JP2024507901A

JP2024507901A - その中にカプセル化されたゲストカーゴを含む人工タンパク質ケージ

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Publication number: JP2024507901A
Application number: JP2023551177A
Authority: JP
Inventors: ヘドル，ジョナサン; ビエラ，アルトゥル; アズマ，ユウスケ; ナスカルスカ，アントニナ; ボゼッカ－ソラーズ，キンガ; ロジッキー，ジャン; ストゥプカ，イザベラ
Original assignee: Uniwersytet Jagiellonski
Current assignee: Uniwersytet Jagiellonski
Priority date: 2021-02-24
Filing date: 2022-02-24
Publication date: 2024-02-21
Also published as: WO2022182261A1; CA3209414A1; CA3209417A1; EP4298115A1; US20240122868A1; CA3209412A1; EP4298117A1; US20240139339A1; WO2022182260A1; WO2022182262A1; US20240181077A1; JP2024507379A; JP2024507900A; MX2023009814A; EP4298116A1

Abstract

本発明は、選択された数のＴＲＡＰ環およびその中にカプセル化されたゲストカーゴを含む人工ＴＲＡＰケージを提供する。

Description

本発明は生化学分野に属する。本発明は、選択された数のＴＲＡＰ環およびその中にカプセル化されたゲストカーゴを含む、「ＴＲＡＰケージ」と呼ばれる人工タンパク質ケージに関する。

単分散ケージ様構造に会合するタンパク質は、バイオテクノロジーおよび医学における多様な適用のための有用な分子容器である。そのようなタンパク質ケージは、天然に、例えばウイルスカプシドに存在するが、実験室においても設計され得かつ構築され得る。

そのため、本発明者らは、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質の単一システイン変異体であるＴＲＡＰ－Ｋ３５Ｃが、金ナノ粒子との反応を介して、複数の環状１１量体サブユニットから構成される中空球体構造に会合し得ることを以前に記載した^１。結果として生じたタンパク質ケージは、多くの厳しい条件下で極めて高い安定性を示すが、還元剤の添加によってカプソメア単位に容易に解体する。

ＴＲＡＰケージのそうした魅力的な特徴は、細胞内送達ビヒクルを開発するのに理想的であるものの、本質的な課題は依然としてゲスト・パッケージングである。

本発明の目的は、化学量論制御可能な様式での、関心対象のタンパク質または治療薬を用いたＴＲＡＰケージの内的担持のための簡易でかつ堅牢な方法を提供することである。

本発明の主題は、選択された数のＴＲＡＰ環およびその中にカプセル化された少なくとも１種のゲストカーゴを含む人工ＴＲＡＰケージである。好ましくは、人工ＴＲＡＰケージは、架橋剤によって適所に保たれる選択された数のＴＲＡＰ環を含む。好ましくは、架橋剤は、分子架橋剤または原子金属架橋剤である。好ましくは、ＴＲＡＰ環は、金またはＤＴＭＥによって連結される。

好ましくは、ゲストカーゴは、ＴＲＡＰケージ内腔の直径以下の大きさである。好ましくは、ゲストカーゴは、直径が１６ｎｍを下回る。好ましくは、ゲストカーゴは、直径が４ｎｍ～１６ｎｍである。４ｎｍよりも大きいゲストカーゴは、ＴＲＡＰケージ内にまたはＴＲＡＰケージから拡散することができないであろう。

好ましくは、カーゴは、酵素（例えば、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ヒドロゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、リパーゼ、リアーゼ、リガーゼ、トランスフェラーゼ、レダクターゼ、リコンビナーゼ、ヌクレアーゼ酸修飾酵素、または他のタイプの酵素）、抗原、抗体を含む群から好ましくは選択されるタンパク質である。または、カーゴは、別のタイプのタンパク質生物学的高分子（例えば、ステロール、ステロイド、または脂肪酸）である。または、カーゴは、脂質、ペプチド（例えば、ペプチド・ホルモン、細胞膜破壊ペプチド、Ｔ細胞刺激ペプチド、または別のタイプのペプチド）、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＤＮＡオリガミ技法を使用して設計されたものを含めた設計されたＤＮＡナノ構造、ＤＮＡザイム、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡザイム）、薬物等の小分子カーゴ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、炭素ベースの構造（例えば、フラーレンまたはバックミンスターフラーレン、単層カーボンナノチューブまたは多層カーボンナノチューブ）、金属（例えば、鉄、亜鉛、白金、銅、ナトリウム、カドミウム、ランタニド、ガドリニウム、テクネチウム、カルシウム、カリウム、クロム、マグネシウム、モリブデン、およびその塩または複合体）、毒素（例えば、リガンド標的毒素、プロテアーゼ活性化毒素、メリチン、および毒素ベースの自殺遺伝子治療薬）、またはナノ粒子（例えば、金、鉄、銀、コバルト・カドミウム・セレン、酸化チタン等の金属ナノ粒子）もしくはＣｄＳ／ＺｎＳ、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳｅ／ＣｄＳ、およびＩｎＡｓ／ＣｄＳｅナノ粒子等のコアシェル金属ナノ粒子である。

好ましくは、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡを含む群から選択される。

好ましくは、治療剤は、代謝障害もしくは疾患における過剰発現、または代謝障害もしくは疾患における過少発現と関連した酵素である。

好ましくは、酵素は、ヒドロゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、リパーゼ、リアーゼ、リガーゼ、プロテアーゼ、トランスフェラーゼ、レダクターゼ、リコンビナーゼ、およびヌクレアーゼ酸修飾酵素を含む群から選択される。

好ましくは、治療剤は、がん治療薬、抗感染症治療薬、血管疾患治療薬、免疫治療薬、セノリティック（ｓｅｎｏｌｙｔｉｃ）、および神経学的治療薬を含む群から選択される。

好ましくは、金属は、鉄、亜鉛、白金、銅、ナトリウム、カドミウム、ランタニド、ガドリニウム、テクネチウム、カルシウム、カリウム、クロム、マグネシウム、モリブデン、およびその塩または複合体を含む群から選択される。

好ましくは、毒素は、リガンド標的毒素、プロテアーゼ活性化毒素、メリチン、および毒素ベースの自殺遺伝子治療薬を含む群から選択される。

好ましくは、ゲストカーゴはタンパク質である。好ましくは、蛍光タンパク質。好ましくは、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、またはｍＯｒａｎｇｅ。好ましくは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）またはネオロイキン（Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ）－２／１５（ＮＬ－２）。

好ましくは、治療剤は、がん治療薬、抗感染症治療薬、血管疾患治療薬、免疫治療薬、セノリティック、および神経学的治療薬を含む群から選択される。

好ましくは、ケージは複数のカーゴを含み、好ましくは、カーゴは互いに同じであるまたは異なる。

好ましくは、本発明に従ったＴＲＡＰケージは、少なくとも１種の外的装飾をさらに含む。

好ましくは、外的装飾の少なくとも１種は、内的ゲストカーゴを含有するケージの細胞内送達を促進する細胞透過剤を含む。

好ましくは、細胞透過剤はＰＴＤ４である。

好ましくは、ＴＲＡＰケージにおけるＴＲＡＰ環の数は、６～６０個、好ましくは７～５５個、好ましくは８～５０個、好ましくは９～４５個、好ましくは１０～４０個、好ましくは１１～３５個、好ましくは１２～３４個、好ましくは１３～３３個、好ましくは１４～３２個、好ましくは１５～３１個、好ましくは１６～３０個、好ましくは１７～２９個、好ましくは１８～２８個、好ましくは１９～２７個、好ましくは２０～２６個である。好ましくは、ＴＲＡＰケージにおけるＴＲＡＰ環の数は、４０個未満、好ましくは３５個未満、好ましくは３０個未満である。好ましくは、ＴＲＡＰケージにおけるＴＲＡＰ環の数は、６個を上回る、好ましくは１０個を上回る、好ましくは１５個を上回る、好ましくは２０個を上回る。

好ましくは、ＴＲＡＰケージにおけるＴＲＡＰ環の数は１２～２４個である。

好ましくは、ＴＲＡＰケージにおけるＴＲＡＰ環の数は、約２４個、好ましくは２４個である。好ましくは、ＴＲＡＰケージにおけるＴＲＡＰ環の数は、約１２個、好ましくは１２個である。好ましくは、ＴＲＡＰケージにおけるＴＲＡＰ環の数は、約２０個、好ましくは２０個である。

好ましくは、ＴＲＡＰケージ内腔の内面は極度に帯電している（ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅｄ）。好ましくは、極度に帯電した内腔を有するＴＲＡＰケージは、Ｅ４８ＱまたはＥ４８Ｋ変異を含む。好ましくは、極度に帯電した内腔を有するＴＲＡＰケージは、Ｋ３５Ｃ／Ｅ４８ＱまたはＫ３５Ｃ／Ｅ４８Ｋ変異を含む。

好ましくは、ゲストカーゴは、ＴＲＡＰケージ内腔の内面に遺伝学的に融合される。好ましくは、工程（ｉｉ）のＴＲＡＰケージ内腔の内面へのゲストカーゴの遺伝学的融合は、内腔の内面に面するＴＲＡＰ^Ｋ３５ＣのＮ末端へのゲストカーゴのＮ末端融合を介したものである。好ましくは、ゲストカーゴは、遺伝学的融合タンパク質、好ましくは蛍光タンパク質、好ましくはＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、またはｍＯｒａｎｇｅである。好ましくは、遺伝学的融合タンパク質は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）またはネオロイキン－２／１５（ＮＬ－２）である。

好ましくは、ゲストカーゴは、好ましくはＴＲＡＰケージ内腔の内面に、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇコンジュゲーションを使用してコンジュゲートされる。好ましくは、工程（ｉｉｉ）のＴＲＡＰケージ内腔の内面へのゲストカーゴのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇコンジュゲーションにおいて、ＴＲＡＰケージに会合した場合に内部に面する残基４７と４８との間のＴＲＡＰ環のループ領域にＳｐｙＣａｔｃｈｅｒが導入され、ゲストカーゴがＳｐｙＴａｇを含有する。

好ましくは、ゲストカーゴは、好ましくは化学的または酵素的結合形成によって、ＴＲＡＰケージに、好ましくはＴＲＡＰケージの内側に、共有結合を介して付着される。

好ましくは、ケージの開口はプログラム可能である。好ましくは、前記特異的条件は、架橋剤の特異的切断特徴に相当する。

好ましくは、ケージのプログラム可能な開口は、ＴＲＡＰケージにおいてＴＲＡＰ環を適所に保つ分子または原子金属架橋剤の選択に依存している。

好ましくは、分子架橋剤の特異的切断特徴は、
（ｉ）還元抵抗性／非感受性分子架橋剤、それによって、ケージは還元条件下で閉じたままである；
（ｉｉ）還元応答性／感受性分子架橋剤、それによって、ケージは還元条件下で開く；および
（ｉｉｉ）光活性化可能な分子架橋剤、それによって、ケージは光に曝露されると開く
を含む群から選択される。

好ましくは、還元抵抗性／非感受性分子架橋剤は、ビスマレイミドヘキサン（ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｅｏｈｅｘａｎｅ）（ＢＭＨ）およびビス－ブロモキシレンを含む群から選択され得る。好ましくは、還元応答性／感受性分子架橋剤は、ジチオビスマレイミドエタン（ｄｉｔｈｉｏｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｅｏｅｔｈａｎｅ）（ＤＴＭＥ）を含む群から選択され得る。好ましくは、光活性化可能な分子架橋剤は、ビス－ハロメチルベンゼン、ならびに１，２－ビス－ブロモメチル－３－ニトロベンゼン（ｏ－ＢＢＮ）、２，４－ビス－ブロモメチル－１－ニトロベンゼン（ｍ－ＢＢＮ）、および１，３－ビス－ブロモメチル－４，６－ジニトロ－ベンゼン（ＢＤＮＢ）を含めたその誘導体を含む群から選択され得る。

好ましくは、分子架橋剤は、ホモ二官能性分子部分およびその誘導体である。好ましくは、ホモ二官能性分子架橋剤はビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）である。

好ましくは、ケージは、還元条件に抵抗性／非感受性である。好ましくは、ホモ二官能性分子架橋剤はジチオビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ）である。

好ましくは、ケージは、還元条件に応答性／感受性である。好ましくは、分子架橋剤は、ビス－ハロメチルベンゼンおよびその誘導体である。

好ましくは、分子架橋剤は、１，２－ビス－ブロモメチル－３－ニトロベンゼン（ＢＢＮ）、ビス－ブロモキシレン、および１，３－ビス－ブロモメチル－４，６－ジニトロ－ベンゼン（ＢＤＮＢ）を含む群から選択される。

好ましくは、分子架橋剤は、ＵＶ光への曝露による光不安定性（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ）である。

好ましくは、本発明に従ったケージは、種々のプログラム可能な分子架橋剤の混合物を含む。

好ましくは、ＴＲＡＰ環は変種である。

好ましくは、人工ＴＲＡＰケージタンパク質は、Ｋ３５Ｃ、Ｅ４８Ｑ、Ｅ４８Ｋ、Ｒ６４Ｓ、Ｋ３５Ｃ／Ｅ４８Ｑ、Ｋ３５Ｃ／Ｅ４８Ｋ、およびＫ３５Ｃ／Ｒ６４Ｓを含む群から選択される変異のいずれか１つまたは複数を含むように改変される。好ましくは、人工ＴＲＡＰケージタンパク質は、Ｋ３５Ｃ変異を含むように改変される。好ましくは、人工ＴＲＡＰケージタンパク質は、Ｋ３５Ｃ変異またはＫ３５Ｃ／Ｅ４８Ｑ変異またはＫ３５Ｃ／Ｅ４８Ｋ変異を含むように改変される。

好ましくは、人工ＴＲＡＰケージタンパク質は、Ｋ３５Ｃ、Ｋ３５Ｈ、Ｒ６４Ｓ、Ｅ４８Ｑ、Ｅ４８Ｋ、Ｋ３５Ｃ／Ｒ６４Ｓ、Ｋ３５Ｈ／Ｒ６４Ｓ、Ｓ３３Ｃ、Ｓ３３Ｈ、Ｓ３３Ｃ／Ｒ６４Ｓ、Ｓ３３Ｈ／Ｒ６４Ｓ、Ｓ３３Ｃ／Ｋ３５Ｈ、Ｓ３３Ｈ／Ｋ３５Ｈ、Ｓ３３Ｃ／Ｋ３５Ｃ、Ｓ３３Ｈ／Ｋ３５Ｃ、Ｋ３５Ｃ／Ｅ４８Ｑ、Ｋ３５Ｃ／Ｅ４８Ｋ、Ｋ３５Ｈ／Ｅ４８Ｑ、Ｋ３５Ｈ／Ｅ４８Ｋ、Ｓ３３Ｃ／Ｅ４８Ｑ、Ｓ３３Ｃ／Ｅ４８Ｋ、Ｓ３３Ｃ／Ｅ４８Ｑ、Ｓ３３Ｃ／Ｒ６４Ｓ／Ｅ４８Ｑ、Ｋ３５Ｈ／Ｓ３３Ｃ／Ｒ６４Ｓ、Ｓ３３Ｃ／Ｒ６４Ｓ、Ｓ３３Ｈ／Ｋ３５Ｈ／Ｒ６４Ｓ、Ｓ３３Ｃ／Ｋ３５Ｃ／Ｒ６４Ｓ、Ｋ３５Ｃ／Ｒ６４Ｓ／Ｅ４８Ｑ、Ｋ３５Ｈ／Ｒ６４Ｓ／Ｅ４８Ｑ、Ｋ３５Ｈ／Ｒ６４Ｓ／Ｅ４８Ｋ、Ｓ３３Ｃ／Ｒ６４Ｓ／Ｅ４８Ｑ、Ｓ３３Ｃ／Ｒ６４Ｓ／Ｅ４８Ｋ、Ｓ３３Ｃ／Ｒ６４Ｓ／Ｅ４８Ｑ、およびＳ３３Ｃ／Ｅ４８Ｋを含む群から選択される変異のいずれか１つまたは複数を含むように改変される。好ましくは、人工ＴＲＡＰケージタンパク質は、Ｋ３５Ｈ／Ｅ４８ＱまたはＫ３５Ｈ／Ｅ４８変異を含むように改変される。

好ましくは、ＴＲＡＰケージは、上昇した温度において、すなわち温度が、通常の室温またはヒト／動物体温よりも上に上昇した場合に安定であり、好ましくは０～１００℃で安定であり、好ましくは１５～１００℃で安定であり、好ましくは１５～７９℃で安定であり、好ましくは最高９５℃で安定であり、好ましくは９５℃以下で安定である。

好ましくは、ＴＲＡＰケージは、非中性ｐＨにおいて安定であり、好ましくはｐＨ７よりも上でおよびｐＨ７よりも下で安定であり、好ましくはｐＨ３～１１で安定であり、好ましくはｐＨ４～１０で安定であり、好ましくはｐＨ５～９で安定である。

好ましくは、ＴＲＡＰケージは、カオトロピック剤（溶液中で水素結合を破壊する、タンパク質または高分子構造を破壊するまたは変性させるであろう作用物質）、またはタンパク質もしくは高分子構造を破壊するもしくは変性させると別様に予想されるであろう界面活性剤において安定である。好ましくは、ケージは、ｎ－ブタノール、エタノール、塩化グアニジン、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、２－プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、および尿素において安定性を示す。好ましくは、ＴＲＡＰケージは、最高４ＭのＧｎｄＨＣｌにおいて安定である。好ましくは、ＴＲＡＰケージは、最高少なくとも７Ｍの尿素において安定である。好ましくは、ＴＲＡＰケージは、最高１５％のＳＤＳにおいて安定である。本明細書に記載されるケージの安定性を、これらの作用物質を使用して当業者に公知であろう標準的条件において試験して、前記安定性を実証し得る。

