KR101024702B1 - 비 세포 림포마(라지) 표적 저분자 결합 유도 펩타이드 - Google Patents

비 세포 림포마(라지) 표적 저분자 결합 유도 펩타이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 in vitro 파지 디스플레이 기법에 의해 선발되어 암세포 표면에 발현되는 수용체를 표적할 수 있는 저분자 결합 유도 펩타이드에 관한 것으로, 본 발명에 따른 펩타이드는 암세포의 표적 및 결합 능력을 획기적으로 증진시킨 효율적인 투약 시스템에 효과적으로 이용될 수 있다.
수용체 리간드 상호작용, 암세포 표적물질, 파지 디스플레이, 세포 특이적 결합 펩타이드

Description

비 세포 림포마(라지) 표적 저분자 결합 유도 펩타이드{Nonapeptide targeting B cell lymphoma, Raji}
본 발명은 암세포 표면에 발현되는 수용체를 표적할 수 있는 저분자 결합 유도 펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 in vitro 파지 디스플레이 기법에 의해 선발되어 암세포 표면에 발현되는 수용체를 표적할 수 있는 펩타이드 서열 CTLPHLKMC를 갖는 저분자 결합 유도 펩타이드에 관한 것이다.
환경오염 및 서구적인 식습관 패턴의 변화로 인해 성인 및 소아암 발병률이 기존에 비해 급격히 증가한 현 상황에서 암세포를 조기 진단하기 위한 물질의 개발이 최근 들어 많은 연구진에 의해 활발히 이루어지고 있는 추세이다.
이러한 암 진단 물질의 개발 분야 산업은 21세기 국가 핵심전략산업인 생명공학산업에서 가장 비중이 큰 분야중 하나로, 화학 및 분자생물학적 기술의 비약적인 발전에 힘입어 신의약품 개발 가능성과 그 성공확률이 매우 높을 것으로 예상되며, 이를 기반으로 인류의 삶의 질 향상에 큰 기여를 할 것으로 예상된다. 초기 단 계의 암세포를 진단할 수 있는 물질의 개발은 난치병으로 알려진 암 치료에 있어 암세포의 조기 진단뿐만 아니라 환자의 완치율을 높일 수 있는 가장 효과적인 방법으로 알려져 있다.
최근 국내의 연구진에 의해 나노미터(10억분의 1ｍ) 단위의 자석입자에 면역세포인 항체를 붙인 암 진단용 나노물질이 개발 되었다. 이를 이용할 경우 자기공명영상촬영장치(MRI)로 진단되지 않던 초기 암세포가 이 물질을 투여하면 포착되는 것이 확인되었다. 이러한 연구의 기본 원리는 암세포를 특이적으로 인식할 수 있는 물질을 생체에 주입하면 표적을 찾아가는 미사일처럼 항체가 암세포에 결합하고, 곧이어 항체에 붙어있는 나노 자석입자가 MRI 신호를 증폭시켜 암세포의 위치를 나타내어 주는 것으로 해석 될 수 있다.
또한, 다국적 바이오기업 제넥셀세인은 국내 연구진과 공동으로 표적항암제 및 당뇨성 망막질환 치료 후보물질인 DAPP라는 물질을 개발하였으며 이 물질이 암 조직을 둘러싼 혈관세포의 신생합성(angiogenesis)을 억제하여 기존의 표적항암제에 비해 효과가 80% 정도 우수하다는 것을 증명하였다. 따라서 암세포의 조기진단을 가능케 하는 표적물질의 탐색과 암세포의 성장을 선택적으로 억제할 수 있는 가장 근본적인 방법인 암세포 주위의 혈관신생합성을 억제할 수 있는 물질의 개발과 암세포주의의 혈관내막세포에 발현된 특이적인 혈관내막세포 수용체를 인식할 수 있는 물질의 개발은 향후 암세포 치료에 있어 선결되어야 할 분야로 주목받고 있다.
세포 진단에 있어 가장 필수적인 방법으로 알려진 것이 방사선을 이용한 진 단이다. 1895년 W.K 뢴트겐에 의해 발견된 X-선은 현대의학과 떼려야 뗄 수 없는 불가분의 관계를 가지고 있어 사람들의 눈에는 보이지 않지만 인체의 내부를 밝혀주는 더 정확하고 더 선명한 영상을 얻기 위해 여러 장치를 개발해 내었다. 컴퓨터 단층촬영 (CT: Computer Tomography)과 MRI (Magnetic Resonance Imaging)와 같은 기존의 이러한 장치들은 평면적인 기존 장비의 단점을 개선한 진단장비로 암의 조기진단에 있어 큰 기여를 하였다. 그러나 이러한 촬영을 하기 위해서는 X-선의 흡수를 돕거나 조절하는 조영제의 복용을 필요로 한다. 이러한 약물 자체는 방사선을 내지 않으며 단지 X-선의 투과를 돕는 보조적인 역할을 하는 것으로 알려져 있으나 환자들에게 거부감을 주는 요인 중 하나로 작용하기도 한다.
또한 암의 진단을 가능하게 하기 위하여 환자에게 반감기가 짧은 Tc-99m, Ga-67, Tl-201 등의 암 진단용 방사성의약품을 사용하여 진단하는 신티그래피라고 부르는 방법이 사용되기도 한다. 그러나 반감기가 짧은 방사성 의약품을 사용하는 것이 인체에 큰 영향을 미치지 않을 것이라 알려져 있으나, 이러한 물질을 투여하게 되는 환자의 측면에서 생각해 볼 때 이러한 방사성의약품을 대체할 수 있는 물질의 개발이 절실하게 요구되고 있는 실정이다.
