CN103789333A - 一种口服重组融合蛋白tat-map30及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种口服重组融合蛋白TAT-MAP30及制备方法和应用，利用基因工程技术将穿膜肽TAT和苦瓜素MP30结合，转化大肠杆菌，获得了一株可生产TAT-MAP30融合蛋白的基因工程菌，CCTCC NO:M2013546。获得的TAT-MAP30融合蛋白具有快速穿过中肠细胞膜的能力，能降低机体生物屏障、物理屏障和化学屏障对蛋白的损失，可作为口服药物用于脊椎动物和无脊椎动物抗细菌、抗病毒的预防和治疗，该融合蛋白的表达量高，易纯化，具有重要的应用前景和实际意义。

Description

一种口服重组融合蛋白TAT-MAP30及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因生物工程技术领域，具体涉及一种口服重组融合蛋白TAT-MAP30，还涉及一种口服重组融合蛋白TAT-MAP30的制备方法，还涉及一种能表达口服重组融合蛋白TAT-MAP30的基因工程菌株，以及一种口服重组融合蛋白TAT-MAP30的在抗菌、抗病毒中应用。

背景技术

MAP30蛋白

MAP30蛋白（mordtca anti-HIV protein of 30）共由286个氨基酸组成。其基因组由858个碱基构成，其中，包含一个独立的ORF阅读框，无内含子。前23个氨基酸为引导肽，在成熟的发挥功能的MAP30蛋白中没有检测到引导肽序列。

目前，MAP30蛋白能使细菌、病毒、肿瘤细胞的核糖体失活的具体机制尚未得到清晰阐述，但是研究推测，MAP30蛋白的作用机制主要是通过改变DNA的拓扑结构而使核糖体失活，比如对超螺旋DNA的切割作用，将其变为缺口环状及线状DNA，以阻碍蛋白质的合成。

苦瓜蛋白MAP30的生物学活性较多，主要包括以下几方面：抗病毒作用，对艾滋病毒、流感病毒、乙脑病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、肝炎病毒、柯萨奇病毒等均有抑制作用；抗肿瘤作用，对中枢神经系统肿瘤，黑色素瘤等均有抑制生长作用；降血糖作用，苦瓜素对于自发性高血糖小鼠，以及诱发性高血糖大鼠均能够起到促进胰岛素分泌，降低血糖浓度，推迟口服蔗糖后血糖升高时间和降低血糖最高峰值的作用；抗菌作用，对金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌均有一定的抑菌效果；抗生育作用；免疫原性等。MAP30蛋白的功效很多，还有待进一步探索。

TAT的研究背景

近年来发现有一些小分子的多肽可以介导外源物质穿过细胞膜，这种小分子多肽被称之为细胞穿膜肽（cell penetrating peptides,CPP）。许多CPP都是来源于某些直接与宿主细胞相互作用的病毒结构蛋白的蛋白转导结构域（protein transduction domains,PTD）。现在研究最多、应用范围最广的细胞穿膜肽（Trans-activating transcriptional activator,Tat）。Tat蛋白中存在3个功能结构域，分别是：位于N-端的酸性区，主要起反式激活的功能；位于第22-37位氨基酸之间的DNA结合区，该区域富含半胱氨酸；位于第47-60位氨基酸之间的碱性区，是主要的蛋白转导结构域，参与Tat蛋白的细胞内化作用。Schwarze发现位于Tat蛋白中第47-57位之间的11个氨基酸YGRKKRRQRRR不仅能够独立穿过细胞膜，而且其穿膜效率比全长的Tat蛋白还要高。这段多肽即是TAT穿膜肽。

不管是单独的TAT穿膜肽，或者是携带其他大分子物质如蛋白质、寡聚核苷酸或脂质体等，在穿膜时都可以表现出较高的穿膜活性。在携带外源物质穿膜时，TAT介导的穿膜似乎与其要携带的分子大小无关，100KD的蛋白质、40nm大小的纳米颗粒、甚至200nm大小的脂质体都可以经TAT运载入细胞内。而且，以这种方式运输到细胞内的脂质体甚至可以在进入细胞内1h后仍然可保持结构的完整性。相反的，没有与TAT穿膜肽连接的物质在与细胞共同孵育时均不能够进入细胞内。

TAT穿膜肽的序列中由于有6个精氨酸和2个赖氨酸残基，因此是带有高度正电荷的多肽。以不带电荷的丙氨酸替代其中的任何一个碱性氨基酸残基都会使穿膜活性降低，而替代序列中的其他氨基酸残基时穿膜活性则不会发生改变。这说明TAT穿膜肽所带的正电荷是其穿膜功能所必需的，因此推测这些正电荷很可能是能够与真核细胞的细胞膜发生强的静电作用，从而介导了穿膜过程。对TAT穿膜肽的亲和性分析发现，它能够与许多细胞膜表面的阴离子通过静电作用强烈地结合，与之结合的细胞表面分子可以是核仁素、蛋白聚糖等。精氨酸丰富的多肽可以穿过细胞膜，而其他氨基酸如赖氨酸、组氨酸等丰富的多肽却不具有此功能。然而，由精氨酸组成的支链聚合物与直链聚合物具有同样的穿膜效率。此外，研究发现TAT穿膜肽不会因为手性结构的改变而影响其穿膜活性，其手性分子与自然结构具有相同的穿膜活性。这说明这种细胞穿膜肽很可能不依赖于特定的结合位点。然而，多肽的长度是影响穿膜效率的重要因素。穿膜效率与精氨酸的个数有关，含有6个或者更多精氨酸的多肽要比含有少于5个精氨酸多肽的穿膜效率高一些，在多肽小于15个氨基酸时，穿膜效率会随着多肽大小的增加而增强。大于15个氨基酸的多肽虽然也可具有穿膜活性，但其效率却会明显减小。

尽管对于TAT穿膜肽的穿膜功能研究的比较多，但是到目前为止，关于TAT穿膜肽进入细胞的分子机制还没有完全研究清楚。早期研究认为是通过直接转运机制穿过细胞膜，且是不依赖于能量的，但最近的研究也有与这一观点不同的结果。尽管其进入细胞的机制还没有完全研究透彻，但TAT穿膜肽的应用已经十分广泛。

金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属（Staphylococcus），是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染，随着抗生素的滥用，耐药菌也越来越多，开发新的抗菌药物迫在眉睫。

金黄色葡萄球菌毒力较强，可以通过侵袭性和毒素性两种方式引起宿主疾病：一是在动物机体内扩散和增殖；二是产生外毒素和其他有害物质。金黄色葡萄球菌的毒力因子有表面结构蛋白、酶类和毒素三种。

金黄色葡萄球菌导致的侵袭性疾病，主要是引发机体局部（一般在皮肤中发生）或全身性的化脓性感染。局部感染分为两种：①包括毛囊炎、伤口化脓、疖等病变的皮肤性化脓感染；②包括气管炎、肺炎、骨髓炎、脓胸等病变的个别器官感染。全身性感染主要是由于金黄色葡萄球菌及其毒素侵入了血液，导致机体的脓毒血症、菌血症和败血症。由其引起的毒素性疾病主要是外毒素造成的，主要包括食物中毒（在夏季高发）、烫伤样皮肤综合症和毒性休克综合症。

