KR101836468B1 - 상피-중간엽 이행 세포 표적용 폴리펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

상피-중간엽 이행 세포 표적용 폴리펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 상피-중간엽 이행(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT) 세포 표적용 폴리펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 명세서에서 일반식(I)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며 EMT 세포와 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 EMT 세포 검출용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 영상화용 조성물 등에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 EMT 세포를 특이적으로 표적하여 생체 내에서 실시간으로 암 전이 및 기관의 섬유화를 모니터링을 할 수 있어 효과적이다.

Description

상피-중간엽 이행 세포 표적용 폴리펩타이드 및 이의 용도 {Polypeptides for targeting epithelial-mesenchymal transition cells and uses thereof}
본 출원은 2015년 5월 28일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2015-0075161호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 상피-중간엽 이행(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT) 세포 표적용 폴리펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 명세서에서 일반식(I)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, EMT 세포와 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 EMT 세포 검출용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 영상화용 조성물 등에 관한 것이다.
상피-중간엽 이행(Epithelial-Mesenchymal Transition, 이하 EMT)은 상피 세포가 침투와 운동성을 띄는 중간엽 세포로 변화는 것이다. EMT는 TGF-beta와 Wnt 등 성장 인자를 포함한 다양한 세포신호 인자에 의해 유도된다. 이 신호인자 중 TGF-beta는 가장 널리 알려진 EMT의 유도자로 연구되었다. 이 과정에서 상피 세포들은 세포간 연접과 세포 극성을 잃으며, 상피 세포 마커인 E-cadherin의 발현이 감소되고 중간엽 세포의 마커인 vimentin, N-cadherin과 a-SMA의 발현이 증가한다.EMT 세포는 주로 치유되고 있는 상처부위, 암 전이가 발생하는 부위 및 기관의 섬유화가 발생하는 부위에서 관찰된다. 따라서 EMT 세포를 감지할 수 있다면, 상기 질병 발생 부위에 대하여 모니터링이 가능해진다.
전이 암은 암으로 인한 사망의 중요한 원인이 된다. 암으로 처음 진단 받은환자의 약 1/3은 진단 당시에 전이 암도 같이 발견된다. 따라서 암 치료도 중요하지만 암의 전이를 막는 것 또한 최근 연구자들의 중요한 과제이다. 전이 암 진단 방법으로는 신체검사나 각종 영상 검사(방사선, CT, MRI, 초음파, 핵의학, PET), 혈액검사와 조직검사 등이 있다. 하지만 아직까지 전이 암 또는 EMT 세포를 타겟으로 미세한 전이까지 진단하는 방법에 대해서 후속적인 연구가 필요한 실정이다. 또한, 기관의 섬유화 현상은 장기의 일부가 굳는 현상으로, 폐섬유화 및 간섬유화가대표적이다. 현재까지 완치 방법이 거의 없어, 조기에 섬유화를 진단할 수 있는 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.
한편, 폴리펩타이드 및 단백질의 파지 디스플레이(phage display)는 타겟 세포에 대한 특이적인 리간드(ligand)를 확인하는데 매우 유용한 방법이며, 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo)상에서 특정 세포를 표적으로 하는 폴리펩타이드 및 단백질을 발굴하는데 널리 사용되어지고 있다. 대표적으로 생쥐모델의 파지 라이브러리(phage library)에서 인비보 파지 스크리닝(in vivo phage screening)을 이용하여 RGD, GSL 및 NGR 모티프가 혈관신생이 활성화된 상피세포 종양에서 활성화되는 인테그린(integrin), VEGF 수용체, MMP 등에 특이적으로 결합하며(Pasqualini R et al., Ann Hematol. 2002;81: S66-S67), 전립선 혈관의 IL11 수용체 및 유방암의 미소혈관에서 발현되는 것을 확인하였다(Arap W et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA . 2002;1527-31). 하지만 이러한 연구 결과들은 EMT가 진행되는 세포를 선택적으로 확인할 수 있는 파지를 제공하지는 못하였다. 따라서 EMT 세포에 특이적으로 발현되는 표적을 타겟으로 하는 폴리펩타이드 및 단백질의 개발이 필요한 상황이다.
이에 본 발명자들은 파지 폴리펩타이드 디스플레이 기술을 이용하여 암의 전이에 사용될 수 있는 폴리펩타이드를 개발하기 위하여 연구를 거듭하던 중, EMT 세포에 특이적인 폴리펩타이드를 개발하였으며, 형광물질을 함께 표지하여 치료 및 진단에 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 다음의 서열 일반식(I)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 상피-중간엽 이행(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT) 세포와 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 이의 용도를 제공하는 것이다;
(I)[아미노 말단-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7- 카복시 말단]
상기 X1은 발린, 알라닌 및 트레오닌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X2는 알라닌, 프롤린, 세린, 이소류신, 트레오닌 및 피롤라이신으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X3은 글라이신, 피롤라이신, 프롤린, 이소류신, 트레오닌 및 아스파르트산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X4는 트레오닌, 세린, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X5는 프롤린, 메티오닌, 세린, 트립토판, 아스파라긴 및 발린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X6은 발린, 아르기닌, 메티오닌, 세린, 류신 및 이소류신으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X7은 트레오닌, 세린, 메티오닌, 라이신, 트레오닌 및 발린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산.
