CN110997705A - 纳米结构蛋白及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及纳米结构蛋白,更具体地涉及适合于将其选择性地递送至特定细胞和组织类型的融合蛋白。其还涉及包括这种纳米结构蛋白的纳米颗粒,以及包括所述蛋白质的核酸、载体、细胞,及其治疗用途。
Description
技术领域
本发明涉及纳米结构蛋白质材料领域,更具体地涉及可用于治疗的融合蛋白。
背景技术
与游离分子相比,将药物以纳米缀合物形式全身施用受益于增强的药物稳定性。通过纳米级载体中的官能团化学并入,可以将有价值的另外的特性(比如细胞靶向性)合并到给定的混杂复合材料中,这得益于纳米材料的高表面/体积比。当全身施用时,在肺或其他高度血管化的器官中没有聚集的情况下,所得的大小在约8至100nm之间的载药缀合物可从肾脏过滤中逃逸。这一事实,与材料的合适的物理化学特性组合,可能会导致延长的循环时间和延长的药物暴露于靶器官,因此增强对患者的治疗影响和益处。
在包括金属、陶瓷、聚合物和碳纳米管的作为药物载体的被研究的材料的多样性中,蛋白质提供了在生物相容性和可降解性方面的独特特性,在越来越多的纳米毒理学问题的背景下使它们尤其具有吸引力。
然而,许多蛋白质种类本身就是可用于人类治疗的有效药物,这通过主要药物机构批准的多于400种基于蛋白质的产品证明。因此,蛋白质药物作为自组织结构单元——其在自组装为纳米颗粒后展现出固有的治疗活性——的工程化构成了有利的概念。因此,由于纳米材料本身起到纳米级药物(期望地在8和100nm之间)的作用,因此该方法无需进一步激活和药物偶联。以此方式,显示固有的治疗活性的化学均质的蛋白质纳米颗粒(如目前在人类医学中使用的普通蛋白质种类,例如激素、生长因子、疫苗等)可以在单个步骤中生物学地产生(作为纳米级组装实体)。由于该材料本身起到药物的作用,因此可以完全消除循环期间药物泄漏的可能性,这是不期望的可能性,尤其是在细胞毒素剂的情况下所担忧的可能性,这相对于现有技术而言是显著的优势。
发明人先前通过应用纳米建筑原理来探索该领域,该原理基于将阳离子N端结构域加C端聚组氨酸添加到核心蛋白。[Serna,N.等人2016.Nanomedicine,12:1241-51]。本领域中已经描述了这些末端标记和在整个融合中产生的电荷平衡促进了单体蛋白的自组装和寡聚,单体蛋白是在血浆中稳定的坚固的环形纳米颗粒[Cespedes,M.V.等人2014.ACSNano.,8:4166-4176],并且如果具有细胞靶向肽的功能,则具有很高的细胞穿透性。[Xu,Z.K.等人2015.Materials Letters,154:140-3]尽管如此,这些蛋白质结构的结构单元也可能包含与模块化组织融合拉伸形式的功能肽,例如细胞靶向剂、内体裂解剂(endosomolytic agent)或核定位信号。
因此,利用这种简单的蛋白质工程化将是非常有益的,因为在本领域中仍然需要具有增强的选择性和生物适应性(biodisponibility)的药物递送系统。
发明内容
在第一方面中,本发明涉及一种融合蛋白,其包括
(i)聚阳离子肽,
(ii)间插多肽区(intervening polypeptide region),和
(iii)带正电荷的富含氨基酸的区域,
其中该间插多肽区不是单独的荧光蛋白或人p53。
在第二方面中,本发明涉及制备包括根据本发明的第一方面的多个拷贝的融合蛋白的纳米颗粒的方法,该方法包括将所述融合蛋白的制剂置于低盐缓冲液中。
在进一方面中,本发明涉及编码根据本发明的第一方面的融合蛋白的多核苷酸,包括所述多核苷酸的载体,和包括所述多核苷酸或所述载体的宿主细胞。
在另外的方面中,本发明涉及包括本发明的多个拷贝的融合蛋白的纳米颗粒或通过本发明用于制备纳米颗粒的方法获得的纳米颗粒。
在又另一个另外的方面,本发明涉及用于医学的根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒。
附图说明
图1.T22-BAK-GFP-H6纳米颗粒的设计和生物化学特征。A)CXCR4结合T22-BAK-GFP-H6结构单元的示意图表明其模块化组成。显示了CXCR4肽配体T22和BAK蛋白的治疗性BH3结构域的氨基酸序列。模块的长度在这里表示为近似值。接头序列是GGSSRSSS。B)纯化的T22-BAK-GFP-H6融合体的质谱指示实验分子量(33,988.762Da)。通过考马斯蓝染色的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶(Co)和蛋白质印迹(WB)中的H6免疫检测也显示了蛋白质完整性。C)在天然状态下和在SDS介导的未组装下T22赋能的纳米颗粒的流体动力学尺寸分布。此处包括未组装的亲本BAK-GFP-H6和GFP-H6蛋白以及相关的T22-GFP-H6颗粒(和SDS介导的未组装单体)用于大小比较。所有蛋白质均溶解在它们各自的存储缓冲液中。D)随机选择的视野的FESEM图像显示T22-BAKGFP-H6纳米颗粒的超微结构形态。条形表示20nm。
图2.T22-BAK-GFP-H6纳米颗粒的细胞穿透性。A)T22-BAK-GFP-H6纳米颗粒在24小时暴露后在培养的CXCR4+HeLa和SW1417细胞中的内在化。通过特定荧光矫正了细胞内荧光的强度,产生了代表蛋白质量的任意单位(au)。B)Hela细胞对纳米颗粒(2μM)的时间依赖性细胞内积聚。插图是暴露于2μM T22-BAK-GFP-H6纳米颗粒48小时后CXCR4-SW1417细胞的活力。C)通过使用CXCR4+抑制剂AMD3100确定CXCR4介导的T22-BAK-GFP-H6纳米颗粒内在化的特异性。
图3.T22-GFP-H6和T22-BAK-GFP-H6纳米颗粒和未组装的BAK-GFP-H6蛋白质在CXCR4+结肠直肠肿瘤中的积聚和器官生物分布。A)在静脉施用330μg剂量的每种蛋白质后2小时、5小时、24小时和48小时的代表性离体肿瘤荧光图像(FLI)。B)使用IVIS光谱系统在2小时、5小时、24小时和48小时在肿瘤中的GFP荧光定量。将来自蛋白质处理小鼠的GFP信号除以每个器官经缓冲液处理的小鼠的自发荧光信号来计算FLI比。&和#p<0.05的条形表示与其余T22-BAK-GFP-H6处理组相比是统计学上显著的。*p<0.05的条形表示指定组之间是统计学上显著的。C)在5小时时针对肿瘤中纳米颗粒的His标记结构域的免疫组织化学。D)在治疗后小鼠脑、肺、心脏、肝、肾和骨髓组织中积聚的物质的代表性离体图像。请注意,与肿瘤相比,这些器官不存在或残留荧光。E)代表性的H&E染色显示在任何器官中都没有改变的结构。缩写:H&E,苏木精和伊红染色;iv:静脉内;FLI:荧光成像;NP:纳米颗粒。
图4.与缓冲液和T22-GFP-H6和BAK-GFP-H6对照对应物相比,在施用T22-BAK-GFP-H6之后2小时、5小时、24小时和48小时荷瘤小鼠中降低的增殖指数、半胱天冬酶-3激活、蛋白水解的PARP、凋亡诱导和坏死率。通过H&E染色(A)以及通过IHC裂解的(活性)半胱天冬酶-3(B)和蛋白水解的PARP(C)阳性肿瘤细胞二者对肿瘤中的有丝分裂像(mitoticfigure)(有丝分裂活性指数)的数量进行定量。#,&p<0.05的条形表示在每次与T22-BAK-GFP-H6-处理的组相比是统计学上显著的;*p<0.05的条形表示在指定组之间是统计学上显著的。D)在Hoechst染色后通过核凝聚检测到的凋亡像计数。*p<0.05的条形表示在指定组之间是统计学上显著的。E)使用Cell D软件测量低功率场放大肿瘤切片中的总面积和坏死面积(μm2)。*p<0.05的条形表示在2小时和5小时处理组之间是统计学上显著的。通过对每个样品的10个高功率场(x400)计数来获得图A-D中的所有定量值。数据表示为平均值±SE。所有统计分析均采用曼惠特尼U检验(Mann Whitney U-test)进行。缩写:H&E,苏木精和伊红染色。
图5.T22-PUMA-GFP-H6和T22-GWH1-GFP-H6纳米颗粒的物理和生物特征。结构单元的示意图基于PUMA(A)和GWH1(B)。指出了治疗性蛋白片段(stretch)的氨基酸序列,而其余构建体如图1所示。描绘了纳米颗粒(绿色)和分解后的结构单元(红色)的DLS图,旁边是以nm计的峰值。还显示了分离的纳米颗粒的代表性FESEM图像。条形表示40nm。C)在5小时静脉内施用300μg剂量的每种纳米颗粒后,代表性的离体肿瘤荧光图像(FLI)和正常器官(脑、肾、肺、心脏和肝组织)。D)定量各个器官中的荧光信号(辐射效率)。E和F)与T22-GFP-H6对照对应物相比,在Hoechst染色之后通过核凝聚检测到的有丝分裂像的数量、(H&E染色)、凋亡像的数量的定量和在施用T22-PUMA-GFP-H6或T22-GWH1-GFP-H6之后5在肿瘤中坏死区(H&E染色)的定量。如图4中所示进行定量。
图6:H6-GFP-R9和H6-R9-GFP蛋白质通过DLS的表征。在三个独立的测定中通过DLS确定H6-GFP-R9和H6-R9-GFP纳米颗粒的流体动力学尺寸分布。
图7:基于GWH1的蛋白质纳米颗粒的表征。A)在该研究中使用的重组蛋白的示意图。盒的长度仅是代表性的。在其他地方已经充分描述了T22-GFP-H6[13]和T22-GWH1-GFP-H6(Serna等人提交)。B)在亲和色谱之后基于重组GWH1蛋白质的质谱分析。C)在PAGE之后通过TGX凝胶化学的纯化蛋白质的可视化。D)与亲本GFP-H6相比GWH1-GFP-H6纳米颗粒的尺寸。T22-GWH1-GFP-H6纳米颗粒的尺寸为24.6nm,并且它将在其他地方充分描述(Serna等人提交)。E)在不同的放大倍数下纯化的GWH1-GFP-H6纳米颗粒的FESEM成像。条形表示50nm。
图8:基于GWH1的蛋白质纳米颗粒的抗细菌活性。A)不同细菌物种暴露于1.25mg/ml基于GWH1的蛋白质纳米颗粒24小时(藤黄微球菌为48小时)的细胞活力。包括T22-GFP-H6作为阴性对照。B)在温育24小时(藤黄微球菌为48小时)之后GWH1-GFP-H6的剂量依赖性抗细菌活性。C)通过光学显微镜监测的用1.25mg/ml GWH1-GFP-H6纳米颗粒温育24小时(藤黄微球菌为48小时)细菌细胞裂解。
图9:基于GWH1的蛋白质纳米颗粒的细胞毒素活性。A)在暴露于纳米颗粒之后24小时通过细胞内GFP荧光监测的蛋白质内在化。数据已通过特定荧光值校正以允许基于摩尔进行比较。B)在暴露于10μM蛋白质纳米颗粒24小时之后的HeLa细胞活力。C)在图B的条件下暴露于蛋白质纳米颗粒的培养的Hela细胞的光学显微镜检查。
图10:T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6纳米颗粒的设计。A.A-B毒素比如白喉毒素(白喉棒状杆菌)或外毒素A(铜绿假单胞菌)的天然结构。天然毒素分为两个片段(A和B)。片段A包括催化结构域(C-结构域),而片段B包括易位和受体结合结构域(T-和R-结构域)。将用于构建重组纳米颗粒的所选结构域用深紫色着色(T22-PE24-H6构建体不包括T-结构域)。B.T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6的模块化组织,其中T22充当CXCR4配体和构造标记。功能区段被接头区域(浅蓝色)和弗林蛋白酶切割位点(深蓝色,黑体字)交叉。天然弗林蛋白酶切割位点也出现在DITOX(深蓝色,加下划线的)内,该位点将氨基末端催化结构域与羧基末端易位结构域分开。KDEL肽已经在T22-PE24-H6的H6区域附近并入。盒尺寸仅是参考性的。出于比较目的,构建了两个另外的蛋白质,即T22-DITOX-H6 F-和T22-PE24-H6 F-,恰恰缺乏工程化的弗林蛋白酶切割位点(黑体字,深蓝色区域)。C在细胞内弗林蛋白酶介导的可用于生物分布和细胞穿透步骤但与细胞杀伤无关的蛋白质结构域释放之后,在CXCR4+靶细胞内T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6纳米颗粒的细胞毒素的预期途径。彩色图像可根据要求提供。
图11:基于毒素的蛋白质T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6的纳米结构。通过DLS确定T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6纳米颗粒的尺寸和SDS介导的分解。峰尺寸(模式)的值以粗体(以nm计,±SEM)表示。还表示了纳米颗粒的Z潜在(Zp)值。纯化后蛋白质的分子量通过PAGE-SDS上的蛋白质印迹显示。B.纯化的T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6材料的FESEM检查。条形表示50nm。彩色图像可以根据要求提供。
图12:基于毒素的纳米颗粒在CXCR4+细胞中的内在化。A.纯的未标记的和ATTO标记的(*)T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6蛋白的质谱图。B.在暴露1小时后T22-DITOX-H6*和T22-PE24-H6*纳米颗粒在CXCR4+HeLa细胞中的剂量依赖性摄取。C.T22-DITOX-H6*和T22-PE24-H6*纳米颗粒(1μM)在CXCR4+HeLa细胞中的细胞内在化的时间进程动力学。注意图中的短误差线。D.暴露1小时之后通过CXCR4拮抗剂AMD3100(+)的蛋白质(100nM)吸收抑制。对于p<0.01,在相关数据对之间的显著差异表示为§。所有的A、B和C数据以平均值±SEM(n=2)呈现。E.将HeLa细胞暴露于T22-DITOX-H6*和T22-PE24-H6*纳米颗粒(1μM)5小时的共焦显微镜检查。将Cell Mask膜染色(红色)与纳米颗粒添加在一起以观察内体膜。纳米颗粒在绿色和蓝色核区域中可见。黄色斑点表示红色和绿色信号的合并。在插图中,3D Imaris重建共焦堆栈。条形表示为5μm。彩色图像可以根据要求提供。
图13:基于毒素的纳米颗粒在CXCR4+细胞中的特异性细胞毒素。A.在将细胞培养物暴露于纳米颗粒(1μM蛋白质)24小时之后,通过HeLa细胞提取物的蛋白质印迹分析来检测细胞内T22-DITOX-H6。M表示分子量标记的迁移。B.左:在暴露后48小时(SW1417细胞系为72小时)通过T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6纳米颗粒(10nM)在SW1417 CXCR4-细胞系和不同的CXCR4+细胞系(包括同基因的CXCR4+SW1417版本)中诱导的细胞死亡。将相关数据对之间的显著差异表示¥0.01<p<0.05和§p<0.01。右:通过CXCR4拮抗剂AMD3100或通过2μM蛋白质T22-GFP-H6抑制HeLa细胞死亡(通过10nM的蛋白质纳米颗粒诱导)。相关数据之间的显著差异表示为字母从“a”到“b”的变化。所有的显著结果均为p<0.01。所有的数据均以平均值±SEM(n=3)呈现。C.分别与相关的T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6相比,T22-DITOX-H6 F-和T22-PE24-H6 F-促进的HeLa细胞死亡。使细胞暴露于10nM的每种蛋白质,持续48小时。数据和统计如图B中。D.免疫细胞化学染色显示,与SW1417 CXCR4+细胞中高CXCR4表达相比,在同基因的SW1417CXCR4-细胞中缺乏CXCR4表达。条形表示50μm。E.通过免疫印迹试验评估在这些细胞中不同的CXCR4蛋白表达。将甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)用作蛋白质负载对照。彩色图像可以根据要求提供。
图14:T22-DITOX-H6*和T22-PE24-H6*纳米颗粒在CXCR4+结肠直肠癌小鼠模型中的生物分布动力学。在50μg或300μg单剂量静脉内施用之后在5小时、24小时、48小时和72小时在缓冲液施用的(对照)和T22-DITOX-H6*-和T22-PE24-H6*处理的小鼠中通过皮下肿瘤和相关器官发射的离体荧光。发射标度(scale)显示为辐射效率单位(参见关于基于白喉毒素(DITOX)和铜绿假单胞菌的外毒素(PE24)的蛋白质纳米颗粒的材料和方法)。
图15:通过ATTO标记的和未标记的T22-DITOX-H6(50μg)和T22-PE24-H6(300μg)纳米颗粒局部诱导肿瘤中的凋亡。A.皮下肿瘤的代表性H&E染色显示凋亡像(黑色箭头)。在研究时间在肝组织中未检测到明显的细胞凋亡。在该器官中观察到少且小的炎症病灶,并由黄色箭头指示,炎症病灶在72小时消失,恢复到组织学上正常的组织实质。注意肾脏没有组织学改变。条形:50μm。B.对于每个纳米颗粒,绘制每十个高倍视野(400×放大)的H&E肿瘤切片中的凋亡细胞体的数量。对于显示较高数感兴趣的细胞凋亡损伤的实验时间,我们还显示了用未标记的蛋白版本处理的动物在不同放大倍数下皮下肿瘤的代表性Hoechst染色。所有的数据均以平均值±SEM(n=3)呈现。统计学显著性:ap=0.008;bp=0.027;cp=0.010;d,e,fp=0.001。
图16:在T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6施用之后的药代动力学、抗肿瘤作用和小鼠体重。A.在分别静脉内推注施用50μg或300μg之后T22-DITOX-H6*和T22-PE24-H6*的药代动力学。在时间0、1、2、5、24和48小时(每个时间点n=3)进行血液离心后,在血浆中记录荧光。B.在对每个纳米颗粒(10μg,每周三次,×8剂量)重复给药施用后,通过分析实验结束时的肿瘤体积和凋亡小体的数量来测量T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6的抗肿瘤作用。C.在描述的蛋白质纳米颗粒重复剂量方案后小鼠体重的演变。统计量为0.01<p<0.05的¥和p<0.01的§。所有的数据均以平均值±SEM呈现,n=3。
图17:T22-mRTA-H6的物理化学特性。A.T22-mRTA-H6的模块化方案和氨基酸序列。mRTA是在材料和方法中描述的蓖麻毒素的修饰片段A,其中Asn残基132已被Ala(加下划线的)替代。盒的尺寸仅是参考性的。B.WB揭示在37℃下产生蛋白质3小时后,总的细胞提取物中不溶性(I)和可溶性(S)细胞部分之间的分级。在一步亲和纯化后,T22-mRTA-H6的SDS-PAGE分析通过Comassie蓝(CB)染色和使用抗组氨酸抗体的蛋白质印迹(WB)揭示。U和AB分别代表未染色和全蓝色标记(Bio-Rad,Refs161-0363和161-0373),并且1、2和3分别表示非特异性洗脱峰和具有增加水平的纯度的两个峰。峰3中的蛋白质被用于进一步实验。C.通过DLS确定的,在纯化时自发形成的T22-mRTA-H6纳米颗粒的流体动力学尺寸(和Z电位)(红线)。Pdi是多分散指数,并且所有的图表示nm。还指示了用1%SDS分解材料40分钟后确定的单体的大小(绿色线)。D.T22-mRTA-H6纳米颗粒在不同放大倍数下的FESEM成像。条形表示20nm。E.在25℃下测得的T22-mRTA-H6在pH 8的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中远紫外CD。F.单独的(黑色线)或在存在T22-mRTA-H6(浅灰色线)和先前在100℃下加热的T22-mRTA-H6(深灰色线)的情况下的ThT荧光发射光谱。λex=450nm。在图的底部,T22-mRTA-H6(黑色条)和先前在100℃下加热的T22-mRTA-H6(灰色条)在490nm处的ThT荧光发射。GF.通过DLS确定的在不同pH值下针对51mM磷酸钠、158.6mM海藻糖脱水、0.01%聚山梨醇酯-20缓冲液透析的T22-mRTA-H6纳米颗粒的尺寸。彩色图像可根据要求提供。
图18:T22-mRTA-H6纳米颗粒的细胞毒性和CXCR4特异性。A.暴露于不同浓度的T22-mRTA-H6纳米颗粒72小时后,培养的CXCR4+HeLa细胞的活力,以剂量反应曲线表示。B.暴露于不同浓度的T22-mRTA-H6纳米颗粒72小时的HeLa细胞中,由CXCR4拮抗剂AMD3100(始终以10:1的过量摩尔比进行)介导的细胞死亡的抑制作用。C.通过流式细胞仪测定不同细胞系(3T3、MV411、THP1和HeLa)确定的CXCR4膜蛋白水平,表示为平均荧光强度比±SE。D.暴露172小时在不同细胞系中100nM T22-GFP-H6的内在化程度。结果表示为平均荧光强度比±SE。EC.在暴露于不同浓度的T22-mRTA-H6纳米颗粒和小分子量抗肿瘤药物Ara-C之后48、72小时培养CXCR4-3T3细胞的活力。包括商业CXCR4-和CXCR4+人AML细胞系(分别为MV411和THP1)作为对照。Ara-C显示超过100nM的细胞毒素(未显示)。标准误差呈现在所有条形中。显著性水平由上标(*p<0.05,**p<0.01)指示。
图19:T22-mRTA-H6纳米颗粒的细胞穿透性和细胞内毒性。A.暴露于100nMATTO488染色的T22-mRTA-H6的培养的HeLa细胞中的细胞内荧光。如所描述的那样,通过hash胰蛋白酶处理将细胞外荧光完全除去(Richard,J.P。等人,The Journal ofbiochemistry 2003,278(1):585)。B.在相同条件下,通过膜联蛋白V检测试剂盒(APC,eBioscience)在暴露于未染色的T22-mRTA-H6的细胞中检测到外部化的磷脂酰丝氨酸。用碘化丙啶(PI)标记死细胞。象限Q1显示用PI标记的HeLa细胞。Q2显示用膜联蛋白V和PI标记的细胞。Q3显示没有PI和膜联蛋白V的细胞。Q4显示用膜联蛋白V标记的细胞。因此,死细胞显示在Q1和Q2中,而活细胞在Q3和Q4中。凋亡细胞显示在Q4。在底部,在上述条件下对HeLa细胞进行Hoechst染色。通过荧光显微镜(x400)获得图像。C.在如上所述经T22-mRTA-H6-处理的细胞中JC-1红色荧光的损失,表明线粒体Δψ的变化。D.用荧光微板试验检测的细胞ROS水平。HeLa细胞用缓冲液、T22-mRTA-H6(100nM,持续15小时或24小时)或100μM绿脓素(1小时)处理作为阳性对照。值表示为相对荧光单位±SE。E.用zVAD-fmk抑制半胱天冬酶逆转HeLa细胞中T22-mRTA-H6的抗肿瘤活性。将细胞用100μM zVAD-fmk预处理1小时,并且然后暴露于100nM T22-mRTA-H6 48小时。细胞活力表示为与对照相比细胞存活的百分比。值为平均值±SE。载体指示用缓冲液处理。指示了显著性水平(*p<0.05,**p<0.01)。
图20:在散播性AML小鼠模型中T22-mRTA-H6的抗肿瘤活性。A.通过IVIS光谱分析在14天实验期间用可溶性T22-mRTA-H6纳米颗粒(T22mRTA)、T22-mRTA-H6 IBs(IB-T22mRTA)或缓冲液(VEHICLE)处理的小鼠发射的生物发光的随访。B.在浸润有用缓冲液(VEHICLE)、T22-mRTAH6 IB(IB-T22mRTA)或可溶性T22-mRTA-H6(T22mRTA)处理的小鼠的白血病细胞比如骨架、后肢、肝和脾的组织中,在IVIS光谱中离体检测到的发光水平。C.通过IHQ在用缓冲液(VEHICLE)、T22-mRTA-H6 IBs(IB-T22mRTA)或可溶性T22-mRTA-H6纳米颗粒(T22mRTA)处理的小鼠的脾、肝和骨髓中检测CD45阳性细胞。T22mRTA,用可溶性T22-mRTA-H6处理的小鼠;IB-T22mRTA,用T22-mRTA-H6 IB处理的小鼠组;VEHICLE,用载体处理的组。条形表示为50μm。彩色图像可以根据要求提供。
图21:在用T22-mRTA-H6处理后在散播性AML小鼠模型中的组织病理学。用苏木精和伊红染色正常(心脏、肺、肾)和白血病浸润的器官(骨髓、肝、脾)。用具有20x物镜和Olympus DP72数码相机的显微镜拍摄图像。H&E,苏木精和伊红;T22mRTA,用可溶性T22-mRTA-H6处理的小鼠;IB-T22mRTA,用T22-mRTA-H6 IB处理的小鼠组;载体,用缓冲液处理的小鼠组。条形表示50μm。彩色图像可以根据要求提供。
具体实施方式
本发明的作者已经观察到,包括聚阳离子肽和侧面有生物活性间插多肽的带正电荷的富含氨基酸的区域的融合蛋白能够被组装成纳米颗粒,其中所述生物活性间插多肽的活性得以保留。借助于聚阳离子区域和细胞表面受体之间的亲和力,可以将这些纳米颗粒递送至特定细胞,从而允许将生物活性多肽特异性递送至感兴趣的细胞。
尽管在本领域中已描述了具有相似结构并且间插多肽为荧光蛋白的融合蛋白,但是发明人获得的结果是出乎意料的,这一方面是由于荧光蛋白的生物活性所涉及的机制本质上不同,和另一方面是由于促凋亡肽、细胞毒素蛋白和其他治疗性多肽可能在癌症或其他病理中实施治愈活性。
在GFP和其他荧光蛋白的情况中,它们通过固有的活性(荧光团的适当折叠和构象结构)而具有生物活性(荧光发射),固有的活性不需要与任何外部因素相互作用或任何外部因素的参与。该蛋白质本身在没有任何细胞或细胞结构的情况下具有活性。
然而,可能在癌症或其他病理中实施治愈活性的促凋亡肽、细胞毒素蛋白和其他治疗性多肽确实需要与细胞结构和细胞蛋白发生复杂的相互作用,这允许在高于特定阈值(在不同的治疗剂之间不同)的浓度到达适当的细胞区室(膜交叉等),该特定阈值的浓度能够通过复杂的信号传导和代谢级联触发靶细胞死亡。
这意味着不是显而易见或不可预测的是,除荧光蛋白以外的功能蛋白可能保持生物活性并以纳米结构形式在体内显示出治疗活性,并且可以保留基于特定蛋白质-蛋白质相互作用的这种复杂的活性谱。细胞毒素或促凋亡蛋白的活性取决于活细胞以及在复杂的细胞内细胞环境中的正确性能。
无法预测或预期的是,组织成寡聚纳米结构的细胞毒素蛋白将保持完整的整个相互作用组和生物活性以执行其治疗功能。
另一方面,不可预测的是,除了GFP以外的蛋白质可以有效地以可溶形式产生,并且能够在患病组织或细胞内形成稳定的、靶向的且没有任何会影响体内期望的生物分布的副作用(side-interactivity)的纳米颗粒。
此外,发明人还产生了毒素的纳米结构形式,其中在侧面有聚阳离子肽(比如T22肽)和带正电荷的富含氨基酸的区域(例如聚组氨酸残基)的细菌中产生蛋白质毒素片段。这些毒素是铜绿假单胞菌的外毒素、白喉毒素(二者均来自细菌)和植物毒素蓖麻毒素。所有这些毒素都通过充当“核糖体失活蛋白”(RIP)不可逆地抑制蛋白质合成,RIP是自然界中最有效的细胞毒素蛋白(特别是蓖麻毒素)。这些融合蛋白进一步包括蛋白酶切割位点(例如弗林蛋白酶切割位点),从而在内体逃逸期间,该蛋白在内体中被切割并以其活性毒素形式与很少的另外的氨基酸一起释放。该设计旨在在靶细胞的细胞质中释放活性形式的最“天然”版本。发明人使用含细菌毒素的融合蛋白获得的结果也是完全出乎意料的,因为如果在以下情况下则是无法预先预测的:
·毒素的选定区段将作为融合蛋白起作用,
·它们将以可溶形式在细菌中产生并自组装,
·它们仍会作为常规的寡聚纳米颗粒起作用,
·纳米颗粒在全身施用中将是稳定的和选择性的,
·蛋白酶活性位点在该具体的调节位点具有活性,
·蛋白酶切割将允许所得毒素区段的细胞毒素作用,
·活性毒素区段将到达细胞内部的其靶标,以进行适当的相互作用和核糖体失活。
本发明的融合蛋白
在第一方面中,本发明涉及一种融合蛋白,其包括
(i)聚阳离子肽,
(ii)间插多肽区,和
(iii)带正电荷的富含氨基酸的区域,
其中间插多肽区不是单独的荧光蛋白或人p53。
术语“融合蛋白”在本领域中是众所周知的,是指人工设计的单条多肽链,其包括来自不同来源的天然和/或人工的两个或更多个序列。按照定义,融合蛋白本身从未在自然界中发现过。
如本文使用的术语“单条多肽链”是指融合蛋白的多肽组分可以首尾缀合,但是也可以包括通过共价键连接的一个或多个插入其间的任选的肽或多肽“接头”或“间隔区”。
如本文所使用,术语“肽”或“多肽”通常是指用肽键连接在一起的约2至40个氨基酸残基的直链。应当理解,术语“肽键”、“肽”、“多肽”和蛋白质是本领域技术人员已知的。从这里开始,“肽”和“多肽”将无区别地使用。
如本文所使用,“氨基酸残基”是指本领域已知的任何天然存在的氨基酸、任何氨基酸衍生物或任何氨基酸模拟型。在某些实施方式中,蛋白质或肽的残基是连续的,没有中断氨基酸残基序列的任何非氨基酸。在其他实施方式中,该序列可以包括一个或多个非氨基酸部分。在具体实施方式中,蛋白质或肽的残基序列可以被一个或多个非氨基酸部分中断。
A.聚阳离子肽
如本文所使用,术语“聚阳离子肽”或“第一带正电荷的富含氨基酸的区域”对应于包含多个带正电荷的氨基酸的多肽序列。聚阳离子肽可以仅由带正电荷的氨基酸形成,或者可以包含其他氨基酸,条件是在pH 7下该区域的总的净电荷为正。
在本领域中众所周知,氨基酸及其相应的氨基酸残基具有取决于其侧链的不同的特性,并且可以根据那些特性分组。因此,在生理pH下,五种氨基酸显示电荷:精氨酸、组氨酸和赖氨酸带正电,而天冬氨酸和谷氨酸带负电。然后,本领域技术人员将认识到,本发明的聚阳离子肽对应于在生理pH条件下具有大于一个正电荷的净电荷的多肽。因此,只要总是有足够的带正电荷的氨基酸残基来产生两个或更多个净正电荷,本发明的聚阳离子肽不受一个或多个带负电荷的氨基酸残基的存在的限制。