本明細書に記載されるケージは、これらの条件において予想外の安定性を呈示し、以前に実証されたよりも安定なＴＲＡＰケージを提供する。

本発明の主題は、制御された期間におけるかつ所望の場所へのカーゴの送達における、上で規定される本発明に従ったケージの使用でもある。

本発明の主題は、その内的ゲストカーゴの細胞内送達のための送達ビヒクルとしての、本発明に従った人工ＴＲＡＰケージの使用でもある。

本発明の主題は、ワクチンとしての、本発明に従った人工ＴＲＡＰケージの使用でもある。

本発明の主題は、がん、血管疾患、心血管疾患、糖尿病、感染症、自己免疫病状、神経変性疾患、細胞老化疾患、関節炎、および呼吸器疾患を含む群から選択される病気または病態の治療のための、本発明に従った人工ＴＲＡＰケージの使用でもある。

本発明の主題は、カプセル化されたゲストカーゴを有する人工ＴＲＡＰケージを作製する方法であって、方法は、
（ｉ）適切な発現システムにおけるＴＲＡＰ環単位の発現、および発現システムからの前記単位の精製によってＴＲＡＰ環単位を獲得する工程；
（ｉｉ）架橋剤との少なくとも１つの遊離チオール連結を介したＴＲＡＰ環単位のコンジュゲーション；
（ｉｉｉ）ゲストカーゴを捕捉するための適切な内面環境を提供するための、ＴＲＡＰ環単位の修飾；
（ｉｖ）ゲストカーゴがカプセル化されるケージ内腔を提供するための、自己会合によるＴＲＡＰケージの形成；ならびに
（ｖ）ゲストカーゴをカプセル化したＴＲＡＰケージの精製および単離
を含む、方法でもある。

好ましくは、工程（ｉｉ）は、まず、少なくとも１種の金属架橋剤、好ましくは原子金属架橋剤を介したＴＲＡＰ環単位のコンジュゲーションを含む。工程（ｉｉ）は、次いで、金属架橋剤を分子架橋剤で置き換える工程を含む。分子架橋剤は、ケージにおける環の配向を変化させることなく、金属原子を交換し得る。好ましくは、金属は金である。この変更された工程（ｉｉ）は、架橋剤が光切断性リンカーであり、好ましくは架橋剤がブロモキシレンまたはビスブロモビマン（ｂｉｓｂｒｏｍｏｂｉｍａｎｅ）である場合に好ましくは適用される。

好ましくは、工程（ｉｉｉ）の修飾は、
（ｉ）ＴＲＡＰケージ内腔の内面を極度に帯電させる工程；
（ｉｉ）ＴＲＡＰケージ内腔の内面へのゲストカーゴの遺伝学的融合；
（ｉｉｉ）ＴＲＡＰケージ内腔の内面へのゲストカーゴのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇコンジュゲーション；ならびに
（ｉｖ）化学的および酵素的方法の両方における共有結合形成を介したもの
を含む群から選択される。

好ましくは、内面の工程（ｉ）の極度に帯電させる工程は、ケージ内腔の内面での正味の正または正味の負電荷のいずれかを提供する。

好ましくは、還元抵抗性／非感受性分子架橋剤は、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）およびビス－ブロモキシレンを含む群から選択され得る。好ましくは、還元応答性／感受性分子架橋剤は、ジチオビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ）を含む群から選択され得る。好ましくは、光活性化可能な分子架橋剤は、ビス－ハロメチルベンゼン、ならびに１，２－ビス－ブロモメチル－３－ニトロベンゼン（ｏ－ＢＢＮ）、２，４－ビス－ブロモメチル－１－ニトロベンゼン（ｍ－ＢＢＮ）、および１，３－ビス－ブロモメチル－４，６－ジニトロ－ベンゼン（ＢＤＮＢ）を含めたその誘導体を含む群から選択され得る。

好ましくは、分子架橋剤は、ＵＶ光への曝露による光不安定性である。

好ましくは、ＴＲＡＰケージ内腔の内面は極度に帯電している。好ましくは、極度に帯電した内腔を有するＴＲＡＰケージは、Ｅ４８ＱまたはＥ４８Ｋ変異を含む。好ましくは、極度に帯電した内腔を有するＴＲＡＰケージは、Ｋ３５Ｃ／Ｅ４８ＱまたはＫ３５Ｃ／Ｅ４８Ｋ変異を含む。

好ましくは、ＴＲＡＰ^{Ｋ３５ＣＥ４８Ｑ}に対するパート（ｉｉｉ）のケージ形成工程は、ｐＨ９～１１で炭酸水素ナトリウム緩衝液中にて実施される。

好ましくは、ＴＲＡＰ^{Ｋ３５ＣＥ４８ｋ}に対するパート（ｉｉｉ）のケージ形成工程は、ｐＨ１０～１０．５で炭酸水素ナトリウム緩衝液中にて実施される。

好ましくは、ゲストカーゴは、ＴＲＡＰケージの会合前または後のいずれかに担持され得る。

好ましくは、工程（ｉｉ）のＴＲＡＰケージ内腔の内面へのゲストカーゴの遺伝学的融合は、内腔の内面に面するＴＲＡＰ^Ｋ３５ＣのＮ末端へのゲストカーゴのＮ末端融合を介したものである。好ましくは、ゲストカーゴは、遺伝学的融合タンパク質、好ましくは蛍光タンパク質、好ましくはＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、またはｍＯｒａｎｇｅである。好ましくは、遺伝学的融合タンパク質は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）またはネオロイキン－２／１５（ＮＬ－２）である。

好ましくは、工程（ｉｉｉ）のＴＲＡＰケージ内腔の内面へのゲストカーゴのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇコンジュゲーションにおいて、ＴＲＡＰケージに会合した場合に内部に面する残基４７と４８との間のＴＲＡＰ環のループ領域にＳｐｙＣａｔｃｈｅｒが導入され、ゲストカーゴがＳｐｙＴａｇを含有する。

好ましくは、酵素的修飾は、ソルターゼ、アスパラギニル・エンドプロテアーゼ、トリプシン関連酵素、およびサブチリシン由来変種を含む群から選択されるペプチド・リガーゼを介したものであり、共有結合性の化学結合形成は、ひずみ促進型アルキン－アジド環化付加（ｓｔｒａｉｎｐｒｏｍｏｔｅｄａｌｋｙｎｅ－ａｚｉｄｅｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ）および疑似ペプチド結合を含み得る。

システインが生体分子に存在しない、またはそれらは存在するが反応に使用可能ではない場合、好ましくはシステインの基としての－ＳＨ基が生体分子に導入され得る。

システインの導入は、当技術分野において公知の任意の方法によって行われ得る。例えば、システインの導入は、商業的遺伝子合成または改変されたＤＮＡプライマーを使用したＰＣＲベースの部位指向性変異導入等、当技術分野において公知の方法によって実施されるが、それらに限定されるわけではない。上述の方法は当業者によって公知であり、プロトコールを有するすぐに使用できるキットが市販されている。

－ＳＨ部分は、生体分子における他のアミノ酸の改変によって、すなわち部位指向性変異導入によってまたは固相ペプチド合成によっても生体分子に導入され得る。

本発明の主題は、本方法によって産生されたＴＲＡＰケージでもある。これらのケージは、上の本発明の第１の態様との関連で記載される特質もしくは特性のいずれか、または本明細書に記載される他の任意のものを有し得る。

本発明の主題は、医薬としての、本明細書に記載されるＴＲＡＰケージのいずれかの使用でもある。

本発明の主題は、患者における疾患を治療することにおける、本明細書に記載されるＴＲＡＰケージのいずれかの使用でもある。

本発明の主題は、前記患者に本明細書に記載されるＴＲＡＰケージを投与する工程を含む、患者を治療する方法でもある。本発明の主題は、がん、血管疾患、心血管疾患、糖尿病、感染症、自己免疫病状、神経変性疾患および神経疾患、細胞老化疾患、関節炎、ならびに呼吸器疾患を含む群から選択される病状に罹患した、療法を必要とする個体の治療の方法であって、方法は、核酸、酵素、治療剤、小分子、有機または無機ナノ粒子、ペプチド、金属、抗原、抗体、および毒素、ならびに治療的価値があるすべての前述のもののその断片を含む群から選択される１種または複数の内的ゲストカーゴを持つ人工ＴＲＡＰケージの治療有効量を投与する工程を含む、方法でもある。

本発明の主題は、がん、血管疾患、心血管疾患、糖尿病、感染症、自己免疫病状、神経変性疾患および神経疾患、細胞老化疾患、関節炎、ならびに呼吸器疾患を含む群から選択される病状により、ワクチン接種を必要とする個体にワクチン接種する方法であって、方法は、核酸、酵素、治療剤、小分子、有機または無機ナノ粒子、ペプチド、金属、抗原、抗体、および毒素、ならびに治療的価値があるすべての前述のもののその断片を含む群から選択される１種または複数の内的ゲストカーゴを持つ人工ＴＲＡＰケージの治療有効量を投与する工程を含む、方法でもある。

好ましくは、ＴＲＡＰケージ治療薬は、鼻腔内吸入または注射を介して投与される。

「ＴＲＡＰタンパク質」への本明細書での言及は、細菌タンパク質であるトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質を指す。このタンパク質は、例えば、野生型Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたは他のそのような細菌から単離され得る。このタンパク質は、様々な細菌から単離され得るが、本明細書に記載されるように働くであろうＴＲＡＰタンパク質は、Ａｌｋａｌｉｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｇｎｉｎｉｐｈｉｌｕｓ、Ａｎａｅｒｏｂａｃｉｌｌｕｓｉｓｏｓａｃｃｈａｒｉｎｉｃｕｓ、Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｉｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓｃａｌｉｄｕｓ、Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｓｈｃｈｉｎｏｅｎｓｉｓ、Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓｔｅｐｉｄａｍａｎｓ、Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓｔｅｐｉｄａｍａｎｓ、Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓｖｉｔａｍｉｎｉｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ細菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｖｅａｙｕｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｖｅａｙｕｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｉｎｅｓａｌｏｕｍｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種ＦＪＡＴ－１４５７８、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種ＨＤ４Ｐ２５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種ＨＭＦ５８４８、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種ＰＳ０６、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種ＲＥＮ１６、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種ＳＡ１－１２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種Ｖ３－１３、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｗｅｉｈａｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｙａｐｅｎｓｉｓ、Ｃａｌｉｄｉｆｏｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓｅｒｚｕｒｕｍｅｎｓｉｓ、Ｃａｌｉｄｉｆｏｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓｏｒｙｚｉｔｅｒｒａｅ、Ｃｙｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｌｕｔｅｏｌｕｓ、Ｆｒｅｄｉｎａｎｄｃｏｈｎｉａａｃｉｄｉｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｆｒｅｄｉｎａｎｄｃｏｈｎｉａｈｕｍｉ、Ｆｒｅｄｉｎａｎｄｃｏｈｎｉａｏｎｕｂｅｎｓｉｓ、Ｆｒｅｄｉｎａｎｄｃｏｈｎｉａｏｎｕｂｅｎｓｉｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ遺伝種（ｇｅｎｏｍｏｓｐ．）３、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ種４６Ｃ－ＩＩａ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓＮＧ８０－２、Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓｄａｂａｎｅｎｓｉｓ、Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｊｅｏｔｇａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄｉａａｌｋａｌｉｔｅｌｌｕｒｉｓ、Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄｉａｓａｌｓａ、Ｍｅｓｏｂａｃｉｌｌｕｓｈａｒｅｎａｅ、Ｍｅｔａｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔａｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｍｅｔａｂａｃｉｌｌｕｓｓｅｄｉｍｉｎｉｌｉｔｏｒｉｓ、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｍｉ、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ種Ｃａｓｔｅｌｓａｒｄｏ、Ｏｒｎｉｔｈｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｏｒｎｉｔｈｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｏｒｎｉｔｈｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ、Ｏｒｎｉｔｈｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｏｒｎｉｔｈｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｓｃａｐｈａｒｃａｅ、Ｐａｒａｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｘｙｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐａｒａｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ遺伝種、Ｐａｒａｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｅｒｍａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ、Ｐａｒａｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｅｒｍａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ、Ｐａｒａｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ、Ｐａｒａｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ、Ｐａｕｃｉｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓｇｌｏｂｕｌｕｓ、Ｐａｕｃｉｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ種ＥＢ０２、Ｐｒｉｅｓｔｉａａｂｙｓｓａｌｉｓ、Ｐｒｉｅｓｔｉａｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃａ、Ｐｒｉｅｓｔｉａｆｉｌａｍｅｎｔｏｓａ、Ｐｒｉｅｓｔｉａｋｏｒｅｅｎｓｉｓ、Ｐｒｉｅｓｔｉａｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓｇｌａｃｉｅｉ、Ｓａｌｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｘｉｎｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｉｅｌｌａｃｏｈｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｌｏｎｇｉｂａｃｉｌｌｕｓａｌｔｉｎｓｕｅｎｓｉｓ等の細菌から単離され得る。

ＴｒｐＲＮＡ結合減衰タンパク質は、細菌性環状ホモ１１－ｍｅｒである（参照により本明細書によって組み入れられる、Ａ．Ａ．Ａｎｔｓｏｎ、Ｊ．Ｏｔｒｉｄｇｅ、Ａ．Ｍ．Ｂｒｚｏｚｏｗｓｋｉ、Ｅ．Ｊ．Ｄｏｄｓｏｎ、Ｇ．Ｇ．Ｄｏｄｓｏｎ、Ｋ．Ｓ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｔ．Ｓｍｉｔｈ、Ｍ．Ｙａｎｇ、Ｔ．Ｋｕｒｅｃｋｉ、Ｐ．Ｇｏｌｌｎｉｃｋを参照されたい）。ｔｒｐＲＮＡ結合減衰タンパク質の構造は、文献に見られ得る（参照により本明細書によって組み入れられる、Ｎａｔｕｒｅ３７４，６９３～７００（１９９５））。

適切には、本明細書で使用されるタンパク質は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから単離された野生型ＴＲＡＰの改変バージョンである。これは表１に見られる：

野生型ＴＲＡＰＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ遺伝子配列は表２に見られる：

好ましくは、タンパク質の調製は、適切な発現システムにおける生体分子発現および発現産物の精製によって実施される。好ましくは、上記の野生型ＴＲＡＰＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ遺伝子配列の改変バージョンを用いる。

ＴＲＡＰタンパク質は、環、本明細書における「ＴＲＡＰ環」を形成し、環はＴＲＡＰタンパク質の天然状態である。典型的に、本明細書において実証されるＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓＳｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓタンパク質の場合のように、ＴＲＡＰ単量体タンパク質は、単量体から作製される環状体または環に自然発生的に会合する。

「ＴＲＡＰケージ内腔」への本明細書における言及は、ＴＲＡＰケージの中空内部である。それは、ＴＲＡＰケージの壁を形成するＴＲＡＰ環によって外的環境から分離され、この壁における任意の穴が、穴を裏打ちするＴＲＡＰ環の端の間の平板によって外部環境から内腔を分離すると考えられる。

ＴＲＡＰケージは、ケージに会合する環をもたらす、架橋され得るシステインの存在を有した、例えば本明細書において実証される特定の条件下でのみ形成される。例えば、本明細書において実証されるように、これらは、３５位におけるシステインの存在を有して形成されるであろう（Ｋ３５Ｃ変異の結果）。

「ＴＲＡＰ環」への本明細書における言及は、ＴＲＡＰビルディング・ブロック、ＴＲＡＰケージ複合体のサブユニット、またはＴＲＡＰ単量体会合体と同義である。特定のタンパク質またはヌクレオチド配列の「類似体」への本明細書における言及は、指定の機能、例えば本明細書に記載される条件下でのＴＲＡＰケージ形成を行い得るのに、または指定の機能、例えば本明細書に記載される条件下でのＴＲＡＰケージ形成を行い得るタンパク質をコードするのに、タンパク質またはヌクレオチド配列と十分な同一性または相同性を有するタンパク質またはヌクレオチド配列を指す。

２種の配列の同一性／相同性パーセントを判定するために、問題の配列および参照を、最適な比較目的のためにアラインする（例えば、最適なアライメントのために第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップが導入され得、非相同配列は、比較目的のために無視され得る）。配列は、それが、関連する長さの参照配列のアミノ酸またはヌクレオチドの、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を有する場合、特定のものの類似体と判定され得る。相当するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する場合、第１の配列における位置が、第２の配列における相当する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合には、分子は、その位置で同一である（本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と等価である）。２種の配列間の同一性パーセントは、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。

適切には、ＴＲＡＰタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性または相同性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＴＲＡＰタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性または相同性を有するアミノ酸配列を含む。

「ＴＲＡＰケージ」への本明細書における言及は、複数の生体分子、本明細書では複合体を形成する複数のＴＲＡＰタンパク質環、から形成される会合したタンパク質複合体を指す。ＴＲＡＰタンパク質環は、架橋剤、本明細書では分子架橋剤によって一緒に連結され得る。「複合体」、「会合体」、「凝集体」は、本記載において代替的に使用され、生体分子間の反応によって構築される上部構造を意味する。複合体に関与する単位の量は、生体分子の性質に依存する。より具体的には、それは、生体分子の量および生体分子に存在する－ＳＨ基の量に存在する。