본 발명의 다른 목적은, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, EMT 세포에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 EMT 세포 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, EMT 세포를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, EMT 세포에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 EMT 세포 특이적 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, EMT 세포에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 EMT 세포 영상화용 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 다음의 서열 일반식(I)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 상피-중간엽 이행(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT) 세포와 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 제공한다;
(I)[아미노 말단-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7- 카복시 말단]
상기 X1은 발린, 알라닌 및 트레오닌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X2는 알라닌, 프롤린, 세린, 이소류신, 트레오닌 및 피롤라이신으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X3은 글라이신, 피롤라이신, 프롤린, 이소류신, 트레오닌 및 아스파르트산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X4는 트레오닌, 세린, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X5는 프롤린, 메티오닌, 세린, 트립토판, 아스파라긴 및 발린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X6은 발린, 아르기닌, 메티오닌, 세린, 류신 및 이소류신으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X7은 트레오닌, 세린, 메티오닌, 라이신, 트레오닌 및 발린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 상피-중간엽 이행(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)된 세포 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (a) 제1항의 폴리펩타이드를 시료와 혼합하는 단계; (b) 미결합되거나 비특이적으로 결합된 상기 폴리펩타이드를 제거하는 단계; 및 (c) 상기 폴리펩타이드의 결합 여부 및 위치를 확인하는 단계를 포함하는 상피-중간엽 이행(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)된 세포의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 상피-중간엽 이행(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT) 세포 특이적 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 상피-중간엽 이행(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT) 세포 영상화용 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서에서 용어 "폴리펩타이드(polypeptide)"는 "단백질" 또는 “펩타이드(peptide)"와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
본 발명에서 "폴리뉴클레오타이드" 또는 “핵산”은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오타이드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오타이드의 공지된 아날로그도 포함된다.
본 명세서에서 용어 "발현(expression)"이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미한다.
본 명세서에서 용어 “암(cancer)”이란 대개 조절되지 않은 세포 성장/증식의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내며, “종양(tumor)”으로 대체되어 사용될 수 있다. 암의 예는 암종, 림프종(예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 암의 보다 특정한 예는 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포암, 위장관암, 췌장암, 신경아교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 직장결장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프증식성 질환, 및 다양한 종류의 두경부암을 포함한다.
본 명세서에서 용어 “섬유화(fibrosis)”란 어떠한 이유로 장기의 일부가 굳는 현상을 말하며, 이에 한정되지는 않지만, 간 섬유화, 심방 섬유화, 근육 섬유화, 폐 섬유화 등이 있다.
본 명세서에서 용어 “EMT”이라 함은 Epithelial-Mesenchymal Transition의 줄임말로 상피-중간엽 이행으로 표시될 수 있다. EMT는 상피 세포가 침투와 운동성을 띄는 중간엽 세포로 변화하는 것을 의미하며, 전이 암 또는 섬유화가 발생할 때 나타나는 현상이다.
본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다:
A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp):아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라긴; O(Ply)피롤라이신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르기닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 트레오닌; U(Sec):셀레노시스테인, V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 티로신.
본 발명은 다음의 서열 일반식(I)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 상피- 중간엽 이행( Epithelial - Mesenchymal Transition , EMT )된 세포와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다;
(I)[아미노 말단- X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - 카복시 말단]
상기 X1 은 발린, 알라닌 및 트레오닌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X2는 알라닌, 프롤린, 세린, 이소류신 , 트레오닌 및 피롤라이신으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X3 은 글라이신, 피롤라이신 , 프롤린, 이소류신 , 트레오닌 및 아스파르트산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X4 는 트레오닌, 세린, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X5 는 프롤린, 메티오닌, 세린, 트립토판, 아스파라긴 및 발린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X6 은 발린, 아르기닌, 메티오닌, 세린, 류신 및 이소류신으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X7 은 트레오닌, 세린, 메티오닌, 라이신, 트레오닌 및 발린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이다.
바람직하게 본 발명의 폴리펩타이드는, 상기 서열 일반식(Ⅰ)에 대하여 상기 X1은 트레오닌 또는 알라닌이며; 상기 X2는 이소류신 또는 트레오닌이며; 상기 X3은 이소류신 또는 트레오닌이며; 상기 X4는 트레오닌 또는 트립토판이며; 상기 X5는 트립토판 또는 아스파라긴이며; 상기 X6은 세린 또는 류신이며; 상기 X7은 라이신 또는 트레오닌인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드일 수 있다.
더욱 바람직하게 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 서열로 표시되는, 상피-중간엽 이행(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)된 세포에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드일 수 있다.
상기한 바와 같이 특수 조합의 아미노산 서열로 구성되는 본 발명의 폴리펩타이드는 EMT 세포를 특이적으로 표적하는 것이 특징이다.
본 발명의 EMT 세포 특이적 폴리펩타이드는 in vitro 및 in vivo에서 다양한 종류의 조직 및 세포에 대하여 적용 가능하며, EMT 세포가 관찰되는 곳으로는 치유되고 있는 상처 부위, 암 전이가 발생하는 부위 및 기관의 섬유화가 발생하는 부위이다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 암 전이 또는 섬유화 현상에 대한 정확한 정보를 제공할 수 있다.
이와 같은 본 발명 폴리펩타이드의 효과는, 본 명세서의 실시예에 잘 나타나있다.
