KR101656758B1 - 히스톤 h1과 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 히스톤 H1과 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는[N말단-C-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-C-C말단]으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 히스톤 H1과 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 사멸세포 검출용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 영상화용 조성물 등에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드는 종양, 심근경색, 뇌졸중 및 동맥경화 등의 조직에 발생하는 아포토시스를 효과적으로 표적한다. 따라서 본 발명의 펩타이드는 치료물질과 결합하여 상기 질환조직에 약물을 선택적으로 전달하는 질환 예방 및 치료용 조성물 등의 목적으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 영상물질과 결합하여 상기 질환의 진단 및 치료약물에 대한 반응의 영상화 등에 다양하게 사용될 수 있다.

Description

히스톤 H1과 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도{peptides binding histone H1 specifically and uses thereof}

본 발명은 히스톤 H1과 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 [N말단-C-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-C-C말단]으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 히스톤 H1과 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 사멸세포 검출용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 영상화용 조성물 등에 관한 것이다. 상기 C는 시스테인이며; X1은 리신, 세린, 아스파르트산으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이며; X2 및 X3는 각각 프롤린, 트립토판, 류신, 아스파라긴으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이며; X4는 리신, 트레오닌, 페닐알라닌, 아르기닌으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이며; X5는 리신, 트레오닌, 글루탐산, 프롤린으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이며; X6은 리신, 글리신, 류신, 아르기닌으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이며; X7은 트레오닌 또는 글루탐산이다.

세포사멸 또는 아포토시스(apoptosis)란 개체의 생명 유지를 위해서 불필요한 세포 혹은 위험한 세포를 스스로 죽게 하도록 하는 현상을 말한다. 아포토시스는 그리스어로 떨어지다를 뜻하며 세포가 소실되어 가는 과정을 꽃에서 잎들이 떨어지는 것에 비유하여 붙여진 이름으로, 1972년 Kerr 등에 의해 처음으로 관찰되었다(Kerr et al., Br J Cancer, 1972, 26:239-257). 아포토시스는 세포의 발생, 분화, 면역 등의 생리학적 현상에 중요한 역할을 한다(Meier et al., Nature, 2000, 407:796-801). 한편, 여러 가지 병리학적 환경 및 질환에서도 아포토시스는 중요하다. 예를 들어, 항암제로 성공적 치료를 하는 경우 다량의 아포토시스가 종양조직 내 발생한다(Thomson, Science, 1995, 267:1456-1462). 반면, 종양의 발생에는 아포토시스의 감소가 원인으로 관여한다. 또 다른 예로, 뇌졸중 및 심근경색에서 뇌 및 심장으로 가는 혈액 공급의 부족으로 뇌세포 및 심근세포가 각각 손상을 받아 아포토시스가 발생한다(Du et al, J Cereb Blood Flow Metab, 1996, 16:195-201; Narula et al., New Engl J Med, 1996, 335:1182-1189). 또한 장기 이식 후 거부반응, 자가면역질환, 퇴행성 뇌신경질환, 동맥경화 및 바이러스 감염 등의 질환에서도 아포토시스가 흔히 발생한다(Thomson, Science, 1995, 267:1456-1462; Kageyama et al., Ann Thorac Surg, 1998, 65:1604-1609).

이러한 아포토시스는 임상적으로 진단 및 치료적 측면에서 매우 중요한 의미를 가진다. 즉, 아포토시스의 영상화는 이의 과도한 증가와 연관된 퇴행성 뇌신경질환(알츠하이머 병 및 파킨슨 병 등)의 조기 진단, 심근경색 및 뇌졸중에서 병의 진행 정도 모니터링, 항암제 처리에 의한 암 치료효과 모니터링, 동맥경화에서 동맥경화반의 파열 가능성 판단 등의 경우에 매우 큰 도움이 될 것이다. 또한 아포토시스가 왕성한 부위에 이를 표적으로 치료제나 세포를 보호하는 제제를 선택적으로 전달하게 되면 부작용을 줄이면서 치료효과를 훨씬 높일 수 있을 것이다.

사멸세포에서 일어나는 초기에는 핵 단백질인 히스톤 H1의 세포질로의 이동 및 세포막 바깥쪽으로의 노출이 발생한다. 정상적으로 히스톤은 핵 내에 존재하는 단백질로, 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4는 DNA 가닥과 결합하여 뉴클레오솜을 형성하며, 히스톤 H1은 뉴클레오솜 사이의 DNA 가닥과 결합해 있다. 아포토시스가 진행되는 동안 DNA와 결합해 있던 히스톤 H1은 핵 바깥인 세포질 및 세포막 바깥으로 나가게 된다(Wu, D. et al., J Biol Chem. 2002, 277:12001-12008; Radic, M. et al., J Immunol. 2004, 172:6692-6700). 히스톤 H1의 핵 바깥으로의 이동은 카스파제(caspase) 효소에 의해 매개되며, DNA 가닥의 절단이 일어나기 이전에 진행되는 것으로 보고되었다(Ohsawa, S. et al., Cell Death Differ. 2008, 15:1429-1439).