ＴＲＡＰタンパク質は、本発明の方法のための適切な生体分子モデルである。これは、その高い固有の安定性、環状体形状、天然システイン残基の欠如（コンジュゲーション過程のより容易な制御のための）、ならびに、結果として生じるシステインが、適正な結合形成に適した適切な化学的および空間的環境にある、システインに変化し得る残基の使用可能性におそらく起因する。

「プログラム可能な」への本明細書における言及は、本発明のＴＲＡＰケージが、それらを、特異的な環境条件または刺激への曝露で、特定のかつ選択された様式で挙動する傾向にするまたは挙動しやすくするまたは挙動しやすい性質にする、それらに付与されたまたは操作された特性を有することを伝えることを意図される。

「開いた」への本明細書における言及は、破砕した、漏出した、断片化した、壊れた、またはカーゴがケージの内部から脱出するのを広く可能にしたＴＲＡＰケージと同義である。

「閉じた」への本明細書における言及は、無傷のままの、壊れない、不浸透性の、または概してケージ全体としてとどまるＴＲＡＰケージと同義である。

「二官能性」への本明細書における言及は、２個の官能基を有する分子架橋剤、例えば本明細書では２個の官能基を有する分子を指し、ＴＲＡＰケージにおけるＴＲＡＰ環を接続するために架橋される対象となるシステイン・チオール基のそれぞれに対して１個の官能基がある。「ホモ二官能性」への本明細書における言及は、２個の基が同じである二官能性リンカーを指す。好ましくは、ホモ二官能性リンカーは、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ジチオビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ）、ビス－ハロメチルベンゼンおよびその誘導体、２－ビス－ブロモメチル－３－ニトロベンゼン（ＢＢＮ）、ビス－ブロモキシレン、ならびに１，３－ビス－ブロモメチル－４，６－ジニトロ－ベンゼン（ＢＤＮＢ）を含む。

「分子架橋剤」とは、１つまたは複数の化学結合の形成を介して、単位、サブユニット、分子、生体分子、または単量体を、それの他の例に接続するように作用する分子である。分子架橋剤は、個別の実体である単一原子リンカーではない。

ＴＲＡＰケージ内への「カプセル化」への本明細書における言及は、ＴＲＡＰケージで取り囲まれた、包み込まれた、含有された、または閉じ込められたと同義である。

「ゲストカーゴ」への本明細書における言及は、生物製剤、またはＴＲＡＰケージ内にカプセル化されるどんなものも指す。

ゲストカーゴは、酵素（例えば、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ヒドロゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、リパーゼ、リアーゼ、リガーゼ、トランスフェラーゼ、レダクターゼ、リコンビナーゼ、ヌクレアーゼ酸修飾酵素、または他のタイプの酵素）、抗原、抗体を含む群から好ましくは選択されるタンパク質であり得る。または、カーゴは、別のタイプのタンパク質生物学的高分子（例えば、ステロール、ステロイド、または脂肪酸）である。または、カーゴは、脂質、ペプチド（例えば、ペプチド・ホルモン、細胞膜破壊ペプチド、Ｔ細胞刺激ペプチド、または別のタイプのペプチド）、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＤＮＡオリガミ技法を使用して設計されたものを含めた設計されたＤＮＡナノ構造、ＤＮＡザイム、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡザイム）、薬物等の小分子カーゴ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、炭素ベースの構造（例えば、フラーレンまたはバックミンスターフラーレン、単層カーボンナノチューブまたは多層カーボンナノチューブ）、金属（例えば、鉄、亜鉛、白金、銅、ナトリウム、カドミウム、ランタニド、ガドリニウム、テクネチウム、カルシウム、カリウム、クロム、マグネシウム、モリブデン、およびその塩または複合体）、毒素（例えば、リガンド標的毒素、プロテアーゼ活性化毒素、メリチン、および毒素ベースの自殺遺伝子治療薬）、またはナノ粒子（例えば、金、鉄、銀、コバルト・カドミウム・セレン、酸化チタン等の金属ナノ粒子）もしくはＣｄＳ／ＺｎＳ、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳｅ／ＣｄＳ、およびＩｎＡｓ／ＣｄＳｅナノ粒子等のコアシェル金属ナノ粒子である。

酵素は、ブロメライン、ボツリヌス毒素Ａ、トロンビン第ＶＩＩＡ因子、プロテインＣ、ＴＥＶプロテアーゼ、具体的にはＬｏｎ－Ａペプチダーゼ、Ｃｌｐプロテアーゼ、ラクトフェリン（ｌａｃｔｏｆｅｒｉｎ）、ヌクレオポリン（ｎｃｕｌｅｏｐｏｒｉｎ）１２５を含む、ＳＢ、ＳＣ、ＳＥ、ＳＦ、ＳＨ、ＳＪ、ＳＫ、ＳＯ、ＳＰ、ＳＲ、ＳＳ、ＳＴ、ＰＡ、ＰＢ、ＰＣ、およびＰＥスーパーファミリー、ならびにＳ４８、Ｓ６２、Ｓ６８、Ｓ７１、Ｓ７２、Ｓ７９、Ｓ８１ファミリーを含めたセリン・プロテアーゼ、具体的にはパパイン、カテプシンＫ、カルパイン、セパラーゼ、アデナイン、ソルターゼＡ、およびヘッジホッグ（Ｈｅｄｈｅｈｏｇ）タンパク質を含む、ＣＡ、ＣＤ、ＣＥ、ＣＦ、ＣＬ、ＣＭ、ＣＮ、ＣＯ、ＣＰ、ＰＡ、ＰＢ．ＰＣ、ＰＤ、およびＰＥスーパーファミリー、ならびにＣ７、Ｃ８、Ｃ２１、Ｃ２３、Ｃ２７、Ｃ３６、Ｃ４２、Ｃ５３、およびＣ７５ファミリーを含めたシステイン・プロテアーゼ、以下のような具体的な例、ＢＡＣＥ１、ＢＡＣＥ２、カテプシン（Ｃａｔｈｅｓｐｉｎ）Ｄ、カテプシンＥ、キモシン、ナプシン（Ｎａｐｓｉｎ）－Ａｄ、ネペンテシン、ペプシン、プレセニリン、プラスメプシンを含む、ＡＡ、ＡＣ、ＡＤ、ＡＥ、およびＡＦスーパーファミリーを含めたアスパラギン酸プロテアーゼ、具体的にはオルニチン（ｏｒｈｉｔｈｉｎｅ）・アシルトランスフェラーゼを含む、ＰＢおよびＰＥスーパーファミリーを含めたトレオニン・プロテアーゼ、Ｇ１およびＧ２スーパーファミリーを含めたグルタミン酸プロテアーゼ、メタロエキソペプチダーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｅｘｐｅｐｔｉｄａｓｅ）およびメタロエンドペプチダーゼを含めたメタロプロテイナーゼを含む群から選択されるプロテアーゼであり得る。

酵素は、エンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ（ｄｅｏｘｃｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）Ｉ；ヒト・エンドヌクレアーゼＶ、ガイドＲＮＡを含めた関連核酸の有無にかかわらないＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３を含む）；ＡＰエンドヌクレアーゼ；フラップ・エンドヌクレアーゼを含む群から選択されるヌクレアーゼであり得る。

タンパク質は、別のタイプの酵素、例えばＳＵＭＯ活性化酵素Ｅ１、ＤＮＡ修復酵素、例えばＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、例えばｍ６Ａ、ｍ４Ｃ、およびｍ５Ｃクラス、テン－イレブン転座（ｔｅｎ－ｅｌｅｖｅｎｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）メチルシトシン・ジオキシゲナーゼ、初期増殖応答タンパク質１（ＥＧＲ１）、オキソグアニン・グリコシラーゼ、カスパーゼ、例えばｐＶＨＬ、ＣＲＢＮ、Ｍｄｍ２、ベータ－ＴｒＣＰ１、ＤＣＡＦ１５、ＤＣＡＦ１６、ＲＮＦ１１４、ｃ－ＩＡＰ１を含めたＥ３ユビキチン・リガーゼ、もしくはＥ１リガーゼ、Ｅ２リガーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ、または毒素、例えばリシン毒素Ａ鎖、ジフテリア毒素およびその断片、孔形成毒素、例えば外毒素Ａ、α－溶血素、Ｇｙｒ－Ｉ、骨髄細胞白血病１（Ｍｃｌ－１）、ＤＮＡポリメラーゼβ、ポリメラーゼδ、およびポリメラーゼεを含めたＤＮＡポリメラーゼ、または酵素置換療法酵素、例えばアガルシダーゼ・ベータ、アガルシダーゼ・アルファ、イミグルセラーゼ、タリグルセラーゼ・アルファ、ベラグルセラーゼ・アルファ、アルグルセラーゼ、セベリパーゼ・アルファ、ラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、エロスルファーゼ・アルファ、ガルスルファーゼ、アルグルコシダーゼ・アルファであり得る。

カーゴは、抗原として認識されるように作用し得る何か、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質全長、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、受容体結合ドメイン、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、そのペプチド、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質全長、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、受容体結合ドメイン、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、そのペプチド、ＡＡＲＳ－ＣｏＶ－２非スパイク構造タンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２非スパイク構造タンパク質、そのペプチド、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ゲノム・コードタンパク質またはその部分、呼吸器合胞体ウイルス・スパイクタンパク質全長、呼吸器合胞体ウイルス・スパイクタンパク質、受容体結合ドメイン、呼吸器合胞体ウイルス・スパイクタンパク質、そのペプチド、呼吸器合胞体ウイルス・スパイクタンパク質全長、呼吸器合胞体ウイルス・スパイクタンパク質、受容体結合ドメイン、呼吸器合胞体ウイルス・スパイクタンパク質、そのペプチド、呼吸器合胞体ウイルス非スパイク構造タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス非スパイク構造タンパク質、そのペプチド、呼吸器合胞体ウイルス・ゲノム・コードタンパク質またはその部分、ラッサ・ウイルス・スパイクタンパク質全長、ラッサ・ウイルス・スパイクタンパク質、受容体結合ドメイン、ラッサ・ウイルス・スパイクタンパク質、そのペプチド、ラッサ・ウイルス・スパイクタンパク質全長、ラッサ・ウイルス・スパイクタンパク質、受容体結合ドメイン、ラッサ・ウイルス・スパイクタンパク質、そのペプチド、ラッサ・ウイルス非スパイク構造タンパク質、ラッサ・ウイルス非スパイク構造タンパク質、そのペプチド、ラッサ・ウイルス・ゲノム・コードタンパク質またはその部分、エプスタイン・バール（Ｅｐｓｔｉｅｎ－Ｂａｒｒ）・ウイルス・スパイクタンパク質全長、エプスタイン・バール・ウイルス・スパイクタンパク質、受容体結合ドメイン、エプスタイン・バール・ウイルス・スパイクタンパク質、そのペプチド、エプスタイン・バール・ウイルス・スパイクタンパク質全長、エプスタイン・バール・ウイルス・スパイクタンパク質、受容体結合ドメイン、エプスタイン・バール・ウイルス・スパイクタンパク質、そのペプチド、エプスタイン・バール・ウイルス非スパイク構造タンパク質、エプスタイン・バール・ウイルス非スパイク構造タンパク質、そのペプチド、エプスタイン・バール・ウイルス・ゲノム・コードタンパク質またはその部分、デング熱ウイルス構造タンパク質Ｎ、Ｍ、またはＥ、デング熱ウイルス構造タンパク質Ｎ、Ｍ、またはＥ、そのペプチド、デング熱ウイルス構造タンパク質Ｎ、Ｍ、またはＥ、その一部分、サイトメガロウイルスタンパク質、その一部分、およびカプシドタンパク質、テグメントタンパク質、ポリメラーゼ、およびウイルス・ゲノムによってコードされる他のタンパク質を含めた由来ペプチド、インフルエンザ・ウイルスＨＡタンパク質全長、インフルエンザ・ウイルスＨＡタンパク質、受容体結合ドメイン、インフルエンザ・ウイルスＨＡタンパク質、そのペプチド、インフルエンザ・ウイルス非ＨＡ構造タンパク質、インフルエンザ・ウイルス非ＨＡ構造タンパク質、そのペプチド、インフルエンザ・ウイルス・ゲノム・コードタンパク質またはその部分であり得る。

カーゴは、抗体、例えば抗ｐ５３抗体、抗変異体ｐ５３抗体、抗ＪＡＫｍＡｂ、例えばトファシチニブおよびバリシチニブ、インターロイキン阻害剤、例えばトシリズマブ、セクキヌマブ、およびウステキヌマブ、抗ＣＤ２０ｍＡｂ、例えばリツキシマブ、オファツムマブ、およびオクレリズマブ、抗ＴＮＦｍＡｂ、例えばインフリキシマブ、アダリムマブ、およびゴリムマブ、抗ＩｇＥｍＡｂ、例えばオマリズマブ、エポエチン等の造血成長因子、キイトルーダ等の抗ＰＤ１およびＰＤＬ－１ｍＡｂ、抗ＣＴＬＡ４ｍＡｂ、例えばイピリムマブ、抗ＩＬ２抗体、抗Ｉｌ１２抗体、抗Ｉｌ１５抗体、抗ＴＧＦベータ抗体、抗血管新生ｍＡｂ、例えばアバスチン、Ａ２ＡおよびＡ２Ｂ受容体のアンタゴニストｍＡｂ、抗Ｈｅｒ２ｍＡｂ、例えばトラスツズマブ、抗体依存性コンジュゲート、抗ＥＧＦＲｍＡｂ、抗ＶＥＧＦＲｍＡｂ、抗ＣＤ５２ｍＡｂ、例えばアレムツズマブ、抗ＢＡＦＦｍＡｂ、例えばベリムマブ、抗ＣＤ１９ｍＡｓ、例えばブリナツモマブ、抗ＣＤ３０ｍＡｂ、例えばブレンツキシマブ・ベドチン、抗ＣＤ３８ｍＡｂ、例えばダラツムマブ、抗ＶＥＧＦＲ２ｍＡｂ、例えばラムシルマブ、または抗ＩＬ６ｍＡｂ、例えばシルツキシマブであり得る。

タンパク質は、別のタイプのタンパク質、例えばラパマイシンの標的（ＴＯＲ）、ＧＡＴＡ転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎ）因子Ｇａｆ１（Ｇａｆワン）、ＴＡＬＥ（転写活性化因子様エフェクター）タンパク質、ジンクフィンガータンパク質、遺伝子発現の制御に関与するもの、例えばｐ１６を含めた腫瘍抑制因子タンパク質、シグナル変換因子、例えば（ＴＧＦ）－β；チェックポイント制御タンパク質、例えばＢＲＣＡ１、細胞接着に関与するタンパク質、例えばＣＡＤＭ１、ＤＮＡ修復タンパク質、例えばｐ５３、転写因子、例えば山中因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ）、シトクロムｃ、Ｂｃｌ－２（Ｂ細胞リンパ腫２）を含めたＢＣＬタンパク質、転写制御タンパク質、例えばＮＦ－κＢ、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン－２を含めたインターロイキン、およびその人工バージョン、リンホカイン、ならびに腫瘍壊死因子を含めたサイトカイン、熱ショックベータ－１タンパク質を含めた熱ショックタンパク質、成長因子、例えばＧＤＦ１１、ユビキチン、ＤＮＡ二本鎖断裂修復タンパク質、例えばＤＮＡリガーゼＩＩＩα、ＰＣＳＫ９阻害剤、例えばエボロクマブおよびアリロクマブ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、またはＩＬ－５の阻害剤、例えばメポリズマブおよびレスリズマブであり得る。

カーゴは、別のタイプの生物学的高分子（例えば、ステロール、ステロイド、または脂肪酸）であり得る。ステロールはコレステロールであり得る。ステロイドはプロゲステロンであり得る。脂肪酸は、飽和脂肪酸、例えばカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、または不飽和脂肪酸、例えばミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、リノエライジン酸、α－リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、ドコサヘキサエン酸であり得る。

カーゴは、リン脂質、例えばホスファチジルコリン（ｐｈｓｏｐｈｏｔｄｉｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ホスファチジン酸（ホスファチデート）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ０）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）、およびホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）、（スフィンゴミエリン）（ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（スフィンゴミエリン）（Ｃｅｒ－ＰＥ）等の脂質であり得る。

カーゴは、ペプチド・ホルモン、細胞膜破壊ペプチド、Ｔ細胞刺激ペプチド、または別のタイプのペプチド等のペプチドであり得る。ペプチド・ホルモンは、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、アミリン、アンギオテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、カルシトニン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ガストリン、グレリン、グルカゴン、成長ホルモン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、インスリン、レプチン、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、オキシトシン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、プロラクチン、レニン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、アルギニン・バソプレシン（ＡＶＰ）もしくは抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）とも呼ばれるバソプレシン、または血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）であり得る。細胞膜破壊ペプチドはメリチンであり得る。Ｔ細胞刺激ペプチドは、上で記載される抗原タンパク質の一部分等の抗原であり得る。別のタイプのペプチドは、マイクロシンＢ－１７および誘導体、アルビシジンおよび誘導体、骨髄細胞白血病１（ｍｃｌ－１）のペプチド阻害剤、ペプスタチンおよびその誘導体であり得る。