본 발명의 일 실시예에서는 파지 라이브러리의 스크리닝을 통하여 EMT 세포에 특이적으로 결합하는 6종류의 폴리펩타이드를 발굴하고(실시예 2 참조), 상기 폴리펩타이드들의 EMT 세포에 대한 결합 특이성을 확인하였다(실시예 3 참조). 그 결과 본 발명의 폴리펩타이드들은 EMT 세포가 존재하지 않는 기관에서는 발견되지 않았으며, EMT 세포가 존재하는 기관에서 발견되었다. 즉, EMT 세포에 특이적으로 결합하였다. 또한 in vitro 뿐만 아니라 동물 모델에 대한 in vivo 실험에서도 EMT 세포의 이미징(영상화)이 가능하였다(실시예 5 참조). 특히, 본 발명에 따른 EMT 표적 펩타이드는 암의 전이 초기 상태 및 종양이 본격적으로 성장하기 이전 단계에서도 전이된 암세포를 민감하게 감지할 수 있었다(실시예 8 참조).
본 발명의 폴리펩타이드는 천연으로부터 유래될 수도 있으며, 공지의 폴리펩타이드 합성 방법(유전공학적 방법, 화학적 합성)을 이용하여 합성될 수 있다. 유전공학적 방법에 의한 작제는, 예를 들어, 통상적인 방법에 따라 상기 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산(예를 들어, 서열번호 5 내지 8의 폴리뉴클레오타이드)을 작제한다. 상기 핵산은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제 할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어 (operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 핵산이 발현되기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 핵산에 의해 발현된, 실질적으로 순수한 폴리펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩타이드(substally pure polypeptide)"라 함은 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie ＆ Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).
또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 천연형 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 폴리펩타이드의 변이체란 본 발명의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 아미노산 유사체의 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 폴리펩타이드를 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
경우에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
본 발명은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 한 폴리뉴클레오타이드의 염기 조합이 특별히 제한되지 않는다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함하여 단쇄 또는 이중쇄의 형태의 핵산분자로서 제공될 수 있다.
바람직하게 본 발명의 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있으며, 예를 들어 서열번호 7 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로 서열번호 1의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있으며, 서열번호 2의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있고, 서열번호 3의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 9의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있으며, 서열번호 4의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 10의 염기서열을 가지는 것일 수 있으며, 서열번호 5의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있고, 서열번호 6의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 12의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 벡터는 통상의 클로닝 벡터 또는 발현벡터일 수 있으며, 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되는 것으로, 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 또한 상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제기원을 포함한다.
본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
상기 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격유전자전달법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection) 및 리포좀 매개법(liposome-mediated method)을 이용할 수 있다.
상기 용어‘형질전환체’는‘숙주세포’등과 호환성 있게 사용될 수 있으며, 임의의 수단(예: 전기충격법, 칼슘 포스파타제 침전법, 미세주입법, 형질전환법, 바이러스 감염 등)에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 의미한다.
본 발명에서 상기 형질전환체는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 모든 종류의 단세포 유기체, 예컨대 각종 박테리아(예컨대, Clostridia속, 대장균, 등) 등의 원핵세포 미생물, 효모 등의 하등 진핵세포 미생물과 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 당업자가 목적하는 바에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용할 수 있다. 일례로 본 발명에서 형질전환체로 이용되는 미생물은 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속 미생물(Streptomyces spp.), 슈도모나스 속 미생물(Pseudomonas spp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스 속 미생물(Staphylococcus spp.), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 등 일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 상피- 중간엽 이행( Epithelial - Mesenchymal Transition , EMT )된 세포 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 폴리펩타이드는, 상기 서열 일반식(Ⅰ)이며, 바람직하게는 서열 일반식(Ⅰ)에 대하여 상기 X1은 트레오닌 또는 알라닌이며; 상기 X2는 이소류신 또는 트레오닌이며; 상기 X3은 이소류신 또는 트레오닌이며; 상기 X4는 트레오닌 또는 트립토판이며; 상기 X5는 트립토판 또는 아스파라긴이며; 상기 X6은 세린 또는 류신이며; 상기 X7은 라이신 또는 트레오닌인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드일 수 있다.
더욱 바람직하게 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 서열로 표시되는, 상피-중간엽 이행(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)된 세포에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 EMT 세포 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 폴리펩타이드의 EMT 세포 결합 여부 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 폴리펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제), 방사성 동위원소(예: 18F, 123I, 124I, 125I, 32P, 35S, 67Ga), 크로모포어(chromophore), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 형광단백질(GFP(Green Fluorescent Protein); EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein); DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein); CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), Cy3, Cy5 및 Cy7.5), 자기공명 영상물질(예: Gadolinium(Gd, 가도리늄), 상자성입자(super paramagnetic particles) 또는 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles))일 수 있다.
표지에 따른 검출 방법은 당업계에 널리 알려져 있으나, 예를 들어 다음과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 면역형광염색법을 이용할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 폴리펩타이드를 시료와 반응시키고 미결합 또는 비특이적인 결합 산물을 제거한 다음 형광현미경 하에서 폴리펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 또한 검출가능한 표지로 효소를 이용하는 경우에는 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의해 흡광도를 측정하고, 방사선 물질인 경우에는 방사선 방출량을 측정함으로써 수행할 수 있다. 아울러, 검출된 결과는 검출표지에 따른 공지된 영상화 방법에 따라 영상화될 수도 있다.
