CN105859841B - 一种双靶向嵌合肽及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用 - Google Patents
一种双靶向嵌合肽及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105859841B CN105859841B CN201610122787.8A CN201610122787A CN105859841B CN 105859841 B CN105859841 B CN 105859841B CN 201610122787 A CN201610122787 A CN 201610122787A CN 105859841 B CN105859841 B CN 105859841B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cxcr4
- cell
- sequence
- tumor
- tumour
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108091006116 chimeric peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 45
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 25
- 238000012546 transfer Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 claims abstract description 81
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 62
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 52
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 101000617130 Homo sapiens Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 claims abstract description 33
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims abstract description 22
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 58
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 12
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 108010061299 CXCR4 Receptors Proteins 0.000 claims description 7
- 102000012000 CXCR4 Receptors Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 5
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 claims description 5
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 3
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 claims 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims 1
- 208000029565 malignant colon neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 claims 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 claims 1
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 abstract description 9
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 abstract description 9
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 abstract description 8
- 230000005012 migration Effects 0.000 abstract description 6
- 238000013508 migration Methods 0.000 abstract description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 abstract description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 abstract description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 53
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 34
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 34
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 13
- 101710088580 Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 12
- 101100230376 Acetivibrio thermocellus (strain ATCC 27405 / DSM 1237 / JCM 9322 / NBRC 103400 / NCIMB 10682 / NRRL B-4536 / VPI 7372) celI gene Proteins 0.000 description 11