カーゴは、抗生物質分子、例えばマクロライド系抗生物質、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、ニコチンアミド・モノヌクレオチド、コレステロール吸収阻害剤、例えばエゼチミブ、フィブラート系薬、例えばゲムフィブロジル、ベザフィブラート、およびシプロフィブラート（ｃｉｐｏｆｉｂｒａｔｅ）、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ラノラジン、イバブラジン、グリセリルトリニトレート等のニトレート、ボセンタン等のエンドセリン・アンタゴニスト、ヒドララジン、ミノキシジル、カルシウム・チャネル遮断薬、例えばアムロジピン、ニフェジピン、ベラパミル、ジルチアゼム、アンギオテンシン・アンタゴニスト、例えばロサルタン、バルサルタン、カンデサルタン、およびイルベサルタン、ＡＣＥ阻害剤、例えばカプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、ジゴキシン、アデノシン受容体アゴニスト、クラスＩＶ抗不整脈薬（Ａｎｔｉｄｙｓｒｈｙｔｈｍｉｃ）、例えばベラパミル、クラスＩＩＩ抗不整脈薬、例えばアミオダロン、クラスＩＩ抗不整脈薬、例えばビソプロロール、エスモロール、およびプロプラノロール、クラスＩ抗不整脈薬、例えばフレカイニドおよびジソピラミド、抗ヒスタミン薬、例えばプロメタジン、シクリジン、およびセチリジン、グルココルチコイド、例えばプレドニゾロン、デキサメタゾン、およびヒドロコルチゾン、抗増殖性免疫抑制剤、カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリン、尿酸排泄剤、例えばアロプリノールおよびフェブキソスタット（ｆｌｅｂｕｘｏｓｔａｔ）、ＤＭＡＲＤ、ＣＯＸ－２阻害剤、例えばセレコキシブ、エトリコキシブ、およびパレコキシブ、ＮＳＡＩＤ、ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ阻害剤、例えばカルビドパもしくはベンセラジド、選択的Ｂ３－アドレナリン受容体アゴニスト、ａ１－受容体アゴニスト、Ｂ１受容体アゴニスト、例えばドブタミン、ａ１受容体アンタゴニスト、例えばプラゾシン、ドキサゾシン、およびタムスロシン、Ｂ２受容体アゴニスト、例えばサルブタモールおよびテルブタリン、ニコチン性部分的アゴニスト、例えばバレニクリン、末梢抗コリンエステラーゼ、例えばネオスチグミン、神経筋遮断薬、例えばパンクロニウム（ｐａｎｕｃｕｒｏｎｉｕｍ）、ベクロニウム、およびロクロニウム、膀胱制御薬、例えばオキシブチニンおよびトルテロジン、代謝拮抗薬、例えば葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、およびプリン類似体、アルキル化剤、抗真菌薬、例えばグリセオフルビン（Ｇｒｉｓｏｆｌｕｖｉｎ）、カスポファンギン、およびテルビナフィン、抗真菌性抗生物質、例えばアムホテリシンおよびナイスタチン、アルテミシニン誘導体、例えばアルテスナートおよびアルテミシニン、葉酸阻害剤、例えばプログアニル、プリマキン、血液殺シゾント剤（Ｂｌｏｏｄｓｃｈｉｚｏｎｔｉｃｉｄｅ）、例えばクロロキン（ｃｈｌｏｑｕｉｎｅ）およびキニーネ、ノイラミニダーゼ阻害剤、例えばオセルタミビルおよびザナミビル、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、例えばアシクロビルおよびガンシクロビル（ｇｌａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、プロテアーゼ阻害剤、例えばダルナビルおよびリトナビル（ｒｉｔａｎｏｖｉｒ）、逆転写酵素阻害剤、例えばネビラピンおよびエファビレンツ、抗てんかん薬、例えばカルバマゼピン（Ｃａｒｂａｍｅｚｅｐｉｎｅ）、ガバペンチン、およびプレガバリン、三環系抗鬱薬、例えばアミトリプチリン、ノルトリプチリン、およびデシプラミン、オピオイド、ＡＭＰＡ受容体遮断薬、例えばトピラマート、バルビツレート（Ｂａｒｂｉｔｕｒａｔｅ）、ベンゾジアゼピン、例えばロラゼパム、ミダゾラム、およびジアゼパム、ナトリウム・チャネル阻害剤、例えばカルバマゼピン、オクスカルバゼピン、およびフェニトイン、双極性疾患に対する薬、例えばリチウム、ドーパミン再取り込み阻害剤、例えばブプロピオン、モノアミン・オキシダーゼ阻害剤、例えばフェネルジン、イソカルボキサジド（ｉｓｏｃａｒｂｏｘｃａｚｉｄ）、およびモクロベミド、ノルアドレナリン再取り込み阻害剤、例えばレボキセチンおよびマプロチリン、ＳＮＲＩ、例えばベンラファキシン、デュロキセチン（ｄｕｌｏｘｅｔｉｄｎｅ）、およびデスベンラファキシン、ＳＳＲＩ、例えばフルオキセチン、パロキセチン、シタロプラム、エスシタロプラム、およびセルトラリン、三環系薬（Ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ）、例えばイミプラミンおよびクロミプラミン、抗精神病薬（Ａｎｔｉ－ｐｙｓｙｃｈｏｔｉｃ）、例えばアミスルプリドおよびスルピリド（ｓｕｐｉｒｉｄｅ）、部分的セロトニン・アゴニスト、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、例えばメマンチン、コリンエステラーゼ阻害剤、例えばドネペジル、リバスチグミン、およびガランタミン、モノオキシダーゼ（Ｍｏｎｏｘｉｄａｓｅ）阻害剤、例えばセレギリンおよびラサギリン、エンタカポンおよびトルカポン等のＣＯＭＴ阻害剤、ドーパミン・アゴニスト、例えばプラミペキソールおよびロチゴチン、ホスホジエステラーゼ・タイプＶ阻害剤、例えばシルデナフィルおよびタダラフィル、子宮刺激薬、例えばミソプロストール（ｍｉｓｏｐｒｏｓｔａｌ）、エルゴメトリン、およびオキシトシン、ＧｎＲＨ類似体および阻害剤、アルファ－グルコシダーゼ阻害剤、ＳＧＬＴ－２阻害剤、例えばカナグリフロジンおよびエンパグリフロジン、ジペプチジル・ペプチダーゼ阻害剤、例えばシタグリプチン、サクサグリプチン、およびリナグリプチン、プロトン・ポンプ阻害剤、例えばオメプラゾール、ランソプラゾール、およびパントプラゾール、吸入式グルココルチコイド、例えばベクロメタゾン（ｎｅｃｌｏｍｅｔａｓｏｎｅ）およびブデソニド、吸入式ムスカリン性アンタゴニスト、例えばチオトロピウムおよびグリコピロニウム、ロイコトリエン・アンタゴニスト、例えばモンテルカスト、ベータ２－受容体アゴニスト、例えばサルメテロール（ａｌｍｅｔｒｏｌ）およびホルモテロール、抗凝固薬、例えばダビガトラン（ｄａｂｉｇｒａｔｒａｎ）、ヘパリン、およびアピキサバン、ＳＴＩＮＧアンタゴニスト、インフラマソーム（Ｉｎｆｌａｍａｓｏｍｅ）阻害剤、標的オンコロジー薬、タンパク質キナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、タンパク質分解のＰＲＯＴＡＣおよび他の促進因子、ＰＡＲＰ阻害剤、例えばニラパリブ、ＡＬＫ阻害剤、例えばアレクチニブ、ＨＤＡＣ阻害剤、例えばベリノスタット、ＭＥＫ阻害剤、例えばコビメチニブ、ＢＲＡＦ阻害剤、例えばダブラフェニブ、ＥＧＦＲ阻害剤、例えばエルロチニブ、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばエベロリムス、ＨＥＲ２阻害剤、例えばラパチニブ、ＦＬＴ３キナーゼ阻害剤、例えばミドスタウリン、ＪＡＫ阻害剤、例えばトファシチニブ、またはＢＣＬ２阻害剤、例えばベネトクラクス等の小分子カーゴであり得る。

「単位」、「サブユニット」、「分子」、「生体分子」、「単量体」は、本記載において代替的に使用され、複合体形成のためにもう一方の分子に接続する一方の分子を意味する。

「還元抵抗性／非感受性分子架橋剤」への本明細書における言及は、ジスルフィド結合が還元剤によって切断される場合に典型的に見られるもの等の還元反応によって切断されない架橋剤への言及である。これらの架橋剤は、還元感受性結合の断裂をもたらすであろう条件下で安定である。これらは、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）およびビス－ブロモキシレンを含む。

「還元応答性／感受性分子架橋剤」への本明細書における言及は、ジスルフィド結合が還元剤によって切断される場合に典型的に見られるもの等の還元反応によって切断される架橋剤への言及である。これらの架橋剤は、還元感受性結合の断裂をもたらすであろう条件下で安定ではない。これらは、ジチオビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ）を含む。

「光活性化可能な分子架橋剤」への本明細書における言及は、光反応性または光に感受性である架橋剤、すなわち光に曝露された場合に切断されるであろうものへの言及である。この光は、ＵＶ、または特異的域の波長の他のそのような光であり得る。これらは、２－ビス－ブロモメチル－３－ニトロベンゼン（ｏ－ＢＢＮ）、２，４－ビス－ブロモメチル－１－ニトロベンゼン（ｍ－ＢＢＮ）、および１，３－ビス－ブロモメチル－４，６－ジニトロ－ベンゼン（ＢＤＮＢ）を含む。

「極度に帯電している」ＴＲＡＰケージの内腔への本明細書における言及は、ケージの内腔に面した表面が、非変異（野生型）の環と比較して、ＴＲＡＰ環あたり少なくとも＋１または－１と等価の電荷の正味変化を受けることを意味する。ゆえに、２４環のＴＲＡＰケージは、極度に帯電した場合、極度に帯電していない変種と比較して、－２４または＋２４の電荷の最小変化を持するであろう。

さらに、以下の略語が使用されている：ＴＲＡＰ（ｔｒｐＲＮＡ結合減衰タンパク質）、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＰＴＤ４（タンパク質形質導入ドメイン）、ＣＰＰ（細胞透過性ペプチド）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動）、ＴＥＭ（透過型電子顕微鏡法）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＦＢＳ（胎仔ウシ血清）。

細胞への分子カーゴの輸送は、薬物、遺伝材料、または酵素の送達を含めた広範な適用にとって望ましい。それぞれがそれら自身の利点および不利な点を有する、リポソーム、ウイルス様粒子、非ウイルスタンパク質ケージ、ＤＮＡオリガミ・ケージ、および無機ナノ粒子を含めて、これを達成するためにいくつかのナノ粒子が採用されている。タンパク質ケージは、しばしば高い効率および特異性を有して、細胞に遺伝材料を送達し得る、天然においてウイルスによって実証される有望な手法である。

人工ケージは、ケージ構造を天然には形成しないタンパク質によって構築され、構成タンパク質間の相互作用は、それらの会合を促進するように修飾され得る。そのような手法を使用する利点は、結果として生じるケージが、天然に存在する形態では使用不能または実現不能であり得る特性および能力を与えられ得ることである。これまでに、１２サブユニットの４面体ケージを形成し得る２回および３回の回転対称性を有するタンパク質のタンデム融合体、８面体対称性を有する２４個のサブユニットのナノキューブ構造、三量体タンパク質ビルディング・ブロックから自己会合する６０サブユニットの２０面体ケージ構造、ならびに小さなウイルスカプシドのものに匹敵する共会合性２構成要素１２０サブユニットの２０面体タンパク質複合体、ならびにケージを形成するために閉じるネットワークを形成し得る設計ペプチドを含めた、いくつかの人工タンパク質ケージが産生されている。人工タンパク質ケージが、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ^２、および蛍光色素を含めた様々なカーゴで充填されているいくつかの例が存在する。しかしながら、ほんのわずかな事例しか、人工ケージによる細胞へのカーゴの送達を実証していない。本発明者らの知る限りでは、人工タンパク質ケージ（天然ケージとは対照的に）によって媒介される細胞へのタンパク質／治療薬カーゴの送達は、以前に実証されていない。

本発明者らは、ＴＲＡＰケージと称される、天然に存在する環状タンパク質であるＴＲＡＰ（ｔｒｐＲＮＡ結合減衰タンパク質）からなるビルディング・ブロックを使用して、人工タンパク質ケージを以前に産生した（図１ａ）^１。天然では、ＴＲＡＰは、トリプトファン合成の制御に関与し、構造的におよび生化学的に十分に特徴付けされている。それは、バイオナノサイエンスにおいて多目的なビルディング・ブロックとしても使用されている。ＴＲＡＰケージは、およそ２２ｎｍ径を形成する２４個のＴＲＡＰ環、直径が大体１６ｎｍの内腔を有する２．２ＭＤａの中空球体からなる。ケージにおける各ＴＲＡＰ環は、５個のＴＲＡＰ環近隣に結合しており、構造は、直径がおよそ４ｎｍの６個の角穴を含有する。めずらしく、他の天然のおよびほとんどの人工ケージと比較して、ケージにおける環サブユニットは、タンパク質－タンパク質相互作用のネットワークによってではなくつなぎ合わされている。その代わりに、３５位における天然に存在するリジンがシステインで置き換えられているタンパク質における環間のシステイン残基の相対する硫黄を、単一の金（Ｉ）イオンが架橋する。ケージにおける各環の１１個の単量体のうちの１０個についてのシステインは、この方式で架橋され、１１番目は架橋されないままであり、例えばマレイミド標識された色素を用いて、反応に使用可能である。

ＴＲＡＰケージは、極めて安定であり、少なくとも３時間の９５℃の温度、および尿素等の高レベルの変性剤を存続し得る。この高い安定性にもかかわらず、ＴＲＡＰケージは、細胞還元剤グルタチオンを含めた低濃度の還元剤の存在下で容易くばらばらになる。この特質は、ＴＲＡＰケージは、それが、その構造を保持すると予想され得、細胞に入るまでカーゴを保護し、そこで細胞内還元剤が解体およびその後のカーゴ放出をもたらすであろうことから、細胞にカーゴを送達するためのシステムとしての実用性を有し得るという見込みを高める。

本発明者らは、ＴＲＡＰケージに、タンパク質カーゴを意図的に充填し得ることを示しており、本発明者らは、例となる分子として緑色蛍光タンパク質の負に極度に帯電した変種ＧＦＰ（－２１）を使用する。本発明者らは、ＴＲＡＰケージを使用して、ヒト細胞の内部にそのようなカーゴを送達し得ることも示す。この細胞透過は、ＴＲＡＰケージの表面が、例えば細胞透過性ペプチドによって修飾される場合にのみそれが生じることから、それ自体が制御可能である。結果は、細胞に医学的に関連したカーゴを送達するための潜在的に有用なツールとしてのＴＲＡＰケージの開発に向けた最初の一歩であり、治療剤としての人工タンパク質ケージ・システムの潜在性をより広く実証する。

本明細書で、本発明者らは、ＴＲＡＰケージを使用して、タンパク質カーゴを意図的にカプセル化し得、細胞内部にそれを送達し得ることを示す。非修飾形態でまたは外的に装飾されたいずれかで採用されたＴＲＡＰケージは、細胞生存率に対して有意な効果を示さなかった。

最初の実例において、カーゴを充填することは、ケージへの拡散を通じて負に極度に帯電したＧＦＰを静電的に捕捉するために、その内部に正に帯電したパッチを有する本発明者らの以前に開発したＴＲＡＰケージ^１を使用して達成された。充填されたカーゴを細胞に送達しようとする試みは、それらが装飾されなかった場合、細胞内へのＴＲＡＰケージの透過の証拠を示さなかった。対照的に、ＴＲＡＰケージの外部への細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）ＰＴＤ４の付着は、細胞内部への有意な透過をもたらした。

細胞へのカーゴの人工タンパク質ケージ媒介性送達に関する少数の以前の仕事は、非タンパク質カーゴに対する成功を実証している。注目すべきことに、ｓｉＲＮＡを担持した人工タンパク質ケージが、種々の哺乳類細胞によって取り込まれ得、そのカーゴを放出して、標的遺伝子発現のＲＮＡｉおよびノックダウンを誘導し得ることが示されている^３。この場合、低い毒性効果と合わせた高い遺伝子サイレンシング効率は、タンパク質ケージ担体が、治療的送達システムとしての潜在性を有することを示した。人工タンパク質ケージ内へのタンパク質カーゴのカプセル化は、以前に実証されている。しかしながら、これらのケージは、細胞にそれらのカーゴを直接送達し得ることが示されず、その代わりに、多コピーのケージそれ自体が、細胞において作製された脂質エンベロープ内のカーゴとして使用され、包み込まれたタンパク質ナノケージ（ＥＰＮ）として精製され、脂質エンベロープは宿主細胞膜に由来した。ＥＰＮはケージを送達し得、細胞への進入は、タンパク質ケージではなく、包み込む宿主由来の膜によって達成されることを意味した。

ＴＲＡＰケージの全体的な高い安定性、しかし細胞還元剤の存在下で解体するその証明された能力^１を考えると、ケージが、いったん細胞の内側に入ると容易くばらばらになるかどうかを知ることは興味深いであろう。細胞に入り次第の、ＴＲＡＰケージに結び付いたＡｌｅｘａ－６４７対ＧＦＰの相対シグナル強度の変化は、ケージの細胞内崩壊およびカーゴの放出を示唆する。考え得る説明は、Ａｌｅｘａ６４７およびＧＦＰがＴＲＡＰケージとの結び付きに起因して互いにごく接近している場合、ＧＦＰ蛍光は、色素からのクエンチング効果に起因して減少し得るということである。いったんＧＦＰがＴＲＡＰケージ解体によって放出されると、ＧＦＰからＡｌｅｘａ－６４７までの平均距離はより大きくなり、検出されるＧＦＰ蛍光の増加をもたらす。この可能性は、細胞内ＧＦＰからのシグナルが、それが、Ａｌｅｘａ－６４７を欠くＴＲＡＰケージを使用して送達される場合よりも目に見えて明るいという観察結果によって支持される（図１０）。

全体として、本明細書において提示される仕事は、人工タンパク質ケージによって媒介される、細胞へのタンパク質送達の最初の実証を与える。実証されたカーゴ充填効率はかなり低く、このことは、それが、ケージ内部により高い密度の正電荷を持するようにＴＲＡＰケージをさらに修飾することによって対処され得る。