본 발명은 (a) 제1항의 폴리펩타이드를 시료와 혼합하는 단계; (b) 미결합되거나 비특이적으로 결합된 상기 폴리펩타이드를 제거하는 단계; 및 (c) 상기 폴리펩타이드의 결합 여부 및 위치를 확인하는 단계를 포함하는 상피- 중간엽 이행( Epithelial - Mesenchymal Transition , EMT )된 세포의 검출 방법을 제공한다.
이 때, 상기 (c) 단계에서 본 발명의 폴리펩타이드의 EMT 세포와 결합 여부 및 위치를 확인하기위하여 수행되는 폴리펩타이드의 검출 방법은 상기에서 기재한 바 또는 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다.
본 발명에서 상기 용어‘시료’는 생물학적 시료를 의미하는 것으로서, 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 폴리펩타이드는 EMT 세포와 특이적으로 결합하는 효과가 뛰어나므로, 약물을 상기 EMT 세포에(궁극적으로 in vivo 상에서 EMT 세포가 존재하는 부위에) 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용할 수 있다.
본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 상피- 중간엽 이행( Epithelial - Mesenchymal Transition, EMT ) 세포 특이적 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 약물 전달용 조성물은, EMT 세포, 전이 암 세포 또는 섬유화가 일어나고 있는 세포에 특이적으로 약물을 전달하는 것이 가능하며, 상기 암 또는 섬유화 질환은 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 EMT에 의한 전이 암 또는 섬유화 현상일 수 있다.
좀더 구체적으로, 상기 약물 전달용 조성물에 포함되는 본 발명의 폴리펩타이드를 종래 항-종양성(항암성) 질환 제제 등의 약제와 연결하여 치료에 이용한다면 본 발명의 폴리펩타이드에 의해 상기 제제가 전이 암 세포에만 선택적으로 전달되기 때문에 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 부작용을 현저히 줄일 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드에 연결될 수 있는 항-종양성 질환 제제는 공지의 종양 치료물질이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 파클리탁셀, 독소루비신, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌(bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴(cisplain), 5-플로오우라실(5-fluouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란(melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard), 니트로소우레아(nitrosourea), 스트렙토키나제(streptokinase), 유로키나제(urokinase), 알테플라제(alteplase), 안지오텐신(angiotensin) II 억제제, 알도스테론(aldosterone) 수용체 억제제, 에리트로포이에틴(erythropoietin), NMDA (N-methyl-d-aspartate) 수용체 억제제, 로바스타틴(Lovastatin), 라파마이신(Rapamycin), 셀레브렉스(Celebrex), 티클로핀(Ticlopin) 마리마스타트(Marimastat) 및 트로케이드(Trocade) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것일 수 있다.
상기 제제와 본 발명의 폴리펩타이드의 연결은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 폴리펩타이드는 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식(modification)될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 폴리펩타이드의 양은 결합되는 상기 치료제의 종류 및 양에 따라 달라질 수 있다.
상기 본 발명의 약학적 조성물에서 본 발명의 폴리펩타이드는 표적 기관에 결합하였는지 여부 확인, 검출 및 정량을 용이하기 하기 위하여 표지된 상태로 제공될 수 있으며, 이에 대해서는 상기에서 기술한 바와 같다.
한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 폴리펩타이드의 순수한 형태 또는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화함으로써 제공될 수 있다. “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀, 생분해성 나노입자 등이 포함된다.
한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 투여 경로에 따라 적합한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로가 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 안정화제(아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산) 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제(벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올)를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 진단 또는 치료 효과의 추적을 가능하게 하는 물질량(amount of substance)을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 대상 질환 및 이의 중증 정도, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 할 때 1회 투여시 1mg 내지 1000mg의 유효용량으로 하루에 수 차례 반복 투여될 수 있다.
아울러, 본 발명의 폴리펩타이드는 EMT 세포와 특이적으로 결합하므로, 임의의 표지수단(영상화용 수단)과 함께 암의 전이가 진행되고 있는 환부 또는 섬유화가 진행되고 있는 환부를 in vivo 및 ex vivo 상에서 영상화할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 상피- 중간엽 이행( Epithelial -Mesenchymal Transition , EMT ) 세포 영상화용 조성물을 제공한다.
상기 EMT 세포 영상화라 함은 상기 환부(還付)의 영상화 및 진단으로서 당업자에게 이해될 수 있으며, 암 질환 및 섬유화 질환에 대해서는 전술한 바와 같다. 구체적으로 예를 들어, 본 발명의 영상화용 조성물은 상기 본 발명의 EMT 세포 검출용 조성물로서 제공될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이 때, 질환의 영상화 및 진단은, 이에 한정되지는 않으나, 질환의 초진 목적 뿐만 아니라, 진행 경과, 치료에 대한 치료 경과, 치료제에 대한 반응 모니터링 등을 포괄하여 사용할 수 있다. 상기 본 발명의 폴리펩타이드는 결합 여부의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 표지된 상태로 제공될 수 있으며, 이에 대해서는 상기에서 기술한 바와 같다.
따라서 본 발명은 상피-중간엽 이행(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT) 세포 표적용 폴리펩타이드 및 이의 용도를 제공한다. 본 발명의 조성물은 EMT 세포를 특이적으로 표적하여 생체 내에서 실시간으로 암 전이 및 섬유화를 모니터링할 수 있으며, 순환종양세포(CTCs) 및 섬유화를 감지하고 검출하는 영상진단에도 사용될 수 있어 효과적이다.