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 11
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 11
- 230000012223 nuclear import Effects 0.000 description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 9
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 8
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 5
- 230000005937 nuclear translocation Effects 0.000 description 5
- 230000006849 nucleocytoplasmic transport Effects 0.000 description 5
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 5
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 4
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 4
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 3
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 3
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101000990902 Homo sapiens Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 2
- NTEVEUCLFMWSND-SRVKXCTJSA-N Lys-Arg-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O NTEVEUCLFMWSND-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- ORVFEGYUJITPGI-IHRRRGAJSA-N Lys-Leu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ORVFEGYUJITPGI-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- YSPZCHGIWAQVKQ-AVGNSLFASA-N Lys-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN YSPZCHGIWAQVKQ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 2
- 208000001894 Nasopharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- RYQWALWYQWBUKN-FHWLQOOXSA-N Phe-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O RYQWALWYQWBUKN-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 2
- GOMUXSCOIWIJFP-GUBZILKMSA-N Pro-Ser-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GOMUXSCOIWIJFP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IIJWXEUNETVJPV-IHRRRGAJSA-N Tyr-Arg-Ser Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N)O IIJWXEUNETVJPV-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- XTAUQCGQFJQGEJ-NHCYSSNCSA-N Val-Gln-Arg Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N XTAUQCGQFJQGEJ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000002952 image-based readout Methods 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000003012 network analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-2-[chloro(diphenyl)methyl]benzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062307 AAVALLPAVLLALLAP Proteins 0.000 description 1
- FSNVAJOPUDVQAR-AVGNSLFASA-N Arg-Lys-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FSNVAJOPUDVQAR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 208000008720 Bone Marrow Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101150066398 CXCR4 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- FKXCBKCOSVIGCT-AVGNSLFASA-N Gln-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FKXCBKCOSVIGCT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- WSXNWASHQNSMRX-GVXVVHGQSA-N His-Val-Gln Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N WSXNWASHQNSMRX-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- 101000708741 Homo sapiens Transcription factor RelB Proteins 0.000 description 1
- PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N L-Arginyl-L-glutamin-acetat Natural products NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXXNVZMWHOLNRJ-AVGNSLFASA-N Met-Pro-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O WXXNVZMWHOLNRJ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 102000005395 NF-kappa B p50 Subunit Human genes 0.000 description 1
- 108010006401 NF-kappa B p50 Subunit Proteins 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010038802 Reticuloendothelial system stimulated Diseases 0.000 description 1
- 235000018259 Solanum vestissimum Nutrition 0.000 description 1
- 240000002825 Solanum vestissimum Species 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102100032727 Transcription factor RelB Human genes 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002159 nanocrystal Substances 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000505 pernicious effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- ZTRPYTHOEREHEN-UHFFFAOYSA-N piperazine pyridine Chemical compound N1CCNCC1.N1=CC=CC=C1.N1=CC=CC=C1 ZTRPYTHOEREHEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YIQPUIGJQJDJOS-UHFFFAOYSA-N plerixafor Chemical compound C=1C=C(CN2CCNCCCNCCNCCC2)C=CC=1CN1CCCNCCNCCCNCC1 YIQPUIGJQJDJOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002169 plerixafor Drugs 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 210000001243 pseudopodia Anatomy 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种双靶向嵌合肽及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用。所述嵌合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其靶向作用于CXCR4+肿瘤细胞，协同抑制肿瘤细胞内CXCR4/SDF‑1a功能轴和NF‑kB信号通路，降低CXCR4+肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。具体地，该嵌合肽由SDF‑1a的氮端序列和NF‑kB P50亚基的核定位序列（NLS）嵌合而成，通过氮端序列靶向识别肿瘤细胞表面受体CXCR4，抑制细胞内SDF‑1a/CXCR4功能轴作用；又作为穿膜肽促使NF‑kB p50亚基NLS序列有效进入肿瘤细胞，靶向抑制NF‑kB的入核转录过程，在研究多靶点抗肿瘤转移药物方面具有重要价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种双靶向嵌合肽及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用。
背景技术
肿瘤是当前危害人类健康的一类重大疾病，其典型特点是不受控制的增殖及转移。虽然在过去的几十年中，因手术、放化疗等方法的进步肿瘤治疗取得了长足的进展，但肿瘤转移导致的多器官性衰竭依然是肿瘤致死的主要原因，所以高转移性的肿瘤被称为恶性肿瘤。因此，针对新的作用靶点和作用机制，研发有效抑制肿瘤转移的药物是今后改善恶性肿瘤多器官转移的重要方向，也是整体改变肿瘤治疗现状的重要途径。
大量研究表明，乳腺癌，胃癌，前列腺癌，肝癌，宫颈癌等约23种具有高转移活性的癌细胞表面高表达趋化因子受体CXCR4，其特异性配体-趋化因子SDF-1（CXCL12）在人体肝脏，骨髓、肺等器官高表达。肿瘤细胞离开原发病灶后，通过血液/体液/淋巴系统到达高表达SDF-1a的器官组织，其表面受体CXCR4与SDF-1a发生特异性识别，激活下游信号通路，包括NF-κB信号通路的持续激活，促使肿瘤细胞产生伪足而具有迁移能力，并分泌细胞外基质金属蛋白酶MMP9，血管内皮生长因子（VEGF）等一系列分子帮助肿瘤细胞侵袭细胞外基质，从而促使肿瘤细胞在这些特异器官落巢，该过程与SDF-1a呈浓度依赖性，因此CXCR4+肿瘤通常会出现肝，骨髓和肺部的特异性转移（机制如图1所示）。实验证明CXCR4的抗体或拮抗剂（如AMD3100）或重组SDF-1a可有效抑制CXCR4+肿瘤细胞的特异性器官转移。由此说明，CXCR4/SDF-1的相互作用直接介导了肿瘤的特异性器官转移，是研究肿瘤转移抑制剂的重要靶点。