さらに、ＴＲＡＰ単量体の内腔に面するＮ末端へのカーゴの遺伝学的融合を使用した、ＴＲＡＰケージ内への機能的タンパク質カーゴの担持が実証される。パッチワーク発現手法は、融合を用いて、またはそれがケージの収容能力を超えないようにカーゴの量の制御を可能にすることなく、ＴＲＡＰ単量体の混合発現を可能にする。このようにして、ｍＣｈｅｒｒｙカーゴを持つ、ならびにｍＣｈｅｒｒｙおよびｍＯｒａｎｇｅカーゴの混合を持つＴＲＡＰケージを実証し、カーゴの存在を確認した。

さらに、遺伝学的融合手法を、内腔に面するＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質の多コピーを提供するように適合させ、これが、ＳｐｙＴａｇを持つ、機能的タンパク質である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびコンピューターで設計されたインターロイキン－２模倣体（ネオロイキン－２／１５、ＮＬ－２）（ＳｉｌｖａＤＡら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１９、５６５、１８６～１９１）を捕捉し得ることが実証された。本発明者らは、ＮＬ－２とその標的細胞受容体との相互作用が、ＴＲＡＰケージ内へのカプセル化によって有意に阻害され、ＴＲＡＰケージが、外的に適用された誘発によって開いた場合に、カーゴは、遊離ＮＬ－２と同様のレベルで機能的になることをさらに示した。

代替的に、他のタンパク質ケージに関して記載されるように、カーゴ捕捉の種々の方法（共有結合性付着等）が探索され得る^４，５。付加的に、本発明者らは、標的化特異性を増加させること、ならびにカプセル化されるカーゴの域および有用性を広げることの両方のために、ＴＲＡＰケージのさらなる修飾を期待する。最後に、ＴＲＡＰケージの精確な細胞内の場所およびそれらの四次状態の両方を突き止めかつ追跡するために、将来的な調査が要されるであろう。態様によれば、本明細書に記載されるケージは医薬として使用され得る。これは、患者に本明細書に記載されるケージを投与する工程、または患者における疾患を治療することにおける使用のための本明細書に記載されるケージを含む等、患者を治療することにおけるものであり得る。これは、特に、細胞内送達のための、カーゴを持しかつ還元剤の存在下で解体するように設計されたケージであり得る。これらのケージは、薬学的に許容される担体、アジュバント、または賦形剤とともにまたはその存在下で投与され得る。医薬としての使用のためのまたは患者を治療するためのケージは、前記患者に有益であろう。例えば、活性分子（とりわけ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド、およびタンパク質等の生物学的高分子）に対する薬物送達システム（ＤＤＳ）として、生物学的高分子は、インビボで見出されるもの等の条件によってしばしば容易に破壊されるまたは消化されることから、それらは利点を提供する。生物学的高分子は、大きなタンパク質であるＴＲＡＰにおける穴から拡散するには大きすぎであり、ＴＲＡＰケージは、全体的構造を破壊することなく顕著な変化を継続させ得る。このことは、それが、治療用カーゴを捕捉するように修飾され得かつ治療標的を標的にするように外部で同時に修飾され得ることを意味する。作用の部位への到着と相関する所望の状況において切断するプログラム可能なリンカーが使用され得る。例えば、標的部位に光を照らして、開いた光切断性ＴＲＡＰケージを切断し得る。ＴＲＡＰケージが細胞に透過した場合、細胞の細胞質が高度に還元していくにつれて、還元性リンカーによってつなぎ合わされたものは自然発生的に開きかつカーゴを放出するであろう。ケージは、ワクチンと併せてまたはワクチンとして作用することにおいても使用され得、Ｔ細胞応答を刺激すると予想される抗原（すなわち、ペプチド）は、ＴＲＡＰケージの内側で捕捉され、次いでＴ細胞に標的化され、その後に誘発された開口が続く。

ＴＲＡＰケージタンパク質の図である。（ａ）異なる色で示される各ＴＲＡＰ環を有するＴＲＡＰケージの構造（ＰＤＢ：６ＲＶＶ）。金原子は、黄色の球体として示されている。（ｂ）電荷分布によって色付けされた、ＴＲＡＰケージ外部（左）および内部（右）の表面描写。（ｃ）電荷に従って色付けされた、示される内部空洞に向く面を有する単一ＴＲＡＰ環の表面像。（ｄ）漫画描写（左）および電荷に従って色付けされた表面像（右）で示された負に極度に帯電したＧＦＰ（－２１）。（ｅ）ＧＦＰ（－２１）を用いたＴＲＡＰケージカプセル化、ならびにＡｌｅｘａ－６４７色素およびＰＴＤ４ペプチドでの外的修飾のスキーム。ＴＲＡＰケージの充填および装飾の図である。（ａ）ＴＣＥＰの非存在下（－ＴＣＥＰ）または存在下（＋ＴＣＥＰ）でＮｉ－ＮＴＡカラムを通した後の、Ｈｉｓタグ付けされたＧＦＰ（－２１）とインキュベートされた精製されたＴＲＡＰケージを示すネイティブＰＡＧＥゲル。レーン１：ＧＦＰ（－２１）陽性対照；２：ネイティブＰＡＧＥに対する分子量マーカー（ｍａｒｋｅｄ）；３：空のＴＲＡＰケージ；４：インプット（ＧＦＰ（－２１）を有するＴＲＡＰケージ）；５および８：素通り；６および９：洗浄；７および１０：溶出。回収された画分を、タンパク質に対して染色した（左）、または蛍光検出によって分析した（右、励起４８８ｎｍ）。（ｂ）回収された画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、それに続く抗ＧＦＰ検出を用いたウェスタン・ブロットに供した。レーン１：ＧＦＰ（－２１）陽性対照；２：ＳＤＳ－ＰＡＧＥに対する分子量マーカー；３：空のＴＲＡＰケージ；４：インプット（ＧＦＰを有するＴＲＡＰケージ）；５および８：素通り；６および９：洗浄；７および１０：溶出。（ｃ）非修飾ＴＲＡＰケージ、またはＡｌｅｘａ－６４７およびＰＴＤ４によって外的に修飾されたＴＲＡＰケージによる、ＧＦＰ（－２１）のカプセル化を示すネイティブＰＡＧＥゲル。レーン１：ＧＦＰ（－２１）を有するＴＲＡＰケージ；２：Ａｌｅｘａ－６４７で装飾された、ＧＦＰ（－２１）を有するＴＲＡＰケージ；３：Ａｌｅｘａ－６４７およびＰＴＤ４で装飾された、ＧＦＰ（－２１）を有するＴＲＡＰケージ；４：ネイティブＰＡＧＥに対する分子量マーカー。ゲルをタンパク質に対して染色し（上のパネル）、ＧＦＰ（中央のパネル、励起４８８ｎｍ）およびＡｌｅｘａ－６４７（下のパネル、励起６４７）の蛍光検出によって分析した。（ｄ）ＧＦＰ（－２１）を有するＴＲＡＰケージのネガティブ染色透過型電子顕微鏡法（左のパネル）；Ａｌｅｘａ－６４７で装飾された、ＧＦＰ（－２１）を有するＴＲＡＰケージ（中央のパネル）；Ａｌｅｘａ－６４７およびＰＴＤ４で装飾された、ＧＦＰ（－２１）を有するＴＲＡＰケージ（右のパネル）。ＭＣＦ－７細胞へのＧＦＰ（－２１）を持するＴＲＡＰケージの送達の図である。（ａ）ＧＦＰ（－２１）を持するＡｌｅｘａ－６４７標識ＴＲＡＰケージ（（ＴＣ＋ＧＦＰ）＋Ａｌｅｘａ－６４７と表される）を用いた４時間の処理後の、ならびに１５分間、２時間、および４時間の、Ａｌｅｘａ－６４７およびＰＴＤ４ペプチドで標識された、ＧＦＰ（－２１）を有するＴＲＡＰケージ（（ＴＣ＋ＧＦＰ）＋Ａｌｅｘａ－６４７＋ＰＴＤ４と表される）を用いた処理後の、ＭＣＦ－７細胞についての代表的なフロー・サイトメトリー・ドット・プロット。ｘ軸およびｙ軸は、それぞれＧＦＰおよびＡｌｅｘａ－６４７の蛍光強度を示している。未処理細胞を陰性対照として使用した。（ｂ）同じ実験からのＭＣＦ－７細胞についての代表的な赤色および緑色蛍光重ね合わせヒストグラム。（ｃ）１５分間、２時間、および４時間のインキュベーション後の、ＧＦＰを持しかつＡｌｅｘａ－６４７で装飾されたまたはＡｌｅｘａ－６４７およびＰＴＤ４の両方で装飾されたＴＲＡＰケージで処理された、Ａｌｅｘａ－６４７およびＧＦＰ陽性細胞の蛍光強度中央値。データは、未処理細胞に対して正規化され、３回の独立した実験に基づく。対照：１：未処理細胞；２：（ＴＣ＋ＧＦＰ）＋Ａｌｅｘａ－６４７とインキュベートされた細胞。（ｄ）未処理細胞（対照細胞、上の行）、ＧＦＰ（－２１）を充填されかつＡｌｅｘａ－６４７のみで標識されたＴＲＡＰケージとインキュベートされた細胞（中央の行）：ＧＦＰ（－２１）を充填されかつＡｌｅｘａ－６４７およびＰＴＤ４で標識されたＴＲＡＰケージとインキュベートされた細胞（下の行）の共焦点顕微鏡法画像。アクチン・フィラメントを、Ａｌｅｘａ－５６８にコンジュゲートされたファロイジンで染色し、核をＤＡＰＩで染色した。緑色チャネル－ＧＦＰ；赤色チャネル－Ａｌｅｘａ－６４７；青色チャネル－ＤＡＰＩ；灰色チャネル－Ａｌｅｘａ－５６８；（スケール・バー：１０μＭ）。ＭＣＦ－７細胞におけるＴＲＡＰケージおよびＧＦＰ（－２１）の追跡の図である。Ａｌｅｘａ－６４７およびＰＴＤ４で装飾されかつ種々の時点で固定された、ＧＦＰ（－２１）を持するＴＲＡＰケージとインキュベートされた細胞の共焦点顕微鏡法統合画像。アクチンを、Ａｌｅｘａ－５６８にコンジュゲートされたファロイジンで染色し、一方でＤＡＰＩを核染色に使用した；（スケール・バー：１０μＭ）。それぞれの主な画像の下の長方形画像は、ｙｚ軸における代表的な直交像である。（ａ）－赤色チャネル最大投射を用いた画像；（ｂ）－緑色チャネル最大投射を用いた画像。ＴＲＡＰケージにおけるＨｉｓタグ付けされたＧＦＰ（－２１）分子の数の推定の図である。（ａ）０～１００ｎＭの濃度域を有する、ＧＦＰ（－２１）タンパク質の蛍光測定から獲得された標準曲線。方程式：ｙ＝０．０２５８ｘ＋４．４；Ｒ^２＝０．９７８６とフィットさせた。（ｂ）バンド・デンシトメトリー分析に使用されたウェスタン・ブロット。レーン１～４：ＧＦＰ（２１）；レーン５：ＧＦＰ（－２１）を担持したＴＲＡＰケージ（（ＴＣ＋ＧＦＰ）と表される）。ＧＦＰ（－２１）でのＴＲＡＰケージの外的装飾の図である。（ａ）ＧＦＰ（－２１）を充填されたＴＲＡＰケージを装飾するために使用された精製されたＰＴＤ４ペプチドを示すＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラム。（ｂ）コンジュゲーション反応におけるＡｌｅｘａ－６４７の滴定後の、ＧＦＰ（－２１）を持するＴＲＡＰケージを示すネイティブＰＡＧＥゲル。ゲルを、Ａｌｅｘａ６４７（左のパネル、励起６４７）およびＧＦＰ（中央のパネル、励起４８８ｎｍ）の蛍光検出によって分析し、タンパク質に対して染色した（右のパネル）。矢印は、さらなる実験において使用された最適な装飾条件を示している。（ｃ）装飾なし、Ａｌｅｘａ－６４７で装飾された、またはＡｌｅｘａ－６４７およびＰＴＤ４の両方で装飾された、ＧＦＰ（－２１）を持するＴＲＡＰケージを比較したＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル。左：４８８ｎｍにおける検出；中央：６４７ｎｍにおける検出；右：抗ＧＦＰ抗体で検出された同じサンプルについてのウェスタン・ブロット。レーン：１：ＳＤＳＰＡＧＥ電気泳動に対する分子量マーカー；２：ＧＦＰ（－２１）を有するＴＲＡＰケージ；３：Ａｌｅｘａ－６４７で装飾された、ＧＦＰ（－２１）を有するＴＲＡＰケージ；４：Ａｌｅｘａ－６４７およびＰＴＤ４で装飾された、ＧＦＰ（－２１）を有するＴＲＡＰケージ；５：ＧＦＰ（－２１）－陽性対照。培養培地におけるＴＲＡＰケージ安定性、および細胞生存率試験の図である。（ａ）１８時間のインキュベーション中の、ＦＢＳ存在の有無でのＤＭＥＭ培養培地におけるＴＲＡＰケージ安定性を示すネイティブＰＡＧＥゲル。（ｂ）空のＴＲＡＰケージ、ＧＦＰ（－２１）を担持したＴＲＡＰケージ、ならびにＡｌｅｘａ－６４７およびＰＴＤ４で装飾された、ＧＦＰ（－２１）を有するＴＲＡＰケージへの４時間の曝露後のＭＣＦ－７およびＨｅＬａ細胞の細胞生存率。Ｍ＝ネイティブ電気泳動に対する分子量マーカー；ＴＣ：空のＴＲＡＰケージ；（ＴＣ＋ＧＦＰ）：ＧＦＰ（－２１）を充填されたＴＲＡＰケージ；（ＴＣ＋ＧＦＰ）＋Ａｌｅｘａ－６４７＋ＰＴＤ４：ＧＦＰ（－２１）を有しかつＡｌｅｘａ－６４７およびＰＴＤ４で装飾されたＴＲＡＰケージ。ＨｅＬａ細胞へのＧＦＰ（－２１）を有するＴＲＡＰケージの送達の図である。（ａ）４時間の、ＧＦＰ（－２１）を有するＡｌｅｘａ－６４７標識ＴＲＡＰケージ（（ＴＣ＋ＧＦＰ）＋Ａｌｅｘａ－６４７と表される）を用いた処理後の、ならびに１５分間、２時間、および４時間の、ＧＦＰ（－２１）およびＰＴＤ４を有するＡｌｅｘａ－６４７標識ＴＲＡＰケージ（（ＴＣ＋ＧＦＰ）＋Ａｌｅｘａ－６４７＋ＰＴＤ４と表される）を用いた処理後の、ＨｅＬａ細胞についての代表的なフロー・サイトメトリー・ドット・プロット。ｘ軸およびｙ軸は、それぞれＧＦＰおよびＡｌｅｘａ－６４７の蛍光強度を示している。未処理細胞を陰性対照として使用した。（ｂ）同じ実験からのＨｅＬａ細胞についての代表的な赤色および緑色蛍光重ね合わせヒストグラム。（ｃ）１５分間、２時間、および４時間のインキュベーション後の、（ＴＣ＋ＧＦＰ）＋Ａｌｅｘａ－６４７および（ＴＣ＋ＧＦＰ）＋Ａｌｅｘａ－６４７＋ＰＴＤ４で処理された、Ａｌｅｘａ－６４７およびＧＦＰ陽性細胞の蛍光強度中央値。データは、未処理細胞に対して正規化され、３回の独立した実験に基づく。対照：１：未処理細胞；２：（ＴＣ＋ＧＦＰ）＋Ａｌｅｘａ－６４７とインキュベートされた細胞。（ｄ）未処理細胞（対照細胞）（上の行）、Ａｌｅｘａ－６４７のみで標識された（ＴＣ＋ＧＦＰ）とインキュベートされた細胞（中央の行）：ＧＦＰ（－２１）を充填されかつＡｌｅｘａ－６４７およびＰＴＤ４で標識されたＴＲＡＰケージとインキュベートされた細胞（下の行）の共焦点顕微鏡法画像。アクチン・フィラメントを、Ａｌｅｘａ－５６８にコンジュゲートされたファロイジンで染色し、核をＤＡＰＩで染色した。緑色チャネル－ＧＦＰ；赤色チャネル－Ａｌｅｘａ－６４７；青色チャネル－ＤＡＰＩ；灰色チャネル－Ａｌｅｘａ－５６８；（スケール・バー：１０μＭ）。ＨｅＬａ細胞におけるＴＲＡＰケージおよびＧＦＰの追跡の図である。Ａｌｅｘａ－６４７およびＰＴＤ４で標識されかつ種々の時点で固定された、ＧＦＰ（－２１）を有するＴＲＡＰケージとインキュベートされた細胞の共焦点顕微鏡法統合画像。アクチンを、Ａｌｅｘａ－５６８にコンジュゲートされたファロイジンで染色し、一方でＤＡＰＩを核染色に使用した；（スケール・バー：１０μＭ）。長方形画像は、ｙｚ軸における代表的な直交像である。（ａ）－赤色チャネル最大投射を用いた画像；（ｂ）－緑色チャネル最大投射を用いた画像。ＧＦＰ（－２１）蛍光に対するＡｌｅｘａ－６４７の影響の図である。（ａ）細胞を、Ａｌｅｘａ－６４７およびＰＴＤ４で標識された（ＴＣ＋ＧＦＰ）（上の行）、またはＰＴＤ４のみで標識された（ＴＣ＋ＧＦＰ）（下の行）に曝露した。アクチン・フィラメントを、Ａｌｅｘａ－５６８にコンジュゲートされたファロイジンで染色し、核をＤＡＰＩで染色した。緑色チャネル－ＧＦＰ；赤色チャネル－Ａｌｅｘａ－６４７；青色チャネル－ＤＡＰＩ；灰色チャネル－Ａｌｅｘａ－５６８；（スケール・バー：１０μＭ）。（ｂ）細胞を、Ａｌｅｘａ－６４７およびＰＴＤ４で標識された（ＴＣ＋ＧＦＰ）、またはＰＴＤ４のみで標識された（ＴＣ＋ＧＦＰ）に曝露したサンプルに対する３つの異なる視野から登録された平均ＧＦＰ蛍光強度。蛍光強度を、バックグラウンド強度差分を考慮して、ＩｍａｇｅＪを用いて定量した。（ｃ）溶液中で測定される、装飾されていないおよび十分に装飾されたＴＲＡＰケージ内にカプセル化されたＧＦＰ（２１）の平均蛍光。遺伝学的融合およびパッチワーク形成を使用した、単一タイプのゲストタンパク質のゲスト・パッケージングの図である。（ａ）遺伝学的融合およびパッチワーク・ストラテジーを使用した、ＴＲＡＰケージ内へのｍＣｈｅｒｒｙカプセル化の略図。Ｐｔｅｔ／ｔｅｔＯ、テトラサイクリン・プロモーター／オペロン；Ｐｔ７／ｌａｃＯ、Ｔ７プロモーター／ｌａｃオペロン・システム。（ｂ）内腔に変化に富んだ数のｍＣｈｅｒｒｙを含有するＴＲＡＰケージのネガティブ染色透過型電子顕微鏡画像。遺伝学的融合およびパッチワーク形成を使用した、２種の異なるタイプのゲストタンパク質のゲスト・パッケージングの図である。（ａ）蛍光タンパク質を担持したＴＲＡＰケージの略図。Ｎ末端でｍＣｈｅｒｒｙ（濃い円筒）またはｍＯｒａｎｇｅ２（薄い円筒）のいずれかと融合したパッチワークＴＲＡＰ環を、ＤＴＭＥまたはトリフェニルホスフィンモノサルフェート（ＴＰＰＭＳ）－Ａｕ（Ｉ）－Ｃｌのいずれかとともに混合した。（ｂ）蛍光性カーゴと結び付いた精製されたＴＲＡＰケージの蛍光特性を示すネイティブＰＡＧＥ。ゲルを、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅタンパク質染色（左）、ならびに５３２ｎｍにおける励起および６１０ｎｍにおける発光を使用した蛍光（右）を使用して可視化した。（ｃ）Ａｕ（Ｉ）（上）またはＤＴＭＥ（下）のいずれかを使用して会合した、空の（左）ＴＲＡＰケージ、および蛍光タンパク質を充填されたもの（右）のＴＥＭ画像。スケール・バー、５０ｎｍ。ＴＲＡＰケージにおける二重タンパク質担持の確認の図である。ａ、ｂ、１０ｍＭＤＴＴの添加前および後の、５１０ｎｍにおける励起があり次第の、ｍＯｒａｎｇｅ２およびｍＣｈｅｒｒｙの両方を担持した、ＴＲＡＰケージ^{Ａｕ（Ｉ）}（ａ）およびＴＲＡＰケージ^ＤＴＭＥ（ｂ）の正規化された発光スペクトル。５６８ｎｍにおけるｍＯｒａｎｇｅ２発光ピーク、６１０ｎｍにおけるｍＣｈｅｒｒｙ発光ピーク。付加的な線は、それぞれＤＴＴの非存在または存在下における、測定の直前に一緒に混合されたｍＯｒａｎｇｅ２またはｍＣｈｅｒｒｙタンパク質のみを担持したケージのスペクトルを示す。ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムを使用したゲスト・パッケージングの概念の図である。（ａ）ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ媒介性ゲスト担持のためのストラテジー。（ｂ）ＴＲＡＰおよびＧＦＰ変種の構築物。ＳｐｙＴ、ＳｐｙＴａｇ；ＳｐｙＣ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ；残基４７と４８との間の位置にＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを含有する。この構築物を、Ｈｉｓタグ付けされたＳＵＭＯを用いて産生し、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティー・クロマトグラフィーの後にＳＵＭＯプロテアーゼによって切断し、ＴＲＡＰ－Ｋ３５Ｃ－ループＳｐｙＣを産出した。内腔にＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを含有するＴＲＡＰケージの産生の図である。（ａ）ＴＲＡＰ－Ｋ３５ＣおよびＳｐｙＣ－ＴＲＡＰまたはＴＲＡＰ－ループＳｐｙＣのいずれかから構成されるＴＲＡＰ１１ｍｅｒの産生についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。ＳＮ、細胞溶解および遠心分離後の上清；Ｎｉ、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティー・クロマトグラフィー；ＳＵ、ＳＵＭＯプロテアーゼ切断。（ｂ）Ａｕ（Ｉ）を用いたケージ形成についてのネイティブＰＡＧＥ分析。反応を、１００μＭＴＲＡＰ、０または１００μＭＴＰＰＭＳ－Ａｕ（Ｉ）－Ｃｌ（Ａｕ（Ｉ）（－）または（＋））、および０または６００ｍＭＮａＣｌ（ＮａＣｌ（－）または（＋））を含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）において実施した。ＳｐｙＴａｇ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムを使用したＴＲＡＰケージ内へのＧＦＰカプセル化の図である。（ａ、ｂ）内腔にＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ部分を含有するＴＲＡＰケージ、ＳｐｙＣ－ＴＲＡＰケージまたはＴＲＡＰ－ループＳｐｙＣケージ、およびＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰの混合物についてのＳＤＳ－（ａ）およびネイティブ－（ｂ）ＰＡＧＥ分析。ネイティブＰＡＧＥに関しては、同じゲルを、蛍光およびＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ染色によって可視化した。ＧＦＰを充填されたＴＲＡＰケージの単離およびイメージングの図である。（ａ、ｂ）３０ｎｇ／ｍＬテトラサイクリン誘導を用いて獲得され、ＳｐｙＴａｇ付けされたＧＦＰと混合された、内腔にＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ部分を含有するＴＲＡＰケージについてのサイズ排除クロマトグラム（ａ）およびネガティブ染色ＴＥＭ画像（ｂ）。ＴＲＡＰ－Ｋ３５Ｃ変種から構成され、いかなるカーゴも充填されていないケージを有するものも、比較のために提供される。（ｃ）ＳｐｙＴ－ＴＲＡＰ変種のネガティブ染色ＴＥＭ画像。光開口性ＴＲＡＰケージにおけるネオロイキン－２／１５のカプセル化のためのストラテジーの図である。パッチワークＴＲＡＰ環は、Ｋ３５Ｃ、Ｒ６４Ｓ変異を含有しかつ７３および７４位におけるリジンを欠くＴＲＡＰ変種、ならびにＫ３５Ｃ変異、Ｎ末端におけるＨｉｓタグｔａｇおよびＳＵＭＯ、ならびに内腔ループにおけるＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを含有するものから構成される。ＢＢＮ、１，２－ビスブロモメチル－３－ニトロベンゼン；β－ＭＥ、β－メルカプトエタノール。ＴＲＡＰケージからのネオロイキン－２の誘発された放出は、標的細胞を刺激することを示した図である。ａ、グラフは、ＮＬ－２、ｈＩＬ－２、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＴＲＡＰ環とコンジュゲートしたＳｐｙ－Ｔａｇ－ＮＬ－２を用いたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞の２４時間の刺激後に測定された吸光度によって示されるＳＥＡＰ活性を反映する；ｂ、ＵＶ照射前および後の、ＮＬ－２、空のＴＲＡＰケージ、ならびにＵＶ照射前および後の、ＳｐｙＴａｇ－ＮＬ－２を充填されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＴＲＡＰケージを用いた２４時間の刺激後のＳＥＡＰの活性。

