CN103501818A - 用于高效及靶向递送治疗性分子至cxcr4细胞的方法和试剂 - Google Patents
用于高效及靶向递送治疗性分子至cxcr4细胞的方法和试剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103501818A CN103501818A CN201280011605.XA CN201280011605A CN103501818A CN 103501818 A CN103501818 A CN 103501818A CN 201280011605 A CN201280011605 A CN 201280011605A CN 103501818 A CN103501818 A CN 103501818A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- conjugate
- polynucleotide
- agent
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
Abstract
本发明涉及缀合物,该缀合物包括基于鲎肽衍生肽的特异性针对CXCR4的靶向部分和治疗剂或成像剂。本发明也涉及所述缀合物用于需要特异性靶向CXCR4+细胞的治疗和诊断的应用。
Description
技术领域
本发明涉及包括靶向部分和治疗性部分或诊断部分的缀合物连同其用于治疗的用途。
背景技术
趋化因子受体在某些细胞的表面上表达,其与称作趋化因子的细胞因子相互作用。CXC趋化因子受体4(CXCR4)是一种转导其内源性配体,趋化因子CXCL12(间质细胞衍生因子-1,SDF-I)的信号的G蛋白偶联受体。在CXCR4/CXCL12相互作用后,触发胞内钙(Ca2+)离子流。这造成多种细胞反应,包括允许细胞穿行于有机体内的趋化性。
CXCR4在髓样细胞、T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞和树突细胞上表达。因此,这种分子在肿瘤细胞表面上的表达使其成为合适候选物,作为将治疗性化合物特异性靶向表达所述分子的细胞的配体。例如,WO 2006029078描述了包括蛋白易位结构域的融合构建体,所述蛋白易位结构域由Tat蛋白、CXCR4受体结合性DV3肽结构域和作为cdk2拮抗剂肽或p53激活肽的治疗剂形成。借助所述蛋白易位结构域,将这些构建体靶向表达CXCR4的细胞,并且将治疗剂转位于细胞内部。然而,除仅在构建体与细胞对接中发挥作用的CXCR4配体之外,这些构建体需要于细胞内部递送所述治疗剂的转位结构域。
Driessen(德雷森)等人(Molecular Therapy(分子治疗),2008,16:516-524)描述了一种与磷脂共价连接的肽类似物4-氟苯甲酰-RR-(L-3-(2-萘基)丙氨酸)-CYEK-(1-瓜氨酸)-PYR-(1-瓜氨酸)-CR(SEQ ID NO:1)靶向基于脂质的基因递送载具至CXCR4+-细胞的用途。然而,这种方法示出低效率并且需要通过使靶细胞与缀合物接触之前与VEGF接触,增加CXCR4在细胞表面上的表达。
Le Bon(勒·邦)等人,(Bioconjugate Chem.(生物共轭化学)(2004,15,413-423)描述了使用脂质缀合物和聚阳离子缀合物时,CXCR4特异性配体AMD3100和AMD3100促进特定基因转移至表达CXCR4的细胞中的用途。然而,这种方法需要佛波醇酯衍生物与聚阳离子脂质治疗剂缀合以便增加靶细胞表面上的CXCR4表达。
Egorova(叶戈洛娃)等人,(J Gene Med(基因医学杂志)2009;11:772-781)描述了由CXCR4配体(肽KPVSLSYRSPSRFFESH-K9-生物素[(SEQ ID NO:2)-生物素]、KPVSLSYR-K9-生物素[(SEQ ID NO:3)-生物素]和D-LGASWHRPDK-K9-生物素[(SEQID NO:4)-生物素]和静电结合聚赖氨酸区的DNA形成的缀合物及其递送核酸至CXCR4阳性细胞的用途。然而,这些缀合物具有低效率并依赖于使用针对CXCR4示出激动活性的肽,这可能导致增加的肿瘤增殖作为CXCR4受配体刺激的反应。
Tamamura(玉村)等人(Bioinorganic&Medicinal Chemistry,(生物有机化学与医药化学)2001,9:2179-2187)描述了T140 CXCR4激动剂的不同类似物和3′-叠氮-3-脱氧胸苷(AZT)缀合物和它们用于防止MT-4细胞中HIV-1诱导的细胞致病性。然而,没有提供这些缀合物能够在体内靶向CXCR4表达细胞或与CXCR4配体缀合的AZT可以被CXCR4内化的证据。
另外,全部这些缀合物均通过递送治疗剂至细胞表面发挥作用,从所述细胞表面开始,所述药剂的内化需要其与细胞表面上的特定受体结合。因此,本领域需要适于特异性递送感兴趣的分子至CXCR4细胞的其他缀合物,这些缀合物克服现有技术描述的缀合物的问题,并且其中治疗剂的内化因使用CXCR4靶向分子而发生,所述CXCR4靶向分子可以由CXCR4表达细胞连同与所述分子结合的治疗剂一起内化。
发明内容
在第一方面,本发明涉及一种缀合物,包括
(i)包括序列RRWCYRKCYKGYCYRKCR(SEQ ID NO:5)的靶向肽或其功能等同变体,以及
(ii)治疗剂
其中所述靶向肽能够特异性结合CXCR4并促进所述治疗剂在表达CXCR4的细胞中的内化。
在另外方面,本发明涉及编码根据本发明的缀合物的多核苷酸、包括所述多核苷酸的载体和包含所述多核苷酸或所述载体的宿主细胞。
在另一个方面,本发明涉及用于医学中使用的缀合物、多核苷酸、载体或宿主细胞。
在另一个方面,本发明涉及根据本发明的用于治疗癌症的方法中使用的缀合物、多核苷酸、载体或宿主细胞,其中所述癌症含有表达CXCR4的细胞。
在另一个方面,本发明涉及根据本发明的用于治疗疾病的方法中使用的缀合物、多核苷酸、载体或宿主细胞,其中所述疾病与HIV感染相关。
附图说明
图1.T22、vCCL2、V1和CXCL12-GFP-H6融合蛋白在HeLa细胞中的内化。由流式细胞术确定的、未处理HeLa细胞的、并且暴露于A)PBS+10%甘油缓冲液中或B)Tris 20mM+NaCl 500mM缓冲液中0.6μM CXCR4配体-GFP-H6融合蛋白T22-GFP-H6、V1-GFP-H6、vCCL2-GFP-H6和CXCL12-GFP-H620小时后的绿色荧光蛋白发射。HeLa细胞经历延长的胰蛋白酶处理(见实验部分)以消除由于最终细胞表面附接GFP融合蛋白所致的潜在残余荧光发射。
图2.在HeLa细胞中内化时,T22、vCCL2、V1和CXCL12-GFP-H6的共聚焦分析。细胞膜用CellMask标记并且细胞DNA用Hoechst 33342标记。CXCR4配体-GFP-H6融合蛋白产生可以在细胞内部作为致密点见到的绿色信号。培养的细胞持续20小时暴露于溶解于PBS+10%甘油缓冲液中的0.6μM的A)T22-GFP-H6、B)V1-GFP-H6、C)vCCL2-GFP-H6和D)CXCL12-GFP-H6蛋白。
图3.T22-GFP-H6进入HeLa细胞的表征。A)由流式细胞术确定的、未处理的HeLa细胞的、并且暴露于不同浓度的T22-GFP-H620小时后的绿色荧光蛋白发射。B)由流式细胞术确定的、暴露于2μM T22-GFP-H620小时后并且在流式细胞分析之前进行不同胰蛋白酶消化处理的HeLa细胞的绿色荧光蛋白发射。C)在蛋白添加20小时后,在完全培养基(右侧)或Optipro(左侧)存在下,由流式细胞术测量并且通过共聚焦显微术分析的血清对2μM T22-GFP-H6内化的影响。D)与2μM T22-GFP-H6孵育后,3D容积x-y-z数据段范围内的HeLa细胞的等值面表示。E)Tris 20mM+NaCl 500mM缓冲液中随机T22-GFP-H6粒子的TEM图像。F)在30min、1h、2h、3h、4h和24h时由共聚焦显微术显示的2μMT22-GFP-H6内化。
图4.评价T22-GFP-H6的DNA结合和基因转移特性。A)通过增加T22-GFP-H6的量所促进的琼脂糖凝胶电泳中质粒DNA迁移阻滞。B)、C)和D)暴露于T22-GFP-H6-td番茄基因复合物24小时后,内部具有T22-GFP-H6蛋白(强烈信号点)的HeLa细胞的共聚焦显微术,所述HeLa细胞表达td番茄基因(软信号)。
图5.T22-GFP-H6内化被CXCR4天然配体,蛋白SDFα以不同的T22-GFP-H6/SDFα比率(1∶0、1∶1、1∶10)抑制。以1∶10比率使用两个无关蛋白GFP-H6和GLA作为对照。
图6.T22-GFP相对于原发性肿瘤组织的选择性生物分布,所述T22-GFP是包括T22作为靶部分(其与CXCR4受体特异性结合)和绿色荧光蛋白的融合蛋白,所述原发性肿瘤组织源自异种移植于免疫抑制小鼠的盲肠中的CXCR4+SW1417人结直肠癌细胞。注意8-47倍T22-GFP积累,如静脉内单次剂量给予后,在若干时点(5、24或48h),使用IVIS200系统(Xenogen公司),以从20至500ug变化的剂量范围,通过荧光定量法所测量。没有在用载具处理的对照小鼠中的原发性肿瘤组织内检测到荧光。胃中荧光归因于摄入的食物,这在实验动物和对照动物之间并无不同。黑色星号:原发性肿瘤。
图7.T22-GFP相对于源自异种移植于免疫抑制小鼠的盲肠中CXCR4+SW1417人结直肠癌细胞中的腹膜转移和肠系膜的及膈膜的淋巴结的选择性生物分布。注意在腹膜转移灶中20-40倍T22-GFP积累,如静脉内单次剂量给予5h或24h后,使用IVIS200系统(Xenogen公司)以500ug剂量,通过荧光定量法所测量。在实验动物或对照(载具对照)动物的肝实质、胰实质、肾、心、无肿瘤肠、无肿瘤淋巴结、肺或脾中未检测到荧光。在肿瘤组织中观察到T22-GFP融合蛋白积累,而在正常组织中没有观察到T22-GFP的积累。在实验动物和对照动物中,胆囊(附接至肝脏)中或胰中均观察到荧光,这可以归因于由这些器官分泌的荧光蛋白。黑色星号:原发性肿瘤;黑色箭头:腹膜转移。
具体实施方式
本发明的作者已经观察到,源自鲎肽II([Tyr5,12,Lys7]鲎肽II,下文称作T22肽)序列的肽令人惊讶地能够促进功能性和可溶性融合化合物内化至靶CXCR4+细胞中。例如本发明的实例中示出,包括T22肽和标记蛋白的融合蛋白可以内化和释放于细胞质中。这个结果出人意料的,因为虽然在现有技术中报道这种肽为CXCR4配体(参见Murakami(村上)等人,J.Virol.(病毒学杂志),1999,73:7489-7496),但是没有报道受体内化速率因该肽与受体的结合而增加。这个结果也是令人惊讶的,因为与T22肽偶联时,可以内化的分子是一种26kDa多肽。这种类型的分子,归因于它们相对大的尺寸,以比小有机分子低得多的效率内化。此外,本发明中提供的实验说明,其他高亲和力CXCR4配体(与vCCL2 N-端区域、完整vCCL2或CXCL12/SDF-1对应的V1肽),在能够促进配体内吞的同时,不引起附接至所述肽的蛋白的内体逃逸。
本发明的治疗性缀合物
因此,在第一方面,本发明涉及一种缀合物,包括
(i)包括序列RRWCYRKCYKGYCYRKCR(SEQ ID NO:5)的靶向肽或其功能等同变体,以及
(ii)治疗剂
其中所述靶向肽能够特异性结合CXCR4并促进治疗剂在CXCR4表达细胞中的内化。
A.靶向肽
本发明的缀合物的第一组分是一种包括序列RRWCYRKCYKGYCYRKCR(SEQ IDNO:5)的靶向肽(下文称作T22肽)或其功能等同变体。
如在此使用,术语“肽”总体上指由肽键连接在一起的约2至40个氨基酸残基的线性链。
如在此使用,“氨基酸残基”指任何天然存在的氨基酸、本领域已知的任何氨基酸衍生物或任何氨基酸模拟物。在某些实施例中,蛋白或肽的残基是依序的,没有任何非氨基酸打断氨基酸残基的序列。在其他实施例中,该序列可以包括一个或多个非氨基酸部分。在具体的实施例中,蛋白或肽的残基序列可以被一个或多个非氨基酸部分打断。
如在此使用,术语“功能等同变体”指T22的任何变体,其含有一个或多个氨基酸的插入、缺失或置换并且基本上保留T22与CXCR4相互作用并且促进与之附接的治疗性分子的内化和/或内体逃逸的能力。用于确定是否可以将给定肽视为其功能等同变体的合适测定法例如是在本发明的实例1中描述的测定法。在这个测定法中,T22变体的推定性功能等同变体与标记多肽(例如荧光蛋白)符合可读框地融合并且与表达CXCR4的细胞(例如HeLa细胞)一起孵育。如果该肽是T22的功能等同变体,则标记蛋白将内化并且在细胞溶胶中表达。
在一个实施例中,靶向肽选自下组,该组由以下各项组成:
-具有序列RRX1CYRKX2PYRX3CR(SEQ ID NO:6)的T140肽,其中X1是L-3-(2-萘基)丙氨酸,X2是D-Lys并且X3是L-瓜氨酸。
-具有序列RRX1CYX2KX3PYRX4CR(SEQ ID NO:7)的TN14003肽,其中X1是L-3-(2-萘基)丙氨酸,X2是Cit,X3是dLys并且X4是L-瓜氨酸,
-具有序列RRX1CYEKX2PYRX3CR(SEQ ID NO:8)的TC14012肽,其中X1是L-3-(2-萘基)丙氨酸,X2是d-瓜氨酸并且X3是L-瓜氨酸,
-具有序列RRX1CYX2KX3PYRX4CR(SEQ ID NO:9)的TE14011肽,其中X1是L-3-(2-萘基)丙氨酸,X2是L-瓜氨酸,X3是dGlu并且X4是L-瓜氨酸并且
-具有序列RRX1CYX2KX3PYRX4CR(SEQ ID NO:9)的TZ14011肽,其中X1是L-3-(2-萘基)丙氨酸,X2是L-瓜氨酸,X3是D-Lys并且X4是L-瓜氨酸或其中N端精氨酸残基乙酰化的其变体(称作Ac-TZ14011)。
在另一个实施例中,靶向肽不是选自下组的肽,该组由以下各项组成:T140肽、TN14003肽、TC14012肽、TE14011、TZ14011或TZ14011的N端乙酰化变体,以及具有序列RRYCYRKX1PYRKCR的T131肽,其中X1为D-Lys(SEQ ID NO:38)。
技术人员将理解,靶向肽的三级结构可以取决于在一级结构中发现的半胱氨酸残基之间二硫键的存在。在一个优选实施例中,T22肽含有在位置4和17处的半胱氨酸之间的至少一个二硫键。在另一个优选实施例中,T22肽含有在位置8和13处的半胱氨酸之间的至少一个二硫键。在仍更优选的实施例中,T22肽含有在位置4和17处的半胱氨酸之间的第一二硫键和在位置8和13处的半胱氨酸之间的第二二硫键。
T22肽可以在N端位置处进一步包括甲硫氨酸残基。
靶向肽的合适功能性变体是相对于T22肽示出约大于25%氨基酸序列同一性,例如25%40%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性程度的那些。使用本领域普通技术人员广泛已知的计算机算法和方法,确定两种多肽之间的同一性程度。两个氨基酸序列之间的同一性程度优选地通过使用如先前所描述的BLASTp算法[BLAST Manual(BLAST手册),Altschul(阿尔丘尔),S.等人,NCBINLM NIH Bethesda(贝塞斯达),Md.20894,Altschul(阿尔丘尔),S.等人,J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)1990;215:403-410]确定。本发明的蛋白可以包括翻译后修饰,例如糖基化、乙酰化、异戊二烯化、肉豆蔻酰化、蛋白酶解加工等。
可替代地,靶向肽的合适功能性变体是其中一个或多个位置含有氨基酸的那些,所述氨基酸是上述T22蛋白中存在的氨基酸的保守性置换。“保守性氨基酸置换”因将一个氨基酸替换为具有相似结构性和/或化学特性的另一个氨基酸引起,例如,以下6各组各自含有彼此互为保守性置换的氨基酸:1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。这类保守性氨基酸置换的选择在本领域普通技术人员的技能范围内并且例如由Dordo(多尔多)等人(J.Mol.Biol(分子生物学杂志),1999,217;721-739)和Taylor(泰勒)等人(J.Theor.Biol.(理论生物学杂志),1986,119:205-218)描述。