另外，核转录因子κB（NF-kB）是由NF-κB1（p50/p105），RELA（p65）和RELB等网状内皮组织增殖（Reticuloendotheliosis，REL）蛋白形成的一系列二聚体家族的总称，近年发现其在肿瘤发展过程中扮演关键角色。在多种血液和实体瘤中，NF-kB过度表达并通过多种途径被持续激活。活化后的NF-κB（主要以p65/p50亚基构成的二聚体形式存在）通过p50亚基的核定位序列（nuclear localization sequrence，NLS）与核质转运受体复合物（importin-a）结合，转运入细胞核，从而启动多种癌基因的转录，促进肿瘤细胞的恶性增殖、侵袭转移和凋亡逃逸等。在卵巢癌、结肠癌及胰腺癌等多种体内模型研究中，阻断NF-kB信号通路的不同环节均可有效发挥抗肿瘤作用。因此NF-kB信号通路已成为抗肿瘤药物作用的重要靶标。其中阻断NF-kB的入核转运过程即是有效抑制NF-kB信号通路活性的重要手段。
目前有大量研究作用于CXCR4/SDF-1功能轴和NF-kB信号通路的抑制剂用于抗肿瘤药物发现。例如CXCR4的内源性配体SDF-1a的衍生肽被用于研究抑制CXCR/SDF-1a相互作用或作为其他药物的引导肽靶向识别CXCR4+肿瘤细胞，但由于肿瘤细胞内的NF-kB信号通路的持续激活，CXCR4处于持续表达状态，因此单纯抑制CXCR4/SDF-1的相互作用较难发挥持续的作用。NF-kB P50亚基的碳端含有一段由5个碱性氨基酸构成的典型NLS（VQRKRQKLMP），能够特异性识别核转运受体（importin-a），引导NF-kB的入核转运。研究证明，合成P50的NLS作为多肽探针分子，能够特异性抑制内源性NF-κB的P50亚基与核转运受体复合物的键合，阻断NF-κB的核转运，抑制相关基因转录。但P50 NLS主要由碱性氨基酸构成，难以穿过脂质细胞膜进入胞内，因此生物利用度很低，难以直接作为药物使用。Hawiger等报道，由脂溶性穿膜肽序（the hydrophobic region/h-region，AAVALLPAVLLALLAP）与P50 NLS肽序构成的嵌合肽-SN50及其环肽分子，通过h-region的穿膜作用有效引导P50-NLS进入细胞，抑制NF-κB与核转运受体复合物的亲和作用，阻断NF-κB的核转运。但因为脂溶性穿膜肽能够穿透所有细胞膜，缺乏肿瘤靶向性，存在较大的毒副作用。因此，寻找对癌细胞具有特异性识别、并能有效携带P50 NLS进入细胞内的定向穿膜引导分子具有重要意义。
已有的报道中，针对CXCR4的抑制剂可实现对肿瘤细胞的靶向性，但对肿瘤细胞内其他靶点包括NF-kB信号通路没有抑制作用，抗肿瘤转移及增值的效果较低；而针对BF-kB信号通路的多肽药物研究，普遍存在生物利用度低的问题，需要加入一段穿膜肽，目前主要使用脂溶性穿膜肽作为进入细胞的引导肽，但这类分子没有肿瘤靶向性，相应的毒副作用显著。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中关于抑制肿瘤转移药物研究的缺陷和不足，提供一种双靶向嵌合肽及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用。该双靶向嵌合肽具有显著的双靶向协同作用，可有效靶向CXCR4+肿瘤细胞，并携带NF-kB信号通路的靶向抑制剂进入细胞，从而实现对SDF-1/CXCR4功能轴和NF-kB信号通路的双靶向协同抑制作用，在用于抗肿瘤转移药物的应用方面具有重要作用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种双靶向嵌合肽，所述双靶向嵌合肽的氨基酸序列由氮端序列和碳端序列两部分序列构成，所述氮端序列如SEQ ID NO.2所示，具体为KPVSLSYRSPSRFFESH，其特征为有效识别肿瘤细胞表面受体；所述碳端序列为能够有效识别NF-kB 核质转运受体的多肽分子。
优选地，所述碳端序列为NF-kB p50 亚基的入核转运序列（nuclearlocalization sequence，NLS），或其他能够有效识别NF-kB核质转运受体的多肽分子，如从噬菌体多肽库中筛选得到的可有效识别核质转运受体，且抑制NF-kB入核转运的多肽分子。
更优选地，所述为NF-kB p50 亚基的入核转运序列（nuclear localizationsequence，NLS），即所述碳端序列如SEQ ID NO.3所示，具体为VQRKRQKLMPK。
即优选地，所述双靶向嵌合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：KPVSLSYRSPSRFFESHVQRKRQKLMPK。
上述双靶向嵌合肽为28个氨基酸残基的多肽，其氮端序列即SEQID NO.2所示序列（KPVSLSYRSPSRFFESH）是取自SDF-1a序列的1位到17位氨基酸残基，其碳端序列即SEQIDNO.3所示序列（VQRKRQKLMPK）为NF-kB p50 亚基的入核转运序列（nuclear localizationsequence，NLS）。
上述双靶向嵌合肽的氮端序列具有靶向CXCR4并引起受体复合物内化的作用，实现整个分子对CXCR4+肿瘤细胞的靶向选择性，并引导碳端序列（来源NF-kB p50 亚基的NLS）进入肿瘤细胞；碳端序列则与细胞内的入核转运受体蛋白importin-a结合，从而有效抑制细胞内处于激活状态的NF-kB移位入核，进而抑制下游靶基因的表达，包括CXCR4，实现双靶向协同抑制作用。
另外，上述双靶向嵌合肽在制备靶向抗肿瘤药物中的应用，也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述抗肿瘤药物是指抗肿瘤转移药物。
更优选地，所述肿瘤为表达CXCR4受体的恶性肿瘤。进一步地，所述肿瘤为高表达CXCR4受体的恶性肿瘤。更进一步地，所述肿瘤细胞存在CXCR4高表达和NF-kB信号通路的持续激活。
更优选地，所述肿瘤为肺癌、胃癌、胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌或膀胱癌等表达CXCR4受体的恶性肿瘤。
上述双靶向嵌合肽对肿瘤转移的抑制作用是通过对CXCR4+肿瘤细胞中CXCR4+/SDF-1a功能轴和NF-kB信号通路的协同抑制作用来实现的。