本発明の実現において採用された技法
電子顕微鏡法
ＧＦＰ（－２１）を充填されたＴＲＡＰケージ、ＧＦＰ（－２１）を充填されかつＡｌｅｘａ－６４７で標識されたＴＲＡＰケージ、およびＧＦＰ（－２１）を充填されかつ十分に装飾されたＴＲＡＰケージを、透過型電子顕微鏡を使用して撮像した。サンプルを、典型的に、０．０２５ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度に希釈し、１００００ｇ、５分間、室温で遠心分離し、上清を、親水性化された（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）カーボンコート銅グリッド（ＳＴＥＭＣｏ．）に適用した。次いで、サンプルを、３％リンタングステン酸、ｐＨ８を用いてネガティブ染色し、８０ｋＶで運転されるＪＥＯＬＪＥＭ－２１００機器を使用して可視化した。

フロー・サイトメトリー
ＴＲＡＰケージ内在化実験に関しては、ＭＣＦ－７およびＨｅＬａ細胞を、ウェルあたり２．５×１０^５個の密度で、１０％ＦＢＳを有する８００μｌのＤＭＥＭ中にて１２ウェル・プレート（ＶＷＲ）に播種し、実験前にさらに１６時間培養した。次いで、細胞を、１０％ＦＢＳを補給された、１５０ｍＭＮａＣｌｐＨ７．５を有する５０ｍＭＨＥＰＥＳ中にて、カーゴを充填され、Ａｌｅｘａ－６４７のみで標識されたまたはＡｌｅｘａ－６４７およびＰＴＤ４ペプチドで装飾された５０μｇ（６ｎＭ）のＴＲＡＰケージとともに１５分間、２時間、および４時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＥＵＲｘ）で５分間３回洗浄し、トリプシン（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて収穫し、１５０ｇで５分間遠心分離した。その後、細胞を、遠心分離（３分間１５０ｇ）によってＰＢＳ中で３回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。細胞をＮａｖｉｏｓフロー・サイトメーター（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）においてランし、各サンプルあたり、１２０００個の細胞の蛍光を回収した。未処理細胞、およびカーゴを充填されかつＡｌｅｘａ－６４７のみで標識されたＴＲＡＰケージで処理された細胞を、陰性対照として使用した。３回の独立した実験に対して獲得されたデータを、Ｋａｌｕｚａソフトウェア（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を用いて分析した。Ａｌｅｘａ－６４７／ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージおよび蛍光強度中央値を、各サンプルに対して判定した。

レーザー走査型共焦点顕微鏡法
蛍光レーザー走査型共焦点顕微鏡観察に関しては、細胞を、１２ウェル・プレートにプレートされた１５－ｍｍガラス・カバー・スリップ上で成長させ（１０％ＦＢＳを有する８００μｌＤＭＥＭ中、ウェルあたり２．５×１０^５個）、フロー・サイトメトリー実験に関して上で記載されるようにさらに刺激した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し（５分間３回）、４％パラホルムアルデヒド溶液で固定し（１５分間、室温）、ＰＢＳ中０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００で透過処理した（７分間、室温）。アクチン・フィラメントを、ＰＢＳ中Ａｌｅｘａ－５６８にコンジュゲートされたファロイジンで染色した（１：３００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１．５時間、室温）。次いで、カバー・スリップを、ＤＡＰＩを有するＰｒｏｌｏｎｇＤｉａｍｏｎｄ媒体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、スライド上に封入した。蛍光画像を、６３×油浸対物レンズとともにＬＳＭ８８０共焦点モジュールを備えたＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１倒立顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）下で取得した。画像を、ＩｍａｇｅＪ１．４７ｖ（米国国立衛生研究所）を使用して処理した。

実施例１．ＴＲＡＰケージの充填
ＴＲＡＰケージに充填するために、本発明者らは、ＴＲＡＰ環の表面の正電荷の顕著なパッチのみが、ケージの内部を裏打ちする面にあるという事実を利用した（図１ａ～ｃ、１ｂ、ｃ）。原理上、これは、他のタンパク質ケージに対して実証されているように（例えば、^６）、静電相互作用を介して、負に帯電したカーゴの捕捉を可能にし得る。構成成分のＴＲＡＰ環が、金（Ｉ）の添加までＴＲＡＰケージに会合しないという事実^１は、およそ４ｎｍを下回るタンパク質カーゴが、カプセル化まで２種の考え得る経路を有することを意味し、それらは会合前にＴＲＡＰ環に結合し得る、またはそれらは、ＴＲＡＰケージ形成後に添加され、４倍の穴を通じてケージ内に拡散するのを可能とされ得る。本発明者らは、負に極度に帯電したＧＦＰ（－２１）をモデルカーゴとして選定した（図１ｄ）。この円筒状のタンパク質は、およそ２．４ｎｍの直径を有し、それゆえ、会合したＴＲＡＰケージ内に拡散し得ると予想される（図１ｅ）。Ｈｉｓタグ付けされたＧＦＰ（－２１）をＴＲＡＰケージと混合し、一晩インキュベートし、その後に、残存する遊離ＧＦＰ（－２１）の除去のためのサイズ排除クロマトグラフィー精製が続いた。ネイティブ・ゲル上での蛍光シグナルの共遊走によって示されるように、２つのタンパク質が結び付いていることが見出された（図２ａ）。Ｈｉｓタグ付けされたＧＦＰ（－２１）がＴＲＡＰケージの内側にあり、その外部に結合していないかどうかを検証するために、本発明者らは、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティー・クロマトグラフィーを使用したプル・ダウン・アッセイ、それに続くウェスタン・ブロット分析を実行した。ＴＲＡＰケージと結び付いたＧＦＰ（－２１）がＮｉ－ＮＴＡカラムに結合しなかったという観察結果は、Ｈｉｓタグをアクセス不能にするカプセル化の成功を示唆した。このことは、還元剤の添加によってケージが解離した後、結び付いたＧＦＰ（２１）のみが、Ｎｉ－ＮＴＡカラムと相互作用するために使用可能であることを示したプル・ダウン・アッセイによってさらに支持された（図２ｂ）。これらの結果は、完全または部分的な様態のいずれかでのＴＲＡＰケージ内へのＧＦＰのカプセル化を強く示唆する（部分的カプセル化とは、内部に向くＨｉｓタグを有するＴＲＡＰケージにおける穴をＧＦＰが「塞ぐ」場合である）。一部は、大幅により多くの数のカーゴを示しているものの、ケージあたりのＧＦＰ（－２１）の数は、いくつかの他の充填されたタンパク質ケージに見出されるものに匹敵するおよそ０．３個であった。

ＧＦＰ（－２１）を充填されたＴＲＡＰケージの産生および精製
ＴＲＡＰケージ産生および精製を、以前に記載されるように実施した^１。関連するプラスミドおよびアミノ酸配列情報に関しては、表１を参照されたい。極度に帯電した（２１）Ｈｉｓタグ付けされたＧＦＰタンパク質を、ＧＦＰ遺伝子をコードするｐＥＴ２８ａから発現させ、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞において産生した。タンパク質を、Ｎｉ－ＮＴＡを使用して精製した。簡潔には、細胞を、プロテアーゼ阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の存在下で、５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、５ｍＭＣａＣｌ_２中にて４℃で超音波処理によって溶解し、溶解物を２００００ｇで０．５時間４℃で遠心分離した。上清を、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．９、１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール（緩衝液Ａ）中であらかじめ平衡化されたＮｉ^２＋結合ニトリロ三酢酸（Ｈｉｓ－ＰｕｒＮｉ－ＮＴＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とカップリングしたアガロース・ビーズとともにインキュベートした。樹脂の３回の洗浄（緩衝液Ａを用いた）の後、タンパク質を、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．９、１５０ｍＭＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール（緩衝液Ｂ）を用いて溶出した。Ｈｉｓタグ付けされたＧＦＰ（－２１）を含有する画分をプールし、室温で５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１５０ｍＭＮａＣｌ中にて、ＨｉＬｏａｄ２６／６００Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーに供した。タンパク質濃度を、２８０ｎｍの波長を使用してＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して測定した。

等体積の１００μＭの負に極度に帯電した（－２１）Ｈｉｓタグ付けされたＧＦＰと、５０ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、（ｐＨ７．９）中で一晩インキュベートした１μＭのあらかじめ形成されたＴＲＡＰケージとを混合することによって、ＧＦＰカプセル化を実行した。ＧＦＰを担持したＴＲＡＰの精製を、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ中にて、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって行った。ＴＲＡＰケージを含有する画分を回収し、３～１２％ネイティブＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したネイティブＰＡＧＥ、それに続く４８８ｎｍにおける励起を用いたＣｈｅｍｉｄｏｃ検出器（ＢｉｏＲａｄ）を使用した蛍光検出によって分析した。

ＴＲＡＰケージにおけるＨｉｓタグ付けされたＧＦＰ（－２１）分子の数を推定する
ＧＦＰ（－２１）の担持を推定するために、２種の方法を使用した：
１．カーゴを充填されたＴＲＡＰケージにおけるＧＦＰ蛍光の検出に基づく。ＧＦＰ（２１）標準曲線を、０～１００ｎＭの濃度域で作成した。λ_ｅｍに対して１．０ｎｍの間隔、走査速度６０００ｎｍ分、λ_ｅｘ帯域幅５ｎｍおよびλ_ｅｍ帯域幅５ｎｍを用い、４８８ｎｍにおける固定励起波長および４９５～５５０ｎｍにおける発光波長域を用い、ＲＦ－６０００Ｓｈｉｍａｄｚｕ（登録商標）分光蛍光光度計を使用して、蛍光スペクトルを２６℃で取得した。発光最大λ_ｅｍ５１０ｎｍにおける蛍光を算出に使用した。ＴＲＡＰタンパク質濃度を、２８０ｎｍにおける吸光度から判定した。１：０．２８±０．０７というＴＲＡＰケージ：ＧＦＰ（－２１）化学量論を獲得した（図５ａ）。