第一组分能够特异性结合CXCR4并促进第二组分内化。
如在此使用,术语“CXCR4”指G蛋白偶联的7次跨膜的趋化因子受体。如同其他趋化因子受体,CXCR4通过介导定向移行和活化白细胞在免疫和炎症反应中发挥重要作用。CXCR4在多种癌细胞系和组织,包括乳腺、前列腺、肺、卵巢、结肠、胰腺、肾和脑、以及非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病中表达或过表达。CXCR4的唯一已知配体是间质细胞衍生因子-1(SDF-1,或CXCL12)CXCR4和SDF-1之间的相互作用在肿瘤形成的多个阶段中发挥重要作用,包括肿瘤生长、侵入、血管生成和转移。
如Tamamura(玉村)等人所述,结合亲和力例如通过油垫法(oil-cushion method)测量(参见Hesselgesset(海瑟尔格萨特)等人,1998,J.Immunol.(免疫学杂志),160:877-883),包括使肽与CXCR4-转染的细胞系(例如CHO细胞)和标记的CXCR4配体(例如125I-SDF-1α)接触,并且测量靶向肽针对标记CXCR4配体的结合的抑制百分比。
如在此使用,表述“特异性结合CXCR4”指与结合替代性受体或细胞相比,本发明的缀合物更频繁、更快速、以更长持续期和/或以更大亲和力与CXCR4或表达CXCR4的细胞结合,而基本上不与其他分子结合的能力。
如Tamamura(玉村)等人所述,结合亲和力例如通过油垫法(oil-cushion method)测量(见Hesselgesset(海瑟尔格萨特)等人,1998,J.Immunol.(免疫学杂志),160:877-883),包括使肽与CXCR4-转染的细胞系(例如CHO细胞)和标记的CXCR4配体(例如125I-SDF-1α)接触并且测量靶向肽针对标记CXCR4配体的结合的抑制百分比。
特异性结合可以例如由具有至少约10-4M的Kd的低亲和力靶向剂显示,例如,如果CXCR4具有多于一个配体结合位点,则具有低亲和力的配体对于靶向可以是有用的。特异性结合可以例如由高亲和力配体显示,例如具有至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10- 9M、至少约10-10M的Kd的配体,或可以具有至少约10-11M或10-12M或更大的Kd。低亲和力和高亲和力配体对于掺入本发明的缀合物中都是有用的。
如在此使用,“内化”指一个过程,借助所述过程,一种分子或包括分子的构建体与细胞膜外表面上的靶元件结合并且所得复合物由细胞内化。内化后可以接着是所得复合物在细胞质内解离。靶元件,连同这种分子或构建体一起,随后可以局限化至特定细胞区室。
在缀合物包括荧光蛋白(例如GFP)的情况下,可以通过荧光方法便利地确定本发明的缀合物由表达CXCR4的细胞内化的能力。这类融合蛋白可以通过制备重组核酸获得,其中编码T22肽和这种荧光蛋白的核酸符合可读框地融合的并且在足够的宿主细胞或有机体中表达。然后使这种融合蛋白与表达CXCR4的细胞的培养物或在体内与表达CXCR4的组织接触一段适当量的时间,此后,荧光显微术可以用来确定这种构建体是否渗透这种细胞。可以通过比较由这种荧光蛋白产生的荧光显微图像与用已知胞质染料所获得的荧光显微图像,进一步研究荧光在细胞质中的存在。
可替代地,也可能通过制备包括该缀合物的第一组分的融合蛋白和编码荧光蛋白的多核苷酸(例如Td番茄基因,编码一种红荧光蛋白)之间的非共价复合物,测试本发明的缀合物由表达CXCR4的细胞内化的能力。然后使这种复合物与表达CXCR4的细胞的培养物或在体内与表达CXCR4的组织接触一段适当量的时间,此后,荧光显微术可以用来确定这种构建体是否渗透这种细胞并且编码这种荧光蛋白的基因是否已经表达。可以通过比较由这种荧光蛋白产生的荧光显微图像与用已知核染染(例如DAPI)所得荧光显微图像,进一步研究荧光在细胞核中的存在。
在一个优选实施例中,第一组分能够特异性结合CXCR4并促进第二组分的内化和内体逃逸。
如在此使用,表述“促进内体逃逸”指在由受体介导的内吞作用内化后,靶向肽诱导缀合物从内体区室释放的能力。
B.治疗剂
治疗剂(在此也称作本发明的缀合物的第二组分)是治疗感兴趣的化合物。
术语“治疗性(治疗的)”以类属意义使用,并且包括治疗剂、预防剂和替代剂。
治疗剂的性质不具体限制,只要它可以与靶向肽缀合或提供为作为具有靶向肽的复合物。因此,治疗剂可以是多肽或核酸。因此,治疗剂的以下替代物是可能的:
-治疗剂是通过共价键与靶向肽结合的多肽。
-治疗剂是多肽并且与靶向肽形成融合蛋白。
-治疗剂是可以直接或通过额外的蛋白结构域、特别是通过静电相互作用与靶向肽附接的多核苷酸,其中所述额外的蛋白结构域示出针对DNA的亲和力。能够经由静电相互作用与DNA结合的合适蛋白结构域包括而不局限于聚赖氨酸、鱼精蛋白、白蛋白和阳离子化白蛋白。
-治疗剂是小有机分子。
-治疗剂是在与靶向肽偶联的纳米转运体内提供的上述(多肽、多核苷酸或小有机分子)中的任一种。
在一个优选实施例中,治疗剂是高分子量化合物。如在此使用,“高分子量化合物”指具有大于1kDa,优选地大于5kDa、更优选地大于10kDa和甚至更优选地大于100kDa的分子量的任何化学实体或分子,例如核酸,肽、蛋白、天然和合成聚合物、药物(例如抗生素)等。
B.1.作为治疗剂的多肽
在一个优选实施例中,治疗剂是多肽。
如在此使用,术语“多肽”指氨基酸残基的聚合物。该术语也适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物,连同天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
在治疗剂是多肽的情况下,缀合物可以是治疗剂和靶向肽的共价复合物。在另一个实施例中,治疗剂和靶向肽形成融合蛋白。优选地,其中治疗剂是多肽和来自融合并且低一和第二第一形成融合蛋白的情况下,则所述缀合物不是鲎肽-1或鲎肽-2。
在一个优选实施例中,充当活性剂的多肽或由所述多肽和靶向肽形成的融合蛋白进一步包括标签,其中使用对所述标签示出特异性亲和力的试剂,标签可以用于检测或纯化缀合物。胜任的检测标签包括六组氨酸(金属螯合物部分)、六-hatGST(谷胱甘肽S-转移酶)谷胱甘肽亲和力、钙调蛋白结合肽(CBP)、链霉亲和素-标签、纤维素结合结构域、麦芽糖结合蛋白、S-肽标签、壳多糖结合标签、免疫反应性表位、表位标签、E2标签、HA表位标签、Myc表位、FLAG表位、AU1和AU5表位、Glu-Glu表位、KT3表位、IRS表位、B标签表位、蛋白激酶-C表位、VSV表位或任何其他标签、只要这种标签不影响缀合物的稳定性或靶向能力。
可以用作治疗剂的合适多肽包括能够促进细胞增殖速率下降的任何多肽。
B.2.作为治疗剂的多核苷酸
在另一个实施例中,形成本发明的缀合物的一部分的治疗剂是核酸。在治疗剂是多核苷酸的情况下,这或者直接关联相靶向肽相互作用,在这些情况下,其中该肽具有允许与DNA形成静电相互作用的净正电荷。可替代地,靶向肽可以包括在所述靶向肽中存在的、具有净正电荷并且因此能够与DNA形成静电相互作用的额外蛋白结构域。能够经由静电相互作用与DNA结合的合适蛋白结构域包括而不局限于聚赖氨酸、鱼精蛋白、白蛋白和阳离子化白蛋白。
如本文可互换使用,术语“核酸”和“多核苷酸”指经由磷酸二酯键连接的核苷酸单元(核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸,相关的天然存在的结构性变体及其合成的非天然存在的类似物或其组合)组成的聚合物、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物。
核酸包括编码区,并且在其中缺陷型基因功能待于细胞中恢复的那些情况下,包括用于靶细胞中促进表达的足够调节信号,或者在其中靶基因表达待抑制的情况下,包括沉默核酸。
总体上,含有编码区的核酸将与适当的调节序列可操作地连接。这类调节序列将至少包括启动子序列。如在此使用,术语“启动子”指一种核酸片段,其起到控制一个或多个基因转录的作用,相对于基因的转录起始位点的转录方向位于上游,并且因存在DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列而被结构上鉴定,包括但不局限于转录因子结合位点、阻遏蛋白和激活物蛋白结合位点和本领域普通技术人员已知的直接或间接发挥作用以调节来自启动子的转录量的任何其他核苷酸序列。“组成型启动子”是在大多数生理条件和发育条件下有活性的启动子。“诱导型启动子”是取决于生理条件或发育条件而受到调节的启动子。“组织特异性”启动子仅在特定类型的分化细胞中有活性。用于从基因治疗载体中表达编码多肽的核苷酸序列的合适启动子包括例如细胞巨化病毒(CMV)中间体早期启动子、病毒长末端重复序列启动子(LTR)(如来自鼠莫洛尼白血病病毒(MMLV)、罗氏肉瘤病毒或HTLV-1的那些)、猴病毒40(SV 40)早期启动子和单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子。
在其中核酸包括编码区的那些情况下,所述编码区选自下组,该组由以下各项组成:肿瘤抑制基因、自杀基因或能够激活针对肿瘤的免疫反应的多核苷酸。合适的基因或cDNA是编码上文相对于活性剂为多肽时所提到的细胞毒多肽、促凋亡多肽或转移多肽的那些。
B.3.作为治疗剂的小有机分子
通常,“小分子”指一种在实验室中制备或自然界中发现的基本上非肽的、非低聚的有机化合物。如在此使用,小分子可以指呈“天然产物样”的化合物,然而,术语“小分子”不局限于“天然产物样”化合物。相反,小分子一般特征在于它含有若干种碳-碳键并且具有小于1500g/mol、小于1250g/mol、小于1000g/mol、小于750g/mol、小于500g/mol或小于250g/mol的分子量,虽然出于本发明目的,这种表征不旨在限制。在某些其他实施例中,利用天然产物样小分子。
可以掺入纳米转运体中的、形成根据本发明的缀合物的一部分的合适小分子包括而不局限于抗癌剂、抗血管生成剂、促凋亡剂和抗逆转录病毒剂。
B.4.作为治疗剂的纳米转运体
如在此使用,术语“纳米转运体”涉及一种含有感兴趣的化合物的具多组分复合物,具有受控的尺度,例如,约1至约1000纳米级别的直径或半径。
本发明的纳米转运体可以包括一种或多种上文提到的活性剂(多核苷酸或多肽)连同适于减少细胞增殖的任何其他细胞毒剂,包括小分子。
用于本发明中使用的优选纳米转运体包括纳米粒子、病毒、病毒样粒子(VLP)、纳米粒子、蛋白笼形物等。
B.4.i.基于纳米粒子的纳米转运体
在另一个实施例中,纳米转运体是纳米粒子。适用于本发明中使用的纳米粒子包括脂质纳米粒子连同聚合物纳米粒子。
聚合物纳米粒子由附接至T22肽靶向部分的聚合物基质形成。在根据本发明的聚合物纳米粒子中会是有用的生物相容性聚合物的非限制性实例包括聚乙烯、聚碳酸酯、聚酐、聚羟酸、聚富马酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、或多胺、聚谷氨酸、葡聚糖、聚酐、聚氨酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯或聚氰基丙烯酸酯、聚二噁烷酮(PDO)、聚羟基链烷酸酯、聚羟丁酸酯、聚(甘油癸二酸酯)、聚乙交酯、聚乳酸、PLGA、聚己内酯或其组合。
可替代地,本发明的纳米粒子可以是脂质纳米粒子,例如脂质体或胶束。
从例如囊泡形成脂类中形成胶束和脂质体是本领域已知的。囊泡形成脂类指在其凝至液晶相转变温度范围以上自发形成脂质双层的脂类。这类脂类典型地具有允许自发性双层形成的某些特征,例如允许堆叠成层状相的它们疏水部分和亲水部分的接近至相同的截面积。能够稳定掺入脂质双层中的脂类,例如胆固醇及其不同的类似物,可以在双层形成期间掺入脂质双层中。囊泡形成脂类优选地是具有两条烃链(典型地为酰基链)和极性亦或非极性的头部基团的脂类。存在多种合成的囊泡形成脂类和天然存在的囊泡形成脂类,包括磷脂,例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇和鞘磷脂,其中所述两条烃链典型地长约14-22个碳源子并且是饱和的亦或具有可变的不饱和度。其酰基链具有可变饱和度的上述脂质和磷脂可以商业地获得或根据公开发表的方法制备。其他合适的脂类包括磷脂、鞘脂、糖脂和固醇,例如胆固醇。
术语“脂质体”指由一个或多个同心有序的脂质双层组成的囊泡,其封装水相。水相典型地含有待递送至靶位点的化合物。抵达靶位点时,脂质体与局部肿瘤细胞或肿瘤血管细胞的质膜融合,由此释放化合物至细胞溶胶中。可替代地,脂质体作为转运囊泡(例如,内体或吞噬体)的内容物,由肿瘤细胞或肿瘤血管细胞内吞或否则摄入。一旦处转运囊泡中,则脂质体降解亦或与囊泡膜融合并且和释放其内容物。技术人员已知的多种方法可用于制备脂质体,例如合适的方法例如包括超声波处理、挤出、高压/均化、微流化、去垢剂透析、钙诱导的小脂质体载具融合和醚融合法,全部方法均是本领域熟知的。
聚合纳米转运体和脂质纳米转运体可以额外地包括围绕聚合材料,形成用于粒子的壳的两性化合物涂层或鞘材料,该鞘材料可以允许粒子避免被免疫系统组分识别并增加粒子循环半衰期。
B.4.ii.病毒纳米转运体
在一个实施例中,本发明的纳米转运体是病毒。技术人员将理解,可以使用本领域已知的任何病毒作为本发明中的纳米转运体,前提是可获得的足够信息,从而允许用T22肽或其功能等同变体修饰外部组分。因此,在无包膜病毒的情况下,通过以下方式获得本发明的纳米转运体:通过T22肽或其功能等同变体的化学偶联,亦或通过插入编码T22肽或其功能等同变体的序列至编码衣壳蛋白的病毒基因中,直接修饰至少一种衣壳蛋白,从而在合成和装配成衣壳时,T22肽或其功能等同变体暴露于衣壳的外表面。可以按以上方式修饰的合适病毒衣壳的实例包括但不局限于,来自以下病毒的衣壳:辛德毕斯病毒和其他甲病毒、弹状病毒(例如水泡性口炎病毒)、小RNA病毒(例如,人鼻病毒、Aichi病毒)、披膜病毒(例如,风疹病毒)、正粘病毒(例如,索戈托病毒、Batken病毒、鸡瘟病毒)、多瘤病毒(例如,多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、禽多瘤病毒BFDV)、细小病毒、轮状病毒、噬菌体Qβ、噬菌体P1、噬菌体M13、噬菌体MS2、噬菌体G4、噬菌体P2、噬菌体P4、噬菌体186、噬菌体Φ6、噬菌体Φ29、噬菌体MS2、噬菌体N4、噬菌体ΦX174、噬菌体AP205、诺瓦克病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒、烟草花叶病毒(TMV)、卫星稷子花叶病毒(SPMV)、羊舍病毒和人乳头瘤病毒。
可替代地,在纳米转运体是包膜病毒的情况下,靶向肽优选地附接至包膜糖蛋白的一部分或替代之。可以用于插入短纤维蛋白的表面糖蛋白的一些非限制性实例包括来自甲病毒,如Semliki森林病毒(SFV)、罗斯河病毒(RRV)和Aura病毒(AV)的糖蛋白,其包括表面糖蛋白,例如E1、E2和E3。使用源自辛德毕斯病毒(SIN)的E2糖蛋白和流感病毒血凝素(HA)是特异性结合细胞表面上具体分子(对于E2是硫酸肝素糖胺聚糖、对于HA是唾液酸)的非逆转录病毒糖蛋白,已知这些糖蛋白耐受某些基因修饰并且仍在逆转录病毒表面上保持高效装配(Morizono(森园)等人,J.Virol.(病毒学杂志)75,8016-8020);拉萨热病毒、乙型肝炎病毒、狂犬病病毒、博尔纳病毒、汉坦病毒或SARS-CoV的糖蛋白;基于黄病毒的表面糖蛋白,来自甲型流感/鸡瘟/Rostock/34病毒(FPV)的血凝素(HA),I类融合剂(T.Hatziioannou(海基阿诺),S.Valsesia(瓦尔塞西娅)-Wittmann(威特曼),S.J.Russell(拉塞尔),F.L.Cosset(柯赛特),J.Virol.(病毒学杂志)72,5313(1998))。用于本发明中使用的合适病毒包括甲病毒、副粘病毒、弹状病毒、冠状病毒、小RNA病毒、正粘病毒、呼肠孤病毒、布尼亚病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、丝状病毒、砂粒病毒、动脉炎病毒或杯状病毒。