另外，上述双靶向嵌合肽在制备协同抑制CXCR4+肿瘤细胞中CXCR4+/SDF-1a功能轴和NF-kB信号通路的药物中的应用，也在本发明的保护范围之内。
进一步地，上述对CXCR4+/SDF-1a功能轴的抑制包括细胞表面受体的内化和蛋白表达的降低；对NF-kB信号通路的抑制包括对NF-kB入核的抑制及下游基因的表达。
本发明实际上是在上述基础上提供了一种可用于治疗高表达CXCR4受体的肿瘤的转移的方法。具体地说是通过肿瘤细胞表面的趋化因子受体CXCR4实现对肿瘤靶向性，并通过协同抑制CXCR4/SDF-1a功能轴和NF-kB信号通路的活性，发挥双靶点抑制CXCR4+肿瘤细胞的转移，用于肿瘤的治疗。这一发明基于以下研究发现：（1）具有高转移活性的恶性肿瘤细胞（如乳腺癌，肺癌，胰腺癌，肝癌等）普遍高表达趋化因子受体CXCR4，其特异性配体SDF-1a在肝脏，肺，骨髓中高表达；研究表明CXCR4与SDF-1a的相互作用直接介导了肿瘤细胞特异性地向肝，肺及骨髓转移；CXCR4基因沉默或阻断CXCR4/SDF-1a的相互作用可有效抑制地肿瘤细胞的迁移活性；因此CXCR4成为高转移活性肿瘤细胞的有效靶点和标志分子；（2）SDF-1a 与CXCR4受体相互作用分析显示其氮端序列是受体识别和引起受体内化的重要结构区域；SDF-1a的1位到17位氨基酸序列组成的多肽分子，可有效识别CXCR4并引起受体内化，具有CXCR4受体部分激动剂的效果；（3）NF-kB信号通路在肿瘤细胞中处于持续激活状态，而CXCR4/SDF-1a的相互作用也与NF-kB的持续激活呈正相关；激活后的NF-kB（主要以p50/p65亚基组成的二聚体）进入细胞核并转录表达多种癌基因，也包括MMP9和CXCR4，促进肿瘤的生长和迁移；因此NF-kB信号通路和CXCR4/SDF-1a功能轴在肿瘤的转移过程中发挥协同作用。
研究证明，乳腺癌等细胞中持续活化的NF-κB通过特异性识别CXCR4启动子-66~+1的DNA序列，上调表达CXCR4，是肿瘤细胞高表达CXCR4的重要途径，直接参与了CXCR4/SDF-1a介导的癌细胞转移过程。因此我们发现， CXCR4/SDF-1a和NF-κB信号通路在肿瘤的增殖与转移过程中相互关联，具有协同作用，研究同时针对二者的双靶向分子将显示更强的抗肿瘤活性，设计多靶向的药物分子协同作用于上述两种信号通路将发挥更好地抗肿瘤转移作用。本发明克服了现有技术中缺陷：关于CXCR4/SDF-1a功能轴和NF-kB信号通路的抗肿瘤药物研究都为单一靶向的，没有考虑到二者在肿瘤细胞生长及转移过程中发挥的协同作用，无基于上述两种靶点的成功药物。本发明基于CXCR4/SDF-1功能轴和NF-kB信号通路在肿瘤生长和转移过程中的协同作用，开发了靶向作用于二者的多功能药物，即上述的双靶向嵌合肽，具有重要的意义。
发明人在设计了双靶向嵌合肽（SEQ ID NO.1）的同时，还合成了其他两个多肽分子，单独的VQRKRQKLMPk（SEQ ID NO.3）（NF-kB p50 亚基入核转运序列）和AAVALLPAVLLALLAPVQRKRQKLMPK（SEQ ID NO.4，即在SEQ ID NO.3序列的前面加了一段脂溶性穿膜肽）。设计这两个多肽的目的是为了确证（SEQ ID NO.3）是否能够进入细胞以及其对肿瘤细胞是否具有选择性。细胞实验结果显示SEQ ID NO.3不能独立进去任何细胞，而添加了脂溶性穿膜肽段的SEQ ID NO.4无选择性进入CXCR4+肿瘤细胞和非肿瘤CHO细胞。该结果进一步说明SEQ ID NO.1不仅保留了SDF-1a序列对CXCR4受体的选择性识别，而且也是有效地保障NF-kB信号通路抑制剂选择性进入肿瘤细胞发挥靶向抑制作用的有效手段。
该嵌合肽靶向作用于CXCR4+肿瘤细胞，协同抑制肿瘤细胞内CXCR4/SDF-1a功能轴和NF-kB信号通路，降低CXCR4+肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，具有抑制肿瘤转移过程的作用。CXCR4/SDF-1功能轴和NF-kB信号通路在肿瘤生长和转移过程中发挥协同作用，该嵌合肽由SDF-1a的氮端序列和NF-kB P50亚基的核定位序列（NLS）嵌合而成，通过SDF-1的氮端序列靶向识别肿瘤细胞表面受体CXCR4，抑制细胞内SDF-1a/CXCR4功能轴作用；又作为穿膜肽促使NF-kB p50亚基 NLS序列有效进入肿瘤细胞，靶向抑制NF-kB的入核转录过程，在制备双靶向抗肿瘤转移药物方面具有重要价值。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次提出利用双靶向嵌合肽实现对CXCR4+肿瘤细胞的靶向选择性并抑制肿瘤细胞转移活性的应用，首次提出利用双靶向抑制剂选择性识别具有高转移活性的CXCR4+肿瘤细胞，并通过协同抑制CXCR4/SDF-1功能轴和NF-kB信号通路活性，从而抑制肿瘤细胞向特异性器官（肝，肺和骨髓等）转移的抗肿瘤治疗方法。该方法具有作用靶点明确，且多靶点具有协同作用的特点，具有独特的抗肿瘤作用机制。
肿瘤转移目前是危害肿瘤患者生命健康的重要原因，目前原发肿瘤的放化疗技术已取得了较大进步，但肿瘤转移治疗目前尚无有效手段和方法。因此本发明提出的一种多靶向治疗CXCR4+肿瘤细胞转移的方法和手段，对恶性肿瘤的转移治疗提供了一种策略。
附图说明
图1为CXCR4/SDF-1介导的肿瘤特异性器官转移机制。
图2为不同细胞表面受体CXCR4的流式细胞分析图；图D和A为Hela细胞加PE标记的CXCR4单抗12G5和空白对照图；图E和B为A549细胞加PE标记的CXCR4单抗12G5和空白对照图；图F和C为CHO细胞加PE标记的CXCR4单抗12G5和空白对照图。
图3为双靶向嵌合肽(SEQ ID NO.1)进入不同细胞的荧光标记图；图A：肿瘤细胞A549，图B：中华仓鼠卵巢细胞CHO，图C和D分别为A549细胞和CHO细胞对多肽(SEQ ID NO.1)的FITC标记复合物的摄取情况。
图4为双靶向嵌合肽(SEQ ID NO.1)进入不同细胞的荧光标记图；图中，E和F分别为A549细胞和CHO细胞对多肽(SEQ ID NO.3)的FITC标记复合物的摄取情况，G和H分别为A459细胞和CHO细胞对多肽(SEQ ID NO.4)的FITC标记复合物的摄取情况。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下示例性实施例中未注明条件的实验方法可以按本领域内的常规实验方法进行，例如可以参考Sambrook等人的《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》（ColdSpring Harbor Laboratory Press,2000）。在以下实施例中，RPMI1640培养基和DMEM培养基如无特殊说明指在灭菌后加入10%灭活小牛血清,青霉素100 IU/mL，链霉素100 IU/mL。