金黄色葡萄球菌，属于革兰氏染色阳性菌，球形，显微镜下可见其排列呈葡萄串状，单个细菌较小，直径约为1um左右。金黄色葡萄球菌结构比较简单，没有芽孢和鞭毛，一般情况下无荚膜，但在体外培养时有时可观察到在菌体外层有粘液物质，发挥着同荚膜同样的保护性作用。在陈旧培养物中，在某些化学物质如氨苄西林存在时，或在细菌生长处于衰亡期时，此时镜检可发现金黄色葡萄球菌呈缺壁的L型，没有规则形态。

金黄色葡萄球菌对环境的抵抗能力较强，可以承受一定的干燥、高热和盐度。有实验表明，在干燥的浓汁中保存了2—3月的细菌仍然有活性。利用高温的方法杀死金黄色葡萄球菌，必须使其在60℃中保持1小时，或80℃中保持30分钟。金黄色葡萄球菌有一定的渗透压抵抗力，可以在NaCL浓度为100—150g/L的培养基中繁殖。

正因为以上特点，金黄色葡萄球菌感染和污染已经成为了一个世界性的难题。尤其是目前抗生素的滥用，导致耐药菌株越来越多，金黄色葡萄球菌中已经出现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MARSA），又名‖超级细菌―，一般抗生素（除了万古霉素）对此种菌株都无效果。因此，开发新的抗菌药物势在必行。

对虾白班综合征病毒（WSSV）

20世纪80年代以来，世界对虾养殖业高速发展，随着对虾养殖业规模化的生产，以及环境的日益破坏，其病害问题越来越突出，已经成为阻碍养殖业发展的重要因素。我国已经成为对虾和小龙虾养殖业大国。1993-1994年我国对虾病毒爆发流行，产量急剧减少，给我国对虾养殖业造成数十亿元的经济损失。其中主要包括以下几种病毒：对虾白斑综合症病毒（WSSV）；桃拉综合症病毒（TSV）和黄头症病毒（YHV）。其中WSSV是对虾养殖业危害严重的病原体之一。

虾白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV）自1992年首次在台湾爆发以来，先后分别在日本、东南亚、北美等国家爆发，在全球范围内对虾养殖业造成了巨大的经济损失。1995年，联合国粮油组织（FAO），国际兽药局（OIE）以及亚太地区水产养殖发展网络中心（NACA）将其列为需要报告的水生动物病毒性疫病之一。为了进一步控制该病原生物的感染，近年来各国专家学者们对白斑综合症病毒进行了深入研究，探讨了其形态结构、基因组成、分类学、感染宿主以及与病毒感染相关的蛋白。为防治WSSV感染提供了重要的理论依据。

WSSV是一种有囊膜的环状双链DNA病毒，其形态学与杆状病毒相似，呈长杆状，具有双层囊膜。完整的病毒粒子主要包括囊膜、核衣壳及病毒核心三部分。病毒经负染后在电子显微镜下可以观察到在囊膜一端延伸出尾状结构。在不同的分离株中，有囊膜包裹的病毒其长度约210-380nm，直径约70-167nm。除去囊膜的核衣壳部分，其长度约180-420nm，直径约54-85nm。自WSSV在全世界范围内爆发以来，ICTV现将WSSV列为新建的线头病毒科（Nimaviridae）、白斑病毒属（Whispovirus）的代表种。

WSSV有较广的宿主范围，除了可以感染虾、蟹类等甲壳动物外，桡足类及部分节肢动物也可以成为该病毒的传播者及携带者。许多十足目的甲壳动物都是WSSV的感染宿主。VP28蛋白最早是由van Hulten发现的，对VP28蛋白的结构分析可以发现，VP28蛋白的结构中存在5个潜在的N-糖基化位点，2个潜在的O-糖基化位点及9个可能的磷酸化位点。同时，在蛋白的N-端存在强疏水区，且这个区域中包含一个理论上的跨膜结构域。van Hulten第一次利用VP28蛋白的抗体中和实验证明了该蛋白与WSSV感染的早期过程有关(van Hulten,M.C.W.,Witteveldt,J.,Snippe,M.,Vlak,J.M..White spot syndrome virus envelope protein VP28is involved in the systemic infection of shrimp[J].Virology,2001b,285:228–233.)。在vanHulten的研究基础上，Yi进一步研究了VP28蛋白在WSSV感染过程中的具体作用，通过抗体中和实验、VP28蛋白的体外结合实验、VP28蛋白及WSSV与对虾血细胞结合的竞争ELISA等，进一步证明了VP28蛋白参与WSSV对虾细胞的吸附及侵入过程(Yi,G.,Wang,Z.,Qi,Y.,Yao,L.,Qian,J.,Hu,L..VP28of white spot syndrome virus is involved in the attachment andpenetration into shrimp cells[J].J.Biochem.Mol.Biol,2004,37:726–734.)。近年来研究发现能够与VP28蛋白相互作用的宿主细胞表面蛋白主要有PmRab7、HSP70(heat shock cognateprotein70)、STAT(signal transducer and activator of transcription)。近年来各国学者一直致力于对WSSV流行病学及致病机理的研究，以寻找防治WSSV感染的措施和方法。目前防治方法主要有利用免疫增强剂来调节增加对虾的抗病毒感染能力、利用中和抗体中和作用来阻断WSSV的感染、利用RNA干扰使特定基因沉默以减弱WSSV的感染、利用疫苗使对虾体内产生抗病的免疫效应。目前已经研究证明能够增强对虾抗WSSV感染能力的免疫增强剂主要有脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)、葡聚糖(Glucan)、肽聚糖(Peptidoglycan,PG)等。Westenberg研究了序列特异性及非特异性的siRNA对斑节对虾（Penaeus monodon）抗WSSV感染的保护作用(Westenberg,M.,Heinhuis,B.,Zuidema,D.,Vlak,J.M.siRNA injectioninduces sequence-independent protection in Penaeus monodon against white spot syndromevirus[J].Virus Res,2009,114:133–139)。Namikoshi的研究中以福尔马林作为灭活剂制备灭活疫苗，在肌肉注射福尔马林灭活的WSSV病毒10天后，进行病毒攻击实验，结果发现灭活的WSSV可以在虾体内产生保护作用，这表明一些囊膜蛋白能够在虾体内诱导产生免疫应答并保护虾抵抗WSSV的感染(Namikoshi A,Wu JL,Yamashita T,Nishizawa T,Nishioka T,ArmotoM,et al.Vaccination trials with Penaeus japonicus to induce resistance to white spot syndromevirus[J].Aquaculture,2004,229:25–35)。然而这种作用十分有限，在注射灭活WSSV病毒20天后就完全失去了保护作用。Zhu研究的灭活疫苗是以二乙烯亚胺（Binary ethylenimine，BEI）作为灭活剂的。BEI是由2-氯乙胺盐酸盐经环化作用而形成的，它可以使核苷酸烷基化，但是在较低的浓度（1mmol/L）下不会使蛋白分子受到破坏，因而以BEI作为灭活剂时WSSV的囊膜蛋白可以保持完整，能够在虾体内诱导产生免疫应答并保护虾抵抗WSSV的感染(FeiZhu,Huahua Du,Zhi-Guo Miao,Hai-Zhi Quan,Zi-Rong Xu.Protection of Procambarus clarkiiagainst white spot syndrome virus using inactivated WSSV[J].Fish&ShellfishImmunology.2009,26:685–690)。Witteveldt利用原核表达载体在大肠杆菌中分别对VP28及VP19蛋白进行重组表达，且重组蛋白N-端与麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein,MBP）融合表达。分别将纯化的VP28及VP19蛋白通过肌肉注射到对虾体内，同时分别以只注射MBP和生理盐水的对虾组作为对照。在肌肉注射后第2天及第25天分别进行病毒攻击实验，结果发现与对照组相比，VP28及VP19蛋白注射组存在较高的相对存活率。因此认为对虾对WSSV的结构蛋白存在一定的免疫应答，可以提高对虾抗WSSV感染的能力(Jeroen Witteveldt,Just M.Vlak,Marielle C.W.,van Hulten.Protection of Penaeus monodon against white spotsyndrome virus using a WSSV subunit vaccine[J].Fish&ShellfishImmunology.2004,16:571-579)。Du利用昆虫细胞表达系统来表达重组的VP28蛋白，重组蛋白经肌肉注射进入鳌虾体内。并注射后第10天进行病毒攻击实验，结果发现昆虫细胞表达的重组蛋白对鳌虾有较好的保护作用，与对照组相比，其相对致死率已经达到了92%(HuahuaDu,Zirong Xu,Xiaofeng Wu,Weifen Li,Wei Dai.Increased resistance to white spot syndromevirus in Procambarus clarkii by injection of envelope protein VP28expressed using recombinantbaculovirus[J].Aquaculture.2006,260:39–43)。Xu利用杆状病毒(HyNPV)表达系统在家蚕体内分别表达重组的VP28及VP19蛋白，并将带有重组蛋白的家蚕匀浆液包裹虾饲料，连续投喂克氏原鳌虾30天。投喂结束后即进行病毒攻击，结果发现与对照组相比，VP28蛋白组及VP19蛋白组的相对存活率分别为94.7%和89.5%。这说明与肌肉注射相比，口服的亚单位疫苗同样可以对克氏原鳌虾产生保护作用(Zirong Xu a,Huahua Du,Yaxiang Xu,Jianyi Sun,JianShen.Crayfish Procambarus clarkii protected against white spot syndrome virus by oraladministration of viral proteins expressed in silkworms[J].Aquaculture.2006:253,179–183)。Xu利用毕赤酵母（Pichia pastoris）对VP28及VP19蛋白进行真核表达，并将表达的重组蛋白经虾饲料包裹后投喂克氏原鳌虾。连续投喂25天后，分别在结束投喂后的第3天及第21天进行病毒攻击实验，结果发现与对照组相比，VP28及VP19蛋白投喂组存在较高的相对存活率。Fu利用枯草芽孢杆菌高效地分泌表达重组的VP28蛋白，并将表达的重组蛋白经虾饲料包裹后投喂中国对虾，连续投喂20天后，分别于第3天、14天、28天进行病毒攻击，结果发现与对照组相比，蛋白投喂组的相对存活率达到了83.3%。近年来开始有学者致力于研究口服的DNA疫苗。Rajesh(S.Rajesh Kumar,C.Venkatesan,M.Sarathi,V.Sarathbabu,John Thomas,K.Anver Basha,A.S.Sahul Hameed.Oral delivery of DNA construct using chitosan nanoparticles toprotect the shrimp from white spot syndrome virus(WSSV)[J].Fish&ShellfishImmunology.2009,26:6429–437.)以壳聚糖纳米颗粒作为转运载体，将带有vp28基因的DNA疫苗包裹在其中，并通过口服的方式免疫对虾。在免疫后第7、15、30天分别进行病毒攻击实验，并得到了较好的保护效果，相对存活率分别为85%、65%、50%。Ning(Jian-Fang Ning,WeiZhu,Jin-Ping Xu,Cong-Yi Zheng,Xiao-Lin Meng.Oral delivery of DNA vaccine encoding VP28against white spot syndrome virus in crayfish by attenuated Salmonella typhimurium.Vaccine[J].2009,27:1127–1135)以减毒的沙门氏菌作为转运载体，将带有vp28基因的真核表达载体pcDNA3.1转化入减毒的沙门氏菌中，并将重组菌以口服的方式免疫克氏原鳌虾。在免疫后第7、15、25天分别进行病毒攻击实验，结果得到的相对存活率分别为88.3%、66.7%和56.7%。

