CN111093718A - 治疗性纳米缀合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及纳米结构的缀合物，更具体地涉及适于将其经缀合的治疗剂选择性递送至特定细胞和组织类型的纳米结构的融合蛋白。本发明还涉及包含此类纳米结构蛋白的纳米颗粒及其治疗用途。

Description

治疗性纳米缀合物及其用途

技术领域

本发明涉及纳米结构蛋白材料领域，更具体地涉及可用于治疗的携带治疗剂的融合蛋白。

背景技术

当与游离分子相比时，以纳米缀合物形式的药物的全身给予受益于增强的药物稳定性。通过纳米级载体中的官能团的化学结合，还可以将有价值的其他性质(如细胞靶向性)合并到给定的杂化复合材料中，从而从纳米材料的高表面积/体积比中获利。当全身给予时，在肺或其他高度血管化的器官中没有聚集的情况下，所得的尺寸在约8至100nm之间的载有药物的缀合物从肾过滤中逃逸。这一事实，与材料的适当的理化性质相结合，可能会导致循环时间延长和药物对靶器官的暴露时间延长，从而增强治疗效果并为患者带来益处。

在包括金属、陶瓷、聚合物和碳纳米管的作为药物载体被研究材料的多样性中，蛋白质在生物相容性和可降解性方面提供了独特的性质，在日益增加的纳米毒理学问题的背景下，这种性质使蛋白质特别具有吸引力。随着蛋白质自组装到纳米结构材料的工程的迅速发展，对最终的几何结构和物化性质的控制变得严格，作为化学偶联药物的载体，蛋白质材料逐渐获得了功能上和结构上的多用性。

实际上，已显示：细胞毒性“有效负载”附着于抗体以形成抗体-药物缀合物(ADC)提供了通过抗体与癌症选择性细胞表面分子的特异性结合，将细胞毒性剂选择性递送至癌细胞的机制。该策略的多个实例已被证明是有效的，像吉妥单抗(gemtuzumabozogamicin)，其包括与高效力靶向DNA的抗生素——用于对抗急性髓性白血病的卡奇霉素(calicheamicin)缀合的抗CD33抗体。此外，美登木素生物碱(maytansinoids)——一种高效力微管破坏剂，作为ADC的有效负载已进行了测试，从而产生用于治疗HER2阳性乳腺癌的制剂曲妥珠单抗-美坦新偶联物(ado-trastuzumab emtansine)。

然而，就成本与合成而言，抗体的结构复杂性可能成为繁琐的障碍。发明人先前通过应用基于在核心蛋白上添加阳离子N末端结构域和C末端聚组氨酸的纳米构造原理，来探究纳米医学领域。[Serna,N.等人2016.Nanomedicine,12:1241-51]在本领域中已有描述：这些末端标签和整个融合过程中产生的电荷平衡促进了单体蛋白自组装和低聚化为稳健的环形纳米颗粒，在血浆中是稳定的[Cespedes,M.V.等人2014.ACS Nano.,8:4166-4176]，并且如若具有细胞靶向肽的能力，则会具有高细胞渗透性。[Xu,Z.K.等人2015.MaterialsLetters,154:140-3]这些蛋白质结构的构建模块(building blocks)也可以包含形式为具有模块化组织的融合延伸的功能肽，如细胞靶向剂、内吞体裂解剂(endosomolyticagents)或核定位信号。

由于当前的治疗方法仍然显示出失败的余地，主要是由于肿瘤抵抗现象，这可能例如是肿瘤内克隆选择那些对化疗最有抗性的细胞所致，因此本领域仍需开发更具特异性的治疗方法，这种方法可以靶向导致治疗失败和肿瘤进展的特定肿瘤细胞，同时减少治疗剂的副作用和脱靶作用。

发明内容

在第一方面，本发明涉及融合蛋白，其包含

(i)聚阳离子肽，

(ii)间插多肽区域，和

(iii)富含带正电荷的氨基酸的区域，

其中，间插多肽区域与至少一种治疗剂缀合。

在其他方面中，本发明涉及制备第一方面的融合蛋白的方法、涉及制备包含多拷贝的根据本发明第一方面的融合蛋白的纳米颗粒的方法、涉及包含多拷贝的本发明的融合蛋白的纳米颗粒、或通过本发明的用来制备多种纳米颗粒的方法所获得的纳米颗粒。

本发明还涉及用于医药的根据本发明的融合蛋白或纳米颗粒。

在最后方面中，本发明涉及用于治疗癌症的根据本发明的融合蛋白或纳米颗粒。

附图说明

图1.硫醇官能化的低聚-FdU的合成和理化表征。(a)用硫醇官能化的低聚-FdU的合成：利用β-氰基乙基亚磷酰胺化学(β-cyanoethylphosphoramiditechemistry)，在RNA/DNA合成仪上以1μmol规模(量级，scale)合成五聚体低聚(FdU)5-SH(低聚-FdU)。3'-硫醇改性剂——C3可控孔径玻璃(controlled pore glass)(CPG)(Link Technologies)用作合成的固体载体(support)。首先，加入六乙二醇(HEG)亚磷酰胺(Glen Research)。然后，通过重复加入二甲氧基三苯甲基(DMT)保护的5-氟-2'-脱氧尿苷亚磷酰胺单元来完成合成。组装好序列后，在室温下将寡核苷酸载体用含0.1M DTT(1,4-二硫苏糖醇)的氨水(32％)处理2小时。18将氨溶液浓缩至干燥，并在使用前将产物在用水洗脱的NAP-10(Sephadex G-25)柱上脱盐。游离低聚-FdU的合成：如前所述地，在无HEG和硫醇基团的情况下，而是使用3'-琥珀酰-FdU可控孔径玻璃作为固体载体来制备对照五聚体低聚-FdU。最后，将寡核苷酸用氨水(32％)在室温下脱保护2h。(b)低聚(FdU)5-SH的理化表征。五聚体FdU-HEG-SH的HPLC分析(条件：X-bridgeTM OST C18(10×50mm,2.5μm)；0％至40％的线性梯度20min，流速2mL/min；溶液A是0.1M水性乙酸三乙铵(TEAA)中的5％ACN，而溶液B是0.1M水性TEAA中的70％ACN。(c)五聚体FdU-HEG-SH的UV光谱。通过在260nm处的吸收来定量五聚体。(d)五聚体FdU-HEG-SH(低聚-FdU)的MS光谱(MALDI-TOF)。M经计算是1976.2，M经发现是1974.0。(e)对照五聚体FdU(游离低聚-FdU)的MS光谱(MALDI-TOF)。M经计算是1478.1，M经发现是1476.5。

图2.T22-GFP-H6-FdU纳米缀合物的理化表征和药物与纳米颗粒的比。通过MALDI-TOFF光谱来分析缀合产物。(a)T22-GFP-H6-FdU缀合产物的质谱分析法确定了携带1个低聚-FdU或2个低聚-FdU有效负载的产物、未缀合的T22-GFP-H6蛋白、和缀合偶联剂(coupler)的T22-GFP-H6的分子质量。(b)与T22-GFP-H6纳米颗粒相比，通过动态光散射测定的T22-GFP-H6-FdU尺寸。(c)通过透射电子显微镜检测的代表性T22-GFP-H6-FdU图像。(d)T22-GFP-H6-FdU自组装纳米粒子的分子模型(来源：Rueda,F.等人Adv Mater 27,7816-7822(2015)。经John Wiley&Sons许可印刷)。(e)药物/纳米颗粒之比：T22-GFP-H6和T22-GFP-H6-FdU纳米缀合物的UV光谱分析给出：平均有8分子的五聚体低聚-FdU，其对应于每个T22-GFP-H6纳米粒子总共有40个FdU分子。

图3.用于在评估转移方案的消退和防止中的抗转移作用的小鼠模型、实验设置和T22-GFP-H6-FdU剂量。(a)用于已建立的转移方案的消退中的小鼠模型：在瑞士裸鼠体内直接同位植入CXCR4⁺生物发光SW1417 CRC细胞，其在淋巴结和肺中产生转移。比例尺是1cm。(b)在盲肠植入CRC细胞后2个月(当已经存在已建立的转移时)开始以每10剂20μg q3d的剂量开始给予T22-GFP-H6-FdU，以评估纳米缀合物诱导已建立的转移的消退的能力。(c)用于防止转移方案的中的小鼠模型：CXCR4⁺生物发光SW1417细胞皮下传代，然后在NOD/SCID小鼠中同位植入分离的(disaggregated)肿瘤细胞(SC+ORT)，其在LN、肝、肺和腹膜中产生转移。(d)在盲肠植入CRC细胞后一个星期(当尚未能发展出转移时)开始以每12剂20μg q3d的剂量给予T22-GFP-H6-FdU，来评估纳米缀合物防止转移发展的能力。在两个实验中，将T22-GFP-H6-FdU的抗转移作用与通过等分子剂量的游离低聚-FdU实现的抗转移作用进行比较。在开始防止转移实验之前，我们在单独的小鼠中确认了所用的小鼠模型在治疗开始前缺少微转移或大转移。在开始消退转移实验之前，我们在单独的小鼠中确认了转移灶在治疗开始之前已经存在。比例尺是100μm。

图4.T22-GFP-H6-FdU纳米缀合物的合成和体外CXCR4⁺CRC细胞的选择性内化和杀死的证明。(a)纳米缀合物包含融合蛋白，T22-GFP-H6(在Unzueta 2012中进行了描述)——由作为CXCR4配体的肽T22、绿色荧光蛋白和组氨酸尾组成——与有效负载药物结合。(b)利用偶联剂，将名为低聚-FdU的抗肿瘤药物5-氟-2'-脱氧尿苷(FdU)的7至9个五聚体寡核苷酸(大约40个分子)与T22-GFP-H6靶向载体缀合。(c)T22-GFP-H6-FdU的化学合成：T22-GFP-H6首先通过其外部赖氨酸中的氨基与MBHS(6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)偶联剂共价结合。然后将硫醇官能化的低聚-FdU(低聚(FdU)5-SH)(参见补充图1)与用马来酰亚胺官能化的T22-GFP-H6反应(迈克尔反应)。(d)如使用流式细胞术通过荧光发射所测量的，在以1μM暴露1小时后，在CXCR4过表达(CXCR4⁺)SW1417 CRC细胞中的纳米缀合物内化。(e)在以1μM暴露24小时后，通过共聚焦显微镜显示的CXCR4⁺SW1417细胞中T22-GFP489-H6-FdU的细胞内运输(trafficking)。(f)与未缀合的游离低聚-FdU暴露相比的线性化T22-GFP-H6-FdU剂量-响应趋势线表示。在按所述浓度暴露72h后，通过MTT测量为CXCR4⁺SW1417细胞活力的抗肿瘤作用。(g)与T22-GFP-H6或游离低聚-FdU相比，通过暴露于1μM T22-GFP-H6-FdU 48h的SW1417细胞的光学显微镜图像所测定的细胞活力是降低的。比例尺是100μm。

图5.T22-GFP-H6-FdU在体外选择性内化并杀死CXCR4⁺海拉(Hela)细胞。(a)在以1μM浓度进行细胞暴露1小时后，通过流式细胞术检测为发射的荧光的T22-GFP-H6-FdU纳米缀合物或T22-GFP-H6在海拉细胞中的内化。通过用CXCR4拮抗剂ADMD3100预处理细胞而获得的完全内化阻断。(b)在以1μM暴露24小时后，通过共聚焦显微镜显示的海拉细胞中T22-GFP-H6-FdU的细胞内运输。(c)与游离低聚-FdU暴露相比的线性化T22-GFP-H6-FdU剂量-响应趋势线表示。在按所述浓度暴露72h后，通过MTT测量为海拉细胞活力的抗肿瘤作用。(d)与T22-GFP-H6或游离低聚-FdU相比，通过暴露于T22-GFP-H6-FdU纳米缀合物48h的海拉细胞的光学显微镜图像所记录的细胞活力是降低的。比例尺是100μm。

图6.体内CXCR4⁺细胞中T22-GFP-H6-FdU的选择性和受体依赖性摄取。(a)实现转移性干细胞的靶向药物递送和选择性杀死的方法：CXCR4-纳米缀合物的相互作用在原发性肿瘤和转移灶中触发CXCR4介导的MetSC的内化，然后FdU释放到细胞溶胶并扩散到核，以诱导双链断裂，导致CXCR4⁺细胞的选择性杀死。(b)如使用IVIS Spectrum 200通过荧光发射测量的，在100μg单次静脉内剂量后5小时，选择性T22-GFP-H6-FdU纳米缀合物在皮下CXCR4⁺SW1417 CRC肿瘤组织中的生物分布。生物分布类似于通过T22-GFP-H6靶向载体实现的生物分布，并且在进行缓冲液或游离低聚-FdU处理后无法检测到。(c)如通过抗GFP IHC测量的，以类似于T22-GFP-H6的水平检测肿瘤组织中T22-GFP-H6-FdU的积累。在缓冲液或游离低聚-FdU对照中不作GFP检测。(d)如荧光发射所测量的，CXCR4拮抗剂AMD3100的给予完全阻断了T22-GFP-H6-FdU肿瘤的生物分布。在缓冲液或游离低聚-FdU对照中未检测到荧光。(e)如使用抗GFP IHC H-评分所定量的，先前的AMD3100给予几乎完全阻断了在CXCR4⁺SW1417肿瘤组织中观察到的T22-GFP-H6-FdU的摄取。(f)通过抗GFP免疫染色显示的T22-GFP-H6-FdU摄取和AMD3100竞争的代表性图像，其定量被记录在图e中。比例尺是50μm。

图7.T22-GFP-H6-FdU诱导的肿瘤组织中CXCR4过表达癌细胞的消耗和剂量间隔的定义。(a)在处理之前，比较组之间(缓冲液、T22-GFP-H6-FdU、T22-GFP-H6和游离低聚-FdU)皮下肿瘤组织中相似水平的CXCR4过表达(上图)。DNA双链断裂诱导(给药后5h，用抗gH2AXIHC测量的，中图)和凋亡诱导(在第24h，Hoechst染色，下图)的代表图像。注意，与游离低聚-FdU相比，T22-GFP-H6-FdU中的DSB和凋亡诱导水平更高。白色箭头指示凋亡细胞。(b)在100μg单次剂量给予后，T22-GFP-H6-FdU消耗了SW1417 CRC肿瘤组织中的CXCR4⁺癌细胞。注意，注射后24小时，肿瘤中CXCR4⁺细胞分数(部分，fraction)减少，在第48小时它们被完全消除，以及在给予后第72小时，CXCR4⁺细胞重新出现，达到与基础水平相似的百分数，使用抗CXCR4 IHC。相比之下，在游离低聚-FdU处理后，肿瘤组织中CXCR4⁺癌细胞分数(CXCR4⁺CCF)随时间保持恒定。CXCR4⁺肿瘤细胞再出现的三天时间延时(定时，time-lapse)定义了在评估其抗转移作用的实验中纳米缀合物给予的重复剂量方案中使用的剂量间隔。比例尺是50μm。

图8.T22-GFP-H6-FdU以CXCR4依赖性方式防止转移。(a)与游离低聚-FdU相比，在防止转移实验结束时，T22-GFP-H6-FdU阻断了CXCR4⁺SW1417同位模型中生物发光淋巴结(LN)、肝和肺转移(mets)的出现。(b)如防止转移实验结束时H&E染色的组织学切片所记录的，与游离低聚-FdU相比，T22-GFP-H6-FdU通过有效力地减少肝、肺和腹膜转移的总数来防止转移。相比之下，在给予T22-GFP-H6-FdU或游离低聚-FdU后，LN转移的数量没有减少。*P<0.05，Mann-Withney检验。纳米缀合物诱导的平均病灶数减少的结果参见表1。关于按位点的转移灶尺寸的减少参见补充表1。(c)如通过抗CXCR4IHC测量的，与游离低聚-FdU相比，在实验结束时，T22-GFP-H6-FdU诱导残留在肝、肺和腹膜转移组织中的CXCR4⁺癌细胞分数(CXCR4⁺CCF)的减少更多。相比之下，在治疗后，T22-GFP-H6 FdU或游离低聚-FdU不降低残留在LN转移或原发性肿瘤组织中的CXCR4⁺CCF。(d)在治疗结束时，T22-GFP-H6-FdU或游离低聚-FdU诱导的CXCR4⁺CCF降低的代表性图像，其定量被记录在图c中。注意T22-GFP-H6-FdU诱导的CXCR4⁺CCF的降低(图c)与其在每个转移位点的抗转移作用(图b)之间的相关性。比例尺是100μm。星号：肿瘤组织；vL：淋巴管，LN：淋巴转移。

图9.T22-GFP-H6-FdU以CXCR4依赖性方式诱导已建立的转移的消退。(a)如通过生物发光发射测量的，在消退转移实验结束时，T22-GFP-H6-FdU显示对肺转移的抑制比游离低聚-FdU高，而两种化合物在CXCR4⁺SW1417同位模型中对LN转移的抑制水平相似。(b)如在H&E染色的组织切片中记录的，在消退转移实验结束时，T22-GFP-H6-FdU显示对肺转移数的减少比游离低聚-FdU更多，而两种化合物对LN转移的抑制水平相似。

图10.T22-GFP-H6-FdU对原发性肿瘤生长的抑制。(a)在78防止转移实验中，如通过体内生物发光发射测量的，在T22-GFP-H6-FdU或游离低聚-FdU处理后，与缓冲液处理的小鼠相比，未观察到原发性肿瘤生长随着实验时间的显著抑制。(b)在实验结束时对原发性肿瘤切除后，对原发性肿瘤所发射的生物发光进行的离体记录显示了T22-GFP-H6-FdU、游离低聚-FdU和缓冲液处理的小鼠中的水平也是相似的。(c)如体内生物发光发射(BLI)检测的，在已建立的转移消退实验中，T22-GFP-H6-FdU随实验时间抑制原发性肿瘤生长，至类似于游离低聚-FdU所达到的水平。与缓冲液处理的动物相比，两种化合物都显著抑制了肿瘤生长。(d)在实验结束时对原发性肿瘤切除后，对原发性肿瘤所发射的生物发光进行的离体记录显示了T22-GFP-H6-FdU小鼠与游离低聚-FdU小鼠之间的水平也是相似的。注意，与记录原发性肿瘤对T22-GFP-H6-FdU或游离低聚-FdU处理的相似反应相比，T22-GFP-H6-FdU诱导的抗转移作用尤其是在防止转移方面明显高于游离低聚-FdU处理后所观察到的抗转移作用(参见图4、补充图5、表1和补充表1)。

图11.可忽略不计的T22-GFP-H6-FdU在非肿瘤组织上的生物分布或毒性。(a)在正常组织中检测不到T22-GFP-H6-FdU发射的荧光，除了在100μg剂量后5h暂时积累在肝中(其在第24小时消失)之外。肝发射的荧光是暂时的，并且显著低于肿瘤组织中记录的荧光。肿瘤/肝比＝7.5(参见图2b中在同一实验中记录的肿瘤强度)比例尺是1cm。(b)描绘了在T22-GFP-H6-FdU或游离低聚-FdU给予后5小时，通过抗g-H2AX测量的正常骨髓中相似低水平的DNA双链断裂诱导——这是在所分析的任何其他正常组织中均不存在的作用——的代表性图像。(c)描绘了在给予100μg剂量的T22-GFP-H6-FdU或等分子554剂量的游离低聚-FdU后24h，H&E染色的组织中缺少组织病理学改变或H&E染色的CXCR4⁺(骨髓)和CXCR4-(大脑、肾、肝、肺和心脏)正常组织样品中缺少凋亡诱导的代表性图像。注意，暂时的纳米缀合物分布到肝或在骨髓中诱导的DNA损伤未对这些无肿瘤组织产生细胞毒性。(d)在转移消退实验中，随时间记录的各组之间的体重没有差异。(e)在防止转移实验中，随时间记录的各组之间的体重没有差异。比例尺是100μm。

图12.骨髓92或循环血细胞中无法检测到T22-GFP-H6-FdU积聚。(a)以10-100μg范围内的剂量给予T22-GFP-H6-FdU或给予对照等分子剂量的游离FdU(1.3-13.0nmol范围)后5小时，使用Ficoll密度梯度从血液中分离的红细胞、白细胞或血小板中缺少荧光发射。(b)在Ficoll程序后，在分离的白细胞和血小板沉淀(团块，pellets)中观察不到可被检测到的荧光发射。(c)在以(a)中所述范围的剂量单次注射T22-GFP-H6-FdU或对照游离低聚-FdU处理小鼠后5小时得到的脾或骨髓中没有荧光发射。

图13.T22-GFP-H6-FdU纳米缀合物的理化表征以及体外CXCR4⁺CRC细胞的选择性内化和杀死的证明。(A)初始的T22-GFP-H6蛋白和T22-GFP-H6-FdU缀合物的质谱分析。(B)利用反向反应的T22-GFP-H6-FdU缀合物的DLS。(C)通过MTT活力测定所分析的暴露于不同浓度的T22-GFP-H6-FdU缀合物48小时的CXCR4⁺海拉细胞的剂量-响应表示。

具体实施方式

发明人测试了通过使用融合蛋白对纳米结构蛋白进行构造的背后的原理，所述融合蛋白包括具有细胞选择性作用的聚阳离子肽和没有固有生理或生物学活性的蛋白质。后来与治疗剂缀合的融合蛋白，发明人惊奇地观察到，融合蛋白作为治疗剂的有效靶标选择性递送系统起作用。

本发明的融合蛋白

因此，在第一方面在，本发明涉及融合蛋白，其包含

(i)聚阳离子肽，

(ii)间插多肽区域，和

(iii)富含带正电荷的氨基酸的区域，

其中间插多肽区域与至少一种治疗剂缀合。

术语“融合蛋白”在本领域中是公知的，是指人工设计的单条多肽链，其包含来自不同来源的天然和/或人工的两个或更多个序列。按照定义，融合蛋白从未在自然界中发现过。

本文所用的术语“单条多肽链”是指融合蛋白的多肽组分可以端对端地缀合，也可以包括插入其间的由共价键连接的一个或多个任选的肽或多肽“连接体”或“间隔区”。

本文所用的术语“肽”或“多肽”通常是指通过肽键连接在一起的约2至40个氨基酸残基的线性链。应该理解，术语“肽键”、“肽”、“多肽”和蛋白质是本领域技术人员已知的。从这里开始，将不作区分地使用“肽”和“多肽”。

如本文所用，“氨基酸残基”是指本领域已知的任何天然存在的氨基酸、任何氨基酸衍生物或任何氨基酸模拟物。在某些实施方式中，蛋白质或肽的残基是连续的，没有任何非氨基酸中断氨基酸残基的序列。在其他实施方式中，序列可以包含一个或多个非氨基酸部分。在具体实施方式中，蛋白质或肽的残基的序列可以被一个或多个非氨基酸部分中断。

本文所用的术语“缀合物”是指由两种或更多种单独化合物的共价连接产生的任何化合物。在本发明中，缀合物是指共价偶联的间插多肽区域和至少一种治疗剂，所述偶联剂直接地或通过连接化合物来进行偶联。

术语“共价偶联”或“共价连接”是指多肽区域和至少一种治疗剂通过化学共价键彼此直接共价连接，或者另外通过一个或多个间插部分(如连接体、或桥、或间隔区、部分或多个部分)彼此间接地共价连接。

A.聚阳离子肽

本文所用的术语“聚阳离子肽”或“第一富含带正电荷的氨基酸的区域”对应于包含多个带正电荷的氨基酸的多肽序列。聚阳离子肽可以仅由带正电荷的氨基酸形成，或者可以包含其他氨基酸，前提是此区域的总净电荷在pH 7处为正。