因此,在本发明的一个实施方式中,本发明的聚阳离子肽选自:
(i)富含精氨酸的序列,
(ii)能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进融合蛋白在所述细胞上的内在化的序列,
(iii)GW-H1肽,
(iv)CD44配体,
(v)能够穿越血脑屏障的肽,
(vi)穿透肽的细胞,和
(vii)核仁素结合肽。
(i)富含精氨酸的序列
如前所述,精氨酸氨基酸及其残基在生理pH下呈现正电荷。将理解的是,“富含精氨酸的序列”是指包含多个精氨酸残基的多肽序列。因此,多肽序列可以包括其完整序列的氨基酸残基的33%,优选地40%,优选地45%,优选地50%,优选地55%,优选地60%,优选地65%,优选地70%,优选地75%,优选地80%,优选地85%,更优选地90%,更优选地95%,甚至更优选地99%,又甚至更优选地100%作为精氨酸残基。应当理解,每当富含精氨酸的序列的序列包括少于该序列的100%作为精氨酸残基时,这些残基不需要都彼此相邻或连续。
本领域技术人员将认识到,具有一个或多个精氨酸残基的多肽将是聚阳离子肽,只要在生理pH下该多肽的总正电荷为2或更大,这不仅是由精氨酸残基的正电荷所致,而且由其他任何带正电荷的氨基酸所致。
在本发明的实施方式中,本发明的聚阳离子肽是富含精氨酸的序列。
在本发明的优选实施方式中,本发明的聚阳离子肽的富含精氨酸的序列选自SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
(ii)能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进融合蛋白在所述细胞上的内在化的序列
如本文所使用,术语“能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进融合蛋白在所述细胞上的内在化的序列”是指与细胞表面上的受体结合的任何多肽序列,其中该受体响应所述多肽序列的结合而经历胞吞作用。这种结合特异性允许将多肽序列以及融合蛋白的其余部分(其为一部分)递送至表达所述受体的细胞、组织或器官。以这种方式,当向动物施用或与不同类型的细胞群体外接触时,包括所述多肽序列的融合蛋白将特异性针对所述细胞。
术语“受体”是指与称为“配体”的生物活性分子结合的细胞相关蛋白。“受体”和“配体”二者都是本领域技术人员通常已知的。
如本文所使用,“内在化”是指分子或包含分子的构建体与细胞膜外表面上的靶元件结合并且所得络合物被细胞内在化的过程。内在化可以在将所得络合物在细胞质内解离之后进行。然后,可以将靶元件与分子或构建体一起定位于特定的细胞区室。优选地,本发明的聚阳离子肽,除了促进内在化之外,还将促进融合蛋白的内体逃逸。
在另一个优选的实施方式中,本发明的融合蛋白包含允许蛋白易位至胞质溶胶并避免其溶酶体降解的肽。在一个实施方式中,允许蛋白质易位至胞质溶胶的肽是包括KDEL序列(SEQ DID NO.48)或由其组成的肽。在进一步优选的实施方式中,允许蛋白质易位至胞质溶胶的肽位于融合蛋白的C端结构域。
各种各样的摄取受体和载体以及甚至更广泛数量的受体特异性配体是本领域已知的。
可以被本发明的聚阳离子靶向的受体的非限制性实例包括血管紧张素受体、蛙皮素受体、缓激肽受体、降血钙素受体、趋化因子受体、胆囊收缩素受体、促肾上腺皮质激素释放因子受体、内皮素受体、肝配蛋白受体、甲酰肽受体、卷曲蛋白受体(Frizzledreceptor)、甘丙肽受体、生长激素促分泌素受体(Ghrelin)受体、神经激肽B受体、黑皮质素受体、神经肽FF/神经肽AF受体、神经肽S受体、神经肽W/神经肽B受体、神经肽Y受体、神经降压素受体、食欲素受体、肽P518受体、生长激素抑制素受体、速激肽受体、Toll样受体、血管加压素和催产素受体和VEGF受体。
在本发明的优选实施方式中,包括能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进融合蛋白在所述细胞上的内在化的序列的聚阳离子肽是CXCR4配体。
如本文所使用,术语“CXCR4”是指G蛋白偶联的七次跨膜趋化因子受体。像其他趋化因子受体一样,CXCR4通过介导白细胞的定向迁移和激活在免疫和炎症反应中起重要作用。CXCR4在多种癌细胞系和组织中表达或过表达,癌细胞系和组织包括乳腺、前列腺、肺、卵巢、结肠、胰腺、肾和脑,以及非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。CXCR4唯一已知的配体是基质细胞衍生因子-1(SDF-1或CXCL12)。CXCR4和SDF-1之间的相互作用在肿瘤发生的多个阶段,包括肿瘤生长、侵入、血管生成和转移中起着重要作用。
如本文所使用,表达“特异性结合CXCR4”是指与可选的受体或细胞相比,本发明的缀合物以更频繁、更迅速、更持久和/或更高的亲和力的能力与CXCR4或表达其的细胞结合,而基本上不与其他分子结合。
例如,通过油垫方法[参见Hesselgesset等人,1998,J.Immunol.,160:877-883]如Tamamura等人所描述的测量结合亲和力,该方法包括使肽与CXCR4转染的细胞系(例如CHO细胞)和标记的CXCR4配体(例如125I-SDF-1α)接触,并测量靶向肽对标记的CXCR4配体结合的抑制百分比。
例如,可以通过具有至少约10-4M的Kd的低亲和力靶向剂展现特异性结合。例如,如果CXCR4对配体具有多于一个结合位点,则具有低亲和力的配体可用于靶向。特异性结合也可以通过高亲和力配体展现,例如具有至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、至少约10- 10M的Kd或可具有至少约10-11M或10-12M或更高的Kd的配体。低亲和力和高亲和力靶向配体二者均可用于并入本发明的缀合物中。
如本文所使用,表达“促进内体逃逸”是指聚阳离子肽或内体逃逸肽在通过受体介导的胞吞作用内在化后诱导融合蛋白从内体区室释放的能力。
在缀合物包括荧光蛋白,比如GFP的情况下,可以通过荧光方法方便地确定本发明的缀合物被表达CXCR4的细胞内在化的能力。这样的融合蛋白可以通过制备重组核酸来获得,其中编码T22肽的核酸和荧光蛋白在框内融合并在合适的宿主细胞或生物中表达。然后使融合蛋白与表达CXCR4的细胞的培养物接触或在体内与表达CXCR4的组织接触合适的时间量,在此之后可以使用荧光显微镜来确定构建体是否穿透细胞。通过将由荧光蛋白产生的荧光显微镜图像与用已知细胞质染色获得的荧光显微镜图像进行比较,可以进一步研究细胞质中荧光的存在。
在本发明的甚至更优选的实施方式中,CXCR4配体选自T22肽(SEQ ID NO:5)、V1肽(SEQ ID NO:6)、CXCL12肽(SEQ ID NO:7)、vCCL2肽(SEQ ID NO:8)或其功能等同变体。
T22肽对应于源自蛋白质polyphemusin II的肽(从来自Lymulus polyphemus的血细胞碎片提取)。VCCL2对应于病毒巨噬细胞炎性蛋白-II,由人疱疹病毒8编码的人趋化因子CCL2的同源物。V1肽对应于vCCL2的N端的残基1-21。CXCL12,C-X-C基序趋化因子12,也称为基质细胞衍生因子1(SDF1),是充当促炎介质的趋化因子家族的成员。已知所有四种肽与CXCR4受体具有相互作用,如Liang,X.2008.Chem.Biol.Drug.Des.72:91-110中所显示。
在一个实施方式中,靶向肽选自:
—具有序列RRX1CYRKX2PYRX3CR(SEQ ID NO:9)的T140肽,其中X1是L-3-(2-萘基)丙氨酸,X2是D-Lys和X3是L-瓜氨酸。
—具有序列RRX1CYX2KX3PYRX4CR(SEQ ID NO:10)的TN14003肽,其中X1是L-3-(2-萘基)丙氨酸,X2是L-瓜氨酸,X3是dLys和X4是L-瓜氨酸,
—具有序列RRX1CYEKX2PYRX3CR(SEQ ID NO:11)的TC14012肽,其中X1是L-3-(2-萘基)丙氨酸,X2是D-瓜氨酸和X3是L-瓜氨酸,
—具有序列RRX1CYX2KX3PYRX4CR(SEQ ID NO:12)的TE14011肽,其中X1是L-3-(2-萘基)丙氨酸,X2是L-瓜氨酸,X3是D-Glu和X4是L-瓜氨酸,和
—具有序列RRX1CYX2KX3PYRX4CR(SEQ ID NO:13)的TZ14011肽,其中X1是L-3-(2-萘基)丙氨酸,X2是L-瓜氨酸,X3是D-Lys和X4是L-瓜氨酸,或其变体,其中N端精氨酸残基被乙酰化(已知的Ac-TZ14011)。
术语“功能变体”和“功能等同变体”是可互换的,并且在本文中应理解为通过修饰、插入和/或缺失一个或多个氨基酸而源自T22、V1、CXCL12和/或vCCL2肽的所有那些肽,条件是基本上保持结合CXCR4和内在化融合蛋白的功能。
在一个实施方式中,阳离子多肽的功能等同变体是根据其各自的SEQ ID NO,显示相对于人T22、V1、CXCL12和/或vCCL2肽大于至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度的那些。两个氨基酸序列之间的同一性程度可以通过常规方法来确定,例如,通过现有技术中已知的标准序列比对算法,比如例如BLAST[Altschul S.F.等人,J.Mol.Biol.,.1990Oct 5;215(3):403-10]。本发明的阳离子多肽可以包括翻译后修饰,比如糖基化、乙酰化、异戊酰化、豆蔻酰化、蛋白水解的加工等。
可选地,阳离子多肽的合适的功能变体是其中一个或多个位置含有氨基酸的那些,该氨基酸是上面提到的T22、V1、CXCL12和/或vCCL2肽中存在的氨基酸的保守取代。“保守氨基酸取代”是将一个氨基酸替换为具有相似结构和/或化学特性的另一个氨基酸所产生的。例如,以下六个基团各自包含彼此保守取代的氨基酸:1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。这种保守氨基酸取代的选择在本领域普通技术人员的能力范围内,并且例如由Dordo等人[J.Mol.Biol,1999,217;721-739]和Taylor等人[J.Theor.Biol.,1986,119:205-218]描述。
用于确定给定肽是否可以视为其功能等同变体的合适试验是例如以下试验:将推定的T22、V1、CXCL12或vCCL2肽变体与标记多肽(例如荧光蛋白)在框内融合。这样的融合蛋白可以通过制备重组核酸来获得,其中将编码肽和荧光蛋白的核酸在框内融合并在合适的宿主细胞或生物中表达。然后将融合蛋白与细胞CXCR4(例如HeLa细胞)的培养物接触适当的时间,在此之后可以使用荧光显微镜来确定构建体是否穿透细胞。如果肽是相应肽的功能上等同的变体,则标记蛋白将被内在化,并且在细胞的细胞质中将可见荧光的存在。此外,可以通过比较由荧光蛋白产生的荧光显微镜图像与用已知细胞质染色(例如DAPI)获得的荧光显微镜图像来分析功能等同变体的性能。
(iii)GW-H1肽
GW-H1肽先前由Chen和同事描述[Chen,Y-L.S.等人2012.Peptides,36:257-265]。首先选择了GW-H1肽作为抗微生物肽,但是它的特征还在于它具有结合细胞膜、将其自身内在化到细胞质中以及迁移到真核细胞的核中的能力。一旦在细胞内部,GW-H1就能诱导细胞凋亡。已经提出,GW-H1通过折叠成两亲性螺旋而发挥其细胞溶解活性[Chen和同事,同上]。因此,认为该肽通过两个连续事件发挥其细胞溶解作用,这两个连续事件包括结合至细胞膜,随后透化。
在本发明的优选实施方式中,本发明的聚阳离子肽是GW-H1肽,其具有SEQ ID NO:14。
(iv)CD44配体
CD44是参与细胞-细胞和细胞-基质相互作用、细胞粘附和迁移的细胞表面跨膜糖蛋白。CD44与炎症和疾病比如癌症有关[Bajorath,J.2000.Proteins.39:103-111]。已知许多同种型,它们以细胞特异性方式表达并且也被差异糖基化。
因此,“CD44配体”将是能够结合CD44的分子。CD44是透明质酸的主要表面受体,透明质酸是细胞外基质的组分,但是它具有其他配体,比如硫酸软骨素,纤连蛋白、骨桥蛋白、丝甘蛋白、胶原蛋白和层粘连蛋白的肝素抑制域。此外,CD44还可以与金属蛋白酶和选择素相互作用。
在本发明的实施方式中,本发明的聚阳离子肽是CD44配体。在本发明的优选实施方式中,CD44配体选自A5G27(SEQ ID NO:15)和FNI/II/V(SEQ ID NO:16)。
肽FNI/II/V对应于纤连蛋白的HBFN-片段V。肽A5G27对应于层粘连蛋白的α5链的肽[Pesarrodona,M等人.2014.Int.J.of Pharmaceutics.473:286-295]。
(v)能够穿越血脑屏障的肽
在本领域中众所周知,脑病理学治疗方法发展的主要障碍是血脑屏障(BBB)。通过两个屏障系统:血脑屏障(BBB)和血脑脊液屏障(BCSFB)的存在保护大脑抵挡潜在毒性物质。BBB被认为是摄取血清配体的主要途径,因为它的表面积比BCSFB大约5000倍。构成BBB的脑内皮细胞代表使用潜在药物对抗多种CNS病症的主要障碍。通常,只有小的亲脂性分子可以穿越BBB,即从血液循环系统到大脑。许多具有较小尺寸或较高疏水性的药物在用于治疗CNS病症的动物研究中显示出有希望的结果。
因此,“能够穿越血脑屏障的肽”将是能够将自身以及其所结合的任何分子,优选蛋白质,从血流转运至CNS的肽。
1983年,据报道,一种肽β-酪啡肽-5可以克服血脑屏障[Ermisch,A.等人1983.J.of Neurochemistry.41:1229-1233]。从那时起,许多其他具有BBB渗透特性的肽已被鉴定、表征和分类,并在2012年建立了一个全面的数据库,如Van Dorpe等人报道[VanDorpe,S.等人2012.Brain Struct.Funct.217:687-718]。前述数据库中列出的大多数肽都适用于本发明的融合蛋白。
在本发明的实施方式中,本发明的聚阳离子肽是能够穿越血脑屏障的肽。在本发明的优选实施方式中,能够穿越血脑屏障的肽选自Seq-1-7(SEQ ID NO:17)、Seq-1-8(SEQID NO:18)和Angiopep-2-7(SEQ ID NO:19)。
(vi)细胞穿透肽(CPP)
术语“细胞穿透肽”(CPP)是指长度通常为约5-60个氨基酸残基的肽,其可以促进分子货物特别是一部分蛋白质的细胞摄取。蛋白质可以呈现一种或多种CPP。CPP还可被表征为能够促进分子货物穿过/通过脂双层、细胞膜、细胞器膜、囊泡膜或细胞壁中的一个或多个的移动或越过。本文中的CPP将是聚阳离子的。在Schmidt等人[2010.FEBSLett.584:1806-18l3]、Holm等人[2006.Nature Protocols 1:1001-1005]、Yandek等人[2007.Biophys.J.92:2434-2444]、Morris等人[2001.Nat.Biotechnol.19:1173-1176]和美国专利申请公开号2014/0068797中公开了本文中有用的CPP的实例,和一般而言CPP的进一步描述。CPP不依赖转运蛋白或受体,从而促进了它们是其一部分的蛋白质直接通过脂质双层运输,而无需任何其他细胞组分的参与。
(vii)核仁素结合肽
核仁素是参与核糖体合成和成熟的真核磷蛋白。该蛋白质存在于多个细胞位置。已经描述了细胞表面核仁素如何参与癌细胞中的信号转导[Reyes-Reyes,E.&Akiyama,S.K.2008.Exp.Cell Res.314:2212-2223]以及细胞表面核仁素拮抗剂的使用如何抑制肿瘤生长和血管生成[Destouches,D.等人2008.PLoS One.3(6):e2518]。
因此,“核仁素结合肽”是能够结合细胞中的核仁素蛋白,优选结合至核仁素的细胞表面表达级分的肽。
在本发明的实施方式中,本发明的聚阳离子肽是核仁素结合肽。
国际专利申请公开号WO 2011/031477A2提供了适用于本发明的融合蛋白的核仁素结合肽的许多实例。
在本发明的优选实施方式中,本发明的核仁素结合肽是序列SEQ ID NO:20的肽。
B.带正电荷的富含氨基酸的区域
如本文所使用,术语“带正电荷的氨基酸”或“第二带正电荷的富含氨基酸的区域”是指不同于聚阳离子区域或第一带正电荷的富含氨基酸的区域的多肽序列,其特征在于它包含多个带正电荷的氨基酸。另外,带正电荷的富含氨基酸的区域可以仅由带正电荷的氨基酸形成,或者可以包含其他氨基酸,只要在pH 7下该区域的总的净电荷为正。因此,带正电荷的富含氨基酸的区域序列可以包括其完整序列的氨基酸残基的33%,优选地40%,优选地45%,优选地50%,优选地55%,优选地60%,优选地65%,优选地70%,优选地75%,优选地80%,优选地85%,更优选地90%,更优选地95%,甚至更优选地99%,又甚至更优选地100%作为带正电荷的氨基酸残基。
带正电荷的富含氨基酸的区域可以包含仅一种类型的带正电荷的氨基酸,或者可以包含多于一种类型的带正电荷的氨基酸。在一个实施方式中,带正电荷的富含氨基酸的区域是聚组氨酸区域。在一个实施方式中,带正电荷的富含氨基酸的区域是聚精氨酸区域。在一个实施方式中,带正电荷的富含氨基酸的区域是聚组氨酸区域。在一个实施方式中,带正电荷的富含氨基酸的区域包括赖氨酸和精氨酸残基。在一个实施方式中,带正电荷的富含氨基酸的区域包括赖氨酸和组氨酸残基。在一个实施方式中,带正电荷的富含氨基酸的区域包括精氨酸和组氨酸残基。在一个实施方式中,带正电荷的富含氨基酸的区域包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸残基。
在一些实施方式中,带正电荷的富含氨基酸的区域包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个带正电荷的氨基酸残基,其中带正电荷的氨基酸可以是组氨酸、赖氨酸、精氨酸或其组合。
在一些实施方式中,带正电荷的富含氨基酸的区域包括少于100个、少于90个、少于80个、少于70个、少于60个、少于50个、少于40个、少于30个、少于29个、少于28个、少于27个、少于26个、少于25个、少于24个、少于23个、少于22个、少于21个、少于20个、少于19个、少于18个、少于17个、少于16个、少于15个、少于14个、少于13个、少于12个、少于11个、少于10个或更少的带正电荷的氨基酸残基,其中带正电荷的氨基酸可以是组氨酸、赖氨酸、精氨酸或其组合。
在一些实施方式中,带正电荷的富含氨基酸的区域包括2至50个氨基酸,2至40个氨基酸,2至30个氨基酸,2至25个氨基酸,2至20个氨基酸,2至10个氨基酸或2至8个氨基酸。
在一些实施方式中,带正电荷的富含氨基酸的区域包括3至50个氨基酸,3至40个氨基酸,3至30个氨基酸,3至25个氨基酸,3至20个氨基酸,3至10个氨基酸或3至8个氨基酸。在一些实施方式中,带正电荷的富含氨基酸的区域包括4至50个氨基酸,4至40个氨基酸,4至30个氨基酸,4至25个氨基酸,4至20个氨基酸,4至10个氨基酸或4至8个氨基酸。在一些实施方式中,带正电荷的富含氨基酸的区域包含5至50个氨基酸,5至40个氨基酸,5至30个氨基酸,5至25个氨基酸,5至20个氨基酸,5至10个氨基酸或5至8个氨基酸。
在本发明的实施方式中,本发明的融合蛋白的带正电荷的富含氨基酸的区域是聚组氨酸区域。在本发明的优选实施方式中,聚组氨酸区域包括2至10个连续的组氨酸残基。
在本发明的实施方式中,本发明的融合蛋白的带正电荷的富含氨基酸的区域是聚精氨酸区域。在本发明的优选实施方式中,聚精氨酸区域包括2至10个连续的精氨酸残基。
在本发明的实施方式中,本发明的融合蛋白的带正电荷的富含氨基酸的区域是聚赖氨酸区域。在本发明的优选实施方式中,聚赖氨酸区域包括2至10个连续的聚赖氨酸残基。
C.融合蛋白的元件和连接元件的相对位置
本发明的融合蛋白(聚阳离子肽、间插多肽区和带正电荷的富含氨基酸的区域)的不同元件可以以任何相对顺序放置,只要聚阳离子肽和带正电荷的富含氨基酸的区域在融合蛋白的任何位置上都起作用,并且间插多肽区还维持全部或部分功能。
如本文所使用,多肽的术语“N末端”、“N端”和“氨基末端”是没有区别的。同样地,术语“C末端”、“C端”和“羧基末端”被认为是等同的。关于蛋白质所包括的多肽链末端的氨基酸的游离部分,这些术语是本领域技术人员的习惯用语。
因此,在本发明的实施方式中,融合蛋白的聚阳离子肽位于蛋白质的N末端,而融合蛋白的带正电荷的富含氨基酸的区域位于蛋白质的C末端。在本发明的另一个实施方式中,融合蛋白的带正电荷的富含氨基酸的区域位于蛋白质的N末端,而融合蛋白的聚阳离子肽位于蛋白质的C末端。在本发明的另一个实施方式中,间插多肽区可以位于融合蛋白的C末端或N末端,而聚阳离子肽在融合蛋白的中间位置,和带正电荷的富含氨基酸的区域在与间插多肽区相对的融合蛋白的末端,或者带正电荷的富含氨基酸的区域在融合蛋白的中间位置,和聚阳离子肽位于与间插多肽区相对的融合蛋白的末端。
因此,根据本发明的融合蛋白的元件的相对顺序可以是:
■N-聚阳离子肽-间插区多肽-带正电荷的富含氨基酸的区域-C;
■N-带正电荷的富含氨基酸的区域-间插区多肽-聚阳离子肽-C;
■N-聚阳离子肽-带正电荷的富含氨基酸的区域-间插区多肽-C;
■N-带正电荷的富含氨基酸的区域-聚阳离子肽-间插区多肽-C;
■N-间插区多肽-聚阳离子肽-带正电荷的富含氨基酸的区域-C;或
■N-间插区多肽-带正电荷的富含氨基酸的区域-聚阳离子肽-C
术语“N末端”和“C末端”并不意味着该组分需要直接首尾缀合,而是它们维持该位置的相对顺序,而与另外的元件比如接头/间隔区是否存于组分末端或是否插入在其间无关。
因此,本发明的融合蛋白包括上述元件((1)聚阳离子肽,(2)间插多肽区,和(3)带正电荷的富含氨基酸的区域),并且这些可以首尾缀合,但是也可以包括优选地通过肽键连接的插入它们之间的一种或多种任选的肽或多肽“接头”或“间隔区”。
根据本发明,间隔区或接头氨基酸序列可以充当组分(1)和(2),(2)和(3)以及(1)和(3)之间的铰链区,该铰链区允许它们彼此独立地移动,同时维持个体结构域的三维形式,使得肽间隔区或接头的存在不会改变组分(1)、(2)和(3)的任何一个的官能度。在这个意义上,根据本发明的优选的中间氨基酸序列将是铰链区,其特征在于允许该移动的结构延性。在具体实施方式中,所述中间氨基酸序列是柔性接头。接头区域的作用是提供在组分(1)和(2)以及(2)和(3)之间的空间。因此确保了组分(1)、(2)或(3)的二级和三级结构不受其他任何一个的存在的影响。间隔区具有多肽性质。接头肽优选地包括至少2个氨基酸,至少3个氨基酸,至少5个氨基酸,至少10个氨基酸,至少15个氨基酸,至少20个氨基酸,至少30个氨基酸,至少40个氨基酸氨基酸,至少50个氨基酸,至少60个氨基酸,至少70个氨基酸,至少80个氨基酸,至少90个氨基酸或大约100个氨基酸。
间隔区或接头可以通过共价键,优选通过肽键,侧面有本发明的缀合物的两种组分的组分结合;并且还优选地间隔区基本上是功能性的,和/或不倾向于蛋白水解的切割,和/或不包括任何半胱氨酸残基。类似地,间隔区的三维结构优选地是线性的或基本上线性的。
间隔区或接头肽的优选实例包括已经用于结合蛋白质而基本上不降低结合肽的功能或至少基本上不降低结合肽的一个的功能的那些。更优选地,用于结合肽的间隔区或接头包括卷曲螺旋结构。
接头肽的优选实例包括选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的2个或更多个氨基酸。柔性接头的优选实例是聚甘氨酸接头。接头/间隔区序列的可能实例包括SGGTSGSTSGTGST(SEQ ID NO:21)、AGSSTGSSTGPGSTT(SEQ ID NO:22)或GGSGGAP(SEQ IDNO:23)。这些序列已被用于将设计的卷曲螺旋与其他蛋白质结构域结合[Muller,K.M.,Arndt,K.M.and Alber,T.,Meth.Enzimology,2000,328:261-281]。合适的接头的进一步的非限制性实例包括氨基酸序列GGGVEGGG(SEQ ID NO:24),鼠IgG3的上铰链区的10个氨基酸残基的序列(PKPSTPPGSS,SEQ ID NO:25),该序列已被用于通过卷曲螺旋产生二聚化抗体[Pack,P.and Pluckthun,A.,1992,Biochemistry 31:1579-1584],序列APAETKAEPMT(SEQID NO:26)的肽,序列GAP的肽,序列AAA的肽和序列AAALE的肽。
可选地,本发明的融合蛋白的组分可以通过肽连接,该肽的序列含有针对蛋白酶的切割靶位点,因此可以分离任何组分。适合将其并入本发明的多肽中的蛋白酶切割位点包括肠激酶(切割位点DDDDK,SEQ ID NO:27)、因子Xa(切割位点IEDGR,SEQ ID NO:28)、凝血酶(切割位点LVPRGS,SEQ ID NO:29)、TEV蛋白酶(切割位点ENLYFQG,SEQ ID NO:30)、PreScission蛋白酶(切割位点LEVLFQGP,SEQ ID NO:31)、弗林蛋白酶(切割位点GNRVRRSV,SEQ ID NO.46或RHRQPRGWEQL,SEQ ID NO.47)内含肽等。在优选的实施方式中,靶切割位点针对蛋白酶弗林蛋白酶(切割位点GNRVRRSV,SEQ ID NO.46或RHRQPRGWEQL,SEQ IDNO.47)。
在另一个优选的实施方式中,针对蛋白酶的切割靶位点位于本发明的融合蛋白的任何组分之间。在更优选的实施方式中,融合蛋白包括几个切割靶位点,每个切割靶位点包括在融合蛋白的不同组分之间,这是在聚阳离子肽和间插肽之间,和/或在间插肽和带正电荷的富含氨基酸的区域之间,更具体地,在聚阳离子肽的C端,在间插肽的N端,在间插肽的C端,和/或在带正电荷的富含氨基酸的区域的N端。在甚至更优选的实施方式中,切割靶位点位于聚阳离子肽和间插肽之间,又更优选地在间插多肽的N端。在另一个优选的实施方式中,它位于聚阳离子肽的C端。
在另一个优选的实施方式中,本发明的切割位点位于如本文所描述的连接基团的C端或N端,其位于本发明的融合蛋白任何组分之间。
因此,在本发明的实施方式中,聚阳离子肽通过接头与间插多肽区结合。在本发明的另一个实施方式中,间插多肽区通过接头与带正电荷的富含氨基酸的区域结合。在本发明的又另一个实施方式中,聚阳离子肽通过接头与间插多肽区结合,和间插多肽区也通过接头与带正电荷的氨基酸区域结合。
如本领域技术人员将认识到的,将聚阳离子肽连接至间插多肽区和将间插多肽区连接至带正电荷的富含氨基酸的区域的接头可以包括相同的序列或不同的序列,但存在前面提到的限制,即接头的存在和/或序列不会导致聚阳离子肽、间插多肽区和/或带正电荷的富含氨基酸的区域的功能改变(例如,但不限于由于融合蛋白的二级或三级结构修饰或二硫键的形成)。
关于融合蛋白的元件从N末端到C末端的相对位置的上述考虑也适用于它们之间存在接头的情况,而与它们的数量或在它们之间放置什么元件无关。因此,元素的可能组合和相对顺序如下(其中保留了元件的上述编号:(1)聚阳离子肽,(2)间插多肽区,(3)带正电荷的富含氨基酸的区域):
■N-(1)-(2)-(3)-C
■N-(1)-接头-(2)-(3)-C
■N-(1)-(2)-接头-(3)-C
■N-(1)-接头-(2)-接头-(3)-C
■N-(3)-(2)-(1)-C
■N-(3)-接头-(2)-(1)-C
■N-(3)-(2)-接头-(1)-C
■N-(3)-接头-(2)-接头-(3)-C
■N-(2)-(1)-(3)-C
■N-(2)-接头-(1)-(3)-C
■N-(2)-(1)-接头-(3)-C
■N-(2)-接头-(1)-接头-(3)-C
■N-(2)-(3)-(1)-C
■N-(2)-接头-(3)-(1)-C
■N-(2)-(3)-接头-(1)-C
■N-(2)-接头-(3)-接头-(1)-C
■N-(1)-(3)-(2)-C
■N-(1)-(3)-接头-(2)-C
■N-(1)-接头-(3)-(2)-C
■N-(1)-接头-(3)-接头-(2)-C
■N-(3)-(1)-(2)-C
■N-(3)-接头-(1)-(2)-C
■N-(3)-(1)-接头-(2)-C
■N-(3)-接头-(1)-接头-(2)-C
在本发明的优选实施方式中,本发明的融合蛋白的接头包括序列GGSSRSS(SEQ IDNO:32)、GGGNS序列(SEQ ID NO:33)的序列。
关于融合蛋白元件从N末端到C末端的相对位置的上述考虑也适用于存在蛋白酶切割位点或在它们之间包含蛋白酶切割位点的多肽的情况,而与它们的数量或在它们之间放置什么元件无关。因此,元件的可能组合和相对顺序如下(其中保留了元件的上述编号:(1)聚阳离子肽,(2)间插多肽区,(3)带正电荷的富含氨基酸的区域),并且其中术语“蛋白酶切割位点”应理解为由蛋白酶切割位点组成或包括蛋白酶切割位点的多肽区域:
■N-(1)-(2)-(3)-C
■N-(1)-蛋白酶切割位点-(2)-(3)-C
■N-(1)-(2)-蛋白酶切割位点-(3)-C
■N-(1)-蛋白酶切割位点-(2)-蛋白酶切割位点-(3)-C
■N-(3)-(2)-(1)-C
■N-(3)-蛋白酶切割位点-(2)-(1)-C
■N-(3)-(2)-蛋白酶切割位点-(1)-C
■N-(3)-蛋白酶切割位点-(2)-蛋白酶切割位点-(1)-C
■N-(2)-(1)-(3)-C
■N-(2)-蛋白酶切割位点-(1)-(3)-C
■N-(2)-(1)-蛋白酶切割位点-(3)-C
■N-(2)-蛋白酶切割位点-(1)-蛋白酶切割位点-(3)-C