综上所述，关于利用苦瓜素抗医学病毒的研究已有许多报道，但利用TAT携带MAP30跨膜进入体内抗病毒还未见报道，若MAP30不能进入动物体内，也就很难达到控制和治疗动物病毒病的目的。而通过注射的方法，尤其是像水产动物，要想达到群体预防和治疗的目的，注射的方法显然是不可能实现的。

发明内容

本发明的目的是提供了一种TAT-MAP30融合蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。将TAT与MAP30融合表达，获得的TAT-MAP30融合蛋白快速穿过中肠细胞膜，减少机体生物屏障、物理屏障和化学屏障对蛋白的损失.可作为口服药物用于脊椎动物和无脊椎动物抗细菌、抗病毒的预防和治疗。

本发明的另一个目的在于提供了一种TAT-MAP30融合蛋白的制备方法，大肠埃希氏菌Escherichia coli BL21（DE3）pET-28a-TAT-MAP30，F^-ompT hsdS_B(r_B ^-m_B ^-)gal dcm(DE3)工程菌大量表达该融合蛋白，并使用镍柱纯化，方法简单，易行，适用于大规模生产。

本发明的另一个目的是在于提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，大肠埃希氏菌Escherichia coli BL21（DE3）pET-28a-TAT-MAP30，F^-ompT hsdS_B(r_B ^-m_B ^-)gal dcm(DE3)（以下简称为大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)–pET28a-TAT-MAP30）；CCTCC NO:M2013546。该菌株可以表达TAT-MAP30融合蛋白。表达量大且可溶，易于工业化生产，成本低，安全性好。

本发明还有一个目的是提供了一种TAT-MAP30融合蛋白在制备抑制金黄色葡萄糖球菌生长药物中的应用，TAT-MAP30重组蛋白对金黄色葡萄球菌的抑制效果明显,可有效避免金黄色葡萄糖球菌在临床上的耐药性。

本发明的最后一个目的在于提供了一种TAT-MAP30融合蛋白在制备抗对虾白斑综合征病毒药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种TAT-MAP30融合蛋白的制备方法：其步骤是：

1.MAP30基因和TAT序列的制备：

人工合成MAP30基因和TAT序列，MAP30的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，TAT核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。

2.TAT-MAP30融合基因的制备:

利用融合PCR技术，在MAP30基因序列的3‘端加入TAT序列，实现了两段基因序列的融合。

3.TAT-MAP30融合基因表达载体的构建：

用EcoR I和XhoI对TAT-MAP30序列和质粒pET28a(+)进行双酶切,并用T4连接酶连接，得到重组质粒TAT-MAP30-pET28a(+)

4.大肠杆菌基因工程菌的制备：

重组质粒TAT-MAP30-pET28a(+)经CaCl₂化学方法转化BL21(DE3)，经PCR鉴定，获得了基因工程表达菌Escherichia coli BL21(DE3)–pET28a-TAT-MAP30。

申请人于2013年11月4日将该菌送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏地址：中国武汉武汉大学，分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli BL21（DE3）pET-28a-TAT-MAP30，F^-ompT hsdS_B(r_B ^-m_B ^-)gal dcm(DE3)，CCTCC NO:M2013546。

通过上述方法获得了一种大肠杆菌基因工程菌株Escherichia coli BL21（DE3）pET-28a-TAT-MAP30。它具有如下特征：最适生长温度为37℃，菌落边缘整齐，表面有光泽、呈灰色。Escherichia coli BL21(DE3)以T7RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区域整合于BL21的染色体上。