이에 본 발명자들은 히스톤 H1과 특이적으로 결합하여 사멸세포를 특이적으로 표적할 수 있는 새로운 단백질 또는 그 단편을 탐색하고자 연구한 결과, 본 발명의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 히스톤 H1과 특이적으로 결합하며, 나아가 사멸세포를 표적할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 다음의 서열 일반식 (I)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 히스톤 H1과 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

일반식 (I) [N말단-C-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-C-C말단]

단, 상기 C는 시스테인이며; X1은 리신, 세린, 아스파르트산으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이며; X2 및 X3는 각각 프롤린, 트립토판, 류신, 아스파라긴으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이며; X4는 리신, 트레오닌, 페닐알라닌, 아르기닌으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이며; X5는 리신, 트레오닌, 글루탐산, 프롤린으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이며; X6은 리신, 글리신, 류신, 아르기닌으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이며; X7은 트레오닌 또는 글루탐산이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환 된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 사멸세포 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 (a) 상기 폴리펩타이드를 시료와 혼합하는 단계; (b) 미결합되거나 비특이적으로 결합된 상기 폴리펩타이드를 제거하는 단계; 및 (c) 상기 폴리펩타이드의 결합 여부 및 위치를 확인하는 단계를 포함하는 사멸 세포의 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 사멸세포 특이적 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드 및 이와 결합된 항-종양성 질환 제제를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 부위의 영상화용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드 및 이와 결합된 뇌졸중 치료제를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 부위의 영상화용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드 및 이와 결합된 심근경색 치료제를 유효성분으로 포함하는 심근경색 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심근경색 부위의 영상화용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드 및 이와 결합된 동맥경화 치료제를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 부위의 영상화용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 서열 일반식 (I)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 히스톤 H1과 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 제공한다.

일반식 (I) [N말단-C-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-C-C말단]

단, 상기 C는 시스테인이며; X1은 리신, 세린, 아스파르트산으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이며; X2 및 X3는 각각 프롤린, 트립토판, 류신, 아스파라긴으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이며; X4는 리신, 트레오닌, 페닐알라닌, 아르기닌으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이며; X5는 리신, 트레오닌, 글루탐산, 프롤린으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이며; X6은 리신, 글리신, 류신, 아르기닌으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이며; X7은 트레오닌 또는 글루탐산이다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환 된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 사멸세포 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 상기 폴리펩타이드를 시료와 혼합하는 단계; (b) 미결합되거나 비특이적으로 결합된 상기 폴리펩타이드를 제거하는 단계; 및 (c) 상기 폴리펩타이드의 결합 여부 및 위치를 확인하는 단계를 포함하는 사멸 세포의 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 사멸세포 특이적 약물 전달용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 및 이와 결합된 항-종양성 질환 제제를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 부위의 영상화용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 및 이와 결합된 뇌졸중 치료제를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 부위의 영상화용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 및 이와 결합된 심근경색 치료제를 유효성분으로 포함하는 심근경색 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심근경색 부위의 영상화용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 및 이와 결합된 동맥경화 치료제를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 부위의 영상화용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 폴리펩타이드는

다음의 서열 일반식 (I)로 표시되며, 히스톤 H1과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.

(I) [N말단-C-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-C-C말단]

단, 상기 C는 시스테인이며; X1은 리신, 세린, 아스파르트산으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이며; X2 및 X3는 각각 프롤린, 트립토판, 류신, 아스파라긴으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이며; X4는 리신, 트레오닌, 페닐알라닌, 아르기닌으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이며; X5는 리신, 트레오닌, 글루탐산, 프롤린으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이며; X6은 리신, 글리신, 류신, 아르기닌으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이며; X7은 트레오닌 또는 글루탐산이다.

바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드는 추가적으로 X1, X4, X5 및 X6으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이 염기성 아미노산인 아르기닌 또는 리신이며, X1, X4, X5 및 X7로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이 하이드록시기를 가진 극성 아미노산인 세린 또는 트레오닌인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드일 수 있다.

본 발명의 상기 서열 구조를 가지는 폴리펩타이드가 히스톤 H1과 특이적으로 결합하며, 이에 따라 아포토시스가 진행되는 동안 사멸세포막에 노출되는 히스톤 H1과 결합하여 사멸세포를 표적한다는 점은 본 발명에서 최초로 공개되는 것이다.

본 발명의 폴리펩타이드 단편은 모든 종류의 폴리펩타이드, 단백질, 폴리펩타이드 모조물, 화합물 및 생물제제를 포함하며, 사멸세포에 특이적으로 결합할 수 있는 활성을 갖는 것을 말한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 천연으로부터 유래될 수도 있으며, 공지의 폴리펩타이드 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 천연형 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 폴리펩타이드의 변이체란 본 발명의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 아미노산 유사체의 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 폴리펩타이드를 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).

경우에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 결과적으로 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 어떤 조합의 염기서열도 가능하다.

아울러, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열을 가지는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환 된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 벡터는 통상의 클로닝 벡터 또는 발현벡터일 수 있으며, 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

상기 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격유전자전달법(electroporation), 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection) 및 리포좀 매개법(liposome-mediated method)를 이용할 수 있으며, 상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스( Staphylococcus), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

보다 구체적으로 본 발명의 일 실시예에서는 무작위로 CX₇C 펩타이드를 코딩하는 상용의 M13 파지 라이브러리를 이용하여 소의 갑상선 조직에서 분리정제된 히스톤 H1 단백질과 특이적으로 결합하는 파지를 각각 스크리닝 하였다. 그 결과, 총 5 라운드의 스크리닝을 실시하여 상기 단백질과 특이적으로 결합하는 파지를 선별할 수 있었다. 한편, 3 - 5 라운드에서 선별된 파지 중 55개의 파지 클론을 무작위로 골라 파지에 삽입된 펩타이드의 서열을 분석한 결과 서열번호 1로 표시되는 CKNPTTGTC, 서열번호 2로 표시되는 CDWWFKKTC, 서열번호 3으로 표시되는 CSPNKERTC, 및 서열번호 4로 표시되는 CSLLRPLEC의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 주로 선별되었음을 알 수 있었다(실시예 1-1 내지 1-3 참조).