■N-(2)-(3)-(1)-C
■N-(2)-蛋白酶切割位点-(3)-(1)-C
■N-(2)-(3)-蛋白酶切割位点-(1)-C
■N-(2)-蛋白酶切割位点-(3)-蛋白酶切割位点-(1)-C
■N-(1)-(3)-(2)-C
■N-(1)-(3)-蛋白酶切割位点-(2)-C
■N-(1)-蛋白酶切割位点-(3)-(2)-C
■N-(1)-蛋白酶切割位点-(3)-蛋白酶切割位点-(2)-C
■N-(3)-(1)-(2)-C
■N-(3)-蛋白酶切割位点-(1)-(2)-C
■N-(3)-(1)-蛋白酶切割位点-(2)-C
■N-(3)-蛋白酶切割位点-(1)-蛋白酶切割位点-(2)-C。
在可选地实施方式中,根据本发明的融合蛋白包含连接融合蛋白的元件的接头区域以及它们之间的蛋白酶切割位点,而与它们的数量或它们之间放置什么元件无关。因此,元素的可能组合和相对顺序如下(其中保留了上述元素的编号:(1)聚阳离子肽,(2)间插多肽区,(3)带正电荷的富含氨基酸的区域),并且其中术语“蛋白酶切割位点”应理解为由蛋白酶切割位点组成或包括蛋白酶切割位点的多肽区域:
■N-(1)-(2)-(3)-C
■N-(1)-接头-蛋白酶切割位点-(2)-(3)-C
■N-(1)-蛋白酶切割位点–接头-(2)-(3)-C
■N-(1)-接头-蛋白酶切割位点-接头-(2)-(3)-C
■N-(1)-(2)-蛋白酶切割位点–接头-(3)-C
■N-(1)-(2)-接头-蛋白酶切割位点-(3)-C
■N-(1)-(2)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(3)-C
■N-(1)-接头-蛋白酶切割位点-(2)-蛋白酶切割位点-(3)-C
■N-(1)-蛋白酶切割位点-接头(2)-蛋白酶切割位点-(3)-C
■N-(1)-接头-蛋白酶切割位点-接头(2)-蛋白酶切割位点-(3)-C
■N-(1)-蛋白酶切割位点-(2)-接头-蛋白酶切割位点-(3)-C
■N-(1)-蛋白酶切割位点-(2)-蛋白酶切割位点–接头-(3)-C
■N-(1)-蛋白酶切割位点-(2)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(3)-C
■N-(1)-接头-蛋白酶切割位点-(2)-接头-蛋白酶切割位点-(3)-C
■N-(1)-蛋白酶切割位点-接头(2)-蛋白酶切割位点–接头-(3)-C
■N-(1)-接头-蛋白酶切割位点-接头(2)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(3)-C
■N-(3)-接头-蛋白酶切割位点-(2)-(1)-C
■N-(3)-蛋白酶切割位点–接头-(2)-(1)-C
■N-(3)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(2)-(1)-C
■N-(3)-(2)-接头-蛋白酶切割位点-(1)-C
■N-(3)-(2)-蛋白酶切割位点–接头-(1)-C
■N-(3)-(2)-接头-蛋白酶切割位点–接头(1)-C
■N-(3)-接头-蛋白酶切割位点-(2)-蛋白酶切割位点-(1)-C
■N-(3)-蛋白酶切割位点–接头-(2)-蛋白酶切割位点-(1)-C
■N-(3)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(2)-蛋白酶切割位点-(1)-C
■N-(3)-蛋白酶切割位点-(2)-接头-蛋白酶切割位点-(1)-C
■N-(3)-蛋白酶切割位点-(2)-蛋白酶切割位点–接头-(1)-C
■N-(3)-蛋白酶切割位点-(2)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(1)-C
■N-(3)-接头-蛋白酶切割位点-(2)-接头-蛋白酶切割位点-(1)-C
■N-(3)-蛋白酶切割位点–接头-(2)-接头-蛋白酶切割位点(1)-C
■N-(3)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(2)-接头-蛋白酶切割位点-(1)-C
■N-(3)-接头-蛋白酶切割位点-(2)--蛋白酶切割位点–接头-(1)-C
■N-(3)-蛋白酶切割位点–接头-(2)-蛋白酶切割位点–接头-(1)-C
■N-(3)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(2)-蛋白酶切割位点-接头(1)-C
■N-(3)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(2)-接头-蛋白酶切割位点-接头-(1)-C
■N-(2)-接头-蛋白酶切割位点-(1)-(3)-C
■N-(2)-蛋白酶切割位点–接头-(1)-(3)-C
■N-(2)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(1)-(3)-C
■N-(2)-(1)-接头-蛋白酶切割位点-(3)-C
■N-(2)-(1)-蛋白酶切割位点–接头-(3)-C
■N-(2)-(1)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(3)-C
■N-(2)-接头-蛋白酶切割位点-(1)-蛋白酶切割位点-(3)-C
■N-(2)-蛋白酶切割位点–接头-(1)-蛋白酶切割位点-(3)-C
■N-(2)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(1)-蛋白酶切割位点-(3)-C
■N-(2)-蛋白酶切割位点-(1)-接头-蛋白酶切割位点-(3)-C
■N-(2)-蛋白酶切割位点-(1)-蛋白酶切割位点–接头-(3)-C
■N-(2)-蛋白酶切割位点-(1)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(3)-C
■N-(2)-接头-蛋白酶切割位点-(3)-(1)-C
■N-(2)-蛋白酶切割位点–接头-(3)-(1)-C
■N-(2)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(3)-(1)-C
■N-(2)-(3)-接头-蛋白酶切割位点-(1)-C
■N-(2)-(3)-蛋白酶切割位点–接头-(1)-C
■N-(2)-(3)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(1)-C
■N-(2)-接头-蛋白酶切割位点-(3)-蛋白酶切割位点-(1)-C
■N-(2)-蛋白酶切割位点–接头-(3)-蛋白酶切割位点-(1)-C
■N-(2)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(3)-蛋白酶切割位点-(1)-C
■N-(2)-蛋白酶切割位点-(3)-接头-蛋白酶切割位点-(1)-C
■N-(2)-蛋白酶切割位点-(3)-蛋白酶切割位点–接头-(1)-C
■N-(2)-蛋白酶切割位点-(3)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(1)-C
■N-(1)-(3)-接头-蛋白酶切割位点-(2)-C
■N-(1)-(3)-蛋白酶切割位点–接头-(2)-C
■N-(1)-(3)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(2)-C
■N-(1)-接头-蛋白酶切割位点-(3)-(2)-C
■N-(1)-蛋白酶切割位点–接头-(3)-(2)-C
■N-(1)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(3)-(2)-C
■N-(1)-接头-蛋白酶切割位点-(3)-蛋白酶切割位点-(2)-C
■N-(1)-蛋白酶切割位点–接头-(3)-蛋白酶切割位点-(2)-C
■N-(1)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(3)-蛋白酶切割位点-(2)-C
■N-(1)-蛋白酶切割位点-(3)-接头-蛋白酶切割位点-(2)-C
■N-(1)-蛋白酶切割位点-(3)-蛋白酶切割位点–接头-(2)-C
■N-(1)-蛋白酶切割位点-(3)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(2)-C
■N-(3)-接头-蛋白酶切割位点-(1)-(2)-C
■N-(3)-蛋白酶切割位点–接头-(1)-(2)-C
■N-(3)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(1)-(2)-C
■N-(3)-(1)-接头-蛋白酶切割位点-(2)-C
■N-(3)-(1)-蛋白酶切割位点–接头-(2)-C
■N-(3)-(1)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(2)-C
■N-(3)-接头-蛋白酶切割位点-(1)-蛋白酶切割位点-(2)-C。
■N-(3)-蛋白酶切割位点–接头-(1)-蛋白酶切割位点-(2)-C。
■N-(3)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(1)-蛋白酶切割位点-(2)-C。
■N-(3)-接头-蛋白酶切割位点-(1)-接头-蛋白酶切割位点-(2)-C。
■N-(3)-蛋白酶切割位点–接头-(1)-接头-蛋白酶切割位点-(2)-C。
■N-(3)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(1)-接头-蛋白酶切割位点-(2)-C。
■N-(3)-接头-蛋白酶切割位点-(1)-蛋白酶切割位点–接头-(2)-C。
■N-(3)-蛋白酶切割位点–接头-(1)-蛋白酶切割位点–接头-(2)-C。
■N-(3)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(1)-蛋白酶切割位点–接头-(2)-C。
■N-(3)-接头-蛋白酶切割位点-(1)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(2)-C。
■N-(3)-蛋白酶切割位点–接头-(1)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(2)-C。
■N-(3)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(1)-接头-蛋白酶切割位点–接头-(2)-C。
■N-(3)-蛋白酶切割位点-(1)-接头-蛋白酶切割位点-(2)-C。
■N-(3)-蛋白酶切割位点-(1)-蛋白酶切割位点–接头-(2)-C。
■N-(3)-蛋白酶切割位点-(1)-接头-蛋白酶切割位点–接头(2)-C。
D.间插多肽区
术语“间插多肽区”和“间插区域”在本文中被认为是等同的。
本发明的融合蛋白的间插多肽区包括生理功能肽,这意味着其与细胞组分的相互作用导致生理变化。因此,将连接根据本发明的融合蛋白的不同元件的接头区域不被视为间插区域。因此,在优选的实施方式中,间插区域包括至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个或更多个氨基酸。
在本发明的实施方式中,本发明的融合蛋白的间插多肽区是治疗剂。
术语“治疗(therapeutic)”以一般含义使用,并且包括治疗剂、预防剂和替代剂。
间插区域的本质是多肽,因为它是具有聚阳离子肽和带正电荷的富含氨基酸的区域的本发明的融合蛋白的一部分。
可用作间插区域的组分的合适的多肽包括能够促进细胞增殖速率降低的任何多肽。
适用于本发明的融合蛋白的间插区域的治疗蛋白的实例包括但不限于细胞毒素多肽、抗血管生成多肽、由肿瘤抑制基因编码的多肽、由能够激活针对肿瘤的免疫应答的多核苷酸编码的多肽。
因此,在本发明的实施方式中,本发明的融合蛋白的间插区域的治疗剂选自:
(i)细胞毒素多肽,
(ii)抗血管生成多肽,
(iii)由肿瘤抑制基因编码的多肽,
(iv)促凋亡多肽,
(v)具有抗转移活性的多肽,
(vi)由能够激活针对肿瘤的免疫应答的多核苷酸编码的多肽,
(vii)化疗剂,
(viii)抗血管生成分子,
(ix)由自杀基因编码的多肽,
(x)伴侣蛋白或蛋白质聚集抑制剂。
(i)细胞毒素多肽
如本文所使用,术语细胞毒素多肽是指能够抑制细胞功能的试剂。该试剂可抑制增殖或对细胞有毒。当被细胞内在化时干扰或不利地改变细胞代谢或以任何方式抑制细胞生长或增殖的任何多肽都包括在该术语的范围内,包括但不限于,当转运到细胞内时介导其毒性作用的试剂,以及在细胞表面介导其毒性作用的那些。有用的细胞毒素多肽包括蛋白质毒素和细菌毒素。
可用于并入根据本发明的缀合物的蛋白质细胞毒素的实例包括但不限于一型和二型核糖体失活蛋白(RIP)。有用的一型植物RIP包括但不限于石竹素30、石竹素32、剪秋罗甙、皂角苷1-9、商陆活化蛋白(PAP)、PAP II、PAP-R、PAP-S、PAP-C、mapalmin、商陆毒蛋白、异珠泻根毒蛋白-L、异珠泻根毒蛋白、大肠杆菌素1和2、软瓜蛋白-A、软瓜蛋白-B、软瓜蛋白-S、19K-蛋白合成抑制蛋白(PSI)、15K-PSI、9K-PSI、α-kirilowin、β-kirilowin、白树毒素、苦瓜蛋白、苦瓜蛋白-II、苦瓜蛋白-Ic、MAP-30、α-苦瓜素、β-苦瓜素、天花粉蛋白、TAP-29、栝楼素;大麦RIP;亚麻RIP、麦芽凝集素、玉米RIP、阿司匹林1和2[Stirpe等人,1992.Bio/Technology 10:405-12]。有用的二型RIP包括但不限于沃氏藤黄辛(volkensin)、蓖麻毒素、接骨木毒蛋白-b、CIP-29、相思豆毒素(abrin)、蒴莲根毒素(modeccin)、核糖体失活蛋白-[α]、核糖体失活蛋白-[β]、核糖体失活蛋白-[γ]、vircumin、黄樟毒蛋白(porrectin),以及其生物活性酶亚基[Stirpe等人,1992.Bio/Technology 10:405-12;Pastan等人,1992.Annu.Rev.Biochem.61:331-54;Brinkmann andPastan,1994.Biochim.et Biophys.Acta 1198:27-45;and Sandvig and Van Deurs,1996.Physiol.Rev.76:949-66]。
可用作细胞毒素的细菌毒素的实例包括但不限于志贺毒素和志贺样毒素(即,具有相同活性或结构的毒素),以及其催化亚基和生物功能片段。有用的细菌毒素的另外的实例包括但不限于假单胞菌外毒素和白喉毒素[Pastan等人,1992.Annu.Rev.Biochem.61:331-54;和Brinkmann and Pastan,1994.Biochim.et Biophys.Acta 1198:27-45]。毒素酶亚基的截短形式和突变体也可用作细胞毒素部分。其他靶向剂包括但不限于所描述的多于34种的核糖核酸酶毒素的大肠杆菌素家族,包括大肠杆菌素A、B、D、E1-9、阴沟肠杆菌素DF13和真菌核糖核酸酶、[α]-八叠球菌[Ogawa等人1999.Science 283:2097-100;Smarda等人,1998.Folia Microbiol(Praha)43:563-82;Wool等人,1992.Trends Biochem.Sci.,17:266-69]。
(ii)抗血管生成多肽
肿瘤细胞的增殖在很大程度上依赖于伴随癌症进展的广泛的肿瘤血管形成。因此,已经引入用抗血管生成剂抑制新血管形成和靶向破坏现有血管作为有效且相对无毒的肿瘤治疗方法。
如本文所使用,术语“抗血管生成多肽”表示能够抑制血管生成的多肽。合适的抗血管生成多肽包括但不限于血管抑素、内皮抑素、抗血管生成抗凝血酶III、如WO2007115376中所描述的sFRP-4,以及抗VEGF抗体,比如雷珠单抗(anibizumab)、贝伐单抗(阿瓦斯汀)、Fab IMC 1121和F200 Fab。
(iii)由肿瘤抑制基因编码的多肽
如本文所使用,“肿瘤抑制因子”是具有抑制细胞失调生长的正常生物学作用的基因或基因产物。肿瘤抑制因子的功能对应物是癌基因——促进正常细胞生长的基因可能被称为“原癌基因”。激活这种基因或基因产物的突变将其进一步转化为“癌基因”,该“癌基因”继续细胞生长活性,但是以失调方式。肿瘤抑制基因和基因产物的实例在文献中是众所周知的,并且可能包括PTC、BRCA1、BRCA2、p16、APC、RB、WTl、EXT1、p53、NF1、TSC2、NF2、VHL、ST7、ST14、PTEN、APC、CD95或SPARC。
(iv)促凋亡多肽
如本文所使用,术语“促凋亡多肽”是指能够在细胞或细胞群中诱导细胞死亡的蛋白质。这些参与凋亡的蛋白质的过表达将抗凋亡因子与促凋亡因子之间的谨慎平衡转移到了凋亡的结局。合适的促凋亡多肽包括但不限于蛋白质的BCL-2家族的促凋亡成员,比如BAX、BAK、BOK/MTD、BID、BAD、BIK/NBK、BLK、HRK、BIM/BOD、BNIP3、NIX、NOXA、PUMA、BMF、EGL-I和病毒同源物,半胱天冬酶比如半胱天冬酶-8,腺病毒E4orf4基因,p53途径基因,促凋亡配体比如TNF、FasL、TRAIL和/或其受体,比如TNFR、Fas、TRAIL-R1和TRAIL-R2。
(v)具有抗转移活性的多肽
如本文所使用,术语“转移抑制因子”是指起到减慢或防止转移(继发性肿瘤)在患有癌症的生物体内扩散作用的蛋白质。合适的转移抑制因子包括但不限于蛋白质,比如BRMS l、CRSP3、DRGl、KAI1、KISS-l、NM23、TIMP家族蛋白质和子宫珠蛋白。
(vi)由能够激活针对肿瘤的免疫应答的多核苷酸编码的多肽
如本文所使用,免疫刺激性多肽剂是由能够在向其施用的受试者中激活或刺激免疫应答(包括增强先前存在的免疫应答)的多核苷酸编码的多肽,无论是单独还是与另一种药剂组合。免疫刺激肽的合适的非限制性实例包括鞭毛蛋白、胞壁酰二肽、包括白细胞介素的细胞因子(例如,IL-2、IL-7、IL-15(或这些细胞因子的超激动剂/突变体形式)、IL-12、IFN-γ、IFN-α、GM-CSF、FLT3-配体等)、免疫刺激抗体(例如,这些分子的抗CTLA-4、抗CD28、抗CD3或单链/抗体片段)等。
(vii)化疗剂
应当理解,术语“化疗剂”是指抗癌剂。
如本文所使用,抗癌剂是至少部分抑制癌症发展或进展的药剂,包括即使仅在短期内抑制与癌症有关的全部或部分症状。
合适的抗癌剂包括干扰素α-2a;干扰素α-2b;干扰素α-nl;干扰素α-n3;干扰素β-Ia;干扰素γ-I b。
抗癌剂可以是酶抑制剂,包括但不限于酪氨酸激酶抑制剂、CDK抑制剂、MAP激酶抑制剂或EGFR抑制剂。CDK抑制剂可以是但不限于p21、p27、p57、pl5、pl6、pl8或pl9。
抗癌剂可以是抗体或抗体片段,包括但不限于抗体或抗体片段,包括但不限于贝伐单抗(AVASTIN)、曲妥珠单抗(HERCEPTIN)、阿仑单抗(CAMPATH,指示用于B细胞慢性淋巴细胞白血病)、吉妥珠单抗(MYLOTARG,hP67.6,抗CD33,指示用于白血病,比如急性髓细胞白血病)、利妥昔单抗(RITUXAN)、托西莫单抗(BEXXAR,抗CD20,指示用于B细胞恶性肿瘤)、MDX-210(同时与HER-2/neu癌基因蛋白产物和免疫球蛋白G(IgG)(FcγRI)的I型Fc受体结合的双特异性抗体)、奥戈伏单抗(OVAREX,指示用于卵巢癌)、依决洛单抗(PANOREX)、达利珠单抗(ZENAPAX)、帕利珠单抗(SYNAGIS,指示用于呼吸道病症,比如RSV感染)、替伊莫单抗(ZEVALIN,指示用于非霍奇金淋巴瘤)、西妥昔单抗(ERBITUX)、MDX-447、MDX-22、MDX-220(抗TAG-72),I0R-C5,10R-T6(抗CD 1)、IOR EGF/R3、西洛伐单抗(celogovab)(ONCOSCINTOV 103)、依帕珠单抗(LYMPHOCIDE)、培妥莫单抗(THERAGYN)、和格里奥单抗-H(Gliomab-H)(指示用于脑癌、黑素瘤)。
(viii)抗血管生成分子
还考虑了在某些实施方式中,本发明的融合蛋白的间插区域对应于充当血管生成抑制剂的蛋白质,该蛋白质靶向肿瘤。除上述抗血管生成多肽外,这些试剂包括马立马司他;AG3340;COL-3、BMS-275291、沙利度胺、内皮抑素、SU5416、SU6668、EMD121974、2-甲氧基雌二醇、羧酰胺基三唑、CMlOl、戊聚糖多硫酸盐、血管生成素2(Regeneron),除草霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利诺胺、沙利度胺、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP470、内皮抑素、紫杉醇、accutin、血管抑素、西多福韦、长春新碱、博莱霉素、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素。还包括VEGF抑制剂,包括但不限于贝伐单抗(AVASTIN)、雷珠单抗(LUCENTIS)、派加他尼(MACUGEN)、索拉非尼、舒尼替尼(SUTENT)、瓦他拉尼、ZD-6474(ZACTIMA)、anecortave(RETAANE)、角鲨胺乳酸盐和轴突导向因子。
(ix)由自杀基因编码的多肽
在本发明的上下文中,“由自杀基因编码的多肽”是指这样的多肽,该多肽的表达导致表达其的细胞通过细胞凋亡杀死自身。该方法包括仅在特定细胞中选择性表达自杀基因,尽管例如仅在实际上患有该疾病的细胞中被激活的特定启动子的使用被抑制。
这种方法包括使用成对的酶和前药,其中在使用前药之前,该酶用于转化靶细胞,前药在酶的作用下成为启动细胞凋亡过程的对细胞有毒的产物。通常,这些自杀基因治疗系统的酶通常不意欲在表达它们的同一生物体中找到,并且因此在哺乳动物中已使用从细菌、真菌或其他生物体中获得的酶。这种策略有几个已知的实例[在Karjoo,Z.等人2016.Adv.Drug Deliv.Rev.99(Pt.A):123-128中综述],比如胸苷激酶/更昔洛韦系统、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶系统、硝基还原酶/CB1954系统、羧肽酶G2/氮芥气系统、细胞色素P450/草氮磷膦(oxazaphosphorine)系统、嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤脱氧核糖核苷(PNP/MEP)、辣根过氧化物酶/吲哚-3-乙酸系统(HRP/IAA)和羧酸酯酶/伊立替康(CE/伊立替康)系统、截短的EGFR、诱导型半胱天冬酶(“iCasp”)、大肠杆菌gpt基因、大肠杆菌Deo基因和硝基还原酶。
(x)伴侣蛋白和蛋白质聚集抑制剂
如本文所使用,“伴侣蛋白多肽”或“伴侣蛋白”是指有助于蛋白质分子折叠或解折叠和/或大分子结构的组装或分解的蛋白质分子。示例性伴侣蛋白包括但不限于ABCE1,ATP-结合盒亚家族E成员1;AHSA1,90kDa热休克蛋白腺苷三磷酸酶同源物1的激活剂;ANP32B,富含酸性亮氨酸的核磷蛋白32家族;BAG6,富含大的脯氨酸的蛋白质BAG6;BCS1L,线粒体伴侣蛋白BCS1;CALR,钙网蛋白;CANX钙联结蛋白;CCT2 T,复合蛋白1亚基β,CCT3 T,复合蛋白1亚基γ,CCT4 T,复合蛋白1亚基δ,CCT5 T,复合蛋白1亚基ε,CCT6A T复合蛋白1亚基ζ,CCT7 T复合蛋白1亚基β,CD74 H-2II类组织相容性抗原γ链;CDC37 Hsp90共伴侣蛋白Cdc37;CLGN钙镁蛋白(Calegin);DNAJA1 DnaJ同源亚科A成员1;DNAJC1 DnaJ同源亚科C成员1;DNAJC11 DnaJ同源亚科C成员11;HSP90AA1热休克蛋白HSP 90-αHSP90AB1热休克蛋白HSP 90-βHSP90B1内质蛋白;HSPA1B热休克70kDa蛋白1A/1B;HSPA2热休克相关的70kDa蛋白2;HSPA8热休克同源71kDa蛋白;HSPA9应激-70蛋白、线粒体;HSPD1 60kDa热休克蛋白、线粒体;HYOU1低氧上调蛋白质1;NDUFAF2 Mimitin、线粒体;SCO1蛋白SCO1同源物,线粒体;SCO2蛋白SCO2同源物、线粒体;ST13 Hsc70-相互作用蛋白;TBCD,微管蛋白特异性伴侣蛋白D;TCP1 T-复合蛋白1亚基α,TIMMDC1,内线粒体膜结构域的转位酶;和TMEM126B,跨膜蛋白126B。
因此,在本发明的实施方式中,本发明的融合蛋白的间插区域的治疗剂是细胞毒素多肽。
在本发明的优选实施方式中,融合蛋白的间插区域的细胞毒素多肽选自BAK的BH3结构域、PUMA GW-H1、白喉毒素、假单胞菌外毒素和蓖麻毒素。在本发明的进一步优选的实施方式中,融合蛋白的间插区域的细胞毒素多肽是选自上文刚刚所指出的肽的截短形式或突变体,优选地选自白喉毒素、假单胞菌毒素和蓖麻毒素。
如本文所使用,“BAK”是指属于Bcl-2蛋白质家族的众所周知的促凋亡因子,其通过使抗凋亡蛋白失活,使线粒体膜透化,并且因此释放细胞色素C和其他线粒体细胞死亡因子而通过半胱天冬酶依赖性凋亡途径触发程序性细胞死亡。[如参见Llambi,F.等人2011.Mol.Cell,44:517-31]。在一个实施方式中,BAK是指全长BAK(SEQ ID NO:34)。在其他实施方式中,BAK是指其含有功能性BH3结构域(SEQ ID NO:35)的任何截短形式。本发明提供的实验显示,BH3 BAK仍起到组装成细胞靶向纳米颗粒的作用。
如本文所使用,“PUMA”是指以对应于SEQ ID NO:36的全序列为特征的蛋白质,该蛋白质通过与Bcl-2家族的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白相互作用而触发细胞死亡的仅(Bcl-2同源性3)BH3的蛋白质。
如本文所使用,GW-H1是指具有SEQ ID NO:14的序列的多肽,该多肽通过折叠成两亲性螺旋而发挥其细胞溶解活性。如本发明的实施例中所显示,GW-H1显示出比其他测试的构建体更温和的作用,但是以这种形式,纳米材料被认为通过两个连续事件发挥细胞溶解作用,这两个连续事件包括结合至细胞膜,随后透化。
如本文所使用,“白喉毒素”是指白喉棒状杆菌的外毒素,并且“假单胞菌外毒素”是指属于ADP-核糖基化毒素家族的铜绿假单胞菌的外毒素A。两种毒素都是作用于真核延长因子2(eEF-2)的蛋白质,基本上抑制了并入它们的细胞的翻译活性并诱导凋亡。两种毒素的结构均呈现了受体结合结构域(与细胞的表面受体结合并诱导胞吞作用;在白喉毒素的情况下肝素结合表皮生长因子前体;在外毒素A的情况下CD91)、易位结构域和催化结构域,在本文中也称为“活性区段”,其对eEF-2执行作用。白喉毒素的催化结构域或活性区段对应于SEQ ID NO:37,而铜绿假单胞菌的外毒素A的催化结构域或活性区段对应于SEQ IDNO:38[在Shapira,A.&Benhar,I.,2010,Toxins,2:2519-2583中提供了综述]。
在优选的实施方式中,本发明的实施方式白喉毒素是白喉棒状杆菌的外毒素的截短形式或突变形式。在进一步优选的实施方式中,本发明的白喉毒素含有白喉毒素的易位域和催化结构域。所述白喉毒素在本文中被称为DITOX,并且具有SEQ ID NO.43的序列。
在另一个优选的实施方式中,本发明的假单胞菌外毒素是铜绿假单胞菌的外毒素A的截短或突变形式。在进一步优选的实施方式中,本发明的假单胞菌外毒素是基于铜绿假单胞菌的外毒素A的去免疫催化结构域,在该去免疫催化结构域中并入了破坏B和T细胞表位的点突变。所述假单胞菌外毒素在本文中被称为PE24,并且具有SEQ ID NO.44的序列。
如本文所使用,“蓖麻毒素”是指最初从大约65KDa的蓖麻的种子中提取的核糖体失活蛋白(RIP),其由通过二硫键连接的两条链组成:具有N-糖苷酶酶活性的链A和具有凝集素特性的链B,其与靶细胞表面的碳水化合物配体结合。在优选的实施方式中,本发明的蓖麻毒素是从蓖麻的种子中提取的蓖麻毒素的截短形式或突变形式。在进一步优选的实施方式中,本发明的蓖麻毒素是蓖麻毒素A链的突变形式。在甚至更优选的实施方式中,所述突变的蓖麻毒素A链由具有突变N132A的蓖麻毒素A链组成,以抑制血管渗漏综合症,同时在施用时保持细胞毒素活性。所述突变的蓖麻毒素A链在本文中被称为mRTA,并且具有SEQ IDNO.45的序列。在优选的实施方式中,本发明的蓖麻毒素由mRTA组成。
在优选的实施方式中,间插多肽是细菌毒素,聚阳离子肽是T22和带正电荷的富含氨基酸的区域是聚组氨酸,并且更具体地是六组氨酸,其中T22肽和细菌毒素通过具有序列GGSSRSS的接头和具有序列GNRVRRSV的弗林蛋白酶切割位点连接。在优选的实施方式中,细菌毒素是修饰的白喉毒素,其包括A-片段和B-片段的T-结构域,但是缺少B-片段的R-结构域。在更优选的实施方式中,细菌毒素是对应于SEQ ID NO.37的修饰的白喉毒素,甚至更优选地细菌毒素是对应于SEQ ID NO.43的修饰的白喉毒素DITOX。在另一个实施方式中,细菌毒素是假单胞菌外毒素。在更优选的实施方式中,细菌毒素是具有SEQ ID NO.38的假单胞菌外毒素,甚至更优选地细菌毒素是具有SEQ ID NO.44的假单胞菌外毒素PE24。