최근 생명공학의 발전으로 인해 다양한 암세포 표적 약물이 기존의 방사성 물질 사용을 대체할 차세대 약물로써 개발되고 있는 현 시점에서 인체에 무해한 고효율의 암세포 표적 물질의 개발은 환자의 복용 순응도를 높일 수 있으며, 진단효율의 증가와 더불어 항암제 투여 효율을 높일 수 있을 것으로 예상된다.
수용체 매개 물질운송 기전 (recptor mediated endocytosis)은 세포막에 발 현된 수용체 (receptor)가 특정한 작용기 (ligand)를 인식하여 엔도좀 (endosome)을 형성하여 세포질(cytosol)내로 진입하는 과정을 의미한다. 이러한 기전에는 다양한 세포막 수용체(membrane receptor) 및 소포체 형성 단백질(clathrin, adaptin 등) 세포질 내 물질의 분배를 담당하는 다양한 신호전달 단백질(vesicular sorting signal)등이 관여하며, 펩타이드계 호르몬, 성장인자(growth factor), 면역항체 등의 거대 분자 단백질도 이러한 기전을 통해 분해되지 않은 형태로 세포 내로의 운송이 가능하다. 특히 이러한 수용체 매개 물질운송 기전 (recptor mediated endocytosis)의 과정 중 가장 먼저 일어나는 수용체-작용기 상호작용은 극성세포 (polarized cell)의 표면에서 트랜스사이토시스(transcytosis)를 유도할 수 있으며, 수용체와 결합한 특정한 물질이 기능을 유지한 채 세포를 통과하여 혈류까지 도달할 수 있도록 하는 기전으로 암세포를 둘러싸고 있는 혈관 내막세포를 통한 항암물질의 이동 및 소장 상피세포를 통한 효과적인 약물전달 시스템 개발에 응용할 수 있는 높은 잠재력을 가지고 있다 (Okamoto, 1998)(도 1 참조).
즉, 목적하는 약물의 전달 효율 및 흡수를 증진시키기 위해 특정 수용체를 인식할 수 있는 작용기를 화학적 접합(chemical conjugation)이나 유전자 재조합 기술(genetic engineering) 등으로 약물과 결합시키는 방안을 생각해 볼 수 있다.
그러나 수용체 작용기 상호작용을 유도하는 것으로 알려진 물질과 항암제를 결합한 신개념의 약물을 개발하여 이를 이용해 암세포의 표적 효율을 높이고 나아가 암세포의 성장을 억제하는 개념에는 몇 가지 고려하여야 할 문제점이 있다.
첫째는 이러한 개념의 약물의 경우 특정 작용기의 수용체에 대한 인식 능력 이 약물의 효율을 결정하는 중요한 요소로서 작용한다. 수용체 작용기 상호작용이 매우 특이적이어야 한다. 전술한 바와 같이 암세포의 경우 진행이 일정 수준 이상으로 일어날 경우 타 기관으로 이동하는 전이 (metastasis)가 일어나게 된다. 이러한 변화로 인해 암세포의 표면에 발현된 수용체의 발현 패턴이 일어나기 때문에 각 단계별로 발현하는 특정 수용체를 인식할 수 있어야 한다. 또한 암세포를 표적하는 작용기를 개발할 것인지 아니면 암세포를 둘러싼 혈관내막세포에 특이적으로 발현되어 있는 수용체를 인식하는 작용기를 이용하여 암세포 내로 트랜스사이토시스를 유도하여 선택적 세포사멸을 유도하는 두 가지 방법을 구분하여야 하며 이에 따른 전략이 차별화되어야 한다.
둘째로, 암세포 표면에 발현된 특이적 수용체 및 암세포를 둘러싼 혈관 내막세포를 인식할 수 있는 작용기를 개발한 이후 실제 약물 전달에 있어서 고려하여야 할 부분은 작용기의 수용체에 대한 약물 효과의 감소에 대한 문제로, 기존의 트랜스사이토시스를 유도하는 것으로 알려진 물질을 암세포 내로 흡수시키고자 하는 약물에 도입할 경우 약물의 구조변화에 따른 기능저하가 초래될 수 있다. 이러한 문제는 유전자 재조합을 통해 단일 사슬(single chain)로 약물을 제조할 경우 흔히 나타날 수 있는데, 흡수효율 증진을 위해 도입한 물질 또한 고분자일 경우 이들에 의해 약물 고유의 기능이 차폐되거나 단백질 생산과정에서 미스폴딩(misfolding)에 의해 불활성 단백질화 되는 경우이다. 이러한 문제를 해결하기 위해서는 흡수효율 증진을 위해 도입되는 물질이 약물 단백질과 단일 사슬로 생산되더라도 약물의 구조나 기능을 방해하지 않는 수준의 저분자 물질이어야만 한다.
마지막으로 운송효율의 문제인데, 이는 암세포에서 작용기를 인식할 수 있는 수용체(receptor)의 특이성 및 발현 양과 관계가 있다. 수용체 작용기 상호작용을 이용한 결합 특이적 작용기의 개발의 관건은 결합의 특이성에 의해 결정되며 또한, 이러한 수용체가 얼마나 발현이 많이 되어 있는지가 중요한 요소로서 작용한다. 한 단계 더 나아가 약물 전달 효율을 높이기 위해서는 얼마나 효율적으로 흡수가 되는가에 있으므로 수용체 작용기 상호작용을 이용한 항암물질의 개발에 있어 수용체 작용기 상호작용에 의해 흡수를 유도하는 것으로 이미 알려져 있는 물질이라도 암세포 및 혈관 내막세포에 수용체의 발현양이 저조하여 흡수효율이 떨어진다면 약물 전달 파트너로서의 의미가 퇴색될 수밖에 없다. 따라서 기존의 흡수를 유도하는 것으로 알려진 물질 중에 어떤 것이 약물-결합 파트너(drug-conjugation partner)로서의 최적의 선택일 것인가에 대한 추가검증이 불가피해 진다. 그러나 기존에 알려진 각각의 물질에 대해 개별적으로 암세포 및 혈관 내막세포에서의 흡수효율을 비교하여 우열을 가리는 것은 매우 어려운 일이기 때문에 이를 극복하기 위해서는 암세포 표면에 발현되어 있는 수용체를 표적할 수 있는 물질을 빠르고 효과적으로 탐색할 수 있는 새로운 연구기법을 정립해야 할 필요가 있다.