B.4.iii.基于VLP的纳米转运体
在一个实施例中,本发明中使用的纳米转运体是VLP。如在此使用,术语“VLP或病毒样粒子”涉及由病毒核衣壳形成的自装配大分子结构,该结构获得与它们起源的病毒相似的四级结构,但是缺少病毒遗传物质。
用于根据本发明使用的VLP可以形成自:源自本领域已知的任何病毒的、具有有序的和重复性的结构的多肽。VLP可以从病毒感染的细胞培养物产生并纯化。所得用于疫苗目标的病毒或病毒样粒子需要无毒力。除了基因工程之外,可以采用物理方法或化学方法灭活病毒基因组功能,这些方法例如UV照射、甲醛治疗。可替代地,VLP是重组VLP。技术人员将理解,可以使用几乎全部公知的已知序列的病毒用于产生VLP,前提是编码一种或多种外壳蛋白的基因可以由技术人员容易地鉴定。通过在宿主中重组表达这一种或多种外壳蛋白制备VLP在技术人员的公知常识范围内。合适的VLP可以从选自下组的病毒的核衣壳蛋白获得,该组由以下各项组成:RNA-噬菌体、腺病毒、番木瓜花叶病毒、流感病毒、诺如病毒、乳头瘤病毒、嗜肝DNA病毒科、呼吸道合胞体病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、麻疹病毒;辛德毕斯病毒;轮状病毒、口蹄疫病毒、新城疫病毒、诺瓦克病毒、甲病毒;SARS、副粘病毒、传染性胃肠炎病毒逆转录病毒、逆转座子Ty、多瘤病毒;烟草花叶病毒;羊舍病毒、豇豆褪绿斑驳病毒;豇豆花叶病毒;和苜蓿花叶病毒。
B.4.iv.基于蛋白笼形物的纳米转运体
在另一个实施例中,本发明中使用的纳米转运体是蛋白笼形物。如在此使用,术语“蛋白笼形物”涉及由能够形成受约束内环境的一种或多种不同蛋白形成的自装配性大分子结构。蛋白笼形物可以具有不同芯尺寸,范围从1至30nm(例如,壳的内径)。适合在本发明中使用的优选蛋白笼形物包括如WO 08124483等中所述的铁蛋白笼形物、热休克蛋白笼形物。
C.接头区域
作为本发明目标的、包括靶向肽和治疗剂的缀合物(其中所述治疗剂具有肽性质)可以含有直接连接靶向肽和治疗剂的键,或可替代地,可以含有作为靶向肽和治疗剂之间接头发挥作用的额外氨基酸序列。接头肽优选地包括至少2个氨基酸、至少2个氨基酸、至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30个氨基酸、至少40个氨基酸、至少50个氨基酸、至少60个氨基酸、至少70个氨基酸、至少80个氨基酸、至少90个氨基酸或约100个氨基酸。
根据本发明,所述非天然中间体氨基酸序列充当结构域之间的铰链区,允许它们彼此相互独立地运动,同时它们维持单个结构域的立体形状。在这个意义下,根据本发明的优选的非天然中间体氨基酸序列将是特征在于允许这种运动的结构延性的铰链区。在一个具体实施例中,所述非天然中间体氨基酸序列是非天然柔性接头。在一个优选实施例中,所述柔性接头是具有20个或更少氨基酸长度的柔性接头肽。在一个更优选的实施例中,接头肽包括2个或更多个选自下组的氨基酸,该组由以下各项组成:甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。在本发明的一个优选实施例中,所述柔性接头是聚甘氨酸接头。
间隔肽或接头肽的优选实例包括那些肽,它们已经用于结合蛋白,而不实质上劣化所结合的蛋白的功能或至少不实质上劣化所结合的蛋白之一的功能。更优选地,间隔序列或接头已经用于结合蛋白,所述蛋白包括具有如下卷曲螺旋的结构,例如:
-由四连接素的残基53-56和残基57-59形成的肽GTKVHMK(SEQ ID NO:19)(Nielsen(尼耳森),B.B.等人,FEBS Lett.(欧洲生物学化学会联盟通讯)412:388-396,1997);
-来自人纤连蛋白的连接链3,对应于氨基酸1992-2102(SWISSPROT编号,条目P02751)。
-子序列的序列PGTSGQQPSVGQQ(SEQ ID NO:20),与纤连蛋白的氨基酸编号2037-2049对应并且在对应于氨基酸2038-2042的子序列片段GTSGQ(SEQ ID NO:21)内。
-鼠IgG3的上铰链区的10氨基酸残基序列(PKPSTPPGSS,SEQ ID NO:22)在一个优选实施例中,接头肽选自下组,该组由以下各项组成:具有序列APAETKAEPMT(SEQ ID NO:23)的肽和具有序列GAP的肽。
-八氨基酸序列GGSSRSSS(SEQ ID NO:33)。
可替代地,本发明的缀合物的两个组分可以由肽连接,所述肽的序列含有用于蛋白酶的切割靶,因此允许靶向肽从治疗剂分离。适合于它们掺入本发明多肽中的蛋白酶切割位点包括肠激酶(切割位点DDDDK,SEQ ID NO:24)、因子Xa(切割位点IEDGR,SEQID NO:25)、凝血酶(切割位点LVPRGS,SEQ ID NO:26)、TEV蛋白酶(切割位点ENLYFQG,SEQ ID NO:27)、PreScission蛋白酶(切割位点LEVLFQGP,SEQ ID NO:28)、蛋白内含子等。
D.多核苷酸、载体和宿主细胞
在其中缀合物是靶向肽和活性(治疗或诊断)剂的融合蛋白的那些情况下,则使用编码这种融合蛋白的多核苷酸时,可以在体内由接受被试者产生这种融合蛋白。因此,在另一个方面,本发明涉及编码根据本发明的缀合物的多核苷酸。
表述“核苷酸序列”、“核酸”和“多核苷酸”在本发明中互换地用来指处于单链或双链形式的核糖核苷(腺苷,鸟苷、尿苷或胞苷;“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷;“DNA分子”)的二磷酸酯或其任何类似磷酸酯(例如硫代磷酸酯和硫酯)的聚合物形式。因此,由DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA形成的螺旋是可能的。术语“核酸序列”并且具体是DNA或RNA分子,仅指该分子的一级结构或二级结构并且不限制任何具体类型的三级结构的。因此,该术语包括双链DNA,因为它以线性或环状DNA分子、超螺旋DNA质粒和染色体出现。
在另一个方面,本发明涉及一种包括根据本发明的多核苷酸的载体。
如本发明中所用,术语“载体”指借此可以操作多核苷酸或DNA分子或将其导入细胞的载具。载体可以是线性或环状多核苷酸,或它可以是更大尺寸的多核苷酸或任何其他类型的构建体,例如来自病毒基因组的DNA或RNA、病毒粒或允许操作DNA或将其导入细胞的任何其他生物构建体。应理解,表述“重组载体”和“重组系统”可以与术语“载体”互换使用。本领域普通技术人员将注意到,就可以使用的载体类型而言,不存在限制,因为所述载体可以是在适于纯化缀合物的不同异源有机体中,适合增殖并且用来获得充足多核苷酸的克隆载体或基因构建体或表达载体。因此,本发明的合适载体包括在原核生物中的表达载体,例如pUC18、pUC19、Bluescript及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、CoIEl、pCR1、RP4、噬菌体和“穿梭”载体,例如pSA3和pAT28;酵母中的表达载体,例如载体2-micron质粒类型、整合质粒、YEP载体、着丝粒质粒和相似质粒;昆虫细胞中的表达载体,例如pAC系列和pVL系列中的载体;植物中的表达载体,例如来自pIBI、pEarleyGate、pAVA、pCAMBIA、pGSA、pGWB、pMDC、pMY、pORE系列和相似载体的载体、和基于病毒载体(腺病毒、腺病毒相关的病毒连同逆转录病毒和慢病毒)和非病毒载体的高等真核细胞中的表达载体,例如pSilencer4.1-CMV(Ambion)、pcDNA3、pcDNA3.1/hyg、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、pZeoSV2、pCI、pSVL和pKSV-10、pBPV-1、pML2d和pTDT1。
本发明的载体可以用来转化、转染或感染易于受所述载体转化、转染或感染的细胞。
因此,本发明的另一个方面涉及包含本发明的多核苷酸、基因构建体或载体的细胞;为此目的,所述细胞已经用本发明所提供的构建体或载体转化、转染或感染。可以通过本领域普通技术人员已知的常规方法获得转化、转染或感染的细胞(Sambrook(萨姆布鲁克)等人,2001,引自上文)。在一个具体实施例中,所述宿主细胞是用适当载体转染或感染的动物细胞。
适于表达本发明的缀合物的宿主细胞包括而不局限于来自哺乳动物、植物、昆虫、真菌和细菌的细胞。细菌细胞包括,而不局限于来自革兰氏阳性细菌的细胞,如来自芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)的物种,以及来自革兰氏阴性细菌的细胞,如来自埃希氏菌属(Escherichia)和假单胞菌(Pseudomonas)的细胞。真菌细胞优选地包括来自酵母的细胞,如酵母(Saccharomyces)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)。昆虫细胞包括而不局限于果蝇细胞和Sf9细胞。连同其它,植物细胞包括来自栽培植物,例如谷物、药用植物、观赏植物或鳞茎类的细胞。适于本发明的哺乳动物细胞包括上皮细胞系(猪等)、骨肉瘤细胞系(人等)、神经母细胞瘤细胞系(人等)、上皮癌(人等)、神经胶质细胞(鼠等)、肝细胞系(来自猴等)、CHO(中国仓鼠卵巢)细胞、COS细胞、BHK细胞、HeLa、911、AT1080、A549、293或PER.C6细胞、人NTERA-2ECC细胞、mESC系的D3细胞、人胚干细胞如HS293和BGV01、SHEF1、SHEF2和HS181、NIH3T3、293T、REH和MCF-7细胞和hMSC细胞。
E.包括抗肿瘤剂的本发明的缀合物及其用于治疗癌症的用途
本发明的缀合物与CXCR4+细胞的高效和特异性相互作用允许所述缀合物用于治疗其中想要递送感兴趣的化合物至表达CXCR4的细胞的任何疾病。因此,在另一个方面,本发明涉及根据本发明的缀合物、多核苷酸或载体,其中治疗剂是抗肿瘤剂。
如在此使用,术语“抗肿瘤剂”指具有抗增殖、抗肿瘤发生和/或抑癌特性的任何化学剂或生物剂或化合物,它们可以用来抑制肿瘤生长、增殖和/或发展
用于本发明中使用的合适抗肿瘤剂包括而不局限于:
(i)细胞毒多肽,
(ii)抗血管生成多肽,
(iii)由肿瘤抑制基因编码的多肽,
(iv)由能够激活针对肿瘤的免疫反应的多核苷酸编码的多肽,
(v)肿瘤抑制基因,
(vi)沉默剂,
(vii)自杀基因,
(viii)能够激活针对肿瘤的免疫反应的多核苷酸,
(ix)化疗剂,以及
(x)抗血管生成分子。
E.1.细胞毒多肽
如在此使用,术语“细胞毒多肽”指能够抑制细胞功能的药剂。这种药剂可以抑制增殖或可以毒害细胞。本术语范围内包括由细胞内化时干扰或有害地改变细胞代谢或以任何方式抑制细胞生长或增殖的任何多肽,包括,但不局限于,向细胞转运时介导其毒性效应的药剂并且也是在细胞表面介导其毒性效应的那些。有用的细胞毒多肽包括蛋白毒素和细菌毒素。
对于掺入根据本发明的缀合物中有用的蛋白性质的细胞毒素的实例包括但不局限于I型和II型核糖体灭活蛋白(RIP)。有用的I型植物RIP包括但不局限于、香石竹毒蛋白30、香石竹毒蛋白32、剪秋罗苷、皂草毒素蛋白1-9、美洲商陸激活蛋白(PAP)、PAPII、PAP-R、PAP-S、PAP-C、mapalmin、dodecandrin、异株泻根毒蛋白-L、异株泻根毒蛋白、大肠菌素1和2、丝瓜籽蛋白-A、丝瓜籽蛋白-B、丝瓜籽蛋白-S、19K蛋白合成抑制蛋白(PSI)、15K-PSI、9K-PSI、α-瓜蒌蛋白、β-瓜蒌蛋白、多花白树毒蛋白、苦瓜蛋白、苦瓜蛋白-II、苦瓜蛋白-Ic、MAP-30、α-苦瓜毒蛋白、β-苦瓜毒蛋白、天花粉蛋白、TAP-29、瓜蒌籽蛋白;大麦RIP;亚麻RIP、tritin、玉米RIP、Asparin1和2(Stirpe(斯特普)等人,Bio/Technology(生物/技术)10:405-12,1992)。有用的II型RIP包括但不局限于蒴莲根毒蛋白(volkensin)、蓖麻毒蛋白、接骨木毒蛋白-b、CIP-29、相思豆毒蛋白、蒴莲素(modeccin)、ebulitin-[α]、ebulitin-[β]、ebultin-[γ]、vircumin、黄樟毒蛋白、以及其生物活性酶亚基(Stirpe(斯特普)等人,Bio/Technology(生物/技术)10:405-12,1992;Pastan(帕斯坦)等人,Annu.Rev.Biochem.61:331-54;Brinkmann和Pastan,Biochim等人,Biophys.Acta(生物物理学报)1198:27-45,1994;和Sandvig(桑维格)和VanDeurs(范德斯),Physiol.Rev.(生理学评论)76:949-66,1996)。
作为细胞毒素有用的细菌毒素的实例包括但不局限于志贺毒素和志贺样毒素(即,具有相同活性或结构的毒素),连同其催化性亚基和生物学功能片段。这些细菌毒素也是II型RIP(Sandvig(桑维格)和VanDeurs(范德斯),Physiol.Rev.(生理学评论)76:949-66,1996;Armstrong(阿姆斯特朗),J.Infect.Dis.(传染病杂志),171:1042-5,1995;Kim(金姆)等人,Microbiol.Immunol.(微生物学与免疫学)41:805-8,1997,和Skinner(斯金纳)等人,Microb.Pathog.(微生物发病机理)24:117-22,1998)。有用的细菌毒素的额外实例包括但不局限于假单胞菌外毒素和白喉毒素(Pastan(帕斯坦)等人,Annu.Rev.Biochem.(生物化学年评)61:331-54;和Brinkmann(布林克曼)和Pastan(帕斯坦),Biochim.et Biophys.Acta(生物化学与生物物理学报)1198:27-45,1994)。毒素酶促亚基的截短形式和突变体也可以用作细胞毒素部分(Pastan(帕斯坦)等人,Annu.Rev.Biochem.(生物化学年评)61:331-54;Brinkmann(布林克曼)和Pastan(帕斯坦),Biochim.et Biophys.Acta(生物化学与生物物理学报)1198:27-45,1994;Mesri(迈斯里)等人,J.Biol.Chem.(生物化学杂志)268:4852-62,1993;Skinner(斯金纳)等人,Microb.Pathog.(微生物发病机理)24:117-22,1998;和美国专利号5,082,927)。其他靶向的药剂包括但不局限于多于34种所述的大肠菌素家族的RNA酶毒素,其包括大肠菌素A、B、D、E1-9、阴沟肠杆菌素DF13和真菌RNA酶[α]-sarcin(Ogawa(小川)等人,Science(科学)283:2097-100,1999;Smarda(斯马达)等人,Folia Microbiol(Praha)43:563-82,1998;Wool(乌尔)等人,Trends Biochem.Sci.(生物化学趋势),17:266-69,1992)。
E.2.抗血管生成的肽和多肽
肿瘤细胞增殖严重依赖于伴随癌症进展的广泛的肿瘤血管化。因此,已经引入用抗血管生成剂抑制新血管形成和靶向破坏现有血管作为有效和相对无毒的肿瘤治疗方法。
如在此使用,术语“抗生血管多肽”指能够抑制血管生成的多肽。合适的抗血管生成多肽包括而不局限于血管抑制素、内皮抑素,抗生血管抗凝血酶III、如WO 2007115376中所述的sFRP-4、抗VEGF抗体如来尼珠单抗、贝伐珠单抗(阿瓦斯汀)、FabIMC1121和F200Fab。
E.3.由肿瘤抑制基因编码的多肽,
如在此使用,“肿瘤抑制物基因”是一种基因或基因产物,其具有阻止细胞失控生长的正常生物学作用。肿瘤抑制基因的功能对应物是癌基因。促进正常细胞生长的基因可以称作“原癌基因”。激活这种基因或基因产物的突变进一步使其转化成“癌基因”,这延续细胞生长活性,但是以失控方式进行。肿瘤抑制基因和基因产物的实例是文献中熟知的并且可以包括PTC、BRCA1、BRCA2、p16、APC、RB、WT1、EXT1、p53、NF1、TSC2、NF2、VHL、ST7、ST14、PTEN、APC、CD95或SPARC。
E.4.促凋亡多肽