本领域公知，氨基酸及其对应的氨基酸残基根据其侧链而具有不同的性质，并且可以根据那些性质进行分组。因此，在生理pH下，五种氨基酸显示出电荷：精氨酸、组氨酸、和赖氨酸带正电，而天冬氨酸和谷氨酸带负电。然后，本领域技术人员将认识到，本发明的聚阳离子肽对应于在生理pH条件下具有多于一个正电荷的净电荷的多肽。因此，本发明的聚阳离子肽不受存在一个或多个带负电荷的氨基酸残基的限制，只要总有足够的带正电荷的氨基酸残基产生两个或更多个净的正电荷即可。

因此，在本发明的一个实施方式中，本发明的聚阳离子肽选自：

(i)富含精氨酸的序列，

(ii)能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进融合蛋白在所述细胞上的内化的序列，

(iii)GW-H1肽，

(iv)CD44配体，

(v)能够穿过血脑屏障的肽，

(vi)细胞穿透肽，和

(vii)核仁素结合肽。

(i)富含精氨酸的序列

如上所述，精氨酸氨基酸及其残基在生理pH下呈现正电荷。应当理解，“富含精氨酸的序列”是指含有多个精氨酸残基的多肽序列。因此，多肽序列可以包含其完整序列的33％，优选40％、优选45％、优选50％、优选55％、优选60％、优选65％、优选70％、优选75％、优选80％、优选85％、更优选90％、更优选95％、甚至更优选99％、再更优选100％的氨基酸残基作为精氨酸残基。将理解的是，富含精氨酸的序列的序列无论何时包含少于100％的此序列作为精氨酸残基时，这些残基都无需相对于彼此是相邻的或连续的。

本领域技术人员将认识到，具有一个或多个精氨酸残基的多肽将是聚阳离子肽，只要此多肽在生理pH下的总正电荷为2或更高，不仅是精氨酸残基的正电荷所致，而且也是任何其他带正电荷的氨基酸所致。

在本发明的实施方式中，本发明的聚阳离子肽是富含精氨酸的序列。

在本发明的优选实施方式中，本发明的聚阳离子肽的富含精氨酸的序列选自SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

(ii)能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进融合蛋白在所述细胞上的内化的序列

本文所用的术语“能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进融合蛋白在所述细胞上的内化的序列”是指与细胞表面上的受体结合的任何多肽序列，其中所述受体响应于所述多肽序列的结合而经历胞吞作用。这种结合特异性允许多肽序列以及作为其部分的融合蛋白的其余部分递送到表达所述受体的细胞、组织或器官。以这种方式，当向动物给予或与不同类型的细胞群体进行体外接触时，包含所述多肽序列的融合蛋白将特异性导向至所述细胞。

术语“受体”表示与被称为“配体”的生物活性分子结合的细胞相关蛋白。“受体”和“配体”都是本领域技术人员通常已知的。

如本文所用，“内化”是指分子或包含分子的构建物结合至细胞膜外表面上的靶元件并且所得的复合物被细胞内化的过程。内化可以通过在细胞质内将所得的复合物进行解离来进行。然后，靶元件连同分子或构建物可定位于特定的细胞区室。优选地，本发明的聚阳离子肽，除了促进内化之外，还将促进融合蛋白的内体逃逸。

广泛的摄取受体和载体——具有甚至更广泛数量的受体特异性配体——是本领域已知的。

可以被本发明的聚阳离子靶向的受体的非限制性实例包括血管紧张素受体、蛙皮素受体、缓激肽受体、降钙素受体、趋化因子受体、胆囊收缩素受体、促肾上腺皮质激素释放因子受体、内皮素受体、麻黄素受体、甲酰基肽受体、卷曲受体(Frizzled receptor)、甘丙肽受体、生长激素促分泌素受体(饥饿激素)受体、亲吻素(Kisspeptin)受体、黑皮质素受体、神经肽FF受体/神经肽AF受体、神经肽S受体、神经肽W/神经肽B受体、神经肽Y受体、神经降压素受体、食欲肽受体、肽P518受体、生长抑素受体、速激肽受体、Toll样受体、血管加压素和催产素受体以及VEGF受体。

在本发明的优选实施方式中，包含能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进融合蛋白在所述细胞上的内化的序列的聚阳离子肽是CXCR4配体。

本文所用的术语“CXCR4”是指G蛋白偶联的七重跨膜趋化因子受体。像其他趋化因子受体一样，CXCR4通过介导白细胞的定向迁移和活化，在免疫和炎性反应中起重要作用。CXCR4在各种癌细胞系和组织中表达或过表达，包括乳腺、前列腺、肺、卵巢、结肠、胰腺、肾、和大脑，以及非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。CXCR4唯一已知的配体是基质细胞衍生因子1(SDF-1，或CXCL12)。CXCR4和SDF-1之间的相互作用在肿瘤发生的多个阶段(包括肿瘤生长、侵袭、血管生成、和转移)中起重要作用。

本文所用的表述“特异性结合CXCR4”是指本发明的缀合物与CXCR4或表达CXCR4的细胞比起其与基本上不与其他分子结合的可选受体或细胞的结合，以更长的持续时间和/或更大的亲和力，更频繁、更迅速地结合的能力。

结合亲和力，例如，如Tamamura等人所述，通过油垫(oil-cushion)法来测量[参见Hesselgesset等人,1998,J.Immunol.,160:877-883]，油垫法包括使肽与CXCR4转染的细胞系(例如，CHO细胞)和标记的CXCR4配体(例如，¹²⁵I-SDF-1α)接触，并测量靶向肽对标记的CXCR4配体的结合的抑制百分数。

特异性结合可以例如通过具有至少约10^-4M的Kd的低亲和力靶向剂来展现，例如，如果CXCR4具有多于一个的配体结合位点，则具有低亲和力的配体可用于靶向。特异性结合也可以通过高亲和力配体来展现，例如具有至少约10^-7M、至少约10^-8M、至少约10^-9M、至少约10^-10M的Kd的配体，或具有的Kd可以是至少约10^-11M或10^-12M或更大。低亲和力靶向配体和高亲和力靶向配体都可用于组合到本发明的缀合物中。

在缀合物包含荧光蛋白(如GFP)的情况下，可以通过荧光法方便地确定本发明的缀合物被表达CXCR4的细胞内化的能力。这样的融合蛋白可以通过制备重组核酸来获得，其中编码T22肽的核酸和荧光蛋白在框内融合并在适当的宿主细胞有机体中表达。然后使融合蛋白与表达CXCR4的细胞的培养物接触或在体内与表达CXCR4的组织接触适当量的时间，此后可以使用荧光显微镜确定构建物是否穿透细胞。通过将由荧光蛋白产生的荧光显微镜图像与用已知细胞质染色获得的荧光显微镜图像进行比较，可以进一步研究细胞质中荧光的存在。

本文所用的表述“促进内体逃逸”是指在受体介导的内吞作用内化之后，聚阳离子肽诱导融合蛋白从内体区室释放的能力。

在本发明的更优选的实施方式中，CXCR4配体选自T22肽(SEQ ID NO：5)、V1肽(SEQID NO：6)、CXCL12肽(SEQ ID NO：7)、vCCL2肽(SEQ ID NO：8)或其功能上等同的变体。

T22肽对应于衍生自蛋白鲎抗菌肽(polyphemusin)II的肽(从来自Lymuluspolyphemus的血细胞碎片中提取)。vCCL2对应于病毒巨噬细胞炎性蛋白II——一种人疱疹病毒8编码的人趋化因子CCL2的同源物。VI肽对应于vCCL2的N末端的1-21位残基。CXCL12——C-X-C基序趋化因子12，也称为基质细胞衍生因子1(SDF1)，是趋化因子家族的成员，其起到促炎介质的作用。已知所有四种肽都与CXCR4受体具有相互作用，如Liang,X.2008.Chem.Biol.Drug.Des.72:91-110中所示的。

在一个实施方式中，靶向肽选自：

-具有序列RRX₁CYRKX₂PYRX₃CR(SEQ ID NO：9)的T140肽，其中X₁是L-3-(2-萘基)丙氨酸，X₂是D-Lys，以及X₃是L-瓜氨酸，

-具有序列RRX₁CYX₂KX₃PYRX₄CR(SEQ ID NO：10)的TN14003肽，其中X₁是L-3-(2-萘基)丙氨酸，X₂是L-瓜氨酸，X₃是dLys，以及X₄是L-瓜氨酸，

-具有序列RRX₁CYEKX₂PYRX₃CR(SEQ ID NO：11)的TC14012肽，其中X₁是L-3-(2-萘基)丙氨酸，X₂是D-瓜氨酸，以及X₃是L-瓜氨酸，

-具有序列RRX₁CYX₂KX₃PYRX₄CR(SEQ ID NO：12)的TE14011肽，其中X₁是L-3-(2-萘基)丙氨酸，X₂是L-瓜氨酸，X₃是D-Glu，以及X₄是L-瓜氨酸，和

-具有序列RRX₁CYX₂KX₃PYRX₄CR(SEQ ID NO：13)的TZ14011肽，其中X₁是L-3-(2-萘基)丙氨酸，X₂是L-瓜氨酸，X₃是D-Lys，以及X₄是L-瓜氨酸或其变体，其中N末端精氨酸残基被乙酰化(已知Ac-TZ14011)。

术语“功能变体”和“功能上等同的变体”是可互换的，并且在本文中应理解为通过一个或多个氨基酸的修饰、插入和/或缺失(前提是基本上维持与CXCR4进行结合和使融合蛋白内化的功能)，从T22、VI、CXCL12、和/或vCCL2肽衍生的所有的那些肽。

在一个实施方式中，阳离子多肽的功能上等同的变体是根据其各自的SEQ ID NO，相对于人T22、VI、CXCL12和/或vCCL2肽表现出一定程度的同一性的那些变体，所述的同一性大于至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。两个氨基酸序列之间的同一性程度可以通过常规方法来确定，例如通过现有技术中已知的标准序列比对算法，如例如[AltschulS.F.等人,J.Mol.Biol.,.1990Oct 5；215(3):403-10]。本发明的阳离子多肽可包括翻译后修饰，如糖基化、乙酰化、异戊二烯基化、豆蔻酰基化、蛋白水解加工等。

可选地，阳离子多肽的适合的功能变体是以下这些：其中一个或多个位置含有这样的氨基酸——所述氨基酸是上述T22、VI、CXCL12、和/或vCCL2肽中存在的氨基酸的保守取代。“保守氨基酸取代”是将一个氨基酸用结构和/或化学性质相似的另一个氨基酸代替所产生的。例如，以下六组各自含有彼此互为保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。这种保守氨基酸取代的选择在本领域普通技术人员的能力范围内，并且例如由Dordo等人,[J.Mol.Biol,1999,217；721-739]和Taylor等人,[J.Theor.Biol.,1986,119:205-218]描述。

用于确定给定肽是否可以视为其功能上等同的变体的适合的测定法是例如以下测定法：将推定的T22、VI、CXCL12或vCCL2肽变体与标记物多肽(例如，荧光蛋白)进行框内融合。这样的融合蛋白可以通过制备重组核酸来获得，其中将编码肽和荧光蛋白的核酸框内融合并在适当的宿主细胞或有机体中表达。然后将融合蛋白与细胞CXCR4(例如，海拉细胞)的培养物接触适当量的时间，之后可以使用荧光显微镜确定构建物是否穿透细胞。如果此肽是相应肽的功能上等同的变体，则标记物蛋白将被内化并且细胞的细胞质中荧光的存在将是可见的。此外，可以通过将由荧光蛋白产生的荧光显微镜图像与用已知细胞质染色(例如，DAPI)获得的荧光显微镜图像进行比较，来评估此功能上等同的变体的性能。

(iii)GW-H1肽

GW-H1肽先前由Chen和同事[Chen,Y-L.S.等人2012.Peptides,36:257-265]描述过。首先选择了GW-H1肽作为抗微生物肽，但其特征还在于它具有结合细胞膜、将其自身内化到细胞质中、并且迁移到真核细胞的核中的能力。一旦在细胞内，GW-H1就能够诱导细胞凋亡。已经提出：GW-H1通过折叠成两亲性螺旋而发挥其细胞溶解活性[Chen和同事，同上]。因此，此肽被认为通过两个连续事件发挥其细胞溶解作用，所述两个连续事件包括结合至细胞膜，随后透化。

在本发明的优选实施方式中，本发明的聚阳离子肽是GW-H1肽，其具有SEQ ID NO：14。

(iv)CD44配体

CD44是一种细胞表面跨膜糖蛋白，参与细胞-细胞和细胞-基质相互作用、细胞粘附和迁移。CD44与炎症和疾病诸如癌症有关[Bajorath,J.2000.Proteins.39:103-111]。已知许多同种型，它们以细胞特异性方式表达并且也被差异地糖基化。

因此，“CD44配体”将是能够结合CD44的分子。CD44是透明质酸——细胞外基质的一种组分——的主要表面受体，但它具有其他配体，如硫酸软骨素、纤连蛋白的肝素结合结构域、骨桥蛋白、丝甘蛋白(serglycin)、胶原蛋白和层粘连蛋白。此外，CD44还可以与金属蛋白酶和选择蛋白相互作用。

在本发明的实施方式中，本发明的聚阳离子肽是CD44配体。在本发明的优选实施方式中，CD44配体选自A5G27(SEQ ID NO：15)和FNI/II/V(SEQ ID NO：16)。

肽FNI/II/V对应于纤连蛋白的HBFN片段V。肽A5G27对应于层粘连蛋白的α5链的肽[Pesarrodona,M.等人.2014.Int.J.of Pharmaceutics.473:286-295]。

(v)能够穿过血脑屏障的肽

本领域公知，大脑病理学治疗方法发展的一个主要障碍是血脑屏障(BBB)。通过存在以下两种屏障系统来保护大脑免受潜在毒性物质的损害：血脑屏障(BBB)和血脑脊液屏障(BCSFB)。BBB被认为是摄取血清配体的主要途径，因为其表面积比BCSFB的表面积大大约5000倍。构成BBB的脑内皮表现为使用潜在药物对抗多种CNS病症的主要障碍。通常，只有小的亲脂性分子可以穿过血脑屏障，即，从循环系统血液到达大脑。许多具有较大尺寸或较高疏水性的药物在用于治疗CNS病症的动物研究中显示出具有前景的结果。

因此，“能够穿过血脑屏障的肽”将是能够将自身以及其结合的任何分子(优选蛋白质)，从血流运输到CNS的肽。

在1983年，据报道，一种肽——β-酪啡肽-5(β-Casomorphin-5)可以克服BBB[Ermisch,A.等人1983.J.of Neurochemistry.41:1229-1233]。从那时起，许多其他具有BBB渗透性质的肽就被鉴定、表征和分类，并在2012年建立了全面的数据库，正如Van Dorpe等人报道的[Van Dorpe,S.等人2012.Brain Struct.Funct.217:687-718]。前述数据库中列举的大多数肽都适用于本发明的融合蛋白。

在本发明的实施方式中，本发明的聚阳离子肽是能够穿过血脑屏障的肽。在本发明的优选实施方式中，能够穿过血脑屏障的肽选自Seq-1-7(SEQ ID NO：17)、Seq-1-8(SEQID NO：18)、和Angiopep-2-7(SEQ ID NO：19)。

(vi)细胞穿透肽(CPP)

术语“穿透细胞的肽”(CPP)是指长度一般约5-60个氨基酸残基的肽，其可以促进细胞摄取分子货物，特别是作为细胞的一部分的蛋白质。蛋白质可以呈现一种或多种CPP。CPP的特征还在于能够促进分子货物移动或行进跨越/穿过脂质双层、细胞膜、细胞器膜、囊泡膜、或细胞壁中的一个或多个。本文中的CPP将是聚阳离子的。

Schmidt等人[2010.FEBS Lett.584:1806-18l3]、Holm等人[2006.NatureProtocols1:1001-1005]、Yandek等人[2007.Biophys.J.92:2434-2444]、Morris等人[2001.Nat.Biotechnol.19:1173-1176]、和美国专利申请公开号2014/0068797中公开了可用于本文的CPP的实例，并在一般情况下对CPP作出了进一步的描述。CPP不依赖转运蛋白或受体，促进作为其部分的蛋白质直接穿过脂质双层进行运输，而无需任何其他细胞组分的参与。

(vii)核仁素(核仁蛋白，nucleolin)结合肽

因此，“核仁素结合肽”是这样的肽：能够结合细胞中的核仁素蛋白，优选地结合细胞表面表达的核仁素的部分。在本发明的实施方式中，本发明的聚阳离子肽是核仁素结合肽。

编号为WO 2011/031477 A2的国际专利申请公开提供了适用于本发明的融合蛋白的核仁素结合肽的许多实例。

在本发明的优选实施方式中，本发明的核仁素结合肽是序列SEQ ID NO：20的肽或序列SEQ ID NO：21的肽。

B.富含带正电荷的氨基酸的区域

本文所用的术语“带正电荷的氨基酸”或“第二富含带正电荷的氨基酸的区域”是指不同于聚阳离子区域或第一富含带正电荷的氨基酸的区域的多肽序列，其特征在于其包含多个带正电荷的氨基酸。另外，富含带正电荷的氨基酸的区域可以仅由带正电荷的氨基酸形成，或者可以包含其他氨基酸，前提是此区域在pH 7处的总净电荷为正。因此，富含带正电荷的氨基酸的区域序列可包含其完整序列的33％，优选40％、优选45％、优选50％、优选55％、优选60％、优选65％、优选70％、优选75％、优选80％、优选85％、更优选90％、更优选95％、甚至更优选99％、又更优选100％的氨基酸残基作为带正电荷的氨基酸残基。

富含带正电荷的氨基酸的区域可以仅包含一种带正电荷氨基酸，或者可以包含多于一种的带正电荷的氨基酸。在一个实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域是聚组氨酸区域。在一个实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域是聚精氨酸区域。在一个实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域是聚组氨酸区域。在一个实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域包含赖氨酸残基和精氨酸残基。在一个实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域包含赖氨酸残基和组氨酸残基。在一个实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域包含精氨酸残基和组氨酸残基。在一个实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域包含赖氨酸残基、精氨酸残基和组氨酸残基。

在一些实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、或至少15个带正电的氨基酸残基，其中带正电的氨基酸可以是组氨酸、赖氨酸、精氨酸或其组合。

在一些实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域包括少于100、少于90、少于80、少于70、少于60、少于50、少于40、少于30、少于29、少于28、少于27、少于26、少于25、少于24、少于23、少于22、少于21、少于20、少于19、少于18、少于17、少于16、少于15、少于14、少于13、少于12、少于11、少于10个或更少的带正电荷的氨基酸残基，其中带正电荷的氨基酸可以是组氨酸、赖氨酸、精氨酸或其组合。

在一些实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域包含2与50之间个氨基酸、2与40之间个氨基酸、2与30之间个氨基酸、2与25之间个氨基酸、2与20之间个氨基酸、2与10之间个氨基酸或2与8之间个氨基酸。

在一些实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域包含3与50之间个氨基酸、3与40之间个氨基酸、3与30之间个氨基酸、3与25之间个氨基酸、3与20之间个氨基酸、3与10之间个氨基酸或3与8之间个氨基酸。在一些实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域包含4与50之间个氨基酸、4与40之间个氨基酸、4与30之间个氨基酸、4与25之间个氨基酸、4与20之间个氨基酸、4与10之间个氨基酸或4与8之间个氨基酸。在一些实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域包含5与50之间个氨基酸、5与40之间个氨基酸、5与30之间个氨基酸、5与25之间个氨基酸、5与20之间个氨基酸、5与10之间个氨基酸或5与8之间个氨基酸。

在本发明的实施方式中，本发明的融合蛋白的富含带正电荷的氨基酸的区域是聚组氨酸区域。在本发明的优选实施方式中，聚组氨酸区域包含2与10之间个连续的组氨酸残基。

在本发明的实施方式中，本发明的融合蛋白的富含带正电荷的氨基酸的区域是聚精氨酸区域。在本发明的优选实施方式中，聚精氨酸区域包含2与10之间个连续的精氨酸残基。

在本发明的实施方式中，本发明的融合蛋白的富含带正电荷的氨基酸的区域是聚赖氨酸区域。在本发明的优选实施方式中，聚赖氨酸区域包含2与10之间个连续的聚赖氨酸残基。

C.融合蛋白的元件和连接元件的相对位置

本发明的融合蛋白的不同元件(聚阳离子肽、间插多肽区域、和富含带正电荷的氨基酸的区域)可以以任何相对顺序放置，前提是聚阳离子肽和富含带正电荷的氨基酸的区域在融合蛋白的任何位置上都具有功能，并且间插多肽区域仍保留全部或部分功能。

本文所用的术语多肽的“N末端”、“N端”、和“氨基末端”是没有区分的。同样，术语“C末端”、“C端”、和“羧基末端”被认为是等同的。这些术语是本领域技术人员关于蛋白质所包含的多肽链末端的氨基酸的游离部分所常用的。

因此，在本发明的实施方式中，融合蛋白的聚阳离子肽位于蛋白质的N末端，而融合蛋白的富含带正电荷的氨基酸的区域位于蛋白质的C末端。在本发明的另一实施方式中，融合蛋白的富含带正电荷的氨基酸的区域位于蛋白质的N末端，而融合蛋白的聚阳离子肽位于蛋白质的C末端。在本发明的另一实施方式中，间插多肽区域可以位于融合蛋白的C末端或N末端，而聚阳离子肽位于融合蛋白的中间位置并且富含带正电荷的氨基酸的区域位于融合蛋白的与间插多肽区域相对的末端，或者富含带正电荷的氨基酸的区域位于融合蛋白的中间位置，而聚阳离子肽位于融合蛋白的与间插多肽区域相对的末端。

因此，根据本发明的融合蛋白的元件的相对顺序可以是：

■N-聚阳离子肽-间插区域多肽-富含带正电荷的氨基酸的区域-C；

■N-富含带正电荷的氨基酸的区域-间插区域多肽-聚阳离子肽-C；

■N-聚阳离子肽-富含带正电荷的氨基酸的区域-间插区域多肽-C；

■N-富含带正电荷的氨基酸的区域-聚阳离子肽-间插区域多肽-C；

■N-间插区域多肽-聚阳离子肽-富含带正电荷的氨基酸的区域-C；或

■N-间插区域多肽-富含带正电荷的氨基酸的区域-聚阳离子肽-C

术语“N末端”和“C末端”并不意味着这些组分需要端对端地直接缀合，而是它们维持相对的位置顺序，而不管组分末端的或插入在其之间的其他元件(如连接体/间隔区)的存在。

因此，本发明的融合蛋白包含上述元件((1)聚阳离子肽，(2)间插多肽区域，和(3)富含带正电荷的氨基酸的区域)，并且这些可以端对端地缀合，而且也可以包括插入其之间，优选地通过肽键连接的一种或多种任选的肽或多肽“连接体”或“间隔区”。

根据本发明，间隔区或连接体氨基酸序列可以充当组分(1)和(2)以及(2)和(3)之间的铰链区，从而允许这些组分在维持三维形式的个体结构域的同时彼此独立地移动，使得肽间隔区或连接体的存在不改变组分(1)、(2)和(3)中的任一个的功能。在这个意义上，根据本发明的优选的中间氨基酸序列将是铰链区，其特征在于允许此运动的结构延展性。在一个具体实施方式中，所述中间氨基酸序列是柔性连接体。连接体区域的作用是在组分(1)和(2)以及(2)和(3)之间提供空间。因此确保了组分(1)、(2)或(3)的二级和三级结构不受其他任何一个的存在的影响。间隔区具有多肽性质。连接体肽优选包含至少2个氨基酸、至少3个氨基酸、至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30个氨基酸、至少40个氨基酸氨基酸、至少50个氨基酸、至少60个氨基酸、至少70个氨基酸、至少80个氨基酸、至少90个氨基酸或大约100个氨基酸。