단백질과 단백질간의 상호작용(protein-protein interaction)을 탐색하는 기술에는 여러 가지가 있는데, 그 중 파지 디스플레이(phage display)는 박테리아(bacteria)에 특이적으로 감염하는 기생체인 박테리오파지의 유전자에 인위적으로 다양한 아미노산 서열을 생산하는 유전자를 도입하여 생산한 재조합 박테리오파지를 이용해 특정 단백질과 결합능력이 있는 미지의 아미노산 서열을 선발하는 기 술로써, 항원 결정기의 동정(epitope mapping), 백신 개발(vaccine development), 작용기-수용체 결합능력 확인(ligand-receptor affinity research), 생리활성 펩타이드 선발 (bioactive peptide selection) 등 다양한 분야에서 그 활용성이 검증되어 있다(Smith 등, 1993).
대표적으로 쓰이는 M13 파지 디스플레이 시스템의 경우에는 M13 박테리오파지의 게놈(genome)중에서 코트 단백질(coat protein)의 일종인 pIII 또는 pVIII를 생산하는 유전자 말단에 7～15개의 무작위 아미노산 서열(random amino acid sequence)의 펩타이드가 발현되도록 인위적으로 유전자 서열을 삽입한 후, 대장균(E. coli)에 감염시켜 얻은 수억 종 이상의 서로 다른 펩타이드를 발현한 재조합 박테리오파지를 이용해 바이오패닝(biopanning)이라는 일련의 과정을 거쳐 특정 단백질과 강한 결합능력을 보이는 파지를 선발하도록 고안되어 있다. 이렇게 선발된 박테리오파지로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출해 인위적으로 삽입했던 특정 펩타이드를 발현하는 DNA 염기서열을 분석하면 목적하는 작용기(ligand) 펩타이드를 얻을 수 있게 된다(도 2 참조).
한편, 이러한 파지 디스플레이 기술을 이용하면 특정 단계의 암세포 외벽에 발현되어 있는 수용체 및 암세포를 둘러싸고 있는 특이적으로 결합하는 펩타이드 서열(organ homing peptide)의 동정도 가능하다. 비단 암세포만이 아니라, 생체의 각 조직이나 기관은 모세혈관으로부터 기능유지에 필요한 다양한 물질을 수용체 매개 물질 운송 기전(receptor -mediated endocytosis)을 통해 공급받고 있기 때문에 이들 모세혈관 내막에는 각 조직이나 기관 특이적인 다양한 수용체(receptor)분자 들이 발현되어 있다.
따라서 이러한 수용체와 결합할 수 있는 작용기(ligand)를 찾아서 특정 약물에 도입할 수 있다면 조직이나 기관에 특이적으로 작용하는 약물의 개발이 가능해진다 (Kolonin 등, 2001). 이러한 배경을 바탕으로 Pasqualini 등은 마우스(mouse)를 이용한 in vivo 파지 디스플레이 기술을 새롭게 고안하였다. 특정 암세포를 둘러싼 혈관 내막세포에는 특정 수용체가 발현되어 있기 때문에 혈관 어드레스(vascular address) 라는 개념을 제시하였다.
이들의 연구에 따르면 다양한 아미노산 서열을 발현 하는 파지 라이브러리를 인간의 암세포가 이식되어 있는 마우스에 주입할 경우 특정 기관의 암세포의 혈관내막세포 표면에 발현되어 있는 펩타이드 서열뿐만 아니라 특정 기관에 특이적으로 결합하는 펩타이드 서열을 대량으로 동정하는데 성공하였으며 (Pasqualini 등, 1996; Rajotte 등, 1998), 이러한 조직 특이적 펩타이드 모티프를 항암제에 도입할 경우 암세포 특이적인 약효가 있음이 보고 되기도 하였다 (Arap 등, 1998). 마우스를 이용한 특정 기관 표적형 펩타이드를 선발하기 위한 In vivo 파지 디스플레이 기술의 개념은 아래의 모식도와 같다(도 3 참조).
전술한 바와 같이 파스쿠알리니(Pasqualini) 등 (1996)은 파지 라이브러리를 생쥐의 혈관을 통해 주입한 후 일정시간 동안 혈류를 통해 순환시킨 다음, 적출된 각 기관으로부터 결합되어 있는 파지를 동정하고 그들이 가지고 있는 펩타이드 서열을 분석해 각각의 기관에 특이적으로 결합하는 펩타이드 서열을 선발하였다. 이러한 개념을 본 연구에 적용하면 암 세포의 표면에 발현되어 있는 수용체의 양상도 다를 것이라 예상할 수 있다. 따라서 파지 디스플레이 기법을 응용하면 암세포에 발현된 세포벽 수용체에 특이적으로 결합하는 펩타이드 서열도 찾을 수 있을 것으로 예상할 수 있다. 예를 들어, 파지 라이브러리를 암세포와 혼합한 후 일정시간 동안 정치한 다음 비특이적으로 결합하고 있는 파지를 제거한 후 특이적으로 결합하고 있을 것으로 예상되는 파지를 동정한다면 이러한 파지는 암세포 표면에 발현되어 있는 수용체에 특이적으로 결합한 것으로 이들이 가지고 있는 펩타이드 서열은 세포벽 수용체에 특이적으로 결합하는 펩타이드일 가능성이 높을 것이다.