도 1은 TGF-β를 농도별로 처리한 후의 A549 세포에 대한 morphology 변화를 현미경으로 나타낸 것이다.
도 2는 TGF-β가 처리된 A549 세포에서 E-cadherin, α-SMA, N-cadherin 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 것이다.
도 3은 TGF-β가 처리된 A549 세포에서 N-cadherin, α-SMA, E-cadherin 발현을 면역형광법으로 확인한 것이다.
도 4는 각 선별 라운드에서의 파지 농축 정도를 나타낸 것이다(Parental: TGF-β 무처리, EMT: TGF-β 처리).
도 5A는 76종의 파지 콜로니로부터 선별된 폴리펩타이드 서열이며, 도 5B는 선별된 개별 파지 클론의 결합능을 확인한 것이다.
도 6은 TGF-β가 처리된 A549 세포와 처리하지 않은 A549 세포에 EMT 표적 폴리펩타이드를 결합시킨 다음 형광현미경(도 6A)과 FACS(도 6B)로 확인한 것이다.
도 7A는 EMT-like Py2T(유방암 세포)를 이용하여 TGF-β가 처리된 세포와 처리하지 않은 세포에서 E-cadherin, vimentin 발현을 Western 블롯팅으로 확인한 것이며, 도 7B은 EMT-like Py2T(유방암 세포)를 이용하여 TGF-β가 처리된 세포와 처리하지 않은 세포에서 EMT 폴리펩타이드의 결합 정도를 면역형광법으로 확인한 것이다.
도 8A는 Py2T(유방암 세포)가 이식된 누드마우스에 Flamma675가 표지된 EMT peptide를 정맥주사하여 1시간 후에 종양 조직내 발현을 Optix 이미지로 확인한 것이며, 도 8B는 종양을 비롯한 각 장기에서의 발현을 Optix 이미지로 확인한 것이다(T: 암, S: 비장, Li: 간, K: 콩팥, H: 심장). 또한, 도 8C는 이를 수치화하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 Py2T 유방암 세포에 EMT 표적 폴리펩타이드를 처리한 후 면역형광법으로 관찰한 사진이다(적색: Vimentin, 녹색: E-cadherin, 황색: peptide).
도 10은 4T1 유방암 세포가 이식된 야생형 마우스에 Flamma675가 표지된 EMT 폴리펩타이드를 정맥주사하여 1시간 후에 전체 몸통 이미지와 종양을 비롯한 각 장기에서의 발현을 Optix 이미지로 확인한 것이다(Tu: 암, Leg: 다리, liver: 간, S: 비장, Lu: 폐, Kid: 콩팥, H: 심장).
도 11은 4T1 전이 폐종양 조직이 이식된 야생형 마우스에 Flamma675가 표지된 EMT 폴리펩타이드를 정맥주사하여 1시간 후에 4T1 전이 폐종양 조직을 면역형광법으로 관찰한 것이다.
도 12는 루시페라제를 발현하는 4T1 유방암 세포가 이식된 야생형 마우스에서 EMT 표적 펩타이드(EMT peptide)의 종양 전이 검출 민감성을 확인하는 생체 이미징(in vivo imaging) 결과이다. 상단은 마우스에서 형광(fluorescence)과 인광(luminescence)을 측정하는 광학 이미징(optical imaging) 결과이고, 하단은 CT 촬영 결과이다. 상단의 검은 점선으로 표시된 타원은 인광 신호로 감지되는 폐의 암 전이 부위, 흰색 화살표는 형광 신호로 감지되는 폐의 암전이 부위를 나타낸다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 폐암 세포 A549의 EMT 유도와 면역형광염색 및 분석
A549 폐암 세포를 각 배양용기에 2 x 105개를 심고 하루 동안 배양하였다. 둘째날, FBS가 없는 무혈청배지로 24시간 동안 starvation 기간을 거치고, 셋째 날 TGF-β를 농도별(0, 1, 2.5, 5, 10 또는 20ng/ml)로 처리해주었다. 그 후, 48시간 뒤에 현미경으로 세포의 형태 변화를 관찰하였다.
그 결과, 5ng/ml 농도에서부터 세포가 중간엽 세포 형태로 변화되는 것을 관찰할 수 있었다(도 1 참조). 계속해서 웨스턴 블롯으로 EMT가 유도된 A549 폐암 세포에서 EMT marker인 E-cadherin, a-SMA, N-cadherin의 발현을 관찰한 결과, 상피세포 마커인 E-cadherin의 발현은 감소하였고, 중간엽 세포 마커인 a-SMA, N-cadherin의 발현은 증가하는 것을 관찰하였다(도 2 참조). 또한, 면역형광법을 이용하여 관찰한 결과 도 3에 나타난 것과 같이, 상피세포 마커인 E-cadherin의 발현은 감소하였고, 중간엽세포 마커인 a-SMA, N-cadherin, vimentin의 발현은 증가하는 것을 관찰하였다(도 3 참조).
< 실시예 2> 파지 라이브러리 스크리닝
본 발명은 EMT된 세포에 특이적인 폴리펩타이드를 찾아내기 위하여, 파지 폴리펩타이드 디스플레이 기술을 이용하였다(Smith, Science, 228:1315-1317, 1985). 파지 폴리펩타이드 디스플레이는 수 개 내지 수십 개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드를 박테리오파지 표면에 디스플레이하는 것이다. 최대 109 종류의 폴리펩타이드를 가진 파지 라이브러리를 만들 수 있기 때문에 한꺼번에 많은 종류의 폴리펩타이드를 탐색하여 원하는 조직 또는 종양에 표적되는 폴리펩타이드를 찾는데 유용한 기술이다.