间隔区或连接体可以通过共价键(优选通过肽键)与本发明的缀合物的两个组分侧翼(flanking)的组分结合；并且还优选地，间隔区本质上是功能缺失的、和/或不易受蛋白水解切割、和/或不包含任何半胱氨酸残基。类似地，间隔区的三维结构优选是线性的或基本线性的。

间隔区肽或连接体肽的优选实例包括那些用于结合蛋白质而基本上不使经结合的肽的功能恶化或至少基本上不使经结合的肽之一的功能恶化的肽。更优选地，用于结合肽的间隔区或连接体包含卷曲螺旋结构。

连接体肽的优选实例包括选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的2种或更多种氨基酸。柔性连接体的优选实例是聚甘氨酸连接体。连接体序列/间隔区序列的可能性实例包括SGGTSGSTSGTGST(SEQ ID NO：22)、AGSSTGSSTGPGSTT(SEQ ID NO：23)或GGSGGAP(SEQ IDNO：24)。这些序列已被用于将设计的卷曲螺旋与其他蛋白质结构域结合[Muller,K.M.,Arndt,K.M.和Alber,T.,Meth.Enzymology,2000,328:261-281]。适合的连接体的其他非限制性实例包括氨基酸序列GGGVEGGG(SEQ ID NO：25)、鼠IgG3的上铰链区的10个氨基酸残基的序列(PKPSTPPGSS，SEQ ID NO：26)，其已被用于通过卷曲螺旋来产生二聚化抗体[Pack,P.和Pluckthun,A.,1992,Biochemistry 31:1579-1584]，序列APAETKAEPMT的肽(SEQ IDNO：27)、序列GAP的肽、序列AAA的肽和序列AAALE的肽(SEQ ID NO：46)。

可选地，本发明的缀合物的组分可以通过包含蛋白酶的切割靶标的序列的肽来连接，从而允许分离任何组分。适于将其组合到本发明的多肽中的蛋白酶切割位点包括肠激酶(切割位点DDDDK，SEQ ID NO：28)、因子Xa(切割位点IEDGR，SEQ ID NO：29)、凝血酶(切割位点LVPRGS，SEQ ID NO：30)、TEV蛋白酶(切割位点ENLYFQG，SEQ ID NO：31)、PreScission蛋白酶(切割位点LEVLFQGP，SEQ ID NO：32)、内含肽等。

因此，在本发明的实施方式中，聚阳离子肽通过连接体与间插多肽区域结合。在本发明的另一实施方式中，间插多肽区域通过连接体与富含带正电荷的氨基酸的区域结合。在本发明的另一实施方式中，聚阳离子肽通过连接体与间插多肽区结合，并且间插多肽区域也通过连接体与富含带正电荷的氨基酸的区域结合。

如本领域技术人员将认识到的，将聚阳离子肽与间插多肽区域连接并将间插多肽区域与富含带正电荷的氨基酸的区域连接的连接体可以包含相同的序列或不同的序列，但存在上述限制，即连接体的存在和/或序列不导致聚阳离子肽、间插多肽区域、和/或富含带正电荷的氨基酸的区域的功能改变(例如，但不限于，由于融合蛋白的二级或三级结构修饰或二硫键的形成)。

关于融合蛋白元件从N末端到C末端的相对位置的前述考虑也适用于元件之间存在连接体的情况，而不依赖于连接体的数目或连接体放置在哪些元件之间。因此，元件的可能组合和相对顺序将如下所示(其中保留了上述元件的编号：(1)聚阳离子肽，(2)间插多肽区域，(3)富含带正电荷的氨基酸的区域)：

■N-(1)-(2)-(3)-C

■N-(1)-连接体-(2)-(3)-C

■N-(1)-(2)-连接体-(3)-C

■N-(1)-连接体-(2)-连接体-(3)-C

■N-(3)-(2)-(1)-C

■N-(3)-连接体-(2)-(1)-C

■N-(3)-(2)-连接体-(1)-C

■N-(3)-连接体-(2)-连接体-(3)-C

■N-(2)-(1)-(3)-C

■N-(2)-连接体-(1)-(3)-C

■N-(2)-(1)-连接体-(3)-C

■N-(2)-连接体-(1)-连接体-(3)-C

■N-(2)-(3)-(1)-C

■N-(2)-连接体-(3)-(1)-C

■N-(2)-(3)-连接体-(1)-C

■N-(2)-连接体-(3)-连接体-(1)-C

■N-(1)-(3)-(2)-C

■N-(1)-(3)-连接体-(2)-C

■N-(1)-连接体-(3)-(2)-C

■N-(1)-连接体-(3)-连接体-(2)-C

■N-(3)-(1)-(2)-C

■N-(3)-连接体-(1)-(2)-C

■N-(3)-(1)-连接体-(2)-C

■N-(3)-连接体-(1)-连接体-(2)-C

在本发明的优选的实施方式中，本发明的融合蛋白的连接体包含序列GGSSSRS(SEQ ID NO：33)、GGGNS序列的序列(SEQ ID NO：34)。

D.间插多肽区域

术语“间插多肽区域”和“间插区域”在本文中被认为是等同的。

本发明的融合蛋白的间插多肽区域包含生理上有功能的肽，这意味着其与细胞组分的相互作用导致生理变化。然而，一旦将其组合到本发明的融合蛋白中，间插多肽区域就不必在生理上具有功能。因此，连接根据本发明的融合蛋白的不同元件的连接体区域不被视为间插区域。因此，在优选实施方式中，间插区域包括至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70、至少80、至少90、至少100或更多个氨基酸。

在优选实施方式中，一旦将其并入本发明的融合蛋白中，间插多肽区域就是生理上有功能的肽或生理功能降低的其片段或突变体。在另一实施方式中，一旦并入本发明的融合蛋白中，间插多肽区域不具有任何生理功能。在另一优选的实施方式中，与在并入本发明的融合蛋白之前的野生型生理上有功能的多肽相比，间插多肽区域是具有已经降低的生理功能的生理上有功能的多肽的片段或突变体。更优选地，由于存在失活突变，所以间插多肽区域是当不形成本发明的融合蛋白的部分时不具有任何生理功能的蛋白质。

本发明的融合蛋白的间插多肽区域是与治疗剂结合的蛋白质。

本文中关于治疗剂所用的术语“治疗性的”以上位含义使用，并且包括治疗剂、预防剂和替代剂。

因为间插区域是本发明的具有聚阳离子肽和富含带正电荷的氨基酸的区域的融合蛋白的部分，所以除涉及治疗剂外，间插区域的性质基本上是多肽性的。意图使缀合至融合蛋白的治疗剂在其化学结构上不受限制。

在本发明的实施方式中，融合蛋白的间插区域选自荧光蛋白、白蛋白、巢蛋白、绒膜促性腺激素、和半胱氨酸蛋白酶抑制剂。

本文所用的“荧光蛋白”涉及其原子结构允许其呈现荧光(这是本领域公知的现象)的蛋白质。适用于本发明的融合蛋白的常用荧光蛋白的非限制性实例是绿色荧光蛋白(GFP，首先在维多利亚多管水母(Aequorea victoria)中发现)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、青色荧光蛋白、或任何其他变体，其实例可以在Kremers等人的[Kremers,G-J-等人2011.J.Cell Sci.124:157-160]中找到。

适用于本发明的融合蛋白的荧光蛋白的其他非限制性实例是增强的绿色荧光蛋白(eGFP)、增强的青色荧光蛋白CFP(ECFP)、增强的YFP(EYFP)、GFPS65T、Emerald、Topaz(TYFP)、Venus、柠檬黄(Citrine)、mCitrine、GFPuv、去稳定的EGFP(dEGFP)、去稳定的ECFP(dECFP)、去稳定的EYFP(dEYFP)、mCFPm、蔚蓝(Cerulean)、T-宝石蓝(Sapphire)、CyPet、YPet、mKO、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、DsRed-单体、J-Red、二聚体2、t-二聚体2(12)、mRFP1、杯形珊瑚素(pocilloporin)、Renilla GFP、Monster GFP、paGFP、Kaede蛋白和点燃蛋白(kindling protein)、藻胆蛋白和藻胆蛋白缀合物(包括B-藻红蛋白、R-藻红蛋白和别藻蓝蛋白)。在其他实施方式中、间插多肽是选自mHoneydew、mBanana、mOrange、dTomato、tdTomato、橘色(mTangerine)、草莓(mStrawberry)、mCherry、mGrapel、树莓(mRaspberry)、mGrape2、紫红色(mPlum)的荧光蛋白[Shaner等人(2005)Nat.Methods 2:905-909]等。

在优选实施方式中，本发明的融合蛋白的间插区域的荧光蛋白是GFP(SEQ ID NO：35)。

本文所用的“白蛋白”是指通常在动物(尤其是哺乳动物)的血浆中发现的水溶性非糖基化的球状蛋白质。在优选实施方式中，融合蛋白的间插区域的蛋白质是白蛋白，更优选地是人白蛋白(SEQ ID NO：36)。

本文所用的“巢蛋白”涉及巢蛋白家族的任何蛋白质，以前被称为动蛋白，是位于基底层中的硫酸化的单体糖蛋白。

在本发明的更优选的实施方式中，融合蛋白的间插区域的蛋白质选自人巢蛋白1(NIDI，SEQ ID NO：37)和人巢蛋白2(NID2，SEQ ID NO：38)。

本文所用的“绒膜促性腺激素”(GC)是指受精卵植入后在哺乳动物胎盘中产生的糖蛋白和激素。人绒膜促性腺激素具有两个亚单元，alpha(α)和beta(β)。意图使两个亚单元中的任一个单独地和两者一起都适用于本发明的目的。

因此，在本发明的另一实施方式中，融合蛋白的间插区域的蛋白质是绒膜促性腺激素。

在本发明的另一优选实施方式中，融合蛋白的间插区域的蛋白质是人绒膜促性腺激素(hGC，SEQ ID NO：39)。

如本文所用的，术语半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)是指被称为半胱氨酸蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制剂家族的成员，其能够抑制属于肽酶家族C1(木瓜蛋白酶家族)和C13(天冬酰胺内肽酶家族)的肽酶的活性。在优选实施方式中，半胱氨酸蛋白酶抑制剂选自半胱氨酸蛋白酶抑制剂A、半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、半胱氨酸蛋白酶抑制剂D和半胱氨酸蛋白酶抑制剂M。在又一个优选实施方式中，半胱氨酸蛋白酶抑制剂是半胱氨酸蛋白酶抑制剂A，也称为StefinA。在优选实施方式中，Stefin A是人源的，具有序列SEQ ID NO：40。在又另一实施方式中，半胱氨酸蛋白酶抑制剂是具有选自G4W、G4R、V48D、V48L、G50S、K71N、S72G、L73P、L82R、T83S突变的一个或多个突变的stefinA变体。在其他实施方式中，stefin A变体相对于SEQ ID NO：40所示的序列含有以下突变：

-G4W、V48D、K71N、S72G和L73P，对应于Woodward等人的(J.Mol.Biol.(2005)352,1118–1133)和Hoffman等人的(Protein Engineering,Design&Selection vol.23 no.5pp.403–413,2010)中定义为STM突变体的突变体。

-G4R、V48L、G50S、K71N、S72G、L73P、L82R和T83S，对应于Hoffman等人(同上)的文章中定义为SQM突变体的突变体。

-G4R，对应于Hoffman等人(同上)的文章中定义为SUN突变体的突变体。

-V48L和G50S，对应于Hoffman等人(同上)的文章中定义为SUM突变体的突变体。

K71N、S72G、L73P、L82R和T83S，对应于在Hoffman等人(同上)的文章中定义为SUC突变体的突变体。

-V48L、G50S、K71N、S72G、L73P、L82R和T83S，对应于在Hoffman等人(同上)的文章中定义为SDM突变体的突变体。

可以用作间插区域的组分的其他适合的多肽和蛋白质包括本身没有任何生理或生物学活性的任何多肽或蛋白质，以及任何在生物学上不具反应性的肽或蛋白质。

在本发明的另一实施方式中，融合蛋白的间插区域的蛋白质是惰性蛋白。

如本文所用的，“惰性蛋白”是指没有已知的生理或生物学活性，或没有与其他大分子特异性相互作用以实现生物学功能的能力的多肽或蛋白质或蛋白质的片段或结构域，以及缺少已知的治疗活性(例如，抗肿瘤活性)的蛋白质的片段或结构域。作为融合蛋白的部分的惰性蛋白是非反应性的，并且起到用于结合治疗剂的物理结构的作用。意图使惰性蛋白不包含任何本身具有内在的酶活性、生理或生物学活性的基序，其也不呈现免疫反应性，这意味着惰性蛋白既不刺激适应性免疫反应也不刺激先天免疫反应。

通常，在涉及融合蛋白的间插区域的蛋白质时，意图使所述蛋白质的任何内在活性对于本发明的目的而言都是无关的，并且既不作出贡献也不阻碍治疗剂的生物学活性。

在具体实施方式中，本发明的融合蛋白的间插多肽是在本章节D的任何实施方式中描述的任何蛋白质的片段。

在另一优选实施方式中，本发明的融合蛋白的间插多肽是本章节D的任何实施方式中描述的任何蛋白质的突变体。

E.治疗剂

本文所用的术语“治疗剂”是指没有化学结构限制的适于治疗和/或治疗状况、障碍或疾病的任何化合物。

治疗剂的性质对本发明没有具体限制，条件是它在融合蛋白中保持活性或一旦将其递送到细胞内就可以被激活。因此，任何治疗剂都可以用于融合蛋白中，条件是它显示出活性或一旦将其递送到细胞内就可以达到未缀合的治疗剂的活性的至少100％、至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％或更少。可选地，由于本发明的目的是通过提高治疗剂的选择性和降低其脱靶效应来促进治疗剂的功效(作用，action)，因此考虑了缀合至融合蛋白的治疗剂的作用可以是协同的，并且超过已知的特定治疗剂的参数值。因此，意图使与本发明的融合蛋白缀合的治疗剂的一些实施方式还显示单独治疗剂的功能性的至少101％、至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少175％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少1000％、或更高。

在本发明的实施方式中，本发明的融合蛋白的间插区域的治疗剂选自：

(i)化疗剂，

(ii)细胞毒性多肽，

(iii)抗血管生成多肽，

(iv)由肿瘤抑制基因编码的多肽，

(v)促凋亡多肽，

(vi)具有抗转移活性的多肽，

(vii)由能够激活针对肿瘤的免疫应答的多核苷酸所编码的多肽，

(viii)抗血管生成分子，和

(ix)毒素。

(i)化疗剂

将理解的是，术语“化疗剂”是指抗癌剂。

如本文所用，抗癌剂是这样的剂：至少部分抑制癌症的发展或进展，包括即使仅在短期内，也可全部或部分抑制与癌症有关的症状。

几种抗癌剂可以归类为DNA损伤剂，并且这些抗癌剂包括拓扑异构酶抑制剂(例如，依托泊苷(etoposide)、ramptothecin、拓朴替康(topotecan)、替尼泊苷(teniposide)、米托蒽醌(mitoxantrone))、DNA烷化剂(例如，顺铂(cisplatin)、盐酸氮芥(mechlorethamine)、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chorambucil)、白消安(busulfan)、噻替派(thiotepa)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、卡铂(carboplatin)、氮烯唑胺(dacarbazine)、甲基苄肼(procarbazine))、DNA链断裂诱导剂(例如，博来霉素(bleomycin)、阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、伊达比星(idarubicin)、丝裂霉素C(mitomycin C))、抗微管剂(例如，长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine))、抗代谢剂(例如，阿糖胞苷(cytarabine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、羟基脲(hydroxyurea)、5-氟尿嘧啶、氟尿苷(floxuridine)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、氟达拉滨(fludarabine)、喷司他丁(pentostatin)、氯脱氧腺苷(chlorodeoxyadenosine))、蒽环类、长春花生物碱类、或表鬼臼毒素类(epipodophyllotoxins)。

抗癌剂的其他实例包括但不限于阿西维奇；阿西维辛(Acivicin)；阿柔比星(Aclarubicin)；盐酸阿可达佐(Acodazole Hydrochloride)；阿克罗宁(Acronine)；阿多来新(Adozelesin)；阿地白介素(Aldesleukin)；六甲蜜胺(Altretamine)；安波霉素(Ambomycin)；醋酸阿美蒽醌(Ametantrone Acetate)；氨鲁米特(Aminoglutethimide)；安吖啶(Amsacrine)；阿那曲唑(Anastrozole)；安曲霉素(Anthramycin)；天冬酰胺酶；曲林菌素(Asperlin)；阿扎胞苷(Azacitidine)；阿扎替派(Azetepa)；阿佐霉素(Azotomycin)；巴马司他(Batimastat)；苯佐替派(Benzodepa)；比卡鲁胺(Bicalutamide)；盐酸必桑郡(Bisantrene Hydrochloride)；二甲横酸双萘法德(Bisnafide Dimesylate)；比折来新(Bizelesin)；硫酸博来霉素(Bleomycin Sulfate)；硼替佐米(Bortezomib)(VELCADE)；布喹那钠(Brequinar Sodium)；溴匹立明(Bropirimine)；白消安；放线菌素C(Cactinomycin)；卡普睾酮(Calusterone)；卡醋胺(Caracemide)；卡贝替姆(Carbetimer)；卡铂(含铂方案)；卡莫斯汀；盐酸卡柔比星(Carubicin Hydrochloride)；卡折来新(Carzelesin)；西地芬戈(Cedefingol)；苯丁酸氮芥(Chlorambucil)；西罗霉素(Cirolemycin)；顺铂(含铂方案)；克拉屈滨(Cladribine)；甲磺酸克立那托(CrisnatolMesylate)；环磷酰胺；阿糖胞苷；氮烯唑胺；放线菌素D(Dactinomycin)；道诺霉素(Daunorubicin)、地西他滨(Decitabine)；右奥马铂(Dexormaplatin)；地扎胍宁(Dezaguanine)；地吖醌(Diaziquone)；多西紫杉醇(Docetaxel)(TAXOTERE)；阿霉素；屈洛昔芬(Droloxifene)；屈他雄酮(Dromostanolone)；达佐霉素(Duazomycin)；依达曲沙(Edatrexate)；盐酸依氟鸟氨酸(Eflornithine)；依沙芦星(Elsamitrucin)；恩洛柏(Enloplatin)；恩普氨酯(Enpromate)；依匹哌啶(Epipropidine)；表阿霉素(Epirubicin)；厄布洛唑(Erbulozole)；厄洛替尼(Erlotinib)(TARCEVA)；依索比星(Esorubicin)；雌莫司汀(Estramustine)；依他硝唑(Etanidazole)；依托泊苷；艾托卜宁(Etoprine)；法屈唑(Fadrozole)；法扎拉滨(Fazarabine)；芬维A胺(Fenretinide)；氟尿苷(Floxuridine)；氟达拉滨；5-氟尿嘧啶；氟西他滨(Flurocitabine)；磷喹酮(Fosquidone)；福司曲星(Fostriecin)；吉非替尼(Gefitinib)(IRESSA)；吉西他滨(Gemcitabine)；羟基脲(Hydroxyurea)；依达比星；异环磷酰胺；伊莫福新(Ilmofosine)；甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate)(GLEEVAC)；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-nl；干扰素α-n3；干扰素β-I a；干扰素γ-I b；异丙铂(Iproplatin)；伊立替康(Irinotecan)；兰瑞肽(Lanreotide)；来那度胺(Lenalidomide)(REVLLMID，REVIMID)；来曲唑(Letrozole)；亮丙瑞林(Leuprolide)；利阿唑(Liarozole)；洛美曲索(Lometrexol)；洛莫斯汀；洛索蒽醌(Losoxantrone)；马索罗酚(Masoprocol)；美登素(Maytansine)；氮芥(Mechlorethamine)；甲地孕酮(Megestrol)；美仑孕酮(Melengestrol)；美法仑(Melphalan)；美诺立尔(Menogaril)；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；氯苯氨啶(Metoprine)；美妥替哌(Meturedepa)；米丁度胺(Mitindomide)；Mitocarcin；丝裂红素(Mitocromin)；米托洁林(Mitogillin)；米托马星(Mitomalcin)；丝裂霉素(Mitomycin)；米托司培(Mitosper)；米托坦(Mitotane)；米托蒽醌(Mitoxantrone)；霉酚酸(Mycophenolic Acid)；诺考达唑(Nocodazole)；诺加霉素(Nogalamycin)；奥马铂(Ormaplatin)；奥昔舒仑(Oxisuran)；紫杉醇(Paclitaxel)；培美曲塞(Pemetrexed)(ALIMTA)；培门冬酶(Pegaspargase)；培利霉素(Peliomycin)；戊氮芥(Pentamustine)；潘托(Pentomone)；培洛霉素(Peplomycin)；培磷酰胺(Perfosfamide)；哌泊溴烷(Pipobroman)；哌泊舒凡(Piposulfan)；Piritrexim Isethionate；吡罗蒽醌(Piroxantrone)；普卡霉素(Plicamycin)；普洛美坦(Plomestane)；卟吩姆钠(Porfimer)；甲基丝裂霉素(Porfiromycin)；泼尼莫司汀(Prednimustine)；甲基苄肼；嘌呤霉素(Puromycin)；吡唑呋喃菌素(Pyrazofurin)；利波腺苷(Riboprine)；罗谷亚胺(Rogletimide)；沙芬戈(Safingol)；司莫司汀(Semustine)；辛曲秦(Simtrazene)；西托糖苷(Sitogluside)；磷乙酰天冬氨酸钠(Sparfosate)；司帕霉素(Sparsomycin)；螺旋锗(Spirogermanium)；螺莫司汀(Spiromustine)；螺铂(Spiroplatin)；链黑菌素(Streptonigrin)；链脲霉素(Streptozocin)；磺氯苯脲(Sulofenur)；他利霉素(Talisomycin)；坦索罗辛(Tamsulosin)；紫杉酚(Taxol)；泰索帝(Taxotere)；替康兰(Tecogalan)；替加氟(Tegafur)；替洛蒽醌(Teloxantrone)；替莫泊芬(Temoporfin)；替莫唑胺(Temozolomide)(TEMODAR)；替尼泊苷；替罗昔隆(Teroxirone)；睾内酯(Testolactone)；沙利度胺(Thalidomide)(THALOMID)及其衍生物；硫咪嘌呤(Thiamiprine)；硫鸟嘌呤(Thioguanine)；噻替派；噻唑羧胺核苷(Tiazofurin)；替拉扎明(Tirapazamine)；拓扑替康(Topotecan)；托瑞米芬(Toremifene)；曲托龙(Trestolone)；曲西立滨(Triciribine)；三甲曲沙(Trimetrexate)；曲普瑞林(Triptorelin)；妥布氯唑(Tubulozole)；尿嘧啶；氮芥(Mustard)；乌瑞替派(Uredepa)；伐普肽(Vapreotide)；维替泊芬(Verteporfin)；长春花碱；长春新碱；长春地辛(Vindesine)；长春匹定(Vinepidine)；长春甘酯(Vinglycinate)；长春罗新(Vinleurosine)；长春瑞滨(Vinorelbine)；长春罗定(Vinrosidine)；长春利定(Vinzolidine)；伏氯唑(Vorozole)；折尼铂(Zeniplatin)；净司他丁(Zinostatin)；佐柔比星(Zorubicin)。