２．デンシトメトリー分析。簡潔には、一連のＨｉｓタグ付けされたＧＦＰ（－２１）希釈物（波長２８０ｎｍでＮａｎｏｄｒｏｐによって測定される０．４ｎｇ；０．８ｎｇ；４ｎｇ；８ｎｇ）およびサンプルであるカーゴを充填されたＴＲＡＰケージ（波長２８０ｎｍでＮａｎｏｄｒｏｐによって測定される２μｇ）を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ウェスタン・ブロッティングに供した（図５ｂ）。Ｈｉｓタグ付けされたＧＦＰ（－２１）タンパク質からのシグナルを、化学発光検出器（Ｃｈｅｍｉｄｏｃ、ＢｉｏＲａｄ）において、抗ＧＦＰ抗体および二次ＨＲＰコンジュゲート抗体を用いて検出した。結果として生じたブロットについてのＩｍａｇｅＬａｂ（ＢｉｏＲａｄ）ソフトウェアを使用したデンシトメトリー分析は、０．６ｎｇのＨｉｓタグ付けされたＧＦＰ（－２１）が、カーゴを充填された２μｇのＴＲＡＰケージに存在することを示した。デンシトメトリー分析は、およそ１：０．４というＴＲＡＰケージ：ＧＦＰ（－２１）化学量論をもたらした。

Ｎｉ－ＮＴＡ「プル・ダウン」
Ｈｉｓタグ付けされたＧＦＰ（－２１）タンパク質を充填された精製されたＴＲＡＰケージのサンプルを、２つの部分に分割し、還元（１ｍＭＴＣＥＰ）または非還元（ＴＣＥＰなし）条件下でインキュベートした。次に、サンプルを重力流の下でＮｉ－ＮＴＡ樹脂（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に通し、１００μｌの各サンプルを、緩衝液Ａで平衡化された５０μｌの樹脂に導入した。３種のサンプルを回収した：（ｉ）素通り、（ｉｉ）緩衝液Ａを用いた洗浄、および（ｉｉｉ）緩衝液Ｂを用いた溶出。サンプルを、ネイティブＰＡＧＥ、それに続く蛍光検出（４８８ｎｍにおける励起、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ、ＢｉｏＲａｄ）およびウェスタン・ブロットによって分析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタン・ブロットに関しては、Ｎｉ－ＮＴＡプル・ダウン・アッセイから回収されたサンプルを、ＴＣＥＰ（最終濃度０．１ｍＭ）の添加および１５分間の煮沸によって変性させ、その後に、Ｔｒｉｓ／グリシン・ゲル電気泳動による分離が続いた。ゲルを、活性化ＰＶＤＦ膜への、２５ｍＭＴｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール緩衝液中での電気泳動転写（２時間、９０Ｖ）に供した。膜を、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を補給されたＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ－Ｔ）中５％スキム・ミルクでブロッキングし、その後に、マウスモノクローナル抗ＧＦＰ抗体（１：２５００；Ｓｔ．Ｊｏｈｎ’ｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＫ）、およびホースラディッシュ・ペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗マウス（１：５０００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）二次抗体との１．５時間のインキュベーションが続いた。シグナルを、ＰｉｅｒｃｅＥＣＬＢｌｏｔｔｉｎｇＳｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して発生させ、ＢｉｏＲａｄＣｈｅｍｉｄｏｃ検出器において可視化した。

本明細書におけるＴＲＡＰケージは、極度に帯電した内腔を有し得る。これを有するために、ＴＲＡＰケージは、Ｅ４８ＱまたはＥ４８Ｋ変異を含み得る。好ましくは、極度に帯電した内腔を有するＴＲＡＰケージは、Ｋ３５Ｃ／Ｅ４８ＱまたはＫ３５Ｃ／Ｅ４８Ｋ変異を含むであろう。これは付加的なものを提供する。

実施例２．蛍光色素でのおよび細胞透過性ペプチド標識でのＴＲＡＰケージの装飾
本発明者らは、その細胞進入を促進するためにＴＲＡＰケージを修飾することを目指した。本発明者らは、低下した数のアルギニンおよび増加したα－ヘリックス含有量を有してより両親媒性である、細胞膜を透過する有意に向上した能力を示す最適化されたＴＡＴベースの細胞透過性ペプチドである、ＰＴＤ４（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ、配列番号８）を選定する^７。いくつかの仕事は、ＰＴＤ４または同様のものでナノ粒子をコートすることが、細胞透過を促進することを示している（例えば、^８）。本発明者らは、ＴＲＡＰケージの表面曝露したリジン上のアミノ基に、ＰＴＤ４誘導体Ａｃ－ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＧ（配列番号９）を付着させた。ＴＲＡＰケージ上に単量体あたり３個のそのような表面曝露したリジンがあり、ケージあたり７９２個のペプチドが付着されるのを潜在的に可能にする。Ｎ末端アミノ基のアセチル化は、ＴＲＡＰタンパク質の使用可能なアミノ基と反応することを意図される活性化カルボキシル部分との、それらのアミノ基の交差反応の可能性を排除する。付加的に、伸長したＣ末端グリシン残基は、柔軟性のあるリンカーとして働き、それはキラルアミノ酸ではないことから、カルボキシル活性化中のラセミ化の機会を破棄する。ペプチドを、固相方法論を使用して合成し、逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製した（図６ａ）。最適化された反応において、本発明者らは、ネイティブＰＡＧＥによって可視化されるように、ＰＴＤ４との反応後にＴＲＡＰケージの見かけの分子量の増加を観察した（図６ｃ）。

そのカーゴから独立してＴＲＡＰケージを追跡し得るために、本発明者らは、それをＡｌｅｘａ－６４７蛍光色素で標識した。これに関して、本発明者らは、色素上のマレイミド基と、環－環相互作用に関与しない、ＴＲＡＰケージの６個の４－ｎｍの穴を裏打ちする２４個の使用可能なシステインとを架橋した。滴定によって、本発明者らは、ＴＲＡＰケージが容易く標識されかつ遊離色素がサンプルに存在しない、添加されるべき最適な量のＡｌｅｘａ－６４７（ＴＲＡＰシステイン基の数と等しい）を立証した。これを、ＧＦＰ（－２１）およびＡｌｅｘａ－６４７の両方を検出する蛍光測定と組み合わされたネイティブＰＡＧＥによって査定した（図６ｂ）。カーゴＧＦＰは３個のシステイン残基を含有するものの、対照反応は、Ａｌｅｘａ６４７でのＧＦＰの検出可能な標識化を示さなかった（図６ｃ）。ネガティブ染色透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）により、修飾されたＴＲＡＰケージがそれらの特徴的な形状を保持することが確認された（図６ｄ）。

ＰＴＤ４ペプチド合成
ＰＴＤ４ペプチド誘導体（Ａｃ－ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＧ、（配列番号１０）、簡略化のために、本文においてＰＴＤ４と呼ばれる）を、Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成方法論に従って、ＬｉｂｅｒｔｙＢｌｕｅ自動マイクロ波合成器（ＣＥＭ、ＵＳＡ）を使用して０．１ｍｍｏｌ規模で合成した。Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｗａｎｇ樹脂（１００～２００メッシュ、置換０．７０ｍｍｏｌ／ｇ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１：１）を用いて一晩膨張させた。Ｆｍｏｃ脱保護を、ＤＭＦ中２５％モルホリンを用いて８５℃で５分間実施した。カップリング反応を、８５℃で５分間、５倍過剰のＦｍｏｃ保護されたアミノ酸誘導体とともにＤＩＣ／オキシマ活性化因子を使用して、推奨されるメーカーのプロトコールのとおりに実施した。二重カップリングを、すべてのＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）カップリングに適用した。Ｎ末端アセチル化を、６０℃でＤＭＦ中１０％無水酢酸を用いて樹脂に対して実施した。樹脂からの切断および側鎖脱保護を、３０℃で激しく振とうしながらの４時間のＴＦＡ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）／／水（９４：３：３）を用いた処理によって達成した。樹脂を濾過し、ＴＦＡを穏やかな窒素気流下で蒸発させた。粗ペプチドを、冷却ジエチルエーテルの添加、それに続く遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）によって沈殿させた。樹脂を、冷却エーテル（２×）および酢酸エチル（２×）で洗浄した。沈殿した粗ペプチドを、真空内で一晩乾燥させた。粗ペプチドを８Ｍ尿素に溶かし、セミ分取Ｃ１８（１０×１５０ｍｍ）カラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ、ナカライテスク）を使用したＡｇｉｌｅｎｔ１２６０ＲＰ－ＨＰＬＣで精製した。回収されたペプチド含有画分を凍結乾燥した。精製されたペプチドを、１．０ｍｌ／分の流速で３０分間、０．１％ＴＦＡを有する０～２０％のアセトニトリルの線形勾配で、分析的Ｃ１８カラム（ＺｏｒｂａｘＳＢＣ１８５ｍｍ４．６×１５０ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）で分析した。ピーク・シグナルを２２０および２８０ｎｍにおいて検出した（図６ａ）。

Ａｌｅｘａ－６４７でのＴＲＡＰケージ標識化および細胞透過性ペプチドでの装飾
ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７Ｃ２マレイミド蛍光色素（Ａｌｅｘａ－６４７、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および細胞透過性ＰＴＤ４ペプチドを、ＴＲＡＰタンパク質に存在するシステインおよびリジンとの架橋反応を介して、ＧＦＰを充填されたＴＲＡＰケージにコンジュゲートした。

蛍光標識化を達成するために、ＧＦＰを持するＴＲＡＰケージ（３００μｌ、１６ｎＭ）を、Ａｌｅｘａ－６４７Ｃ２マレイミド色素（５０μｌ、１μＭ）と混合し、反応を、４５０ｒｐｍで連続的に撹拌しながら、室温で２．５時間、１５０ｍＭＮａＣｌｐＨ７．５を有する５０ｍＭＨＥＰＥＳ中で実行した。ＴＲＡＰケージへのマレイミド・コンジュゲートＡｌｅｘａ－６４７の最適な相互作用比を、滴定によって査定した（図６ｂ）。簡潔には、ＧＦＰ（－２１）を担持したＴＲＡＰケージのアリコート（１１．３６ｎＭ）を、０．１μＭ～１００μＭに及ぶマレイミド・コンジュゲートＡｌｅｘａ－６４７と混合した。次いで、サンプルを、ネイティブ・ゲル電気泳動によって分離し、６４７ｎｍにおける励起を用いて、Ｃｈｅｍｉｄｏｃにおける蛍光検出によって可視化した。遊離Ａｌｅｘａ－６４７がサンプルに存在せずかつＡｌｅｘａ－６４７シグナルとのＧＦＰ干渉が観察されない反応を、最適な装飾条件と見なし、さらなる実験において使用した。

付加的に、Ａｌｅｘａ－６４７による直接ＧＦＰ標識化の可能性を除くために、Ａｌｅｘａ－６４７標識化の有無での、ＧＦＰ（－２１）を担持したＴＲＡＰケージを、変性ゲル分離およびウェスタン・ブロッティング、それに続く抗ＧＦＰ抗体を用いた検出に供した。Ａｌｅｘａ－６４７色素とのＧＦＰの潜在的相互作用によるバンド・シフトは観察されなかった（図６ｃ）。

細胞透過性ペプチド装飾に関しては、ＰＴＤ４ペプチド（５０μｌ、０．５ｍＭ）を、１－エチル－３－（－３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、１０μｌ、８３ｍＭ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、１０μｌ、４３５ｍＭ）と混合し、すべての試薬をｄｄＨ_２Ｏに溶かした。その後、過剰の活性化ＰＴＤ４ペプチドを、ＧＦＰ（－２１）を充填されたＴＲＡＰケージに添加し、Ａｌｅｘａ－６４７で標識し、４５０ｒｐｍで連続的に撹拌しながら、室温で次の２．５時間インキュベートした。反応を、５μｌの２００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ７．５の添加によって停止させた。コンジュゲーション効率を、ネイティブＰＡＧＥおよび蛍光ゲル・イメージングによって検証した。装飾されたＴＲＡＰケージの分子量の変化は、ネイティブＰＡＧＥにおいて観察されるバンド・シフトをもたらす（図６ｃ）。

実施例３．ＴＲＡＰケージの安定性および細胞生存率に対する効果
細胞送達試験に着手する前に、本発明者らは、まず、ＴＲＡＰケージが構造的に安定かどうか、すなわち細胞培養条件下で解体しないかどうかを査定した。安定性を、様々な濃度の胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）の有無で、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中にて、３７℃、５％ＣＯ_２大気にてチェックした。結果は、ケージ構造が、３７℃、５％ＣＯ_２での１８時間以内のインキュベーションにおいてＤＭＥＭ培養培地中で安定であることを示した（図７ａ）。

細胞生存率に対するＴＲＡＰケージの効果を判定するために、ａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイを行った。この試験は、ミトコンドリアのおよび他の還元酵素によって、青色でかつ非蛍光性の化合物であるレザズリンを、赤色でかつ蛍光性の分子であるレソフリン（ｒｅｓｏｆｕｒｉｎ）に変換する生存細胞の天然の能力に基づく^９。ヒトがん細胞株ＭＣＦ－７およびＨｅＬａを、ＴＲＡＰケージ、ＧＦＰ（２１）を充填されかつＡｌｅｘａ－６４７およびＰＴＤ４ペプチドで装飾されたＴＲＡＰケージの存在下でインキュベートした。細胞生存率試験において使用された細胞の数、ＴＲＡＰケージ用量、および刺激時間は、ＴＲＡＰケージの内在化実験が実施された条件に相当する。未処理細胞を対照として使用した。データは、非修飾ＴＲＡＰケージ、ならびにＧＦＰ（－２１）を充填されかつＡｌｅｘａ－６４７およびＰＴＤ４で装飾されたＴＲＡＰケージの両方とも、少なくとも４時間のインキュベーションの間、ＭＣＦ－７およびＨｅＬａ細胞の生存率に有意に影響を及ぼさないことを示した（図７ｂ）。

細胞培養およびＴＲＡＰケージの細胞毒性査定：
ＨｅＬａおよびＭＣＦ－７細胞を、１０％ＦＢＳ（ＥＵＲｘ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン（Ｇｉｂｃｏ）を補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）中で培養した。培養を、５％ＣＯ_２下にて３７℃で維持した。培養培地におけるＴＲＡＰケージ安定性を試験するために、精製されたサンプルを、０、２、および１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ培地に添加し、５％ＣＯ_２下にて３７℃で２時間、６時間、および１８時間インキュベートした。その後、サンプルを、ネイティブＰＡＧＥ、それに続くＩｎｓｔａｎｔｂｌｕｅゲル染色によって分析した（図７ａ）。

ＴＲＡＰケージ処理後の細胞生存率を、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ試験（ＶＷＲ）を使用して判定した。細胞を、ウェルあたり２．５×１０^４個細胞の密度で９６ウェル・プレートにおいて培養した。次に、細胞を、１０％ＦＢＳを補給された、１５０ｍＭＮａＣｌｐＨ７．５を有する５０ｍＭＨＥＰＥＳ中にて、５μｇ（０．６ｎＭ）のＴＲＡＰケージ、ＧＦＰ（２１）を充填されかつＡｌｅｘａ－６４７およびＰＴＤ４で装飾されたＴＲＡＰケージで４時間処理した。処理の後、９０μｌＤＭＥＭ培地に希釈された１０μｌのａｌａｍａｒＢｌｕｅをウェルごとに添加し、細胞を、５％ＣＯ_２下にて３７℃で次の３時間インキュベートした。ａｌａｍａｒＢｌｕｅの活性構成要素であるレザズリンは、生存細胞においてのみ高蛍光性化合物レソフリンに還元され、この色素の吸光度（励起５７０ｎｍ、発光６３０ｎｍ）を記録した。無処理細胞を陰性対照として使用した（図７ｂ）。すべてのサンプルを、３回の独立した実験において三つ組で測定した。

実施例４．細胞へのタンパク質カーゴの送達
細胞へのＴＲＡＰケージの送達を、ヒトがん細胞株ＭＣＦ－７およびＨｅＬａを使用して調査した。細胞を、カプセル化されたＧＦＰ（－２１）を含有しかつＡｌｅｘａ－６４７のみでまたはＡｌｅｘａ－６４７およびＰＴＤ４で標識された精製されたＴＲＡＰケージとともに種々の期間インキュベートし、フロー・サイトメトリーによって分析した。Ａｌｅｘａ６４７およびＧＦＰの両方に起因した蛍光シグナルは、Ａｌｅｘａ－６４７およびＰＴＤ４ペプチドで標識された、ＧＦＰを有するＴＲＡＰケージで処理された両細胞株において長期のインキュベーション時間とともに増加した（図３ａ、ｂ、ｃ）。これらの結果は、細胞透過性ペプチドでのＴＲＡＰケージの外的修飾が、それらの細胞進入および有効なカーゴ送達を促進することを示している。興味深いことに、この効果は、ＨｅＬａ細胞株と比較して、ＭＣＦ－７細胞株の場合により著しかった（図８ａ、ｂ、ｃ）。

細胞に内在化したＴＲＡＰケージからおよび細胞膜で外的に吸着されたものからの蛍光シグナルを区別するために、共焦点顕微鏡法を使用した。ＧＦＰ（－２１）を含有しかつＡｌｅｘａ－６４７で標識されているがＰＴＤ４を欠くＴＲＡＰケージは、細胞において観察されなかった。対照的に、ＧＦＰ（－２１）を含有しかつＰＴＤ４で装飾されたＴＲＡＰケージは、刺激の４時間後に細胞内部において明白なシグナルを示した（図３ｄおよび図８ｄ）。