A549 폐암 세포를 각 배양용기에 2 x 105개를 심고 밤새 배양하였다. 둘째날 FBS가 없는 무혈청배지로 24시간 동안 starvation 기간을 거치고, 셋째날 TGF-β를 5ng/ml 처리하였다. 48시간 후 파지 라이브러리 스크리닝을 수행하였다. EMT가 유도된 A549 폐암 세포에 특이적인 파지를 선택할 가능성을 높이기 위해, 본 발명자들은 파지 라이브러리를 TGF-β 처리한 세포 또는 처리하지 않은 세포와 반응시키는 음성 선택(또는 공제) 단계를 포함시켰다.
EMT를 유도한 A549 폐암 세포와 결합한 파지의 역가는 4회 및 5회 스크리닝 반복공정시에 확연히 증가하였다(도 4 참조). EMT를 유도한 A549 폐암 세포에 결합한 파지는 무처리 대조군 세포와 비교하여 약 10배 가량 높았다. EMT를 유도한 A549 폐암 세포에서 1회와 비교하여 5회에 약 219배 증가하였다(도 4 참조).
4회 및 5회 스크리닝 반복 공정으로부터 76종의 파지 콜로니를 서열분석 하였다. TIITWSK 폴리펩타이드 서열(서열번호 4)을 가진 파지 클론이 12%(9/76)로 가장 우세하였고, APOSMRS 폴리펩타이드 서열(서열번호 2)을 가진 파지 클론이 그 뒤를 따랐다(도 5A 참조).
개별 파지 클론들과 TGF-β를 처리한 EMT 세포 또는 TGF-β를 처리하지 않은 EMT 세포 간의 결합도를 조사하였다. 6개의 클론 중 3개가 무처리 세포에 비해 TGF-β를 처리한 EMT 세포에 더 높은 결합도를 보였다(도 5B 참조). 대조군으로 사용한 파지 라이브러리 풀은 최소한의 결합도를 보였다. 이들 중 TIITWSK 폴리펩타이드 서열을 가진 파지 클론(도 5B의 clone4)을 선택하여 추후 실험을 진행하였는데, 이는 이들이 여타 파지 클론에 비하여 무처리 세포 대비 TGF-β를 처리한 EMT 세포에 결합도가 상대적으로 높았기 때문이다.
< 실시예 3> EMT 세포와 폴리펩타이드의 결합능 확인
EMT 세포에 결합하는 여러 폴리펩타이드 중 가장 결합능이 좋은 서열번호 4 폴리펩타이드에 FITC 형광을 표지하였다. 그 후, 상기 폴리펩타이드를 TGF-β를 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에 각각 4 oC 온도에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 세포를 세척하고 형광현미경으로 형광 신호를 관찰하여 폴리펩타이드의 결합을 조사하였다.
그 결과, 도 6A에서 보이는 바와 같이, TGF-β를 처리하지 않은 세포보다 처리한 EMT 세포에서 훨씬 강한 결합능을 보였다. 또한, 유세포 분석기를 통한 실험에서도 같은 결과를 얻었다(도 6B 참조).
< 실시예 4> 유방암 세포 Py2T 의 EMT 유도 및 면역형광분석
폐암 세포 뿐 아니라 다른 암 세포에서도 같은 결과를 얻을 수 있는지 실험해보았다. 먼저, 상기 <실시예 1>에서 서술한 방법으로 Py2T 유방암 세포에 TGF-β를 처리하여 EMT를 유도하였으며, EMT의 마커인 vimentin과 E-cadherin의 발현을 관찰하였다. 그 결과 TGF-β를 처리한 Py2T 세포에서 vimentin의 발현이 현저히 증가되는 것을 관찰하였다. 반면, E-cadherin의 발현이 현저히 감소하는 것을 관찰하였다(도 7A 참조). 또한, 면역형광염색을 통하여 FITC가 표지된 서열번호 4 폴리펩타이드가 TGF-β를 처리한 Py2T 세포에 더욱 잘 결합한다는 것을 확인하였다(도 7B 참조). 본 실험을 통해, 암세포의 종류에 상관없이 암세포에서 EMT이 유도되면 본 발명의 폴리펩타이드가 잘 결합하는 것으로 생각된다.
< 실시예 5> 폴리펩타이드를 이용한 생체 내 유방암 형광 영상화
폴리펩타이드를 이용한 생체내 암표적 영상화를 실험하기 위하여 마우스(BALB/c nu/nu)를 동양 연구소(한국)에서 구입하였다. 종양 이종이식 모델을 만들기 위하여, 6주령 BALB/c nu/nu 수컷 마우스에 Py2T 유방암 세포주(1 x 107 개)와 Py2T TBRDN(dominant-negative form of TGFβ receptor II)을 유방지방패드(mammary fat pad) 조직에 이식하였다. 그런 다음 3주간 종양세포가 0.5 내지 1cm의 크기로 자랄 수 있도록 하였다. flamma675가 표지된 폴리펩타이드를 꼬리 정맥을 통해 체내에 주입하고 1시간 뒤에 생체 형광영상을 촬영하였다(도 8 참조). 마우스는 무균 조건 및 온도와 습도 제어 조건에서 사육하였으며, 모든 동물 실험은 경북 대학교 동물 관리 위원회(IACUC)의 가이드라인에 의하여 수행하였다.