如在此使用,术语“促凋亡多肽”,指能够在细胞或细胞群中诱导细胞死亡的蛋白。合适的促凋亡多肽包括而不局限于BCL-2蛋白家族的促凋亡成员,例如BAX、BAK、BOK/MTD、BID、BAD、BIK/NBK、BLK、HRK、BIM/BOD、BNIP3、NIX、NOXA、PUMA、BMF、EGL-I和病毒同源物,胱天蛋白酶类,例如胱天蛋白酶-8、腺病毒E4 orf4基因、p53途径基因,促凋亡配体,例如TNF、FasL、TRAIL和/或它们的受体,例如TNFR、Fas、TRAIL和TRAIL。
E.5.具有抗转移性活性的多肽
如在此使用,术语“转移抑制蛋白”指发挥作用以延缓或防止转移(继发性肿瘤)在患有癌症的有机体身体内扩散的蛋白。合适的转移抑制蛋白包括而不局限于,蛋白,例如BRMS 1、CRSP3、DRG1、KAI1、KISS-1、NM23、TIMP-家族蛋白和子宫球蛋白。
E.6.免疫刺激性多肽
如在此使用,免疫刺激性多肽剂是一种多肽,在给予该多肽的受试者中刺激免疫反应(包括增强已有免疫反应),无论单独或与以下项组合给予:另一药剂,鞭毛,胞壁酰二肽,细胞因子(包括白介素(例如IL-2、IL-7、L-15(或这些细胞因子的超激动剂/突变体形式)、IL-12、IFN-γ、IFN-α、GM-CSF、FLT3-配体、等)),免疫刺激性抗体(例如,抗CTLA-4、抗CD28、抗CD3或这些分子的单链片段),等。
E.7.肿瘤抑制基因
合适的肿瘤抑制基因包括编码上文所限定的任何多肽的基因或基因产物。肿瘤抑制基因和基因产物的实例是文献中熟知的并且可以包括PTC、BRCA1、BRCA2、p16、APC、RB、WT1、EXT1、p53、NF1、TSC2、NF2、VHL、ST7、ST14、PTEN、APC、CD95或SPARC。
E.8.沉默剂
在核酸是沉默剂的情况下,所述沉默剂旨在阻断其过表达导致细胞增殖和肿瘤生长的基因表达。可以被携带沉默剂的根据本发明的缀合物抑制的基因包括而不局限于HRAS(v-Ha-ras Harvey大鼠肉瘤病毒癌基因同源物)、NRAS(神经母细胞瘤RAS病毒(v-ras)癌基因同源物)、KRAS(v-Ki-ras2,Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物)、MYC(v-myc,禽髓细胞增多症病毒癌基因同源物)、MYCN(v-my源自神经母细胞瘤的禽髓细胞增多症毒相关癌基因)、MYB(v-myb,禽成髓细胞过多症病毒癌基因同源物)、Jun-癌基因、FOS(v-fos,FBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物)、致癌性ABL1(v-ab1,Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(这种基因是如果SH3结构域截短时唯一的癌基因,作为某些白血病中的规律性出现)、SRC(v-src,肉瘤(Schmidt-Ruppin A-2)禽病毒癌基因同源物)、FES(猫肉瘤癌基因)、RAF1(v-raf-1,鼠白血病病毒癌基因同源物1)、REL(v-rel,网状内皮组织增殖症病毒癌基因同源物,禽)、RELA(v-rel,禽网状内皮组织增殖症病毒癌基因同源物A,B细胞中κ轻链多肽基因增强子的核因子3,p65)、RELB(v-rel禽网状内皮组织增殖症病毒癌基因同源物B,B细胞中κ轻链多肽基因增强子的核因子3)、FGR(Gardner-Rasheed猫肉瘤病毒(v-fgr)癌基因同源物)、和KIT(v-kit Hardy-Zuckerman4,猫肉瘤病毒癌基因同源物)。
适合在本发明中使用的其他沉默剂包括那些针对以下项的那些:细胞周期蛋白G1、细胞周期蛋白D1、Bcl-2(B细胞慢性淋巴性白血病相关蛋白2)、Bcl-XL(Bcl-2相关基因xl)、HLA-G(人白细胞抗原G类)、IGF-1(胰岛素样生长因子-1)、EGF(表皮生长因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)、VEGFR(血管内皮生长因子受体)、IGFR(胰岛素样生长因子受体)、EGFR(表皮生长因子受体)、FGFR(成纤维细胞生长因子受体)、TGF-β(转化生长因子β)、胱天蛋白酶3、CEACAM6(癌胚抗原相关的细胞黏附分子6)、HPV-E6(人乳头瘤病毒蛋白E6)、HPV-E7(人乳头瘤病毒蛋白E7)、H-Ras基因、P100a基因、CREB(cAMP反应元件结合)、BRAF基因、ATF2(激活转录因子2)、HER2(人EGF样受体第2号)、和N-myc。
治疗性分子的实例包括但不局限于细胞周期控制剂;抑制细胞周期蛋白的药剂,例如针对细胞周期蛋白G1基因和细胞周期蛋白D1基因的反义多核苷酸。
在另一个实施例中,可以将沉默剂靶向针对CXCR4。合适的CXCR4-沉默剂包括而不局限于:
-针对CXCR4的反义寡核苷酸,其具有序列5′-CTGATCCCCTCCATGGTAACCGCT-3′(SEQ ID NO:10),5′-TATATACTGATCCCCTCCATGGTA-3′(SEQ ID NO:11)和5-CCTCCATGGTAACCGCTGGTTCT-3′(SEQ ID NO:12)并且在US 6429308中描述;
-如WO2008008852中所述的CXCR4特异性siRNA,其包括了具有序列5′-UAAAAUCUUCCUGCCCACCdTdT-3′(SEQ ID NO:13)和5′-GGAAGCUGUUGGCUGAAAAdTdT-3′(SEQ ID NO:14)的有义链。
-WO 2007143584中描述的靶向CXCR4 mRNA内序列的CXCR4特异性干扰RNA。
-US 20050124569中描述的靶向CXCR4 mRNA内序列的CXCR4特异性干扰RNA。
-CXCR4特异性核酶,其具有序列3′-UGUUGCA-X-Y-X-UCACUC-5′(SEQ IDNO:15),其中X是催化性序列并且Y是茎-环区的序列。这种核酶和编码所述序列的DNA盒的详细结构在US 6916653中描述;
-如US2009210952中所述的CXCR4特异性shRNA,其具有序列5′-GATCCAGGATGGTGGTGTTTCAATTCCTTCAAGAGAGGAATTGAAACACCACCATCCTTTTTGG-3′(SEQ ID NO:16)。
-如WO 2004087068中所述的、靶向CXCR4 mRNA内序列的CXCR4特异性siRNA,AATAAAATCTTCCTGCCCACC(SEQ ID NO:17)和AAGGAAGCTGTTGGCTGAAAA(SEQ ID NO:18)。
-US 2009235772和US 2005124569中描述的、靶向CXCR4 mRNA内序列的CXCR4特异性干扰RNA。
基于包括靶可及性和二级结构预测的合理设计原理,鉴定mRNA中用于设计RNA干扰剂的潜在靶位点。这些原理中的每一个可以影响敲低(knockdown)mRNA靶表达的重现性和程度以及治疗作用所需要的siRNA浓度。此外,siRNA双链体的热动力稳定性(例如,反义siRNA结合能、内部稳定性谱和siRNA双链体末端的差异稳定性)可能与其产生RNA干扰的能力相关。(Schwarz(施瓦茨)等人,Cell(细胞)115:199-208,2003;Khvorova(克沃洛娃)等人,Cell(细胞)115:209-216,2003)。也使用经验法则,如Tuschl(图许尔)实验室提供的那些(Elbashir(巴希尔)等人,Nature(自然)411:494-498,2001;Elbashir(巴希尔)等人,Genes Dev.(基因与发育)15:188-200,2001)。用于siRNA设计的软件和互联网交互服务可在Ambion和Invitrogen网站获得。Levenkova(列万科娃)等人描述一种用于设计和优选化siRNA寡聚物的软件系统(Levenkova(列万科娃)等人,Bioinformatics(生物信息学)20:430-432,2004)。Levenkova(列万科娃)系统在互联网可获得并且免费下载用于学术目的和商业目的。在此披露的siRNA分子基于Ambion、Invitrogen和Levenkova(列万科娃)推荐。
典型地,对给定靶特异的siRNA寡聚物主要基于相对人类序列的独特性(即,相对于人类通用基因的单一良好命中,并且杂交温度Tm相对于第二最佳命中存在巨大差异)并基于GC含量(即,具有40%-60%范围内GC%的序列)来实施。任选地,为了更详细地描述寡聚物的潜在杂交,可以使用例如Sfold软件实施RNA靶可及性和二级结构预测(Ding(丁)Y和Lawrence(劳伦斯),C.E.(2004)Rational design of siRNAs with Sfold software(用Sfold软件的siRNA合理设计).引自:RNA Interference:from Basic Science to DrugDevelopment(RNA干扰:从基础科学到药物开发).K.Appasani(阿帕萨尼)(编辑),Cambridge University Press(剑桥大学出版社);Ding(丁)和Lawrence(劳伦斯),Nucleic Acids Res.(核酸研究)29:1034-1046,2001;Nucleic Acids Res.(核酸研究31:7280-7301,2003)。Sfold在互联网上可获得。也在Beaucage(贝卡格)等人2000年编辑的CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry(核酸化学实验指南)中在11.2.1-11.2.10中描述了RNA二级结构确定。
在本发明的情景下,不具体地限制沉默剂的类型和作用模式。合适的沉默剂包括而不局限于反义RNA或DNA、核酶和旨在用作反义剂的其他寡核苷酸。可以使用用来检测基因表达水平的标准技术,例如RT-PCR、RNA印迹等鉴定针对感兴趣的基因的合适沉默剂。
反义寡核苷酸,包括反义寡核苷酸;三重体分子;哑铃寡核苷酸;胞外蛋白结合寡核苷酸;和小核苷酸分子,是与具有互补序列的mRNA特异性结合,由此防止mRNA翻译的寡核苷酸(参见,例如,Altman(阿特曼)等人的美国专利号5,168,053、Inouye(井上)的美国专利号5,190,931、Burch(伯奇)的美国专利号5,135,917;授予Smith(史密斯)的美国专利号5,087,617以及Clusel(克吕塞尔)等人(1993)Nucl.Acids Res.(核酸研究)21:3405-3411,其描述哑铃状反义寡核苷酸)。三重体分子指靶向双链体DNA并由此防止转录的单DNA链(参见,例如,授予Hogan(霍根)等人的美国专利号5,176,996,它描述了用于制造与双链体DNA上靶位点结合的合成性寡核苷酸的方法)。
E.9.自杀基因
在另一个实施例中,用作活性剂的多核苷酸包括自杀基因的编码区。术语“自杀基因”指编码一种产物的核酸,其中所述产物借助自身或在其他化合物存在下造成细胞死亡。自杀基因的代表性实例是编码单纯疱疹病毒胸苷激酶的自杀基因。额外实例是水痘带状疱疹病毒胸苷激酶和细菌基因胞嘧啶脱氨酶,它可以将5-氟胞嘧啶转化成高度细胞毒性化合物5-氟尿嘧啶。
自杀基因可以通过将前药转化具有细胞毒性的产物而产生细胞毒性。在一个实施例中,术语“前药”是指可以被转化成对细胞有毒的产物的任何化合物。这种前药的代表性实例是在体内由HSV-胸苷激酶转化成有毒化合物的更昔洛韦。更昔洛韦衍生物随后毒害细胞。前药的其他代表性实例包括针对VZV-TK的阿昔洛韦、FIAU[1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶],6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖苷和针对胞嘧啶脱氨酶的5-氟胞嘧啶。
E.10.能够激活针对肿瘤的免疫反应的多核苷酸
能够激活针对肿瘤的免疫反应的合适多核苷酸包括编码如上文定义的任何免疫刺激性多肽药物的基因。
E.11.化疗剂
如在此使用,抗癌剂是一种药剂,其至少部分地抑制癌症的发展或进展,包括抑制与癌症相关的整体或部分症状症,即便仅短期抑制。若干抗癌剂可以划归为DNA损伤剂并且这些药剂包括拓扑异构酶抑制剂(例如,依托泊苷、喜树碱(Camptothecin)、拓扑替康、替尼泊苷、米托蒽醌)、DNA烷基化剂(例如、顺铂、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仓、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安、塞替派、卡莫司汀、罗莫司汀、卡铂、达卡巴嗪、丙卡巴肼)、DNA链断口诱导剂(例如、博来霉素、多柔比星、佐柔比星、伊达比星、丝裂霉素C)、抗微管剂(例如、长春新碱、长春碱)、抗代谢剂(例如、阿糖胞苷、甲氨蝶呤、羟基、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、氟达拉滨、喷司他丁、氯脱氧腺苷)、蒽环类、长春碱类生物碱或表鬼臼毒素。
抗癌剂的实例包括而不局限于阿西维辛;阿柔比星;盐酸阿考达唑;阿克罗宁;阿多来新;阿地白介素;六甲蜜胺;安波霉素;醋酸阿美蒽醌;氨鲁米特;安吖啶;阿那曲唑;安曲霉素;天冬酰胺酶;曲林菌素;阿扎胞苷;阿扎替派;阿佐霉素;巴马司他;苯佐替派;比卡鲁胺;盐酸比生群;双甲磺酸双奈法德;比折来新;硫酸博来霉素;硼替佐米(VELCADE);布喹那钠;溴匹立明;白消安;放线菌素;卡芦睾酮;卡醋胺;卡贝替姆;卡铂(含铂方案);卡莫司汀;盐酸卡柔比星;卡泽来新;西地芬戈;苯丁酸氮芥;西罗霉素;顺铂(含铂方案);克拉立滨;甲磺酸克立那托;环磷酰胺;阿糖胞苷;达卡巴嗪;更生霉素;佐柔比星;地西他滨;右奥马铂;地扎胍宁;地吖醌;多西紫杉醇(TAXOTERE);多柔比星;屈洛昔芬;屈他雄酮;达佐霉素;依达曲沙;依氟鸟氨酸;依沙芦星;恩洛铂;恩普氨酯;依匹哌啶;表柔比星;厄布洛唑;厄洛替尼(特罗凯(Tarceva)),依索比星;雌氮芥;依他硝唑;依托泊苷;氯苯乙嘧胺;法倔唑;法扎拉滨;芬维A胺;氟尿苷;氟达拉滨;5-氟尿嘧啶;氟西他滨;磷喹酮;福司曲星;吉非替尼(易瑞沙(Iressa)),吉西他滨;羟基;伊达比星;异环磷酰胺;伊莫福新;甲磺酸伊马替尼(GLEEVAC);干扰素α-2a;干扰素α-2b;干扰素α-n1;干扰素α-n3;干扰素β-Ia;干扰素γ-Ib;异丙铂;依立替康;兰瑞肽;来那度胺(REVLLMlD,REVIMID);来曲唑;亮丙瑞林;利罗唑;洛美曲索;罗莫司汀;洛索蒽醌;马索罗酚;美坦辛;氮芥;甲地孕酮;美仑孕酮;美法仓;美诺立尔;巯基嘌呤;甲氨蝶呤;氯苯氨啶;美妥替哌;米丁度胺;米托克星;丝裂红素;米托洁林;米托马星;丝裂霉素;米托司培;米托坦;米托蒽醌;霉酚酸;诺考达唑;诺拉霉素;奥马铂;奥封溴铵;紫杉醇;培美曲塞(ALIMTA),培门冬酶;培利霉素;溴新斯的明;喷托孟;培洛霉素;培磷酰胺;哌泊溴烷;哌泊舒凡;羟乙基磺酸吡曲克辛;吡罗蒽醌;普利霉素;普洛美坦;卟菲尔钠;泊非霉素;泼尼莫司汀;丙卡巴肼;嘌呤霉素;吡唑霉素;利波腺苷;罗谷亚胺;沙芬戈;司莫司汀;辛曲秦;西托糖苷;磷乙酰天冬氨酸;司帕霉素;锗螺胺;螺莫司汀;螺铂;链黑菌素;链佐星;磺氯苯脲;他利霉素;坦索罗辛;紫杉酚;泰索帝;替可加兰;替加氟;替洛蒽醌;替莫泊芬;替莫唑胺(TEMODAR);替尼泊苷;替罗昔隆;睾内酯;沙立度胺(THALOMID)及其衍生物;硫咪嘌呤;硫鸟嘌呤;塞替派;噻唑羧胺核苷;替拉扎明;拓扑替康;托瑞米芬;曲托龙;曲西立滨;三甲曲沙;曲普瑞林;妥布氯唑;尿嘧啶;氮芥;乌瑞替派;伐普肽;维替泊芬;长春碱;长春新碱;长春地辛;长春匹定;长春甘酯;长春罗新;长春瑞滨;长春罗定;长春利定;伏氯唑;泽尼铂;净司他丁;佐柔比星。