따라서 이러한 펩타이드 서열을 특정 항암제에 도입하게 되면 펩타이드의 수용체 결합능력에 의해 암세포 특이적인 표적 및 더 나아가 암세포 내로 약물을 운송할 수 있는 효율이 증진될 것으로 예측할 수 있다.
따라서 본 발명자들은 in vitro 파지 디스플레이 기술을 응용하여, 혈액세포 중 B 세포 유래 임파종 세포인 Raji 세포에서 특이적 결합을 유도하는 펩타이드 서열을 탐색하기 위해, 파지 라이브러리를 세포에 넣어주고 결합 특이적 파지를 동정하는 'in vitro 파지 디스플레이’ 기법을 새롭게 고안함으로써 본 발명에 이르게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 암세포 특이적 결합 단백질을 탐색하기 위한 기존의 생화학적 방법의 단점을 보완한 보다 간편한 방법으로 세포 표적 작용기를 탐색 하기 위하여 기존의 파지 디스플레이 기법(파지 display technique)을 응용한 in vitro 파지 디스플레이 기법을 고안하여 그 기술적인 조건을 최적화 하고, 확립된 기법을 이용해 B 세포 유래 임파종 세포주인 Raji 세포에 특이적으로 결합하는 펩타이드 작용기(peptide ligand)를 탐색한 후, 이들의 특성을 다각적인 방법을 통해 규명하고 세포 특이적 결합 작용기의 수용체를 탐색함으로써 향후 본 연구에서 개발된 암세포 표적형 펩타이드 작용기를 이용한 효율적인 약물전달 시스템의 기반을 구축 하는 데 있다.
본 발명의 상기와 같은 목적은 in vitro 파지 디스플레이 기법을 이용한 연속적인 바이오패닝(biopanning) 과정을 통해, 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 배양중인 Raji 세포에 넣고 결합을 유도한 후 결합된 파지의 개체수를 조사하여 Raji 세포 특이적 결합을 유도할 것으로 예상되는 펩타이드를 보유한 재조합 파지의 개체수가 바이오패닝을 거듭함에 따라 현격하게 증가하는 양상을 확인하고, 분리한 재조합 파지의 DNA를 추출하여 그 염기서열을 분석하고 동정된 펩타이드의 아미노산 서열에 기반을 둔 분류 프로파일을 통하여 Raji 세포에 대해 특이적인 결합을 유도 할 수 있는 핵심 서열을 확인한 다음 이들의 분류 프로파일 분석을 통해 Raji 세포 표적 후보 펩타이드를 코딩하고 있는 파지를 선발하여 무작위적 펩타이드 서열을 가지는 파지와 결합능력을 비교하여 Raji 세포에 대하여 유의적으로 높은 결합능력을 보이는 ‘CTLPHLKMC' 서열을 가진 파지를 선발하고, 합성 펩타이드 를 이용한 다각적인 실험을 통해 'CTLPHLKMC' 펩타이드가 Raji 세포에 발현되고 있는 특정 단백질에 결합을 한다는 가능성을 확인하고, CTLPHLKMC 펩타이드 서열과 결합하는 Raji 세포 표면에 발현 하고 있는 수용체가 인간 면역글로블린 중사슬 가변영역이라는 것을 검증하여 CTLPHLKMC 펩타이드와 수용체간 결합 특이성을 규명함으로써 달성되었다.
본 발명에서는 기존의 파지 디스플레이 기법을 응용한 in vitro 파지 디스플레이 기법을 통해 Raji 세포외부에 발현된 수용체에 효과적으로 결합하는 펩타이드 서열을 선발하고 그 특성을 규명하였다. 선발된 펩타이드 중에서 CTLPHLKMC의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 B 세포 유래 암세포주인 Raji 세포 표면에 발현되어 있는 인간 면역글로블린 중사슬 가변영역에 특이적으로 결합하는 것을 확인 하였으며, 이 수용체를 특이적으로 인식함으로써 Raji 세포 표면에 유의적으로 높은 결합능력을 보이는 것으로 확인되었다.
따라서 본 발명은 암세포 표면에 발현되는 수용체를 표적할 수 있는 암세포 표적 저분자 결합 유도 펩타이드를 제공한다.
상기 본 발명에 따른 암세포 표적 저분자 유도 펩타이드는 CTLPHLKMC(서열번호 1), CLYGNSDKC(서열번호 2), CQHNHSKQC(서열번호 3), CTKQHTSQC(서열번호 4), CDWTKPQSC(서열번호 5), CNPSLALHC(서열번호 6), CSTGAHTQC(서열번호 7), CTVKNGTLC(서열번호 8), CQEGKMRLC(서열번호 9), CSEHKTPMC(서열번호 10), CQKQGHPSC(서열번호 11) 및 CTSTPFRIC(서열번호 12)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 펩타이드 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 암세포 표적 저분자 결합 유도 펩타이드가 특이적으로 결합하는 인간 면역글로블린 중사슬 가변영역을 제공한다.
상기 인간 면역글로블린 중사슬 가변영역은 75kDa의 밴드임을 특징으로 한다.