术语解释：SDF-1a（CXCl2）：趋化因子，又称基质细胞衍生因子，是CXCR4的特异性配体。CXCR4：一种七次跨膜G-蛋白偶联受体。NF-kB：转录因子蛋白家族；P50 NLS：NF-kBP50亚基的核定位序列（nuclear localization sequence）。
实施例1 双靶向嵌合肽的合成及鉴定
1、本发明的具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的双靶向嵌合肽是通过Fmoc/tBu固相有机合成方法得到。得到的多肽可以通过与趋化因子受体CXCR4的靶向识别选择性进入CXCR4+肿瘤细胞，并有效抑制CXCR4+/SDF-1a功能轴和NF-kB信号通路。因此，根据本发明的多肽具有肿瘤细胞靶向及抑制肿瘤迁移作用，可以应用于肿瘤靶向治疗的药物中，如应用在靶向抗肿瘤转移药物体系中。
另外，发明人同时合成了其他两个多肽分子，单独的VQRKRQKLMP（SEQ ID NO.3）（NF-kB p50 亚基入核转运序列）和AAVALLPAVLLALLAPVQRKRQKLMPK（SEQ ID NO.4，即在SEQID NO.3序列的前面加了一段脂溶性穿膜肽）。设计这两个多肽的目的是为了确证（SEQ IDNO.3）是否能够进入细胞以及其对肿瘤细胞是否具有选择性。
2、具体地，本发明双靶向嵌合肽（以下也简称多肽）的合成及鉴定方法如下：
以CLTR 树脂（2-氯-三苯甲基氯树脂）为载体，Fmoc/tBu为氨基酸保护策略，20%哌啶/DMF为脱保护试剂，根据氨基酸序列进行耦合及脱保护反应，最后以95%的TFA/H2O把多肽分子从树脂上切除，通过高效液相分离纯化得到。详细实验步骤可以参照Chan W.C.《Fmoc solid phase peptide synthesis》（Oxford University press,2000）。
为便于利用荧光标记的方法检测多肽进入细胞的情况，在多肽序列的碳段耦合biotin分子，获得每个多肽分子的biotin标记多肽分子，经高效液相色谱和质谱鉴定为设计目的肽序，纯度均超过95%。具体合成工作由上海强耀生物有限公司合成完成。合成的肽序如下表1所示。
表1
实施例2双靶向嵌合肽靶向进入CXCR4+肿瘤细胞
1、多肽靶向进入CXCR4+肿瘤细胞
（1）流式细胞分析法鉴定CXCR4+/-表达细胞株
两种肿瘤细胞A549和Hela采用DMEM培养基，非肿瘤细胞CHO（中华仓鼠卵巢细胞CHO）采用RPMI1640培养基，于37℃ 5% CO2 培养箱中培养。在细胞状态良好时，加入胰酶消化，PBS清洗并进行细胞计数。每种细胞分别取2 x 100μl（含106个细胞），其中一份加入5μl含有PE标记的CXCR4单抗（PE-12G5），另一份为阴性对照。4℃避光孵育30min，流式细胞分析细胞表面受体数量。
图2中图D和E相比阴性对照显示，肿瘤细胞A549和Hela细胞高表达CXCR4受体，而非肿瘤细胞CHO CXCR4表达量较少。该实验结果与大量文献报道结果相近，所以，此三种细胞可以作为CXCR4+/-表达的典型细胞。
（2）高内涵筛选系统分析多肽选择性进入CXCR4+肿瘤细胞
为了表征多肽进入细胞的情况，在多肽碳端标记biotin，取biotin标记的三种多肽分子溶于DMSO，分别与avidin-FITC 以摩尔比1:1在40℃水浴中反应1h，利用biotion/avidin的强相互作用形成FITC标记的多肽复合物（荧光复合物）。用2μM FITC标记的多肽复合物加入96孔板中，于37℃分别孵育A549和CHO细胞2h。同时用2μM avidin-FITC 孵育两种细胞作为空白对照。用1 x PBS溶液清洗细胞2次，细胞洗后Hoechst染核，5mM的NaCl溶液洗掉非特异性结合于细胞表面的多肽复合物。采用Thermo 的高内涵筛选系统（型号：ArrayScanVTI）分别拍摄10个视野内的细胞，并进行数据统计分析。
（3）双靶向嵌合肽（SEQ ID NO.1）以及其他两种合成的多肽进入不同细胞的荧光标记图如附图3和图4。
图3中A和B 显示，在空白对照实验中，纯的avidin-FITC分子不会进入A549和CHO细胞。
图3中C和D分别为A549细胞和CHO细胞对多肽（SEQ ID NO.1）的FITC标记复合物的摄取情况。图C中的荧光明确表明，肿瘤细胞A549明显有效摄取多肽复合物，而非肿瘤细胞CHO几乎没有摄取多肽复合物。表明该双靶向嵌合肽（SEQ ID NO.1）分子对肿瘤细胞具有明显的靶向选择性。
图4中E和F分别为A549细胞和CHO细胞对多肽（SEQ ID NO.3）的FITC标记复合物的摄取情况。显示多肽分子即没有进入肿瘤细胞A549，也没有进入非肿瘤细胞CHO。
图4中G和H分别为A459细胞和CHO细胞对多肽（SEQ ID NO.4）的FITC标记复合物的摄取情况。显示该多肽分子无选择性地进入任何细胞。
以上结果明确显示，双靶向嵌合肽（SEQ ID NO.1）利用氮端肽序对CXCR4的特异性识别作用可选择性进入CXCR4+肿瘤细胞（肺腺癌细胞A549），而不进入CXCR4-细胞（中华仓鼠卵巢细胞CHO），且氮端肽序可作为靶向穿膜肽引导NF-kB信号通路的抑制剂进入肿瘤细胞，发挥对肿瘤细胞的特异性作用。
实施例3 肺腺癌细胞A549和宫颈癌Hela细胞的Transwell细胞迁移抑制试验
1、双靶向嵌合肽对肿瘤细胞的迁移抑制实验
（1）材料
迁移抑制实验采用12 孔聚苯乙烯培养板和transwell小室（Costor 3421 型）组成的迁移装置。上室底部覆盖聚碳酸酯膜，直径6.5mm，膜孔径5μm。
SDF-1α（100μg/ml，中山大学药学院分子生物学实验室马伟峰博士赠）溶于无菌去离子水中，-20℃保存。
肺腺癌细胞A549和宫颈癌Hela细胞。
（2）迁移抑制实验
在12孔细胞培养板和transwell小室中分别加入600μl和100μl DMEM培养液于37℃、5% CO2条件下平衡。30min后，吸掉培养液，在下室中分别加入混有SDF-1a（100ng/ml）和嵌合肽（SEQ ID NO.1）不同浓度（10μM、3μM、0.3μM）的600μl DMEM培养液。同时设阳性对照，即在下室中加入仅含SDF-1α（100ng/ml）的600μl DMEM培养液；阴性对照，即在下室中只加600μl DMEM培养液。