5.基因工程融合蛋白的制备：

5.1发酵

①接种50ul Escherichia coli BL21(DE3)–pET28a-TAT-MAP30甘油菌种于20mlLB液体培养基中（Kan抗性），37℃200rpm培养过夜。

②第二天，按照4%的比例，即4ml发酵液于100ml培养基中（加100ul浓度为1mol/ml的Kan），于37℃200rpm的条件下培养大约2小时左右。

③当菌液OD600约为0.6时，取出三角瓶冰浴10分钟，再加入20ul浓度为1mol/ml的IPTG，于18℃200rpm的条件下诱导发酵20～24小时。

2.2提取可溶性重组融合蛋白

①将200mL Escherichia coli BL21(DE3)–pET28a-TAT-MAP30发酵液于室温8000rpm离心40分钟，收集湿菌体。

②用80mL Lysis Buffer重悬菌体，并将菌液转移至破碎杯中

③在低温高速离心机中，以4℃10000rmp的条件，将破碎液离心20分钟。

④收集上清，弃掉沉淀。

经镍柱纯化，透析，浓缩后即得一种TAT-MAP30融合蛋白,其序列为SEQ ID NO.2所示。

一种TAT-MAP30融合蛋白在制备抑制金黄色葡萄糖球菌生长药物中的应用，其应用过程是：

滤纸片法抑菌实验测定基因工程融合蛋白抑制金黄色葡萄球菌生长的情况以及MTT法测定TAT-MAP30对金黄色葡萄球菌的MIC值。

一种TAT-MAP30融合蛋白在制备抗对虾白斑综合征病毒药物中的应用，其应用过程是：

水产市场购买健康鳌虾（体重30g左右），实验设有阳性对照，病毒自孵育阴性对照组和TAT-MAP30共孵育组3组处理，每组处理各设三个重复。各处理养殖盒贴上相应标签，具体实施方法如下：

第一组（阳性对照）：每日分两餐喂食饲料，每盒每天共喂食4g饲料。两周后直接注射WSSV病毒

第二组（病毒自孵育阴性对照组）：每日分两餐喂食饲料，每盒每天共喂食4g饲料。两周后每只螯虾注射于28℃水浴锅中孵育1小时的病毒悬液。

第三组（病毒与TAT-MAP30重组蛋白共孵育组）：每日分两餐喂食饲料，每盒每天共喂食4g饲料。两周后每只螯虾注射病毒与TAT-MAP30重组蛋白共孵育于28℃水浴锅中1小时的病毒悬液。

检测鳌虾发病情况。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.利用大肠杆菌表达TAT跨膜域和苦瓜蛋白MAP30的融合蛋白，意在治疗类似金黄色葡萄球菌等抗性菌感染以及病毒感染、肥胖症、糖尿病等等。该工程蛋白不仅可用于无脊椎动物而且还可用于脊椎动物。

2.利用TAT的蛋白转导功能，引导苦瓜蛋白MAP30快速跨过肠细胞膜，减少机体生物屏障、物理屏障和化学屏障对蛋白的损失，快速进入循环系统。在实际应用中，可以通过经口给药的方式代替注射给药，使此工程蛋白不仅可用于无脊椎动物(如水产动物)而且还可用于脊椎动物（如家禽、猪马牛羊及人药）。

3.本发明制得的融合重组蛋白在克氏螯虾上的急性毒性实验和慢性毒性实验，证明此蛋白对无脊椎动物是安全的。

4.TAT穿膜肽目前还没有直接应用于养殖业，尤其是水产养殖业。但其独特的穿膜效率十分具有吸引力。解决了使药物不经肌肉注射而直接进入循环系统中，使其具有实际操作的可行性。本发明公开了TAT携带MAP30跨肠膜的实验过程，为其应用打下了理论基础，而且基因工程菌株的构建方法可以应用于大规模的养殖业中，表达量大，操作简单，成本低。

附图说明

图1为一种重组质粒TAT-MAP30-pET-28a(+)构建过程示意图。

图2为一种TAT-MAP30PCR结果示意图。

图3为一种重组质粒TAT-MAP30-pET28a(+)双酶切鉴定图。

图4为一种重组蛋白TAT-MAP30诱导表达示意图。

泳道1:蛋白Marker

泳道2：IPTG诱导前的TAT-MAP30-pET28a-BL21(DE3)破碎液上清

泳道3：IPTG诱导前的TAT-MAP30-pET28a-BL21(DE3)破碎液沉淀

泳道4：IPTG诱导后的TAT-MAP30-pET28a-BL21(DE3)破碎液上清

泳道5：IPTG诱导后的TAT-MAP30-pET28a-BL21(DE3)破碎液沉淀

泳道6：IPTG诱导后的pET28a-BL21(DE3)破碎液上清

泳道7：IPTG诱导后的pET28a-BL21(DE3)破碎液沉淀

泳道8：蛋白Marker

泳道9：乳糖自动诱导TAT-MAP30-pET28a-BL21(DE3)破碎液上清

泳道10：乳糖自动诱导TAT-MAP30-pET28a-BL21(DE3)破碎液沉淀

图5为一种TAT-MAP30重组蛋白对金黄色葡萄球菌的生长抑制实验。

图6为一种MTT法测重组蛋白TAT-MAP30对金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度。

图7为一种ELISA检测螯虾血淋巴中TAT-MAP30重组蛋白示意图。

图8为一种重组融合蛋白TAT-MAP30抗WSSV的作用示意图。

具体实施方式

本实验所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详细阐述的请参见《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等主编。

实施例1：

工程菌大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）pET-28a-TAT-MAP30的制备

1.MAP30基因和TAT序列的获得

人工合成MAP30基因的序列，其序列为SEQ ID NO.3所示。

TAT序列根据根据Dietz GP et al.Application of a blood-brain-barrier-penetrating form ofGDNF in a mouse model for Parkinson's disease.Brain Res.2006Apr12;1082(1):61-6.文献报道，委托生物公司合成TAT基因的全序列，并保存到T载体上，TAT序列为SEQ ID NO.4所示。

2.TAT-MAP30融合基因的获得

利用融合PCR技术，在MAP30基因序列的3‘端加入TAT序列，实现了两段基因序列的融合。为了通过重叠PCR技术，在MAP305‘端加入TAT，现设计引物如下:

说明：加粗处标记为酶切位点；下划线部分为重叠搭桥序列。

按照下列体系，进行PCR反应

反应条件如下

第一轮PCR以P1和P2做为引物，以合成的MAP30为模板；第二轮PCR以P1和P3作为引物，以第一轮PCR回收产物作为模板。PCR反应完毕，于1%琼脂糖凝胶中进行电泳，切胶，并回收，得到TAT-MAP30序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。