상기 본 발명에 따른 저분자 결합 펩타이드는 암세포 표면의 수용체를 특이적으로 인식할 수 있기 때문에 암세포의 진단에 사용되는 환자에게 투약에 대한 거부감을 줄 수 있는 방사성 암세포 표적 약물을 대체할 수 있고, 이를 통해 새로운 약물 전달 시스템의 개발 및 이를 이용한 새로운 약물의 개발에 이용할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 암세포 표적 저분자 결합 유도 펩타이드가 결합된 암세포 표적 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 암세포 표적 약학적 조성물은 도 1에서 도시한 바와 같이 수용체-작용기 상호작용 기전을 이용한 것으로 수용체와 결합한 특정한 물질이 기능을 유지한 채 세포를 통과하여 혈류까지 도달할 수 있도록 하는 기전으로 암세포를 둘러싸고 있는 혈관 내막세포를 통한 항암물질의 이동 및 소장 상피세포를 통한 효과적인 약물전달 시스템이다.
본 발명을 통해 선발된 저분자 결합 유도 펩타이드를 기존의 항암제에 분자생물학적 기법을 이용하여 도입하여 암세포의 표적 및 결합 능력을 획기적으로 증진시킨 효율적인 투약 시스템이 확립될 경우 관련 분야에 지대한 파급효과를 예상할 수 있다.
실용적으로는 의학 및 약학 분야에서 방사성 물질을 표적 물질로 사용하는데 있어 요구되었던 복잡한 절차를 간편한 저분자 펩타이드계 약물로 대체함으로서 그동안 환자들에게 야기 되었던 거부감 및 숙련된 노동력의 필요에 의한 불필요한 부대비용의 증가를 피할 수 있을 것이다. 아울러, 향 후 이러한 펩타이드가 경유하는 막 수용체에 대한 연구가 뒷받침 된다면 세포막 수용체와 이를 이용한 물질운송 기전을 규명하여 학술적 지식을 심화하는 데에도 크게 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
본 발명에 따른 암세포 표면에 발현되는 수용체를 표적할 수 있는 저분자 결합 유도 펩타이드는 암세포의 표적 및 결합 능력을 획기적으로 증진시킨 효율적인 투약 시스템에서 저분자 펩타이드계 약물로 이용될 수 있어, 의료산업 및 제약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
이하에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시예를 통해 보다 구체적으로 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리 기법 확립
본 발명에서 사용된 파지 디스플레이 펩타이드 디스플레이 라이브러리는 'ph.D.-C7CTM (New England BioLab.)'으로, 이는 M13 박테리오파지(bacteriophage)의 게놈(genome)중에서 코트 단백질(coat protein)의 일종인 pIII를 생산하는 유전자 말단에 7개의 무작위 아미노산 서열(random amino acid sequence)의 펩타이드(peptide)가 발현되도록 인위적으로 유전자 서열을 삽입한 후, 대장균(E. coli)에 감염시켜 얻은 수억 종 이상의 서로 다른 펩타이드를 발현한 재조합 박테리오파지로 구성되어 있다.
한편, M13 파지에 도입되어 있는 7개의 무작위 아미노산 서열은 양쪽에 시스테인 잔기를 보유하도록 설계되어, 펩타이드 발현 시 자연적으로 이황화 결합(disulfide bond)을 형성함으로써 고리모양(loop shape)을 이루도록 하여 목적 단백질과 더욱 강한 결합을 유도할 수 있게 고안되어 있다(도 2a 참조).
기존의 파지디스플레이 연구기법을 응용하여 암세포 표면의 수용체에 결합할 수 있는 능력을 가진 펩타이드 작용기를 효과적으로 탐색하는 ‘in vitro 파지 디스플레이 기법’의 공정을 확립하고 이를 이용해 실제 파지 -펩타이드 라이브러리를 임파종 유래 B 세포주인 Raji 세포와 배양한 후 세포외부에 결합하고 있는 재조합 파지를 동정함으로써 확립된 실험기법의 효용성을 검정하였다.
In vitro 파지 디스플레이 기법은 1.0× 1011 pfu의 파지-펩타이드 라이브러리(개별 재조합 파지 클론의 약 100 카피) 또는 말단에 펩타이드를 가지고 있지 않는 인서트리스 파지 (wild type: negative control)를 배양중인 1.0× 1011 cell/mL의 Raji 세포에 넣어준 후 파지의 비 특이적 결합을 방지하기 위하여 4℃에서 30분 간 정치한 후 세척 과정을 거쳐 세포표면에 특이적으로 결합한 것으로 예상되는 파지를 회수하여 정량하는 순서로 이루어져 있다. 이러한 과정을 수차례 반복 수행(round of biopanning)한 다음 높은 효율로 Raji 세포 표면에 결합하고 있는 파지 집단이 어떠한 펩타이드 서열을 가지고 있는지에 대해 파지 게놈에 대한 염기서열을 분석함으로써 Raji 세포의 표면에 발현되고 있는 수용체에 특이적으로 결합능력을 보이는 펩타이드 작용기를 동정하게 된다.
실시예 2 : 확립된 in vitro 파지 디스플레이 기법에 의한 바이오패닝( Biopanning )
상기 실시예 1에서 확립된 in vitro 파지 디스플레이 기법을 이용하여 총 4 회의 순차적인 바이오패닝을 실시하여 각각의 회차에서 Raji 세포의 세포 표면에 결합된 파지를 정량하였다. 각 회차는 총 3차례의 독립적인 실험으로 구성되어 있으므로 각 회차의 파지 적정농도는 3번의 반복실험을 통해 얻어진 결과의 평균값을 나타낸다.