그 결과, 도 8A에 보이는 바와 같이, EMT 표적 펩타이드인 Flamma675-TIITWSK를 주사한 Py2T 종양 모델에서 Flamma675-control peptide를 주사한 그룹에 비해 훨씬 강한 형광 신호를 관찰할 수가 있었다. 또한, 음성 대조군인 Py2T TBRDN 그룹에 Flamma675-TIITWSK 폴리펩타이드를 주사하였을 때 Py2T 그룹보다 훨씬 약한 신호를 관찰할 수가 있었다. 또한 ex vivo에서도 in vivo 이미지와 동일한 결과로 Flamma675-TIITWSK를 주사한 Py2T 종양에서 다른 그룹에 비해 훨씬 강한 신호를 관찰할 수가 있었다(도 8B 및 도 8C 참조).
< 실시예 6> 폴리펩타이드의 생체 내 폐암 세포 표적능
6주령 BALB/c 누드 마우스(오리엔트사)에 Py2T 유방암 세포주(1 x 107 개)를 유방지방패드(mammary fat pad)에 피하 주사하였다. Py2T 세포주는 항생제(페니실린 및 스트렙토마이신)가 첨가된 10% 우태아혈청(FBS, Fetal bovine serum)을 포함하는 DMEM/High 배지에서 배양되었으며, 2 내지 3일마다 계대배양하였다. 그 후, 종양세포가 0.5 내지 1cm의 크기로 자랄 수 있도록 하였다. Flamma675 형광 표지된 폴리펩타이드를 종양이 자란 마우스의 꼬리 정맥에 주입하고 1시간 동안 순환시킨 후 종양과 기타 장기를 적출하였다. 조직의 동결절편을 만든 후, 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 9에서 보이는 바와 같이 Control-Flamma675 폴리펩타이드를 주사한 그룹에 비해, EMT 표적 펩타이드인 TIIWSK-Flamma675 폴리펩타이드를 주사한 Py2T 종양에서 폴리펩타이드의 신호가 훨씬 강한 것을 관찰할 수가 있었다. 또한 Py2T 종양에서 E-cadherin의 발현이 감소하고, vimentin의 발현이 증가하는 것을 관찰할 수가 있었다.
< 실시예 7> 암 전이 모델에서의 폴리펩타이드의 표적능
6주령 BALB/c 누드 마우스(오리엔트사)에 4T1 유방암 세포주(1 x 107 개)를 유방지방패드(mammary fat pad)에 피하 주사하였다. 4T1 세포주는 항생제(페니실린 및 스트렙토마이신)가 첨가된 10% 우태아혈청(FBS, Fetal bovine serum)을 포함하는 DMEM/High 배지에서 배양되었으며, 2 내지 3일 마다 계대배양하였다. 그 후, 종양세포가 0.5 내지 1cm의 크기로 자랄 수 있도록 하였다. Flamma675 형광 표지된 폴리펩타이드를 종양이 자란 마우스의 꼬리 정맥에 주입하고 1시간 동안 순환시킨 후 생체 형광 영상을 촬영하였다(도 10A). 그 후, 종양과 기타 장기를 적출하여 다시 형광 영상을 촬영하였다(도 10B). 또한, 폐종양의 동결절편을 만든 후, 형광현미경으로 관찰하였다(도 11).
그 결과, control-Flamma675 폴리펩타이드를 주사한 그룹에 비해, EMT 표적 펩타이드인 TIITWSK-Flamma675 폴리펩타이드를 주사한 4T1 종양모델에서 폴리펩타이드의 신호가 폐에서 강하게 나타나는 것을 관찰할 수가 있었다(도 10A 참조). 또한 ex vivo에서도 전이가 가장 잘 일어나는 폐에서 강한 신호를 관찰할 수가 있었다(도 10B 참조).
8주 후 마우스의 폐를 적출한 결과, 폐에 종양이 생성된 상태였다. 즉, 4주차 즈음에 폐로 전이가 일어나기 위하여 EMT 세포가 많이 순환하였으며, 이 때문에 4주차의 폐에서 강한 형광 신호가 나타난 것으로 보인다(도 10). 폐 종양의 동결절편을 형광현미경으로 관찰한 결과는 도 11에 도시하였으며, 이 결과는 앞서 도9에서 나타난 것과 유사하게 4T1 폐종양에서 E-cadherin의 발현이 감소하고, vimentin의 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.
< 실시예 8> 암 전이 모델에서의 폴리펩타이드의 표적 민감성
1차 종양과 종양의 전이(metastasis)를 추적하기 위한 EMT 표적 펩타이드의 민감성(sensitivity) 정도를 마우스 암 전이 모델에서 확인하였다. 루시페라제(luciferase)를 발현하도록 형질전환된 마우스 유방암 세포주인 4T1 세포(퍼킨 엘머사)를 마우스에 주입하여 암세포를 인광(luminescence)으로 감지될 수 있도록 하였다. 루시페라제를 발현하는 4T1 세포는 앞선 실시예에서와 유사한 방법으로 마우스의 우측 하단의 유방 지방 조직에 이식하였다. 4주 경과 후, 상기 유방암 세포주를 이식한 마우스에 생체 내 인광(luminescence) 촬영을 실시하고, 앞선 실시예와 유사한 방법으로 대조군 펩타이드(control peptide) 또는 형광 표지된 EMT 표적 펩타이드(EMT peptide)를 주입하고, 1시간 후에 생체 내 형광(fluorescence) 및 CT 촬영을 실시하여 암 세포를 관찰하였다(도 12).