在优选的实施方式中,间插多肽是细菌毒素,聚阳离子肽是T22和带正电荷的富含氨基酸的区域是聚组氨酸,并且更具体地是六组氨酸,其中T22肽和细菌毒素通过具有序列GGSSRSS的接头、具有序列RHRQPRGWEQL的弗林蛋白酶切割位点和具有GGS序列并且在带正电荷的富含氨基酸的区域之后的C端进一步包括KDEL序列的第二接头连接。在优选的实施方式中,细菌毒素是修饰的白喉毒素,其包括A-片段和B-片段的T-结构域,但是缺少B-片段的R-结构域。在更优选的实施方式中,细菌毒素是对应于SEQ ID NO.37的修饰的白喉毒素。在又更优选的实施方式中,细菌毒素是对应于SEQ ID NO.43的修饰的白喉毒素DITOX。在另一个实施方式中,细菌毒素是假单胞菌外毒素。在更优选的实施方式中,细菌毒素是具有SEQ ID NO.38的假单胞菌外毒素,甚至更优选地是具有SEQ ID NO.44的假单胞菌外毒素PE24。
在优选的实施方式中,间插多肽是蓖麻毒素,聚阳离子肽是T22,并且带正电荷的富含氨基酸的区域是聚组氨酸,并且更具体地是六组氨酸,并且在带正电荷的富含氨基酸的区域之后的C端进一步包括KDEL序列。在优选的实施方式中,融合蛋白在包括序列GGSSRSS的T22肽的C端进一步包括接头区域。在另一个实施方式中,融合蛋白进一步包括具有序列RHRQPRGWEQL的弗林蛋白酶的切割位点,该位点连接接头区域的C端和具有序列GGS的第二接头区域。在优选的实施方式中,间插多肽是携带旨在抑制血管渗漏综合症的N132A突变的修饰的蓖麻毒素。在另一个优选的实施方式中,间插多肽是蓖麻毒素A链。在另一个实施方式中,间插多肽是携带N132A突变的蓖麻毒素A链。
在本发明的融合蛋白中,间插多肽区不是荧光蛋白或p53。
在优选的实施方式中,间插多肽不是荧光蛋白。应当理解,本发明的融合蛋白在其结构内仍可包括一种或多种荧光蛋白,前提是荧光蛋白不是间插多肽。因此,在一个实施方式中,如果根据本发明的融合蛋白包含单个间插多肽,则该多肽不是荧光蛋白。在另一个实施方式中,如果本发明的融合蛋白包含除间插多肽之外的一个或多个另外的多肽,则另外的一个或多个多肽可以是荧光蛋白。术语“间插多肽”不包括形成融合蛋白的一部分并连接融合蛋白的不同元件的任何接头区域。荧光蛋白选自绿色荧光蛋白(GFP)或其变体、GFP的蓝色荧光变体(BFP)、GFP的青色荧光变体(CFP)、GFP的黄色荧光变体(YFP)、增强的GFP(EGFP)、增强的CFP(ECFP)、增强的YFP(EYFP)、GFPS65T、Emerald、TYFP、Venus、Citrine、mCitrine、GFPuv、去稳定的EGFP(dEGFP)、去稳定的ECFP(dECFP)、去稳定的EYFP(dEYFP)、mCFPm、Cerulean、T-Sapphire、CyPet、YPet、mKO、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、DsRed-单体、J-红色、二聚体2、t-二聚体2(12)、mRFPl、pocilloporin、Renilla GFP、Monster GFP、paGFP、Kaede蛋白和kindlinG蛋白、藻胆蛋白和藻胆蛋白缀合物,包括B-藻红蛋白、R-藻红蛋白和别藻蓝蛋白。在其他实施方式中,间插多肽不是选自mHoneydew、mBanana、mOrange、dTomato、tdTomato、mTangerine、mStrawberry、mCherry、mGrapel、mRaspberry、mGrape2、mPlum的荧光蛋白(Shaner等人(2005)Nat.Methods 2:905-909)等。
在优选的实施方式中,间插多肽不是由TP53基因编码的p53或p53同种型,比如p53a、p53p、p53y、A40p53a、A40p53p、A40p53y、A133p53a、A133p53p、A133p53y、A160p53a、A160p53p、A160p53y等。
E.报告蛋白
在本发明的另一个实施方式中,本发明的融合蛋白进一步包括报告蛋白。应当理解,如本文所使用,报告蛋白不同于间插多肽。
本领域技术人员将认识到术语“报告蛋白”是指由“报告基因”的表达产生的蛋白质。报告蛋白是众所周知的,并且在本领域中通常用作适合多种目的的标志物,比如报告基因在组织中的表达位置、细胞或亚细胞位置、蛋白质-蛋白质相互作用、跨越质膜或内膜的运输、囊泡运输、配体-受体相互作用等。
在本发明的上下文中有用的报告蛋白包括来自北美萤火虫(Photinus pyralis)的萤光素酶-4-单加氧酶、β-半乳糖苷酶、胸苷激酶等。适用于本发明的融合蛋白的优选的报告蛋白也是荧光蛋白,比如绿色荧光蛋白(GFP,首先在维多利亚多管发光水母(Aequoreavictoria)中发现)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)或任何其他变体,其实例可以在Kremers等中找到[Kremers,G-J-等人2011.J.Cell Sci.124:157-160]。
因此,在本发明的优选实施方式中,本发明的融合蛋白的报告蛋白是荧光蛋白。
本发明的融合蛋白所包括的荧光蛋白与带正电荷的富含氨基酸的区域直接相邻或通过接头分离。然而,带正电荷的富含氨基酸的区域的相对位置保持依照前述关于融合蛋白的元件的相对位置的考虑。因此,与融合蛋白的位置无关,荧光蛋白总是直接或通过接头与其相邻。
因此,在包括荧光蛋白的本发明的实施方式中,本发明的融合蛋白的元件的可能相对位置将适合以下方案(其中FP是指荧光蛋白,并且保留了元件的上述编号:(1)聚阳离子肽,(2)间插多肽区,(3)带正电荷的富含氨基酸的区域):
■N-(1)-(2)-FP-(3)-C
■N-(1)-接头-(2)-FP-(3)-C
■N-(1)-(2)-接头-FP-(3)-C
■N-(1)-接头-(2)-接头-FP-(3)-C
■N-(3)-FP-(2)-(1)-C
■N-(3)-FP-接头-(2)-(1)-C
■N-(3)-FP-(2)-接头-(1)-C
■N-(3)-FP-接头-(2)-接头-(3)-C
■N-(1)-(2)-FP-接头-(3)-C
■N-(1)-接头-(2)-FP-接头-(3)-C
■N-(1)-(2)-接头-FP-接头-(3)-C
■N-(1)-接头-(2)-接头-FP-接头-(3)-C
■N-(3)-接头-FP-(2)-(1)-C
■N-(3)-接头-FP-接头-(2)-(1)-C
■N-(3)-接头-FP-(2)-接头-(1)-C
■N-(3)-接头-FP-接头-(2)-接头-(3)-C
■N-(2)-(1)-FP-(3)-C
■N-(2)-接头-(1)-FP-(3)-C
■N-(2)-(1)-接头-FP-(3)-C
■N-(2)-接头-(1)-接头-FP-(3)-C
■N-(2)-FP-(3)-(1)-C
■N-(2)-(3)-FP-(1)-C
■N-(2)-接头-FP-(3)-(1)-C
■N-(2)-接头-(3)-FP-(1)-C
■N-(2)-FP-(3)-接头-(1)-C
■N-(2)-(3)-FP-接头-(1)-C
■N-(2)-接头-FP-(3)-接头-(1)-C
■N-(2)-接头-(3)FP--接头-(1)-C
■N-(1)-FP-(3)-(2)-C
■N-(1)-(3)-FP-(2)-C
■N-(1)-FP-(3)-接头-(2)-C
■N-(1)-(3)-FP-接头-(2)-C
■N-(1)-接头-FP-(3)-(2)-C
■N-(1)-接头-(3)-FP-(2)-C
■N-(1)-接头-FP-(3)-接头-(2)-C
■N-(1)-接头-(3)-FP-接头-(2)-C
■N-FP-(3)-(1)-(2)-C
■N-(3)-FP-(1)-(2)-C
■N-FP-(3)-接头-(1)-(2)-C
■N-(3)-FP-接头-(1)-(2)-C
■N-FP-(3)-(1)-接头-(2)-C
■N-(3)-FP-(1)-接头-(2)-C
■N-FP-(3)-接头-(1)-接头-(2)-C
■N-(3)-FP-接头-(1)-接头-(2)-C
包括多个拷贝本发明的融合蛋白的纳米颗粒及其制备方法
在第二方面中,本发明涉及制备包括根据本发明的第一方面的多个拷贝的融合蛋白的纳米颗粒的方法,该方法包括将所述融合蛋白的制剂置于低盐缓冲液中。
如本领域技术人员将认识到的,“纳米颗粒”是其尺寸以纳米测量的微观颗粒。本发明的纳米颗粒包括由本发明的多个拷贝的融合蛋白的组装产生的纳米颗粒,如先前部分所定义。在用本发明的融合蛋白制备纳米颗粒的方法中,本发明的融合蛋白的制剂包括本发明的融合蛋白的单体形式,其在低盐缓冲液的条件下在热力学上有利于形成非共价静电结合并自发聚集。
本领域技术人员将认识到,纳米颗粒的尺寸可以在1和1000nm之间,更优选地在2.5和500nm之间,甚至更优选地在5和250nm之间,并且又甚至更优选在10和100nm之间的范围内。
将理解的是,表达“低盐缓冲液”包括由一种或多种盐溶解在水中而产生的任何缓冲溶液,其具有适度改变pH的能力,其中溶解的一种或多种盐的量导致低于或等于生理流体例如细胞质或细胞外介质的摩尔渗透压浓度。因此,低盐缓冲液应被理解为将pH和摩尔渗透压浓度保持在生理值范围内,并将在生理温度范围内使用。
本领域技术人员将认识到,生理温度的范围可以在15和45℃之间,更优选地在20和40℃之间,甚至更优选地在25和39℃之间,甚至更优选地在30和37℃之间波动。本领域技术人员还将认识到,低盐缓冲液的摩尔渗透压浓度将在100和400毫摩尔渗透压/L(mOsm/L)之间,优选地在150和350mOsm/L之间,更优选地在200和300mOsm/L之间,甚至更优选在225和275mOsm/L之间的范围内。
适于本发明的低盐缓冲液是,例如Tris-葡萄糖缓冲液(20mM Tris+5%葡萄糖,pH7.4)、Tris-NaCl缓冲液(20mM Tris,500NaCl,pH 7.4)、PBS-甘油缓冲液(磷酸盐缓冲盐水,PBS,pH 7.4,其在本领域是众所周知的,+10%甘油)、Tris缓冲盐水(TBS)-葡萄糖(20mMTris-HCl缓冲液pH 7.5,本领域熟知的,200NaCl,+5%葡萄糖)、Tris缓冲盐水-Tween 20(TBST)缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.5,200mM NaCl,+0.01%Tween 20),或本领域已知的pH不低于6的任何生理缓冲液。
在本发明的优选实施方式中,本发明的方法的低盐缓冲液选自碳酸盐缓冲液、Tris缓冲液和磷酸盐缓冲液。
在本发明的尤其优选的实施方式中,本发明的方法的低盐缓冲液是包括浓度在100和300nM之间的碳酸氢钠的碳酸盐缓冲液。在本发明的另一个尤其优选的实施方式中,本发明的方法的低盐缓冲液是包括浓度在10和30nM之间的Tris的Tris缓冲液。在本发明的方法的另一个尤其优选的实施方式中,本发明的低盐缓冲液是包括总浓度在5mM和20mM之间的Na2HPO4和NaH2PO4的磷酸盐缓冲液。
在本发明的甚至更优选的实施方式中,本发明的方法的低盐缓冲液进一步包括葡萄糖和/或甘油。
在本发明的又更优选的实施方式中,本发明的方法的低盐缓冲液具有在6.5和7.5之间的pH。
在本发明的甚至又更优选的实施方式中,本发明的方法的低盐缓冲液选自:
(i)166mM NaHCO3,pH 7.4
(ii)20mM Tris,500mM NaCl,5%葡萄糖,pH 7.4
(iii)140mM NaCl,7.5mM Na2HPO4,2.5mM NaH2PO4,10%甘油,pH 7.4
在本发明的另一方面,本发明涉及包括本发明的第一方面的多个拷贝的融合蛋白的纳米颗粒或根据本发明用于制备纳米颗粒的方法制备的纳米颗粒。
因此,本发明的纳米颗粒包括本发明的多个拷贝的融合蛋白的组装的络合物,其是由于它们的结构中的区域之间的静电相互作用而产生的,这有利于它们在生理条件下的非共价结合和偶联。由于本发明的用于制备纳米颗粒的方法包括将本发明的融合蛋白的制剂置于低盐缓冲液中,因此应该理解,由此形成的纳米颗粒还包括多个拷贝的融合蛋白的组装的络合物。
在本发明的优选实施方式中,本发明的纳米颗粒具有在10和100nm之间的直径。
本发明的多核苷酸、载体和宿主细胞
在本发明的另一方面,本发明涉及编码本发明的第一方面的融合蛋白的多核苷酸、包括上述多核苷酸的载体和包括上述多核苷酸或上述载体的宿主细胞。
如本文可互换使用的术语“核酸”和“多核苷酸”是指由通过磷酸二酯键连接的核苷酸单元(核糖核苷酸,脱氧核糖核苷酸,相关的天然存在的结构变体和其合成的非天然存在的类似物或其组合)组成的聚合物,相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物。
本领域技术人员将认识到,多核苷酸编码对应于本发明的第一方面的本发明的融合蛋白的多肽或蛋白序列。因此,本发明的多核苷酸包括编码融合蛋白中包括的所有元件的序列:聚阳离子多肽、间插肽区、带正电荷的富含氨基酸的区域以及可以是融合蛋白的一部分的任何其他元件,比如报告蛋白、接头等。
应该理解,本发明的核酸或多核苷酸包括编码区和适当的调控信号,用于促进在细胞中的表达以产生生物活性融合蛋白。
通常,含有编码区的核酸将与适当的调控序列可操作地连接。这种调控序列将至少包含启动子序列。如本文所使用,术语“启动子”是指起到控制一个或多个基因的转录作用的核酸片段,该核酸片段位于该基因的转录起始位点的转录方向的上游,并通过DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列的存在在结构上被鉴定,包括但不限于转录因子结合位点、阻抑物和激活蛋白结合位点以及本领域技术人员已知直接或间接用以调节来自启动子的转录量的任何其他核苷酸序列。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是取决于生理或发育条件调节的启动子。“组织特异性”启动子仅在特定类型的分化细胞/组织中具有活性。
原则上,任何启动子都可以用于本发明的基因构建体,条件是所述启动子与将要表达多核苷酸的细胞相容。因此,适用于本发明实施方式的启动子包括但不限于组成型启动子,比如真核病毒比如多瘤病毒、腺病毒、SV40、CMV、禽肉瘤病毒、乙肝病毒的基因组衍生物,金属硫蛋白基因的启动子,单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的启动子,逆转录病毒LTR区,免疫球蛋白基因的启动子,肌动蛋白基因的启动子,EF-1α基因的启动子,以及诱导型启动子,其中蛋白质的表达取决于分子或外源信号的添加,比如四环素系统、NFκB/UV光系统、Cre/Lox系统和热休克基因的启动子、在WO/2006/135436中描述的RNA聚合酶II的可调控启动子以及组织特异性启动子。
编码本发明的融合蛋白的本发明的多核苷酸可以是载体的一部分。因此,在另一个实施方式中,本发明涉及包括本发明的多核苷酸的载体。本领域技术人员将理解,对于可以使用的载体类型没有限制,因为所述载体可以是适合在不同异源生物体中繁殖并用于获得多核苷酸或表达载体的克隆载体,该多核苷酸或表达载体适合于纯化本发明的融合蛋白。因此,根据本发明的合适的载体包括在原核生物中的表达载体,比如pET(比如pET14b),pUC18、pUC19、Bluescript和其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、CoIEl、pCRl、RP4、噬菌体和穿梭载体比如pSA3和pAT28,酵母中的表达载体比如以下类型的载体:2微米质粒、整合质粒、YEP载体、着丝质粒等,昆虫细胞中的表达载体比如pAC系列和pVL系列载体,植物中的表达载体比如植物中的表达载体,比如pIBI、pEarleyGate、pAVA、pCAMBIA、pGSA、pGWB、pMDC、pMY、pORE系列载体等,和基于病毒载体(腺病毒,与腺病毒以及逆转录病毒和慢病毒相关的病毒)以及非病毒载体的高等真核细胞中的表达载体比如pSilencer 4.1-CMV(Ambion)、pcDNA3、pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEFl/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAXl、pZeoSV2、pCI、pSVL和pKSV-10、pBPV-1、pML2d和pTDTl。
本发明的载体可用于转化、转染或感染可被所述载体转化、转染或感染的细胞。所述细胞可以是原核或真核的。举例来说,其中引入了所述DNA序列的载体可以是质粒或载体,当将其引入宿主细胞时,质粒或载体被整合到所述细胞的基因组中并与其中已经被整合的染色体(一个或多个)一起复制。所述载体可以通过本领域技术人员已知的常规方法获得[Sambrook等人,2001,“Molecular cloning,to Laboratory Manual”,第2版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,N.Y.Vol 1-3a]。
因此,本发明还涉及包括本发明的多核苷酸或载体的细胞,所述细胞已经能够被本发明提供的多核苷酸或载体转化、转染或感染。转化、转染或感染的细胞可以通过本领域技术人员已知的常规方法获得[Sambrook等人,2001,如上所述]。
适用于表达本发明的缀合物的宿主细胞包括但不限于哺乳动物、植物、昆虫、真菌和细菌细胞。细菌细胞包括但不限于革兰氏阳性细菌细胞,比如芽孢杆菌属、链霉菌属、李斯特菌属和葡萄球菌属的种;和革兰氏阴性细菌细胞,比如埃希氏菌属、沙门氏菌属和假单胞菌属的细胞。真菌细胞优选地包括酵母细胞,比如酿酒酵母、毕赤酵母和多形汉逊酵母。昆虫细胞包括但不限于果蝇和Sf9细胞。植物细胞包括作物植物比如谷物、药用、观赏或球茎植物的细胞等。本发明中合适的哺乳动物细胞包括上皮细胞系(人、绵羊、猪等)、骨肉瘤细胞系(人等)、神经母细胞瘤细胞系(人等)、上皮癌(人等)、神经胶质细胞(鼠等),肝细胞系(来自猴子等)、CHO(中国仓鼠卵巢)细胞、COS细胞、BHK细胞、HeLa细胞、911、AT1080、A549、293或PER.C6、NTERA-2人ECC细胞、mESC系的D3细胞、人胚胎干细胞,比如HS293、BGV01、SHEF1、SHEF2、HS181、NIH3T3细胞、293T、REH和MCF-7和hMSC细胞。
在本发明的优选实施方式中,本发明的多核苷酸、载体和宿主细胞适合于表达本发明的融合蛋白的生物活性形式。
本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体和纳米颗粒在医学中的用途
在另一方面,本发明涉及用于医学的根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒。
本领域技术人员将理解,通过在医学中使用,可以将本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒施用至患者以诱导治疗反应。治疗反应包括抑制、减轻或阻止患者患有的病理状况或疾病的病因;消除、减轻、阻止或改善病症或疾病的症状;或者消灭、阻止或减缓患者的病症或疾病。
本领域技术人员将认识到,适用于医学的本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒可以伴随药学上可接受的载体一起提供。如本文所使用,术语“药学上可接受的载体”是指任何类型的无毒的、惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、封装材料或制剂助剂。Remington's Pharmaceutical Sciences.Ed.by Gennaro,Mack Publishing,Easton,Pa.,1995中公开了用于配制药物组合物的各种载体制剂及用于其制剂的已知技术。
因此,包括本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒和药学上可接受的载体的组合物是药物组合物。
本发明的药物组合物可以通过本领域已知的任何方式,包括口服和胃肠外途径施用至患者。根据这样的实施方式,本发明的组合物可以通过注射(例如,静脉内、皮下或肌内、腹膜内注射)、直肠、阴道、局部(如通过散剂、乳膏、软膏或滴剂)或通过吸入(如通过喷雾)施用。
A-本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒在治疗癌症中的用途
本发明的另一个实施方式涉及融合蛋白、本发明的多核苷酸、本发明的载体、包括该载体或多核苷酸并表达融合蛋白的本发明的宿主细胞,以及本发明的纳米颗粒,或其相应的药物组合物,其中聚阳离子肽是能够与细胞表面上的受体特异性相互作用的序列,该序列能够促进融合蛋白内在化到细胞中,其中表达受体的所述细胞是癌症中存在的肿瘤细胞,并且其中间插多肽区是用于治疗癌症的抗肿瘤肽。
如本文所使用,术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指减轻或改善癌症的进展、严重程度和/或持续时间,或改善癌症的一种或多种症状(优选地,一种或多种可辨别症状)。术语“治疗”还指改善患者不一定能辨别的至少一种可测量的癌症物理参数,比如肿瘤的生长。此外,“治疗”还指物理上例如通过可辨别的症状的稳定,生理上例如通过物理参数的稳定或二者来抑制癌症的进展。“治疗”还可以指肿瘤大小的减小或稳定或癌细胞计数的减少或稳定。
术语“癌症”是指涉及异常的、不受控制的细胞生长和增殖(成瘤)的一组疾病,有可能侵入或扩散(转移)到生物体的其他组织、器官或通常的远处部分;转移是癌症和癌性肿瘤的恶性肿瘤的标志之一。癌细胞的异常生长和/或增殖是改变其正常生理的遗传和环境因素组合的结果。癌细胞的生长和/或增殖异常导致生理疾病,并且在许多情况下,由于受影响的细胞类型、组织和器官的功能障碍或功能丧失导致个体死亡。
术语“癌症”包括但不限于乳腺癌、心脏癌、小肠癌、结肠癌、脾癌、肾癌、膀胱癌、头癌、颈癌、卵巢癌、前列腺癌、脑癌、胰腺癌、皮肤癌、骨癌、骨髓癌、血癌、胸腺癌、子宫癌、睾丸癌、肝胆系统癌和肝癌;除肿瘤外,例如但不限于腺瘤、血管肉瘤、星形细胞瘤、上皮癌、生殖细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、血管内皮瘤、血管肉瘤、血肿、肝母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、肝胆管癌、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤和畸胎瘤。此外,该术语包括顶头黑素瘤、光化角化症腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞癌、星形细胞瘤、巴索林腺癌、基底细胞癌、支气管腺癌、毛细血管类癌、癌、癌肉瘤、胆管癌、囊腺瘤、内胚层静脉窦肿瘤(endodermal sinus tumor)、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜腺癌、室管膜肉瘤、尤因肉瘤、局灶性结节性增生、生殖细胞瘤、胶质母细胞瘤、胰高血糖素瘤、血管母细胞瘤、血管内皮细胞瘤(hemagioendothelioma)、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病(hepatic adenomastosis)、肝细胞癌、肝胆外科癌、胰岛瘤、上皮内瘤变、鳞状细胞上皮内瘤变、浸润性鳞状细胞癌、大细胞癌、平滑肌肉瘤、黑素瘤、恶性黑素瘤(malignant melonoma)、恶性间皮瘤、中神经母细胞瘤(meduloblastoma)、髓上皮瘤、黏膜上皮样癌(mucoepidermoid carcinoma)、神经母细胞瘤、神经上皮腺癌、结节性黑素瘤、骨肉瘤、乳头状浆液性腺癌、垂体瘤、浆细胞瘤、假性肉瘤、肺母细胞瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌、小细胞性癌、软组织癌、生长激素抑制素分泌肿瘤、鳞状癌、鳞状细胞癌、未分化癌、葡萄膜黑素瘤、疣状癌、舒血管肠肽瘤(vipoma)、维尔姆瘤(Wilmtumor)、脑癌、头颈癌、直肠癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、小细胞癌和非小细胞癌、转移性黑素瘤、雄激素非依赖性转移性前列腺癌、雄激素依赖性转移性前列腺癌和乳腺癌。
因此,在本发明的优选实施方式中,本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒的抗肿瘤肽选自:
(i)细胞毒素多肽,
(ii)抗血管生成多肽,
(iii)由肿瘤抑制基因编码的多肽,
(iv)促凋亡多肽,
(v)具有抗转移活性的多肽,
(vi)由能够激活针对肿瘤的免疫应答的多核苷酸编码的多肽,
(vii)化疗剂,
(viii)抗血管生成分子,和
(ix)由自杀基因编码的多肽。
在本发明的更优选的实施方式中,本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒的抗肿瘤肽选自BAK的BH3结构域、PUMA、GW-H1、白喉毒素、假单胞菌外毒素和蓖麻毒素。在本发明的进一步优选的实施方式中,本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒的抗肿瘤肽是选自上文刚刚所指出的肽的截短形式或突变体,优选地选自白喉毒素、假单胞菌外毒素和蓖麻毒素。所述肽的优选序列在上文“间插多肽区”部分中指出。
在本发明的甚至更优选的实施方式中,本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒的聚阳离子肽是CXCR4配体,并且待用本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒治疗的靶向癌症的特征在于包括表达CXCR4受体的细胞。
在本发明的又更优选的实施方式中,本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒的CXCR4配体选自T22肽、V1肽、CXCL12肽、vCCL2肽或其功能等同变体。
在本发明的另一个更优选的实施方式中,待用本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒治疗的癌症选自胰腺癌和结肠直肠癌。
蛋白质CD44是癌细胞发展和转移的另一种众所周知的关键调节剂(如在Senbanjo,L.T.&Chellaiah,M.A.2017.Front.Cell Dev.Biol.5:18中所综述)。
因此,在本发明的另一个优选的实施方式中,待用本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒治疗的癌症的特征在于CD44的表达。
本发明的另一个更优选的实施方式涉及用于治疗癌症的本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中癌症的特征在于CD44的表达,其中间插区多肽是选自已经列出的组中的一种的抗肿瘤肽,其中聚阳离子肽区域是CD44配体,并且其中CD44配体是A5G27或FNI/II/V。
本发明的另一个甚至更优选的实施方式涉及用于治疗癌症的本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中癌症的特征在于CD44的表达,其中间插区多肽是抗肿瘤肽,其中聚阳离子肽区域是在A5G27和FNI/II/V之间选择的CD44配体,并且其中癌症是结肠癌、肝癌、前列腺癌或乳腺癌。
本发明的另一个优选的实施方式涉及本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中聚阳离子肽是能够穿越血脑屏障的肽,并且其中间插区多肽是用于治疗中枢神经系统的癌症的抗肿瘤肽。
本发明的另一个更优选的实施方式涉及本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中聚阳离子肽是能够穿越血脑屏障的肽,并且其中抗肿瘤肽选自已经列出的组中的一种,用于治疗中枢神经系统的癌症。
本发明的甚至更优选的实施方式涉及本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中聚阳离子肽是选自Seq-1-7、Seq-1-8和Angiopep-2-7的能够穿越血脑屏障的肽,并且其中抗肿瘤肽选自已经列出的组中的一种,用于治疗中枢神经系统的癌症。
本发明的又甚至更优选的实施方式涉及本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中聚阳离子肽是选自Seq-1-7、Seq-1-8和Angiopep-2-7的肽,并且其中抗肿瘤肽选自已经列出的组中的一种,用于治疗中枢神经系统的癌症,其中中枢神经系统的癌症是神经胶质瘤。
B-本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒在治疗细菌感染中的用途
本发明的另一个实施方式涉及用于治疗由细菌感染引起的疾病的本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒。
如本文所使用,术语“治疗”是指减轻或改善细菌感染的进展、严重程度和/或持续时间,或改善细菌感染的一种或多种症状(优选地一种或多种可辨别的症状)。术语“治疗”还指改善患者不一定能辨别的细菌感染的至少一个可测量的物理参数,比如细菌毒素的存在。此外,“治疗”还指物理上例如通过可辨别症状的稳定,生理上例如通过物理参数的稳定或二者来抑制细菌感染的进展。“治疗”还可以指细菌细胞计数的减少或稳定。
如本文所使用,术语“细菌”是指结构域细菌的原核生物。可用于本发明的方法的细菌属的非限制性实例包括:放线菌、芽孢杆菌、拟杆菌、巴尔通体(Bartonella)、包特氏菌、包柔氏螺旋体、布鲁氏菌、伯克氏菌、弯曲杆菌、衣原体、梭菌、棒状杆菌、科氏杆菌(Coxiella)、埃希氏菌(Ehrlichia)、肠球菌、埃希氏菌属(Eschericia)、弗朗西斯氏菌、嗜血杆菌、螺杆菌、克雷伯菌(Klebsiella)、军团杆菌、细螺旋体、李斯特菌、莫拉氏菌、分支杆菌、支原体、奈瑟氏菌、诺卡氏菌(Nocardia)、假单胞菌、立克次氏体、沙门氏菌、志贺氏杆菌、葡萄球菌、链杆菌(Streptobacillus)、链球菌、密螺旋体、脲原体(Ureaplasma)、弧菌和耶尔森菌。结构域细菌的单个原核生物被命名为细菌。
本发明考虑了融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒对治疗细菌的感染的适用性,细菌比如淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌、变形链球菌;杜克伊嗜血杆菌;莫拉氏菌属,包括粘膜炎莫拉氏菌(M.catarrhalis),也称为卡他莫拉氏菌博德特氏菌(Branhamella catarrhalisBordetella spp.),包括百日咳博德特氏菌(B.pertussis)、副百日咳博德特氏菌和支气管败血性博德氏菌,分支杆菌属,包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌(M.bovis)、麻风杆菌(M.leprae)、M.avium,副结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis);军团杆菌属,包括嗜肺乳杆菌,埃希氏菌属,包括肠毒性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌和肠致病性大肠杆菌,弧菌属,包括霍乱弧菌、志贺氏菌属,包括索氏志贺氏菌,痢疾链球菌,弗氏志贺氏菌;耶尔森菌属,包括小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌;弯曲杆菌属,包括空肠弯曲杆菌,沙门氏菌属,包括伤寒链球菌、肠炎沙门氏菌和邦戈里链霉菌;李斯特菌属,包括单核细胞增生李斯特菌;螺杆菌属,包括幽门螺杆菌,假单胞菌属,包括铜绿假单胞菌;葡萄球菌属,包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌;肠球菌属,包括粪肠球菌、屎肠球菌;梭菌属,包括破伤风梭菌、肉毒梭菌、艰难梭菌(C.difficile),芽孢杆菌属,包括炭疽杆菌;棒状杆菌属,包括白喉衣原体,伯氏菌属,包括伯氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体、阿弗西尼疏螺旋体(B.afzelii)、安德森疏螺旋体(B.andersonfi)、赫姆斯疏螺旋体(B.hermsii);埃利希氏体属,包括大肠埃希氏菌(E.equi)和人粒细胞埃希氏菌的试剂;立克次氏体属,包括R.rickettsii;衣原体属,包括沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹅热衣原体(C.psittaci);细螺旋体属,包括钩端螺旋体;密螺旋体属,包括梅毒螺旋体(T.pallidum)、密螺旋体(T.denticola)、痢疾密螺旋体(T.hyodysenteriae)、结核分支杆菌,链球菌属,包括肺炎链球菌,嗜血杆菌属,包括B型流感嗜血杆菌和非分型的流感嗜血杆菌等但不限于此。
C-本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒在治疗病毒感染中的用途
本发明的另一个实施方式涉及本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中聚阳离子肽能够与被造成感染的病毒所感染的细胞的细胞表面的受体特异性相互作用;并且其中间插多肽区是抗病毒剂,用于治疗由病毒感染引起的疾病。
如本文所使用,术语“治疗”是指减轻或改善病毒感染的进展、严重程度和/或持续时间,或改善病毒感染的一种或多种症状(优选地一种或多种可辨别的症状)。术语“治疗”还指改善患者不一定能辨别的细菌感染的至少一个可测量的物理参数,比如病毒滴度。此外,“治疗”还指物理上例如通过可辨别的症状的稳定,生理上例如通过物理参数的稳定或二者来抑制病毒感染的进展。“治疗”还可以指病毒滴度的降低或稳定。
如本文所使用,术语“病毒”是指仅可在生物体的活细胞内复制的小型致病因子。可用于本发明的方法的病毒家族的非限制性实例包括腺病毒科、非洲猪瘟样病毒、沙粒病毒科、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、星状病毒科(Astroviridae)、杆状病毒科、双RNA病毒科(Birnaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、杯状病毒科、环病毒科(Circoviridae)、冠状病毒科、三角洲病毒(Deltavirus)、丝状病毒科(Filoviridae)、黄病毒科、嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)、肝炎病毒科(Hepeviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、小RNA病毒科(Picomaviridae)、过氧化物酶科(Poxyviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、逆转录病毒科和弹状病毒科(Rhabdoviridae)。
本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒适合治疗的病毒感染的实例包括人类免疫缺陷病毒(HIV-1)、人类疱疹病毒比如HSV1或HSV2、巨细胞病毒,特别是人、爱泼斯坦巴尔病毒、水痘带状疱疹病毒、肝炎病毒比如乙肝病毒、丙肝病毒、副粘病毒比如呼吸道合胞病毒、副流感病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒、黄病毒(例如,黄热病毒、登革热病毒、森林脑炎病毒、日本脑炎病毒)、流感病毒、轮状病毒等。
在本发明的甚至更优选的实施方式中,本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒的抗病毒剂选自:
(i)细胞毒素多肽,
(ii)促凋亡多肽,
(iii)由自杀基因编码的多肽;和
(iv)抗逆转录病毒多肽
细胞毒素多肽(i)、促凋亡多肽(ii)和由自杀基因编码的多肽已经在对应于融合蛋白的部分中进行了讨论。
抗逆转录病毒药剂是抗病毒的类别的抗微生物剂的一种同种型。抗逆转录病毒药剂专门用于治疗由逆转录病毒引起的病毒感染。逆转录病毒包括逆转录病毒科的病毒家族,其包括比如α逆转录病毒、β逆转录病毒和慢病毒等属。它们的特征是单链、正义RNA基因组病毒。逆转录病毒通过其自身的逆转录酶产生其基因组的双链DNA拷贝,该拷贝整合到其宿主细胞的基因组中。本领域技术人员将认识到“抗逆转录病毒药剂”包括能够在逆转录病毒的任何阶段干扰其正常复制周期的任何分子或化合物。因此,如本文使用的抗逆转录病毒多肽(iv)是指具有抗逆转录病毒特性的多肽。
适用于本发明的抗逆转录病毒多肽是例如“进入抑制剂”,也称为“融合抑制剂”,其是干扰逆转录病毒结合、融合和进入宿主细胞的肽。该组的实例是依夫韦肽(efuvirtide),一种与HIV-1融合机制竞争的仿生肽,以及肽T,一种阻断趋化因子受体CCR2和CCR5的肽。
还包括作为进入抑制剂的是特异性针对逆转录病毒用于与细胞融合的受体的抗体。适于被抗体阻断的这些受体的非限制性实例是CD4、CCR2、CCR5和CXCR4。
如本文所使用,术语“抗体”是指对被称为“抗原”的特定蛋白质表现出特异性结合活性的糖蛋白。术语“抗体”包括完整的单克隆抗体或多克隆抗体或其片段,并且包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和非人源抗体。“单克隆抗体”是针对单个位点或抗原“决定簇”的同质、高度特异性的抗体群。“多克隆抗体”包括针对不同抗原决定簇的异源抗体群。
如本文所使用,适用于本发明的抗体不仅包括全长抗体(例如IgG),而且还包括其抗原结合片段,例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、非人源抗体、重组抗体以及通过基因工程技术产生的源自免疫球蛋白的多肽,例如单链Fv(scFv)、双抗体、重链或其片段、轻链或其片段、VH或其二聚体、VL或其二聚体,通过二硫键(dsFv)稳定的Fv片段,具有单链可变区结构域(Abs)的分子,小抗体,scFv-Fc和包括抗体的融合蛋白或包括具有所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。本发明的抗体也可以是双特异性抗体。抗体片段可以指抗原结合片段。抗体包括任何类别的抗体,即IgA、IgD、IgE、IgG(或其亚类)和IgM,并且抗体不必是任何特定类别。
因此,本发明的又更优选的实施方式涉及本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中聚阳离子肽是CXCR4配体,并且其中该细胞是用于治疗HIV感染的HIV感染的细胞。
本发明的又甚至更优选的实施方式涉及本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中CXCR4配体选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8或其功能等同变体,用于治疗病毒感染。
D-本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒在治疗神经退行性疾病中的用途
蛋白质聚集是一种生物现象,其是由于错误折叠的蛋白质(无论是细胞内还是细胞外)的积聚而导致的。产生的蛋白质聚集体可以引发疾病,并且事实上,已经发现它们参与了广泛的称为淀粉样变性的疾病。淀粉样变性包括几种研究充分的神经退行性疾病,比如ALS、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和朊病毒病。
由于在将蛋白质生理折叠为其天然的三维构象中的错误而发生聚集,这是热力学上最有利的(也称为“天然状态”)。蛋白质的疏水部分倾向于通过掩埋到蛋白质内部而使其自身免受细胞的亲水环境的影响,从而驱动了折叠过程。因此,蛋白质的外部通常是亲水的,而内部通常是疏水的。然后,蛋白质结构通过本领域技术人员众所周知的非共价静电相互作用和二硫键而稳定,非共价静电相互作用和二硫键产生蛋白质的二级和三级结构。
导致蛋白质错误折叠或解折叠的错误可能是由蛋白质氨基酸序列的改变引起的。如果不纠正这些错误,例如通过“伴侣蛋白”(如本领域技术人员将知道的,伴侣蛋白或“蛋白伴侣”是辅助其他蛋白质正确折叠成其正确构象和三级或三维结构的支架的蛋白质),错误折叠或未折叠的蛋白质将由于其疏水区域彼此之间的天然相互作用而聚集,作为限制它们暴露于细胞的亲水环境中的方式[Roberts,C.J.,2007.Biotechnology&Bioengineeering,98(5):927-938]。
因此,本发明的另一个实施方式涉及本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体或纳米颗粒,其中聚阳离子肽是能够穿越血脑屏障的肽,并且其中间插多肽区是用于治疗神经退行性疾病的伴侣蛋白或蛋白质聚集抑制剂。
合适的伴侣蛋白或蛋白质聚集抑制剂如上所限定。可以使用根据本发明的融合蛋白、纳米颗粒、载体或宿主细胞治疗的疾病包括阿尔茨海默氏病、匹克氏病、α1-抗胰蛋白酶缺陷症、帕金森病和其他共核蛋白病、克雅氏病、青光眼的视网膜神经节细胞变性、脑β-淀粉样变性血管病、朊病毒病、蛋白病、额颞前叶变性、II型糖尿病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、亨廷顿病和其他三核苷酸重复病症、家族性丹麦型痴呆、家族性英国痴呆(FamilialEnglish dementia)、伴随淀粉样变性的遗传性脑出血、亚历山大病、Seipinopathies、家族性淀粉样神经变性、老年系统性淀粉样变性、溶菌酶淀粉样变性、血纤蛋白原淀粉样变性、透析淀粉样变性、包涵体肌炎/肌病、白内障、伴随视紫红质突变的色素性视网膜炎、甲状腺髓性癌、心脏房性淀粉样变性、垂体催乳素瘤、遗传性晶格角膜营养障碍(Hereditarylattice corneal dystrophy)、皮肤地衣淀粉样变性、马洛里小体(Mallory bodies)、角膜乳铁蛋白淀粉样变性、肺的肺泡蛋白贮积症(Pulmonary alveolar proteinosis)、牙源性肿瘤淀粉样蛋白、精囊淀粉样蛋白、载脂蛋白C2淀粉样变性、载脂蛋白C3淀粉样变性、Lect2淀粉样变性、胰岛素淀粉样变性、半乳凝素-7淀粉样变性(主要局部皮肤淀粉样变性)、角膜锁链蛋白淀粉样变性、恩夫韦肽淀粉样变性、囊性纤维化、镰状细胞病、伴随淀粉样变性的遗传性脑出血、AL淀粉样变性、AH淀粉样变性、AA淀粉样变性、大动脉内侧淀粉样变性、ApoAI淀粉样变性、ApoAII淀粉样变性、ApoAIV淀粉样变性和芬兰型的家族性淀粉样变性。
因此,本发明的优选的实施方式涉及本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中间插多肽区是用于治疗神经退行性疾病的伴侣蛋白或蛋白质聚集抑制剂,其中能够穿越血脑屏障的聚阳离子肽选自Seq-1-7、Seq-1-8和Angiopep-2-7。
下面通过以下实施例描述本发明,这些实施例仅是示例性的,并不限制本发明的范围。
实施例
关于融合蛋白T22-BAK-GFP-H6、T22-GFP-H6、T22-GWH1-GFP-H6和T22-PUMAGFP-H6
的材料和方法
蛋白质设计、生产和纯化
工程化的融合蛋白根据其模块化组织进行命名(图1、5;T22-BAK-GFP-H6、T22-GFP-H6、T22-GWH1-GFP-H6和T22-PUMAGFP-H6)。合成基因自行设计并从插入原核表达pET-22b载体的GeneArt中获得。编码的蛋白质在带有质粒的大肠杆菌Origami B(BL21、OmpT-、Lon-、TrxB-、Gor-、Novagen)细胞中产生,该细胞在37℃下在2L摇瓶中用500ml LB培养基和100μg/ml的氨苄西林,15μg/ml卡那霉素和12.5μg/ml四环素培养。加入0.1mM异丙基-β-d-硫代半乳糖吡喃糖苷(thiogalactopyronaside)(IPTG)后,在约0.5-0.7的OD550处诱导重组基因表达,并且然后在37℃下使细菌细胞保持生长3小时,用于T22-BAK-GFP-H6融合蛋白生产,并在20℃下过夜,用于T22-GFP-H6,T22-GWH1-GFP-H6和T22-PUMA-GFP-H6生产。
然后在存在无EDTA的蛋白酶抑制剂(完全不含EDTA;Roche,Basel,Switzerland)的情况下,通过在4℃下在5000g下离心15分钟,并且再悬浮在清洗缓冲液(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,10mM咪唑,pH 8.0)中收获细菌细胞。在弗氏压碎器(French Press)(ThermoFA-078A)中在1200psi下破碎细胞,并将裂解物离心45分钟(在4℃下15,000g)。
通过AKTA纯化器FPLC(GE Healthcare),使用HiTrap螯合HP 1ml柱(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA),通过His-tag亲和色谱纯化所有蛋白质。在过滤可溶部分后,将样品上样至该柱,并用10倍柱体积的清洗缓冲液清洗。通过20mM Tris-HCl、500mMNaCl、500mM咪唑,pH 8.0的线性梯度实现洗脱,并且收集纯化的部分,并通过SDS-PAGE和蛋白质印迹用抗His单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology,Heidelberg,Germany)分析以观察感兴趣的蛋白质。
在4℃下将蛋白质对含盐的碳酸氢钠缓冲液(166mM NaHCO3 pH 7.4+333mM NaCl)透析过夜。这些缓冲液是进一步实验的最终溶剂。蛋白质完整性和纯度通过质谱(MALDI-TOF)检查,并通过Bradford试验定量。
荧光测定、动态光散射(DLS)和场发射扫描电子显微镜(FESEM)
使用450nm的激发波长在510nm处用Varian Cary Eclipse荧光分光光度计(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,美国)测定融合蛋白的荧光。通过DLS在633nm处(Zetasizer Nano ZS,Malvern Instruments Limited,Malvern,UK)测定纳米颗粒和单体GFP蛋白融合物的体积尺寸分布。
对于荧光测定,将蛋白质样品在相应的存储缓冲液中稀释至0.5mg/ml,最终体积为100μl。对于DLS分析,将蛋白质(存储在-80℃下)解冻,并且每个样品使用50μl。在1kV下操作并配备高分辨率透镜内二次电子检测器的Zeiss Merlin(Zeiss,Oberkochen,德国)场发射扫描电镜进行场发射扫描电子显微镜(FESEM)定性分析。将稀释的纯化蛋白的微滴沉积在硅片表面(Ted Pella,Reading,CA,USA)上,风干并立即观察。
细胞培养和流式细胞仪
将CXCR4+HeLa细胞系(ATCC-CCL-2)在补充有10%胎牛血清的伊格尔最低必需培养基(Eagle's Minimum Essential medium)(Gibco,Rockville,MD,USA)中培养,并在37℃下和湿润气氛中5%的CO2中温育。同时,将SW1417细胞系维持在补充有10%胎牛血清的Dulbecco改良的伊格尔培养基(DMEM:GlutaMAXTM,Thermo FisherScientific,Waltham,MA,USA)中,并在37℃和湿润气氛中10%的CO2中温育。将HeLa和SW1417细胞系在24孔板上分别以33x104和12x104个细胞/孔培养24小时,直到达到70%的融合。
在流式细胞仪分析前24小时,在存在Optipro培养基的情况下,将纳米颗粒和单体蛋白以不同的浓度(范围从0.1至2μM)添加到细胞培养物中。在488nm激发下使用15W空气冷却的氩离子激光器,在FACSCanto系统(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ,USA)上分析细胞样品。用1mg/ml胰蛋白酶处理15分钟后,用检测器D(530/30nm带通滤光器)测量GFP荧光发射。
使用AMD3100/CXCR4+抑制剂(八盐酸盐水合物(octahydrochloride hydrate),Sigma-Aldrich,Steinheim,Germany)测量纳米颗粒的特异性内在化。对于该实验,在室温下在黑暗中1小时内用ATTO488(41698,Sigma-Aldrich)标记T22-BAK-GFP-H6以获得更多的荧光蛋白。在存在1:10的比例的AMD3100的情况下,在1小时温育期间以25nM添加T22-BAK-GFP-H6-ATTO488。
共焦显微镜
HeLa细胞在Mat-Tek培养皿(MatTek Corporation,Ashland,MA,USA)上生长。除去培养基并用DPBS清洗细胞,在2μM下染色之前24小时添加补充L-谷氨酰胺的OptiPro培养基和蛋白质。用0.2μg/ml Hoechst 33342(Molecular Probes,Eugene,OR,USA)标记细胞核,并且用2.5μg/ml CellMaskTM Deep Red(Molecular Probes)在黑暗中标记质膜,持续10分钟。使用Plan Apo 63×/1.4(油HC×PL APO lambdablue)物镜通过TCS-SP5共焦激光扫描显微镜(Leica Microsystems,Heidelberg,Germany)记录活细胞。
为了确定颗粒在细胞内的位置,以0.5μm的Z间隔收集10-20个切片的堆栈(stack),针孔设置为1Airy单位。使用Imaris版本7.2.1.0软件(Bitplane,Zürich,Switzerland)处理图像并生成3-D重建。
生物分布
使用称重在18至20克之间并维持在SPF条件下的五周龄的雌性瑞士nu/nu小鼠(Charles River,L’Arbresle,France)用于体内研究。所有体内程序均已由圣保罗医院动物伦理委员会批准,并根据欧洲理事会的指示进行。
为了生成皮下(SC)小鼠模型,我们从供体动物获得了10mg SP5 CCR肿瘤组织,并将其皮下植入瑞士nu/nu小鼠的下皮层中。当肿瘤大约达到500mm3时,将小鼠随机分配并以330μg/小鼠的剂量施用T22-BAK-GFP-H6、BAK-GFP-H6和T22-GFP-H6纳米颗粒。
试验短时间(2小时和5小时)和长时间时间(24小时和48小时)以探索所施用的纳米颗粒的生物学作用。为此,对小鼠实施安乐死,并收集肿瘤和脑、胰腺、肺和心脏、肾脏、肝脏和骨髓,并在光谱装置(PerkinElmer Inc,Waltham,MA,USA)中分别研究离体GFP荧光。首先将荧光信号(FLI)数字化,显示为伪彩色叠加图,并表示为辐射效率。将来自蛋白质处理小鼠的FLI信号除以对照小鼠的FLI自发荧光信号来计算FLI比例。
最后,收集所有的器官并用4%的甲醛磷酸盐缓冲溶液固定24小时。然后将这些样品包埋在石蜡中进行组织学和免疫组织化学分析,以及确定有丝分裂和凋亡指数以及评估坏死。
组织病理学和免疫组织化学分析
用苏木精和伊红(H&E)对4微米厚的切片进行染色,并由两名独立的观察者进行完整的组织病理学分析。使用DAKO免疫系统设备和标准方案通过免疫组织化学评估组织切片中His标记在蛋白材料中的存在和位置,以及蛋白水解的PARP和活性切割的半胱天冬酶3蛋白在组织切片中的存在和位置。在与第二抗体在肿瘤组织中温育2、5、24和48小时之后,将针对His标记的一级抗体(1:1000;MBL International,Woburn,MA,USA),抗-PARP p85片段pAb(1:300;Promega,Madison,WI,USA)或抗活性的半胱天冬酶3抗体(1:300,BDPharMigen,San Diego,CA,USA)温育25分钟。通过两个独立的盲计数器来定量染色细胞的数量,计数器记录每10个高倍视野中阳性细胞的数量(放大倍数400x)。使用Cell∧B软件(Olympus Soft Imaging v 3.3,Nagano,Japan)拍摄代表性图片。
评估有丝分裂、细胞凋亡、坏死率
还通过对H&E染色的肿瘤中每十个高倍视野(放大倍数x400)计数有丝分裂像的数量来处理肿瘤切片以评估增殖能力。通过H&E中细胞死亡体的存在以及还通过肿瘤切片中的Hoechst染色来评估凋亡诱导。在Triton X-100(0.5%)的透化切片中进行Hoechst33258(Sigma-Aldrich,Steinheim,Germany)染色。然后将载玻片用Hoechst 33258(在PBS中为1:5000)染色1小时,用水清洗,固定(mount)并在荧光显微镜(λex=334nm/λem=465nm)下分析。
通过两个独立的盲记录——每10个高倍视野(放大倍数400x)中凝结的和/或碎片化的核的数量——来定量凋亡小体的数量。使用Cell∧B软件在15x的放大倍数下来定量肿瘤中的坏死区域,并使用相同的Cell∧B软件在400x的放大倍数下拍摄代表性图片。
关于基于白喉毒素(DITOX)和铜绿假单胞菌的外毒素(PE24)的蛋白质纳米颗粒的
材料和方法
蛋白质设计、生产和纯化
自行设计分别编码自组装模块蛋白T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6的合成基因(图10A),并由Geneart(ThermoFisher)提供。DITOX包含来自白喉棒状杆菌的白喉毒素的易位域和催化结构域。PE24基于铜绿假单胞菌的外毒素A的去免疫催化结构域,其中并入了破坏B和T细胞表位的点突变。此外,已经在T22-PE24-H6的C端添加了KDEL序列,这使得在随后的细胞内运输过程中,在高尔基体能够更有效地与KDEL受体结合。在CXCR4配体T22和功能性毒素之间插入了弗林蛋白酶切割位点(图10A),一旦内在化到靶细胞中就释放出氨基端肽。已经设计了这种结构,以使两种毒素的天然形式都与游离氨基末端作用,并且在不存在另外的肽区段的情况下证明具有活性的重组形式也显示出该末端。两种基因融合体均插入质粒pET22b中,并通过在大肠杆菌Origami B(BL21,OmpT-,Lon-,TrxB-,Gor-,Novagen,Darmstadt,Germany)中的热休克转化了该载体的重组形式。将转化的细胞在补充有100μg/ml氨苄西林,12.5μg/ml四环素和15μg/ml卡那霉素的LB培养基中在37℃下过夜生长。当细胞培养物的OD550约为0.5-0.7时,分别在T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6中加入0.1和1mMIPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷),在20℃下过夜产生编码的蛋白质。细菌细胞在15分钟(在4℃下,5000g)内离心,并保持在-80℃下,直到使用。将沉淀解冻,并在存在蛋白酶抑制剂(完全不含EDTA,Roche Diagnostics,Indianapolis,IN,USA)的情况下将其再悬浮于清洗缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0,500mM NaCl,10mM咪唑)中。细胞破碎是由弗氏压碎器(Thermo FA-078A)在1200psi下进行的。然后将裂解物离心45分钟(在4℃下,15,000g),并使用0.2μm的孔径过滤可溶部分。然后,使用HiTrap螯合HP 1ml柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)和AKTA纯化器FPLC(GE Healthcare)通过固定金属亲和色谱(IMAC)通过His-tag纯化蛋白质。使用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0,500mM NaCl和500mM咪唑)的线性梯度实现洗脱。收集洗脱的部分,针对碳酸盐缓冲液(166mM NaCO3H pH 8)透析,并离心15分钟(在4℃下,15,000g)以除去不溶的聚集物。使用抗His单克隆抗体(SantaCruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)通过质谱(MALDITOF)、SDS-PAGE和蛋白质印迹分析蛋白质的完整性和纯度。通过布拉德福德(Bradford)试验测定蛋白质浓度。根据融合蛋白的模块化组织,已经建立了用于融合蛋白的命名法。
弗林蛋白酶切割设计和检测
为了促进T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6融合蛋白的无配体毒素在细胞内释放,在T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6中包括了两个不同的弗林蛋白酶切割位点,其在各自的毒素前体中自然地起作用以激活易位(图10A)。在T22-DITOX-H6中评估了平台中的切割效率,因为预期的片段应该展现出适用于定量分析的完全可区分的分子量。为此,将暴露于1μM蛋白质24小时的HeLa细胞提取物经历蛋白质印迹分析。在蛋白质温育后,将细胞收集、离心、悬浮在DPBS中,并通过超声破碎。使用Image Lab软件5.2.1版定量蛋白质印迹带。还构建了不包括这些工程化的弗林蛋白酶切割位点的两个另外的模块蛋白,即T22-DITOX-H6 F-和T22-PE24-H6 F-。除了对应于蛋白酶靶位点的黑体字深蓝色肽(图10A)外,它们的氨基酸序列与等同的构建体T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6的氨基酸序列完全匹配。这些不可切割的构建体被用于蛋白质细胞毒素的比较分析。
荧光标记和动态光散射
关于T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6融合蛋白的荧光标记和动态光散射,用ATTO488(Sigma Aldrich,Buchs,Switzerland)标记所述融合蛋白以在体外和体内实验中追踪其内在化。在黑暗中在室温下以1:2的摩尔比进行缀合。将反应混合物在1小时内每15分钟轻轻搅拌一次,离心15分钟(在4℃下,15,000g),并在原始缓冲液(166mM NaCO3H pH 8)中透析过夜,以消除游离的ATTO。
通过Varian Cary Eclipse荧光分光光度计(Agilent Technologies,Mulgrave,Australia)在523nm下使用488nm的激发波长测定0.1mg/ml的纳米颗粒的荧光。为了比较分析,通过蛋白质量校正了荧光强度,以提供特定的发射值。通过在人血清(S2257-5ML,Sigma,St Louis,MO,USA)内0.5μg/μl的最终浓度下在37℃下温育T22-DITOX-H6*持续48小时,伴随轻轻搅拌,来评估染料缀合的稳定性。然后,将样品在300ml碳酸盐缓冲液(166mMNaCO3H,pH 8)中透析2小时,以除去可能已从纳米颗粒释放的游离ATTO。与此同时(inparallel),透析含有相同量的游离ATTO的阳性对照。用荧光计测量透析后获得的缓冲液的荧光。通过在633nm下的动态光散射(DLS)来确定所有纳米颗粒的体积尺寸分布(ZetasizerNano ZS,Malvern Instruments Limited,Malvern,Worcestershire,UK)。
超微结构表征
使用在1kV下操作的场发射扫描电子显微镜(FESEM)Zeiss Merlin(Zeiss,Oberkochen,Germany)评估了接近天然状态的T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6纳米颗粒的尺寸和形状。将3μl的每种蛋白质样品的液滴直接沉积在硅片(Ted Pella Inc.,Reading,CA,USA)上,持续1分钟,用1号沃特曼(Whatman)滤纸(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)清除过量,空气干燥,并且观察没有涂覆高分辨率透镜内二次电子检测器。对于每个样品,在120,000×至200,000×的放大倍数下获取不同视野的代表性图像。
细胞培养和流式细胞仪
使用CXCR4+宫颈癌、结肠直肠癌和胰腺癌细胞系来研究体外重组蛋白(HeLaATCC-CCL-2,SW1417 ATCC-CCL-238和Panc-1 ATCC-CCL-1469)的性能。HeLa细胞维持在伊格尔最低必需培养基(Rockville,MD,USA)中,而SW1417和Panc-1维持在Dulbecco改良的伊格尔培养基中。它们都补充有10%的胎牛血清并在37℃和5%CO2(对于SW1417细胞,则为10%)的湿润气氛中温育。
为了监测蛋白质内在化,将HeLa细胞以3x104个细胞/孔在24孔板上培养24小时,直至达到70%的融合。在存在补充有L-谷氨酰胺的OptiPROTM SFM的情况下,将蛋白质在不同的浓度(100、500和1000nM)下温育1小时。另外,通过添加特异性拮抗剂AMD3100证明了通过CXCR4受体的特异性内在化,该拮抗剂期望抑制与T22的相互作用。在蛋白质温育前1小时,以1:10的比例添加该化学抑制剂。此外,在不同的温育时间段(0、20、30、60、120和240分钟)后,以1μM的浓度进行内在化动力学。在蛋白质暴露后,在37℃下使用1mg/ml的胰蛋白酶-EDTA分离细胞,持续15分钟,这是设计为去除外部附着的蛋白质的苛刻实验方案(Richard J.P.等人,J.Biol.Chem.2003,278:585-590)。使用在488nm激发下的15mW空气冷却的氩离子激光器通过FACS-Canto系统(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ,USA)分析获得的样品。一式两份进行实验。
共焦激光扫描显微镜
对于共焦显微镜,将HeLa细胞在Mat-Tek平板(MatTek Corporation,Ashland,MA,USA)上生长。在暴露于材料后,在室温下将细胞核用5μg/ml Hoechst 33342(ThermoFischer,Waltham,MA,USA)标记,并将质膜用2.5μg/ml CellMaskTM Deep Red(ThermoFischer)标记,持续10分钟。然后在PBS缓冲液(Sigma-Aldrich,Steinheim,Germany)中清洗细胞。使用63×(1.4NA)油浸物镜在倒置的TCS SP5 Leica光谱共焦显微镜(Leica Microsystems,Wetzlar,Germany)上收集HeLa细胞的共焦图像。经由405nm蓝光二极管激光器(核酸)、488nm线的氩离子激光器(纳米颗粒)和633nm线的HeNe激光器(细胞膜)达到激发。优化的发射检测带宽配置为避免通道间串扰,并且使用了多轨顺序采集设置。共焦针孔设置为1Airy单位,并选择z堆栈采集间隔以满足Nyquists采样标准。使用ImarisX64 v.7.2.1软件(Bitplane,Zürich,Switzerland)中的Surpass模块处理三维图像。
细胞活力试验
使用发光细胞活力试验(Promega,Madison,WI,USA)来测定T22-DITOX-H6、T22-PE24-H6、T22-DITOX-H6 F-和T22-PE24-H6 F-纳米颗粒在HeLa、SW1417CXCR4+或SW1417 CXCR4-细胞系上的细胞毒素。在37℃下在24小时内以3500或6000个细胞/孔在不透明壁的96孔板中培养细胞,直至达到70%的融合。根据使用的细胞系,所有蛋白质温育均在相应的培养基中进行。在蛋白质温育前1小时,以1:10的比例添加AMD3100(CXCR4的化学拮抗剂)来分析细胞死亡的抑制。T22-GFP-H6(一种非功能性的携带T22的蛋白质)也以2μM的最终浓度用作T22赋能毒素的竞争剂。在蛋白质温育后,将制造商提供的单个试剂添加到培养的细胞中,这会促使细胞裂解并产生与样品中ATP量成比例的发光信号。产生的ATP与孔中剩余的活细胞数量直接相关。然后,在常规的发光计Victor3(Perkin Elmer,Waltham,MA,USA)中测量平板。在相同的实验条件下,使用另一种非荧光试剂盒(EZ4U)测定过表达萤光素酶的Panc-1细胞的活力。一式三份进行细胞活力实验。
在单剂量施用纳米颗粒之后在CXCR4+结肠直肠癌小鼠模型中的生物分布、药代动力学和凋亡诱导分析
所有体内实验均由圣保罗医院的动物伦理委员会批准。我们使用了5周龄的雌性瑞士Nu/Nu小鼠,称重18–20g(Charles River,L'Abresle,France),保持在无特定病原体的条件下。为了产生皮下(SC)小鼠模型,我们在小鼠下皮层中皮下植入了10mg来自供体动物的源自患者的M5大肠直肠癌(CCR)肿瘤组织。在第15天,当肿瘤达到约500mm3时,小鼠接受单次静脉推注50μg NaCO3H,pH=8缓冲液中的T22-DITOXH6*(n=3)或单次静脉推注300μgNaCO3H,pH=8缓冲液中的T22-PE24-H6*(n=3)。对照动物接受相同的缓冲液(n=3)或0.25μg的游离ATTO 488(n=2)。在第5小时、24小时和48小时对小鼠实施安乐死,并收集皮下肿瘤和器官(脑、肺、肝脏、肾脏和心脏)。通过使用光谱(Perkin Elmer,Santa Clara,CA,USA)平台测量离体组织切片(3mm厚)中发射的荧光来确定ATTO标记的纳米颗粒在肿瘤和非肿瘤器官中的生物分布。首先将荧光信号(FLI)——其与每个组织中积聚的蛋白质的施用量相关联——数字化,显示为伪彩色叠加图,并表示为辐射效率[(p/s/cm2/sr)/μW/cm2]。通过对照小鼠的FLI自发荧光减去实验小鼠的FLI信号来计算FLI值。首先用PBS中的4%甲醛将样品固定24小时,然后将其包埋在石蜡中以进行组织病理学评估和凋亡指数分析。在12只瑞士裸鼠中单次静脉推注施用T22-PE24-H6*之后,或在12只动物中也单次推注施用50μg T22-DITOX-H6*之后,进行药代动力学分析。
在施药后的0、1、2、5、24和48小时的每个时间点处死三只小鼠,并获得约1ml的血液EDTA抗凝收集管。测量获得的血浆的精确体积和在每个时间点的荧光发射,并且将纳米颗粒的浓度称为发射的荧光并计算的施用剂量的浓度。对被苏木精和伊红(H&E)染色的肿瘤和正常器官(肝脏、肺、脾、心脏、肾脏和脑)的4μm切片进行凋亡诱导分析,其由两名独立的观察者进行了病理组织学分析。通过H&E染色和Hoechst染色的肿瘤切片二者中细胞死亡体的存在来评估凋亡诱导。然后将X-100(0.5%)透化的切片用在PBS中以1:5000稀释的Hoechst 33258(Sigma-Aldrich)染色1小时,用水清洗,固定并在荧光显微镜(λex=334nm/λem=465nm)下分析。在两名独立研究人员使用Cell∧B评估的盲样品中,通过记录每10个高倍视野(放大倍数400×)记录的浓缩和/或碎片整理的核的数量来定量凋亡细胞体的数量。
在纳米颗粒重复的剂量施用后CXCR4+CRC模型中的抗肿瘤作用
为了产生CXCR4+结肠直肠异种移植小鼠模型,我们使用了源自患者的M5结肠直肠肿瘤组织。将从供体动物获得的10mg片段植入瑞士nu/nu小鼠的下皮层,以产生如上所述的皮下(SC)肿瘤(n=9)。一旦肿瘤达到约120mm3,将小鼠随机分为对照组、T22-PE24-H6组和T22-DITOX-H6组,并且接受静脉内给药T22-PE24-H6或T22-DITOX-H6,二者均为重复的给药方案:10μg,每周3次,每次8剂量。使用相同的施药方案使对照组接受缓冲液。在实验期间记录小鼠体重,每周3次。开始纳米颗粒施用后第17天,对小鼠实施安乐死,并对皮下肿瘤进行测量,以测量其最终肿瘤体积并计数在5个高倍视野(放大倍数400×)中如上所述的H&E染色的肿瘤切片的的凋亡图的数量。
统计分析
分别通过单向方差分析(one-way ANOVA)和Tukey检验检查了纳米颗粒促进的细胞死亡的特异性和成对数据比较。使用Student t检验评估内在化和细胞死亡的成对散度,而使用曼惠特尼U检验成对比较凋亡小体的数量。各组之间的差异被认为是显著的,p<0.05,并且相关数据之间的差异在附图中用字母表示,或对于0.01<p<0.05表示为¥,和对于p<0.01为§。所有的统计分析均使用SPSS 11.0版程序包(IBM,NY,USA)进行,并且数值表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。
关于基于重组蓖麻毒素(mRTA)的蛋白纳米颗粒的材料和方法
遗传设计和蛋白质生产
重组蛋白T22-mRTA-H6(图17A)设计为包括在氨基末端高度特异性的CXCR4配体T22,随后是蓖麻毒素A链的突变形式,和在羧基末端的六组氨酸尾。引入突变N132A是为了在潜在的未来体内施药中抑制血管渗漏综合征,保持细胞毒素活性。另外,还并入了弗林蛋白酶切割位点,以允许内体中的辅助N端区域和准天然序列形式的蓖麻毒素的细胞内活性的释放。还并入了KDEL基序以利于内体逃逸。在噬菌体T7启动子的控制下编码蛋白质的质粒构建体pET22b-T22-mRTA-H6由GeneArt产生,并转化到大肠杆菌Origami B细胞中。
可溶性蛋白质的生产和纯化
在37℃和250rpm下,用含100μg/ml氨苄西林,15μg/ml卡那霉素和12.5μg/ml四环素的溶菌肉汤(LB)培养基中培养重组细菌。当培养物的OD达到0.5和0.7之间的值时,通过添加0.1mM异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导重组基因表达。随后将培养物在20℃和250rpm下温育过夜。收获细胞并离心(5,000g,15分钟,4℃)。在存在完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的情况下,将细胞沉淀再悬浮在清洗缓冲液(51m M磷酸钠缓冲液,pH=8,158.6mM海藻糖二水合物,0.01%聚山梨醇酯-20,15mM咪唑,300mM NaCl)中。将细菌细胞超声处理两次,一次在10%的振幅下,和一次在15%的振幅下,每轮10分钟,离心(15,000g,45分钟,4℃),并在AKTA纯化器FPLC(GE Healthcare)中用HiTrap螯合HP柱通过亲和色谱法纯化可溶部分。在将样品过滤(0.22μm)并注入柱中后,在约30%的洗脱缓冲液(51mM磷酸钠,pH=8,158.6mM海藻糖二水合物,0.01%聚山梨醇酯-20,500mM咪唑,300mM NaCl)下洗脱待收集的部分。缓冲液交换是在Centricon Centrifugal Tubes Ultracel 10,000NMWL中进行的。发现T22-mRTA-H6在51mM磷酸钠pH=6.2,60mg/mlα-海藻糖脱水,0.01%聚山梨醇酯-20中是高度稳定的。通过在TGX无染色凝胶(Bio-Rad)上进行SDS电泳,然后使用抗His单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)进行蛋白质印迹分析,分析蛋白质纯度。在TGX无染色胶(Bio-Rad)上进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以分析蛋白质。将样品以3:1的摩尔比在变性缓冲液(0.53M Tris碱,5.52M甘油,0.27M SDS,2.84Mβ-巯基乙醇,7.99M尿素)中稀释,在96℃下煮沸,持续10分钟,并上样至凝胶通道中。对于蛋白质印迹,使用抗His单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology),随后使用山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP第二抗体(Ref:170-6516)缀合物(Bio-Rad,Ref:170-6516)。使用ChemiDocTouch成像系统观察图像。已通过ICTS“NANBIOSIS”,更具体地通过CIBER-BBN/IBB(http://www.nanbiosis.es/unit/u1-protein-production-platform-ppp/)的蛋白质生产平台部分地进行蛋白质生产。
定量蛋白质分析
通过在Chemi Doc Touch Imaging System(Bio-Rad)上的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白质纯度。简而言之,将可溶性和不溶性样品二者以3:1的比例在变性缓冲液(0.53M Tris碱,5.52M甘油,0.27M十二烷基硫酸钠(SDS),2.84Mβ-巯基乙醇,7.99M尿素)中混合,分别煮沸5或45分钟,并上样到凝胶上。对于蛋白质印迹,使用抗His单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology),随后使用山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP第二抗体缀合物(Bio-Rad)。以高分辨率扫描凝胶,并使用已知的可溶性重组T22-mRTA-H6蛋白质标准品,用Quantity One Software(Bio-Rad)定量条带。
可溶性蛋白质的定量和定性分析
通过质谱法(MALDI-TOF)验证蛋白质分子量,并通过Bradford试验(Dye ReagentConcentrate Bio-Rad试剂盒)确定浓度。通过动态光散射(DLS)确定蛋白质纳米颗粒的体积大小分布。为此,将50μl等分试样(存储在-80℃下)解冻,并立即在633nm下测定纳米颗粒的体积尺寸分布(Zetasizer Nano ZS,Malvern Instruments Limited)。在25℃下用JascoJ-715分光光度计测定远紫外圆二色谱(CD)以评估T22-mRTA-H6的二级结构,T22-mRTA-H6以0.35mg/ml溶解在pH 8的166mM碳酸氢钠缓冲液中。CD光谱是在190-260nm的波长范围内以50nm/min的扫描速率,1秒的响应和1nm的带宽,在1mm路径长度的比色杯中获得的。累计进行了六次扫描。使用JASCO Spectrummanager分析软件分析二级结构的大小。为了研究蛋白质纳米颗粒中潜在的分子间β-折叠结构,调整了用于硫黄素T(ThT)染色的常规方法。
简而言之,将蛋白质等分试样(10μl)添加到pH 7.4的90μl,50μM(Sigma Aldrich)磷酸盐缓冲盐水(PBS)中,并搅拌1分钟。最终蛋白质的浓度为0.17mg/ml。ThT在450nm处激发,并使用Varian Cary Eclipse分光荧光计记录在460至565nm范围内的荧光发射光谱。通过增强游离染料荧光发射来监测交叉β-折叠结构。
细胞培养和细胞活力和凋亡的测定
在37℃下在5%CO2湿润气氛中,在补充有10%胎牛血清(Gibco Thermo FisherScientific(TFS))的MEM-α培养基中培养HeLa细胞(ATCC-CCL-2)。将它们接种在不透明的96孔板(3x104个细胞/孔)中,持续24小时。当化验不溶性T22-mRTA-H6时,向培养基中补充2%青霉素,10,000U/ml链霉素(Gibco,TFS)。第二天,添加可溶性T22-mRTA-H6,并将细胞暴露24、48和72小时。在24、48、72、96、120和144小时内,细胞也暴露于不溶性蛋白形式。细胞活力是通过在Multilabel Plater Reader Victor3(Perkin Elmer)中进行CellTiterGlo发光细胞活力试验(Promega)来确定的。对于CXCR4特异性测定,在并入蛋白质前1小时,以10:1的摩尔比添加CXCR4拮抗剂AMD3100。将最终体积为10μl的拮抗剂和蛋白质温育,其与90μl培养基混合。所有可溶性蛋白质实验均一式三份进行,并且不溶性蛋白质一式六份进行。另一方面,AML细胞系THP1(ACC-16)和MV411(ACC-102)以及3T3小鼠成纤维细胞(ACC-173)购买自DSMZ(Microorganisms and Cell Cultures的Leibniz Institute DSMZGermanCollection,Braunschweig,Germany)。在补充有10%FBS、10mmol/l L谷氨酰胺、100U/ml青霉素、10mg/ml链霉素和0.45μg/ml两性霉素的RPMI-1640培养基中培养THP1。(Gibco,TFS)。用添加相同补料(supplement)的DMEM培养基培养3T3细胞。将细胞保持在37℃下,5%CO2的湿润气氛中。使用XTT细胞活力试剂盒II(Roche Diagnostics)对这些细胞系进行细胞活力试验,并用分光光度计在490nm处读取吸光度(BMG Labtech)。将接种在96孔板上的细胞预处理1小时(100μM zVAD-fmk),并且然后将其暴露于100nM T22-mRTA-H6,持续48小时,评估半胱天冬酶抑制剂zVAD-fmk的作用。抗肿瘤药Ara-C(胞嘧啶β-D-阿拉伯糖呋喃糖苷盐酸盐)购买自Sigma Aldrich。为了允许对小鼠中的AML随访,用编码萤光素酶基因的质粒转染THP1 AML细胞系,该萤光素酶基因可赋予非侵袭性成像的生物发光(BLI)至细胞。简而言之,在24孔板中收获THP1细胞,用0.5μg DNA质粒处理,并按照制造商的说明在Opti-MEM还原血清培养基(Gibco,TFS)中与Lipofectamine LTX和PLUS试剂(A12621,Invitrogen,TFS)混合。在48小时后,在IVIS光谱体内成像系统(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)中将细胞与萤光素一起温育来测试BLI水平。最后,用1.5mg/mL遗传霉素(G418硫酸盐,Gibco,TFS)选择转染的细胞,并定期分析BLI以检查质粒在细胞中的保存,该细胞被称为THP1-Luci细胞。通过荧光激活细胞分选(FACS Calibur,BD)来确定3T3、MV411、THP1和HeLa中T22-GFP-H6的内在化。将细胞暴露于浓度100nM的T22-GFP-H6,持续1小时。然后,将细胞用PBS清洗并进行胰蛋白酶消化(1mg/ml胰蛋白酶,Life Technologies),以去除纳米颗粒与细胞膜的非特异性结合。最后,通过流式细胞仪定量细胞内GFP荧光的水平。平均荧光强度比给出为处理样品的平均荧光强度除以载体的平均荧光强度。
为了评估细胞凋亡,用Hoescht 3342染料(Sigma-Aldrich)在暴露于100nM T22-mRTA-H6或缓冲液中持续不同时间的HeLla细胞中进行核染色。在温育结束后,收集培养基并离心,以获得悬浮的细胞。将它们用PBS清洗并再次离心。粘附的细胞被胰蛋白酶消化,并将与先前获得的细胞拉在一起。在-20℃下将这些细胞固定(PBS中3.7%的对甲醛,pH 7.4)10分钟,用PBS清洗并再悬浮于10μl PBS中。最后,将细胞用具有DAPI的ProLongTM GoldAntifade Mountant固定在载玻片上,并在荧光显微镜下观察细胞核的外观。此外,根据供应商的说明,通过膜联蛋白V检测试剂盒(APC,eBioscience)检测到暴露于外部的磷脂酰丝氨酸蛋白的细胞,同时用碘化丙啶(PI)点样(spot)死细胞。如其他地方所描述,使用ATTO标记的蛋白质监测细胞内在化。
ROS水平和线粒体损伤的测定
另一方面,用细胞ROS检测试剂盒(Abcam)测量细胞ROS的水平。简而言之,将HeLa细胞暴露于100nM T22-mRTA-H6(15或24小时)或缓冲液中。然后,清洗细胞,并在黑暗中在37℃下用ROS检测溶液温育1小时,向阳性对照添加100μM绿脓素(1小时)。然后,在Ex=488nm和Em=520nm处用酶标仪(BMG Labtech)读取荧光水平。将值表示为减去空白的背景荧光后的相对荧光单位。最后,为了测量线粒体膜电位(Δψm),根据制造商的说明,我们使用了线粒体电位检测试剂盒(BD MitoScreen,BD Biosciences)。通过流式细胞仪分析标记的细胞,并将数据表示为含有去极化线粒体的细胞百分比(JC-1红色荧光的损失)。
流式细胞仪
通过荧光激活细胞分选法(FACSCalibur,BD)确定CXCR4膜表达。用0.5%BSA的PBS清洗细胞,并与作为对照的PE-Cy5小鼠抗CXCR4单克隆抗体(BD Biosciences)或PE-Cy5小鼠IdG2a同种型(BD Biosciences)温育。用软件Cell Quest Pro分析荧光发射的结果,并表示为每个样品的平均荧光强度与同种型值之间的比。
电子显微镜
通过场发射扫描电子显微镜(FESEM)观察T22-mRTA-H6的可溶性(以纳米颗粒形式)和不溶性(以IB形式)的超微结构。将不溶性蛋白质再悬浮在PBS中,并且在10%振幅下超声处理,0.5秒开/关,持续1分钟。在1分钟内,将10μL存储缓冲液中的可溶性蛋白质或PBS中的不溶性蛋白质的液滴沉积在硅片(Ted Pella)上,除去过量的液体,并风干。用在FESEMZeiss Merlin(Zeiss)中以1kV运行的镜头内检测器观察没有涂层的样品。在宽范围的放大倍数(100,000x到450,000x)下获得代表性图像。
在散播性急性髓细胞白血病(AML)小鼠模型中的抗肿瘤作用
从查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)(Wilmington,MA,USA)获得NSG(NOD-scid IL2Rgammanull)雌性小鼠(5周龄),并饲养(house)在微型隔离器中,自由采食(ad libitum)无菌食物和水。在隔离1周后,向NSG小鼠静脉内(IV)注射萤光素酶转染的THP1细胞(THP1-Luci;1×106个细胞/200μL),并随机分为三个不同的实验组。一组(VEHICLE;n=3)静脉内注射NaCO3H pH=8缓冲液,第二组(T22mRTA;n=1)施用10μg T22-mRTA-H6。两组均每天注射一剂量,总共10剂量。第三组(IB-T22mRTA;n=2)皮下(SC)注射一次1mg T22-mRTA-H6 IB。这些治疗在小鼠中静脉内注射THP1-Luci细胞后两天开始,其产生了散播性AML模型。在IVIS光谱中监测AML散布的演变,每周3次,直到安乐死那天。在BLI分析的同一天测量动物的体重。所有小鼠均在它们中的第一只出现相关疾病迹象,比如体重减轻10%或缺乏行动能力的那天被安乐死。对动物腹膜内注射萤光素,并在5分钟后通过颈椎脱臼处死小鼠。切除组织并离体分析器官的BLI水平。在此之后,将其保存在3.7%的甲醛中,并包埋石蜡,用于进行进一步的免疫组织化学分析。在体内和离体研究均使用LivingImage 4.4软件中的辐射光子进行BLI的分析和检测。所有程序均按照圣保罗医院动物伦理委员会批准的指南进行。
组织病理学和免疫组织化学染色
将浸润的(肝、脾、后肢和骨架)和正常(肺,心脏和肾)器官的石蜡包埋的样品的切片用苏木精和伊红(H&E)染色,并分析毒性的存在。此外,为了检测浸润组织中的AML细胞,在石蜡包埋的组织样品中进行了抗人CD45抗体(DAKO)的免疫组织化学分析。按照制造商的说明,在Dako Autostainer Link 48中进行染色。两名独立的观察者使用Olympus BX51显微镜(Olympus)评估了所有样品。使用Olympus DP72数码相机获取图像,并使用CellDImaging 3.3软件(Olympus)进行处理。
统计分析
定量数据表示为平均值±标准误差(SE)。在进行统计分析之前,分别使用Shapiro-Wilk和Levene检验对所有变量的方差的正态性和均匀性进行检验。用Tukey检验比较可溶性蛋白质的细胞毒素作用和竞争试验。同时,蛋白质细胞毒素测定通过曼惠特尼U检验进行评估。在p<0.05时接受显著性。
实施例1:T22-BAK-GFP-H6融合蛋白和纳米颗粒的设计和表征
发明人设计了包括阳离子肽T22的融合蛋白,用于BAK类结构单元的构建,所述阳离子肽T22为BAK BH3结构域的有力CXCR4-配体。将GFP并入融合平台,以方便地监测材料的定位和探索材料在诊断以及疗法(或用于治疗诊断)中的潜在用途。融合蛋白的示意图可见图1A。
在大肠杆菌中生物制备嵌合蛋白质并且通过常规的程序纯化(如在材料和方法章节指出)为具有预期质量的独特的和稳定分子种类(图1B)。如预期的,蛋白质自发组装成直径为约13.5nm的离散的单分散材料,其当用SDS处理时分解成>7nm的结构单元(图1C)。T22-BAK-GFP-H6单体稍微大于BAK-GFP-H6蛋白质(<7nm),因为缺少阳离子T22,其未组装。当在Optipro络合物培养基(未显示)中温育5小时时,未观察到分解,指示纳米颗粒在络合物生理学培养基中的稳定性。
而且,T22-BAK-GFP-H6纳米颗粒为发荧光的,展现出306.7±7.8单位/μg的特定绿色荧光发射,适于定量成像。高分辨率扫描电子显微镜揭示这些材料为具有规则形态测量的平面物体(图1D)。
实施例2:T22-BAK-GFP-H6融合蛋白纳米颗粒的功能分析
就功能分析而言,发明人首先确定蛋白质纳米颗粒以受体依赖性方式结合和穿透CXCR4+细胞的能力。的确,组装的T22-BAK-GFP-H6蛋白质有效穿透CXCR4+HeLa和SW1417细胞(图2A)。积聚的动力学与受体-介导的胞吞作用兼容(图2B),而吸收为CXCR4依赖性的,作为T22-CXCR4相互作用的抑制剂,AMD3100,[Unzueta,U.等人,2012.Int.J.Nanomedicine.7:4533-44.]在暴露之后显著降低了两个细胞系中的细胞内荧光。
对照不含T22的构建体不能进入细胞(图2C)。通过大部分暴露的细胞中荧光的普遍发生(图2D,和核周的区域中材料的细胞内积聚(图2E),确认了T22-BAK-GFP-H6的有效的渗透。T22-BAK-GFP-H6本质上是无毒的,因为在延长的暴露之后CXCR4-细胞活力保持不变(图2B,插图)。
实施例3:T22-BAK-GFP-H6融合蛋白纳米颗粒的体内积聚和分布
考虑到T22-BAK-GFP-H6纳米颗粒的高CXCR4连锁的细胞穿透性,就材料在肿瘤组织中诱导选择性细胞凋亡的生物分布和能力,发明人在CXCR4+结肠直肠癌的小鼠模型中测试了新的材料。通过尾静脉全身施用T22-BAK-GFP-H6纳米颗粒使得在肿瘤中瞬时积聚材料,在5小时达到峰值,如通过离体荧光图像和IHC确定(图3A-3C)。
其他相关器官,比如肾显示仅仅残留的荧光发射水平(图3D),不仅仅确认了材料的期望的定位,而且也确认了缺少明显的肾过滤,在肺中的聚集或在时间进程中的可检测的毒性(图3D、3E)。尤其,肾中蛋白质的缺少指示低聚物的高稳定性,因为单体或分解的蛋白质,甚至靶向特定的肿瘤标记,在肾中积聚[Cespedes,M.V.等2014.ACS Nano,8:4166-76]。
在24小时而不是在48小时,肿瘤仍显示可检测的荧光(表1),指示纳米颗粒在靶器官中延长的持久性。
表1.
表1:脑、肺和心脏、肝、肾和骨髓组织中表达为荧光比例的GFP荧光信号的定量。这通过将蛋白质处理的小鼠中每个器官的荧光除以时间进程实验中各自器官的缓冲液处理的小鼠中测量的自发荧光来计算。数据表达为平均值±SE。
实施例4:T22-BAK-GFP-H6融合蛋白纳米颗粒对于细胞凋亡和细胞周期的作用
与亲本T22-GFP-H6或未靶向的BAK-GFP-H6蛋白质比较,T22-BAK-GFP-H6诱导了明显减少的有丝分裂像(图4A)。这与半胱天冬酶-3激活、PARP的蛋白水解、小鼠中材料施用之后很快(2小时)肿瘤组织中凋亡小体和增加坏死区域的发生相关(图4B-4F)。肿瘤细胞凋亡在5小时时达到峰值并且保持至少48小时(图4A)。
相反,非靶向BAK-GFP-H6蛋白质在肿瘤中仅仅产生可忽略水平的半胱天冬酶-3激活或细胞凋亡,因为其与缓冲液处理的肿瘤的背景没有差异(图4F)。在任何探索的非目标器官中未观察到组织学改变(图3E)。这些观察不仅仅证实了当作为规则纳米颗粒递送时BAK BH3结构域的分子可用性,然而,如设想的T22-BAK-GFP-H6纳米颗粒展现出固有的生物活性。
实施例5:T22-PUMA-GFP-H6和T22-GW-H1-GFP-H6融合蛋白的纳米颗粒的物理和生
物特征
在该阶段,发明人更深入研究了基于仅仅治疗蛋白纳米颗粒的这种平台具有的可选方案。因此,发明人测试了基于细胞凋亡PUMA的p53上调的调节剂的功能纳米级材料的形成[Zhang,Y等人2009.Mol Biol Cell.,20:3077-87]和抗微生物肽GWH1[Chen,Y-L.S.等人2012.Peptides,36:257-65],也都在癌细胞中内在化时诱导细胞凋亡。根据与T22-BAK-GFP-H6相同的模块化方案,T22-PUMA-GFP-H6(图5A)和T22-GWH1-GFP-H6(图5B)分别形成20nm和24nm的纳米颗粒,如在三个BAK类构建体保留GFP荧光(未显示)。当体内施用时,两种纳米颗粒都在肿瘤中积聚(图5C-5D),在肾中很少发生T22-GWH1-GFP-H6。两种类型的纳米颗粒明显降低了有丝分裂速率并且甚至具有一些变异性,地毯材料倾向于在肿瘤组织中诱导细胞死亡和促进选择性坏死,该效果在PUMA类材料的情况下是明显的(图5E-5F)。
实施例6:H6-GFP-R9和H6-R9-GFP融合蛋白的表征
发明人设计融合蛋白以下述顺序包括六组氨酸区域、GFP和聚精氨酸序列(H6-GFP-R9融合蛋白)和六组氨酸区域、聚精氨酸序列和GFP(H6-R9-GFP融合蛋白)。
在大肠杆菌中生物制备嵌合蛋白质并且通过常规的程序纯化(如在材料和方法章节叙述)为具有预期质量的独特的和稳定分子种类的形式。在H6-GFP-R9融合蛋白的情况下,蛋白质自发组装成直径为约40-70nm的离散的单分散材料,并且在H6-R9-GFP融合蛋白的情况下直径为60-90nm(图6)。
实施例7:基于GWH1的蛋白质纳米颗粒的表征
在重组体大肠杆菌中成功地产生GWH1-GFP-H6(图1A),而没有明显的毒性迹象。其在单个步骤中通过His亲和色谱的纯化得到了具有30.2kDa的预期分子量的蛋白质种类(图7B、C)。因为GWH1肽是高度阳离子的并且末端阳离子肽加上聚组氨酸的组合促进蛋白质自组装,我们测试了该蛋白质形成低聚物的潜能。的确,在蛋白质的纯制品中通过DLS检测到了纳米颗粒的自发形成(图7D),指示GWH1作为纳米级组织标签的良好性能。在47nm达到峰值的那些纳米颗粒通过0.1%SDS充分分解,产生5nm的结构单元,其与亲本未组装的GFP-H6的尺寸匹配(图7D)。通过FESEM充分评估规则GWH1-GFP-H6纳米颗粒的形成(图1E)。
实施例8:基于GWH1的蛋白质纳米颗粒的抗细菌活性
为了测试当组装为蛋白质纳米颗粒时,GWH1-GFP-H6是否保持抗菌剂活性,我们将数个细菌物种的培养物暴露于该材料。如观察的(图8A),GWH1-GFP-H6在四种类中的三种显示出强力抗生素活性,其明显是剂量依赖性的(图8B)。蛋白质对铜绿假单胞菌的活性仍是明显的,但是比在剩余的靶中较弱。
在所有的情况下,细菌死亡明显与细胞裂解相关(图8C),强烈提示通过GWH1的常规膜活性达到了抗菌活性。因为先前还未描述游离的AMP氨基末端对于这种活性是否是必须的(在其他AMP的情况下将发生什么,并且设想更复杂的GWH1类重组构建体的进一步潜在设计,我们也在相同试验中测试了T22-GWH1-GFP-H6纳米颗粒。T22为细胞因子受体CXCR4的阳离子配体,其临床上可能与HIV感染相关(因为该蛋白质是病毒的共受体)并且与过表达该受体的数种人癌症,比如胰腺癌、转移黑素瘤或骨肉瘤相关[19-23]。如观察的,T22-GWH1-GFP-H6纳米颗粒对于靶细菌细胞仍有活性,但是效率降低了(图8A)。T22未提供这些材料的抗菌特性,因为相关的低聚构建体T22-GFP-H6未显示任何生物效果(图8A)。
实施例9:GWH1类蛋白纳米颗粒的细胞毒活性
我们对于了解GWH1-GFP-H6纳米颗粒是否也将显示细胞毒素潜力也感兴趣。这之所以重要,是因为GWH1纳米颗粒的任何残留的抗细胞活性将妨碍它们用作抗微生物剂的潜力。因为GWH1-GFP-H6展现出代表约50%的由His标记的GFP显示的特异性(未显示)的发荧光,我们能够在培养的人细胞中监测潜在的内在化。如观察的,GWH1-GFP-H6未内在化HeLa细胞,但是携带CXCR4配体T22的两种构建体能够穿透这些培养细胞(图9A)。GWH1-GFP-H6纳米颗粒在促进HeLa细胞死亡中同样低效,也如用对照T22-GFP-H6发生(图9B)。然而,在暴露于T22-GWH1-GFP-H6纳米颗粒的细胞中强的细胞毒素是明显的(图9B),指示细胞内靶向剂(T22)和AMP的组合对于细胞杀伤是有效的。
实施例10:基于白喉毒素(DITOX)和铜绿假单胞菌的外毒素(PE24)的蛋白质纳米
颗粒
在大肠杆菌中产生白喉毒素(DITOX)和铜绿假单胞菌的外毒素(PE24)的活性片段(图10A、B),作为模块化融合蛋白T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6,旨在通过蛋白质药物的催化片段的活性诱导靶向细胞死亡(图10C)。放置在完整构建体并且与羧基末端组氨酸协作的氨基末端的阳离子肽T22促进寡聚成规则纳米颗粒并且结合细胞表面趋化因子受体CXCR4(在许多侵略性人癌症中过表达)二者。这样,已经证实了在有助于载荷GFP和IRFP内体渗透至CXCR4+癌症干细胞中是有效的。然后,T22-DITOX-H6自发自组装成38和90nm纳米颗粒(Pdi=0.25±0.01nm)并且T22-PE24-H6组发自组装成~60nm纳米颗粒(Pdi=0.22±0.01,图11A),总在视为对于有效的细胞吸收最佳的尺寸范围内。在T22-PE24-H6的情况下,观察到了蛋白材料的次级群体,总是少数。通过0.1%SDS有效分解纳米颗粒,导致在~6nm达到峰值的单分散结构单元(Pdi=0.60±0.01和0.30±0.07分别),符合单体蛋白预期的尺寸。然而,两种蛋白质纳米颗粒在培养基角度温育的数个生理缓冲液中非常稳定,并且当暴露于高盐含量缓冲液(至多1M NaCl,未显示)中也非常稳定,其促使我们预期高的稳定性体内。另外,发现纳米颗粒在-80℃下存储一年之后并且当冷冻和解冻的重复循环是稳定的(未显示)。组装的蛋白质以圆环材料出现(图11B),其具有超微结构形态学(圆形和清晰的尺寸群体),这证实了通过DLS观察到的尺寸范围。先前已经为相关的T22-GFP-H6构建体描述了相同的常规结构,其中基于GFP的亚基(分子尺寸与T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6相似)组织为圆环实体,其组织已通过计算机模拟,并通过复杂的分析方法比如SAXS或高分辨率电子显微镜成像技术确认。
在用荧光染料ATTO 488化学标记(标记为*,图12A)后,测试了纯化的T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6纳米颗粒是否内在化到培养的CXCR4+细胞中。两种标记的纳米颗粒(图12A)都以剂量依赖的方式穿透靶HeLa细胞(图12B),并以受体介导的摄取动力学特征在细胞内积聚(在T22-PE24-H6*的情况中以更快的斜率,图12C)。通过CXCR4拮抗剂AMD3100对其的抑制,证实了穿透的CXCR4特异性(图12D)。观察到内在化的纳米颗粒被吞入内体中,特别是在靠近细胞膜的细胞质区域,但是当接近核周区域时,它们倾向于被可视化为无膜实体(图12E),这表明重要的内体逃逸。在任何情况下都没有观察到细胞附着的细胞外荧光。
一旦评估了内在化作用,我们就测试了引入构建体中的弗林蛋白酶切割位点以从结构单元释放毒素区段在低聚物中是否具有活性。预期的细胞内水解应增强毒素结构域的细胞毒素特性,然后可从较低负载的多余蛋白序列中受益。为此,我们探索了构建体T22-DITOX-H6中多个切割位点的敏感性,这些位点在细胞内消化后可提供完全可区分的蛋白质片段。与作为一种单一蛋白质种类(图11A和12A)出现的细胞外蛋白质不同,被细胞吞噬的蛋白质的His标记免疫检测显示该蛋白质被不同的替代位点消化,与每种弗林蛋白酶切割位点的预期产物的分子量相匹配。特别地,通过从48.65kDa全长蛋白质到44.21kDa片段的转移,在暴露于纳米颗粒24小时之后分析细胞提取物,在体内被细胞内在化的蛋白质中证明了通过从头整合的切割位点释放T22肽(图13A)。其余片段对应于仍保留羧基末端标记的渐进消化中间体,通过该中间体可以免疫检测蛋白质。从易位结构域释放催化结构域的内部弗林蛋白酶位点的天然切割也通过主要20.60kDa区段的发生证明。因此,预期催化片段将以合理的量在靶细胞内部以及其他生物活性形式中发生。
在探索细胞毒素作用时,T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6均可有效杀死培养的HeLa细胞,IC50值较低(分别为0.78nM和0.99nM,未显示)。在包括SW1417 CXCR4+的几种表达CXCR4的细胞系中明显可检测到细胞毒素作用,而在同基因的SW1417 CXCR4-系中则未检测到(图13B,左)。细胞毒素在很大程度上被AMD3100和展现T22的生物学内在蛋白T22-GFP-H6所消除(图13B,右),因此再次确认纳米颗粒进入的特异性,纳米颗粒介导的毒性的细胞内性质以及细胞杀伤中预期的CXCR4受体介导。此外,已经观察到当添加氯喹时T22-DITOX-H6(90%)的还原作用,其抑制内体酸化(未显示)。这一事实证实,作用机制是如上所述的pH依赖性的(图10)。在这种情况下,还评估了去除辅助蛋白区段(由弗林蛋白酶介导)对纳米颗粒的细胞毒素的相关性。为此,构建了不含工程切割位点(标记为F-)的T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6的形式,并对其生物活性进行了测试。由这些蛋白质介导的HeLa细胞死亡的比较分析揭示,与原始材料相比,T22-DITOX-H6 F-和T22-PE24-H6 F-纳米颗粒的细胞毒性急剧下降(图13C)。另一方面,通过免疫细胞化学和蛋白质印迹充分评估了同基因SW1417细胞中CXCR4的差异表达(图13D、E)。有趣的是,T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6促进细胞死亡的能力在-80℃储存一年后没有丧失,以及在4个冷冻和解冻循环后都没有丧失(未显示)。由于在细胞培养中观察到高的CXCR4+特异性细胞毒素,我们接下来使用CXCR4关联的疾病模型在体内测试了基于毒素的材料的性能。为此,我们探讨了在过表达CXCR4的皮下结肠直肠癌模型中T22-DITOX-H6*和T22-PE24-H6*纳米颗粒二者的生物分布、抗肿瘤活性和潜在的毒副作用。如预期的,在单次静脉注射施用后在研究的时间范围内施用蛋白质物质在肿瘤中积聚(图14)。其他器官,比如脑、肺或心脏完全没有荧光。然而,在肝脏和肾脏中发现了与两种纳米颗粒相关的显著水平的发射。为了丢弃在血液循环过程中可能从纳米颗粒中释放出大量ATTO并在生物分布分析中产生伪影,我们评估了在商业血清中温育的T22-DITOX-H6*纳米颗粒中染料的稳定性。在48小时,纳米颗粒仅释放了极少量的荧光(5%)。此外,游离ATTO的施用在肿瘤中未产生可检测到的积聚,并且主要器官中染料信号的缺失指示快速的尿液分泌(如对981Da的小分子所预期的)。这些数据完全支持图14中所显示的标记的纳米颗粒的生物分布。
观察到肝脏中纳米颗粒的存在值得进行更深入的分析,因为在常规和创新性癌症治疗中,甚至在显示组织特异性靶向的纳米缀合物或基于抗体的药物中,肝脏的发生和损害也是一个严重的问题。然后,由于区分这些器官中仅发生的荧光和毒素诱导的损伤至关重要,因此我们比较研究了肿瘤、肝和肾中的细胞损伤。在这方面,我们观察到由肿瘤组织中的两种纳米颗粒诱导的高水平的凋亡,这在施用后48小时在经T22-PE24-H6*处理的动物中尤其强烈(图15)。相反,在肝或肾中未检测到凋亡(图15),并且除了少数和散布的小炎症病灶(图15)以外,大部分肝组织在组织结构上是正常的,这可归因于药物在脱靶组织中的非特异性细胞外滞留。在恢复正常组织72小时后,这种改变得以解决。可能由弗林蛋白酶介导的辅助肽释放(图13)所促进的毒素的细胞内激活不会在肝组织中发生,肝组织不会过表达CXCR4。为了丢弃在单剂量施用后可能对肿瘤材料的细胞毒素有积极作用的ATTO,我们检查了用非标记蛋白形式T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6处理的动物的局部凋亡。在所测试的时间中,这样做的效率最高(分别为24小时和48小时)。如观察到的,局部凋亡仍然存在(图15),该值甚至高于由标记的蛋白质形式诱导的值。该结果表明所观察到的抗肿瘤作用与蛋白材料内在相关。然后,数据支持了这样的观点:尽管在肝和肾中存在蛋白质药物,但这并未转化为这些组织实质中两种纳米颗粒中任何一种的相关摄取。我们的观察表明,这两种标记的蛋白药物均通过孔状肝窦和肾小球进行短暂循环,尽管如针对其他纳米颗粒所报道的,它们具有纳米尺寸(与其他正常组织相比)。此外,由于与比如脾或骨髓——尽管它们显示出低的纳米颗粒积聚表达CXCR4——相比,它们的CXCR4表达微不足道,因此它们在肾或肝中缺乏毒性表明它们无法内在化到这些器官的薄壁组织细胞中。这一发现与报道的针对CXCR4靶向的成像剂的发现相似。然后,T22-DITOX-H6和T22-PE24-H6二者似乎都具有足够高的治疗指数以验证(i)它们用于治疗CXCR4+肿瘤的潜在用途,但是更重要的是,(ii)横向概念的广泛适用性支持基于化学均一结构单元的自组装自驱动蛋白质药物。为了进一步评估工程毒素的治疗潜力和支持基于毒素的纳米颗粒的设计的概念,我们还评估了在单剂量的50μg T22-DITOX-H6*或300μg T22-PE24-H6*后血液小鼠样品中的药代动力学。这是通过在施用后第0小时、1小时、2小时、5小时、24小时和48小时记录其荧光发射来完成的。我们观察到血浆浓度从Cmax呈双相下降,两种测试蛋白的快速纳米颗粒生物分布仅限于血浆区室(T22-PE-H6*的Vd=3.9ml,T22-DITOX-H6*的Vd=3.2ml)。这种快速的生物分布是在第二个且缓慢的消除阶段之后进行的,两种纳米颗粒的半衰期均为t1/2=30小时(图16A)。该动力学行为类似于先前针对药理学上无活性的蛋白质纳米颗粒所报道的动力学行为,并且也与针对抗体药物缀合物或大的纳米量级的尺寸治疗蛋白所描述的动力学行为相似,其表现出与未缀合抗体相似的行为。在进一步的步骤中,我们评估了在重复的剂量施用后在CXCR4+皮下CRC小鼠模型中每种纳米颗粒的抗肿瘤作用。在10μg T22-DITOX-H6,每周3次,每次8剂量的剂量方案后,我们在实验结束时观察到与缓冲液处理的小鼠相比,肿瘤体积减少了5.8倍(p=0.05)。这与肿瘤组织中的凋亡像增加3.0倍有关(p<0.001)(图16B),在毒素治疗组和对照组之间的体重没有显著差异(图16C)。类似地,并且10μg T22-PE24-H6,每周3次,每次8剂量的剂量方案之后,我们在实验结束时观察到,与缓冲液处理的小鼠相比,肿瘤体积减少了2.3倍(p=0.034),这与肿瘤组织中凋亡像的数量增加3.8倍有关(p=0.001)(图16B)。再次,在实验组和对照组之间没有观察到体重的显著差异(图16C)。
实施例11:基于重组蓖麻毒素(mRTA)的蛋白质纳米颗粒
重组T22-mRTA-H6(图17A)在大肠杆菌Origami B中成功地生产,并通过基于组氨酸的一步亲和色谱纯化,并被检测为已通过质谱(未显示)充分证实具有35.91kDa的预期分子量的单一蛋白质物种(图17B)。通过DLS和FESEM二者可以直接观察到纯的蛋白质为出现在存储缓冲液中的~11nm的实体,而没有进一步的处理(图17C,D),这表明自组装的纳米颗粒的自发形成。这是预期的结果,因为已证明氨基末端的阳离子肽和羧基末端的聚组氨酸的组合对于促进蛋白质寡聚化为规则的纳米结构是最佳的,而与核心蛋白质区段(蓖麻毒素,在T22-mRTA-H6的情况中,图17A)无关。用SDS处理材料得到5.5nm的单体(图17C),这代表了纳米颗粒的可能结构单元。在相关的自组装蛋白T22-GFP-H6中,结构单元的尺寸和组装形式二者均与T22-mRTA-H6的那些等同,使用小角度X射线散射和其他复杂的方法分析方法以及计算机模拟已经揭示纳米颗粒是由大约10种单体形成的。估计该像也适合T22-mRTA-H6。通过圆二色性(CD)对T22-mRTA-H6纳米颗粒的分析揭示了其中α-螺旋占主导的结构组成(29.2%,图17E)。然而,硫黄素T(Th T)试验还揭示了分子间β-折叠相互作用的发生(图17F),这可能有助于蛋白质纳米颗粒的稳定性,并且也与在CD中发现的重要的β-折叠结构的程度兼容(图17E)。由于纳米结构的蓖麻毒素旨在在肿瘤组织中传递,我们想知道纳米颗粒是否可以在肿瘤环境中观察到的异常pH值下保持稳定,据报道,该异常pH值范围为从大约6.3(细胞内)到7.4(细胞外)。如观察到的,T22-mRTA-H6在这些条件下保持完整组装(图17F),从稳定性的角度来看,这支持了构建体的可用性。
为了测试这种组装形式的重组蓖麻毒素的功能,将培养的CXCR4+HeLa细胞暴露于不同浓度的基于蓖麻毒素的纳米颗粒中。这些材料显示出有效的、剂量依赖性的细胞毒素,其基本上消除了在100nM下的细胞活力(图18A)。在暴露72小时后,IC50测定为13±0.5nM。为了确认是否如预期的,T22-mRTA-H6介导的细胞死亡是否取决于其细胞结合和经由细胞表面受体CXCR4及其配体T22对蛋白质的内在化,我们测试了当有效的CXCR4拮抗剂AMD3100可以用作毒素的竞争剂时,是否能够以10:1的摩尔比恢复细胞活力。如所观察到的(图18B),AMD3100在经T22-mRTA-H6-处理的细胞中显著增强细胞活力,证明了纳米颗粒特异性的、受体介导的穿透进入靶细胞。为了进一步确认这种精确的细胞进入机制,我们决定将非肿瘤(CXCR4-)3T3细胞以及代表性的CXCR4-和CXCR4+肿瘤细胞系暴露于T22-mRTA-H6,以及还有用于治疗几种癌症类型但是特别是急性髓细胞白血病(AML)的常规的化学药物,即胞嘧啶阿糖核苷(Ara-C)。这些具有不同水平的CXCR4表达的细胞系(图18C)支持由T22和CXCR4之间的特异性相互作用介导的不同水平的蛋白质内在化(图18D)。这是通过摄取T22-GFPH6来确定的,T22-GFPH6是一种与T22-mRTA-H6密切相关的自组装荧光蛋白,其中含有同样容纳在多肽的氨基末端的相同的CXCR4配体。必须注意的是,如预期的,CXCR4表达和T22介导的蛋白质内在化显示平行的行为(比较图18C和D)。然后,当最终对它们进行比较测试时,基于蓖麻毒素的蛋白质纳米颗粒仅在CraxC4+癌细胞中促进特异性细胞死亡,而在正常细胞中则不会促进特异性细胞死亡,在这种剂量下(100nM)Ara-C对这些细胞系中的任一个均不显示任何毒性作用(图18E)。该观察证明,与等摩尔剂量的模型化学药物相比,不仅可以有效地靶向蛋白质药物,而且具有优异的细胞毒素。
在此阶段,我们想确认T22-mRTA-H6促进的细胞毒素与CXCR4+细胞内部纳米颗粒的摄取有关,并且是从内部触发的。这是通过将HeLa细胞暴露于ATTO标记的纳米颗粒并监测内在化来实现的。如所观察到的(图19A),纳米颗粒被细胞内在化至少长达24小时。如预期的活性形式的蓖麻毒素一样,通过膜联蛋白亲和力试验和通过Hoechst染色均检测到凋亡(图19B),凋亡细胞的数量似乎在暴露后约15-24小时达到峰值。此外,用T22-mRTA-H6处理后15小时和24小时,通过用降低的JC-1红色荧光的细胞数量的显著增加证实了线粒体损伤(图19C),表明线粒体ΔΨ的去极化与凋亡诱导有关。有趣的是,细胞损伤的发生没有活性氧物质的增加(ROS,图19D),而暴露于蓖麻毒素的HeLa细胞中凋亡小体的形成显然是半胱天冬酶依赖性的(图19E)。这些数据的组合表明,T22-mRTA-H6-介导的细胞死亡是通过经典的半胱天冬酶依赖性凋亡途径发生的。
在散播性AML动物模型中评估了T22-mRTA-H6可溶性纳米颗粒和T22-mRTA-H6 IB二者的抗肿瘤作用。向NSG小鼠注射THP1-Luci细胞以在小鼠中产生白血病扩散。在通过静脉尾部细胞注射后两天,在两只小鼠(IB-T22mRTA组)的小鼠皮下(SC)中单剂量注射1mgT22-mRTA-H6 IB。在不同的小鼠组中,开始每天向一只小鼠静脉内施用10μg可溶性T22-mRTA-H6(T22mRTA组)或向三只小鼠静脉内施用单独的缓冲液(VEHICLE组),总共10剂量。在治疗期间观察到对小鼠体重没有作用(数据未显示)。通过使用IVIS光谱监测BLI来评估白血病的进展和传播。从第6天直到实验结束,用可溶性T22-mRTA-H6(T22mRTA)处理的小鼠显示低于VEHICLE组的发光发射(图20A)。因此,如通过BLI测量,与每剂量10μg,第4、6、8、10剂量的T22-mRTA-H6之后,与载体组相比,用可溶性T22-mRTA-H6处理抑制了小鼠中AML细胞的扩散(分别对应于在细胞注射后第6、8、10或13天)。相反,在用T22-mRTA-H6 IB(IB-T22mRTA)处理的小鼠和对照VEHICLE小鼠之间未发现BLI的差异(图20A)。
下一步,当小鼠出现晚期疾病迹象时,在注射细胞后14天,在受感染的离体器官中分析纳米颗粒的抗肿瘤活性。IVIS光谱的分析表明,与在单独使用缓冲液(VEHICLE)处理的小鼠中的发现相反,用可溶性T22-mRTA-H6纳米颗粒(T22mRTA)处理可降低骨髓(骨架和后肢)、肝和脾中的BLI(图21B)。然而,与对照小鼠(VEHICLE)相比,在相同组织中用T22-mRTA-H6 IB(IB-T22mRTA)处理未显示BLI的变化(图20B)。
此外,还通过CD45的IHC评估了白血病细胞在受感染的动物器官中的扩散情况,IHC是一种检测AML THP1细胞的人类白细胞标记。与BLI分析相关的结果表明,与检测T22-mRTA-H6 IB后登记的可溶性T22-mRTA-H6不同,通过用可溶性T22-mRTA-H6检测用可溶性T22-mRTA-H6治疗的小鼠的骨髓、肝和脾中CD45阳性细胞的数量减少,降低了浸润组织中的扩散(图20C)。最后,对浸润的器官和未被白血病细胞感染的其他器官进行H&E染色。在均没有用可溶性T22-mRTA-H6或T22-mRTA-H6 IB处理任何被感染或未被感染的组织中均未观察到毒性迹象(图21)。由于是在体外发生,IB会引起轻微的生物学效应(如果有的话)。
序列表
<110> 巴塞罗那自治大学
圣十字圣保罗医院基金会
恩雷德生物医学调查中心
<120> 纳米结构蛋白
<130> P14505EP00
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 聚阳离子肽1
<400> 1
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 聚阳离子肽2
<400> 2
Arg Arg Arg Gly Arg Gly Arg Arg Arg
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 聚阳离子肽3
<400> 3
Arg Ala Arg Gly Arg Gly Arg Arg Arg
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 聚阳离子肽4
<400> 4
Arg Ala Arg Gly Arg Gly Gly Gly Ala
1 5
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> Lymulus polyphemus
<400> 5
Arg Arg Trp Cys Tyr Arg Lys Cys Tyr Lys Gly Tyr Cys Tyr Arg Lys
1 5 10 15
Cys Arg
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> 疱疹病毒
<400> 6
Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Cys Leu Gly Tyr Gln
1 5 10 15
Lys Arg Pro Leu Pro
20
<210> 7
<211> 67
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser
1 5 10 15
His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro
20 25 30
Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln
35 40 45
Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys
50 55 60
Ala Leu Asn
65
<210> 8
<211> 68
<212> PRT
<213> 疱疹病毒
<400> 8
Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Cys Leu Gly Tyr Gln
1 5 10 15
Lys Arg Pro Leu Pro Gln Val Leu Leu Ser Ser Trp Tyr Pro Thr Ser
20 25 30
Gln Leu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg
35 40 45
Gln Val Cys Ala Asp Lys Asp Trp Val Lys Lys Leu Met Gln Gln Leu
50 55 60
Pro Val Thr Ala
65
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T140肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> X = L-3-(2-萘基)丙氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> X = D-Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X = L-瓜氨酸
<400> 9
Arg Arg Xaa Cys Tyr Arg Lys Xaa Pro Tyr Arg Xaa Cys Arg
1 5 10
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TN14003肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> X = L-3-(2-萘基)丙氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> X = L-瓜氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> X =D-Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X =L-瓜氨酸
<400> 10
Arg Arg Xaa Cys Tyr Xaa Lys Xaa Pro Tyr Arg Xaa Cys Arg
1 5 10
<210> 11
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TC 14012肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> X = L-3-(2-萘基)丙氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> X = D-瓜氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X = L-瓜氨酸
<400> 11
Arg Arg Xaa Cys Tyr Glu Lys Xaa Pro Tyr Arg Xaa Cys Arg
1 5 10
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TE14011肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> X = L-3-(2-萘基)丙氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> X = L-瓜氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> X = D-谷氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X = L-瓜氨酸
<400> 12
Arg Arg Xaa Cys Tyr Xaa Lys Xaa Pro Tyr Arg Xaa Cys Arg
1 5 10
<210> 13
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TZ14011肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> X = L-3-(2)-萘基)丙氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> X = L-瓜氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> X = D-赖氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X = L-瓜氨酸
<400> 13
Arg Arg Xaa Cys Tyr Xaa Lys Xaa Pro Tyr Arg Xaa Cys Arg
1 5 10
<210> 14
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GW-H1肽
<400> 14
Gly Tyr Asn Tyr Ala Lys Lys Leu Ala Asn Leu Ala Lys Lys Phe Ala
1 5 10 15
Asn Ala Leu Trp
20
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Arg Leu Val Ser Tyr Asn Gly Ile Ile Phe Phe Leu Lys
1 5 10
<210> 16
<211> 69
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu
1 5 10 15
Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly
20 25 30
Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr
35 40 45
Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile
50 55 60
Gly Arg Lys Lys Thr
65
<210> 17
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Seq-1-7肽
<400> 17
Lys Tyr Leu Ala Tyr Pro Asp Ser Val His Ile Trp Arg Lys Arg Lys
1 5 10 15
Arg Lys
<210> 18
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Seq-1-8肽
<400> 18
Lys Tyr Leu Ala Tyr Pro Asp Ser Val His Ile Trp Arg Lys Arg Lys
1 5 10 15
Arg Lys Arg
<210> 19
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Angiopep-2-7肽
<400> 19
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr
1 5 10 15
Glu Glu Tyr Arg Lys Arg
20
<210> 20
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核仁素结合肽(F3-RK肽)
<400> 20
Lys Asp Glu Pro Gln Arg Arg Ser Ala Arg Leu Ser Ala Lys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Glu Pro Lys Pro Lys Lys Ala Pro Ala Lys Lys Arg
20 25 30
Lys Arg Lys Arg Lys Arg Lys
35
<210> 21
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头1
<400> 21
Ser Gly Gly Thr Ser Gly Ser Thr Ser Gly Thr Gly Ser Thr
1 5 10
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头2
<400> 22
Ala Gly Ser Ser Thr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Gly Ser Thr Thr
1 5 10 15
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头3
<400> 23
Gly Gly Ser Gly Gly Ala Pro
1 5
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头4
<400> 24
Gly Gly Gly Val Glu Gly Gly Gly
1 5
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头5
<400> 25
Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser
1 5 10
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头6
<400> 26
Ala Pro Ala Glu Thr Lys Ala Glu Pro Met Thr
1 5 10
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点1 (肠激酶)
<400> 27
Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点2 (因子Xa)
<400> 28
Ile Glu Asp Gly Arg
1 5
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点3 (凝血酶)
<400> 29
Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点4 (TEV蛋白酶)
<400> 30
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点5 (PreScission蛋白酶)
<400> 31
Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro
1 5
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 优选的接头1
<400> 32
Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser
1 5
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 优选的接头2
<400> 33
Gly Gly Gly Asn Ser
1 5
<210> 34
<211> 211
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Met Ala Ser Gly Gln Gly Pro Gly Pro Pro Arg Gln Glu Cys Gly Glu
1 5 10 15
Pro Ala Leu Pro Ser Ala Ser Glu Glu Gln Val Ala Gln Asp Thr Glu
20 25 30
Glu Val Phe Arg Ser Tyr Val Phe Tyr Arg His Gln Gln Glu Gln Glu
35 40 45
Ala Glu Gly Val Ala Ala Pro Ala Asp Pro Glu Met Val Thr Leu Pro
50 55 60
Leu Gln Pro Ser Ser Thr Met Gly Gln Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile
65 70 75 80
Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg Arg Tyr Asp Ser Glu Phe Gln Thr Met
85 90 95
Leu Gln His Leu Gln Pro Thr Ala Glu Asn Ala Tyr Glu Tyr Phe Thr
100 105 110
Lys Ile Ala Thr Ser Leu Phe Glu Ser Gly Ile Asn Trp Gly Arg Val
115 120 125
Val Ala Leu Leu Gly Phe Gly Tyr Arg Leu Ala Leu His Val Tyr Gln
130 135 140
His Gly Leu Thr Gly Phe Leu Gly Gln Val Thr Arg Phe Val Val Asp
145 150 155 160
Phe Met Leu His His Cys Ile Ala Arg Trp Ile Ala Gln Arg Gly Gly
165 170 175
Trp Val Ala Ala Leu Asn Leu Gly Asn Gly Pro Ile Leu Asn Val Leu
180 185 190
Val Val Leu Gly Val Val Leu Leu Gly Gln Phe Val Val Arg Arg Phe
195 200 205
Phe Lys Ser
210
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg Arg
1 5 10 15
<210> 36
<211> 193
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Met Ala Arg Ala Arg Gln Glu Gly Ser Ser Pro Glu Pro Val Glu Gly
1 5 10 15
Leu Ala Arg Asp Gly Pro Arg Pro Phe Pro Leu Gly Arg Leu Val Pro
20 25 30
Ser Ala Val Ser Cys Gly Leu Cys Glu Pro Gly Leu Ala Ala Ala Pro
35 40 45
Ala Ala Pro Thr Leu Leu Pro Ala Ala Tyr Leu Cys Ala Pro Thr Ala
50 55 60
Pro Pro Ala Val Thr Ala Ala Leu Gly Gly Ser Arg Trp Pro Gly Gly
65 70 75 80
Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gly Pro Arg Pro Asp Gly Pro Gln Pro Ser
85 90 95
Leu Ser Leu Ala Glu Gln His Leu Glu Ser Pro Val Pro Ser Ala Pro
100 105 110
Gly Ala Leu Ala Gly Gly Pro Thr Gln Ala Ala Pro Gly Val Arg Gly
115 120 125
Glu Glu Glu Gln Trp Ala Arg Glu Ile Gly Ala Gln Leu Arg Arg Met
130 135 140
Ala Asp Asp Leu Asn Ala Gln Tyr Glu Arg Arg Arg Gln Glu Glu Gln
145 150 155 160
Gln Arg His Arg Pro Ser Pro Trp Arg Val Leu Tyr Asn Leu Ile Met
165 170 175
Gly Leu Leu Pro Leu Pro Arg Gly His Arg Ala Pro Glu Met Glu Pro
180 185 190
Asn
<210> 37
<211> 187
<212> PRT
<213> 白喉棒状杆菌
<400> 37
Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
20 25 30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
35 40 45
Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
85 90 95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
100 105 110
Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala
180 185
<210> 38
<211> 209
<212> PRT
<213> 铜绿假单胞菌
<400> 38
Gly Asp Ile Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu
1 5 10 15
Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe
20 25 30
Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe
35 40 45
Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly
50 55 60
Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp
65 70 75 80
Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg
85 90 95
Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Gly Leu
100 105 110
Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly
115 120 125
His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu
130 135 140
Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr
145 150 155 160
Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly
165 170 175
Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala
180 185 190
Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu
195 200 205
Lys
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 39
Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser
1 5
<210> 40
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Ser Thr Met Gly Gln Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly Asp Asp
1 5 10 15
Ile Asn Arg Arg Tyr Asp Ser Glu Phe
20 25
<210> 41
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Glu Glu Gln Trp Ala Arg Glu Ile Gly Ala Gln Leu Arg Arg Met Ala
1 5 10 15
Asp Asp Leu Asn Ala Gln Tyr Glu Arg
20 25
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 42
Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser
1 5
<210> 43
<211> 382
<212> PRT
<213> 白喉棒状杆菌
<400> 43
Gly Ala Asp Asp Trp Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe
1 5 10 15
Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys
20 25 30
Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp
35 40 45
Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr
50 55 60
Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Trp Lys
65 70 75 80
Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn
85 90 95
Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu
100 105 110
Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly
115 120 125
Ala Ser Arg Trp Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val
130 135 140
Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu
145 150 155 160
Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr
165 170 175
Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val
180 185 190
Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp
195 200 205
Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys
210 215 220
Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala
225 230 235 240
Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu
245 250 255
Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly
260 265 270
Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser
275 280 285
Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu
290 295 300
Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His
305 310 315 320
Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met
325 330 335
Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe
340 345 350
Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Trp His
355 360 365
Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr
370 375 380
<210> 44
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于铜绿假单胞菌外毒素A的去免疫催化结构域的肽PE24
<400> 44
Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser
1 5 10 15
Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His
20 25 30
Ala Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr
35 40 45
Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Ala Ala Arg
50 55 60
Ser Gln Asp Leu Ala Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp
65 70 75 80
Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Ala
85 90 95
Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Ala Ser
100 105 110
Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu
115 120 125
Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Ala
130 135 140
Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr
145 150 155 160
Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Trp Ile Pro Ser Ala Ile
165 170 175
Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile
180 185 190
Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln
195 200 205
Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys
210 215
<210> 45
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带有突变N132A的来自蓖麻种子的蓖麻毒素的链A
<400> 45
Ile Phe Pro Lys Gln Tyr Pro Ile Ile Asn Phe Thr Thr Ala Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Gln Ser Tyr Thr Asn Phe Ile Arg Ala Val Arg Gly Arg Leu
20 25 30
Thr Thr Gly Ala Asp Val Arg His Glu Ile Pro Val Leu Pro Asn Arg
35 40 45
Val Gly Leu Pro Ile Asn Gln Arg Phe Ile Leu Val Glu Leu Ser Asn
50 55 60
His Ala Glu Leu Ser Val Thr Leu Ala Leu Asp Val Thr Asn Ala Tyr
65 70 75 80
Val Val Gly Tyr Arg Ala Gly Asn Ser Ala Tyr Phe Phe His Pro Asp
85 90 95
Ala Gln Glu Asp Ala Glu Ala Ile Thr His Leu Phe Thr Asp Val Gln
100 105 110
Asn Arg Tyr Thr Phe Ala Phe Gly Gly Asn Tyr Asp Arg Leu Glu Gln
115 120 125
Leu Ala Gly Asn Leu Arg Glu Asn Ile Glu Leu Gly Asn Gly Pro Leu
130 135 140
Glu Glu Ala Ile Ser Ala Leu Tyr Tyr Tyr Ser Thr Gly Gly Thr Gln
145 150 155 160
Leu Pro Thr Leu Ala Arg Ser Phe Ile Ile Cys Ile Gln Met Ile Ser
165 170 175
Glu Ala Ala Arg Phe Gln Tyr Ile Glu Gly Glu Met Arg Thr Arg Ile
180 185 190
Arg Tyr Asn Arg Arg Ser Ala Pro Asp Pro Ser Val Ile Thr Leu Glu
195 200 205
Asn Ser Trp Gly Arg Leu Ser Thr Ala Ile Gln Glu Ser Asn Gln Gly
210 215 220
Ala Phe Ala Ser Pro Ile Gln Leu Gln Arg Arg Asn Gly Ser Lys Phe
225 230 235 240
Ser Val Tyr Asp Val Ser Ile Leu Ile Pro Ile Ile Ala Leu Met Val
245 250 255
Tyr Arg Cys Ala Pro Pro Pro Ser Ser Gln Phe
260 265
<210> 46
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于弗林蛋白酶的靶切割位点
<400> 46
Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val
1 5
<210> 47
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于弗林蛋白酶的靶切割位点
<400> 47
Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu
1 5 10
<210> 48
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KDEL内体逃逸肽
<400> 48
Lys Asp Glu Leu
1
Claims (57)
1.一种融合蛋白,其包括:
(i)聚阳离子肽,
(ii)间插多肽区,和
(iii)带正电荷的富含氨基酸的区域,
其中所述间插多肽区不是荧光蛋白或人p53。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白,其中所述聚阳离子肽选自:
(i)富含精氨酸的序列,
(ii)能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进所述融合蛋白在所述细胞上的内在化的序列,
(iii)GW-H1肽,
(iv)CD44配体,
(v)能够穿越血脑屏障的肽,
(vi)穿透肽的细胞,和
(vii)核仁素结合肽。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白,其中所述聚阳离子肽是包括选自RRRRRRRRR(SEQID NO:1)、RRRGRGRRR(SEQ ID NO:2)、RARGRGRRR(SEQ ID NO:3)和RARGRGGGA(SEQ ID NO:4)的序列的富含精氨酸的序列。
4.根据权利要求2所述的融合蛋白,其中所述聚阳离子肽包括能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进所述融合蛋白在所述细胞上的内在化的序列,所述序列是CXCR4配体。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白,其中所述CXCR4配体选自包括序列RRWCYRKCYKGYCYRKCR(SEQ ID NO:5)、V1肽(SEQ ID NO:6)、CXCL12肽(SEQ ID NO:7)、vCCL2(SEQ ID NO:8)或其功能等同变体的肽。
6.根据权利要求2所述的融合蛋白,其中所述聚阳离子肽是CD44配体A5G27(SEQ IDNO:15)或FNI/II/V(SEQ ID NO:16)。
7.根据权利要求2所述的融合蛋白,其中所述聚阳离子肽是能够穿越血脑屏障的肽Seq-1-7(SEQ ID NO:17)、Seq-1-8(SEQ ID NO:18)、Angiopep-2-7(SEQ ID NO:19)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的融合蛋白,其中所述带正电荷的富含氨基酸的区域是聚组氨酸区域。
9.根据权利要求4所述的融合蛋白,其中所述聚组氨酸区域包括3至6个组氨酸残基。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白,其中所述聚阳离子肽位于所述融合蛋白的N端并且所述带正电荷的富含氨基酸的区域位于所述融合蛋白的C端,或者其中所述带正电荷的富含氨基酸的区域位于所述融合蛋白的N端并且所述聚阳离子肽位于所述融合蛋白的C端。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的融合蛋白,其中所述聚阳离子区域经由第一肽接头连接至治疗蛋白,和/或其中所述治疗蛋白经由第二肽接头连接至所述带正电荷的富含氨基酸的区域。
12.根据权利要求11所述的融合蛋白,其中所述第一肽接头包括GGSSRSS序列(SEQ IDNO:32)或GGGNS序列(SEQ ID NO:33)。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的融合蛋白,其中所述间插区是治疗剂。
14.根据权利要求13所述的融合蛋白,其中所述治疗剂选自:
(i)细胞毒素多肽,
(ii)抗血管生成多肽,
(iii)由肿瘤抑制基因编码的多肽,
(iv)促凋亡多肽,
(v)具有抗转移活性的多肽,
(vi)由能够激活针对肿瘤的免疫应答的多核苷酸编码的多肽,
(vii)化疗剂,
(viii)抗血管生成分子,
(ix)由自杀基因编码的多肽,和
(x)伴侣蛋白多肽。
15.根据权利要求14所述的融合蛋白,其中所述治疗剂是选自下列的细胞毒素多肽:BAK(SEQ ID NO:35)、PUMA(SEQ ID NO:36)、GW-H1(SEQ ID NO:14)的BH3结构域,白喉毒素(SEQ ID NO.37)、DITOX(SEQ ID NO.43)的活性区段,铜绿假单胞菌的外毒素A(SEQ IDNO.38)、PE24(SEQ ID NO.44)和蓖麻毒素(SEQ ID NO.45)的活性区段。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的融合蛋白,进一步包括报告蛋白。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的融合蛋白,其中所述融合蛋白的组分通过肽连接,所述肽的序列包括针对蛋白酶的靶切割位点。
18.根据权利要求17所述的融合蛋白,其中包括针对蛋白酶的靶切割位点的所述肽位于所述聚阳离子肽和所述间插多肽区之间。
19.根据权利要求17或18中任一项所述的融合蛋白,其中针对蛋白酶的靶切割位点选自弗林蛋白酶、肠激酶、因子Xa、凝血酶、TEV蛋白酶和PreScission蛋白酶。
20.根据权利要求19所述的融合蛋白,其中针对所述弗林蛋白酶的靶切割位点是SEQID NO.46或SEQ ID NO.47,针对肠激酶蛋白酶的靶切割位点是SEQ ID NO.27,针对蛋白酶因子Xa的靶切割位点是SEQ ID NO.28,针对凝血酶蛋白酶的靶切割位点是SEQ ID NO.29,针对TEV蛋白酶的靶切割位点是SEQ ID NO.30,针对PreScission蛋白酶的靶切割位点是SEQ ID NO.31。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的融合蛋白,包括有助于内体逃逸的肽。
22.根据权利要求21所述的融合蛋白,其中有助于内体逃逸的肽是具有SEQ ID NO.48的KDEL。
23.根据权利要求21或22中任一项所述的融合蛋白,其中所述有助于内体逃逸的肽位于所述融合蛋白的C端结构域。
24.一种制备包括多个拷贝的根据权利要求1至16中任一项所述的融合蛋白的纳米颗粒的方法,包括将所述融合蛋白的制剂置于低盐缓冲液中。
25.根据权利要求24所述的方法,其中所述低盐缓冲液选自碳酸盐缓冲液、Tris缓冲液和磷酸盐缓冲液。
26.根据权利要求24或25所述的方法,其中所述碳酸盐缓冲液包括浓度在100和300mM之间的碳酸氢钠,所述Tris缓冲液包括浓度在10和30mM之间的Tris,和/或其中所述磷酸盐缓冲液包括总浓度在5mM和20mM之间的Na2HPO4和NaH2PO4。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法,其中所述低盐缓冲液进一步包括葡萄糖和/或甘油。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的方法,其中所述缓冲液的pH在6.5和8.5之间。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的方法,其中所述缓冲液选自:
(i)166mM NaHCO3,pH 7.4,
(ii)20mM Tris、500mM+5%葡萄糖pH 7.4,和
(iii)140mM NaCl、7.5mM Na2HPO4、2.5mM NaH2PO4+10%甘油pH 7.4。
30.一种编码根据权利要求1至16中任一项所述的融合蛋白的多核苷酸。
31.一种载体,其包括如权利要求30中所限定的多核苷酸。
32.一种宿主细胞,其包括根据权利要求30所述的多核苷酸或根据权利要求31所述的载体。
33.一种纳米颗粒,其包括多个拷贝的根据权利要求1至16中任一项所述的融合蛋白。
34.根据权利要求33所述的纳米颗粒,其具有在10和100nm之间的直径。
35.根据权利要求1至16中任一项所述的融合蛋白,根据权利要求30所述的多核苷酸,根据权利要求31所述的载体,根据权利要求32所述的宿主细胞或根据权利要求33或34所述的纳米颗粒,用于医学。
36.根据权利要求1至16中任一项所述的融合蛋白,根据权利要求30所述的多核苷酸,根据权利要求31所述的载体,根据权利要求32所述的宿主细胞或根据权利要求33或34所述的纳米颗粒,其中所述聚阳离子肽是能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进所述融合蛋白在所述细胞上的内在化的序列,
其中所述细胞是存在于癌症中的肿瘤细胞,并且其中所述间插序列是抗肿瘤肽,用于治疗所述癌症。
37.根据方面36所述的使用的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中所述抗肿瘤肽选自:
(i)细胞毒素多肽,
(ii)抗血管生成多肽,
(iii)由肿瘤抑制基因编码的多肽,
(iv)促凋亡多肽,
(v)具有抗转移活性的多肽,
(vi)由能够激活针对肿瘤的免疫应答的多核苷酸编码的多肽,
(vii)化疗剂,
(viii)抗血管生成分子,和
(ix)由自杀基因编码的多肽。
38.根据权利要求36或37所述的使用的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中所述抗肿瘤肽是BAK(SEQ ID NO:35)、PUMA(SEQ ID NO:36)、GW-H1(SEQ ID NO:14)的BH3结构域,白喉毒素(SEQ ID NO.37)、DITOX(SEQ ID NO.43)的活性区段,铜绿假单胞菌的外毒素A(SEQ ID NO.38)、PE24(SEQ ID NO.44)或蓖麻毒素(SEQ ID NO.45)的活性区段。
39.根据权利要求36至38中任一项所述的使用的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中所述聚阳离子肽是CXCR4配体,并且其中所述癌症的特征在于包括表达CXCR4的癌细胞。
40.根据权利要求39所述的使用的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中所述CXCR4配体选自包括序列RRWCYRKCYKGYCYRKCR(SEQ ID NO:5)、V1肽(SEQ ID NO:6)、CXCL12肽(SEQ ID NO:7)、vCCL2肽(SEQ ID NO:8)或其功能等同变体的肽。
41.根据权利要求39或40所述的使用的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中所述癌症是胰腺癌或结肠直肠癌。
42.根据权利要求1至16中任一项所述的融合蛋白,根据权利要求30所述的多核苷酸,根据权利要求31所述的载体,根据权利要求32所述的宿主细胞或根据权利要求33或34所述的纳米颗粒,其中所述聚阳离子肽是GW-H1(SEQ ID NO:14)肽,用于治疗由细菌感染引起的疾病。
43.根据权利要求1至16中任一项所述的融合蛋白,根据权利要求30所述的多核苷酸,根据权利要求31所述的载体,根据权利要求32所述的宿主细胞或根据权利要求33或34所述的纳米颗粒,其中所述聚阳离子肽是能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进所述融合蛋白在所述细胞上的内在化的序列,
其中所述细胞是被病毒感染的细胞,并且其中所述间插序列是抗病毒剂,用于治疗由所述病毒感染引起的疾病。
44.根据权利要求43所述的使用的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中所述抗病毒剂选自:
(i)细胞毒素多肽,
(ii)促凋亡多肽,
(iii)由自杀基因编码的多肽,
(iv)抗逆转录病毒多肽。
45.根据权利要求43或44所述的使用的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,
其中所述聚阳离子肽是CXCR4配体,并且
其中被病毒感染的所述细胞是HIV感染的细胞,
用于治疗由HIV感染引起的疾病。
46.根据权利要求45所述的使用的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中所述CXCR4配体选自包括序列RRWCYRKCYKGYCYRKCR(SEQ ID NO:5)、V1肽(SEQ ID NO:6)、CXCL12肽(SEQ ID NO:7)、vCCL2肽(SEQ ID NO:8)或其功能等同变体的肽。
47.根据权利要求1至16中任一项所述的融合蛋白,根据权利要求30所述的多核苷酸,根据权利要求31所述的载体,根据权利要求32所述的宿主细胞或根据权利要求33或34所述的纳米颗粒,其中所述聚阳离子肽是CD44配体,其中所述间插序列是抗肿瘤肽,用于治疗特征在于表达CD44的癌症。
48.根据权利要求47所述的使用的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中所述抗肿瘤肽选自细胞毒素多肽,
(i)抗血管生成多肽,
(ii)由肿瘤抑制基因编码的多肽,
(iii)促凋亡多肽,
(iv)具有抗转移活性的多肽,
(v)由能够激活针对肿瘤的免疫应答的多核苷酸编码的多肽,
(vi)化疗剂,
(vii)抗血管生成分子,和
(viii)由自杀基因编码的多肽。
49.根据权利要求47或48所述的使用的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中所述抗肿瘤肽是BAK(SEQ ID NO:35)、PUMA(SEQ ID NO:36)、GW-H1(SEQ ID NO:14)的BH3结构域,白喉毒素(SEQ ID NO.37)、DITOX(SEQ ID NO.43)的活性区段,铜绿假单胞菌的外毒素A(SEQ ID NO.38)、PE24(SEQ ID NO.44)或蓖麻毒素(SEQ ID NO.45)的活性区段。
50.根据权利要求47至49中任一项所述的使用的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中所述CD44配体是A5G27(SEQ ID NO:9)或FNI/II/V(SEQ ID NO:10)。
51.根据权利要求47至50中任一项所述的使用的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中所述癌症是结肠癌、肝癌、前列腺癌或乳腺癌。
52.根据权利要求1至16中任一项所述的融合蛋白,根据权利要求30所述的多核苷酸,根据权利要求31所述的载体,根据权利要求32所述的宿主细胞或根据权利要求33或34所述的纳米颗粒,其中所述聚阳离子肽是能够穿越血脑屏障的序列,并且其中所述间插多肽区是伴侣蛋白或蛋白质聚集抑制剂,用于治疗神经退行性疾病。
53.根据权利要求52所述的使用的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中所述肽能够穿越血脑屏障Seq-1-7(SEQ ID NO:11)、Seq-1-8(SEQ ID NO:12)、Angiopep-2-7(SEQ ID NO:13)。
54.根据权利要求1至16中任一项所述的融合蛋白,根据权利要求30所述的多核苷酸,根据权利要求31所述的载体,根据权利要求32所述的宿主细胞或根据权利要求33或34所述的纳米颗粒,其中所述聚阳离子肽是能够穿越血脑屏障的肽,其中所述间插序列是抗肿瘤肽,用于治疗中枢神经系统的癌症。
55.根据权利要求54所述的使用的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中所述抗肿瘤肽选自细胞毒素多肽,
(i)抗血管生成多肽,
(ii)由肿瘤抑制基因编码的多肽,
(iii)促凋亡多肽,
(iv)具有抗转移活性的多肽,
(v)由能够激活针对肿瘤的免疫应答的多核苷酸编码的多肽,
(vi)化疗剂,
(vii)抗血管生成分子,和
(viii)由自杀基因编码的多肽。
56.根据权利要求2所述的融合蛋白,其中所述聚阳离子肽是能够穿越血脑屏障的肽Seq-1-7(SEQ ID NO:11)、Seq-1-8(SEQ ID NO:12)、Angiopep-2-7(SEQ ID NO:13)。
57.根据权利要求47至50中任一项所述的使用的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或纳米颗粒,其中所述中枢神经系统的癌症是神经胶质瘤。
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