일반적으로 파지 디스플레이 기법을 통한 바이오패닝을 실시할 경우 목적하는 타깃과 강한 결합 친화력을 가지는 파지 집단이 회차를 거듭할수록 증가하기 때문에 회차에 따른 파지 적정농도의 증가 현상은 파지 디스플레이 실험에 있어서 실험이 의도한 방향으로 진행되고 있는지를 판가름하는 가장 기본적인 파라미터라고 할 수 있다. 도 5에서 나타난 바와 같이 그러한 현상은 본 연구를 통해서도 확인 할 수 있었는데, 확립된 in vitro 파지 디스플레이 기법에 의해 바이오패닝을 실시한 결과, 회차를 거듭할수록 회수된 파지의 적정농도가 3 회차에서 4 회차로 반복 됨에 따라 급격히 증가하는 양상을 보였다. 1 회차에 비해 4 회차의 파지 적정농도는 약 872배 증가하였으며, 말단에 펩타이드 서열을 포함하지 않는 인서트리스 파지의 경우에는 1 회차와 유사한 적정농도를 보였다.
바이오패닝의 회차를 거듭함에 따라 Raji 세포에 분포하는 파지의 수가 증가하는 이유는 세포 표면에 발현된 수용체에 높은 결합능력을 보이는 펩타이드 서열을 가진 파지의 비율이 회차의 진행에 따라 점차 증가하기 때문인 것으로 추정할 수 있었다.
실시예 3 : 펩타이드 서열의 동정
상기 실시예 2의 in vitro 파지 디스플레이 바이오패닝 과정을 통해 Raji 세포의 수용체에 특이적 결합을 할 것으로 예상되는 파지의 적정농도가 4 회차에서 가장 높은 수준을 보였기 때문에 4 회차 바이오패닝 과정에서 회수한 파지 집단을 아가 플레이트에 도말한 후 각각의 개별적인 파지 플라크를 취해 유전자 DNA를 추출하고 염기서열을 분석함으로써 각각 어떠한 펩타이드 서열을 보유하고 있는지를 동정하였다 (도 6 및 7 참조).
4 회차의 바이오패닝 과정을 거친 후 시료를 회수한 파지 집단에서 총 62개 파지 개체를 무작위로 선발하여 펩타이드 서열을 동정한 결과 인서트리스 파지를 제외한 46개의 유효 펩타이드 선발을 확인하였으며 클러스터 W 프로그램(ClustalW program)을 이용하여 서열 정렬을 실시한 결과‘CTLPHLKMC'의 아미노산 서열을 가진 펩타이드가 총 10회 반복되어 출현하는 것을 확인하였으며, 그 외 3회, 2회의 반복 출현 빈도수를 보이는 펩타이드 서열도 확인할 수 있었다(표 1 참조).
<표 1>
Raji 세포-표적 펩타이드의 서열 및 빈도
서열번호 서열 빈도(%)
1 CTLPHLKMC 10/46(21.7)
2 CLYGNSDKC 3/46(6.52)
3 CQHNHSKQC 3/46(6.52)
4 CTKQHTSQC 3/46(6.52)
5 CDWTKPQSC 2/46(4.34)
6 CNPSLALHC 3/46(6.52)
7 CSTGAHTQC 3/46(6.52)
8 CTVKNGTLC 1/46(2.17)
9 CQEGKMRLC 1/46(2.17)
10 CSEHKTPMC 1/46(2.17)
11 CQKQGHPSC 1/46(2.17)
12 CTSTPFRIC 1/46(2.17)
4 회차에서 Raji 세포에 결합한 파지의 적정농도가 105 (pfu/10μL)승 수준인 것을 감안할 때 이러한 거대 모집단에서 62개의 표본추출을 통해 10번의 출현 빈도수를 보였다는 것은 모집단 내에 이러한 펩타이드 서열을 가진 파지의 비율이 매우 높다는 것으로 해석할 수 있으며 이러한 펩타이드 서열은 Raji 세포외벽에 발현된 수용체에 특이적 결합을 유도할 수 있는 잠재력이 매우 높을 것으로 추정할 수 있었다.
실시예 4 : CTLPHLKMC 서열에 대한 소장 점막층 흡수효율 검정
상기 실시예 3에서 In vitro 파지 디스플레이 기법을 이용하여 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 Raji 세포에 주입 한 후 특이적으로 결합 능력을 보일 것으로 예상되는 파지로부터 동정한 CTLPHLKMC 펩타이드 서열에 대해 Raji 세포 특이적 결합능력을 검정하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
실시예 4-1 : 개별 파지 결합 분석 및 합성 펩타이드 결합 분석
특정 물질이 특정단계의 세포에 투여된 후 수용체 작용기 결합을 이루어 수용체에 의한 ‘수용체 매개 물질 운송 기전 (receptor-mediated endocytosis or transcytois)’을 통하여 세포 내로 흡수되기 위해서는 우선 세포 외부에 발현되어져 있는 특정 수용체에 특이적으로 결합능력을 가져야 한다. 따라서 본 실시예에서는 in vitro 파지 디스플레이 기법을 통해 선발된 CTLPHLKMC 펩타이드 서열을 말단에 보유하고 있는 파지와 인서트리스(와일드 타입) 파지 그리고 장상피세포를 특이적으로 트랜스사이토시스 시킬 수 있는 능력을 가진 것으로 알려진 CSKSSDYQC 펩타이드 서열을 말단에 보유하고 있는 파지를 이용하여 선발된 펩타이드 작용기를 발현하고 있는 파지와 장상피세포 특이적 트랜스사이토시스를 유도하는 펩타이드 서열을 말단에 보유하고 있는 파지를 이용하여 Raji 세포에 대한 결합력 차이를 비교하였다. 아울러 합성된 CTLPHLKMC 펩타이드의 첨가 유무에 따른 결합력의 변화를 유세포 분석기(Flow cytometer)를 이용하여 관찰하였다. 만약 이러한 결합이 실제 수용체의 매개에 의해 이루어지는 것이라면 합성 펩타이드 작용기 (CTLPHLKMC)의 첨가량이 증가할수록 결합하는 첨가된 합성 펩타이드가 증가하여야 한다. 따라서 Raji 세포에 대한 펩타이드의 결합의 증가 유무는 본 연구에서 선발한 펩타이드 작용기와 수용체 사이의 결합이 수용체 매개에 의한 것인지에 대한 간접적인 증거 가 될 수 있다.