在一个实施方式中，抗癌剂作为包含若干抗癌分子单元的低聚物被提供。在一个实施方式中，抗癌剂是氟尿苷多核苷酸或氟尿苷寡核苷酸，其包含若干氟尿苷分子。氟尿苷多核苷酸或氟脲苷寡核苷酸(poligonucleotide)含有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个氟尿苷分子。在优选实施方式中，氟尿苷多核苷酸是氟尿苷五核苷酸，即含有5个氟尿苷分子的寡核苷酸。

抗癌剂可以是酶抑制剂，不限制地包括酪氨酸激酶抑制剂、CDK抑制剂、MAP激酶抑制剂、或EGFR抑制剂。酪氨酸激酶抑制剂可以不限制地是染料木素(4',5,7-三羟基异黄酮)、酪氨酸磷酸化抑制剂25(3,4,5-三羟基苯基),亚甲基]-丙二腈、除莠毒素A、大豆苷元(4',7-二羟基异黄酮)、AG-126、反式-1-(3'-羧基-4'-羟基苯基)-2-(2”,5”-二羟基-苯基)乙烷、或HDBA(2-羟基5-(2,5-二羟基苄基氨基)-2-羟基苯甲酸。CDK抑制剂可以不限制地是p21、p27、p57、p15、p16、p18、或p19。MAP激酶抑制剂可以不限制地是KY12420(C23H2408)、C-1493、PD98059、或4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)1H-咪唑。EGFR抑制剂可以不限制地是厄洛替尼(TARCEVA)、吉非替尼(IRESSA)、WHI-P97(喹唑啉衍生物)、LFM-A12(来氟米特(leflunomide)代谢类似物)、ABX-EGF、拉帕替尼(lapatinib)、卡奈替尼(canertinib)、ZD-6474(ZACTIMA)、AEE788、和AG1458。

抗癌剂可以是VEGF抑制剂，不限制地包括贝伐单抗(bevacizumab)(AVASTIN)、兰尼单抗(ranibizumab)(LUCENTIS)、哌加他尼(pegaptanib)(MACUGEN)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)(SUTENT)、瓦他拉尼(vatalanib)、ZD-6474(ZACTIMA)、阿奈可他(anecortave)(RETAANE)、乳酸角鲨胺(squalamine lactate)、和信号素(脑信号蛋白，semaphorin)。抗癌剂可以是抗体或抗体片段，不限制地包括抗体或抗体片段，包括但不限于贝伐单抗(AVASTIN)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(HERCEPTIN)、阿仑单抗(alemtuzumab)(CAMPATH，适用于B细胞慢性淋巴细胞白血病)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)(MYLOTARG，hP67.6、抗CD33，适用于白血病，如急性髓性白血病)、利妥昔单抗(rituximab)(RITUXAN)、托西莫单抗(tositumomab)(BEXXAR，抗CD20，适用于B细胞恶性肿瘤)、MDX-210(同时与HER-2/neu癌基因蛋白产物和免疫球蛋白G(IgG)(FcγRI)的I型Fc受体结合的双特异性抗体)、奥戈伏单抗(oregovomab)(OVAREX，适用于卵巢癌)、依决洛单抗(edrecolomab)(PANOREX)、达利珠单抗(daclizumab)(ZENAPAX)、帕利珠单抗(palivizumab)(SYNAGIS，适用于呼吸状况，如RSV感染)、替依莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(ZEVALIN，适用于非霍奇金淋巴瘤)、西妥昔单抗(cetuximab)(ERBITUX)、MDX-447、MDX-22、MDX-220(抗TAG-72)、I0R-C5、10R-T6(抗CD 1)、IOR EGF/R3、西洛果瓦(celogovab)(ONCOSCINT OV 103)、依帕珠单抗(epratuzumab)(LYMPHOCIDE)、佩姆图单抗(pemtumomab)(THERAGYN)、和Gliomab-H(适用于脑癌、黑素瘤)。

考虑在本发明的某些实施方式中充当血管生成抑制剂的蛋白质靶向肿瘤。除上述抗血管生成多肽外，这些试剂还包括马立马司他(Marimastat)；AG3340；COL-3，BMS-275291、沙利度胺、内皮抑制素(Endostatin)、SU5416、SU6668、EMD121974、2-甲氧基雌二醇(2-methoxyoestradiol)、羧酰胺基三唑(羧胺三唑，carboxiamidotriazole)、CMlOl、戊聚糖聚硫酸盐(pentosan polysulphate)、血管生成素2(Regeneron)、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、三羧氨基喹啉(利诺胺，Linomide)、酞胺呱啶酮(沙利度胺，thalidomide)、已酮可可豆碱(pentoxifylline)、染料木素、TNP470、内皮抑制素、紫杉醇、accutin、制管张素、西多福韦(cidofovir)、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子4或二甲胺四环素(minocycline)。

其他适合的活性剂是DNA断裂剂(DNA cleaving agent)。适用于在实践所述方法中使用的缀合物中被包括作为细胞毒素的DNA断裂剂的实例包括但不限于蒽醌-寡吡咯-羧酰胺、苯并咪唑、雷拉霉素(leinamycin)；dynemycin A；烯二炔类(enediyne)；以及其生物活性类似物或衍生物(即，具有基本上等同的生物活性的那些)。例如在Islam等人,J.Med.Chem.34 2954-61,1991；Skibo等人,J.Med.Chem.37:78-92,1994；Behroozi等人,Biochemistry 35:1568-74,1996；Helissey等人,Anticancer Drug Res.11:527-51,1996；Unno等人,Chem.Pharm.Bull.45:125-33,1997；Unno等人,Bioorg.Med.Chem.,5:903-19,1997；Unno等人,Bioorg.Med.Chem.,5:883-901,1997；和Xu等人,Biochemistry 37:1890-7,1998)中公开了已知的类似物和衍生物。其他实例包括但不限于烯二炔醌亚胺(endiynequinone imines)(美国专利号5,622,958)；2,2r-双(2-氨基乙基)-4-4'-双噻唑[Lee等人,Biochem.Mol.Biol.Int.40:151-7,1996]；epilliticine-萨伦铜(epilliticine-salen.copper)缀合物[Routier等人,Bioconjug.Chem.,8:789-92,1997]。

上述化疗剂中的一些可以作为抗代谢物而被一起分类为一般类别。本文所用的“抗代谢物”是指抑制作为正常代谢的部分的代谢物的利用的化合物。抗代谢物的结构通常与其干扰的代谢物相似，如干扰叶酸的利用的抗叶酸剂(antifolates)。抗代谢物的非限制性实例包括以下化合物：博来霉素、白消安、卡培他滨、卡莫斯汀、卡铂、氯脱氧腺苷、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯唑胺、柔红霉素、多西紫杉醇、阿霉素、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、美法仑、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇、甲基苄肼、SN-38、硫鸟嘌呤、噻替派、替尼泊苷、长春花碱、长春新碱、和长春瑞滨。

(ii)细胞毒性多肽

本文所用的术语“细胞毒性多肽”是指能够抑制细胞功能的剂。该剂可抑制增殖或对细胞有毒。当被细胞内化时，干扰或有害地改变细胞代谢或以任何方式抑制细胞生长或增殖的任何多肽都包括在此术语的范围内，包括但不限于在被运输到细胞中时其毒性作用被介导的剂以及其毒性作用在细胞表面被介导的剂。有用的细胞毒性多肽包括蛋白质毒素，如细菌毒素。

可用于并入到根据本发明的缀合物的蛋白质细胞毒素的实例包括但不限于一型和二型核糖体失活蛋白(RIP)。有用的一型植物RIP包括但不限于香石竹毒蛋白30、香石竹毒蛋白32、剪秋罗甙(lychnin)、肥皂草毒蛋白1-9、美洲商陆活化蛋白(PAP)、PAP II、PAP-R、PAP-S、PAP-C、mapalmin、商陆毒蛋白、异株泻根毒蛋白L、异株泻根毒蛋白、大肠杆菌素1和2、软瓜蛋白-A、软瓜蛋白-B、软瓜蛋白-S、19K蛋白合成抑制蛋白(PSI)、15K-PSI、9K-PSI、α-kirilowin、β-kirilowin、多花白树毒蛋白、苦瓜毒蛋白、苦瓜毒蛋白-II、苦瓜毒蛋白-Ic、MAP-30、α-momorcharin、β-momorcharin、天花粉蛋白、TAP-29、括楼素(trichokirin)；大麦RIP；亚麻RIP、小麦毒蛋白、玉米RIP、Asparin 1和2[Stirpe等人,1992.Bio/Technology 10:405-12]。有用的二型RIP包括但不限于塑连根毒蛋白I、蓖麻毒蛋白、接骨木毒蛋白b、CIP-29、相思豆毒蛋白、塑连根毒蛋白II、ebulitin-[α]、ebulitin-[β]、ebulitin-[γ]、vircumin、黄樟毒蛋白(porrectin)、以及其生物活性酶亚基[Stirpe等人,1992.Bio/Technology 10:405-12；Pastan等人,1992.Annu.Rev.Biochem.61:331-54；Brinkmann和Pastan,1994.Biochim.et Biophys.Acta 1198:27-45,；以及Sandvig和VanDeurs,1996.Physiol.Rev.76:949-66]。

可用作细胞毒素的细菌毒素的实例包括但不限于志贺毒素和志贺样毒素(即，具有相同活性或结构的毒素)、以及其催化亚基和生物学功能片段。这些细菌毒素也是两型RIP[Sandvig和Van Deurs,1996.Physiol.Rev.76:949-66；Armstrong,1995.J.Infect.Dis.,171:1042-5；Kim等人,1997.Microbiol.Immunol.41:805-8；和Skinner等人,1998.Microb.Pathog.24:117-22]。有用的细菌毒素的其他实例包括但不限于假单胞菌外毒素和白喉毒素[Pastan等人,1992.Annu.Rev.Biochem.61:331-54；以及Brinkmann和Pastan,1994.Biochim.et Biophys.Acta 1198:27-45]。毒素酶亚基的截短形式和突变体也可以用作细胞毒素部分(Pastan等人,Annu.Rev.Biochem.61:331-54；Brinkmann和Pastan,Biochim.et Biophys.Acta 1198:27-45,1994；Mesri等人,J.Biol.Chem.268:4852-62,1993；Skinner等人,Microb.Pathog.24:117-22,1998；和美国专利号5,082,927)。其他靶向剂包括但不限于多于34种所述的大肠菌素RNase毒素家族，其包括大肠菌素A、B、D、E1-9、阴沟肠道菌素DF13和真菌RNase、α-帚曲霉素[Ogawa等人1999.Science 283:2097-100；Smarda等人,1998.Folia Microbiol(Praha)43:563-82；Wool等人,1992.Trends Biochem.Sci.,17:266-69]。

(iii)抗血管生成多肽

肿瘤细胞的增殖在很大程度上依赖于伴随肿瘤进展的广泛的肿瘤血管形成。因此，用抗血管生成剂抑制新血管形成和靶向破坏现有血管已被引入作为有效且相对无毒的肿瘤治疗方法。

如本文所用的术语“抗血管生成多肽”表示能够抑制血管生成的多肽。适合的抗血管生成多肽包括但不限于如WO2007115376中所述的制管张素、内皮抑制素、抗血管生成抗凝血酶III、sFRP-4，以及抗VEGF抗体，如anibizumab、贝伐单抗(阿瓦斯汀(avastin))、FabIMC 1121和F200 Fab。

(iv)肿瘤抑制基因编码的多肽

如本文所用，“肿瘤抑制剂”是具有抑制不受调控的细胞生长的正常生物学作用的基因或基因产物。肿瘤抑制剂的功能对应物是癌基因——促进正常细胞生长的基因可被称为“原癌基因”。激活这种基因或基因产物的突变进一步将其转化为使细胞生长活性继续——但是以失调方式——的“癌基因”。肿瘤抑制基因和基因产物的实例在文献中是公知的，并且可以包括PTC、BRCA1、BRCA2、p16、APC、RB、WT1、EXT1、p53、NF1、TSC2、NF2、VHL、ST7、ST14、PTEN、APC、CD95或SPARC。

(v)促凋亡多肽

如本文所用的，术语“促凋亡多肽”是指能够诱导细胞或细胞群中的细胞死亡的蛋白质。这些参与凋亡的蛋白质的过表达将抗凋亡因子与促凋亡因子之间的谨慎平衡朝向凋亡的结果转移。适合的促凋亡多肽不限制地包括BCL-2蛋白家族的促凋亡成员，如BAX、BAK、BOK/MTD、BID、BAD、BIK/NBK、BLK、HRK、BIM/BOD、BNIP3、NIX、NOXA、PUMA、BMF、EGL-I、和病毒同系物、胱天蛋白酶(如胱天蛋白酶-8)、腺病毒E4orf4基因、p53途径基因、促凋亡配体(如TNF、FasL、TRAIL)和/或其受体(如TNFR、Fas、TRAIL-R1和TRAIL-R2)。

(vi)具有抗转移活性的多肽

如本文所用的术语“转移抑制剂”是指起到使转移(继发性肿瘤)在患有癌症的有机体内的扩散减慢或防止的作用的蛋白质。适合的转移抑制剂不限制地包括蛋白质，如BRMS1、CRSP3、DRG1、KAI1、KISS-1、NM23、TIMP家族蛋白和子宫珠蛋白。

(vii)由能够激活针对肿瘤的免疫应答的多核苷酸所编码的多肽

如本文所用，免疫刺激多肽剂是由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸能够单独地或者与其他剂组合地在其被给予的对象中激活或刺激其免疫应答(包括增强预先存在的免疫应答)。免疫刺激肽的适合的非限制性实例包括鞭毛蛋白、胞壁酰二肽)、包括白介素的细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-15(或这些细胞因子的超激动剂/突变形式)、IL-12、IFN-γ、IFN-α、GM-CSF、FLT3-配体等)、免疫刺激抗体(例如，抗CTLA-4、抗CD28、抗CD3、或这些分子的单链/抗体片段)等。

(viii)抗血管生成分子

也考虑在某些实施方式中本发明的融合蛋白的间插区域对应于充当血管生成抑制剂的靶向肿瘤的蛋白质。除上述抗血管生成多肽外，这些剂还包括马立马司他；AG3340；COL-3、BMS-275291、沙利度胺、内皮抑制素、SU5416、SU6668、EMD121974、2-甲氧基雌二醇、羧酰胺基三唑、CMlOl、戊聚糖聚硫酸盐、血管生成素2(Regeneron)、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、三羧氨基喹啉(利诺胺，linomide)、沙利度胺(thalidomide)、已酮可可豆碱(pentoxidylline)、染料木碱(genistein)、TNP470、内皮抑制素、紫杉醇、accutin、制管张素、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子4或二甲胺四环素。VEGF抑制剂也包括在内，不限制地包括贝伐单抗(AVASTIN)、兰尼单抗(LUCENTIS)、哌加他尼(MACUGEN)、索拉非尼、舒尼替尼(SUTENT)、瓦他拉尼、ZD-6474(ZACTIMA)、阿奈可他(RETAANE)、乳酸角鲨胺、和信号素。

(ix)毒素

如本文所用的，术语“毒素”是指获自不同有机体的非蛋白质/非多肽的细胞毒性化合物，以及这些相同化合物的化学修饰衍生物和通过化学合成获得的化合物。这类具有生物学起源的化合物可获自微生物(不管是细菌、古细菌、原生动物或单细胞真菌)或多细胞有机体(多细胞真菌、植物、或动物，如软体动物)。这些毒素的化学组成和结构旨在不以任何方式受其非多肽性质的限制，因此，无论是作为其基本组成的部分还是作为化学衍生的结果，一种或多种氨基酸都可以成为其结构的部分，只要参与结构的所有氨基酸不被肽键结合在一起。

适用于本发明的毒素的实例是刺孢霉素γ1、海兔毒素10(dolastatin 10)、美登木素生物碱(DM1)和吡咯并苯并二氮

二聚体(PBD)。

F.治疗剂与间插区域的连接

本发明的治疗剂与本发明的融合蛋白缀合。如前所述，意图将治疗剂缀合至融合蛋白的间插区域，而就N末端和C末端而言，不限制间插区域内的缀合位置。因此，治疗剂可以在相对于N末端和C末端等距离的位置处、或者其可以更靠近它们中的任一个而缀合至间插多肽区域。因此，治疗剂可以以距N末端或C末端100、90、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、30、25、20、15、20、10个或更少个氨基酸残基的距离、或以距N末端或C末端相同个残基的距离而缀合至间插多肽区域。

治疗剂缀合位置的唯一预期的限制是治疗剂和融合蛋白的元件是功能性的，并且治疗剂的缀合不干扰治疗剂或融合蛋白的活性。因此，治疗剂、聚阳离子肽、和富含带正电荷的氨基酸的区域分别相对于非缀合形式的融合蛋白和治疗剂，保存其功能性的至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、优选95％、更优选99％、甚至更优选100％。

意图使治疗剂可以与融合蛋白的间插多肽的残基直接缀合，或者其键可以由连接部分介导。如本文所用的，“连接部分”涉及将治疗肽连接至融合蛋白的间插区域的分子。还意图使连接部分在其化学性质和/或结构上不受限制；因此，连接部分可以是多糖、多肽、脂肪酸、磷脂、或其化学衍生物等。还意图使治疗剂可以通过任何化学键(如肽键、异肽键、酰胺键、亚胺键等)结合至连接部分。

本领域技术人员将认识到，无论何时偶联剂介导治疗剂和融合蛋白之间的缀合，关于融合蛋白的元件和治疗剂的功能性的先前规定也适用。因此，无论何时治疗剂通过连接部分与融合蛋白缀合，治疗剂、聚阳离子肽、和富含带正电荷的氨基酸的区域分别相对于非缀合形式的融合蛋白和治疗剂，均保存其功能性的至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、优选95％、更优选99％、甚至更优选100％，而不管间插区域中缀合的位置、连接部分的化学组成或结构以及连接部分和治疗剂之间与连接部分和间插区域之间的键(一个或多个)的化学性质如何。

因此，在本发明的实施方式中，治疗剂直接结合至融合蛋白的间插多肽区域。

在本发明的另一实施方式中，治疗剂通过连接部分结合至融合蛋白的间插区域。

在本发明的优选实施方式中，介导治疗剂与融合蛋白的间插区域的键的连接部分是6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。在另一优选实施方式中，介导治疗剂与融合蛋白的间插区域的键的连接部分是4-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。

在本发明的一些实施方式中，使治疗剂与融合蛋白的间插区域结合的连接部分易于被细胞质中存在的酶加工，一旦缀合至融合蛋白的治疗剂在细胞中被内化，就从融合蛋白释放治疗剂。

如本领域技术人员将认识到的，融合蛋白的间插区域的多肽链的许多残基不仅提供了可以结合或连接的治疗剂的多个位置，还提供了将多于一分子的相同或不同治疗剂连接至相同融合蛋白的可能性。如前所述，意图维持关于融合蛋白的元件以及治疗剂(一种或多种)的功能的规定，并且意图使相同或不同治疗剂的分子数的增加、不同治疗剂的结合、它们的化学性质、或它们的结合位置不影响每种治疗剂的有效性和功能性。

此外，一些治疗剂可以以使得相同分子的多个拷贝可以结合在一起的方式聚合，就像核苷酸类似物的聚合物可以是寡核苷酸，例如5-氟-2'-脱氧尿苷(FdU)，其产生低聚-FdU。意图使本发明的一些实施方式可以包含这样的聚合物。此外，意图使本发明的一些其他实施方式可以包含2种或更多种不同治疗剂分子的聚合物，前提是此治疗剂不干扰彼此的生理或生物学作用。本领域技术人员将认识到，以治疗剂的聚合物为特征的本发明的那些实施方式可以以2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、15、30、40、50个或更多个按1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、或更多的比例的一种或多种不同治疗剂聚合在一起的分子为特征。

因此，在本发明的另一实施方式中，融合蛋白的间插多肽与多种治疗剂缀合，其中所述多种治疗剂相同或不同。

在本发明的优选实施方式中，与融合蛋白的间插多肽区域缀合的治疗剂是化疗剂。

在本发明的更优选的实施方式中，与融合蛋白的间插区域缀合的化疗剂是抗代谢物。

在本发明的甚至更优选的实施方式中，与融合蛋白的间插区域缀合的化疗剂是抗代谢物。

在本发明的甚至更优选的实施方式中，与融合蛋白的间插区域缀合的抗代谢物是嘧啶类似物或其低聚形式。

在本发明的最优选实施方式中，与融合蛋白的间插区域缀合的嘧啶类似物是氟尿苷。

G.报告蛋白

在本发明的另一实施方式中，本发明的融合蛋白还包含报告蛋白。

本领域技术人员将认识到术语“报告蛋白”是指由“报告基因”的表达产生的蛋白质。报告蛋白是公知的，并且在本领域中常用作适用于多种目的的标记物，如报告基因在组织、细胞或亚细胞位置中的表达位置、蛋白质-蛋白质相互作用、跨细胞质膜或内膜的运输、囊泡转运、配体-受体相互作用等。

在本发明背景下有用的报告蛋白包括来自Photinus pyralis的萤光素酶-4-单加氧酶、β-半乳糖苷酶、胸苷激酶等。报告蛋白还包括已经讨论过的荧光蛋白。

本发明的融合蛋白所包含的报告蛋白与富含带正电荷的氨基酸的区域直接相邻或被连接体隔开。然而，根据前述关于融合蛋白的元件的相对位置的考虑，保留了富含带正电荷的氨基酸的区域的相对位置。因此，与融合蛋白的位置无关，荧光蛋白总是直接与之相邻或通过连接体与之隔开。

因此，在本发明的包含荧光蛋白的实施方式中，本发明的融合蛋白的元件的可能的相对位置将适合以下方案(其中RP是指报告蛋白，并且保留了上述元件的编号：(1)聚阳离子肽，(2)间插多肽区域，(3)带正电荷的氨基酸区域)：