取生长状态良好的A549细胞和Hela细胞，调整细胞密度至106个/ml，分别取100μl加入8个transwell小室中，再把小室放入下室培养液中，整个培养板置于37℃、5% CO2 条件下4h。
之后轻轻移走transwell小室，用倒置显微镜观察迁移至下室的细胞数，记录下室5 个视野中的细胞数，取平均值。
2、多肽（SEQ ID NO.1）对两种肿瘤细胞的迁移抑制效率如表2所示。
表2 多肽（SEQ ID NO.1）对两种肿瘤细胞的迁移抑制效率
实验结果表明，在肺腺癌细胞A549和宫颈癌Hela细胞的Transwell细胞迁移抑制试验中，嵌合肽（SEQ ID NO.1）可有效抑制SDF-1a（100ng/ml）可有效引起肿瘤细胞从上室迁移至下室，在3μM浓度下即可抑制50%以上的肿瘤细胞迁移，表明本发明的双靶向嵌合肽分子具有抑制肿瘤细胞迁移的能力。
实施例4双靶向嵌合肽转运入核实验
1、嵌合肽进入细胞后的入核转移效率
同样利用FITC标记的多肽复合物孵育不同细胞，并对细胞核进行染色，然后采用高内涵系统分析细胞核内荧光强度与细胞质中的荧光强度，计算二者差值，以分析分子入核的效率。
2、实验结果
如表3所示，高内涵荧光数据分析得到的核内平均荧光数-胞浆平均荧光数值，用于反映分子的入核转移情况。
表3 多肽进入不同细胞后的入核转移效率
表中数据显示嵌合肽（SEQ ID NO.1）在肿瘤细胞内的入核效率显著高于CHO细胞，而多肽（SEQ ID NO.4）无选择性进入A549和CHO细胞后，二者的入核效率存在明显差异。
综上所述，以上结果表明，本发明的多肽分子（SEQ ID NO.1）进入肿瘤细胞后，高效率地转运入核，其在核内分布量高于胞浆分布量，说明其高效识别核质转运受体蛋白importin-a，转运入核，可有效抑制NF-kB的入核转运，从而抑制下游靶基因的转录表达。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种双靶向嵌合肽及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> 双靶向嵌合肽的氨基酸序列
<400> 1
Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Ser Pro Ser Arg Phe Phe Glu Ser
1 5 10 15
His Val Gln Arg Lys Arg Gln Lys Leu Met Pro Lys
20 25
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 双靶向嵌合肽的氮端序列
<400> 2
Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Ser Pro Ser Arg Phe Phe Glu Ser
1 5 10 15
His
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 双靶向嵌合肽的碳端序列
<400> 3
Val Gln Arg Lys Arg Gln Lys Leu Met Pro Lys
1 5 10
<210> 4
<211> 27
<212> PRT
<213> 合成对比序列
<400> 4
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10 15
Val Gln Arg Lys Arg Gln Lys Leu Met Pro Lys
20 25
Claims (8)
1.一种双靶向嵌合肽，其特征在于，所述双靶向嵌合肽的氨基酸序列由氮端序列和碳端序列两部分序列构成，其氮端序列如SEQ ID NO.2所示，具体为KPVSLSYRSPSRFFESH；所述碳端序列如SEQ ID NO.3所示，具体为VQRKRQKLMPK。
2.根据权利要求1所述双靶向嵌合肽，其特征在于，所述双靶向嵌合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：KPVSLSYRSPSRFFESHVQRKRQKLMPK。
3.权利要求1所述双靶向嵌合肽在制备多靶向抗肿瘤药物中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物是指抗肿瘤转移药物。
5.根据权利要求3或4所述应用，其特征在于，所述肿瘤为表达CXCR4受体的恶性肿瘤。
6.根据权利要求3或4所述应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌、胃癌、胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌或膀胱癌。
7.权利要求1所述双靶向嵌合肽在制备协同抑制CXCR4+肿瘤细胞中CXCR4+/SDF-1a功能轴和NF-kB信号通路的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，对CXCR4+/SDF-1a功能轴的抑制包括细胞表面受体的内化和蛋白表达的降低；对NF-kB信号通路的抑制包括对NF-kB入核的抑制及下游基因的表达。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610122787.8A CN105859841B (zh) | 2016-03-04 | 2016-03-04 | 一种双靶向嵌合肽及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610122787.8A CN105859841B (zh) | 2016-03-04 | 2016-03-04 | 一种双靶向嵌合肽及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105859841A CN105859841A (zh) | 2016-08-17 |
| CN105859841B true CN105859841B (zh) | 2019-09-20 |
Family
ID=56625283