3.重组质粒TAT-MAP30-pET28a(+)的获得

用EcoR I和XhoI对TAT-MAP30序列和质粒pET28a(+)进行双酶切：

1）按照以下体系加样：

表2.4酶切反应体系

2）酶切条件：于水浴锅中37℃恒温酶切3～4个小时。

3）酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，切胶，用试剂盒回收。

进行连接反应：

1）使用Fermentas公司T4连接酶按照以下体系加样：

连接反应体系

2）连接条件：于水浴锅中4℃连接过夜。

获得重组质粒TAT-MAP30-pET28a(+)。

4.克隆菌Escherichia coli JM109–pET28a(+)-TAT-MAP30的获得

利用化学方法转化大肠杆菌JM109感受态细胞，以获得克隆菌Escherichia coli JM109–pET28a(+)-TAT-MAP30。

4.1大肠杆菌JM109感受态的制备

①用接种环挑取实验室-80℃低温保存的菌种，于LB琼脂平板进行划线，并于37℃恒温培养箱中培养15～17小时。

②挑取单菌落，接种于20mlLB液体培养基中培养过夜。

③接种200uL过夜培养物于20mlLB液体培养基中培养2～3h，至OD600为0.6左右。

④将培养物放于冰上冷却30分钟后，在超净工作台中取1.5ml培养物于EP管中，4℃12000rpm离心1分钟。

⑤完全弃掉上清。

⑥用200ul预冷的0.1M CaCl₂重悬菌体，反复轻轻吹吸数次，4℃12000rpm离心1分钟。

⑦弃掉上清，用200ul预冷的0.1M CaCl₂重悬菌体，并于冰上放置30分钟。

⑧4℃12000rpm离心1分钟。

⑨弃掉上清，用100ul预冷的0.1M CaCl₂重悬菌体。放于冰上备用。

4.2转化感受态细胞

①将连接产物全部加入已经制备好的感受态细胞中，反复吹吸几次混匀，冰浴30分钟。

②于水浴锅中42℃热激90秒，完毕立刻放置于冰上冷却2～5分钟。

③将所有菌液转移至浓度为30ug/ml卡那霉素的LB琼脂培养基上，并均匀涂布。④将平板于37℃恒温培养箱中正向放置1小时，待液体被充分吸收后倒置平板37℃培养12～15小时。

5.重组质粒TAT-MAP30-pET28a(+)正确性的鉴定

5.1菌落PCR鉴定

①挑取单菌落若干个，分别接种于200ul LB液体培养基（已加卡那霉素）中，37℃200rpm培养3～4小时。

②用引物P1和P3进行菌落PCR。反应体系如下

③跑胶鉴定。

5.2双酶切鉴定

①选出菌落PCR为阳性克隆的菌液，接种于20ml LB液体培养基中（已加氨苄），培养过夜。

②用试剂盒提取质粒。

③用EcoR I和XhoI进行双酶切。

④进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

5.3测序鉴定

选取双酶切鉴定阳性的克隆，送质粒到基因公司测序。

6.工程菌大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）pET-28a-TAT-MAP30的获得

挑选经测序鉴定正确的克隆，用CaCl₂化学方法转化BL21(DE3)（购自上海北诺生物科技有限公司）。

经PCR鉴定，获得了基因工程表达菌Escherichia coli BL21（DE3）pET-28a-TAT-MAP30，申请人于2013年11月4日将该菌送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏地址：中国武汉武汉大学，分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli BL21（DE3）pET-28a-TAT-MAP30，F^-ompT hsdS_B(r_B ^-m_B ^-)gal dcm(DE3)，CCTCC NO:M2013546。

实施例2：

重组融合蛋白TAT--MAP30的获得

1.重组融合蛋白TAT--MAP30表达的鉴定

用IPTG诱导工程菌Escherichia coli BL21（DE3）pET-28a-TAT-MAP30，经SDS-PAGE胶鉴定和Western-blotting鉴定，证明重组融合蛋白TAT-MAP30得到有效表达。具体方法如下：

①于20mL LB液体培养基中，接种50uL大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）pET-28a-TAT-MAP30甘油菌，培养过夜。

②按照4%的比例，接种800uL过夜培养物于20ml丰富培养基（2×YT）中，37℃200rpm培养至OD600约为0.6左右。

③将三角瓶冰浴10-20分钟。

④取1ML培养物作为阴性对照，剩余培养基中加入10ul IPTG（母液浓度为1mol/ml）,于20℃200rpm培养12～18小时。

⑤取1ml菌液，4℃12000rpm离心1分钟，弃上清。

⑥用500ul无菌水重悬菌体，并按照下列程序超声破碎，到菌液完全透明。

⑦将破碎液于低温高速离心机中，4℃12000rpm离心20分钟。

⑧取上清100ul放于新EP管中，其余弃掉，沉淀用1ml无菌水重悬，取重悬液100ul放于新EP管中。

⑨加入100ul2×loading Buffer,沸水中煮15分钟。

⑩完毕，将样品12000rpm离心1分钟，在浓度为12%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳检测（压缩胶中恒压80伏电泳，分离胶中恒压100伏电泳）。

2.重组融合蛋白TAT-MAP30的获得

通过对基因工程表达菌大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）pET-28a-TAT-MAP30的大量发酵，以及后续的镍柱纯化与浓缩，得到了浓度较高的重组蛋白。蛋白获得具体过程如下:

2.1发酵

①接种50ul大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）pET-28a-TAT-MAP30甘油菌种于20mlLB液体培养基中（Kan抗性），37℃200rpm培养过夜。

②第二天，按照4%的比例，即4ml发酵液于100ml培养基中（加100ul浓度为1mol/ml的Kan），于37℃200rpm的条件下培养大约2小时左右。

③当菌液OD600约为0.6时，取出三角瓶冰浴10分钟，再加入20ul浓度为1mol/ml的IPTG，于18℃200rpm的条件下诱导发酵20～24小时。

2.2提取可溶性重组融合蛋白

①将大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）pET-28a-TAT-MAP30发酵液于室温8000rpm离心40分钟，收集湿菌体。

②用80mL Lysis Buffer重悬菌体，并将菌液转移至破碎杯中，按照以下程序进行超声破碎。当菌液变得清亮时停止破碎。

③在低温高速离心机中，以4℃10000rmp的条件，将破碎液离心20分钟。

④收集上清，弃掉沉淀。

2.3镍柱纯化蛋白

①过滤：将提取到的上清液，用微孔滤膜（Φ25mm，0.45μm）在冰上进行过滤。

②镍柱的平衡：用10倍柱体积量的binding-buffer进行柱平衡。

③上样：在4℃冷柜中，以1mL/min的速度上样，并循环两次，以使蛋白上6-His标签能与Ni²⁺结合充分。

④20mmol咪唑漂洗：用含20mM咪唑的Wash Buffer洗脱柱子，其速率为1.5mL/min，以洗脱与Ni²⁺柱结合的非目的蛋白。

⑤40mmol咪唑漂洗：用含40mM咪唑的Wash Buffer洗脱柱子。同步骤4。

⑥目的蛋白的收集：用含250mM咪唑的Elution Buffer，按照0.25mL/min的速度洗脱柱子,以获得目的蛋白。用EP管收集洗脱液，直到洗掉所有蛋白。

2.4透析、浓缩蛋白

①PBS的透析：合并收集到的洗脱液，并将其装入透析袋（截留量为8～14kD），用PBS进行透析，透析24小时，每6小时换透析液一次。

②浓缩：透析完毕，将装有洗脱液的透析袋放于聚乙二醇20000中进行浓缩，至刚有蛋白析出为界，停止浓缩，此时蛋白终浓度为750ug/ml,其序列为SEQ ID NO.2所示，并将蛋白分装为100ul/管，存放于-20℃备用。

实施例3：

ELISA检测TAT-MAP30蛋白的穿肠功能

1.酶联免疫吸附测定（ELISA）相关溶液

显色液：

称取0.47g柠檬酸，0.92g Na₂HPO₄-12H₂O，定容至100ml，即配制成底物缓冲液。临用时于底物缓冲液中加入40mg邻苯二胺、0.1ml H₂O₂，混匀即可。