抗癌剂可以是一种酶抑制剂,包括而不局限于酪氨酸激酶抑制剂、CDK抑制剂、MAP激酶抑制剂或EGFR抑制剂。酪氨酸激酶抑制剂可以是而不局限于染料木黄酮(4′,5,7-三羟基异黄酮)、酪氨酸磷酸化抑制剂25(3,4,5-三羟苯基)-亚甲基]-丙二腈、除莠霉素A、黄豆苷元(4′,7-二羟基异黄酮)、AG-126、反-1-(3′-羧基-4′-羟苯基)-2-(2″,5″-二羟苯基)乙烷或HDBA(2-羟基5-(2,5-二羟苄氨基)-2-羟苯甲酸。CDK抑制剂可以是而不局限于p21、p27、p57、p15、p16、p18或p19。MAP激酶抑制剂可以是而不局限于KY12420(C23H24O8)、CNI-1493、PD98059或4-(4-氟苯基苯基)-2-(4-甲基亚硫酰苯基)-5-(4-吡啶基)1H-咪唑。EGFR抑制剂可以是而不局限于厄洛替尼(特罗凯(Tarceva))、吉非替尼(易瑞沙(Iressa))、WHI-P97(喹唑啉衍生物),LFM-A12(来福米特(leflunomide)代谢物类似物)、ABX-EGF、拉帕替尼、卡纽替尼、ZD-6474(ZACTIMA)、AEE788和AG1458。
抗癌剂可以是VEGF抑制剂、包括而不局限于贝伐珠单抗(阿瓦斯汀)、来尼珠单抗(ranibizumab)(LUCENTIS)、哌加他尼(MACUGEN)、索拉替尼、舒尼替尼(索坦(Sutent))、瓦他拉尼(vatalanib)、ZD-6474(ZACTIMA)、阿奈可他(RETAANE)、乳酸司夸胺和脑信号蛋白(semaphorin)。抗癌剂可以是抗体或抗体片段,包括而不局限于以下抗体或抗体片段,包括但不局限于贝伐珠单抗(阿瓦斯汀)、曲妥珠单抗(赫赛汀)、阿伦珠单抗(alemtuzumab)(CAMPATH,适用于B细胞慢性淋巴细胞白血病)、吉妥珠单抗(MYLOTARG、hP67.6、抗CD33,适用于白血病如急性髓样白血病)、利妥昔单抗(RITUXAN)、托西莫单抗(tositumomab)(BEXXAR,抗CD20,适用于B细胞恶性肿瘤)、MDX-210(与HER-2/neu癌基因蛋白产物和免疫球蛋白G(IgG)的I型Fc受体(FcγRI)同时结合的双特异性抗体)、奥戈伏单抗(OVAREX,适用于卵巢癌)、依屈洛抗单抗(PANOREX)、达克珠单抗(ZENAPAX)、帕利珠单抗(SYNAGIS,适用于呼吸道疾病如RSV感染)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(ZEVALIN,适用于非霍奇金淋巴瘤)、西妥昔单抗(爱必妥(Erbitux))、MDX-447,MDX-22,MDX-220(抗标签)、IOR-C5、10R-T6(抗CD1)、IOREGF/R3,西洛果瓦(ONCOSCINTOV103)、依帕珠单抗(LymphoCide)、pemtumomab(THERAGYN)和戈利木单抗-H(Gliomab-H)(适用于脑癌、黑色素瘤)。
其他合适的活性剂是DNA切割剂。适合作为细胞毒素在实践该方法时所用的缀合物中包括的DNA切割剂的实例包括但不局限于蒽醌吖酮-寡聚吡咯-甲酰胺,苯并咪唑,雷拉霉素(leinamycin);达内霉素A(dynemycin A);烯二炔;以及其生物活性类似物或衍生物(即,具有基本上等同生物活性的那些)。已知的类似物和衍生物例如在Islam(伊斯兰)等人,J.Med.Chem.(医药化学杂志)342954-61,1991;Skibo(斯科博)等人,J.Med.Chem.(医药化学杂志)37:78-92,1994;Behroozi(伯鲁兹)等人,Biochemistry(生物化学)35:1568-74,1996;Helissey(哈里塞)等人,Anticancer Drug Res.(抗癌药物研究)11:527-51,1996;Unno(海野)等人,Chem.Pharm.Bull.45:125-33,1997;Unno(海野)等人,Bioorg.Med.Chem.(生物有机化学与医药化学),5:903-19,1997;Unno(海野)等人,Bioorg.Med.Chem.(生物有机化学与医药化学),5:883-901,1997;和Xu(徐)等人,Biochemistry(生物化学)37:1890-7,1998)中披露。其他实例包括但不局限于烯二炔醌亚胺(美国专利号5,622,958);2,2r-双(2-氨基乙基)-4-4′-二噻唑(Lee(李)等人,Biochem.Mol.Biol.Int.(生物化学与分子生物学国际)40:151-7,1996);epilliticine-萨伦铜(salen.copper)缀合物(Routier(鲁迪埃)等人,Bioconjug.Chem.(生物共轭化学),8:789-92,1997)。
E.12.抗血管生成分子
考虑了在本发明的某些实施例中,将充当血管生成抑制剂的蛋白靶向肿瘤。除上文提到的抗生血管多肽之外,这些药剂包括马立马司他(Marimastat);AG3340;COL-3、BMS-275291、沙立度胺、内皮抑素、SU5416、SU6668、EMD121974、2-甲氧基雌二醇、羧胺三唑(carboxiamidotriazole)、CM101、硫酸戊聚糖聚酯、血管生成素2(Regeneron)、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利诺胺、沙立度胺、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP470、内皮抑素、紫杉醇、accutin、血管抑制素、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素。
因此,在另一个方面,本发明涉及用于医学中使用的根据本发明的缀合物。仍在另一个实施例中,本发明涉及一种包括根据本发明的缀合物和药学上可接受的运载体的药物组合物。
如在此使用,术语“药学上可接受的运载体”是指任何类型的无毒的、惰性固体的、半固体的或液体的填料,稀释剂,包囊材料或配制辅料。1995年Gennaro(加图索)编辑的Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿氏药物科学),Mack Publishing出版,Easton(伊斯顿),Pa.(宾夕法尼亚州)披露了在配制药物组合物中使用的不同运载体和用于制备它们的已知技术。
本发明的药物组合物可以通过通过本领域已知的任何手段(包括口服和肠胃外途径)给予患者。根据这类实施例,本发明组合物可以通过注射(例如,静脉内、皮下或肌内、腹腔注射)、直肠、阴道、局部(如通过散剂、乳膏剂、油膏剂或滴剂),或通过吸入(如通过喷雾剂)给予。
由于CXCR45在一系列肿瘤细胞中过表达,因此本发明的缀合物对于递送感兴趣的化合物至所述肿瘤细胞特别有用。如果活性化合物具有细胞抑制或细胞毒活性,则所述缀合物对于治疗过表达CXCR4的癌症特别有用。
因此,在另一个方面,本发明涉及用于治疗癌症的方法中使用的根据本发明的缀合物、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体或根据本发明的宿主细胞,其中所述癌症含有表达CXCR4的细胞。
可替代地,本发明涉及根据本发明的缀合物、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体或根据本发明的宿主细胞用于制造药物的用途,其中所述药物用于在治疗癌症的方法中使用,其中所述癌症含有表达CXCR4的细胞。
可替代地,本发明涉及一种用于治疗受试者中癌症的方法,其中所述癌症含有表达CXCR4的细胞,包括向所述受试者给予根据本发明的缀合物、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体或根据本发明的宿主细胞。
“含有表达CXCR4的细胞的癌症”包括而不局限于卵巢癌、膀胱癌、结直肠癌、肺癌、头颈癌、肾癌、胃癌、子宫癌、急性淋巴性白血病和宫颈癌。在一个优选实施例中,待使用根据本发明的方法治疗的癌症是结直肠癌或胰腺癌。
如在此使用,术语“结直肠癌”包括任何类型的结肠、直肠和盲肠瘤形成并且指早期和晚期腺瘤以及癌连同指遗传性、家族性或散发性癌症。遗传性CRC包括那些综合征,它们包括存在息肉,例如错构瘤息肉综合征和最著名的家族性腺瘤息肉(FAP)连同非息肉综合征,例如遗传性非息肉结直肠癌(HNPCC)或Lynch(林奇)综合征I。
在本发明的一个优选实施例中,所述结直肠癌(CRC)是结肠癌、直肠癌和/或阑尾癌。在本发明的另一个实施例中,所述结直肠癌是0期、I期、II期、III期和/或IV期结直肠癌。在此提到的CRC分期对应于美国癌症联合委员会(AJCC)CRC分期,虽然可以同等地使用其他分期方法,例如Dukes(杜克斯)和Astler(阿斯特勒)-Coller(科勒)分期。
如在此使用,短语“胰腺癌”指胰的恶性肿瘤,包括但不局限于腺癌、腺鳞状癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶体癌、未分化癌、伴有其中破骨细胞样巨细胞的未分化癌和胰岛细胞癌。
如在此使用,“受试者”可以是人或非人动物。非人动物例如包括家畜和宠物,例如羊、牛、猪、犬、猫和鼠哺乳动物,连同爬行类、鸟和鱼类。优选地,受试者是人。
例如,在治疗癌症的情况下,也可以通过观察到一种或多种以下效果监测增强的免疫反应:(1)某种程度地抑制肿瘤生长,包括,(i)减慢、(ii)抑制血管生成和(ii)完全生长停滞;(2)肿瘤细胞数目减少;(3)维肿瘤尺寸;(4)肿瘤尺寸减小;(5)抑制,包括(i)减少、(ii)减慢或(iii)完全防止肿瘤细胞浸润至外周器官中;(6)抑制,包括(i)减少、(ii)减慢或(iii)完全防止转移;(7)增强抗肿瘤免疫反应,这可以导致(i)维持肿瘤尺寸、(ii)减小肿瘤尺寸、(iii)减慢肿瘤生长,(iv)减少、减慢或防止侵入和/或(8)某种程度地减轻与病症相关的一个或多个症状的严重性或数目。
药物以有效量给予。有效量是足以提供医学上想要的结果的药剂量。有效量将随以下变动:正在治疗的具体病状、正在治疗的受试者的年龄和身体状况、病状的严重性、治疗的持续期、同步或联合疗法(如有的话)的性质、具体给予途径和处于健康执业者的知识和专业知识范围内的类似因素。通常优选一般使用最大剂量,即,根据正确医学判断的最高安全剂量。例如,如果受试者患有肿瘤,则有效量可以是减小肿瘤体积或负载(例如通过肿瘤成像所确定)的量。有效量也可以由癌细胞在血液或其他体液或组织(例如,活组织检查样品)中的存在和/或频率来评估。如果肿瘤正在影响组织或器官的正常发挥功能,则可以通过测量该组织或器官的正常发挥功能评估有效量。
配制缀合物用于选择的递送途径,包括但不局限于局部、关节内、脑池内、眼球内、心室内、鞘内、静脉内、肌内、气管内、腹内和皮内。
F.包括抗病毒剂的本发明的缀合物及其治疗由HIV感染引起的疾病的用途
由于CXCR4优势地在CD4+细胞中表达,因此本发明的缀合物对于递送感兴趣的化合物至所述CD4+细胞特别有用。如果活性化合物具有具有抗逆转录病毒活性或能够诱导细胞死亡,则所述缀合物对于治疗与HIV感染相关的疾病特别有用。
因此,在另一个方面,本发明涉及根据本发明的缀合物、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体或根据本发明的宿主细胞,其中治疗剂是抗逆转录病毒剂。
如在此使用,术语“抗逆转录病毒剂”指抑制逆转录病毒有效感染宿主的能力的化合物。抗逆转录病毒剂可以抑制多种过程,包括病毒遗传物质复制或逆转录病毒进入细胞中。在一些实施例中,抗逆转录病毒剂选自:蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂和病毒融合抑制剂。
在一个优选实施例中,活性化合物是可以用于治疗与HIV感染相关的疾病的抗HIV剂。根据本发明用作治疗剂的合适抗HIV剂包括而不局限于以下一种或多种:
1)结合药物:依非韦伦、恩曲他滨或富马酸替诺福韦二吡呋酯(Atripla(R)/BMS、Gilead);拉米夫定或齐多夫定(Combivir(R)/GSK);阿巴卡韦或拉米夫定(Epzicom(R)/GSK);阿巴卡韦、拉米夫定或齐多夫定(Trizivir(R)/GSK);恩曲他滨、富马酸替诺福韦二吡呋酯(Truvada(R)/Gilead)。
2)进入和融合抑制剂:马拉韦罗(Celsentri(R),Selzentry(R)/Pfizer);喷他夫西或恩夫韦肽(Fuzeon(R)/Roche,三聚体)。在一些实施例中,病毒进入抑制剂是融合抑制剂、CD4受体结合抑制剂,是CD4模拟物或gp120模拟物。在一些另外实施例中,病毒进入抑制剂是gp41拮抗剂、CD4单克隆抗体或CCR5拮抗剂,包括CCR5拮抗剂亚类,例如锌指抑制剂。仍在另一个实施例中,病毒进入抑制剂是CXCR4辅助受体拮抗剂。
3)整合酶抑制剂:拉替拉韦或MK-0518(Isentress(R)/Merck)。
4)逆转录酶抑制剂:用于根据本发明的组合物中使用的合适逆转录酶抑制剂是选自下组的一种或多种化合物,该组由以下各项组成:恩曲他滨、卡拉韦林、替诺福韦、拉米夫定、扎西他滨、地拉韦啶、奈韦拉平、去羟肌苷、司他夫定、阿巴卡韦、阿洛夫定、齐多夫定、消旋的恩曲他滨、阿立他滨、乙米韦林、艾夫他滨、TMC-278、DPC-083、氨多索韦、(-)-β-D-2,6-二氨基嘌呤二氧戊环、MIV-210(FLG)、DFC(右艾夫他滨)、二氧戊环胸苷、绵毛胡桐内酯A、依曲韦林(TMC-125)、L697639、阿替韦啶(U87201E)、MIV-150、GSK-695634、GSK-678248、TMC-278、KP1461、KP-1212、洛德腺苷(lodenosine)(FddA)、5-[(3,5-二氯苯基)硫代]-4-异丙基-1-(4-吡啶基甲基)咪唑-2-甲醇氨基甲酸、(-)-I2-D-2,6-二氨基嘌呤二氧戊环、AVX-754、BCH-13520、BMS-56190((4S)-6-氯-4-[(1E)-环丙基乙烯基]-3,-4-二氢-4-三氟甲基-2(1H)-喹唑啉酮)、TMC-120和L697639,其中在联合疗法中使用时,这些化合物以有效治疗HIV的量存在。
5)蛋白酶抑制剂:根据本发明,可以与miRNA或编码miRNA的多核苷酸组合的合适蛋白酶抑制剂选自下组,该组由以下各项组成:利托那韦、洛匹那韦、沙奎那韦、安普那韦、福沙那韦、奈非那韦、替拉那韦、茚地那韦、阿扎那韦、TMC-126、地瑞那韦、莫折那韦(DMP-450)、JE-2147(AG1776)、L-756423、KNI-272、DPC-681、DPC-684、替利那韦(SC-52151)、BMS 186318、决昔那韦(SC-55389a)、DMP-323、KNI-227、1-[(2-羟乙氧基)甲基]-6-(苯基硫代)-胸腺嘧啶、AG-1859、RO-033-4649、R-944、DMP-850、DMP-851和贝卡那韦(GW640385)。用于与本发明化合物组合使用的优选蛋白酶抑制剂包括沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安普那韦、洛匹那韦、阿扎那韦、地瑞那韦、贝卡那韦、福沙那韦和替拉那韦。特别有用的这类组合包括例如AZT+3TC;TDF+3TC;TDF+FTC;ABC+3TC;和阿巴卡韦。
额外地,根据本发明的组合物可以按联合疗法中使用时有效治疗HIV的量进一步包括选自下组的抗逆转录病毒剂,该组由以下各项组成:疫苗、基因治疗疗法、细胞因子、TAT抑制剂和免疫调节剂。
在另一个方面,本发明涉及本根据发明的缀合物、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体或根据本发明的宿主细胞,其中治疗剂选自下组,该组由以下各项组成:
(i)抗逆转录病毒剂,
(ii)细胞毒多肽,
(iii)促凋亡多肽
(iv)沉默剂,以及
(v)自杀基因,
用于治疗与HIV感染相关的疾病中使用。
可替代地,本发明涉及根据本发明的缀合物、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体的用途,其中治疗剂选自下组,该组由以下各项组成:
(i)抗逆转录病毒剂,
(ii)细胞毒多肽,
(iii)促凋亡多肽
(iv)沉默剂,以及
(v)自杀基因,
用于制造一种药物,该药物用于在用于治疗的方法中使用。
可替代地,本发明涉及一种用于治疗对其有需求的受试者中与HIV感染相关的疾病的方法,该方法包括向所述受试者给予根据本发明的缀合物、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体,其中治疗剂选自下组,该组由以下各项组成:
(i)抗逆转录病毒剂,
(ii)细胞毒多肽,
(iii)促凋亡多肽
(iv)沉默剂,以及
(v)自杀基因,
上文已经定义术语“逆转录病毒剂”。
术语“细胞毒多肽”、“促凋亡多肽”、“沉默剂”和“自杀基因”已经在上文在本发明的抗肿瘤剂背景下详细解释并且同等地适用于本发明的方法的背景下。
合适的沉默剂包括而不局限于用于抑制HIV复制的siRNA构建体。这些siRNA构建体可以特异性针对不同HIV靶(综述见Morris(莫里斯)(2006)Gene Ther(基因治疗)13:553-558;Rossi(罗西)(2006)Biotechniques Suppl(生物技术增刊):25-29;Nekhai(纳克亥)(2006)Curr Opin Mol Ther(分子治疗新进展)8:52-61;和Cullen(卡伦)(2005)AIDS Rev(AIDS综述)7:22-25)。为了防止HIV感染宿主T-细胞,本发明也特征在于减少T细胞辅助受体(例如,CCR5和CCR4)表达的组分。这类抑制将预期阻碍对宿主T-细胞的感染,因为具有CCR5A32突变的人抗HIV感染。本发明也特征在于包括多个siRNA构建体(例如,针对HIV基因和用于HIV感染的T-细胞受体的构建体)。这里,一种siRNA构建体可以阻断感染并且同时第二siRNA构建体防止感染进展。
如在此使用,术语“与HIV感染相关的疾病”包括其中受试者已经发展AIDS的状态连同其中感染HIV的受试者不具有(未示出)疾病的任何体征或症状的状态。因此,向不具有感染临床体征的受试者给予时,本发明的组合物可以具有防止活性,因为它们可以防止疾病发作。这些组合物能够在这种受试者中防止或减慢健康CD4+T细胞的感染和破坏。它也指防止和减慢以下获得性免疫缺陷疾病症状的发作,例如极低CD4+T细胞计数和遭受条件性病原体(例如分枝杆菌属物种(Mycobacteria spp.)、卡氏肺囊虫(Pneumocystiscarinii)和肺隐球菌(Pneumocystis cryptococcus))反复感染。有益或希望的临床结果包括但不局限于新生CD4+T-细胞绝对计数增加(范围10-3520)、CD4+T-细胞相对于总循环免疫细胞的百分比增加(范围1-50百分比)、和/或作为未感染的受试者中正常CD4+T-细胞计数百分比,CD4+T-细胞计数增加(范围1-161百分比)。“治疗”也可以指与如果受试者未接受任何HIV靶向性治疗的预期存活期相比,感染的受试者的延长存活。
本发明进一步涉及防止或减少与HIV感染相关的症状。这些包括与HIV感染的轻微症状期相关的症状,包括例如带状疱疹、皮肤皮疹和指甲感染、口疡、反复鼻和喉感染和体重减轻。此外,与HIV感染主要症状期相关的另外症状包括例如鹅口疮和阴道念珠球菌病(假丝酵母属(Candida))、持续性腹泻、体重减轻、持续性咳嗽和复活的结核病或复发性疱疹感染,如冷疱(单纯疱疹)。可以根据本发明治疗的成熟AIDS的其他症状包括例如腹泻,恶心和呕吐、鹅口疮和口疡、持续性、复发性阴道感染和宫颈癌,持续性全身淋巴腺病(PGL),严重皮肤感染,疣和癣,呼吸道感染,肺炎、尤其卡氏肺囊虫肺炎(PCP),带状疱疹(或shingles)、神经系统问题如手和足疼痛、麻木或“针刺和针扎”感、神经学异常、卡波西肉瘤、淋巴瘤、结核病或其他相似的机会性感染。
本发明的缀合物的制备
提供了用于制备缀合物的方法。这些方法包括化学缀合方法和依赖于重组产生缀合物的方法。
在实践本发明中使用的靶向肽可以通过化学修饰附接至具有治疗兴趣或诊断兴趣的活性化合物。典型地,化学方法依赖于用希望的连接剂衍生活性剂(治疗剂或诊断剂),并且然后与靶向肽反应。化学衍生方法可以使用双官能交联剂实施。
在实践化学方法时,通过任何手段(典型地通过在细菌宿主或真核宿主中表达DNA或通过化学合成)产生的靶向肽与活性剂化学偶联。如果靶向肽或活性剂不含用于实现化学连接的合适部分,则可以将它衍生化。例如,药剂,例如志贺毒素、多花白树毒蛋白或其他此类药剂,可以如通过与连接剂,例如N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)的反应而衍生化。在其他实施例中,靶向药剂,例如志贺毒素A链在N末端或其附近被修饰以包括半胱氨酸残基,使得所得修饰药剂可以与趋化因子受体结合部分蛋白反应,而无需进一步衍生化。
参与这类缀合的可能化学基团的非限制性实例是:靶向肽上的羧酸基,其可以与活性剂上的氨基(例如,赖氨酸侧链上的ε-氨基)反应以形成连接靶向肽和活性剂的酰胺基;靶向肽上的氨基,其可以与活性剂上的羧酸基(例如,谷氨酸或天冬氨酸侧链上的羧酸基)反应以形成连接靶向肽和活性剂的酰胺基;靶向肽上的二硫基,其可以与活性剂上的巯基(例如,半胱氨酸侧链侧链上的巯基)反应以形成连接靶向肽和活性剂的二硫基。
一旦缀合,则通常将纯化缀合物,用来从未缀合的靶向剂或从其他污染物分离缀合物。可获得大量纯化技术用于在提供具有使其临床有用的足够纯度的缀合物中使用。基于大小分离的纯化方法,例如凝胶过滤法、凝胶渗透或高效液相色谱,将一般是最常用的。也可以使用其他色谱技术,例如蓝色琼脂糖凝胶分离法(Blue-Sepharose separation)。
在某些实施例中,在其中融合蛋白或肽可以是分离或纯化的情况下,缀合物是靶向肽和治疗剂的融合蛋白。蛋白纯化技术是本领域普通技术人员熟知的。在一个水平,这些技术涉及将细胞、组织或器官均化和初步分级成多肽部分和非多肽部分。感兴趣的蛋白或多肽可以使用色谱技术和电泳技术进一步纯化,以实现部分或完全纯化(或纯化至均一)。特别适合于制备纯肽的分析性方法是离子交换层析、凝胶排阻层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、亲和层析、免疫亲和层析和等电聚焦法。一种特别有效的纯化肽的方法是快速液相色谱(FPLC)或甚至是高效液相色谱(HPLC)。
纯化的蛋白或肽旨在指从其他组分可分离的组合物,其中将蛋白或肽纯化至相对于其天然可得状态的任何程度。因此,分离或纯化的蛋白或肽也指从环境中游离的蛋白或肽,在环境中它可以天然存在。总体上,“纯化”将指一种蛋白或肽组合物,它已经历分级以除去不同其他组分并且组合物基本上保留其表现的生物活性。在使用术语“基本上纯化”的情况下,这种名称将指一种组合物,其中蛋白或肽形成组合物的主要组分,例如构成约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%或更多在组合物中的蛋白。
适用于蛋白纯化的不同技术是本领域普通技术人员熟知的。这些技术例如包括用硫酸铵、PEG、抗体等,或通过加热变性,随后是离心;层析步骤如离子交换、凝胶过滤、反相羟基磷灰石和亲和层析;等电聚焦;凝胶电泳;以及这些技术和其他技术的组合。如本领域周知,认为可以改变实施不同纯化步骤的顺序,或某些步骤可以省略,并且仍导致用于制备基本上纯化的蛋白或肽的合适方法。
不总体要求蛋白或肽总是以其最纯化状态提供。实际上,考虑了基本上纯化程度更低的产物在某些实施例中具有效用。可以通过组合使用更少纯化步骤或通过利用相同的一般纯化方案的不同形式,实现部分纯化。例如,应理解,利用HPLC设备进行的阳离子交换管柱色谱总体上将比利用低压色谱系统的相同技术导致更大“倍数”的纯化。显示更低相对纯化程度的方法度可以在蛋白产物的总回收率方面,或在维持表达的蛋白的活性方面具有优势。
本发明借助以下实例描述,所述实例应仅解释为说明性而不是限制本发明的范围。
实例
材料与方法
蛋白产生和纯化
通过标准重组DNA技术产生GFP融合基因,以编码在C末端含有His标签并在氨基端含有相关CXCR4配体的杂合蛋白。编码的蛋白T22-GFP-H6、V1-GFP-H6、vCCL2-GFP-H6和CXCL12-GFP-H6(表2)以可溶性形式在大肠杆菌菌株OrigamiB(OmpT-,lon-,trxB-,gor-(Novagen))中产生。在Luria(卢里亚)-Bertani(贝塔尼)(LB)培养基中生长携带编码每种融合蛋白的不同pET22b版本(Novagen 69744-3)的细菌,并且通过0.1mM异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。将细菌培养物离心并且在无EDTA的蛋白酶抑制剂存在下(完全无EDTA;Roche(罗氏公司))重悬于缓冲液A(20mM Tris-HCl pH 7.5,500mM NaCl,10mM咪唑)中。然后使用弗氏压碎器(ThermoFA-078A),通过1100psi压力破碎细胞。
在AKTA纯化器FPLC(GE healthcare)中,使用HiTrap螯合HP 1ml Ni2+管柱(GEhealthcare公司)通过6xHis标签亲和色谱从粗细胞提取物中纯化蛋白。将阳性部分收集于洗脱缓冲液(Tris-HCl 20mM pH 7.5,500mM NaCl,500mM咪唑)中,针对PBS+10%甘油或20mM Tris、500mM NaCl缓冲液透析,并且由布拉德福德方法(Bradford’sprocedure)定量。蛋白完整性由质谱法(MALDI-TOF)和N-端测序表征。
DNA阻滞测定法和透射电子显微术
根据先前公开的实验方案(2),在PBS pH6+10%甘油中进行DNA-蛋白孵育和DNA迁移率测定法。
对于透射电子显微术,将纯化的蛋白稀释至0.2mg/ml终浓度。全部蛋白样品均用2%乙酸双氧铀负染到碳涂层网格(carbon coated grid)上。还通过在含有样品的网格上沉积1nm蒸发的铂层,对样品镀铂。全部样品均在HitachiH-7000透射电子显微镜中可视化。
细胞培养物和共聚焦激光扫描显微术
HeLa(ATCC-CCL-2)细胞系用于全部实验中在不固定的情况下监测。将细胞在补充有10%胎牛血清(GIBCO)的MEM(GIBCO公司,Rockville(罗克维尔),MD(马里兰州))中维持并且在37℃和5%CO2在增湿的气氛下孵育。在共聚焦分析之前20h,将GFP融合蛋白以所示的浓度在Optipro培养基(GIBCO,Invitrogen公司)存在的情况下添加至细胞培养物,除了在血清存在下的时程研究和内化研究(完全培养基)。对于共聚焦分析,将细胞在Mat-Teck培养碟上培育(Mat Teck Corp.公司,Ashland(亚什兰),Massachusetts(马萨诸塞州),美国)。细胞核用20μg/ml Hoechst 33342(MolecularProbes公司,Eugene(尤金),Oregon(俄勒冈州),美国)标记,并且质膜用2.5μg/mlCellMaskTM深红(Deep Red)(Molecular Probes公司,Invitrogen公司,Carlsbad(卡尔斯巴德),加利福尼亚州,美国),黑暗中持续5分钟。在PBS(Sigma-Aldrich Chemie GmbH公司,Steinheim(施泰因海姆),德国)中洗涤细胞。使用PPlan Apo 63x/1.4(油镜HC xPLAPOλ蓝)物镜,用TCS-SP5共聚焦激光扫描显微镜(Leica Microsystems(徕卡显微系统公司),海德堡,德国)记录活细胞。Hoechst 33342DNA标记物用蓝光二极管(405nm)激发并且在415-460nm范围内检测。GFP-蛋白用氩激光(488nm)激发并且在525-545nm范围内检测。细胞用氦氖激光(633nm)激发并且在650-775nm范围内检测。为了确定细胞内部的蛋白定位,沿细胞厚度每隔0.5μm采集一组10至20个截面。用LeicaLAS AF软件生成所获得的系列截面的投影,并且使用Imaris v.6.1.0软件(Bitplane公司;Zürich,瑞士)生成立体模型。
蛋白介导的质粒转染
对于表达实验,将20、40、60和80μg T22-GFP-H6蛋白(1、2、3和4阻滞单位-RU-)和1μg Td番茄表达载体混合成终体积85μl的PBS+10%甘油缓冲液,并且在室温1h后形成复合物,此后添加便利体积的Optipro。将这种复合物温和地添加至HeLa细胞,随后在37℃在5%CO2气氛下孵育24和48h。通过流式细胞术并通过共聚焦显微术监测Td番茄基因表达。使用未处理或仅单独与表达载体或蛋白孵育的细胞作为对照。
流式细胞术
用HBSS中的0.5mg/ml胰蛋白酶、4Na处理1min后,使用在488nm激发的15mW气冷氩离子激光,在FACSCanto系统(Becton Dickinson公司)上分析细胞样品。对于EGFP,用检测器D(530/30nm带通滤光片)测量荧光发射,并且对于Td番茄荧光蛋白,用检测器C(585/42nm带通滤光片)测量荧光发射。为测试不同公开的胰蛋白酶处理(Lundberg(伦德伯格),2003,Mol.Ther.(分子治疗),8:143和Egorova(叶戈洛娃)等人,2009,J.Gene Med.(基因医学杂志),11:772)在我们的内化结果中的作用,我们在细胞测定分析之前,在具有或没有1M NaCl的情况下,使用0.5mg/ml和1mg/ml胰蛋白酶持续1或15min。
竞争测定法
为评估T22-GFP-H6对CXCR4的结合特异性,将HeLa细胞在竞争测定法中于24孔平板中以70%汇合生长。将细胞与Optipro中渐增量的天然CXCR4配体SDF1α一起预孵育30min以达到25nM和250nM,或与无关蛋白GFP-H6和人α-半乳糖苷酶(二者均在250nM)一起预孵育30min。然后,将T22-GFP-H6以25nM添加至培养物并进一步孵育。1小时后,细胞用1mg/ml胰蛋白酶处理15min并且通过流式细胞术确定胞内荧光。数据用WinMDI、Microsoft Excel 2003和Sigmaplot 10软件分析。
实例1
肽T22能够促进功能性和可溶性融合的蛋白内化至靶CXCR4+细胞中。
在此研究中,研究4种肽的内化性能,所述肽已经被描述为CXCR4配体,即T22、V1、vCCL2,CXCL12(参见表1)。通过以下方式做到这一点:构建其中这些肽已经与GFP-H6融合的4种模型蛋白(表2),产生完整荧光蛋白。当培养的HeLa细胞暴露于这些构建体时,相对于其余肽,与T22-GFP-H6接触的那些细胞显著地被绿色荧光标记(图1和图2)。这种摄取是浓度依赖的(参见图3A),并且甚至在结合融合蛋白后用胰蛋白酶处理细胞,以消除表面附接的蛋白后仍观察到(图3B)。为评估这种信号归因于实际的蛋白摄取,使培养的细胞经历共聚焦分析,验证T22-GFP-H6的高度有效内化和其余测试肽的不良渗透(图3C、3D、3E和F)。
因此,肽T22能够促进功能性和可溶性融合的蛋白内化至靶CXCR4+细胞中。
实例2
肽T22能够促进质粒DNA内化至靶CXCR4+细胞中并在其中表达。
通过替代方法确定T22-GFP-H6的不同生物学和物理化学特征(图3)。在它们当中,值得指出的是T22-GFP-H6的核周定位和蛋白在核膜中的假定对接(图3D,参见插图)。这提示,除T22在递送功能性蛋白(在该模型中,实例1中示出的完整荧光GFP)方面的潜力之外,这种个肽也可以递送可表达的DNA并最终促进它们进入核区室中。为探索这种可能性,首先确定T22-GFP-H6是否可以在体外结合质粒DNA,这由DNA阻滞测定法充分证明(图4)。此外,在这个基因与T22-GFP-H6复合物结合时,分析编码红色荧光蛋白的Td番茄报道基因的潜在基因表达。分析转染的HeLa细胞(图4B、4C和4D)表明,这种报道基因表达,并且在这些培养的细胞中清晰地观察到没有红色荧光(DNA表达)和绿色荧光(T22-GFP-H6)匹配。
实例3
T22-GFP-H6的内化受CXCR4的天然配体抑制
通过在蛋白SDFα存在下,以不同的T22-GFP-H6/SDFα比率(1∶0、1∶1、1∶10),使CXCR4+细胞与T22-GFP-H6接触,测试天然CXCR4配体(SDFα)抑制T22-GFP-H6内化的能力。以1∶10比率使用两个无关蛋白GFP-H6和GLA作为对照。结果示出SDFα能够以剂量依赖性方式抑制T22-GFP-H6内化,而用不相关蛋白观察到没有效果(图5)。
实例4
T22-GFP在体内相对于原发性肿瘤的选择性生物分布