그 결과, CTLPHLKMC를 보유한 파지의 경우 Raji 세포에 대한 결합능력이 인서트리스 파지 및 장상피세포 특이적인 펩타이드 서열을 보유하고 있는 CSKSSDYQC-파지에 비해 유의적으로 높은 수준을 보였다(도 5 (B) 참조). Raji 세포에 대한 펩타이드의 결합 친화력 및 특이성을 추가로 시험하기 위해 표 1의 펩타이드를 선택하여 비교하였다. 도 5 (C)에 나타내 바와 같이, CTLPHLKMC를 함유한 파지 클론이 인서트리스 대조 파지에 비해 대략 77배 이상의 가장 강력한 결합 친화력을 나타내었다.
본 실시예에서 사용된 CTLPHLKMC-파지 와 CSKSSDYQC-파지 그리고 인서트리스 파지의 유일한 차이는 파지 말단의 펩타이드 서열의 유무이므로 이러한 두 파지 그룹 간의 차이는 바로 CTLPHLKMC 펩타이드 서열에서 비롯되는 것으로 추정할 수 있었다.
다음으로 Raji 세포에 비오틴이 결합된 CTLPHLKMC 및 CSKSSDYQC 펩타이드를 첨가한 이후 결합 능력을 알아보기 위하여 스트렙타비딘(streptavidin)에 형광물질이 결합되어 있는 2차 항체를 이용하여 펩타이드의 결합능력을 유세포 분석기를 통하여 분석하였을 때(도 8 참조), CTLPHLKMC 펩타이드의 경우 사용된 펩타이드의 농도가 증가함에 비례하여 결합 정도가 증가한 반면 CSKSSDYQC 펩타이드의 경우 펩타이드의 첨가량이 증가에 따른 결합의 증가를 보이지 않았다[도 9 (A) 참조].
이러한 결과로 미루어 볼 때 CTLPHLKMC 펩타이드 서열은 Raji 세포 표면에 발현된 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 수용체를 지닌 것으로 예측되지만 Raji 세포가 B 세포 유래의 암세포주 이기 때문에 정상적인 B세포에 대한 결합능력을 보이는 지에 대한 여부를 검증할 필요성이 요구 되었다.
실시예 4-2 : CTHPHLKMC 펩타이드의 프라이머리 B 세포 결합 분석
본 발명에서 선발된 CTLPHLKMC 펩타이드 작용기(펩타이드 ligand)가 B 세포 유래 암세포주인 Raji 세포 표면의 수용체에 효과적으로 결합한다고 해서 반드시 Raji 세포 표면에 특이적으로 발현된 수용체에 결합하였다고 결론을 내리는 것은 지나친 논리적 비약이라고 할 수 있다. 따라서 본 실시예에서는 인간 혈액에서 분리한 프라이머리 B 세포에 CTLPHLKMC 펩타이드를 넣어 결합여부를 조사하였다. 그 결과 CTLPHLKMC 펩타이드 서열의 경우 장상피세포 특이적인 트랜스사이토시스 능력을 보인 펩타이드의 결합 양상과 유사하게 펩타이드 농도의 증가에 따른 프라이머리 B 세포에 결합증가가 나타나지 않는 것으로 확인되었다 [도 9 (C) 참조].
이상의 결과로 in vitro 파지 디스플레이 기법을 이용하여 선발한 CTLPHLKMC 펩타이드는 B 세포 유래의 암세포주인 Raji 세포 표면에 특이적으로 발현되어 있는 수용체에 효과적으로 결합할 수 있는 능력을 가진 것이라 결론지을 수 있었으며 향후 이를 이용할 경우 Raji 세포를 표적할 수 있는 펩타이드 작용기가 될 뿐만 아니라 이를 이용한 약물의 체내 전달효율을 크게 증진 시킬 수 있음을 검증할 수 있었다.
실시예 4-3 : CTLPHLKMC 펩타이드 결합 특이적 수용체의 탐색
전술한 일련의 실험을 통해 특정 펩타이드 서열을 말단에 발현하지 않은 야생형 파지(인서트리스 파지)와 소장 점막 층에서의 흡수효율이 높은 것으로 알려진 CSKSSDYQC 서열을 말단에 발현하는 재조합 파지에 비해 CTLPHLKMC 펩타이드 서열의 경우 Raji 세포 표면에 발현된 수용체에 결합할 수 있는 능력이 높은 것을 확인하였다.
본 실시예에서는 여기에서 한 단계 더 나아가 생화학적 분석기법인 면역침강(immunoprecipitation) 기법을 이용하여 Raji 세포 표면의 어떠한 수용체에 CTLPHLKMC 펩타이드 서열이 결합하고 있는지 검사하였다.