终止液：2mol/L的H₂SO₄。

PBS缓冲液：

分别称取8.5g NaCl、2.85g Na₂HPO₄-12H₂O、0.2g KCl、0.27g KH₂PO₄，加入去离子水定容至1000ml。

PBST缓冲液：

于1000ml PBS缓冲液中加入0.5-2ml吐温-20。

5%BSA：

称取0.5g BSA，溶于10ml PBST缓冲液中。

2.实验材料

实验用克氏原鳌虾（Cambarus clarkii）购自武汉市水产市场，体重15-20g左右，购回后饲养于本实验室，饲养温度26℃左右，同时每天喂食换水一次。新购买的鳌虾于实验室至少喂养十五天待鳌虾状态稳定后方可用于实验。

3.MAP30抗血清的制备与纯化

1.兔抗MAP30蛋白的抗血清的制备

①用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮肤；

②第一次免疫:用2ml注射器吸取抗原液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml；

③第二次免疫：间隔10-14天后，于两侧腋窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入抗原液，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml；

④间隔7-10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价。效价达到1∶16以上时放血；

⑤抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中，将三角烧瓶置37℃温箱1小时，再置4℃冰箱内3～4小时。待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15分钟，取上清加入0.02%叠氮钠，分装后置-70℃冰箱中保存备用。

2.利用Invitrogen公司的Protein A作为亲和层析介质纯化MAP30抗血清，具体步骤如下：

①取1ml抗血清用Protein A亲和层析专用的Binding Buffer稀释至10ml，于冷冻离心机中4℃、10,000rpm离心10min。

②取上清，并用0.4μm滤膜过滤，以备上样。

③用移液器吸取Protein A Sepharose^TMCL-4B填料装入层析柱至1ml，用大量去离子水冲洗填料，并用Binding Buffer平衡。

④将过滤好的样品借助恒流泵以一定的流速缓慢流过平衡好的填料，并将穿漏液重复上样两次。

⑤样品与填料充分结合后，用适量的Binding Buffer以一定的流速流过填料，流出液用蛋白核酸检测仪检测OD₂₈₀，待OD值持续为0时即停止洗涤。

⑥Elution Buffer以缓慢的速度流过填料洗脱IgGs，并将洗脱液分别收集于eppendorf管中。为了较好的保持IgGs的抗体活性，立即向每管洗脱液中加入100μL Neutralizing Buffer并混匀。

⑦SDS-PAGE电泳分析纯化的IgGs，测定IgGs的蛋白浓度。

4.抗凝血淋巴的制备

将纯化并已测定浓度的TAT-MAP30（750ug/ml）灌喂鳌虾，每只鳌虾灌喂100μL蛋白溶液。同时将只投喂PBS缓冲液的鳌虾作为阴性对照。1.5h后用1ml一次性无菌注射器于鳌虾的围心腔内取血淋巴100μL，并立即加入含有等体积抗凝剂的eppendorf管中，以防止血淋巴凝固。将血淋巴在离心机中于300g离心5min后，吸取上清液用于ELISA检测。

鳌虾血淋巴抗凝剂（27mmol/L柠檬酸、336mmol/L NaCl、115mmol/L葡萄糖-H₂O、9mmol/L EDTA）:分别称取7.74g柠檬酸、19.65g NaCl、22.77g葡萄糖-H₂O、3.35g EDTA-Na₂，加入适量去离子水使其完全溶解，并加入NaOH调pH至7.0，最后加入去离子水定容至1000ml。

5.双抗体夹心ELISA检测抗原

①将纯化的MAP30抗体于PBS缓冲液中稀释100倍，并于96孔酶标板中每孔加入100μL。将酶标板的小孔用封口膜封口后置于37℃恒温培养箱中温育2h，使抗体包被于酶标板底部。

②弃去酶标板小孔中的样品，于每空中加入100μL5%BSA，用封口膜封口后置于冰箱中4℃封闭过夜。

③甩干酶标板小孔中的封闭液，于每孔中加入300μL PBST缓冲液，浸泡5min，并间歇振动酶标板使洗涤更加充分。重复操作三次。

④分别吸取抗凝血淋巴100μL加入酶标板小孔中，同时以只加PBS缓冲液不加抗凝血淋巴的酶标板小孔作为空白对照。将酶标板的小孔用封口膜封口后置于37℃恒温培养箱中温育1h，使血淋巴中的抗原与包被在酶标板中的抗体充分结合。

⑤重复步骤③。

⑥将辣根过氧化物酶（HRP）标记的MAP30抗体于PBST缓冲液中稀释200倍，于酶标板小孔中每孔加入100μL。用封口膜封口后置于37℃恒温培养箱中温育1h，使HRP标记的MAP30抗体与抗原充分结合。