본 발명의 또다른 실시예에서는 히스톤 H1 단백질에 대한 상기 선별된 파지의 결합 특이성을 확인하였다. 그 결과, 대조군인 소혈청 알부민에 비하여 히스톤 H1에 대한 결합이 본 발명의 파지 클론(CKNPTTGTC,CDWWFKKTC,CSPNKERTC,CSLLRPLEC)에서 훨씬 더 강하여 히스톤 H1에 특이적으로 결합함을 알 수 있었다(실시예 1-4 참조).

본 발명의 또다른 실시예에서는 약제 처리로 아포토시스가 유도된 세포에 대한 상기 선별된 파지의 결합 특이성을 확인하였다. 그 결과, 약제를 처리하지 않은 세포에 비해서 약제를 처리한 사멸세포에는 본 발명의 파지 클론(CKNPTTGTC,CDWWFKKTC,CSPNKERTC,CSLLRPLEC)이 더 강하게 결합함을 알 수 있었다(실시예 2-1 참조).

본 발명의 또다른 실시예에서는 약제 처리로 아포토시스가 유도된 세포에 대한 상기 선별된 펩타이드의 결합 특이성을 확인하였다. 그 결과, 약제를 처리하지 않은 세포에는 펩타이드가 거의 결합하지 않는 데에 비해서 약제를 처리한 사멸세포에는 본 발명의 CDWWFKKTC(서열번호 2) 및 CSLLRPLEC(서열번호 3) 펩타이드가 더 강하게 결합함을 알 수 있었다(실시예 2-2 참조).

결론적으로, 본 발명의 펩타이드가 히스톤 H1과 특이적으로 결합하며 이를 통해 사멸세포의 인식 및 표적을 할 수 있음을 알 수 있었다.

참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오타이드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).

따라서 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 서열을 가지는 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 사멸세포 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어‘사멸 세포(apoptotic cell)’는 아포토시스(apoptosis)가 진행되고 있는 세포를 의미하는 것이다. 세포가 죽는 방식은 크게 아포토시스(apoptosis) 및 자가포식(autophagy)의 세포 계획사와 괴사(necrosis)로 나뉠 수 있다. 상기 아포토시스는 제1형 세포계획사로 자가포식(autophagy)은 제2형 세포 계획사로 불리고 있다(Hye Seung Jung, Autophagy in Diabetes, Korean Diabetes J 33:453~457, 2009). 본원 발명의 펩타이드는 다른 유형의 세포죽음(cell death)과 구별하여 아포토시스에 의한 사멸세포에만 특이적으로 결합하며, 특히 세포 계획사 중에서도 자가포식과 구별하여 아포토시스에 의한 사멸세포에만 특이적으로 결합하는 것이 특징이다.

본 발명의 펩타이드의 사멸세포 결합 여부의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제), 방사성 동위원소(예: ¹⁸F, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ³²P, ³⁵S), 크로모포어(chromophore), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 형광단백질(GFP(Green Fluorescent Protein); EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein); DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein); CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), Cy3, Cy5 및 Cy7.5), 상자성입자(super paramagnetic particles) 또는 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)일 수 있다.

표지에 따른 검출 방법은 당업계에 널리 알려져 있으나, 예를 들어 다음과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 면역형광염색법을 이용할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 시료와 반응시키고 미결합 또는 비특이적인 결합 산물을 제거한 다음 형광현미경 하에서 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 또한 검출가능한 표지로 효소를 이용하는 경우에는 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의해 흡광도를 측정하고, 방사선 물질인 경우에는 방사선 방출량을 측정함으로써 수행할 수 있다. 아울러, 검출된 결과는 검출표지에 따른 공지된 영상화 방법에 따라 영상화될 수도 있다.

또한, 본 발명은 (a) 본 발명의 폴리펩타이드를 시료와 혼합하는 단계; (b) 미결합되거나 비특이적으로 결합된 상기 폴리펩타이드를 제거하는 단계; 및 (c) 상기 폴리펩타이드의 결합 여부 및 위치를 확인하는 단계를 포함하는 사멸 세포의 검출 방법을 제공한다. 이 때, 본 발명의 폴리펩타이드 및 사멸세포와 결합된 본 발명의 폴리펩타이드의 검출 방법은 상기에서 기재한 바 또는 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다.

또한 본 발명의 펩타이드는 사멸세포와 특이적으로 결합할 수 있으므로 약물을 상기 세포에 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용할 수 있다. 따라서 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.

상기한 바와 같이, 아포토시스는 여러 종류의 종양세포 뿐만 아니라, 뇌졸중, 심근경색 및 동맥경화가 진행되는 세포에서 나타난다(Thomson, Science, 1995, 67:1456-1462; Du et al, J Cereb Blood Flow Metab, 1996, 16:195-201; Narula et al., New Engl J Med, 1996, 335:1182-1189). 따라서 상기 약물 전달용 조성물은 종양성 질환, 뇌졸중, 심근경색 또는 동맥경화에 특이적일 수 있다. 종양성 질환이란 악성 종양에 의해 병리적 증상을 보이는 질환으로서, 그 예로는 이에 한정되지는 않으나, 대장암, 폐암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종, 피부암, 간암, 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 복합 골수종(multiple myeloma), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 신경아종(neuroblastoma), 재생불량성 빈혈일 수 있다.