将包括T22作为靶部分(其特异性结合CXCR4受体)和绿色荧光蛋白的融合蛋白给予含有原发性肿瘤的免疫抑制小鼠,所述原发性肿瘤生成自CXCR4+SW1417人结直肠癌细胞在小鼠盲肠中的异种移植。在静脉内单次剂量给予范围从20至500ug变化的剂量后,在若干时点(5、24或48h)确定T22-GFP分布。相对于对照动物,T22-GFP积累8-47倍,如使用IVIS200系统(Xenogen公司),通过荧光定量法测量。在载具处理的对照小鼠中的原发性肿瘤组织中检测到没有荧光。
实例5
T22-GFP相对于腹膜转移和肠系膜的及膈膜的淋巴结的选择性生物分布
给予小鼠500μg T22-GFP的静脉内单次剂量,示出源自异种移植于免疫抑制小鼠的盲肠中的CXCR4+SW1417人结直肠癌细胞的腹膜转移和肠系膜的及膈膜的淋巴结。T22-GFP在腹膜转移灶中积累20-40倍,如5h或24h后使用IVIS200系统(Xenogen公司),通过荧光定量法所测量。在实验动物或对照(载具对照)动物的肝实质、胰实质、肾、心、无肿瘤肠、无肿瘤淋巴结、肺或脾中检测到没有荧光。在肿瘤组织中观察到T22-GFP融合蛋白积累,而在正常组织中观察到没有T22-GFP的积累。在实验动物和对照动物二者中,胆囊(附接至肝脏)中或胰中均观察到荧光,这可以归因于由这些器官分泌的荧光蛋白。
Claims (17)
1.一种缀合物,包括
(i)包括序列RRWCYRKCYKGYCYRKCR(SEQ ID NO:5)的一种靶向肽或其功能等同变体,以及
(ii)一种治疗剂
其中该靶向肽能够特异性结合CXCR4并促进该治疗剂在表达CXCR4的细胞中的内化。
2.根据权利要求1所述的一种缀合物,其中该治疗剂是一种多肽。
3.根据权利要求3所述的一种缀合物,其中该治疗剂和该靶向肽是一种融合蛋白的一部分。
4.一种编码如权利要求3中限定的缀合物的多核苷酸。
5.一种包括如权利要求4中限定的多核苷酸的载体。
6.一种包含根据权利要求4所述的多核苷酸或根据权利要求5所述的载体的宿主细胞。
7.根据权利要求1所述的一种缀合物,其中该治疗剂是一种多核苷酸。
8.如权利要求1中限定的一种缀合物,其中该治疗剂在一种纳米转运体内提供并且其中该纳米转运体与该靶向肽偶联。
9.根据权利要求1至3、7或8中任一项所述的一种缀合物、根据权利要求4所述的一种多核苷酸或根据权利要求5所述的一种载体,其中该治疗剂是抗肿瘤剂。
10.根据权利要求9所述的一种缀合物、多核苷酸或载体,其中该抗肿瘤剂选自下组,该组由以下各项组成:
(i)一种细胞毒多肽,
(ii)一种抗血管生成多肽,
(iii)一种由肿瘤抑制基因编码的多肽,
(iv)一种促凋亡多肽,
(v)一种具有抗转移性活性的多肽,
(vi)一种由能够激活针对肿瘤的免疫反应的多核苷酸编码的多肽,
(vii)一种肿瘤抑制基因,
(viii)一种沉默剂,
(ix)一种自杀基因,
(x)一种能够激活针对肿瘤的免疫反应的多核苷酸,
(xi)一种化疗剂,以及
(xii)一种抗血管生成分子。
11.根据权利要求10所述的一种缀合物、多核苷酸或载体,其中该沉默剂选自下组,该组由以下各项组成:一种siRNA、一种shRNA和一种反义寡核苷酸。
12.一种根据权利要求11或12所述的用于医学中使用的缀合物、多核苷酸或载体。
13.根据权利要求11或12所述的、用于在用于治疗癌症的方法中使用的一种缀合物、多核苷酸或载体,其中所述癌症含有表达CXCR4的细胞。
14.用于根据权利要求13所述的用途的一种缀合物、多核苷酸或载体,其中该癌症是胰腺癌或结直肠癌。
15.根据权利要求1至3、7或8中任一项所述的一种缀合物、根据权利要求4所述的一种多核苷酸或根据权利要求5所述的一种载体,其中该治疗剂是一种抗逆转录病毒剂。
16.根据权利要求14所述的用于医学中使用的一种缀合物、多核苷酸或载体。
17.根据权利要求1至3、7或8中任一项所述的一种缀合物、根据权利要求4所述的一种多核苷酸或根据权利要求5所述的一种载体,其中该治疗剂选自下组,该组由以下各项组成:
(i)一种抗逆转录病毒剂,
(ii)一种细胞毒多肽,
(iii)一种促凋亡多肽
(iv)一种沉默剂,以及
(v)一种自杀基因,
用于治疗与HIV感染相关的一种疾病中使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP11382005A EP2476441A1 (en) | 2011-01-13 | 2011-01-13 | Methods and reagents for efficient and targeted delivery of therapeutic molecules to CXCR4 cells |
EP11382005.4 | 2011-01-13 | ||
PCT/EP2012/050513 WO2012095527A1 (en) | 2011-01-13 | 2012-01-13 | Methods and reagents for efficient and targeted delivery of therapeutic molecules to cxcr4 cells |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103501818A true CN103501818A (zh) | 2014-01-08 |
Family
ID=43983350
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201280011605.XA Pending CN103501818A (zh) | 2011-01-13 | 2012-01-13 | 用于高效及靶向递送治疗性分子至cxcr4细胞的方法和试剂 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US9580468B2 (zh) |
EP (2) | EP2476441A1 (zh) |
JP (1) | JP2014508515A (zh) |
CN (1) | CN103501818A (zh) |
AU (1) | AU2012206533B2 (zh) |
DK (1) | DK2663336T3 (zh) |
ES (1) | ES2646390T3 (zh) |
IL (1) | IL227442B (zh) |
PL (1) | PL2663336T3 (zh) |
PT (1) | PT2663336T (zh) |
WO (1) | WO2012095527A1 (zh) |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103789333A (zh) * | 2014-03-05 | 2014-05-14 | 湖北肽洋红生物工程有限公司 | 一种口服重组融合蛋白tat-map30及制备方法和应用 |
CN105859841A (zh) * | 2016-03-04 | 2016-08-17 | 中山大学 | 一种双靶向嵌合肽及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用 |
CN106086075A (zh) * | 2016-06-23 | 2016-11-09 | 福建医科大学 | CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法 |
CN107325187A (zh) * | 2017-07-19 | 2017-11-07 | 黄子为 | 一种具有cxcr4蛋白激动活性的多肽及其应用和药物组合物 |
CN110997705A (zh) * | 2017-05-05 | 2020-04-10 | 巴塞罗那自治大学 | 纳米结构蛋白及其用途 |
CN111909278A (zh) * | 2014-01-27 | 2020-11-10 | 分子模板公司 | Mhc i类表位递送多肽 |
CN113164547A (zh) * | 2018-09-25 | 2021-07-23 | 爱默蕾大学 | 用于细胞识别和整合的核酸 |
CN113831416A (zh) * | 2014-06-11 | 2021-12-24 | 分子模板公司 | 耐受蛋白酶切割的志贺毒素a亚基效应子多肽和包含其的细胞靶向分子 |
CN114729023A (zh) * | 2019-04-01 | 2022-07-08 | 西托戴恩股份有限公司 | 阻断癌症转移或增强由dna损伤化学疗法诱导的细胞死亡的抗ccr5药剂和治疗方法 |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9616114B1 (en) | 2014-09-18 | 2017-04-11 | David Gordon Bermudes | Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity |
US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
CN114796218A (zh) * | 2017-02-21 | 2022-07-29 | 库拉肿瘤学公司 | 使用法尼基转移酶抑制剂治疗癌症的方法 |
AU2018301651B2 (en) * | 2017-07-10 | 2023-05-18 | Sri International | A peptide saporin conjugate for the treatment of cancer |
AU2018301804A1 (en) | 2017-07-10 | 2020-01-30 | Sri International | Molecular guide system peptides and uses thereof |
EP3427756A1 (en) * | 2017-07-14 | 2019-01-16 | Universidad Autónoma De Barcelona (UAB) | Therapeutic nanoconjugates and uses thereof |
US10639379B2 (en) * | 2017-09-05 | 2020-05-05 | Mainline Biosciences Llc | High affinity CXCR4 selective binding conjugate and method for using the same |
WO2020177717A1 (zh) * | 2019-03-04 | 2020-09-10 | 上海一宸医药科技有限公司 | 新型双特异性结合分子及其药物偶联物 |
EP3722255A1 (en) * | 2019-04-11 | 2020-10-14 | Universitat Autònoma De Barcelona | Protein nano- or microparticles as artificial inclusion bodies |
US20220202733A1 (en) * | 2019-04-11 | 2022-06-30 | Universitat Autonoma De Barcelona | Protein nano- or microparticles as artificial inclusion bodies |
WO2023133422A1 (en) * | 2022-01-04 | 2023-07-13 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for delivering cargo to a target cell |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006029078A2 (en) * | 2004-09-07 | 2006-03-16 | The Regents Of The University Of California | Targeting transducible molecules to specific cell types |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5190931A (en) | 1983-10-20 | 1993-03-02 | The Research Foundation Of State University Of New York | Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA |
US5082927A (en) | 1986-09-24 | 1992-01-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Selectively cytotoxic IL-4-PE40 fusion protein |
US5176996A (en) | 1988-12-20 | 1993-01-05 | Baylor College Of Medicine | Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use |
US5087617A (en) | 1989-02-15 | 1992-02-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for treatment of cancer using oligonucleotides |
US5168053A (en) | 1989-03-24 | 1992-12-01 | Yale University | Cleavage of targeted RNA by RNAase P |
US5135917A (en) | 1990-07-12 | 1992-08-04 | Nova Pharmaceutical Corporation | Interleukin receptor expression inhibiting antisense oligonucleotides |
OA09696A (en) * | 1991-05-02 | 1993-08-30 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | Novel polypeptides with affinity to lipopolysaccharides and their uses |
US5622958A (en) | 1994-12-01 | 1997-04-22 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Enediyne quinone imines and methods of preparation and use thereof |
EP1045901B1 (en) | 1998-01-15 | 2004-11-03 | King'S College London | Ribozymal nucleic acids cleaving ccr5 or cxcr4 |
US6429308B1 (en) | 1998-11-24 | 2002-08-06 | Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. | HIV infection inhibitors |
CA2414650A1 (en) * | 2000-06-30 | 2002-01-10 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Isolation of a cell-specific internalizing peptide that infiltrates tumor tissue for targeted drug delivery |