⑦重复步骤③。

⑧于酶标板小孔中每孔中加入300μL PBS缓冲液，浸泡5min，并间歇振动酶标板使洗涤更加充分。

⑨于酶标板小孔中每孔加入100μL显色液，用封口膜封口后于37℃恒温培养箱中避光显色20min。

⑩于酶标板小孔中每孔加入50μL终止液，终止显色反应。并用酶标仪在490nm波长下测定各孔的光吸收值。

结果见图7，鳌虾血淋巴中的TAT-MAP30浓度在口服TAT-MAP300.5h后即出现明显升高，到6.5h后血淋巴中基本检测不出TAT-MAP30蛋白。

实施例4：

滤纸片法抑菌实验测定基因工程融合蛋白抑制金黄色葡萄球菌生长的情况

1.实验准备

①从实验室超低温冰箱取出待试菌种，平板划线活化菌种。

②挑取单菌落，分别接种于LB液体培养基(不包含任何抗性)中，37℃过夜培养金黄色葡萄球菌。

③倒LB固体培养基平板，每个平板约为15～20ml培养基。

④对以上过夜培养物进行平板计数，并记录。

i用LB液体培养基对过夜培养物进行10^-6到10^-10稀释；

ii取每种浓度稀释菌液100ul，三角涂布棒充分涂布均匀，每个浓度梯度做三个平行对照；

iii37℃恒温培养12～16小时；

iv选取菌落数为30～200的平板进行计数，记录求平均数，得出结果。

2.抑菌实验

①分别将滤纸片、平板、镊子、三角涂布棒、平皿高温高压灭菌。

②倒LB固体培养基平板。

③取500ul浓度为1×10⁹上述细菌培养物，用已灭菌的三角涂布棒在培养基上涂布菌液，使菌液充分均匀分布。

④用灭菌小镊子夹取滤纸片分别充分浸透无菌水、浓度为0.1mg/ml的氨苄西林和TAT-MAP30纯化蛋白。

⑤涂布菌液10分钟后，待菌液被平板充分吸收，用灭菌镊子将滤纸片如下图所示贴于已涂布菌液的平板。

⑥倒置平板，并于37℃恒温培养12～16小时。

⑦观察并测量抑菌圈大小。

⑧当阳性对照组有明显抑菌圈，同时阴性对照组没有抑菌圈时，实验结果有效。否则，结果无效。

⑨重复以上实验6次，计算抑菌圈大小的平均值。

结果表明，重组融合蛋白TAT-MAP30对金黄色葡萄球菌有良好的抑制生长作用。结果见图5，抑菌圈平均半径为1.5cm。

实施例5：

MTT法测定TAT-MAP30对金黄色葡萄球菌的MIC值

1.MTT的配制（整个过程均在避光条件下进行）

①称取0.5gMTT，溶于100ml磷酸缓冲液。

②用0.22μm微孔滤膜过滤溶液，以除去细菌。

③分装为1ML/管，用锡箔纸包裹EP管，－20℃避光保存待用，一般存放时间不应超过15天。（MTT对实验者有害，因此在配制时应严格遵守戴手套操作的要求。）

2.MIC50的测定

①将过夜培养的金黄色葡萄球菌，稀释至10⁵CFU/ml。

②于96孔细胞培养板中，加入稀释菌液50ul/孔。

③设置阴性对照组（无菌水）和阳性对照组（氨苄西林），每组设3个复孔，实验组样品稀释为400ug/ml、200ug/ml、100ug/ml3组，每个组设3个复孔。

④阴性对照组、阳性对照组和实验组，每孔分别加样50ul。

⑤37℃恒温培养12～16小时。

⑥分别向每孔中加入5mg/ml MTT10ul,37℃恒温培养2小时，至反应完全。

⑦向各孔中加入90ulDMSO，反复吹打混匀，使蓝色晶体充分溶解（若结晶不易溶解，可在37℃恒温培养箱中放置半小时）。

⑧用酶标检测仪测定其OD570，并记录。

⑨重复以上实验6次，取平均值作图分析。

实验结果表明，当重组蛋白浓度大于400ug/ml时，抑菌效果比较明显；但是随着蛋白浓度的降低，抑制金黄色葡萄球菌生长的效果迅速降低，当蛋白浓度为200ug/ml时，金黄色葡萄球菌的生长抑制率不到20%，现象已经不再明显，结果见图6。

实施例6：

苦瓜蛋白TAT-MAP30对克氏螯虾急性毒性作用的研究

①将大小相同，重量均为30g左右的健康克氏螯虾分成4组，每组20只。

第一组为空白对照组；

第二组为PBS阴性对照组；

第三组为实验组I（每只螯虾肌肉注射200ug蛋白样品实验组）；

第四组为实验组II（每只螯虾肌肉注射400ug蛋白样品实验组）。

②第一组不做任何处理；第二组于第三腹节处肌肉注射灭菌生理盐水100ul;第三组于第三腹节处肌肉注射蛋白样品200ul;第四组于第三腹节处肌肉注射蛋白样品100ul。

③将实验虾只放于25℃恒温实验房里饲养，每天喂适当虾饲料，且换水一次，保持环境清洁，观察并记录螯虾的生理状态和死亡情况。

④如有螯虾死亡，立即做解剖观察，查看其肝、肌肉、腮、脾等内脏器官有无特殊病理变化。

⑤连续观察10天，第十天时解剖所有螯虾，观察其内脏器官有无病变。

⑥统计数据，并分析结果。

毒性作用：

以注射蛋白的当天的第二天为第一天算起，至第十天时，各组螯虾均无死亡，400ug/只注射组和200ug/只注射组的螯虾死亡率为0。第十天时，解剖所有的螯虾，观察其内脏器官，结果发现肝胰腺、心脏、胃肠、肌肉、鳃等组织均无明显异常。

虾内脏器官的毒理学变化：

在攻毒第十天，解剖所有实验螯虾，观察其内脏器官有无病变。结果证明，所有螯虾（包括对照组和实验组）的内脏器官均无明显毒理学变化。

实施例7：

苦瓜蛋白TAT-MAP30对克氏螯虾的慢性毒性实验

①将大小相同，重量均为30g左右的健康克氏螯虾分成组，每组20只。

第一组为空白对照组；

第二组为PBS阴性对照组；

第三组为实验组；

②第一组不做任何处理；第二组每隔24小时灌喂灭菌生理盐水100ul;第三组每隔24小时灌喂蛋白样品100ul，连续灌喂7天。

③将实验虾只放于25℃恒温实验房里饲养，每天喂适当虾饲料，且换水一次，保持环境清洁，观察并记录螯虾的生理状态和死亡情况。

④如有螯虾死亡，立即做解剖观察，查看其肝、肌肉、腮、脾等内脏器官有无特殊病理变化。

⑤连续观察28天，第28天时解剖所有螯虾，观察其内脏器官有无病变。

⑥统计数据，并分析结果。

至实验结束，未有实验螯虾死亡。解剖活虾也未见其明显的器官组织病变。

实施例8：

TAT-MAP30重组蛋白抗对虾白斑综合征病毒（WSSV）实验

（1）实验样品及来源

纯化的TAT-MAP30融合蛋白，制备方法如下：本发明所涉及的基因工程菌株大肠杆菌BL21（DE₃）pET-28a-TAT-MAP30经发酵，发酵液4000rpm离心20分钟，弃去上清，收集湿菌体。称取湿菌体，用5mM pH7.4的PBS重悬菌体，超声波破碎后离心取上清，再经过镍柱纯化和聚乙二醇20000浓缩，得到浓度约为400ug/ml的蛋白溶液。

WSSV悬浮液，武汉大学生科院病毒学国家重点实验室基因工程药物及昆虫病毒分子生物学研究室分离，经测序鉴定，与A simple and efficient method for purification of  intact white spot syndrome virus(WSSV)viral particles.Xie X,Li H,Xu L,YangF.Virus Res.2005Mar;108(1-2):63-7.中相符。

（2）实验条件

水产市场购买健康鳌虾（体重30g左右），每盒投放20尾（75×50×20），室内暂养，以备实验用。实验期间水温平均25-26℃。

（3）实验设计、调查及统计

实验设有阳性对照，病毒自孵育阴性对照组和TAT-MAP30共孵育组3组处理，每组处理各设三个重复。各处理养殖盒贴上相应标签，具体实施方法如下：

第一组（阳性对照）：每日分两餐喂食饲料，每盒每天共喂食4g饲料。两周后直接注射WSSV病毒1×10⁶拷贝。

第二组（病毒自孵育阴性对照组）：每日分两餐喂食饲料，每盒每天共喂食4g饲料。两周后每只螯虾注射100ul病毒1×10⁶拷贝于28℃水浴锅中孵育1小时的病毒悬液。

第三组（病毒与TAT-MAP30重组蛋白共孵育组）：每日分两餐喂食饲料，每盒每天共喂食4g饲料。两周后每只螯虾注射100ul病毒1×10⁶拷贝与TAT-MAP30重组蛋白75ug共孵育于28℃水浴锅中1小时的病毒悬液。

③调查及统计：逐日早晚观察记录（并打捞）各处理项目养殖盒内的死虾，统计累计死亡头数。实验结束后，统计各处理养殖箱内剩余的活虾,计算最后的存活率。保护效率见附图8所示，结果表明，阳性对照以及病毒与病毒自孵育组螯虾在3天后死亡率达到50%，4天后升值90%，而病毒与TAT-MAP30重组蛋白共孵育组螯虾在攻毒第七天才开始出现死亡，死亡率未超过10%。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  湖北肽洋红生物工程有限公司

 

<120>  一种口服重组融合蛋白TAT-MAP30及制备方法和应用

 