본 발명의 약물 전달용 조성물에 포함되는 본 발명의 펩타이드를 종래 항-종양성 질환 제제. 심근경색 치료제, 뇌졸중 치료제 및 동맥경화 치료제 등의 약제와 연결하여 치료에 이용한다면 본 발명의 펩타이드에 의해 상기 제제가 종양세포, 심근경색 부위, 뇌졸중 부위, 동맥경화 부위 등의 질환 부위에만 선택적으로 전달되기 때문에 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 부작용을 현저히 줄일 수 있다.

본 발명의 펩타이드에 연결될 수 있는 항-종양성 질환 제제는 종래 종양 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예컨대, 파클리탁셀, 독소루비신, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌(bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴(cisplatin), 5-플로오우라실(5-fluorouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란(melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard), 니트로소우레아(nitrosourea) 등이 있다. 아울러, 심근경색 치료제, 뇌졸중 치료제 및 동맥경화 치료제는 종래 이들 질환의 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예컨대, 상기 뇌졸중 및 심근경색 질환에서 혈관을 막고 있는 혈전을 제거하기 위해 사용되고 있는 혈전용해제(thrombolytic drug)인 스트렙토키나제(streptokinase), 유로키나제(urokinase), 알테플라제(alteplase) 등의 약물이 있다. 또한 심근세포 보호제인 안지오텐신(angiotensin) II 억제제, 알도스테론(aldosterone) 수용체 억제제 및 에리트로포이에틴(erythropoietin) 등이 있다. 또한 뇌신경세포 보호제인 NMDA (N-methyl-d-aspartate) 수용체 억제제 등이 있다. 또한 콜레스테롤 합성 억제 및 혈중 콜레스테롤 농도를 낮추는 약물인 로바스타틴(Lovastatin), 혈관평활근세포의 증식을 줄이는 약물인 라파마이신(Rapamycin), 항염증약물인 셀레브렉스(Celebrex), 혈소판 응집 억제 약물인 티클로핀(Ticlopin) 및 기질금속단백질분해효소(matrix metalloprotease) 억제 약물인 마리마스타트(Marimastat) 및 트로케이드(Trocade) 등이 있다. 상기 제제와 본 발명의 펩타이드의 연결은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 펩타이드는 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식(modification)될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 펩타이드의 양은 결합되는 항암제의 종류 및 양에 따라 달라질 수 있다.

한편, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 및 이와 결합된 항-종양성 질환 제제를 유효성분으로 종양성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이 때, 상기 약학적 조성물에서 항-종양성 질환 제제, 결합 방법 및 종양성 질환에 대해서는 상기에서 기재한 바와 같다.

한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 펩타이드의 순수한 형태 또는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화함으로써 제공될 수 있다. "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀, 생분해성 나노입자 등이 포함된다.

한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 투여 경로에 따라 적합한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로가 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당 업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.

흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.

그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 안정화제(아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산) 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제(벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올)를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 진단 또는 치료 효과의 추적을 가능하게 하는 화합물 또는 추출물의 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 대상 질환 및 이의 중증정도, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 할 때 1회 투여시 10 ㎍ 내지 10 ㎎의 유효용량으로 하루에 수 차례 반복 투여될 수 있다.

아울러, 본 발명의 펩타이드는 사멸세포와 특이적으로 결합하므로 종양성 질환의 발병 부위의 영상화 및 진단에도 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환의 영상화 및 진단용 조성물을 제공한다. 이 때, 종양성 질환의 영상화 및 진단은, 이에 한정되지는 않으나, 종양성 질환의 초진 목적 뿐만아니라, 진행 경과, 종양 치료에 대한 치료 경과, 치료제에 대한 반응 모니터링 등을 포괄하여 사용할 수 있다. 상기 펩타이드는 결합 여부의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 표지된 상태로 제공될 수 있으며, 이에 대해서는 상기에서 기술한 바와 같다.

또한, 본 발명의 펩타이드는 사멸세포와 특이적으로 결합하므로 종양에만 국한되지 않고 아포토시스가 크게 증가해 있는 뇌졸중, 심근경색 및 동맥경화에서 본 발명의 펩타이드는 약물 전달을 할 수 있다. 즉, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 및 이와 결합된 뇌졸중 치료제를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 아울러, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 및 이와 결합된 심근경색 치료제를 유효성분으로 포함하는 심근경색 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 아울러, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 및 이와 결합된 동맥경화 치료제를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 펩타이드를 종래 뇌졸중 치료제, 심근경색 치료제 및 동맥경화 치료제와 연결하여 치료에 이용한다면 본 발명의 펩타이드에 의해 상기 제제가 질병 부위의 세포에만 선택적으로 전달되기 때문에 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 부작용을 현저히 줄일 수 있다.

본 발명의 펩타이드에 연결될 수 있는 심근경색 치료제, 뇌졸중 치료제 및 동맥경화 치료제는 종래 이들 질환의 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 상기에서 언급한 스트렙토키나제(streptokinase), 유로키나제(urokinase), 알테플라제(alteplase), 안지오텐신(angiotensin) II 억제제, 알도스테론(aldosterone) 수용체 억제제, 에리트로포이에틴(erythropoietin), NMDA (N-methyl-d-aspartate) 수용체 억제제, 로바스타틴(Lovastatin), 라파마이신(Rapamycin), 셀레브렉스(Celebrex), 티클로핀(Ticlopin), 마리마스타트(Marimastat) 및 트로케이드(Trocade) 등이 이용될 수 있다. 상기 제제와 본 발명의 펩타이드의 연결은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 펩타이드는 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식(modification)될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 펩타이드의 양은 결합되는 상기 치료제의 종류 및 양에 따라 달라질 수 있다.

아울러, 본 발명의 펩타이드는 사멸세포와 특이적으로 결합하므로 뇌졸중, 심근경색 및 동맥경화의 발병 부위의 영상화 및 진단에도 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 부위의 영상화용 조성물을 제공한다. 아울러, 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심근경색 부위의 영상화용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 부위의 영상화용 조성물을 제공한다.

이 때, 질환의 영상화 및 진단은, 이에 한정되지는 않으나, 질환의 초진 목적 뿐만아니라, 진행 경과, 치료에 대한 치료 경과, 치료제에 대한 반응 모니터링 등을 포괄하여 사용할 수 있다. 상기 펩타이드는 결합 여부의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 표지된 상태로 제공될 수 있으며, 이에 대해서는 상기에서 기술한 바와 같다.

이와 같이, 본 발명은 히스톤 H1과 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 이를 이용한 사멸세포검출용 조성물, 사멸세포 특이적 약물 전달용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 사멸세포에 특이적으로 결합하므로, 사멸세포가 발생하는 종양성 질환, 뇌졸중, 심근경색 및 동맥경화 치료제, 상기 질병의 영상화제 제조에 효과적이다.

도 1은 히스톤 H1과 특이적으로 결합하는 파지를 스크리닝하여 증폭시킨 선별된 파지의 타이터 측정 그래프이다(X 축: 파지 스크리닝 라운드 (R) 횟수, Y 축: 1R 기준 각 라운드의 파지 타이터의 배수).
도 2는 선별된 파지 클론에 삽입된 펩타이드의 아미노산 서열을 반복 빈도 순으로 나타낸 것이다.
도 3은 선별된 파지 클론의 소혈청알부민(BSA) 대비 히스톤 H1과 특이적으로 강하게 결합함을 나타낸 그래프이다(CKNPTTGTC: 서열번호 1의 아미노산 서열이 삽입된 파지, CDWWFKKTC: 서열번호 2의 아미노산 서열이 삽입된 파지, CSPNKERTC: 서열번호 3의 아미노산 서열이 삽입된 파지, CSLLRPLEC: 서열번호 4의 아미노산 서열이 삽입된 파지, Y 축: 파지 결합에 따른 흡광도).
도 4는 서열번호1 내지 4의 펩타이드가 삽입된 파지 클론이 약제(Cisplatin/5-FU)를 처리하지 않은 SNU484 위암세포 대비 약제 처리로 세포사멸이 유도된 SNU484 위암세포에 특이적으로 강하게 결합함을 나타낸 그래프이다(CKNPTTGTC: 서열번호 1의 아미노산 서열이 삽입된 파지, CDWWFKKTC: 서열번호 2의 아미노산 서열이 삽입된 파지, CSPNKERTC: 서열번호 3의 아미노산 서열이 삽입된 파지, CSLLRPLEC: 서열번호 4의 아미노산 서열이 삽입된 파지, Y 축: 파지 결합에 따른 흡광도).
도 5는 서열번호2와 4의 선택된 서열을 가지는 펩타이드가 약제(Cisplatin/5-FU)를 처리하지 않은 SNU484 위암세포 대비 약제 처리로 세포사멸이 유도된 SNU484 위암세포에 특이적으로 강하게 결합하는 것을 FACS로 분석한 그래프이다(CDWWFKKTC: 서열번호 2의 펩타이드, CSLLRPLEC: 서열번호 4의 펩타이드, Y 축: 펩타이드 결합한 세포의 백분율).
도 6은 서열번호1 내지 4의 선택된 서열을 가지는 펩타이드가 약제(Rapamycin)를 처리하지 않은 A549 폐암세포 뿐만 아니라 약제 처리로 오토파지가 유도된 A549 폐암세포에 거의 결합하지 않는 것을 형광현미경으로 분석한 그래프이다(FITC: Fluorescein isothiocyanate, HO: Hoechst 염색 ).

이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

히스톤 H1 과 결합하는 파지 클론의 스크리닝

<1-1> 히스톤 H1 으로 코팅된 자성 입자의 제조

본 발명에서 사용되는 히스톤 H1으로 코팅된 자성 입자를 제조하기 위하여, 우선 소의 갑상선조직에서 분리정제된 히스톤 H1 단백질 15ul(60ug)와 108ul 자성 입자(3×10⁸개, Dynal사) 및 60ul 3M ammonium sulfate를 37℃에서 16-24시간 동안 반응 시켰다. 대조군으로는 아무런 단백질도 코팅하지 않은 자성 입자를 사용 하였다.

<1-2> 히스톤 H1 결합 파지 클론의 스크리닝

본 발명자들은 히스톤 H1에 특이적인 펩타이드를 찾아내기 위하여, 파지 펩타이드 디스플레이 기술을 이용하였다(Smith, Science, 228:1315-1317, 1985). 파지 펩타이드 디스플레이는 수 개 내지 수 십 개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 박테리오파지 표면에 디스플레이 하는 것이다. 최대 10⁹ 종류의 펩타이드를 가진 파지 라이브러리를 만들 수 있기 때문에 한꺼번에 많은 종류의 펩타이드를 탐색하여 원하는 조직 또는 종양에 표적되는 펩타이드를 찾는 데 유용한 기술이다.

본 발명은 양 말단에 시스테인이 있고 그 사이에 임의의 7개 아미노산을 포함하는 CX₇C 펩타이드를 M13 파지의 pⅢ 단백질에 융합된 상태로 노출하는 M13 파지 라이브러리(New England Biolabs사)를 사용하여 다음과 같이 히스톤 H1과 결합하는 파지를 스크리닝하였다.

인산염 완충액(phosphate-buffered saline, PBS)(195ul)에 1×10⁹ 플라크-형성 유닛트(plaque-forming units, pfu)를 갖고 있는 상기 M13파지 라이브러리(phage library, 5ul)를 자성 입자와 실온에서 서서히 흔들어 주면서(gentle shaking) 15분 동안 반응 시켰다. 그런 다음 상층액을 회수하여 자성입자 자체에 부착하는 파지가 제거된(subtracted) 파지 라이브러리를 히스톤 H1으로 코팅된 자성 입자와 4℃에서 서서히 흔들어 주면서(gentle shaking) 1시간 동안 반응 시켰다. 결합되지 않거나 약하게 결합된 파지를 제거하기 위하여 이를 PBS-T (PBS containing 0.5% Tween-20) 완충액으로 3회 세척하였다(washing). 히스톤 H1이 코팅된 자성 입자에 결합한 파지를 60ul의 0.1M citrate(pH3.1) 버퍼로 실온에서 2분간 용출하였다(elution). 용출된 파지를 즉시 1M Tris-HCl(pH9.1)로 중화하고, 제조사의 지침에 따라서 20ml의 ER2738 박테리아(New England Biolabs사)로 증폭하였다.

증폭 후, 배양액에 있는 파지를 폴리에틸렌 글리콜/NaCl 용액으로 침전시킨 다음 타이터(titer)를 측정하였다. 타이터의 측정은 IPTG와 X-gal을 포함하는 LB플레이트를 사용하였고, 37℃에서 밤새 배양한 다음 파란색 콜로니의 수를 계수하였다.

측정된 타이터를 이용하여 1차적으로 선별된 파지를 1×10⁹ pfu가 되게 맞추어 추가적인 선별(총 5회)을 하였고, 선별과정은 상기에 기재한 것과 같이 하였다.

그 결과, 도 1에서 보듯이, 4회째 선별 과정 후 1회 선별 과정 대비 87 배의 파지 타이터가 증가하였음을 알 수 있었다.

<1-3> 스크리닝된 파지 클론에 삽입된 펩타이드 서열의 분석

상기 실시예 <1-2>에서와 같이 선별 과정을 거쳐 히스톤 H1에 특이적인 파지를 선별하였으며, 3 - 5 라운드에서 선별된 파지 클론에서 DNA를 분리하였다. 총 55개의 파지 클론에서 DNA를 분리하였고 이를 polymerase chain reaction(PCR)을 통해 증폭하였다. 이 때 5-프라이머로서 올리고뉴클레오타이드(AGCGGACCAGATTATCGCTA, 서열번호 5) 및 3-프라이머로서 올리고뉴클레오타이드(AACCCCTCAAGACCCGTTTA, 서열번호 6)를 각각 사용하였다. PCR은 95℃에서 5분 동안 가열하여 주형 DNA를 전변성시킨 후, 94℃에서 50초; 50℃에서 1분; 및 72℃에서 1분을 1 사이클로 하여 총 35회 반복 수행한 다음, 72℃에서 6분 동안 최종적으로 반응시켜 수행하였다. 이후, PCR 반응 산물의 염기서열을 염기서열 분석 회사(바이오니아, 한국)에 의뢰하여 판독하였다. 판독된 염기서열을 바탕으로 아미노산 서열을 추정하고, 추정된 아미노산 서열을 ClustalW 프로그램으로 분석하였다.

그 결과, 도 2에서 보듯이, 서열번호 1로 표시되는 CKNPTTGTC, 서열번호 2로 표시되는 CDWWFKKTC, 서열번호 3으로 표시되는 CSPNKERTC, 및 서열번호 4로 표시되는 CSLLRPLEC의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 55개 클론 중 각각 7개(12.7%), 6개(10.9%) 5개(9.1%), 및 4개(7.2%) 빈도로 나타나, 이들 펩타이드가 주로 선별되었음을 알 수 있었다. 이 외에도 2개 및 1개씩만 나타난 펩타이드도 있었다.

<1-4>선별된 파지의 히스톤 H1 에 대한 결합 특이성 확인

선별된 파지 클론의 히스톤 H1에 대한 결합 특이성(binding specificity)을 다음과 같이 파지 결합 ELISA(phage binding ELISA)를 통해 측정하였다.

먼저, 이뮬론 1B 마이크로타이터 플레이트(Immulon 1B microtiter plates)를 200ng의 소혈청 알부민 또는 히스톤 H1로 코팅하였다. 그런 다음10mg/ml의 알부민을 포함하는 TBS배지로 실온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다.

선별된 파지 클론(1×10⁹ pfu)을 100ul의 TBS-T (TBS+0.1% Tween-20) 버퍼에 넣어 알부민 또는 히스톤 H1로 코팅된 플레이트에 첨가하고, 이를 천천히 흔들어 주면서 실온에서 1시간 동안 반응 시켰다. 선별에 사용한 M13 파지 라이브러리 자체는 대조군으로 사용하였다. 반응이 끝난 후 TBS-T(TBS+0.1% Tween-20) 버퍼로 6회 강하게 세척한 다음 플레이트에 결합한 파지를 HRP(horseradish peroxidase)-결합된 항-M13 항체(New England Biolabs) (dilution, 1:4000 in TBS-T)와 실온에서 1시간 동안 결합시켜 검출하였다. 그런 다음 HRP의 기질 용액(TMB, Pierce)으로 10-30분 동안 발색반응을 시켰다. 발색반응은 2N H₂SO₄를 첨가하여 중단시키고 마이크로플레이트 리더(microplate reader, Bio-Rad, model 550)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 3에서 보듯이, 대조군인 M13 파지 라이브러리에서는 히스톤 H1로 코팅된 마이크로 플레이트에 거의 결합하지 않는 데에 비해, 본 발명의 선별된 파지 클론(CKNPTTGTC, CDWWFKKTC, CSPNKERTC, CSLLRPLEC)는 강하게 히스톤 H1과 결합함을 알 수 있었다. 한편, CKNPTTGTC, CDWWFKKTC, CSPNKERTC, 및 CSLLRPLEC 파지 클론의 경우 알부민과 대비하여 히스톤 H1에 각각 217배, 113배, 124배 및 251배 정도 더 강하게 결합함을 알 수 있었다.

< 실시예 2>

사멸세포에 대한 결합 특이성 확인

<2-1> 선별된 파지의 배양상태의 사멸세포에 대한 결합 특이성 확인

사멸세포에 대한 본 발명의 펩타이드 결합을 확인하기 아포토시스가 유도된 세포에 대한 상기 선별된 파지의 결합 특이성을 확인하였다.

먼저 96-well 세포배양 용기에 10⁵개의 SNU484 세포를 배양한 다음, 20μM Cisplatin + 200μM 5-fluorouracil (5-FU)를 세포에 6 내지 15시간 처리하여 아포토시스를 유도하였다. 약 10⁹ pfu의 파지를 4℃에서 1시간 동안 세포사멸을 유도한 세포와 반응시키고, HRP-결합된 항-M13 항체를 실온에서 1시간 동안 결합시켰다. 그런 다음 HRP의 기질 용액(TMB)으로 10-30분 동안 발색반응을 시켰다. 발색반응은 2N H₂SO₄를 첨가하여 중단시키고 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 약제를 처리하지 않은 세포에 비해서 약제를 처리한 사멸세포에는 CKNPTTGTC(서열번호 1) 파지는 1.8배, CDWWFKKTC(서열번호 2) 파지는 2.5배, CSPNKERTC(서열번호 3) 파지는 2.9배, CSLLRPLEC(서열번호 4) 파지는 2.3배 정도 더 강하게 결합함을 알 수 있었다. 한편, 대조군인 M13 파지 라이브러리는 사멸세포에 거의 결합하지 않았다.

<2-2> 사멸세포에 대한 본 발명의 펩타이드의 결합

사멸세포에 대한 본 발명의 펩타이드 결합을 확인하기 위해 사멸세포에 플루오레신이 표지된 본 발명의 펩타이드를 처리한 다음, 결합 여부를 FACS 분석으로 확인하였다.

먼저 세포배양 용기에 SNU484 세포를 배양한 다음, 20μM Cisplatin + 200μM 5-fluorouracil (5-FU)를 세포에 6 내지 15시간 처리하여 아포토시스를 유도하였다. 약물 처리후, 세포를 트립신 처리하여 시험관으로 수거하였다. 플루오레신 표지된 본 발명의 CDWWFKKTC 펩타이드(서열번호 2) 또는 CSLLRPLEC 펩타이드(서열번호 4)를 10μM 농도로 약제를 처리하지 않은 세포 또는 약제(Cisplatin/5-FU)를 처리한 사멸세포와 시험관에서 4℃에서 1시간 반응하였다. 한편, 사멸세포와 결합하는 것으로 기존 알려진 펩타이드인 ApoPep-1을 동일 조건으로 세포와 반응하였다. 또한 사멸세포와 결합하는 것으로 기존 알려진 단백질인 아넥신 V는 실온에서 15분간 세포와 반응하였다. 반응이 끝난 후, 상기 세포에 대한 펩타이드 결합을 FACS 기기(Becton Dickinson사)를 사용하여 FACS 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 5에서 보듯이, 약제를 처리하지 않은 정상세포에는 펩타이드가 거의 결합하지 않는 데에 비해서 약제를 처리한 사멸세포에는 CDWWFKKTC(서열번호 2) 및 CSLLRPLEC(서열번호 4) 펩타이드가 각각 약 54%와 52% 퍼센트로 결합함을 알 수 있었다. 한편, 사멸세포에 ApoPep-1 펩타이드 및 아넥신 V를 처리한 경우 각각 약 45%와 63%정도 결합하였다.

<2-3> 오토파지세포에 대한 본 발명의 펩타이드의 결합

세포죽음의 또다른 형태인 오토파지세포(autophagic cells)에 본 발명의 펩타이드를 처리한 다음, 결합 여부를 형광현미경 분석으로 확인하였다.