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610122787.8A Active CN105859841B (zh) | 2016-03-04 | 2016-03-04 | 一种双靶向嵌合肽及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105859841B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113490517B (zh) * | 2021-04-27 | 2022-04-19 | 北京博辉瑞进生物科技有限公司 | 一种嵌合肽修饰的sis膜、其制备方法及应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103501818A (zh) * | 2011-01-13 | 2014-01-08 | 巴塞罗那自治大学 | 用于高效及靶向递送治疗性分子至cxcr4细胞的方法和试剂 |
-
2016
- 2016-03-04 CN CN201610122787.8A patent/CN105859841B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103501818A (zh) * | 2011-01-13 | 2014-01-08 | 巴塞罗那自治大学 | 用于高效及靶向递送治疗性分子至cxcr4细胞的方法和试剂 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Development of a receptor-targeted gene delivery system using CXCR4 ligand-conjugated cross-linking peptides.;Anna Egorova et al.;《THE JOURNAL OF GENE MEDICINE》;20141231;第16卷;336-351 * |
| From willow bark to peptides: the ever widening spectrum of NF-kB inhibitors.;Fulvio D’Acquisto and Angela Ianaro;《Current Opinion in Pharmacology》;20061231;第6卷;387-392 * |
| Potential of CXCR4/CXCL12 Chemokine Axis in Cancer Drug Delivery.;Yan Wang et al.;《Curr Pharmacol Rep》;20160104;第2卷;1-10 * |
| Study of modular peptide-based vechicles for targeted gene delivery;Bogacheva M.S.et al.;《Human Gene Therapy》;20131231;全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105859841A (zh) | 2016-08-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2843470C (en) | Brain tumor targeting peptides and methods | |
| CA2781318C (en) | Brain tumor targeting peptides and methods | |
| US7914780B1 (en) | Aminopeptidase A (APA) targeting peptides for the treatment of cancer | |
| CN102264755A (zh) | 靶向vegfr-1/nrp-1的肽 | |
| CN107082805A (zh) | 抗转移疗法中axl信号传导的抑制 | |
| CN105198964A (zh) | 一种肿瘤靶向多肽、其制备方法及应用 | |
| KR101750549B1 (ko) | 암 세포 표적용 펩타이드 및 이의 용도 | |
| MX2010014173A (es) | Peptidos de señalizacion de la crkl. | |
| US7642063B2 (en) | Methods for targeting and killing glioma cells | |
| Lingasamy et al. | Homing peptides for cancer therapy | |
| TW201247710A (en) | Tumor-targeting peptides and their uses in detecting and treating cancers | |
| CN105085631A (zh) | 一种特异靶向her2蛋白的多肽及其应用 | |
| CN101918433B (zh) | 肝细胞癌细胞特异性的肽及其应用 | |
| CN105859841B (zh) | 一种双靶向嵌合肽及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用 | |
| Lau et al. | Peptide ligands targeting integrin α3β1 in non-small cell lung cancer | |
| US20150071855A1 (en) | Egfl7 targeting and/or binding polypeptides and methods for inhibiting angiogenesis | |
| US6974791B2 (en) | Endothelial specific targeting | |
| KR101836468B1 (ko) | 상피-중간엽 이행 세포 표적용 폴리펩타이드 및 이의 용도 | |
| WO2020000634A1 (zh) | 一种与cd105特异性结合的多肽及其应用 | |
| Choi et al. | Dual-function synthetic peptide derived from BMP4 for highly efficient tumor targeting and antiangiogenesis | |
| CN111138515B (zh) | 一种靶向FGFRs的抗肿瘤小分子多肽及应用 | |
| KR101024702B1 (ko) | 비 세포 림포마(라지) 표적 저분자 결합 유도 펩타이드 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |