차 정제 후， 탈염 컬럼을 사용하여 NaCl이 없는 버퍼로 교체한 뒤， 마지막에 이온교환 ( Ionic Exchange； IEX) 컬럼을 통해 피크 분획 (peak fract ion)올 수집하였다. 이온교환 컬럼은 GE Healthcare의 source 15Q resin을 사용하여 만든 컬럼을 사용하였으며, A 버퍼로 단백질을 컬럼에 로딩한 뒤에 B 버퍼를 5-15% 구배로 홀려주어서 불순물과 항 -Her2 scFvFc를 분리 하였다. 상기 분리된 최종 단백질 (항 _Her2 scFvFc)은 20mM 소듐 PBS (pH6.0)+15%(v/v) 글리세를 버퍼로 lnig/ml의 농도로 농축하여 실험에 사용하고 40C에 보관하였다. 발현된 단백질은 평균 배양 배지 1L당 8mg의 수득량을 보였다.
상기 항 -HER2 scFvFc에 대한 이온교환 컬럼 수행 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타난 바와 같이， B 버퍼의 5~15% 구배를 7.5분으로 주었올 때가 항 -HER2 scFvFc가 불순물과 분리가 완전히 되는 가장 최적의 조건임을 확인할 수 있었다.
2.2. 핵산 결합 펩타이드와 항 -Her2 scFvFc와의 접합체 [ (R3WW)6- scFvFc] 제조
상기 분리 정제된 항 -Her2 scFvFc의 N 말단에 상기 실시예 1에서 제작된 페길레이션 (PEGylat ion)된 핵산 결합 펩타이드 [(R3而 )6-PEGᅳ ALD]를 접합하고， 하나의 scFvFc에 하나의 (R3WW)6-PEG-ALD가 도입된 접합체만 친화 크로마토그래피와 이은교환 크로마토그래피 과정을 통해 정제하였다 (도 2 참조) . 구체적으로， 상기 분리 정제된 항 -Her2 scFvFc 10 마이크로 몰 (uM) )몰과 실시예 1에서 제작된 (R3WW)6-PEG-ALD (25 내지 100 마이크로 몰 (uM) )몰을 흔합하여 40C에서 2일동안 반응시켜， 화학적으로 커플링된 접합체 [ (R3WW)6-PEG-scFvFc]를 제작하였다. 이때 (R3W)6-PEG-ALD가 scFVFc의 N-말단의 아민기와 반웅하여 접합된다. 상기 반웅 후， Protein A 칼럼 분리를 통해 미반웅 펩타이드를 제거하고， 이온교환 크로마토그래피 (source 15S column; B gradient 0-100%, A buf fer : 20mM Tr i s (pH8.5)+15% glycerol /B buf fer : 20mM Tr i s (pH8.5)+15% glycerol+4M NaCl )를 이용하여 최종적으로 미반웅 항체 및 부반웅물을 제거하였다. (도 2 및 도 10 참조) .
상기 이온교환 크로마토그래피 (source 15S column)를 이용한 분석 결과를 도 3에 나타내었다. 핵산 결합 펩타이드의 아미노산 서열을 다음과 같이 한 것을 제외하고， 상기와 동일한 방법으로 접합체를 제작하고， 상기 제작된 접합체에 대하여 상기한 방법으로 수행한 이온교환 크로마토그래피 분석 결과도 도 3에 함께 나타내었다:
9Rd : RRRRRRRRR-GPG-RRRRRRRRR (서열번호 5: 도 3에 표시된 scFvFc- 9Rd 접합체의 핵산 결합 펩타이드) ,，
(R3W)6 : R RWRRRWRRRWRRRWRRRWRRRW (서열번호 6 : 도 3에 표시된 scFvFc-R3W 접합체의 핵산 결합 펩타이드) .
(도 3과 관련하여, 접합체의 간략한 표현을 위하여 PEG를 생략하여 표시함)
도 3에서 확인되는 바와 같이, 양이온성 아미노산 R(Arg)를 갖는 핵산 결합 펩타이드가 접합된 scFvFc [9Rd-scFvFc 접합체， (R3W)6-scFvFc 접합체， 또는 (R3WW)6-scFvFc 접합체]는 scFvFc (실시예 2. 1)보다 양이온을 더 가지고 있기 때문에 양이온교환 수지에 결합을 더 잘하여 더 높은 염 농도에서 용출되므로， product peak가 더 뒤쪽에 나타났으며， 이 중에서도 (R3而 )6 scFvFc 접합체의 product peak가 가장 뒤쪽에 나타났다. 상기 결과로부터 9Rd-scFVFc 접합체， (R3W)6-scFvFc 접합체， 및 (R3WW)6-scFvFc 접합체， 특히 (R3W)6-scFvFc 접합체 및 (R3WW)6-scFvFc 접합체가 성공적으로 얻어짐을 확인 할 수 있다.
2.3. (R3WW)6-PEG-scFvFc 접합체의 HER2 친화도측정
인간 Fc 결합 항체 (Human Fc binding antibody; R&D system)가 고정화된 CM5 chip (10000 RU i睡 obi 1 izat ; GE healthcare)에 상기 준비된 scFvFc (실시예 2.1)， (R3WW)6-PEG-scFvFc 접합체 (실시예 2.2)를 고정 (~150 RU capture)한 후， 농도별 HER2 (HER2 농도: 0 ~ 100 nM; Sino Biological Inc.)의 assoc i t i on/di ssoc i at i on# 관찰하고 이를 통한 KD value를 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 11에 나타내었다 (KD values: scFvFc = 0.582 nM, (R3WW)6-conj-scFvFc = 0.561 nM) . 도 11에 나타난 바와 같이 , 항 -Her2 scFvFc의 Her2에 대한 친화도를 측정한 결과， conjugation 전후에 특정 항원 (Her2)에 대한 affinity의 변화가 거의 없음을 확인하였다.
[실시예 3] 페길레이션 (PEGylation) 도입 후 핵산 결합 펩타이드와 소간섭 리보핵산 (siRNA) 복합체의 입자 안정성 향상 평가
안정화 전달체 역할을 하는 페길레이션 (PEGylation)된 핵산 결합 펩타이드와 소간섭 리보핵산 (siRNA) 복합체의 NaCl 용액 내 입자 안정성 향상을 나노입자 거동을 통해 확인하였다.
상기 실시예 1에서 준비된 (R3WW)6 펩타이드와 siRNA를 몰비 1:5로 흔합하고 상온에서 30분동안 인큐베이션하여 복합체를 형성하였다. 그 후, 각각 다른 농도 (0， 75, 150， 300 nM)의 NaCl 용액에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이때 생성되는 복합체 나노입자의 크기를 DLS (Dynamic light scattering) 장비로 측정하였다.
상기 사용된 siRNA의 서열은 다음과 같다:
센스서열: 5' -CCU ACG CCA CCA AUU UCG U(dTdT)-3' (서열번호 2-dTdT) 안티센스 서열: 5' -ACG AAA UUG GUG GCG UAG G (dTdT )-3' (서열번호
3-dTdT) 상기 얻어진 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 페길레이션 도입. 전의 핵산 결합 펩타이드와 siRNA의 복합체는 NaCl 농도가 높아질수록 나노입자 크기가 커지는 aggregat ion 현상이 관찰되어 NaCl 농도가 혈액내 전해질 농도 (150 mM) 보다 낮은 75 mM에서 이미 aggregat ion되어 크기가 수 μ ιτι의 큰 입자로 변하는 반면， 페길레이션된 펩타이드와 siRNA의 복합체는 300 mM의 NaCl 용액에서도 안정적으로 lOOnm 이하의 균일한 나노 입자를 유지하고 있음을 확인할 수 있다.
[실시예 4] 세포 특이적 전달 효능 평가
(R3WW)6-PEG-scFvFc 접합체 (표적화 전달체)와 (R3WW)6-PEG (안정화 전달체)를 흔합한 핵산 전달체의 siRNA 세포내 전달 효율을 siRNA를 이용하여 FACS (Fluorescence-act ivated cel l sort ing) 분석 방법으로 평가하였다.
구체적으로， 평가 전날， SK-BR— 3 (HER2 posit ive 세포; ATCC, accession number HTB-30) , 및 MCF7(HER2 negat ive 세포; ATCC, accession number： HTB-22)를 각각 2 X 105cel Is/wel l의 농도로 12 웰 -플레이트에 시딩하였다. (R3WW)6-PEG-scFvFc 접합체 (표적화 전달체; 실시예 2.2)와 (R3WW)6-PEG (안정화 전달체; 실시예 1)가 몰비 기준으로 1 :9 (표적화 전달체 몰:안정화 전달체 몰)의 흔합비로 혼합된 핵산 전달체와 FITC-siRNA의 복합체를 제작하여 시험에 사용하였다.
상기 FITC-siRNA는 실시예 3에 사용된 서열번호 2 및 3의 siRNA의 51 말단에 FITC (Fluorescein i sothiocyanate)를 표지하여 준비하였다. (R3WW)6-PEG-scFvFc 접합체 (실시예 2.2)를 상기 준비된 FITC-siRNA와 1 : 1 (접합체 몰: FITC siRNA 몰)의 몰비로 흔합하여 실온에서 30분 동안 복합체화 (complexat ion) 한 뒤， (R3WW)6-PEG 펩타이드를 상기 PEG— scFvFc 접합체와의 몰비가 1 :9 (표적화 전달체 몰:안정화 전달체 몰)이 되도록 가하고 실온에서 30분 더 복합체화하여 복합체를 제작하였다.
상기 얻어진 복합체를 앞서 준비한 세포 (SK-BR-3 및 MCF7)에 각각 처리하였다 (복합체 처리 농도: siRNA 농도 기준으로 20 nM 또는 ΙΟΟηΜ) . 상기 세포를 37°C에서 4시간 인큐베이션한 후, 트립신으로 harvest하고， 세포 내로 internal izat ion되지 않고 세포 표면에 남은 복합체를 제거하기 위해서 PBS/0.3%(v/v) BSA (PH 3.8)로 세포를 세척하였다. 최종적으로 얻어진 PBS 상의 세포 용액으로 FACS 분석을 진행하였다 (BD FACS Cant oi l 장비 사용) .
상기 얻어진 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 핵산 전달 시스템 (복합체)올 통해 HER2 과발현 세포 (SK-BR-3)에만 특이적으로 s iRNA가 세포 내로 다량 도입됨이 확인되었다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
양이온성 아미노산과 소수성 아미노산을 포함하는 제 1 핵산 결합 펩타이드 및 항체를 포함하는 핵산 전달용 조성물.
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 항체는 세포 표면에 발현하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 항체로부터 유래하는 scFV, scFvFc , (scFv)2 , Fab , Fab' 및 F(ab' )2로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원 결합 단편인， 핵산 전달용 조성물.
【청구항 3】
겨 12항에 있어서, 상기 항체는 양이온성 아미노산과 소수성 아미노산을 포함하는 제 2 핵산 결합 펩타이드와 연결된 핵산 결합 펩타이드 -항체 접합체 형태인， 핵산 전달용 조성물.
【청구항 4】
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 제 1 핵산 결합 펩타이드 또는 제 2 핵산 결합 펩타이드는 각각 독립적으로 다음의 화학식 1로 표현되,는 펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 것인， 핵산 전달용 조성물:
[화학식 1]
Figure imgf000026_0001
상기 식 중
X는 양이온성 아미노산이고，
Z는 벤젠고리를 포함하는 소수성 아미노산이고
n은 단위체의 개수로서 1 내지 20의 정수이고，
' ρΐ , ρ2...ρη'에서 ρ는 해당 단위체에 포함된 양이온성 아미노산의 개수로서 1 내지 10의 정수이고，
' ql , q2...qn'에서 q는 해당 단위체에 포함된 벤젠고리를 포함하는 소수성 아미노산의 개수로서 1 내지 10의 정수이고， 상기 pi , ρ2·..ρη과 ql , Q2.„qn은 각 단위체마다 서로 같거나 상이한 수치이며，
총 아미노산 길이는 2 내지 100개이고，
X가 2개 이상 존재하는 경우 서로 같거나 상이한 아미노산이고，
Z가 2개 이상 존재하는 경우 서로 같거나 상이한 아미노산이다.
【청구항 5】
제 4항에 있어서， 상기 양이온성 아미노산은 아르기닌， 라이신 및 히스티 ¾으로 이루어진 군에서 선택되며， 상기 벤젠 고리를 포함하는 소수성 아미노산은 트립토판， 타이로신 및 페닐알라닌으로 이루어진 군에서 선택되는 것인， 핵산 전달용 조성물.
【청구항 6]
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 제 1 핵산 결합 펩타이드 또는 상기 제 2 핵산 결합 펩타이드는 PEG(polyethyleneglycol )을 추가로 포함하는 것인， 핵산 전달용 조성물.
【청구항 7】
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 항체 또는 제 2 핵산 결합 단백질 -항체 접합체와 제 1 핵산 결합 펩타이드와의 흔합비가 몰비로 1 : 9 내지 3 : 7(항체 또는 제 2 핵산 결합 단백질ᅳ항체 접합체 몰: 제 1 핵산 결합 펩타이드 몰)인， 핵산 전달용 조성물.
【청구항 8】
, 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 핵산 전달용 조성물 및 핵산을 포함하고，
상기 핵산은 상기 핵산 전달용 조성물 내의 제 1 핵산 결합 펩타이드 또는 제 2 핵산 결합 팹타이드의 양이은성 아미노산과 정전기적으로 결합하는，
핵산 복합체 .
【청구항 9】
제 8항에 있어서 , 상기 제 1 핵산 결합.펩타이드 또는 제 2 핵산 결합 펩타이드는 PEG을 추가로 포함하는 것인， 핵산 복합체.
【청구항 10]
게 8항에 있어서， 상기 핵산 전달용 조성물 내의 항체 또는 제 2 핵산 결합 단백질 -항체 접합체와 제 1 핵산 결합 펩타이드와의 흔합비가 몰비로 1 : 9 내지 3 :7(항체 또는 제 2 핵산 결합 단백질 -항체 접합체 몰: 제 1 핵산 결합 펩타이드 몰)인， 핵산 복합체 . ■
【청구항 11】
제 8항에 있어서， 상기 핵산 전달용 조성물 1몰에 대하여 핵산 0.1 내지 1몰을 포함하는， 핵산 복합체.
【청구항 12】
제 8항의 핵산 복합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는， 핵산 전달 방법 .
【청구항 13】
제 12항에 있어서， 상기 핵산 복합체 내의 제 1 핵산 결합 펩타이드 또는 제 2 핵산 결합 펩타이드는 PEG을 추가로 포함하는 것인， 핵산 전달 방법.
【청구항 14]
제 12항에 있어서, 상기 핵산 복합체는 핵산 전달용 조성물 내의 항체 또는 제 2 핵산 결합 단백질 -항체 접합체와 제 1 핵산 결합 펩타이드와의 흔합비가 몰비로 1 :9 내지 3 :7(항체 또는 제 2 핵산 결합 단백질 -항체 접합체 몰: 제 1 핵산 결합 펩타이드 몰)인 것인, 핵산 전달 방법.
【청구항 15]
' 제 12항에 있어서, 상기 핵산 복합체는 핵산 전딜1용 조성물 1몰에 대하여 핵산 0.1 내지 1몰을 포함하는 것인, 핵산 전달 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110305217A (zh) * 2018-03-27 2019-10-08 广州爱思迈生物医药科技有限公司 双特异性抗体及其应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101882133B1 (ko) * 2017-02-21 2018-07-25 성균관대학교산학협력단 핵산과 결합 가능한 펩타이드를 이용하여 핵산을 분리하는 방법
WO2023286766A1 (ja) * 2021-07-13 2023-01-19 浩志 貴田 抗体と遺伝子に結合能を有するポリペプチド

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100050438A (ko) * 2007-01-26 2010-05-13 한양대학교 산학협력단 ｓｉＲＮＡ의 타겟된 운반
KR20110002794A (ko) * 2009-07-02 2011-01-10 한양대학교 산학협력단 아르기닌―기제 양친성 펩티드 마이셀

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100050438A (ko) * 2007-01-26 2010-05-13 한양대학교 산학협력단 ｓｉＲＮＡ의 타겟된 운반
KR20110002794A (ko) * 2009-07-02 2011-01-10 한양대학교 산학협력단 아르기닌―기제 양친성 펩티드 마이셀

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DERFUS, A. M. ET AL.: "Targeted quantum dot conjugates for siRNA delivery", BIOCONJUGATE CHEMISTRY, vol. 18, no. 5, 2007, pages 1391 - 1396, XP009137582, DOI: doi:10.1021/bc060367e *
DEROUCHEY, J. ET AL.: "Monomolecular assembly of siRNA and poly (ethylene glycol)- peptide copolymers", BIOMACROMOLECULES, vol. 9, no. 2, 2008, pages 724 - 732, XP009106452, DOI: doi:10.1021/bm7011482 *
FELBER, A. E. ET AL.: "siRNA nanocarriers based on methacrylic acid copolymers", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, vol. 152, no. 1, 2011, pages 159 - 167, XP028226336, DOI: doi:10.1016/j.jconrel.2010.12.012 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110305217A (zh) * 2018-03-27 2019-10-08 广州爱思迈生物医药科技有限公司 双特异性抗体及其应用
EP3733713A4 (en) * 2018-03-27 2021-05-26 Excelmab Inc. BISPECIFIC ANTIBODIES AND ITS APPLICATIONS
CN110305217B (zh) * 2018-03-27 2022-03-29 广州爱思迈生物医药科技有限公司 双特异性抗体及其应用
US11718671B2 (en) 2018-03-27 2023-08-08 Excelmab, Inc. Bispecific antibody and uses thereof

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