그 과정을 간략히 기술하면 먼저 Raji 세포로부터 막 단백질을 분리하였다. 이 후 바이오틴이 결합되어 있는 CTLPHLKMC와 CSKSSDYQC 펩타이드와 스트렙타비딘-아가로스 비드를 이용하여 펩타이드-비드 면역 복합체를 만들고 추출한 Raji 세포 막 단백질과 함께 혼합하여 펩타이드 리간드-단백질 상호작용을 유도하였다. 그 후, SDS-PAGE를 이용하여 각 펩타이드에 결합된 단백질을 분석하였다.
도 10에서 볼 수 있듯이 CSKSSDYQC, 음성 대조구로 사용된 바이오틴-스트렙타비딘 아가로스 비드 면역 복합체를 사용한 실험군과 비교 하였을 때, CTLPHLKMC 펩타이드의 경우 약 75kDa 위치에 두 개의 특이적 밴드를 확인할 수 있었다. 본 결과는 3차례의 반복실험을 통하여 동일하게 나타난 결과로서 이는 75kDa 위치의 두 개의 밴드가 CTLHPLKMC 펩타이드에 특이적으로 결합을 하는 수용체일 가능성이 높은 것으로 예상되었다. 따라서 이러한 결과를 바탕으로 75kDa의 크기를 나타내는 단백질의 특성을 분석하기 위하여 MALDI-TOF 분석을 실시하였으며, SWISS-PROT 단 백질 데이터 베이스를 이용하여 검색을 실시하였다.
그 결과 ~75kDa의 크기를 나타내는 아래의 밴드가 인간 면역글로블린 중사슬 가변영역(human immunoglobulin heavy chain variable region)으로 확인되었다. 다음으로 MALDI-TOF 분석을 통해 얻어진 데이터에 대한 검증을 하기 위하여 면역침강 시에 얻어진 단백질을 이용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 그 결과 기존의 SDS-PAGE의 결과와 동일한 75Kda의 밴드를 확인할 수 있었다(도 11 참조).
이러한 결과들을 종합해 볼 때, in vitro 파지디스플레이 기법을 이용하여 선발된 CTLPHLKMC-펩타이드는 Raji세포 표면에 발현되어 있는 인간 면역글로블린 중사슬 가변영역에 특이적으로 결합 하는 것으로 결론을 내릴 수 있었다. 개별 파지 결합 분석의 결과와 마찬가지로 CSKSSDYQC-펩타이드와 CTLPHLKMC-펩타이드의 특징을 구분 짓는 유일한 변인은 펩타이드 서열의 차이인 점을 감안할 때 CTLPHLKMC-펩타이드에 결합하는 75kDa의 밴드는 특이성을 가지는 수용체-작용기 결합에 의한 것으로 사료된다.
도 1은 소장 상피세포에서 FcRn 수용체에 의한 IgG의 트랜스사이토시스 및 수용체 작용기 상호작용을 이용한 약물의 개념을 나타낸 도이다.
도 2는 랜덤 파지 라이브러리의 개념 및 전형적인 in vitro 파지 디스플레이 과정을 나타낸 도이다.
도 3은 기관 특이적 펩타이드 서열을 탐색하기 위한 in vivo 파지 디스플레이 기법의 개념을 나타낸 도이다.
도 4는 암세포 특이적 수용체 결합능력을 가지는 펩타이드 작용기 서열을 탐색하기 위한 in vitro 파지 디스플레이 기법의 개념을 나타낸 도이다.
도 5는 In vitro 파지 디스플레이 바이오패닝 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 플라크 증폭 및 시퀀싱 템플릿 정제 과정의 모식도이다.
도 7은 (a) 랜덤 디설파이드-제한 헵타펩타이드-pIII 융합체의 N-말단 서열 이고, (b) 유전자 코드를 나타낸 도이다.
도 8은 펩타이드 결합 분석 과정을 나타낸 모식도이다.
도 9는 Raji 세포에 대한 CTLPHLKMC 펩타이드의 결합 특이성을 나타낸 그래프이다.
도 10은 CTLPHLKMC 펩타이드에 대한 숙주 상대 분자를 확인한 도이다.
도 11은 CTLPHLKMC 펩타이드에 대한 상대 분자를 확인한 도이다.
<110> Insilicotech <120> Nonapeptide targeting cancer cell <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Peptide <400> 1 Cys Thr Leu Pro His Leu Lys Met Cys 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Peptide <400> 2 Cys Leu Tyr Gly Asn Ser Asp Lys Cys 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Peptide <400> 3 Cys Gln His Asn His Ser Lys Gln Cys 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Peptide <400> 4 Cys Thr Lys Gln His Thr Ser Gln Cys 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Peptide <400> 5 Cys Asp Trp Thr Lys Pro Gln Ser Cys 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Peptide <400> 6 Cys Asn Pro Ser Leu Ala Leu His Cys 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Peptide <400> 7 Cys Ser Thr Gly Ala His Thr Gln Cys 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Peptide <400> 8 Cys Thr Val Lys Asn Gly Thr Leu Cys 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Peptide <400> 9 Cys Gln Glu Gly Lys Met Arg Leu Cys 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Peptide <400> 10 Cys Ser Glu His Lys Thr Pro Met Cys 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Peptide <400> 11 Cys Gln Lys Gln Gly His Pro Ser Cys 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Peptide <400> 12 Cys Thr Ser Thr Pro Phe Arg Ile Cys 1 5

Claims (6)

  1. 서열 번호 1의 펩타이드 서열을 갖는 암세포 표면에 발현되는 수용체를 표적할 수 있는 암세포 표적 저분자 결합 유도 펩타이드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 따른 암세포 표적 저분자 결합 유도 펩타이드가 결합된 암세포 표적 약학적 조성물.
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