먼저 세포배양 용기에 A549 세포를 배양한 다음, 1 μM Rapamycin을 세포에 4 시간 처리하여 오토파지를 유도하였다. 약물 처리후, 세포를 트립신 처리하여 시험관으로 수거하였다. 플루오레신 표지된 본 발명의 CKNPTTGTC(서열번호 1), CDWWFKKTC 펩타이드(서열번호 2), CSPNKERTC(서열번호 3), 또는 CSLLRPLEC 펩타이드(서열번호 4)를 10μM 농도로 약제를 처리하지 않은 세포 또는 약제를 처리한 세포와 시험관에서 4℃에서 1시간 반응하였다. 반응이 끝난 후, 상기 세포에 대한 펩타이드 결합을 형광현미경 기기를 사용하여 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 6에서 보듯이, 약제를 처리하지 않은 정상세포 뿐만아니라 약제를 처리한 오토파지세포에도 CKNPTTGTC(서열번호 1), CDWWFKKTC 펩타이드(서열번호 2), CSPNKERTC(서열번호 3), 또는 CSLLRPLEC 펩타이드(서열번호 4) 펩타이드가 거의 결합하지 않음을 알 수 있었다.

이상 살펴본 바와 같이, 이와 같이, 본 발명은 히스톤 H1과 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 이를 이용한 사멸세포검출용 조성물, 사멸세포 특이적 약물 전달용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 사멸세포에 특이적으로 결합하므로, 사멸세포가 발생하는 종양성 질환, 뇌졸중, 심근경색 및 동맥경화 치료제, 상기 질병의 영상화제 제조에 효과적이므로 산업상 이용가능성이 높다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Peptides binding histone H1 specifically and uses thereof <130> NP14-0033 <150> 10-2013-0048546 <151> 2013-04-30 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Histone binding peptide 1 <400> 1 Cys Lys Asn Pro Thr Thr Gly Thr Cys 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Histone binding peptide 2 <400> 2 Cys Asp Trp Trp Phe Lys Lys Thr Cys 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Histone binding peptide 3 <400> 3 Cys Ser Pro Asn Lys Glu Arg Thr Cys 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Histone binding peptide 4 <400> 4 Cys Ser Leu Leu Arg Pro Leu Glu Cys 1 5 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for phage display amplification <400> 5 agcggaccag attatcgcta 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for phage display amplification <400> 6 aacccctcaa gacccgttta 20

Claims (23)

1. 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 표시되는 히스톤 H1과 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항의 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
   
5. 제4항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
   
6. 제5항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
   
7. 제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 히스톤 H1이 세포막 바깥쪽으로 노출된 사멸 세포 검출용 조성물.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
   
9. (a) 제1항의 폴리펩타이드를 시료와 혼합하는 단계;
   (b) 미결합되거나 비특이적으로 결합된 상기 폴리펩타이드를 제거하는 단계; 및
   (c) 상기 폴리펩타이드의 결합 여부 및 위치를 확인하는 단계를 포함하는 히스톤 H1이 세포막 바깥쪽으로 노출된 사멸 세포의 검출 방법.
   
10. 제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 히스톤 H1이 세포막 바깥쪽으로 노출된 사멸세포 특이적 약물 전달용 조성물.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 조성물은 질환 부위에 히스톤 H1이 세포막 바깥쪽으로 노출된 사멸세포가 포함된 종양성 질환, 뇌졸중, 심근경색 및 동맥경화로 이루어진 군에서 선택된 질환에 특이적인 것임을 특징으로 하는 조성물.
    
12. 제11항에 있어서, 상기 종양성 질환은 대장암, 폐암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종, 피부암, 간암, 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 복합 골수종(multiple myeloma), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 신경아종(neuroblastoma), 재생불량성 빈혈로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
    
13. 제10항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 파클리탁셀, 독소루비신, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌(bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴(cisplain), 5-플로오우라실(5-fluouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란(melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard), 니트로소우레아(nitrosourea), 스트렙토키나제(streptokinase), 유로키나제(urokinase), 알테플라제(alteplase), 안지오텐신(angiotensin) II 억제제, 알도스테론(aldosterone) 수용체 억제제, 에리트로포이에틴(erythropoietin), NMDA (N-methyl-d-aspartate) 수용체 억제제, 로바스타틴(Lovastatin), 라파마이신(Rapamycin), 셀레브렉스(Celebrex), 티클로핀(Ticlopin) 마리마스타트(Marimastat) 및 트로케이드(Trocade)로 이루어진 군에서 선택된 약제와 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
    
14. 제1항의 폴리펩타이드 및 이와 결합된 항-종양성 질환 제제를 유효성분으로 포함하는 질환부위에 히스톤 H1이 세포막 바깥쪽으로 노출된 사멸세포가 포함된 종양성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
    
15. 제14항에 있어서, 상기 항-종양성 질환 제제는 파클리탁셀, 독소루비신, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌(bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴(cisplatin), 5-플로오우라실(5-fluouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란(melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아(nitrosourea)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
    
16. 삭제
17. 삭제
18. 제1항의 폴리펩타이드 및 이와 결합된 뇌졸중 치료제를 유효성분으로 포함하는 질환부위에 히스톤 H1이 세포막 바깥쪽으로 노출된 사멸세포가 포함된 뇌졸중 예방 및 치료용 약학적 조성물.
    
19. 삭제
20. 제1항의 폴리펩타이드 및 이와 결합된 심근경색 치료제를 유효성분으로 포함하는 질환부위에 히스톤 H1이 세포막 바깥쪽으로 노출된 사멸세포가 포함된 심근경색 예방 및 치료용 약학적 조성물.
    
21. 삭제
22. 제1항의 폴리펩타이드 및 이와 결합된 동맥경화 치료제를 유효성분으로 포함하는 질환부위에 히스톤 H1이 세포막 바깥쪽으로 노출된 사멸세포가 포함된 동맥경화 예방 및 치료용 약학적 조성물.
23. 삭제

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