<130>  一种口服重组融合蛋白TAT-MAP30及制备方法和应用

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  825

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  1

atggatgtta acttcgattt gtcgactgcc actgcaaaaa cctacacaaa atttatcgaa     60

 

gatttccggg cgactcttcc atttagccat aaagtgtatg atatccctct cctgtattcc    120

 

actatttccg actcccggcg tttcatcctc ctcaatctca caagttatgc atatgaaacc    180

 

atctcggtgg ccatcgatgt gacgaacgtt tatgttgtgg cctatcgcac ccgcgatgta    240

 

tcctactttt ttaaagaatc tcctcctgaa gcttataaca tcctcttcaa aggtacgcgg    300

 

aaaattacac tgccatatac cggtaattat gaaaatcttc aaactgctgc acacaaaatc    360

 

cgggagaata ttgagcttgg actccctgcc ttgagtagtg ccattaccac attgttttat    420

 

tacaatgccc aatctgcgcc ttctgcattg cttgtactca tccagacgac tgcagaagct    480

 

gcacggttta agtatatcga gcggcacgtt gctaagtatg ttgccactaa ctttaagcca    540

 

aatctcgcca tcatcagctt ggaaaatcaa tggtctgctc tctccaaaca aatctttttg    600

 

gcgcagaatc aaggagcaaa atttcggaat cctgtcgacc ttatcaaacc taccggggaa    660

 

cggtttcaag taaccaatgt tgattcagat gttgtaaaag gtaatatcaa actcctgctg    720

 

aactcccggg ctagcactgc tgatgaaaac tttatcacaa ccatgactct ccttggggaa    780

 

tctgttgtga attatggtcg taaaaaacgt cgtcagcgtc gtcgt                    825

 

 

<210>  2

<211>  275

<212>  PRT

<213>  人工合成

 

<400>  2

 

Met Asp Val Asn Phe Asp Leu Ser Thr Ala Thr Ala Lys Thr Tyr Thr

1               5                   10                  15     

 

 

Lys Phe Ile Glu Asp Phe Arg Ala Thr Leu Pro Phe Ser His Lys Val

            20                  25                  30         

 

 

Tyr Asp Ile Pro Leu Leu Tyr Ser Thr Ile Ser Asp Ser Arg Arg Phe

        35                  40                  45             

 

 

Ile Leu Leu Asn Leu Thr Ser Tyr Ala Tyr Glu Thr Ile Ser Val Ala

    50                  55                  60                 

 

 

Ile Asp Val Thr Asn Val Tyr Val Val Ala Tyr Arg Thr Arg Asp Val

65                  70                  75                  80 

 

 

Ser Tyr Phe Phe Lys Glu Ser Pro Pro Glu Ala Tyr Asn Ile Leu Phe

                85                  90                  95     

 

 

Lys Gly Thr Arg Lys Ile Thr Leu Pro Tyr Thr Gly Asn Tyr Glu Asn

            100                 105                 110        

 

 

Leu Gln Thr Ala Ala His Lys Ile Arg Glu Asn Ile Glu Leu Gly Leu

        115                 120                 125            

 

 

Pro Ala Leu Ser Ser Ala Ile Thr Thr Leu Phe Tyr Tyr Asn Ala Gln

    130                 135                 140                

 

 

Ser Ala Pro Ser Ala Leu Leu Val Leu Ile Gln Thr Thr Ala Glu Ala

145                 150                 155                 160

 

 

Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Arg His Val Ala Lys Tyr Val Ala Thr

                165                 170                 175    

 

 

Asn Phe Lys Pro Asn Leu Ala Ile Ile Ser Leu Glu Asn Gln Trp Ser

            180                 185                 190        

 

 

Ala Leu Ser Lys Gln Ile Phe Leu Ala Gln Asn Gln Gly Ala Lys Phe

        195                 200                 205             

 

 

Arg Asn Pro Val Asp Leu Ile Lys Pro Thr Gly Glu Arg Phe Gln Val

    210                 215                 220                

 

 

Thr Asn Val Asp Ser Asp Val Val Lys Gly Asn Ile Lys Leu Leu Leu

225                 230                 235                 240

 

 

Asn Ser Arg Ala Ser Thr Ala Asp Glu Asn Phe Ile Thr Thr Met Thr

                245                 250                 255    

 

 

Leu Leu Gly Glu Ser Val Val Asn Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln

            260                 265                 270        

 

 

Arg Arg Arg

        275

 

 

<210>  3

<211>  792

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  3

atggatgtta acttcgattt gtcgactgcc actgcaaaaa cctacacaaa atttatcgaa     60

 

gatttccggg cgactcttcc atttagccat aaagtgtatg atatccctct cctgtattcc    120

 

actatttccg actcccggcg tttcatcctc ctcaatctca caagttatgc atatgaaacc    180

 

atctcggtgg ccatcgatgt gacgaacgtt tatgttgtgg cctatcgcac ccgcgatgta    240

 

tcctactttt ttaaagaatc tcctcctgaa gcttataaca tcctcttcaa aggtacgcgg    300

 

aaaattacac tgccatatac cggtaattat gaaaatcttc aaactgctgc acacaaaatc    360

 

cgggagaata ttgagcttgg actccctgcc ttgagtagtg ccattaccac attgttttat    420

 

tacaatgccc aatctgcgcc ttctgcattg cttgtactca tccagacgac tgcagaagct    480

 

gcacggttta agtatatcga gcggcacgtt gctaagtatg ttgccactaa ctttaagcca    540

 

aatctcgcca tcatcagctt ggaaaatcaa tggtctgctc tctccaaaca aatctttttg    600

 

gcgcagaatc aaggagcaaa atttcggaat cctgtcgacc ttatcaaacc taccggggaa    660

 

cggtttcaag taaccaatgt tgattcagat gttgtaaaag gtaatatcaa actcctgctg    720

 

aactcccggg ctagcactgc tgatgaaaac tttatcacaa ccatgactct ccttggggaa    780

 

tctgttgtga at                                                        792

 

 

<210>  4

<211>  33

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  4

tatggccgta agaaacgtcg tcagcgtcgt cgt                                  33

 

 

Claims (6)

1.一种合成的基因，其序列为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述基因编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述基因的基因工程菌：大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）pET-28a-TAT-MAP30 ，F^-  ompT hsdS _B (r _B ^- m _B ^- )gal dcm(DE3)；CCTCC NO: M2013546。

4.权利要求2所述蛋白的制备方法，其步骤为：

    1）诱导

 接种50ul 重组基因工程菌于20ml  Kan抗性的LB液体培养基中，37℃ 200rpm 培养过夜；

 第二天，按照4%的比例，即4ml发酵液于100ml培养基中，该培养基中加有100ul 浓度为1mol/ml的Kan，于37℃ 200rpm的条件下培养2小时；

 当菌液OD600约为0.6时，取出三角瓶冰浴10分钟，再加入20ul浓度为1mol/ml的IPTG，于18℃ 200rpm的条件下诱导发酵20～24小时；

2）提取可溶性重组融合蛋白

 将200mL 重组基因工程菌发酵液于室温8000rpm离心40 分钟，收集湿菌体；

 用80mL Lysis Buffer重悬菌体，并将菌液转移至破碎杯中；

 在低温高速离心机中，以4℃ 10000rmp的条件，将破碎液离心20分钟；

 收集上清，弃掉沉淀；

经镍柱纯化，透析，浓缩后即得一种TAT-MAP30融合蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示；

所述的重组基因工程菌为：大肠埃希氏菌Escherichia coli BL21（DE3）pET-28a-TAT-MAP30，F^-  ompT hsdS _B (r _B ^- m _B ^- )gal dcm(DE3)；CCTCC NO: M2013546。

5.权利要求1所述的基因或权利要求2所述蛋白在制备抑制金黄色葡萄糖球菌生长药物中的应用。

6.权利要求1所述的基因或权利要求2所述蛋白在制备抗对虾白斑综合征病毒药物中的应用。

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