US20050124569A1 (en) | 2001-05-18 | 2005-06-09 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of CXCR4 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
US20040132642A1 (en) * | 2002-11-12 | 2004-07-08 | Government Of The U.S.A., Represented By The Secretary, Dept. Of Health & Human Services | Methods of inhibiting metastasis or growth of a tumor cell |
US20050113324A1 (en) * | 2003-01-15 | 2005-05-26 | Bondarev Igor E. | Modulation of line-1 reverse transcriptase |
JP2006524242A (ja) | 2003-03-27 | 2006-10-26 | エモリー ユニバーシティー | Cxcr4アンタゴニストおよびそれらの使用方法 |
CA2633442A1 (en) | 2005-12-16 | 2007-09-13 | Xiaoyun Wu | Compositions and methods related to controlled gene expression using viral vectors |
WO2007115376A1 (en) | 2006-04-11 | 2007-10-18 | The University Of Western Australia | Anti-angiogenic agents and methods of their use |
WO2007143584A2 (en) | 2006-06-02 | 2007-12-13 | Alcon Research, Ltd. | RNAi-MEDIATED INHIBITION OF STROMAL CELL-DERIVED FACTOR 1-RELATED TARGETS FOR TREATMENT OF NEOVASCULARIZATION-RELATED CONDITIONS |
WO2008008852A2 (en) | 2006-07-11 | 2008-01-17 | Emory University | Cxcr4 antagonists including heteroatoms for the treatment of medical disorders |
WO2008124483A1 (en) | 2007-04-04 | 2008-10-16 | Specigen, Inc. | Protein cage immunotherapeutics |
WO2009039981A2 (en) | 2007-09-11 | 2009-04-02 | Mondobiotech Laboratories Ag | Use of a peptide as a therapeutic agent |
US7908940B2 (en) | 2008-03-24 | 2011-03-22 | Shimano Inc. | Bar end electric shifter |
WO2010053763A1 (en) * | 2008-10-29 | 2010-05-14 | Academia Sinica | Tumor-targeting peptides and uses thereof |
EP2370055A2 (en) * | 2008-11-30 | 2011-10-05 | University Of The Witwatersrand, Johannesburg | Polymeric pharmaceutical dosage form in sustained release |
-
2011
- 2011-01-13 EP EP11382005A patent/EP2476441A1/en not_active Withdrawn
-
2012
- 2012-01-13 WO PCT/EP2012/050513 patent/WO2012095527A1/en active Application Filing
- 2012-01-13 AU AU2012206533A patent/AU2012206533B2/en active Active
- 2012-01-13 CN CN201280011605.XA patent/CN103501818A/zh active Pending
- 2012-01-13 JP JP2013548853A patent/JP2014508515A/ja active Pending
- 2012-01-13 PT PT127047116T patent/PT2663336T/pt unknown
- 2012-01-13 DK DK12704711.6T patent/DK2663336T3/da active
- 2012-01-13 ES ES12704711.6T patent/ES2646390T3/es active Active
- 2012-01-13 EP EP12704711.6A patent/EP2663336B1/en active Active
- 2012-01-13 US US13/979,560 patent/US9580468B2/en active Active
- 2012-01-13 PL PL12704711T patent/PL2663336T3/pl unknown
-
2013
- 2013-07-11 IL IL227442A patent/IL227442B/en active IP Right Grant
-
2017
- 2017-01-10 US US15/402,795 patent/US10265371B2/en active Active
-
2019
- 2019-02-27 US US16/287,583 patent/US10813975B2/en active Active
-
2020
- 2020-09-21 US US17/026,543 patent/US11590198B2/en active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006029078A2 (en) * | 2004-09-07 | 2006-03-16 | The Regents Of The University Of California | Targeting transducible molecules to specific cell types |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
HIROKAZU T. ET AL: "Synthesis and Evaluation of Bifunctional Anti-HIV Agents Based on Specific CXCR4 Antagonists-AZT Conjugation", 《BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY》, vol. 9, no. 8, 31 August 2001 (2001-08-31), pages 2179 - 2187 * |
Cited By (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111909278A (zh) * | 2014-01-27 | 2020-11-10 | 分子模板公司 | Mhc i类表位递送多肽 |
CN111909278B (zh) * | 2014-01-27 | 2024-04-09 | 分子模板公司 | Mhc i类表位递送多肽 |
CN103789333B (zh) * | 2014-03-05 | 2016-02-24 | 湖北肽洋红生物工程有限公司 | 一种口服重组融合蛋白tat-map30及制备方法和应用 |
CN103789333A (zh) * | 2014-03-05 | 2014-05-14 | 湖北肽洋红生物工程有限公司 | 一种口服重组融合蛋白tat-map30及制备方法和应用 |
CN113831416A (zh) * | 2014-06-11 | 2021-12-24 | 分子模板公司 | 耐受蛋白酶切割的志贺毒素a亚基效应子多肽和包含其的细胞靶向分子 |
CN105859841A (zh) * | 2016-03-04 | 2016-08-17 | 中山大学 | 一种双靶向嵌合肽及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用 |
CN105859841B (zh) * | 2016-03-04 | 2019-09-20 | 中山大学 | 一种双靶向嵌合肽及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用 |
CN106086075A (zh) * | 2016-06-23 | 2016-11-09 | 福建医科大学 | CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法 |
CN106086075B (zh) * | 2016-06-23 | 2019-08-06 | 福建医科大学 | CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法 |
CN110997705A (zh) * | 2017-05-05 | 2020-04-10 | 巴塞罗那自治大学 | 纳米结构蛋白及其用途 |
CN107325187A (zh) * | 2017-07-19 | 2017-11-07 | 黄子为 | 一种具有cxcr4蛋白激动活性的多肽及其应用和药物组合物 |
CN113164547A (zh) * | 2018-09-25 | 2021-07-23 | 爱默蕾大学 | 用于细胞识别和整合的核酸 |
CN114729023A (zh) * | 2019-04-01 | 2022-07-08 | 西托戴恩股份有限公司 | 阻断癌症转移或增强由dna损伤化学疗法诱导的细胞死亡的抗ccr5药剂和治疗方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2012206533B2 (en) | 2017-08-31 |
DK2663336T3 (da) | 2017-11-27 |
US20170209590A1 (en) | 2017-07-27 |
EP2476441A1 (en) | 2012-07-18 |
AU2012206533A1 (en) | 2013-08-01 |
PL2663336T3 (pl) | 2018-01-31 |
US9580468B2 (en) | 2017-02-28 |
US20140094404A1 (en) | 2014-04-03 |
PT2663336T (pt) | 2017-11-15 |
JP2014508515A (ja) | 2014-04-10 |
US11590198B2 (en) | 2023-02-28 |
WO2012095527A1 (en) | 2012-07-19 |
US10265371B2 (en) | 2019-04-23 |
EP2663336B1 (en) | 2017-08-09 |
IL227442B (en) | 2018-05-31 |
US10813975B2 (en) | 2020-10-27 |
US20190183968A1 (en) | 2019-06-20 |
US20210008154A1 (en) | 2021-01-14 |
IL227442A0 (en) | 2013-09-30 |
ES2646390T3 (es) | 2017-12-13 |
EP2663336A1 (en) | 2013-11-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11590198B2 (en) | Methods and reagents for efficient and targeted delivery of therapeutic molecules to CXCR4 cells | |
TWI406946B (zh) | 用於胞內輸送之細胞穿透胜肽 | |
CN105377867A (zh) | I型干扰素的环状二核苷酸诱导 | |
CN102238965A (zh) | 选择性抗癌嵌合肽 | |
CN110248645A (zh) | 新型的基于外来体的抗癌剂 | |
US9757473B2 (en) | Cell-penetrating peptide and conjugate comprising same | |
CN110121506A (zh) | 条件活性多肽及产生它们的方法 | |
CN110023333B (zh) | 高亲和力的可溶性pd-1分子 | |
TW201117837A (en) | Oil body carriers, uses in target therapy and/or detection of the same, and fusion proteins comprised therein | |
CN107475275A (zh) | 嵌合抗原受体及其表达基因、双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的t细胞及其应用 | |
US20200223893A1 (en) | Therapeutic nanoconjugates and uses thereof | |
Manivannan et al. | Phage in cancer treatment–Biology of therapeutic phage and screening of tumor targeting peptide | |
CN107913284A (zh) | miRNA302‑367簇的微小RNA在靶向抑制血管新生和肿瘤生长的应用 | |
US8957186B2 (en) | Recombinant protein for intracellular delivery of siRNA and composition comprising the same | |
KR102274876B1 (ko) | 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도 | |
CN108383912A (zh) | 人工融合蛋白及其用途 | |
CN104119444B (zh) | 抗肿瘤融合蛋白及其制备方法和用途 | |
EP3842452A1 (en) | Scaffold proteins and therapeutic nanoconjugates based on nidogen | |
EP2108698A1 (en) | Vascular endothelial cell-binding peptide | |
CN108727472A (zh) | 带负电荷的细胞穿透肽及作为细胞内运送载体的用途 | |
CN105859841A (zh) | 一种双靶向嵌合肽及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用 | |
CN107841501A (zh) | 核酸分子ctl4hsh20、其制备方法及应用 | |
CN107841500A (zh) | 核酸分子ctl4hsh18、其制备方法及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140108 |