먼저 루시페라제의 효소 작용에 의해 인광을 발광하게 되는 기질인 루시페린(luciferin)을 100μl(30mg/mL) 복강투여하고 15분 후 IVIS Lumina K 기기(퍼킨엘머사)를 사용하여 인광(luminescence)을 관측하였다. 루시페라제를 세포 내에 발현하고 있는 4T1 유방암 세포가 이식된 우측 하단 유선 부위에서 발생한 1차 종양에서는 인광 신호가 강하게 나타났으며, 한편 좌측 폐에서는 1차 종양으로부터 전이된 것으로 보이는 인광 신호가 약하게 관찰되었다(도 12 상단, 점선 타원).
다음으로, 형광(fluorescence) 및 CT 촬영은 인광 촬영한 24시간 뒤 시행하였다. Flamma675 형광을 표지한 본 발명에 따른 EMT 표적 펩타이드(TIITWSK-Flamma675) 또는 대조군 펩타이드를 마우스 꼬리 정맥으로 주입한 후, 1시간 뒤에 IVIS Spectrum CT 기기(퍼킨 엘머사)를 사용하여 3D 형광(fluorescence)을 촬영하였다. 영상처리 및 분석은 기기 제조사에서 제공하는 Living Image 4.5 software를 이용하여 진행하였다. EMT 표적 펩타이드를 주입한 마우스에서는 전이로 보이는 좌측 폐에서 형광 신호가 나타났으며(도 12 상단, 흰색 화살표), 대조군 펩타이드를 주사한 마우스에서는 아무런 신호가 관찰되지 않았다. 도 12 하단의 CT 사진은 상기 실험에 사용한 동일한 마우스와 기기를 사용하여 각각 생체 내 형광을 3D CT로 촬영한 것으로(voltage, 50kVp; current, 1mA), 형광 신호가 관찰된 곳의 해부학적 위치가 폐 부위임을 보다 정확히 알 수 있었다.
본 결과는 1차 종양인 유방암으로부터 암 전이에 의해 폐에서 인광이 약하게 보일 정도의 전이 초기 및 종양이 성장하기 이전 단계에서 본 발명에 따른 펩타이드가 EMT 진행으로 전이된 세포를 표적으로 하여 전이를 민감하게 검출할 수 있음을 보여준다.
본 발명은 상피-중간엽 이행(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT) 세포 표적용 폴리펩타이드 및 이의 용도를 제공한다. 본 발명의 조성물은 EMT 세포를 특이적으로 표적하여 생체 내에서 실시간으로 암 전이 및 섬유화를 모니터링 할 수 있으며, 순환종양세포(CTCs) 및 섬유화를 감지하고 검출하는 영상진단에도 사용될 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Polypeptides for targeting epithelial-mesenchymal transition cells and uses thereof <130> NP16-0053 <150> KR 10-2015-0075161 <151> 2015-05-28 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 1 peptide <400> 1 Val Ala Gly Thr Pro Val Cys 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 2 peptide <400> 2 Ala Pro Gln Ser Met Arg Ser 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 3 peptide <400> 3 Thr Ser Pro Gly Ser Met Met 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 4 peptide <400> 4 Thr Ile Ile Thr Trp Ser Lys 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 5 peptide <400> 5 Ala Thr Thr Trp Asn Leu Thr 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 10 peptide <400> 6 Thr Gln Asp Pro Val Ile Val 1 5 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 1 polynucleotide <400> 7 gttgcgggga cgccggtgac g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 2 polynucleotide <400> 8 gcgccgcagt cgatgaggtc t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 3 polynucleotide <400> 9 acgagtccgg gttcgatgat g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 4 polynucleotide <400> 10 acgattatta cgtggtcgaa g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 5 polynucleotide <400> 11 gcgacgacgt ggaatctgac t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 10 polynucleotide <400> 12 acgcaggatc cggtgattgt g 21

Claims (16)

  1. 서열번호 4로 표시되는 상피-중간엽 이행(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)된 세포와 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 암 전이(tumor metastasis)를 특이적으로 감지하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  5. 제1항의 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  7. 제5항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  8. 제7항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  9. 제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 상피-중간엽 이행(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)된 세포 검출용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 암 전이(tumor metastasis)를 특이적으로 감지하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 자기공명 영상물질, 상자성입자(superparamagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. (a) 제1항의 폴리펩타이드를 시료와 혼합하는 단계;
    (b) 미결합되거나 비특이적으로 결합된 상기 폴리펩타이드를 제거하는 단계; 및
    (c) 상기 폴리펩타이드의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함하는 상피-중간엽 이행(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)된 세포의 검출 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 방법은 암 전이(tumor metastasis)를 특이적으로 감지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 상피-중간엽 이행(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT) 세포 특이적 약물 전달용 조성물.
  15. 제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 상피-중간엽 이행(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT) 세포 영상화용 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 자기공명 영상물질, 상자성입자(superparamagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
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