■N-(1)-(2)-RP-(3)-C

■N-(1)-连接体-(2)-RP-(3)-C

■N-(1)-(2)-连接体-RP-(3)-C

■N-(1)-连接体-(2)-连接体-RP-(3)-C

■N-(3)-RP-(2)-(1)-C

■N-(3)-RP-连接体-(2)-(1)-C

■N-(3)-RP-(2)-连接体-(1)-C

■N-(3)-RP-连接体-(2)-连接体-(3)-C

■N-(1)-(2)-RP-连接体-(3)-C

■N-(1)-连接体-(2)-RP-连接体-(3)-C

■N-(1)-(2)-连接体-RP-连接体-(3)-C

■N-(1)-连接体-(2)-连接体-RP-连接体-(3)-C

■N-(3)-连接体-RP-(2)-(1)-C

■N-(3)-连接体-RP-连接体-(2)-(1)-C

■N-(3)-连接体-RP-(2)-连接体-(1)-C

■N-(3)-连接体-RP-连接体-(2)-连接体-(3)-C

■N-(2)-(1)-RP-(3)-C

■N-(2)-连接体-(1)-RP-(3)-C

■N-(2)-(1)-连接体-RP-(3)-C

■N-(2)-连接体-(1)-连接体-RP-(3)-C

■N-(2)-RP-(3)-(1)-C

■N-(2)-(3)-RP-(1)-C

■N-(2)-连接体-RP-(3)-(1)-C

■N-(2)-连接体-(3)-RP-(1)-C

■N-(2)-RP-(3)-连接体-(1)-C

■N-(2)-(3)-RP-连接体-(1)-C

■N-(2)-连接体-RP-(3)-连接体-(1)-C

■N-(2)-连接体-(3)RP--连接体-(1)-C

■N-(1)-RP-(3)-(2)-C

■N-(1)-(3)-RP-(2)-C

■N-(1)-RP-(3)-连接体-(2)-C

■N-(1)-(3)-RP-连接体-(2)-C

■N-(1)-连接体-RP-(3)-(2)-C

■N-(1)-连接体-(3)-RP-(2)-C

■N-(1)-连接体-RP-(3)-连接体-(2)-C

■N-(1)-连接体-(3)-RP-连接体-(2)-C

■N-RP-(3)-(1)-(2)-C

■N-(3)-RP-(1)-(2)-C

■N-RP-(3)-连接体-(1)-(2)-C

■N-(3)-RP-连接体-(1)-(2)-C

■N-RP-(3)-(1)-连接体-(2)-C

■N-(3)-RP-(1)-连接体-(2)-C

■N-RP-(3)-连接体-(1)-连接体-(2)-C

■N-(3)-RP-连接体-(1)-连接体-(2)-C

本发明的优选融合蛋白

在优选的实施方式中，融合蛋白是T22-GFP-H6-5FdU，其包含：

(i)作为聚阳离子肽的T22肽，

(ii)作为间插多肽区域的GFP，

(iii)作为富含带正电荷的氨基酸的区域的六组氨酸区域，

(iv)作为治疗剂的氟尿苷五核苷酸

在更优选的实施方式中，T22-GFP-H6-5FdU通过由6原子的间隔区域连接的GFP蛋白侧链中的氨基与治疗剂中的硫醇基之间的键(linkage)形成。

在优选实施方式中，融合蛋白是T22-STM-H6-5FdU，其包含：

(i)作为聚阳离子肽的T22肽，

(ii)作为间插多肽区域的上文定义的Ste2的STM变体，

(iii)作为富含带正电荷的氨基酸的区域的六组氨酸区域，

(iv)作为治疗剂的氟尿苷五核苷酸。

在更优选的实施方式中，T22-STM-H6-5FdU通过由6原子的间隔区域连接的STM蛋白侧链中的氨基与治疗剂中的硫醇基之间的键形成。

本发明的融合蛋白和纳米缀合物的化学计量

与本发明的融合蛋白缀合的治疗剂的数量不作具体限制，将取决于间插多肽中可用于与治疗剂化学缀合的可用残基的数量。由于大多数缀合是通过存在于形成间插多肽的部分的氨基酸侧链中的氨基或巯基发生的，因此与融合蛋白缀合的治疗剂的数量将取决于赖氨酸残基和精氨酸残基的数量(对于通过侧链中的氨基进行的缀合)或取决于半胱氨酸残基的数量(对于通过侧链中的巯基进行的缀合)以及缀合反应的产率。因此，在本发明的具体实施方式中，本发明的融合蛋白与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20、25、30个治疗剂缀合。

应当理解，在其中治疗剂以聚合物被提供的具体情况下，治疗剂的数量也将取决于聚合物中单体的数量。在FdU低聚物的具体情况下，给定融合蛋白中治疗剂的数量将是附着至融合蛋白的低聚物的数量乘以单体数量的结果。在FdU五聚体的优选情况下，优选实施方式包括这样的融合蛋白，每个融合蛋白含有至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、75、85、100、125、150个或更多治疗剂，分别对应于每分子缀合1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20、25、或30个FdU五聚体。

另外，根据本发明的纳米颗粒是由多拷贝的本发明的融合蛋白的组装产生的。在优选实施方式中，纳米颗粒包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、20、25个本发明的融合蛋白的单体，更优选包含至少15个本发明的融合蛋白的单体。

因此，附着至每个纳米颗粒的治疗剂的总数将取决于(i)缀合至每个融合蛋白的治疗剂的数量，(ii)治疗剂的低聚状态和(iii)形成纳米颗粒的融合蛋白的数量。在优选实施方式中，纳米颗粒与至少30、35、40、45、50、60、65、70、57、80、85、90、59、100、125、150、175、200、225、250、275、300个治疗剂缀合。在另一优选实施方式中，纳米颗粒与至少30、35、40、45、50、60、65、70、57、80、85、90、59、100个分子的FdU五聚体缀合，更优选与至少60个分子的FdU五聚体缀合。

制备本发明的融合蛋白的方法

在第二方面中，本发明涉及制备本发明的融合蛋白的方法，包括以下步骤：

a)提供融合蛋白，其包含

i.聚阳离子肽

ii.间插多肽区域，和

iii.富含带正电荷的氨基酸的区域，

其中聚阳离子肽和富含带正电荷的氨基酸的区域位于蛋白的末端，和

b)使所述融合蛋白与治疗剂的活化形式或其低聚形式的活化形式接触，其中所述治疗剂的活化形式或其低聚形式的活化形式含有能够与融合蛋白中的间插区域中的至少一个基团反应的反应性基团，并且其中在足以在治疗剂中的反应性基团和间插多肽区域中的基团之间形成键的条件下进行接触。

在另一实施方式中，本发明涉及制备本发明的融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供融合蛋白，其包含

i.聚阳离子肽

ii.间插多肽区域，和

iii.富含带正电荷的氨基酸的区域，

其中聚阳离子肽和富含带正电荷的氨基酸的区域位于蛋白的末端，并且其中融合蛋白以活化形式提供，其中融合蛋白的所述活化形式在间插区域中包含反应性基团，和

b)使所述融合蛋白与治疗剂或其低聚形式接触，其中所述治疗剂包含能够与融合蛋白中的反应性基团反应的基团，其中所述接触在足以在融合蛋白中的反应性基团与治疗剂中的基团之间形成键的条件下进行。

本领域技术人员将认识到，如本文所用的，“反应性基团”是指这样的分子的任何部分，其能够以使得将两个分子结合在一起的方式与另一分子的另一部分进行化学反应，通常释放一个或多个其他分子。许多这样的反应是本领域已知的，诸如在羧基和胺基之间形成肽键是其中的一个非限制性实例。

如本文所用的，“活化”，当指代分子时，是指分子的修饰形式(version)，其含有化学修饰，由此所述分子能够以分子中先前不存在的方式进行化学反应(例如，活化添加了先前不存在的部分，从而允许之前不可行的键)或能够以提高的反应性进行化学反应(意味着分子与另一分子的反应所需的活化能比失活状态下的活化能低)。本发明考虑了活化治疗剂然后使活化的治疗剂与融合蛋白接触或活化融合蛋白然后使活化的融合蛋白与治疗剂接触的可能性。在两种情况下，融合蛋白的活化或治疗剂的活化通常通过使待活化分子与将反应性基团引入待活化分子的合适部分中的试剂反应来进行。允许治疗剂或融合蛋白活化的反应性基团的实例包括但不限于羧基、胺、亚胺、硫醇、砜、羟基、硫酸根(硫酸盐，sulfate)、和磷酸根(磷酸盐，phosphate)部分，其中许多是本领域技术人员通常已知的。治疗剂的活化形式在本文中也称为“活化的治疗剂”。融合蛋白的活化形式在本文中也称为“活化的融合蛋白”。活化的融合蛋白中的一个或多个反应性基团位于间插区域中，虽然不排除在融合蛋白的其他区域中也可以发现另外的反应性基团。

在本发明的其中连接部分介导融合蛋白和治疗剂之间的键的那些实施方式中，连接部分是双功能交联剂，并且更优选地是异双功能交联剂，其利用Kalia J等人Advancesin bioconjugation.Curr Org Chem 2010January,14(2):138-147中公开的其他键(如硫醚、酰胺键、碳氮双键、或环加成反应所产生的键)与治疗剂中的基团和融合蛋白中的基团顺序地(或是先与活化的治疗剂反应，然后与融合蛋白反应，或是先与融合蛋白反应，然后与活化的治疗剂反应)或同时地反应。例如，典型的硫醇反应性官能团包括碘乙酰胺、马来酰亚胺、和二硫化物。另外，可以用展示活化酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯)的小分子或表面来处理蛋白质，从而与赖氨酸侧链上的氨基和N端形成酰胺键。在另一实施方式中，连接部分是杂双功能交联剂，其含有能够与硫醇基反应和与氨基反应的反应性基团。在一个实施方式中，杂双官能交联剂是6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。

在优选实施方式中，连接部分在第一步中与活化的治疗剂反应，和在第二步中与融合蛋白反应。在另一实施方式中，连接部分在第一步中与融合蛋白反应，和在第二步中与治疗剂反应。

意图使将本发明的融合蛋白与治疗剂的活化形式接触的步骤在有利于在它们之间建立键的反应的介质中进行。适用于这种反应的介质是本领域技术人员公知的，包括水性缓冲液和非水性缓冲液。还意图使固体载体(supports)可以连同介质一起用于导致活化的治疗剂和融合蛋白、治疗剂、还有包括了连接部分的实施方式中的连接部分的缀合物的合成的任何反应步骤。此外，意图使用于制备融合蛋白与治疗剂之间的缀合物的方法不限于融合蛋白、活化的治疗剂、和连接部分，而且一些实施方式还包括在反应中使用一种或多种催化剂和辅助因子。

因此，在本发明的一个实施方式中，治疗剂的活化形式含有与融合蛋白的肽区域中(优选在融合蛋白的间插区域中)的残基的至少一个侧链反应的基团。

在另一优选的实施方式中，所述残基是外部赖氨酸。在本发明的另一优选实施方式中，与融合蛋白的间插区域的侧链反应的活化的治疗剂(优选是化疗剂)的基团是硫醇基。

在本发明的甚至更优选的实施方式中，活化的治疗剂是活化的化疗剂，更优选是硫醇官能化的寡氟尿苷。

在其他优选实施方式中，连接部分是4-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，其介导活化的治疗剂与本章节前述实施方式中指示的融合蛋白的肽区域的残基侧链之间的缀合。在其他更优选实施方式中，在第一步骤中，将连接部分4-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯与治疗剂(优选活化的FdU，再更优选用巯基官能化的FdU)结合，和在第二步骤中与融合蛋白残基中的侧链(更优选与融合蛋白的外部赖氨酸，甚至更优选与融合蛋白间插区域的外部赖氨酸)结合。

还意图使将本发明的活化的融合蛋白与治疗剂接触的步骤在有利于在它们之间建立键的反应的介质中进行。适用于反应的介质是本领域技术人员公知的，包括水性缓冲液和非水性缓冲液。还意图使固体载体可以连同介质一起用于导致了融合蛋白和治疗剂、还有包括了连接部分的实施方式中的连接部分的缀合物合成的任何反应步骤。此外，意图使用于制备融合蛋白与治疗剂之间的缀合物的方法不限于融合蛋白、活化的治疗剂、和连接部分，而是一些实施方式还包括在反应中使用一种或多种催化剂和辅助因子。

因此，在本发明的一个实施方式中，融合蛋白的活化形式含有与治疗剂中的至少一个部分反应的基团。在本发明的其他优选实施方式中，与活化的融合蛋白反应的治疗剂(优选化疗剂)的基团是硫醇基。

在本发明的甚至更优选的实施方式中，活化的融合蛋白剂是氨基官能化的融合蛋白，其中形成间插多肽的部分的氨基酸侧链中的一个或多个氨基被具有硫醇反应性的活化基团修饰(改性，modified)。在其他优选实施方式中，连接部分是4-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，其介导融合蛋白中的氨基与治疗剂中的硫醇基之间的缀合。在再更优选的实施方式中，连接部分4-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在第一步骤中与融合蛋白结合，更优选与融合蛋白的外部赖氨酸结合，和在第二步中与融合蛋白残基中的治疗剂侧链结合。

本发明的纳米颗粒和使用本发明的融合蛋白制备本发明的纳米颗粒的方法

在第三方面中，本发明涉及制备包含多个拷贝的根据本发明第一方面的融合蛋白的纳米颗粒的方法，所述方法包括将所述融合蛋白制剂置于低盐缓冲液中。

如本领域技术人员将认识到的，“纳米颗粒”是其尺寸以纳米测量的微观颗粒。本发明的纳米颗粒包括由多个拷贝的本发明的融合蛋白的聚集产生的纳米颗粒，如先前章节所定义的。在用本发明的融合蛋白制备纳米颗粒的方法中，本发明的融合蛋白制剂包括本发明的融合蛋白的单体形式，其在热力学上有利于形成非共价静电结合(unions)并在低盐缓冲液的条件下自发聚集。

本领域技术人员将认识到，纳米颗粒的尺寸可以在1与1000nm之间的范围内，更优选在2与500nm之间和5与500nm之间，甚至更优选在5于250nm之间，并且甚至更优选在10与100nm之间。

将理解的是，表述“低盐缓冲液”包括由一种或多种盐溶解于水中而产生的任何缓冲溶液，其具有适度的pH变化的能力，例如，其中溶解的一种或多种盐的量所导致的同渗浓度低于或等于生理流体(如细胞质或细胞外介质)的同渗浓度。因此，低盐缓冲液被理解为将pH和同渗浓度保持在生理值范围内，并将在生理温度范围内使用。

本领域技术人员将认识到，生理温度范围可以在15与45℃之间，更优选在20与40℃之间，甚至更优选在25与39℃之间，甚至更优选在30与37℃之间摆动。本领域技术人员还将认识到，低盐缓冲液的同渗浓度将在100与400毫渗透压摩尔/L(mOsm/L)之间的范围内，优选在150与350mOsm/L之间，更优选在200与300mOsm/L之间，甚至更优选在225与275mOsm/L之间。

适用于本发明的低盐缓冲液例如是Tris-右旋糖缓冲液(20mM Tris+5％右旋糖，pH 7.4)、Tris-NaCl缓冲液(20mM Tris，500NaCl，pH 7.4)、PBS-甘油缓冲液(磷酸盐缓冲盐水，PBS，pH 7.4，其是本领域公知的，+10％甘油)、Tris缓冲盐水(TBS)-右旋糖(20mM Tris-HCl缓冲液pH 7.5，本领域公知的，200NaCl，+5％右旋糖)、Tris缓冲盐水-吐温20(TBST)缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.5、200mM NaCl，+0.01％吐温20)或本领域已知的pH不低于6的任何生理缓冲液。

在本发明的优选实施方式中，本发明的方法的低盐缓冲液选自碳酸盐缓冲液、Tris缓冲液和磷酸盐缓冲液。

在本发明的特别优选的实施方式中，本发明的方法的低盐缓冲液是碳酸盐缓冲液，其包含浓度在100与300nM之间的碳酸氢钠。在本发明的另一特别优选的实施方式中，本发明的方法的低盐缓冲液是Tris缓冲液，其包含浓度在10与30nM之间的Tris。在本发明的方法的另一特别优选的实施方式中，本发明的低盐缓冲液是磷酸盐缓冲液，其包含总浓度在5mM与20mM之间的Na₂HPO₄和NaH₂PO₄。

在本发明的甚至更优选的实施方式中，本发明的方法的低盐缓冲液还包含右旋糖和/或甘油。

在本发明再更优选的实施方式中，本发明的方法的低盐缓冲液的pH在6.5与8.5之间。

在本发明的甚至更优选的实施方式中，本发明的方法的低盐缓冲液选自：

(i)166mM NaHCO₃，pH 7.4

(ii)20mM Tris，500mM NaCl，5％右旋糖，pH 7.4

(iii)140mM NaCl，7.5mM Na₂HPO₄，2.5mM NaH₂PO₄，10％甘油，pH 7.4

在本发明的另一方面中，本发明涉及包含多个拷贝的本发明第一方面的融合蛋白的纳米颗粒或根据用于制备纳米颗粒的本发明的方法或发明制备的纳米颗粒。

因此，本发明的纳米颗粒包含多个拷贝的本发明的融合蛋白的聚集体(aggregates)，这是由它们的结构中区域之间的静电相互作用而导致的，有利于它们在生理条件下进行非共价结合和偶联。由于本发明的用于制备纳米颗粒的方法包括将本发明的融合蛋白制剂(preparation)置于低盐缓冲液中，因此应理解，由此形成的纳米颗粒还包含多个拷贝的融合蛋白的聚集体。

在本发明的优选实施方式中，本发明的纳米颗粒的直径在10与100nm之间。

本发明的融合蛋白和纳米颗粒在医学中的用途

在另一方面中，本发明涉及用于医学的根据本发明的融合蛋白或纳米颗粒。在另一方面中，本发明涉及根据本发明的融合蛋白或纳米颗粒在治疗患有对形成本发明融合蛋白的部分的治疗剂有反应的疾病的患者中的用途。

如本文所用的，术语“治疗(treat，treatment和treating)”是指减少或改善状况、障碍或疾病的进展、严重性和/或持续时间，或改善状况、障碍或疾病的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨别的症状)。术语“治疗(treat，treatment和treating)”还指改善状况、障碍或疾病的不一定能被患者辨别的至少一种可测量的物理参数。此外，“治疗(treat，treatment和treating)”还指在物理上通过例如，稳定可辨别的症状，在生理上通过例如，稳定物理参数，或者在这两方面上抑制状况、障碍或疾病的进展。“治疗(treat，treatment和treating)”也可以指状况、障碍或疾病的减少或稳定。

本领域技术人员将理解，通过在医学中使用，本发明的融合蛋白或纳米颗粒可被施用于患者以诱导治疗反应。

治疗反应包括抑制、减少或停止(arrest)患者遭受的病理状况或疾病的原因；消除、减少、停止或改善状况或疾病的症状；或消灭、停止或减缓患者的状况或疾病的进展。

本领域技术人员将认识到，适用于医学的本发明的融合蛋白或纳米颗粒可以与药学上可接受的载体一起提供。如本文所用的，术语“药学上可接受的载体”是指任何类型的无毒、惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或配制辅料。Remington'sPharmaceutical Sciences.Ed.by Gennaro,Mack Publishing,Easton,Pa.,1995公开了用于配制药物组合物的各种载体及制备其的已知技术。

因此，包含本发明的融合蛋白或纳米颗粒和药学上可接受的载体的组合物是药物组合物。

本发明的药物组合物可以通过本领域已知的任何方式(包括口服途径和胃肠外途径)施用于患者。根据这样的实施方式，本发明的组合物可以通过注射(例如，静脉内、皮下或肌内、腹膜内注射)、直肠、阴道、局部(如通过粉末、乳膏、软膏或滴剂)或通过吸入(如通过喷雾)给予。

A-本发明的融合蛋白或纳米颗粒在治疗癌症中的用途。

本发明的另一实施方式涉及用于治疗癌症的本发明的融合蛋白和纳米颗粒、或其对应的药物组合物，其中聚阳离子肽是能够与细胞表面上的受体特异性相互作用的序列，所述序列能够促进融合蛋白内化至细胞中，其中表达受体的所述细胞是存在于癌症中的肿瘤细胞，并且其中治疗剂选自：

(i)化疗剂，

(ii)细胞毒性多肽，

(iii)抗血管生成多肽，

(iv)由肿瘤抑制基因编码的多肽，

(v)促凋亡多肽，

(vi)具有抗转移活性的多肽，

(vii)由能够激活针对肿瘤的免疫应答的多核苷酸编码的多肽，和

(viii)抗血管生成分子，

(ix)毒素。

如本文所用的，术语“治疗(treat，treatment和treating)”是指减少或改善癌症的进展、严重性和/或持续时间，或改善癌症的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨别的症状)。术语“治疗(treat，treatment和treating)”还指改善癌症的不一定能被患者辨别的至少一种可测量的物理参数(如肿瘤的生长)。此外，“治疗(treat，treatment和treating)”还指在物理上通过例如，稳定可辨别的症状，在生理上通过例如，稳定物理参数，或者在这两方面上抑制癌症的进展。“治疗(treat，treatment和treating)”也可以指肿瘤尺寸或癌细胞计数的减少或稳定。

术语“癌症”是指这样的一组疾病：涉及异常、不受控制的细胞生长和增殖(瘤形成)，有可能侵入或扩散(转移)到有机体的其他组织、器官或一般而言远处的部分；转移是癌症和癌性肿瘤的恶性的标志之一。癌细胞的异常生长和/或增殖是遗传因素和环境因素的改变其正常生理的组合的结果。癌细胞的生长和/或增殖异常导致生理障碍，并且在许多情况下，由于受影响的细胞类型、组织和器官的功能障碍或功能丧失，导致个体死亡。

术语“癌症”包括但不限于乳腺癌、心脏癌、小肠癌、结肠癌、脾癌、肾癌、膀胱癌、头癌、颈癌、卵巢癌、前列腺癌、腺癌、脑癌、胰腺癌、皮肤癌、骨癌、骨髓癌、血癌、胸腺癌、子宫癌、睾丸癌、肝胆系统癌和肝癌；除肿瘤之外，诸如但不限于腺瘤、血管肉瘤、星形细胞瘤、上皮癌、生殖细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、血管内皮瘤、血管肉瘤、血肿、肝母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、肝胆癌、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤和畸胎瘤。此外，此术语包括脚拇指恶性黑素瘤(acrolentiginousmelanoma)、光化性角化病、腺癌、腺样囊样癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞癌(adenosquamuscarcinoma)、星形细胞肿瘤、巴多林腺癌(前庭大腺癌，Bartholin gland carcinoma)、基底细胞癌、支气管腺癌、毛细血管类癌、癌、癌肉瘤、胆管癌(cholangiocarcinoma)、囊腺瘤、内胚窦瘤(endodermal sinus tumor)、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样腺癌(endometrioid adenocarcinoma)、室管膜肉瘤、尤文肉瘤、局灶性结节性增生(focalnodular hyperplasia)、生殖细胞肿瘤、成胶质细胞瘤、胰高血糖素瘤(glucagonoma)、血管母细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝腺瘤(hepatic adenoma)、肝腺瘤(hepaticadenomastosis)、肝细胞癌、肝胆(hepatobilliary)癌、胰岛瘤、上皮内瘤变(intraepithelial neoplasia)、鳞状细胞上皮内瘤变(squamous cell intraepithelialneoplasia)、浸润性鳞状细胞癌、大细胞癌、平滑肌肉瘤、黑素瘤、恶性黑素瘤、恶性间皮瘤、肌瘤(medulobastoma)、髓上皮瘤、黏液表皮样癌、神经母细胞瘤、神经上皮腺癌、结节状黑素瘤、骨肉瘤、乳头状浆液性腺癌(papillary serous adenocarcinoma)、垂体瘤、浆细胞瘤、假性肉瘤、肺母细胞瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌、微细胞癌、软组织癌、生长抑素分泌肿瘤、鳞状癌、鳞状细胞癌、未分化癌、葡萄膜黑素瘤、疣状癌(verrucous carcinoma)、血管活性肠肽瘤(vipoma)、肾母细胞瘤(维尔姆瘤，Wilm tumor)、脑内癌、头颈癌、直肠癌、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、微细胞癌和非微细胞癌、转移性黑素瘤、雄激素非依赖性转移性前列腺癌和雄激素依赖性转移性前列腺癌和乳腺癌。

因此，在本发明的优选实施方式中，治疗剂选自：

(i)细胞毒性多肽，

(ii)抗血管生成多肽，

(iii)由肿瘤抑制基因编码的多肽，

(iv)促凋亡多肽，

(v)具有抗转移活性的多肽，

(vi)由能够激活针对肿瘤的免疫应答的多核苷酸编码的多肽，

(vii)化疗剂，和

(viii)抗血管生成分子。

在本发明的更优选实施方式中，本发明的融合蛋白或纳米颗粒的抗肿瘤肽选自BAK、PUMA、GW-H1的BH3结构域、和白喉毒素I的活性片段、和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)外毒素A。

如本文所用的，“BAK”是指公知的属于Bcl-2蛋白家族的促凋亡因子，其通过胱天蛋白酶依赖性凋亡途径，通过使抗凋亡蛋白失活，使线粒体膜通透，因而释放细胞色素C和其他线粒体细胞死亡因子来触发细胞程序性死亡。[参见Llambi,F.等人2011.Mol.Cell,44:517-31]]。在一个实施方式中，BAK是指全长BAK(SEQ ID NO：41)。在其他实施方式中，BAK是指其含有功能性BH3结构域(SEQ ID NO：42)的其任何截短形式。

如本文所用的，“PUMA”是指以对应于SEQ ID NO：43的全序列为特征的蛋白质，此蛋白质是仅(Bcl-2同源3)BH3的蛋白质，其通过与Bcl-2家族的前体蛋白和抗凋亡蛋白相互作用而触发细胞死亡。

如本文所用的，GW-H1是指具有SEQ ID NO：14的序列的多肽，其通过折叠成两亲性螺旋而发挥其细胞溶解活性。

白喉毒素I(由白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)属细菌产生)(SEQ IDNO：44)和铜绿假单胞菌的外毒素(SEQ ID NO：45)属于ADP核糖化毒素家族。两种毒素都是作用于真核延伸因子2(eEF-2)的蛋白质，基本上抑制将其并入的细胞的翻译活性并诱导凋亡。两种毒素的结构均具有受体结合结构域(与细胞的表面受体结合并诱导胞吞作用；在白喉毒素的情况下，结合肝素结合表皮生长因子前体；在外毒素A的情况下，结合CD91)、易位结构域、和作用于eEF-2的催化结构域(Shapira,A.&Benhar,I.,2010,Toxins,2:2519-2583中提供了概述)。

在本发明的甚至更优选的实施方式中，本发明的融合蛋白或纳米颗粒的聚阳离子肽是CXCR4配体，并且待用本发明的融合蛋白或纳米颗粒靶向治疗的癌症的特征在于包含表达CXCR4受体的细胞。在更优选的实施方式中，表达或过表达CXCR4的癌细胞是转移性干细胞。如本文所用的，术语“转移性干细胞”是指负责转移起始和转移维持的细胞。

在本发明的再更优选的实施方式中，本发明的融合蛋白或纳米颗粒的CXCR4配体选自包括T22肽、VI肽、CXCL12肽、vCCL2肽或其功能上等同的变体的组。

在本发明的另一更优选的实施方式中，待用本发明的融合蛋白或纳米颗粒治疗的癌症选自胰腺癌和结直肠癌。

在本发明的另一优选实施方式中，本发明的融合蛋白和纳米颗粒用于治疗癌性肿瘤，其中癌性肿瘤是原发性肿瘤或转移。

***

将通过以下实例描述本发明，这些实例应被认为仅仅是示例性的，而不是对本发明范围的限制。

实施例

材料和方法

5'-二甲氧基三苯甲基-5-氟-2'-脱氧尿苷的合成

在干燥的吡啶中使5-氟-2'-脱氧尿苷(FdU)(3.2mmol)与二甲氧基三苯甲基氯(4.4mmol)反应。将溶液搅拌过夜，并蒸发溶剂。使用从纯CH₂Cl₂至CH₂Cl₂中10％甲醇的梯度，通过柱色谱法纯化残余物，得到期望的65％二甲氧基三苯甲基-5-氟-2′-脱氧尿苷(DMT-FdU)。

5'-二甲氧基三苯甲基-5-氟-2'-脱氧尿苷亚磷酰胺的合成

在减压下，通过用无水乙腈来蒸发干燥5'-二甲氧基三苯甲基-5-氟-2'-脱氧尿苷(1mmol)。接下来，在氩气下将产物溶解于无水CH₂Cl₂(20mL)中，并在排除水分的情况下加入二异丙基乙胺(5mmol)。用冰浴冷却溶液，并用注射器滴加2-氰基乙氧基-N,N-二异丙基氨基-氯膦(2mmol)。在室温下将溶液搅拌1h，然后，用CH₂Cl₂稀释溶液，并用饱和水性NaCl洗涤。用无水Na₂SO4干燥有机相后，蒸发溶剂并通过柱色谱法纯化产物。利用乙酸乙酯/己烷1:1中10％三乙胺的溶液，用硅胶填充柱，并用乙酸乙酯/己烷1:1至纯乙酸乙酯的梯度洗脱化合物。以70％的产率获得所需的亚磷酰胺。

5'-二甲氧基三苯甲基-5-氟-2'-脱氧尿苷官能化的固体载体的制备

通过用无水乙腈蒸发干燥DMT-FdU衍生物(0.4mmol)，并使其与琥珀酸酐(0.6mmol)和N,N-二甲基氨基吡啶(0.6mmol)在CH₂Cl₂(20mL)中反应。在室温下将反应混合物搅拌过夜。将反应混合物用30mL CH₂Cl₂稀释，并将溶液用饱和水性NaCl、10％柠檬酸水溶液洗涤，然后再用饱和水性NaCl洗涤。有机层经无水Na₂SO₄干燥并蒸发至干燥。获得作为白色固体的所得DMT-FdU半琥珀酸酯(89％产率)，并且用于下一步而无需进一步纯化。将DMT-FdU半琥珀酸酯衍生物并入长链烷基胺控制的孔径玻璃载体(LCAA-CPG)中。将氨基-LCAA-CPG(CPG New Jersey；450mg,70μmol氨基/g)置于装配有聚丙烯圆盘(disc)的聚丙烯注射器中，并依次用甲醇、CH₂Cl₂和乙腈洗涤。然后将溶解在0.6mL乙腈/CH₂Cl₂(1:3)混合物中的2,2'-二硫代双(5-硝基吡啶)(0.18mmol)加入乙腈中DMT-FdU半琥珀酸酯(0.9mmol)和N.N-二甲基氨基吡啶(0.18mmol)的溶液中(1.5mL)。接下来，加入三苯基膦(0.18mmol)并将混合物搅拌几秒钟，加入到载体中，并使其反应1h。用甲醇、CH₂Cl₂和乙腈洗涤载体并在真空下干燥。通过DMT定量(42μmol/g)来测定树脂的官能度。最后，在30min内用乙酸酐溶液处理固体载体，以封端未反应的氨基。

氟尿苷寡核苷酸(低聚-FdU)的合成

制备了两种五核苷酸序列：1)5'-(FdU)5-3'是对照FdU五聚体；和2)3'-硫醇化的FdU五聚体：具有FdU 5-氟-2'-脱氧尿苷和作为六乙二醇间隔区的HEG的5'-(FdU)5-HEG-丙基-SH 3'。为了合成对照5'-(FdU)5-3'五聚体，使用了用如上所述制备的DMT-FdU官能化的可控孔径玻璃(CPG)载体。然后，在DNA合成仪(392Applied Biosystems,Foster City,CA,美国)上通过连续添加DMT保护的FdU亚磷酰胺，利用1μmol的合成循环组装对照五聚体序列。序列组装后，在室温下用氨水(32％)处理寡核苷酸载体2小时，并通过HPLC纯化所得产物。HPLC条件：X-bridgeTM OST C18柱(10×50mm，2.5μm)；20分钟的从0％到40％的线性梯度，流速2mL/min；溶液A是0.1M水性乙酸三乙铵(TEAA)中的5％乙腈，而溶液B是0.1M水性TEAA中的70％乙腈。通过质谱分析法(MALDI-TOF)表征五聚体。

利用β-氰基乙基亚磷酰胺化学并遵循标准方案，在自动化的RNA/DNA合成仪上以1μm的规模合成几批五聚体FdU寡核苷酸。3'-硫醇-改性剂C3固体载体(Link Technologies)用于在3'-末端引入硫醇基，然后六乙二醇亚磷酰胺(hexaethyleneglycolphosphoramidite)(Glen Research,VA,美国)用作间隔区。最后，通过重复添加DMT保护的FdU亚磷酰胺来完成合成。序列组装后，在室温下用具有0.1M 1,4-二硫苏糖醇(DTT)的氨水(32％)处理寡核苷酸载体2小时。将氨溶液浓缩至干燥，并在使用前将产物在用水洗脱的NAP-10(Sephadex G-25)柱上脱盐。使用上述条件，通过HPLC分析五聚体FdU-HEG-SH的纯度(见图1)。通过在260nm处的吸收来定量五聚体，并通过MALDI质谱分析法(MALDI-TOF)确认。

T22-GFP-H6-FdU治疗性纳米缀合物的表征和药物/纳米粒子比的测定

T22-GFP-H6-FdU合成反应后获得的产物用质谱分析法表征，以测量其分子质量。通过在633nm下的动态光散射(Zetasizer Nano ZS,Malvern Instruments Limited,Malvern,Worcestershire,UK)来确定纳米颗粒的体积和尺寸分布。如33所述，在HitachiH-7000透射电子显微镜(TEM)中进行可视化之前，还使用经纯化的样品测量纳米缀合物的尺寸，将其稀释至0.2mg/mL，并通过在涂覆碳的网格中蒸发1nm铂层进行对比。通过分析T22-GFP-H6和T22-GFP-H6-FdU纳米缀合物的紫外光谱并计算每个T22-GFP-H6纳米颗粒的FdU分子数来获得药物与纳米颗粒的比。

CXCR4⁺海拉细胞中的T22-GFP-H6-FdU内化、CXCR4特异性和细胞毒性

评估T22-GFP-H6-FdU在第二细胞类型中内化的能力：CXCPv4⁺海拉人宫颈癌细胞系，在用10％FBS和2mM Glutamax(Gibco)补充的最小必需培养基中培养，通过将细胞暴露于1μm T22-GFP-H6-FdU浓度1小时，并在流式细胞仪FACS-Canto系统(Becton Dickinson)中测量内化的细胞发出的绿色荧光。为了评估CXCR4受体介导的内化的特异性，如先前关于T22-GFP-H6所描述的，在暴露于纳米缀合物之前，进行以1:10(蛋白质：拮抗剂)的摩尔比温育CXCR4⁺海拉细胞与CXCR4拮抗剂AMD3100(八盐酸盐水合物，Sigma-Aldrich)1小时的竞争研究。

使用共聚焦显微镜评估T22-GFP-H6-FdU亚细胞定位。简而言之：为了进行共聚焦分析，将细胞培养在培养皿(Mat-Tek Co.)上；然后，在用L-谷氨酰胺补充的OptiPro培养基中加入T22-GFP-H6-FdU。核用Hoechst 33342(Life Technologies)标记，而质膜用CellMaskTM Deep Red(Life Technologies)标记。通过TCS-SP5共聚焦激光扫描显微镜(Leica Microsystems,Wetzlar,德国)拍摄显微照片，并使用Imaris软件(Bitplane)生成T22-GFP-H6-FdU定位的3D模型。

还通过使用MTT代谢测试(Roche)研究了T22-GFP-H6-FdU的细胞毒活性。为此目的，将CXCR4⁺海拉细胞暴露于1-1,000nM浓度范围的T22-GFP-H6-FdU并在48小时测量其与等分子浓度或游离低聚-FdU相比的活力。之后，构建了显示线性化的T22-GFP-H6-FdU剂量-响应趋势线表示的图，以比较两种化合物的细胞活力。还通过暴露于1μm T22-197 GFP-H6-FdU 48h的海拉细胞的光学显微镜图像确定了细胞活力的降低,如与T22-GFP-H6或游离FdU相比的。

CCR模型和用于治疗已建立的转移的方案的产生

使用瑞士裸鼠中的CXCR4⁺SW1417同位CCR模型来评估对已建立的转移的可能抑制。T22-GFP-H6-FdU给予开始于肿瘤细胞植入后两个月(当小鼠体内已经存在转移时，使用IVIS光谱，通过生物发光图像进行测量)。为此目的，将32只瑞士裸鼠随机分为四组(缓冲液、T22-GFP-H6-FdU、T22-GFP-H6和游离FdU五聚体(n＝10/每组)。每种化合物(T22-GFP-H6-FdU：20ug，T22-GFP-H6：20ug，等分子剂量的游离低聚-FdU或缓冲液)单次静脉内剂量每三天进行给予，总共10剂。当使缓冲液处理组的第一只动物安乐死后，实验结束。

抗转移作用的评估

处理方案中所应用的相同评估用于防止转移。简而言之，在尸检时，记录每只小鼠所有器官中可见转移的数量和尺寸，使用

200-Spectrum对在靶器官中发射生物发光的转移灶的数量进行离体计数，并进行组织病理学和免疫组织化学分析来确认转移的位置和数量。

骨髓和循环血细胞中的T22-GFP-H6-FdU生物分布和毒性

在以10-100μg剂量给予T22-GFP-H6-FdU后5小时，在骨髓和循环血细胞中测量荧光发射，评估T22-GFP-H6-FdU摄取。在尸检时，提取骨髓并在

200-Spectrum设备中进行离体记录。通过在上颌丛(maxillary plexus)中进行点刺(punction)来收集小鼠血液。使用标准方案，通过Ficoll密度梯度法分离红细胞、白细胞和血小板。此外，通过以600g，10min离心分离的细胞提取物来获得沉淀，然后使用

200-Spectrum进行记录以测量荧光。

T22-GFP-H6-FdU治疗性纳米缀合物的合成。

通过共价结合靶向载体T22-GFP-H6(使用重组DNA策略在细菌中产生的蛋白质纳米颗粒)和低聚-FdU(氟尿苷(5-氟-2'-脱氧尿苷)的五聚寡核苷酸)(Sigma AldrichChemie GmbH,Steinheim,德国)来合成纳米缀合物，两者在缀合之前均已功能化。如图1所述，用巯基使低聚-FdU官能化。按照Hermanson[Hermanson,G.2013.BioconjugateTechniques,第3版,ISBN9780123822390,Academic Press,London,pp.1200]描述的蛋白质的生物功能化方案，通过与连接体MBHS(4-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)(Thermo Fisher)反应来使T22-GFP-H6功能化。此连接体结合T22-GFP-H6蛋白的外部赖氨酸的氨基，从而添加马来酰亚胺基。使用马来酰亚胺官能化的T22-GFP-H6与低聚-FdU-硫醇反应，获得最终的T22-GFP-H6-FdU纳米缀合物(迈克尔反应)。最终反应产物通过透析纯化。图1描述了使用硫醇进行的低聚-FdU的功能化表征和理化表征。图2描述了T22-GFP-H6-FdU的合成的反应产物的理化表征和功能表征。

基于1mg/ml的T22-GFP-H6缀合物溶液和1mg/ml的T22-GFP-H6-FdU缀合物溶液在260nm的紫外线下的吸光度，确定所得纳米缀合物中的低聚-FdU与T22-GFP-H6的比。两种溶液之间吸光度的差提供了存在于T22-GFP-H6-FdU溶液中的FdU分子的吸光度。考虑朗伯比尔定律(Abs＝mg/ml*E*L其中E＝44500M^-1.Cm^-1)和T22-GFP-H6蛋白的分子量(MW＝30,691KDa)，确定每mg T22-GFP-H6蛋白的FdU摩尔数。考虑到T22-GFP-H6的吸光度约为每mg蛋白0.7，以及T22-GFP-H6-FdU的吸光度约为每mg融合蛋白7.32，结果显示4.56个分子的低聚-FdU与每个融合蛋白结合。

体外的T22-GFP-H6-FdU内化、CXCR4特异性和CXCR4⁺细胞中的细胞毒性。

将CXCR4+SW1417-luc CRC细胞在用10％胎牛血清(Gibco)补充的改良Eagle培养基(Gibco,Rockville,MD)中培养，并在37℃下和5％CO₂的潮湿环境中温育。通过将CXCR4+SW141-luc细胞(表达荧光素酶报告基因)暴露于1mM T22-GFP-H6-FdU浓度1小时，用1mg/mL胰蛋白酶(Gibco)将其处理15分钟，并使用15mW风冷氩离子激光器，在488nm激发下在流式细胞仪FACS Canto系统(Becton Dickinsonm Franklin Lakes,NJ)中测量内化的纳米缀合物颗粒发射的绿色荧光来评估纳米缀合物的内化能力。用D检测器(530/30nm带通滤波器)测量荧光发射。为了评估CXCR4受体介导的内化的特异性，进行了竞争研究：将CRC SW1417细胞与CXCR4拮抗剂AMD3100(Sigma Aldrich)以1:10(蛋白质：拮抗剂)的摩尔比温育1h，然后将其暴露于1mM纳米缀合物又一小时。

为了评估T22-GFP-H6-FdU的亚细胞定位，将细胞在MatTek培养皿(MatTekCorporation,MA,美国)中培养；然后，在用L-谷氨酰胺补充的OptiPro培养基中加入T22-GFP-H6-FdU。用0.2μg/mL Hoechst 33342(Molecular Probes,Eugene,OR)标记核，用2.5μg/mL CellMaskTM Deep Red(Molecular Probes)在黑暗中标记质膜10分钟。在磷酸盐缓冲盐水(Sigma-Aldrich)中洗涤细胞。如所述的，使用Plan Apo 63×/1.4(油HC×PLAPOλ蓝)物镜，通过TCS-SP5共聚焦激光扫描显微镜(Leica Microsystems,Heidelberg,德国)记录活细胞。为了确定细胞内的颗粒定位，收集每0.5μm细胞厚度的10-20个切片的堆叠，并使用Imaris版本6.1.0软件(Bitplane,Zurich,瑞士)产生三维模型。

T22-GFP-H6-FdU细胞毒性活性也通过测量细胞活力并利用代谢测试3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)(MTT,Roche,Basilea,瑞士)(遵循制造商的建议)进行了研究。为此目的，将SW1417 CRC细胞暴露于1.0-1,000nM浓度范围的T22-GFP-H6-FdU，并测量其在72小时与等分子浓度的T22-GFP-H6或游离低聚-FdU相比的生存能力。然后构建剂量-响应曲线，并使用Sigmaplot vs.10.0软件确定每种化合物的线性化T22-GFP-H6-FdU剂量-响应趋势线。

CRC小鼠模型的产生。

使用了三种不同的CRC小鼠模型：一种是通过皮下CRC细胞植入以研究纳米缀合物的生物分布和CRC凋亡的诱导所产生的，而另两种是通过同位细胞植入以研究纳米缀合物的生物分布和抗转移作用(用于防止转移或用于诱导已建立的转移的消退)所产生的。为了产生这些模型中的两种，使用了五周大的瑞士裸鼠，而在一种模型中，使用了NOD-SCID小鼠。它们都是体重为18至20g的雌性小鼠(Charles River,L’Arbresle,法国)，并且被随意饲养在提供了寝具(bedding)、水和经过γ射线灭菌的食物的无菌环境中。实验获得了圣十字圣保罗医院(Hospital de la Santa Creu i Sant Pau)的小鼠道德委员会(MouseEthics Committee)的批准。

皮下(SC)小鼠CRC模型。

通过在小鼠侧面(flank)注射重悬于250μl培养基中的1×10⁷CXCR4⁺人SW1417-luci CRC细胞(表达荧光素酶，以允许对肿瘤生长进行生物发光跟踪(follow-up))来产生皮下CRC模型。当肿瘤达到700mm³时，将其切除并通过trocher系统将SC肿瘤等分试样(3x3x3mm)植入一组小鼠中。SC模型用于评估肿瘤摄取和纳米缀合物的内化以及利用CXCR4拮抗剂AMD3100的共同给予进行体内竞争研究。如下所述，它还用于确定DNA双链断裂的诱导、肿瘤细胞凋亡以及在治疗后随时间仍留在肿瘤组织(CXCR4⁺CCF)中的CXCR4⁺癌细胞的分数。然后这些数据用于设计随后实验中所需的纳米缀合物重复剂量疗法的剂量间隔，以确定其抗转移作用。

用于研究已建立的转移的消退的同位(ORT)CRC小鼠模型。

用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉瑞士裸鼠，通过剖腹手术使其盲肠外露。将2×10⁶CXCR4⁺SW1417-luci CRC细胞(表达荧光素酶，以允许在治疗结束时对受影响器官中的转移灶进行离体生物发光识别)悬浮在50ml的改良Eagle’s培养基中，并装入无菌微量移液管中。在双目镜下，以大约30°角缓慢注入细胞悬浮液，并将其尖端(末梢，tip)引入盲肠壁5毫米。之后，在移液管轴线方向上，在距注射点大约2mm处用棉签略微施加压力。移出移液管，并用3％的碘清洁注射周围的区域。注射后，将肠返回腹腔并用手术吻合钉(staples)闭合。此模型用于评估T22-GFP-H6-FdU纳米缀合物诱导已建立的转移的消退的能力。

同位(ORT)CRC小鼠模型研究转移的防止。

在接受了SW1417-luci CRC细胞的脑内微注射(ORT)的NOD/SCID小鼠中产生高效的转移模型，所述细胞是从先前在不同组的NOD/SCID小鼠中产生的SC肿瘤中分离的。因此，产生了SC+ORT模型：当SC肿瘤达到700mm³的体积时，通过颈椎脱位处死小鼠并切除肿瘤，丢弃坏死区域。然后将300mg存活的肿瘤组织切成片，并以0.05％胰蛋白酶(Invitrogen)和100mg/ml DNase(Sigma-Aldrich)的混合物分解。用10ml移液管将混合物吸打30次，并在37℃下振荡温育10分钟。然后将其用10ml、3ml和1ml移液管再吸打30次，并在37℃下再振荡温育5分钟。然后重复此重复吸打步骤。通过细胞过滤器过滤所获得的SW1417单细胞悬浮液，并在计数细胞之前以1000g离心10分钟。然后按照上述方法，将先前在培养物中生长并重悬于50μl培养基中的2×10⁶个细胞微注射到每只小鼠的盲肠中。此模型用于评估T22-GFP-H6-FdU纳米缀合物防止转移发展的能力。

‘体内的’T22-GFP-H6-FdU肿瘤摄取、肿瘤细胞内化和DNA损伤和凋亡的诱导。

与缓冲液、T22-GFP-H6(未靶向的纳米缀合物)和低聚-FdU(未缀合的游离药物)相比，在将100mg T22-GFP-H6-FdU作为静脉内单次弹丸(推注，bolus)给予后，利用SC CXCR4⁺SW1417 CRC模型评估T22-GFP-H6-FdU纳米缀合物到CXCR4⁺肿瘤细胞的细胞溶胶的内化。给予后2小时、5h和24h，对小鼠进行安乐死以切除肿瘤，并使用

200-Spectrum(PerkinElmer,MA,美国)对生物分布到肿瘤组织的纳米缀合物所发射的绿色荧光强度进行离体记录。随后，获取、加工肿瘤组织样品并使用抗GFP抗体(1:300；Santa-Cruz Biotechnology,CA,美国)进行免疫组织化学(IHC)，以确定是否存在相应的纳米缀合物进入肿瘤细胞的细胞溶胶。还使用抗gH2AX mAb(1:400,Novus Biologicals,Cambridge,UK)，通过IHC测量双链断裂(DSB)的形成，并在每只小鼠的不同肿瘤切片的五个放大视野中计数染色细胞的数量。最后，在给予等分子剂量的低聚-FdU或缓冲液后24小时，比较了T22-GFP-H6-FdU诱导凋亡的能力。使用Olympus DP73数码相机和CellD Imaging 3.3程序(Olympus,日本东京)，通过对肿瘤组织切片进行Hoechst染色来确定核浓缩和对每个肿瘤的不同切片的五个高倍放大视野中浓缩的或碎片化的(defragmented)核的数量进行计数来评估凋亡。

通过给予T22-GFP-H6-FdU后CXCR4+肿瘤细胞数的变化来定义最佳剂量间隔。

使用SC SW1417小鼠模型来确定纳米缀合物诱导肿瘤组织中DNA损伤和凋亡的能力，以及治疗后肿瘤细胞膜中CXCR4表达的动力学——涉及表达CXCR4的肿瘤细胞的分数及其强度，因为CXCR4⁺是纳米缀合物的靶细胞。为此目的，在单次静脉内弹丸给予00μg T22-GFP-H6-FdU后24、48、72h，对小鼠进行安乐死并取出肿瘤样品，随后将其固定并石蜡包埋，以用抗CXCR4抗体(1:300,Abcam,英国)，利用IHC确定表达CXCR4的肿瘤细胞的水平和百分数。用等分子剂量的T22-GFP-H6、游离低聚-FdU或缓冲液处理小鼠，其中还测定了在不同时间点处肿瘤组织中CXCR4表达的水平。肿瘤细胞中CXCR4表达的动力学结果用于建立用以评估抗转移作用的重复剂量方案中最佳的T22-GFP-H6-FdU纳米缀合物给予间隔。

用于评估T22-GFP-H6-FdU对转移消退的诱导的处理方案。

使用在瑞士裸鼠中开发的同位和转移性CRC模型进行转移消退实验。将40只小鼠随机分为四组：缓冲液、T22-GFP-H6、T22-GFP-H6-FdU和游离低聚-FdU(n＝10/组)，并以如下等分子剂量重复静脉内弹丸给予：T22-GFP-H6-FdU 20μg、游离低聚-FdU：2.6nmol、或缓冲液)，每三天一次(q3d)，共10剂。T22-GFP-H6-FdU给予是在肿瘤细胞植入后两个月开始的，在之前的实验中确定当时存在淋巴结和肺转移(图3)。当必须对缓冲液处理组的第一只动物进行安乐死时，实验结束。参见下文研究的参数以评估抗转移作用。

用于评估T22-GFP-H6-FdU的防止转移作用的处理方案。

在NOD/SCID小鼠中建立的SC+ORT转移性CRC模型用于评估纳米缀合物防止转移的能力。将34只小鼠随机分为三组：缓冲液(n＝11)、T22-GFP-H6-FdU(n＝12)和游离低聚-FdU(n＝11)，并以如下等分子剂量重复静脉内弹丸给予：T22-GFP-H6-FdU 20ug、游离低聚-FdU：2.6nmols、或缓冲液)，每三天一次(q3d)，共12剂。在肿瘤细胞植入后一周，转移性扩散出现之前，开始给予T22-GFP-H6-FdU(图3)。当必须对缓冲液处理组的第一只动物进行安乐死时，实验结束。

在治疗结束时评估抗转移作用并确定肿瘤组织中CXCR4+癌细胞分数。

在消退转移实验和防止转移实验结束时，采用相同的方法来确定T22-GFP-H6-FdU的抗转移作用。尸检时，记录所有比较组中每只小鼠的预期以结直肠癌扩散的器官(淋巴结、肝、肺和腹膜)中可见转移的数量和尺寸。还使用

200-Spectrum(Perkin-Elmer)在靶器官中针对转移进行发射生物发光的转移灶数量(源自SW1417-luci CRC细胞)的离体计数。收集并加工用于组织病理学和免疫组织化学分析的样品。两名独立的观察者分析了H&E染色的样本，以对每只小鼠的每个器官的三个(防止转移实验)或六个(消退转移实验)切片中所有观察到的转移灶的数量进行计数并测量尺寸。拍摄图像并使用具有CellDOlympus软件(v3.3)的Olympus显微镜进行测量。如上所述，用抗CXCR4抗体，利用IHC测定肿瘤组织中的CXCR4表达来测定治疗后肿瘤组织(CXCR⁴⁺CCF)中仍存留的CXCR4⁺癌细胞(包括原发性肿瘤和位于受转移影响的不同器官(腹膜、肝、肺和淋巴结)的转移灶)的分数。所获得的结果用于研究在不同位点处CXCR4⁺CCF与抗转移作用之间的可能相关性。

正常器官中T22-GFP-H6-FdU的生物分布和毒性。

利用上述方法学，通过测量由纳米缀合物的GFP结构域发射的绿色荧光以及正常(非肿瘤)组织中的DNA DSB和凋亡诱导来评估T22-GFP-H6-FdU摄取。此外，两名独立的观察者评估了在H&E染色的非肿瘤组织样本中观察到的可能的组织病理学改变，从而寻找毒性迹象。这些组织包括纳米缀合物可能会在其中积累的表达CXCR4的器官(尽管此受体的表达水平显著低于肿瘤组织中的表达水平)，如骨髓和脾，并且对非表达CXCR4的器官(尤其是未缀合的低聚-FdU在其中积累的那些器官(如肝))中的毒性也进行了评估。

统计学分析。

为了分析受影响小鼠的对照组和实验组之间在不同器官的转移率方面的差异，使用了Fisher精确检验。使用Mann-Whitney检验来比较各组中受影响器官中转移灶的数量和尺寸。所有定量值均表示为平均值±SE，并使用SPSS 11.0版(IBM,New York,美国)进行统计学检验。组间差异被认为是显著的，p＜0.05。

实施例1：HS-低聚-FdU的理化表征

通过在260nm处的吸收来定量官能化的五聚体FdU-HEG-SH并通过MALDI质谱分析法(MALDI-TOF)确认，从而获得1976.2的MW，预期MW是1974.0。由质谱分析法(MALDI-TOF)表征的对照五核苷酸(游离低聚-FdU)获得1476.5的MW，预期MW是：1478.1。

实施例2：T22-GFP-H6-FdU纳米缀合物的理化表征和药物与纳米颗粒之比的确定

通过MALDI-TOFF光谱对缀合产物进行分析，识别出具有图2所示的MW的结合到纳米颗粒的一分子或两分子的FdU的五寡核苷酸相对应的峰。通过动态光散射来确定T22-GFP-H6-FdU的尺寸为14.6+0.14，相比而言，对照T22-GFP-H6纳米颗粒的尺寸为13.4+0.11，这个尺寸与通过透射电子显微镜测定的尺寸一致。通过SEC-MALS测定的T22-GFP-H6纳米颗粒的分子量为477kDa。考虑到T22-GFP-H6多肽的分子量为30,691kDa，这导致每个纳米颗粒具有大约15个单体。基于T22-GFP-H6和T22-GFP-H6-FdU纳米缀合物的UV光谱，对于在T22-GFP-H6-FdU纳米缀合物合成反应中获得的产物而言，获得的药物/纳米颗粒之比为60。此产物平均包含4分子的五聚体低聚-FdU，当组装成含有15个融合蛋白单体的纳米颗粒时，每个T22-GFP-H6纳米粒子对应总共60个FdU分子。

实施例3：一种靶向CXCR4⁺CRC细胞的纳米缀合物T22-GFP-H6-FdU的开发

先前已经证明，过表达CXCR4(CXCR4⁺)的结直肠癌(CRC)细胞具有转移起始能力(metastasis initiation capacity)(MIC)[Croker,A.K.&Allan,A.L.2008.J Cell MolMed 12,374-390；Zhang,S.S.等人2012.BMC Med 10,85(2012)]，并且CXCR4的下调对MIC的抑制作用[Murakami,T.等人2012.BMC Med 10,85；Wang,T.B.等人2014.Int J Oncol 44,1861-1869]将这些细胞鉴定为转移性干细胞(MetSC)。在此基础上，发明人产生了靶向CXCR4的纳米缀合物以评估其是否可以通过选择性消除CXCR4⁺CRC细胞来达到抗转移作用。图1、2和4a-c中描述了这种新的T22-GFP-H6-FdU纳米缀合物的结构和理化表征。缀合物含有T22(靶向CXCR4受体的配体)、绿色荧光蛋白(允许其进行体内跟踪)和具有针对CRC31的药物活性的寡核苷酸——低聚-FdU，其使得大量药物分子装载到纳米缀合物中。T22-GFP-H6-FdU是通过用硫醇使低聚-FdU功能化来合成的(图4c和图1a)，其随后一旦与化学偶联剂结合就被缀合到T22-GFP-H6蛋白纳米颗粒(图4c)。发明人通过HPLC、UV光谱法和MALDI-TOF(图1b-e)对HS-低聚-FdU进行了物理化学表征，并通过MALDI-TOF、动态光散射(DLS)和场发射扫描电子显微镜(FESEM)对最终的T22-GFP-H6-FdU产物进行了表征(图2a-c)。此产物的药物/纳米颗粒(DNR)之比大约是40(图2)，尺寸比T22-GFP-H6略高(14.66+0.14nm)，并保持了其自组装能力(图2d)。此外，其尺寸大于肾滤过截留值(cut-off)(6-7nm)，从而确保了在血液中的高再循环时间，这是有效的靶向药物递送的要求。

还使用反向法来产生T22-GFP-H6-FdU，其中首先用化学偶联剂使T22-GFP-H6官能化，然后与硫醇官能化的低聚-FdU接触。然后通过MALDI-TOF和动态光散射(DLS)对使用此法获得的缀合物(被称为T22-GFP-H6-FdU反向)进行物理化学表征(图13A和B)。

实施例4：T22-GFP-H6-FdU在体外选择性内化并杀死CXCR4⁺CRC细胞

随后，发明人评估了所装载的低聚-FdU在维持其CXCR4靶向能力的同时是否赋予纳米颗粒细胞毒性活性，前提是药物缀合可以改变蛋白质构象和功能。T22-GFP-H6-FdU在人CXCR4⁺SW1417 CRC细胞中内化(正如使用流式细胞术通过荧光发射测定的(图4d))，并在其细胞溶胶中积累和运输(正如通过共聚焦显微镜观察的(图4e))。由于AMD3100CXCR4拮抗剂能够下调膜中的CXCR4受体并完全阻断纳米缀合物的内化，因此纳米缀合物还维持了对用于内化的CXCR4的依赖性(图1d)。另外，正如通过细胞活力(图4f)或相差显微镜(图1g)所测量的，相同细胞中T22-GFP-H6-FdU诱导的细胞毒性显著高于游离低聚-FdU诱导的细胞毒性。发明人证实了人CXCR4⁺海拉细胞中的CXCR4依赖性纳米缀合物内化和比游离低聚-FdU更高的细胞毒性(图5a-d)。

使用反向法获得的T22-GFP-H6-FdU反向缀合物的特征还在于其对CXCR4+海拉细胞的细胞毒性作用(图13C)。

实施例5：T22-GFP-H6-FdU在体内选择性靶向CXCR4⁺CRC细胞

一旦确立了T22-GFP-H6-FdU体外活性的CXCR4依赖性，发明人就在皮下(SC)CXCR4⁺SW1417 CRC模型中通过以下方式研究纳米缀合物在将其静脉内给予后是否可以实现靶向药物递送：评估其关于肿瘤组织摄取的选择性和CXCR4依赖性、过表达CXCR4的MetSC(靶细胞)中的内化、细胞毒性药物FdU的细胞内释放和CXCR4⁺MetSC的选择性杀死(图6a)。在小鼠中注射100mg剂量后5小时，T22-GFP-H6-FdU显示出选择性肿瘤摄取，如通过荧光发射所测量的(图6b)，如针对T22-GFP-H6所示[Céspedes,M.V.等人2016.Nanomedicine.12,1987-1996.]。此外，如通过抗GFP免疫组织化学(IHC)所测量的，T22-GFP-H6-FdU和T22-GFP-H6均内化到CXCR4⁺肿瘤细胞的细胞溶胶中(图6c)，这是一种无法在缓冲液或游离低聚-FdU阴性对照中检测到的信号。另外，在纳米缀合物之前向小鼠给予CXCR4拮抗剂AMD3100，完全阻断了其肿瘤摄取(图6d)以及其在CXCR4⁺癌细胞中的内化(图6e-f)。因此，纳米缀合物以CXCR4依赖性方式不仅实现了选择性的肿瘤生物分布，而且还实现了其到靶CXCR4⁺癌细胞的细胞溶胶中的特异性内化。

实施例6：T22-GFP-H6-FdU实现靶向药物递送，导致CRC肿瘤中CXCR4⁺CRC细胞的选 择性消耗。

接下来，使用相同的SC CRC模型评估通过纳米缀合物实现的CXCR4⁺靶癌细胞选择性内化到细胞溶胶中是否导致选择性的FdU递送。发明人还评估了所递送的FdU是否可以诱导DNA损伤和凋亡从而引发CXCR4⁺肿瘤细胞的特异性消除，以及这些作用是否与通过游离低聚-FdU实现的作用不同。为此目的，H2AXg IHC用于测量DNA双链断裂(DSB)的产生，因为DSB介导FdU抗肿瘤活性38。T22-GFP-H6-FdU治疗后5小时，肿瘤中DSB灶的数量(22.8±1.4)显著高于(p＝0.02)游离低聚-FdU治疗后的数量(13.4±0.7)，而T22-GFP-H6或缓冲液处理的小鼠中未检测到DSB(图7a)。T22-GFP-H6-FdU对DSB的诱导表明它在靶细胞中释放FdU以到达核且并入到DNA中以诱导DNA损伤的能力。此外，增加的DSB导致更高的抗肿瘤活性，因为如通过Hoechst核浓缩或碎片化测量的，在T22-GFP-H6-FdU注射后24h(13.9±0.5)，肿瘤组织中的凋亡体(apoptotic figures)的数目显著比游离低聚-FdU(7.1±0.6)、T22-GFP-H6(3.0±0.3)或缓冲液(1.9±0.4)处理后更高(p<0.05)(图7a)。

随后，使用SC CXCR4⁺SW1417 CRC模型，在单次100mg T22-GFP-H6-FdU剂量后，随时间测量与游离低聚-FdU相比肿瘤组织中存留的CXCR4⁺癌细胞(CXCR4⁺CCF)的分数。在治疗之前，两组均显示出肿瘤组织中相似的CXCR4⁺CCF(图7b)；然而，在T22-GFP-H6-FdU处理后，在24h时CXCR4⁺CCF降低，而在48h时变得检测不到(图7b)。因此，给予T22-GFP-H6-FdU后48小时实现了在体内对CXCR4⁺肿瘤细胞的选择性消除。相比而言，在等摩尔剂量的游离低聚-FdU后，肿瘤组织中的CXCR4⁺CCF随时间仍类似于其基础水平。综上，这些结果表明：如DNA损伤和肿瘤细胞死亡的增强所表明的，T22-GFP-H6-FdU实现了对肿瘤组织的选择性生物分布和FdU向靶CXCR4⁺癌细胞的递送，这与选择性消除CXCR4⁺癌细胞有关，因此实现了将FdU靶向递送至靶癌细胞。

实施例7：暂时的靶细胞消除和重复T22-GFP-H6-FdU注射的剂量间隔的限定

尽管T22-GFP-H6-FdU在将其给予后48小时在肿瘤组织中实现了CXCR4⁺靶细胞的选择性消耗，但发现这种作用是暂时的，因为在肿瘤组织中注射后72h，CXCR4⁺癌细胞分数变得类似于其在治疗之前的水平(图7b)。相比而言，在游离低聚-FdU治疗后，肿瘤组织中的CXCR4⁺CCF随时间保持，在处理后24h、48h或72h，与治疗前相同(图7b)。因此，与T22-GFP-H6-FdU作用相反，通过游离低聚-FdU杀死癌症没有显示出对CXCR4⁺癌细胞的选择性。基于这些结果，并且为了评估T22-GFP-H6-FdU的抗转移作用，发明人将其在重复剂量时间表中的最佳给予间隔限定为72h(3天)。预期此时间表将在处理期间维持原发性肿瘤和转移灶中仍存留的CXCR4⁺癌细胞(CXCR4⁺CCF)的分数足够低，从而有效地阻断转移性扩散和/或灶生长，前提是CXCR4⁺癌细胞充当MetSC。通过在瑞士裸鼠中使用产生淋巴结(LN)和肺转移(图3a)的同位生物发光CXCR4⁺CRC模型，并在CRC细胞植入后2个月开始以20mg静脉内q3d剂量治疗(图3b)，通过与等分子剂量的T22-GFP-H6或游离低聚-FdU进行比较来评估T22-GFP-H6-FdU抑制已建立的转移的生长的能力。还通过使用同位发光CXCR4⁺CRC NOD/SCID模型，在CRC植入后一周开始给药(图3d)，来评估T22-GFP-H6-FdU与游离寡核苷酸-FdU相比防止转移的能力，此模型在LN、肝、肺和腹膜处具有提高的转移效率和扩散性(图3c)。

实施例8：T22-GFP-H6-FdU防止转移发展并诱导已建立的转移的消退

在防止转移实验结束时，并且与游离低聚-FdU作用相反，如通过离体发光所测量的，T22-GFP-H6-FdU阻断了转移在肝和肺中的发展(图8a)。在实验结束时，组织学分析显示，与游离低聚-FdU处理的小鼠相比，T22-GFP-H6-FdU处理的小鼠腹膜(p＝0.0001)中转移总数减低了10.3倍，并且肝(p＝0.001)或肺(p＝0.006)中转移总数降低了3.1-3.7倍，但它并未防止LN转移(图8b)。比较两组之间每只小鼠腹膜、肝或肺的平均病灶数，获得了相似的结果(表1)。

·在3个随机选择的组织学切片中计数的每只小鼠的平均值+SE转移灶数

·游离-低聚-FdU：等分子剂量的游离低聚-FdU

·^ap＝0.04；^bp＝0.01；^cp＝0.001；^dp＝0.002；^ep＝0.006；^fp＝0.002；^gp＝0.006。

纳米缀合物诱导的平均病灶尺寸减少见表2。

·在6个随机选择的组织学切片中计数的每只小鼠的平均值+SE病灶数

·游离-低聚-FdU：等分子剂量的游离低聚-FdU

·^hp＝0.03；ⁱp＝0.01；^jp＝0.04；^kp＝0.03；^lp＝0.03；^mp＝0.04

表1.T22-GFP-H6-FdU在防止转移实验和消退转移实验中的抗转移作用，以每只小鼠平均灶数的减少为量度

重要的是，与T22-GFP-H6-FdU不同，与缓冲液处理的动物相比，游离低聚-FdU并未减少任何位点(LN、肝、肺、腹膜)的总灶数(图8b)或平均灶数(表1)。此外，与游离低聚-FdU相比，T22-GFP-H6-FdU还引起腹膜灶尺寸减少2.4倍(p＝0.01)(表2)。

*每组的所有鼠中患有原发性肿瘤的小鼠数量

**每组小鼠总数中受转移影响的小鼠数量

&平均值+SE转移灶尺寸

^ap＝0.05；^bp＝0.012；^cp＝0.05；^dp＝0.036；^ep＝0.009；^fp＝0.032；^gp＝0.002；^hp＝0.01

T22-GFP-FdU、游离低聚-FdU或缓冲液诱导的总灶数的减少参见表1

表2.在防止转移实验结束时，T22-GFP-FdU、游离低聚-FdU或缓冲液处理的小鼠中携带转移灶的小鼠数量和观察到的转移灶的尺寸

在消退转移实验结束时，与游离-低聚-FdU(p＝0.04)、T22-GFP-H6(p＝0.03)、或缓冲液(p＝0.03)处理的小鼠相比(图9b)，T22-GFP-H6-FdU处理的小鼠记录了如通过离体发光发射(图9a)所测量的较低数量的肺转移或组织学切片中总肺灶计数的减少。当比较各组中每只小鼠的肺灶数平均值时，获得了相似的结果(表1)。T22-GFP-H6-FdU处理的小鼠也记录了与缓冲液处理的小鼠(p＝0.03)相比的显著更低的淋巴结转移数量；然而，其作用与游离低聚-FdU所实现的作用相似(图9b和表1)。总之，重复给予T22-GFP-H6-FdU有效地阻止腹膜、肝和肺中的转移发展，而游离低聚FdU不阻止任何位点的转移。此外，T22-GFP-H6-FdU在诱导已建立的肺转移的消退方面比游离低聚-FdU更有效。有趣的是，在防止转移实验(图10a、b)或消退转移实验193(图10c、d)中，T22-GFP-H6-FdU和游离低聚-FdU对原发性肿瘤的生长均表现出正如通过在体内随时间推移或在体外于实验结束时通过发光发射所测量的相似的抑制作用。

实施例9：位点依赖性CXCR4调节、T22-GFP-H6-FdU CXCR4⁺细胞靶向和抗转移作用

基于T22-GFP-H6-FdU在防止转移实验中获得的明确的位点依赖性抗转移效力(图8b和表1)、基于其对用于细胞内化的CXCR4膜表达的依赖性(图2e)和基于其选择性杀死CXCR4⁺癌细胞的能力(图7a、b和图5a)，发明人研究了治疗后所记录的CXCR4表达是否与在不同位点观察到的抗转移作用相关。通过用抗CXCR4 IHC进行检测而观察到实验结束时转移灶中CXCR4⁺CCF的位点依赖性降低(与基础水平相比)，而纳米缀合物在腹膜中敏感性较高，在肝和肺中居中，以及在无反应的淋巴结中不存在(图8c-d)，这与不同位点处的抗转移作用相关(图8b)。与T22-GFP-H6-FdU诱导的转移控制不同，与用缓冲液处理的小鼠相比(图8b和表1)，游离低聚-FdU不降低CXCR4⁺CCF(图8c)，并且似乎在肝和腹膜处理结束时似乎是增加而非减少转移数。类似地，在消退转移实验中，发明人观察到：与未显示出CXCR4⁺CCF的降低和显示出对T22-GFP-H6-FdU治疗的差的反应的淋巴结灶(图9和表1)相比，实验结束时肺转移灶中的CXCR4⁺CCF降低(图9c)并且在此位点处的抗转移作用更大(图9b)。

实施例10：正常组织中缺少T22-GFP-H6-FdU积累或毒性

为了估计T22-GFP-H6-FdU治疗窗口，分析了其在非肿瘤组织中的生物分布和对DNA损伤或凋亡的诱导。T22-GFP-H6-FdU注射导致了通过荧光发射所测量的高选择性的肿瘤组织积累(图6b)，而在同一实验中，除了在肝中短暂积累(图11a)以外，在CXCR4阳性(骨髓、脾)或CXCR4阴性(肾、肺、大脑、心脏或肝)正常组织中检测不到摄取。此外，处理后5h，正常骨髓中通过抗gH2AX IHC检测到的DSB水平与游离低聚-FdU诱导的水平相似(图11b)，而在肝中则未检测到。因为给予后24h未在骨髓或肝中检测到凋亡或组织学改变(图11c)，因此DSB诱导未导致凋亡或组织学改变。因此，与纳米缀合物对正常组织的可忽略不计的分布一致，在所有经分析的组织(包括骨髓或循环血单核细胞)中均缺少可检测到的凋亡或组织学改变(图12)，并且消退转移实验(图11d)或防止转移实验(图11e)中不存在小鼠体重减轻，或缺少临床毒性的任何迹象均表明：在实现有效的抗转移作用的剂量下，T22-GFP-H6-FdU的治疗指数宽。

序列表

<110> 巴塞罗那自治大学

圣十字圣保罗医院基础研究所

生物技术网络研究中心联合会

<120> 治疗性纳米缀合物及其用途

<130> P14353PC00

<150> EP17382461.6

<151> 2017-07-14

<160> 52

<170> 蛋白质 版本3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 聚阳离子肽

<400> 1

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 聚阳离子肽

<400> 2

Arg Arg Arg Gly Arg Gly Arg Arg Arg

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 聚阳离子肽

<400> 3

Arg Ala Arg Gly Arg Gly Arg Arg Arg

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 聚阳离子肽

<400> 4

Arg Ala Arg Gly Arg Gly Gly Gly Ala

1 5

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T22肽

<400> 5

Arg Arg Trp Cys Tyr Arg Lys Cys Tyr Lys Gly Tyr Cys Tyr Arg Lys

1 5 10 15

Cys Arg

<210> 6

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> V1肽

<400> 6

Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Cys Leu Gly Tyr Gln

1 5 10 15

Lys Arg Pro Leu Pro

20

<210> 7

<211> 67

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CXCL12肽

<400> 7

Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser

1 5 10 15

His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro

20 25 30

Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln

35 40 45

Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys

50 55 60

Ala Leu Asn

65

<210> 8

<211> 68

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> vCCL2肽

<400> 8

Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Cys Leu Gly Tyr Gln

1 5 10 15

Lys Arg Pro Leu Pro Gln Val Leu Leu Ser Ser Trp Tyr Pro Thr Ser

20 25 30

Gln Leu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg

35 40 45

Gln Val Cys Ala Asp Lys Asp Trp Val Lys Lys Leu Met Gln Gln Leu

50 55 60

Pro Val Thr Ala

65

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T140肽

<220>

<221> 各种各样尚未归类的特征（MISC_FEATURE）

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是L-3-(2-萘基)丙氨酸

<220>

<221> 各种各样尚未归类的特征

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是D-Lys

<220>

<221> 各种各样尚未归类的特征

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是L-瓜氨酸

<400> 9

Arg Arg Xaa Cys Tyr Arg Lys Xaa Pro Tyr Arg Xaa Cys Arg

1 5 10

<210> 10

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TN14003肽

<220>

<221> 各种各样尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是L-3-(2-萘基)丙氨酸

<220>

<221> 各种各样尚未归类的特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是L-瓜氨酸

<220>

<221> 各种各样尚未归类的特征

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是D-Lys

<220>

<221> 各种各样尚未归类的特征

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是L-瓜氨酸

<400> 10

Arg Arg Xaa Cys Tyr Xaa Lys Xaa Pro Tyr Arg Xaa Cys Arg

1 5 10

<210> 11

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TC 14012肽

<220>

<221> 各种各样尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是L-3-(2-萘基)丙氨酸

<220>

<221> 各种各样尚未归类的特征

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是D-瓜氨酸

<220>

<221> 各种各样尚未归类的特征

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是L-瓜氨酸

<400> 11

Arg Arg Xaa Cys Tyr Glu Lys Xaa Pro Tyr Arg Xaa Cys Arg

1 5 10

<210> 12

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TE14011肽

<220>

<221> 各种各样尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa is L-3-(2-萘基)丙氨酸

<220>

<221> 各种各样尚未归类的特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是 L-瓜氨酸

<220>

<221> 各种各样尚未归类的特征

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是D-谷氨酸

<220>

<221> 各种各样尚未归类的特征

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是 L-瓜氨酸

<400> 12

Arg Arg Xaa Cys Tyr Xaa Lys Xaa Pro Tyr Arg Xaa Cys Arg

1 5 10

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TZ14011肽

<220>

<221> 各种各样尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是L-3-(2)-萘基)丙氨酸

<220>

<221> 各种各样尚未归类的特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是L-瓜氨酸

<220>

<221> 各种各样尚未归类的特征

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是D-赖氨酸

<220>

<221> 各种各样尚未归类的特征

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是L-瓜氨酸

<400> 13

Arg Arg Xaa Cys Tyr Xaa Lys Xaa Pro Tyr Arg Xaa Cys Arg

1 5 10

<210> 14

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GW-H1肽

<400> 14

Gly Tyr Asn Tyr Ala Lys Lys Leu Ala Asn Leu Ala Lys Lys Phe Ala

1 5 10 15

Asn Ala Leu Trp

20

<210> 15

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A5G27

<400> 15

Arg Leu Val Ser Tyr Asn Gly Ile Ile Phe Phe Leu Lys

1 5 10

<210> 16

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FNI/II/V

<400> 16

Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu

1 5 10 15

Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly

20 25 30

Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr

35 40 45

Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile

50 55 60

Gly Arg Lys Lys Thr

65

<210> 17

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Seq-1-7肽

<400> 17

Lys Tyr Leu Ala Tyr Pro Asp Ser Val His Ile Trp Arg Lys Arg Lys

1 5 10 15

Arg Lys

<210> 18

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Seq-1-8肽

<400> 18

Lys Tyr Leu Ala Tyr Pro Asp Ser Val His Ile Trp Arg Lys Arg Lys

1 5 10 15

Arg Lys Arg

<210> 19

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Angiopep-2-7肽

<400> 19

Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr

1 5 10 15

Glu Glu Tyr Arg Lys Arg

20

<210> 20

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 核仁素结合肽

<400> 20

Lys Asp Glu Pro Gln Arg Arg Ser Ala Arg Leu Ser Ala Lys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Pro Lys Pro Glu Pro Lys Pro Lys Lys Ala Pro Ala Lys Lys

20 25 30

<210> 21

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 核仁素结合肽

<400> 21

Lys Asp Glu Pro Gln Arg Arg Ser Ala Arg Leu Ser Ala Lys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Pro Lys Pro Glu Pro Lys Pro Lys Lys Ala Pro Ala Lys Lys Arg

20 25 30

Lys Arg Lys Arg Lys Arg Lys

35

<210> 22

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接体/间隔区

<400> 22

Ser Gly Gly Thr Ser Gly Ser Thr Ser Gly Thr Gly Ser Thr

1 5 10

<210> 23

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接体/间隔区

<400> 23

Ala Gly Ser Ser Thr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Gly Ser Thr Thr

1 5 10 15

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接体/间隔区

<400> 24

Gly Gly Ser Gly Gly Ala Pro

1 5

<210> 25

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接体/间隔区

<400> 25

Gly Gly Gly Val Glu Gly Gly Gly

1 5

<210> 26

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠IgG3的上铰链区的10个氨基酸残基

<400> 26

Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser

1 5 10

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接体/间隔区

<400> 27

Ala Pro Ala Glu Thr Lys Ala Glu Pro Met Thr

1 5 10

<210> 28

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点

<400> 28

Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 29

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点

<400> 29

Ile Glu Asp Gly Arg

1 5

<210> 30

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点

<400> 30

Leu Val Pro Arg Gly Ser

1 5

<210> 31

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点

<400> 31

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

1 5

<210> 32

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点

<400> 32

Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro

1 5

<210> 33

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接体

<400> 33

Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser

1 5

<210> 34

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接体

<400> 34

Gly Gly Gly Asn Ser

1 5

<210> 35

<211> 238

<212> PRT

<213> 维多利亚多管水母（Aequorea victoria）

<400> 35

Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val

1 5 10 15

Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys

35 40 45

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe

50 55 60

Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln

65 70 75 80

His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg

85 90 95

Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val

100 105 110

Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile

115 120 125

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130 135 140

Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly

145 150 155 160

Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val

165 170 175

Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro

180 185 190

Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser

195 200 205

Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val

210 215 220

Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 36

<211> 609

<212> PRT

<213> 智人

<400> 36

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

20 25 30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

35 40 45

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

50 55 60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

65 70 75 80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

85 90 95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

100 105 110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

115 120 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

130 135 140

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

145 150 155 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

165 170 175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

180 185 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

195 200 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

210 215 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225 230 235 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

245 250 255

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

260 265 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

275 280 285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

290 295 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

305 310 315 320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

325 330 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

340 345 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

355 360 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

370 375 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385 390 395 400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

405 410 415

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

420 425 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

435 440 445

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

450 455 460

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

465 470 475 480

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

485 490 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

500 505 510

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

515 520 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

530 535 540

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545 550 555 560

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

565 570 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

580 585 590

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

595 600 605

Leu

<210> 37

<211> 1247

<212> PRT

<213> 智人

<400> 37

Met Leu Ala Ser Ser Ser Arg Ile Arg Ala Ala Trp Thr Arg Ala Leu

1 5 10 15

Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ala Gly Pro Val Gly Cys Leu Ser Arg Gln

20 25 30

Glu Leu Phe Pro Phe Gly Pro Gly Gln Gly Asp Leu Glu Leu Glu Asp

35 40 45

Gly Asp Asp Phe Val Ser Pro Ala Leu Glu Leu Ser Gly Ala Leu Arg

50 55 60

Phe Tyr Asp Arg Ser Asp Ile Asp Ala Val Tyr Val Thr Thr Asn Gly

65 70 75 80

Ile Ile Ala Thr Ser Glu Pro Pro Ala Lys Glu Ser His Pro Gly Leu

85 90 95

Phe Pro Pro Thr Phe Gly Ala Val Ala Pro Phe Leu Ala Asp Leu Asp

100 105 110

Thr Thr Asp Gly Leu Gly Lys Val Tyr Tyr Arg Glu Asp Leu Ser Pro

115 120 125

Ser Ile Thr Gln Arg Ala Ala Glu Cys Val His Arg Gly Phe Pro Glu

130 135 140

Ile Ser Phe Gln Pro Ser Ser Ala Val Val Val Thr Trp Glu Ser Val

145 150 155 160

Ala Pro Tyr Gln Gly Pro Ser Arg Asp Pro Asp Gln Lys Gly Lys Arg

165 170 175

Asn Thr Phe Gln Ala Val Leu Ala Ser Ser Asp Ser Ser Ser Tyr Ala

180 185 190

Ile Phe Leu Tyr Pro Glu Asp Gly Leu Gln Phe His Thr Thr Phe Ser

195 200 205

Lys Lys Glu Asn Asn Gln Val Pro Ala Val Val Ala Phe Ser Gln Gly

210 215 220

Ser Val Gly Phe Leu Trp Lys Ser Asn Gly Ala Tyr Asn Ile Phe Ala

225 230 235 240

Asn Asp Arg Glu Ser Val Glu Asn Leu Ala Lys Ser Ser Asn Ser Gly

245 250 255

Gln Gln Gly Val Trp Val Phe Glu Ile Gly Ser Pro Ala Thr Thr Asn

260 265 270

Gly Val Val Pro Ala Asp Val Ile Leu Gly Thr Glu Asp Gly Ala Glu

275 280 285

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<210> 38

<211> 1375

<212> PRT

<213> 智人

<400> 38

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275 280 285

Ala Ala His Ser Ser Val Pro Leu Gly Arg Ser Phe Ser His Ala Thr

290 295 300

Ala Leu Glu Ser Asp Tyr Asn Glu Asp Asn Leu Asp Tyr Tyr Asp Val

305 310 315 320

Asn Glu Glu Glu Ala Glu Tyr Leu Pro Gly Glu Pro Glu Glu Ala Leu

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Asn Gly His Ser Ser Ile Asp Val Ser Phe Gln Ser Lys Val Asp Thr

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385 390 395 400

Arg Asp Ser Leu Ala Pro Ser Trp Glu Thr Pro Pro Pro Tyr Pro Glu

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465 470 475 480

Asn Ala Ala Asn Lys Glu Thr Cys Glu His Asn His Arg Gln Cys Ser

485 490 495

Arg His Ala Phe Cys Thr Asp Tyr Ala Thr Gly Phe Cys Cys His Cys

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Gln Ser Lys Phe Tyr Gly Asn Gly Lys His Cys Leu Pro Glu Gly Ala

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Pro His Arg Val Asn Gly Lys Val Ser Gly His Leu His Val Gly His

530 535 540

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Asn Arg Arg Ile Leu Ile Asn Thr Asp Ile Gly Leu Pro Asn Gly

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Arg Val Ile Gln Asn Asn Leu Lys Tyr Pro Phe Ser Ile Val Ser

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<210> 39

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 39

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<212> PRT

<213> 智人

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Gly Phe

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 41

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Glu Val Phe Arg Ser Tyr Val Phe Tyr Arg His Gln Gln Glu Gln Glu

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Phe Lys

210

<210> 42

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BH3结构域

<400> 42

Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg Arg

1 5 10 15

<210> 43

<211> 193

<212> PRT

<213> 智人

<400> 43

Met Ala Arg Ala Arg Gln Glu Gly Ser Ser Pro Glu Pro Val Glu Gly

1 5 10 15

Leu Ala Arg Asp Gly Pro Arg Pro Phe Pro Leu Gly Arg Leu Val Pro

20 25 30

Ser Ala Val Ser Cys Gly Leu Cys Glu Pro Gly Leu Ala Ala Ala Pro

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Asn

<210> 44

<211> 187

<212> PRT

<213> 白喉杆菌

<400> 44

Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn

1 5 10 15

Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln

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Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp

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Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val

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Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val

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Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu

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Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly

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Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser

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Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala

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<210> 45

<211> 209

<212> PRT

<213> 铜绿假单胞菌

<400> 45

Gly Asp Ile Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu

1 5 10 15

Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe

20 25 30

Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe

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Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly

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Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly

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Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala

180 185 190

Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu

195 200 205

Lys

<210> 46

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接体肽

<400> 46

Ala Ala Ala Leu Glu

1 5

<210> 47

<211> 98

<212> PRT

<213> 智人

<400> 47

Met Ile Pro Trp Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile

1 5 10 15

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<210> 48

<211> 98

<212> PRT

<213> 智人

<400> 48

Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile

1 5 10 15

Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn

20 25 30

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Ala Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr

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65 70 75 80

Val Arg Ser Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr

85 90 95

Gly Phe

<210> 49

<211> 98

<212> PRT

<213> 智人

<400> 49

Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile

1 5 10 15

Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn

20 25 30

Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Val

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Ala Gly Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr

50 55 60

Met His Leu Lys Val Phe Lys Ser Leu Pro Gly Gln Asn Glu Asp Leu

65 70 75 80

Val Leu Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr

85 90 95

Gly Phe

<210> 50

<211> 98

<212> PRT

<213> 智人

<400> 50

Met Ile Pro Gly Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile

1 5 10 15

Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn

20 25 30

Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu

35 40 45

Ala Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr

50 55 60

Met His Leu Lys Val Phe Lys Ser Leu Pro Gly Gln Asn Glu Asp Leu

65 70 75 80

Val Leu Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr

85 90 95

Gly Phe

<210> 51

<211> 98

<212> PRT

<213> 智人

<400> 51

Met Ile Pro Gly Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile

1 5 10 15

Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn

20 25 30

Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Val

35 40 45

Ala Gly Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr

50 55 60

Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly Pro Pro Gly Gln Asn Glu Asp Leu

65 70 75 80

Val Arg Ser Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr

85 90 95

Gly Phe

<210> 52

<211> 98

<212> PRT

<213> 智人

<400> 52

Met Ile Pro Gly Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile

1 5 10 15

Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn

20 25 30

Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu

35 40 45

Ala Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr

50 55 60

Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly Pro Pro Gly Gln Asn Glu Asp Leu

65 70 75 80

Val Arg Ser Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr

85 90 95

Gly Phe

Claims (43)

1.融合蛋白，其包含

(i)聚阳离子肽，

(ii)间插多肽区域，和

(iii)富含带正电荷的氨基酸的区域，

其中，所述间插多肽区域与至少一种治疗剂缀合。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述聚阳离子肽选自

(i)富含精氨酸的序列，

(ii)能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进所述融合蛋白在所述细胞上的内化的序列，

(iii)GW-H1肽，

(iv)CD44配体，

(v)能够穿过血脑屏障的肽，

(vi)细胞穿透肽，和

(vii)核仁素结合肽。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述聚阳离子肽是包含选自以下的序列的富含精氨酸的序列：RRRRRRRRR(SEQ ID NO：1)、RRRGRGRRR(SEQ ID NO：2)、RARGRGRRR(SEQ IDNO：3)、和RARGRGGGA(SEQ ID NO：3)。

4.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述聚阳离子肽包含能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进所述融合蛋白在所述细胞上的内化的序列，所述序列是CXCR4配体。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述CXCR4配体选自包含序列RRWCYRKCYKGYCYRKCR(SEQ ID NO：5)的肽、V1肽(SEQ ID NO：6)、CXCL12(SEQ ID NO：7)肽、vCCL2(SEQ ID NO：8)或其功能上等同的变体。

6.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述聚阳离子肽是CD44配体A5G27(SEQ IDNO：15)或FNI/II/V(SEQ ID NO：16)。

7.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述聚阳离子肽是能够穿过血脑屏障的选自以下的肽：Seq-1-7(SEQ ID NO：17)、Seq-1-8(SEQ ID NO：18)、Angiopep-2-7(SEQ ID NO：19)。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的融合蛋白，其中所述富含带正电荷的氨基酸的区域是聚组氨酸区域。

9.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述聚组氨酸区域包含2与10之间个连续的组氨酸残基。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白，其中所述间插多肽选自荧光蛋白、白蛋白(SEQ ID NO：36)、巢蛋白1(SEQ ID NO：37)、巢蛋白2(SEQ ID NO：38)、绒膜促性腺激素(SEQ ID NO：39)和半胱氨酸蛋白酶抑制剂。

11.根据权利要求10所述的融合蛋白，其中所述间插多肽是选自半胱氨酸蛋白酶抑制剂A、半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、半胱氨酸蛋白酶抑制剂D和半胱氨酸蛋白酶抑制剂M的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。

12.根据权利要求11所述的融合蛋白，其中所述间插多肽是具有序列SEQ ID NO：40的半胱氨酸蛋白酶抑制剂A或其变体，所述变体具有相对于SEQ ID NO：40中编号的选自G4W、G4R、V48D、V48L、G50S、K71N、S72G、L73P、L82R和T83S的一个或多个突变。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的融合蛋白，其中所述聚阳离子肽位于所述融合蛋白的N端，而所述富含带正电荷的氨基酸的区域位于所述融合蛋白的C端，或者其中所述富含带正电荷的氨基酸的区域位于所述融合蛋白的N端，而所述聚阳离子肽位于所述融合蛋白的C端。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白，其中所述聚阳离子区域通过第一肽连接体与所述间插多肽连接，和/或其中所述间插多肽通过第二肽连接体与所述富含带正电荷的氨基酸的区域连接。

15.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中所述第一肽连接体包含GGSSRSS序列(SEQID NO：33)或GGGNS序列(SEQ ID NO：34)。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的融合蛋白，其中所述治疗剂选自

(i)化疗剂，

(ii)细胞毒性多肽，

(iii)抗血管生成多肽，

(iv)由肿瘤抑制基因编码的多肽，

(v)促凋亡多肽，

(vi)具有抗转移活性的多肽，

(vii)由能够激活针对肿瘤的免疫应答的多核苷酸所编码的多肽，和

(viii)抗血管生成分子，

(ix)毒素。

17.根据权利要求16所述的融合蛋白，其中所述间插多肽缀合至多种治疗剂，其中所述多种治疗剂相同或不同。

18.根据权利要求16或17所述的融合蛋白，其中所述治疗剂是化疗剂。

19.根据权利要求18所述的融合蛋白，其中所述化疗剂是抗代谢物。

20.根据权利要求19所述的融合蛋白，其中所述抗代谢物是嘧啶类似物或其低聚形式。

21.根据权利要求20所述的融合蛋白，其中所述嘧啶类似物是氟尿苷。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的融合蛋白，其还包含报告蛋白。

23.用于制备根据权利要求1至22中任一项所述的融合蛋白的方法，所述方法选自：

(i)方法，其包括

a)提供融合蛋白，其包含

i.聚阳离子肽

ii.间插多肽区域，和

iii.富含带正电荷的氨基酸的区域，

其中所述聚阳离子肽和所述富含带正电荷的氨基酸的区域位于所述蛋白质的末端，和

b)使所述融合蛋白与治疗剂的活化形式或其低聚形式的活化形式接触，其中所述治疗剂的活化形式或其低聚形式的活化形式含有能够与所述融合蛋白的间插区域中的至少一个基团反应的反应性基团，并且其中在足以在所述治疗剂中的所述反应性基团和所述间插多肽区域中的基团之间形成键的条件下进行所述接触或

(ii)方法，其包括

a)提供融合蛋白，其包含

i.聚阳离子肽

ii.间插多肽区域，和

iii.富含带正电荷的氨基酸的区域，

其中所述聚阳离子肽和所述富含带正电荷的氨基酸的区域位于所述蛋白质的末端，

并且其中所述融合蛋白以活化形式提供，其中所述融合蛋白的所述活化形式在所述间插区域中包含反应性基团，和

b)使所述融合蛋白与治疗剂或其低聚形式接触，其中所述治疗剂包含能够与所述融合蛋白中的所述反应性基团反应的基团，其中所述接触在足以在所述融合蛋白中的所述反应性基团与所述治疗剂中的基团之间形成键的条件下进行。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述治疗剂是化疗剂，并且其中其活化形式含有与所述间插多肽区域中的侧链中的至少一个进行反应的基团。

25.根据权利要求24所述的方法，其中与所述间插多肽区域中的侧链中的至少一个进行反应的所述基团是硫醇基。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述活化的化疗剂是硫醇官能化的低聚氟尿苷。

27.用于制备包含多个拷贝的根据权利要求1至26中任一项所述的融合蛋白的纳米颗粒的方法，所述方法包括将所述融合蛋白的制剂置于低盐缓冲液中。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述低盐缓冲液选自碳酸盐缓冲液、Tris缓冲液和磷酸盐缓冲液。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述碳酸盐缓冲液包含浓度在100与300mM之间的碳酸氢钠，所述Tris缓冲液包含浓度在10与30mM之间的Tris，和/或其中所述磷酸盐缓冲液包含总浓度在5mM与20mM之间的Na₂HPO₄和NaH₂PO₄。

30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述低盐缓冲液还包含右旋糖和/或甘油。

31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中所述缓冲液的pH在6.5与8.5之间。

32.根据权利要求27至31中任一项所述的方法，其中所述缓冲液选自

(i)166mM NaHCO₃，pH 7.4

(ii)20mM Tris，500mM5％右旋糖，pH 7.4，和

(iii)140mM NaCl，7.5mM Na₂HPO₄，2.5mM NaH₂PO₄，10％甘油，pH 7.4。

33.包含多个拷贝的根据权利要求1至24中任一项所述的融合蛋白的纳米颗粒或根据权利要求27至32中任一项所述的方法获得的纳米颗粒。

34.根据权利要求33所述的纳米颗粒，其直径在10与100nm之间。

35.根据权利要求1至22中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求35或36所述的纳米颗粒，其用于医学。

36.用于治疗癌症的根据权利要求1至22中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求33或34所述的纳米颗粒，其中所述聚阳离子肽是能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并且能够促进所述融合蛋白在所述细胞上的内化的序列，

其中所述细胞是存在于癌症中的肿瘤细胞，

并且其中所述治疗剂选自

(i)化疗剂，

(ii)细胞毒性多肽，

(iii)抗血管生成多肽，

(iv)由肿瘤抑制基因编码的多肽，

(v)促凋亡多肽，

(vi)具有抗转移活性的多肽，

(vii)由能够激活针对肿瘤的免疫应答的多核苷酸编码的多肽，和

(viii)抗血管生成分子，

(ix)毒素。

37.用于根据权利要求36所述的用途的融合蛋白或纳米颗粒，其中所述抗肿瘤肽是BAK的BH3结构域(SEQ ID NO：42)、PUMA(SEQ ID NO：43)、GWHI(SEQ ID NO：14)、白喉毒素I(SEQID NO：44)的活性片段和铜绿假单胞菌(P.aeuroginosa)外毒素(SEQ ID NO：45)。

38.用于根据权利要求36至38中任一项所述的用途的融合蛋白或纳米颗粒，其中所述聚阳离子肽是CXCR4配体，并且其中所述癌症的特征在于其包含表达或过表达CXCR4的癌细胞。

39.用于根据权利要求39所述的用途的融合蛋白或纳米颗粒，其中所述CXCR4配体选自包含序列RRWCYRKCYKGYCYRKCR(SEQ ID NO：1)的肽、V1肽(SEQ ID NO：2)、CXCL12肽(SEQ IDNO：3)、vCCL2肽(SEQ ID NO：4)或其功能上等同的变体。

40.用于根据权利要求36至39中任一项所述的用途的融合蛋白或纳米颗粒，其中所述聚阳离子肽是CXCR4配体，并且其中所述癌症的特征在于其包含表达或过表达CXCR4的癌细胞。

41.用于根据权利要求40所述的用途的融合蛋白或纳米颗粒，其中所述表达或过表达CXCR4的癌细胞是转移性干细胞。

42.用于根据权利要求36至41中任一项所述的用途的融合蛋白或纳米颗粒，其中所述癌症胰腺癌和结直肠癌。

43.用于根据权利要求36至42中任一项所述的用途的融合蛋白或纳米颗粒，其中所述肿瘤癌症是原发性肿瘤或转移。

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