実施例５．ＴＲＡＰケージの細胞内動力学
適度な濃度の細胞還元剤の存在下でばらばらになるその能力と相まったＴＲＡＰケージの高い安定性は、細胞質におけるＴＲＡＰケージが容易く解体し、ＧＦＰ（－２１）カーゴを放出することを示唆する。ＴＲＡＰケージおよびＧＦＰは個別でかつ追跡可能なシグナルを所有することから、本発明者らは、細胞進入後にＡｌｅｘａ－６４７およびＧＦＰシグナルが共局在しなくなる場合、ケージ解体およびＧＦＰ（－２１）の放出が強く推測され得るという仮説を立てた。この可能性を査定するために、本発明者らは、ＭＣＦ－７およびＨｅＬａがん細胞への添加後に両シグナルを経時的に追跡した。注目すべきことに、試験された両細胞株において、インキュベーションの最初の９０分間の間、ＴＲＡＰケージは、そこでのＡｌｅｘａ－６４７シグナルの強い局在によって示されるように、主に細胞境界に存在し（図４ａ、９ａ）、ＧＦＰシグナルはほとんど検出不能であった（図４ｂ、９ｂ）。しかしながら、インキュベーションの３時間後、ＴＲＡＰケージ・シグナル（Ａｌｅｘａ－６４７）はより弱くなり、細胞内により一様に分布するように見え、一方でＧＦＰシグナルは、ＴＲＡＰケージからのその放出におそらく起因してはっきりと検出可能であった（図４ａ、ｂおよび図９ａ、ｂ）。

実施例６．ＧＦＰ（－２１）蛍光に対するＡｌｅｘａ－６４７の影響
ＧＦＰ（－２１）蛍光に対するＡｌｅｘａ－６４７の潜在的影響（図６ａ、中央のパネルによって示唆される）を査定するために、本発明者らは、カーゴを充填されたＴＲＡＰケージを共焦点顕微鏡イメージングによって比較し、比較されたケージは、ＰＴＤ４ペプチドのみで装飾されたまたは十分に装飾された（ＰＴＤ４およびＡｌｅｘａ－６４７）（図１０ａ）。簡潔には、細胞を、材料および方法に記載されるように、それぞれのサンプルで処理した。次に、上で記載されるプロトコールに従って、細胞を固定しかつ染色した。緑色チャネルにおける蛍光強度を、ＩｍａｇｅＪを用いて定量した。平均蛍光強度の算出（図１０ｂ）は、各視野からのバックグラウンド・シグナルを考慮に入れた。

付加的に、十分に装飾されたＴＲＡＰケージ内にカプセル化されたＧＦＰ（－２１）の溶液中蛍光を、ＲＦ－６０００Ｓｈｉｍａｄｚｕ（登録商標）分光蛍光光度計を使用して、Ａｌｅｘａ－６４７なしのＴＲＡＰケージ内のカーゴの蛍光と比較した。図１０ｃに示されるように、ＴＲＡＰケージ上のＡｌｅｘａ－６４７色素の存在は、そのカーゴの蛍光のおよそ３０％の低下をもたらす。

実施例７．遺伝学的融合によりタンパク質カーゴをＴＲＡＰケージに充填する
効率的なタンパク質パッケージングを、ケージを形成するＴＲＡＰへのゲストの遺伝学的融合によって達成した。初回モデルとして、本発明者らは、遠赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙを採用した（図１１ａ）。Ｎ末端にＨｉｓタグ付けされた蛍光タンパク質を、会合した場合に内部に面するＴＲＡＰ^Ｋ３５ＣＮ末端に遺伝学的に融合した。１個の１１－ｍｅｒＴＲＡＰ単位へのこれらの蛍光タンパク質での過度の修飾は、立体障害に起因してケージ会合を妨げ得ることから、融合タンパク質を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ宿主細胞において非修飾ＴＲＡＰ^Ｋ３５Ｃと共産生し、個々の転写レベルは、異なる誘導因子であるそれぞれテトラサイクリンおよびイソプロピル－β－_Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって制御され得る。この共産生システムを使用して、ＴＲＡＰ環あたりのｍＣｈｅｒｒｙの数は、テトラサイクリンの濃度を変更することによって十分に調節され得る。ｍＣｈｅｒｒｙに融合したパッチワークＴＲＡＰ環を、次いで、Ａｕ（Ｉ）を使用してケージに会合させた（図１１ｂ）。同じ手法を使用して、ＴＲＡＰケージに１種を上回るタイプのカーゴタンパク質を充填し得る。

タンパク質産生：
パッチワークを産生するために、ＴＲＡＰ環を、ｐＡＣＴｅｔ＿Ｈ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＴＲＡＰ－Ｋ３５ＣおよびｐＥＴ２１＿ＴＲＡＰ－Ｋ３５Ｃで共形質転換した。タンパク質発現を、０．２ｍＭイソプロピル－β－ｄ－チオガラクトピラノシドおよびテトラサイクリン（８ｎｇ／ｍｌ）の添加によって誘導した。超音波処理による細胞溶解の後、パッチワークＴＲＡＰ環を、次いで、Ｎｉ－ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）アフィニティー・クロマトグラフィー、それに続くＳｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬカラムを使用したＳＥＣを使用して単離した。

ケージ会合および特徴付け：
ＴＲＡＰケージの形成を、６００ｍＭＮａＣｌを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中にて、ｍＣｈｅｒｒｙを含有する精製されたＴＲＡＰ環およびクロロ（トリフェニルホスフィンモノスルホキシド）金（Ｉ）－（ＴＰＰＭＳ－Ａｕ（Ｉ）－Ｃｌ）の等モル量を混合することによって行い、室温で一晩保った。ゲストタンパク質化学量論を、吸光度比２８０／５８７ｎｍを使用して判定した。単離されたケージの形態学を、上で記載されるプロトコールを用いて、ネガティブ染色ＴＥＭを使用して調べた。

細胞透過性ペプチドを用いたｍＣｈｅｒｒｙ装飾を有するＴＲＡＰケージ：
マレイミド部分を、６－マレイミドヘキサン酸およびＤＩＣ／オキシマ・カップリング・プロトコールを使用して、樹脂上のペプチドのＮ末端に導入した。０．５ｍＭ６－マレイミドヘキサン酸（ｍａｌｅｉｍｉｄｅｈｅｘａｎｏｉｃ）－ＰＴＤ４またはＨＡ／Ｅ２（２５μｌ、０．５ｍＭ）ペプチドを、ｍＣｈｅｒｒｙを充填されたＴＲＡＰケージ（７５μｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ）と混合し、４５０ｒｐｍで連続的に撹拌しながら、室温で一晩インキュベートした。コンジュゲーション効率を、ネイティブＰＡＧＥおよび蛍光ゲル・イメージングによって検証した。装飾されたＴＲＡＰケージの分子量の変化は、ネイティブＰＡＧＥにおいて観察されるバンド・シフトをもたらす。

実施例９．遺伝学的融合により２種の異なるタンパク質カーゴをＴＲＡＰケージに充填する
１種を上回るタイプのタンパク質をＴＲＡＰケージに充填することが可能である。フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のそれぞれドナーおよびアクセプターとして働く２種の蛍光タンパク質ｍＯｒａｎｇｅ２およびｍＣｈｅｒｒｙを、ＴＲＡＰ単量体のＮ末端への各カーゴタンパク質の遺伝学的融合によりカプセル化した。融合タンパク質を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ宿主細胞において非修飾ＴＲＡＰＫ３５Ｃと共産生し、個々の転写レベルは、異なる誘導因子であるテトラサイクリンおよびイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって制御され得る。添加される発現誘導因子の量を最適化して、ケージ形成過程の間の立体障害を避けることを可能にする、ＴＲＡＰ環あたり０．３個のｍＯｒａｎｇｅ２および１個のｍＣｈｅｒｒｙタンパク質を獲得した。

カーゴ修飾されたＴＲＡＰ環を、次いで１：１モル比で混合し、Ａｕ（Ｉ）－またはＤＴＭＥのいずれかを添加して、ケージ会合を促進した（図１２ａ）。

結果として生じたケージを、次いでサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、蛍光検出およびＴＥＭイメージングと組み合わされたネイティブＰＡＧＥによって分析した（図１２ｂ、ｃ）。ネイティブＰＡＧＥにより、５３２ｎｍにおける蛍光励起（発光６１０ｎｍ）によって見られ得る両蛍光性カーゴを用いたＴＲＡＰケージのカプセル化の成功が確認された（図１２ｂ）。

ＴＥＭイメージングは、カーゴ修飾されたＴＲＡＰ環の混合物を用いたその会合後に、カーゴをはっきりとパッケージされたＴＲＡＰケージの単分散集団を示した。結果として生じたものは、Ａｕ（Ｉ）またはＤＴＭＥにより誘導された空のケージと比較してそれらの形態学を保持した（図１２ｃ）。

ＴＲＡＰケージにごく接近したｍＯｒａｎｇｅ２およびｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の存在は、エネルギーが、励起されたフルオロフォアから別の分子に移動する物理的過程であるフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を可能にするはずである。タンパク質ケージの内側にカプセル化された蛍光タンパク質間のエネルギー移動はすでに記載されているが、人工タンパク質ケージの解体反応速度論のモニタリングに適用されたことはない。

ＴＲＡＰケージ^ＤＴＭＥおよびＴＲＡＰケージ^{Ａｕ（Ｉ）}の内側のｍＯｒａｎｇｅ２およびｍＣｈｅｒｒｙタンパク質間のＦＲＥＴの効率を査定するために、ｍＯｒａｎｇｅ２に対する励起値を使用して、スペクトルデータを集めた。すべてのスペクトルデータをｍＯｒａｎｇｅ２蛍光ピークで正規化し、ｍＣｈｅｒｒｙとの共局在を、蛍光強度比の相対値によって判断した。蛍光スペクトルを、ＦＲＥＴペアをパッケージされたＴＲＡＰケージに対してだけでなく、ｍＣｈｅｒｒｙまたはｍＯｒａｎｇｅ２タンパク質のいずれかのみをカプセル化したＴＲＡＰケージ^{Ａｕ（Ｉ）／ＤＴＭＥ}である対照サンプルに対しても測定し、後に溶液中で混合した。そのような対照サンプルは、遠いケージ内にカプセル化されて、フルオロフォアが互いに離れているためＦＲＥＴを示し得ない。実際、ＦＲＥＴペアをパッケージされたＴＲＡＰケージ^{Ａｕ（Ｉ）}およびＴＲＡＰケージ^ＤＴＭＥのスペクトルは、相当する対照サンプルと比較して、６１０ｎｍにおけるｍＣｈｅｒｒｙ発光のおよそ１．５倍高いシグナルを示し（図１３ａ、ｂ）、それは、ＤＴＭＥおよびＡｕ（Ｉ）により誘導されたＴＲＡＰケージの両方の内側でｍＯｒａｎｇｅ２とｍＣｈｅｒｒｙとの間の効率的なエネルギー移動を示す。

タンパク質産生：
Ｅ．ｃｏｌｉ系統ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、ｐＡＣＴｅｔ＿Ｈ－ｍＯｒａｎｇｅ－ＴＲＡＰＫ３５ＣまたはｐＡＣＴｅｔ＿Ｈ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＴＲＡＰ－Ｋ３５Ｃのいずれか、およびｐＥＴ２１＿ＴＲＡＰ－Ｋ３５Ｃで共形質転換した。細胞を、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを補給された１００ｍｌＬＢ培地中にて３７℃でＯＤ_６００＝０．５～０．７まで成長させた。この時点で、タンパク質発現を、０．２ｍＭＩＰＴＧ、およびｐＡＣＴｅｔ＿Ｈ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＴＲＡＰ－Ｋ３５Ｃの場合には１０ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリン、またはｐＡＣＴｅｔ＿Ｈ－ｍＯｒａｎｇｅ－ＴＲＡＰ－Ｋ３５Ｃの場合には３０ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリンの添加によって誘導し、その後に２５℃で２０時間のインキュベーションが続いた。次いで、細胞を、５，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって収穫した。細胞ペレットを、精製まで－８０℃で保管した。ペレットを、ＤＮａｓｅＩおよびリゾチーム、１錠のプロテアーゼ阻害剤カクテル、ならびに２ｍＭＤＴＴを補給された４０ｍｌ溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、６００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）に再懸濁し、室温で３０分間撹拌した。次いで、サンプルを超音波処理し、１０，０００×ｇ、４℃で２０分間の遠心分離によって浄化した。次いで、上清を、重力流カラムにおいて溶解緩衝液中であらかじめ平衡化された４ｍｌＮｉ－ＮＴＡ樹脂とともに２０分間インキュベートした。次いで、樹脂を、２０および４０ｍＭイミダゾールを含有する溶解緩衝液中で、１０カラム体積を上回って洗浄した。Ｈｉｓタグ付けされたタンパク質を、５００ｍＭイミダゾールを含有する５ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を使用して溶出した。次いで、タンパク質サンプルを、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－１５遠心式フィルター・ユニット（５０ｋ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）、ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、以降本明細書において２×ＰＢＳ－Ｅと称される２×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）に緩衝液交換した。次いで、タンパク質を、０．８ｍｌ／分の流速で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーに供した。５４８ｎｍまたは５８７ｎｍで吸収を示す主なピークをプールし、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－１５（５０ｋＭＷＣＯ）を使用して濃縮した。タンパク質純度をＳＤＤ－ＰＡＧＥによってチェックし、タンパク質濃度を、減衰係数：ε_{ｍＣｈｅｒｒｙ５８７}＝７２，０００Ｍ^－１ｃｍ^－１、ε_{ｍＯｒａｎｇｅ５４８}＝５８，０００Ｍ^－１ｃｍ^－１、ε_{ＴＲＡＰ２８０}＝８２５０Ｍ^－１ｃｍ^－１を使用して、ＵＶ－１９００ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（島津製作所）を使用して測定された吸光度によって判定した（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ．ｈｔｍｌ）。タンパク質を、使用まで４℃で保管した。

ケージ会合および精製：
架橋剤により誘導されたケージ会合に関しては、２×ＰＢＳ－Ｅ中のＴＲＡＰ（Ｋ３５Ｃ／Ｒ６４Ｓ）（１００～５００μＭ）を、５倍モル過剰のＤＴＭＥまたはＢＭＨのいずれかと混合し、室温で１時間撹拌した。溶液中の最終ＤＭＳＯ濃度を１２．５％以下（ｎｏｇｒｅａｔｅｒｔｈａｎ）に保った。反応後、水溶液中での架橋剤の低い溶解度におそらく起因した不溶性画分を、１２，０００×ｇで５分間の遠心分離によって除去した。次いで、上清を、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒＦＰＬＣ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて、０．５ｍｌ／分の流速で、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。架橋したＴＲＡＰケージを含有する画分をプールし、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－４（１００ｋＭＷＣＯ）遠心式フィルター・ユニットを使用して濃縮した。獲得された架橋したＴＲＡＰケージの典型的な収量はおよそ２０％であった。金（Ｉ）により誘導されたＴＲＡＰケージの形成および精製を、以前に記載されるように実施した（１）。部分的に会合したケージからサンプルを精製するサイズ排除クロマトグラフィーの前に付加的なＮｉ－ＮＴＡ精製工程を用いて、架橋したおよび金（Ｉ）により誘導されたケージの両方に関して記載されるのと同じプロトコールを使用して、融合タンパク質を用いたケージ形成を実施した（ケージの内側で十分に保護されていない、Ｈｉｓタグ付けされたｍＣｈｅｒｒｙおよびｍＯｒａｎｇｅ２は、Ｎｉ－ＮＴＡカラムに結合する）。カプセル化されたゲストのタンパク質濃度および比を、以前に報告されたもの（４）の類似法を使用して、２８０／５４８ｎｍまたは２８０／５８７ｎｍにおける吸光度比を使用して推定した。算出に使用された減衰係数は、ε_{ｍＣｈｅｒｒｙ５８７}＝７２０００Ｍ^－１ｃｍ^－１、ε_{ｍＯｒａｎｇｅ２５４８}＝５８０００Ｍ^－１ｃｍ^－１、ε_{ＴＲＡＰ２８０}＝８２５０Ｍ^－１ｃｍ^－１であった。ｍＣｈｅｒｒｙとｍＯｒａｎｇｅ２との間のスペクトル重複に起因して、両方のカプセル化されたゲストの濃度を適正に算出するために、ＴＲＡＰへの融合なしのｍＣｈｅｒｒｙの５４８／５８７ｎｍにおける吸光度比を使用して、ｍＣｈｅｒｒｙ減衰係数も５４８ｎｍにおいて推定した（ε_{ｍＣｈｅｒｒｙ５４８}＝４２５３８Ｍ^－１ｃｍ^－１）。同じように、２８０ｎｍにおけるｍＣｈｅｒｒｙおよびｍＯｒａｎｇｅ２の減衰係数を、それぞれε_{ｍＣｈｅｒｒｙ２８０}＝５６７４４Ｍ^－１ｃｍ^－１およびε_{ｍＯｒａｎｇｅ２２８０}＝５２２００Ｍ^－１ｃｍ^－１として実験的に判定した。会合したケージの形態学的忠実度を、ネガティブ染色ＴＥＭおよびネイティブＰＡＧＥ分析によって確認した。

蛍光測定：蛍光スペクトルを、ＲＦ－６０００蛍光分光光度計（島津製作所）にて、１－ｃｍ光路長のポリスチレン・キュベットにおいて２×ＰＢＳ－Ｅ中７０ｎＭｍＯｒａｎｇｅ２を使用して、室温で取得した。タンパク質を５１０ｎｍで励起し、発光を５３０～７００ｎｍの波長域にわたって走査した。獲得されたスペクトルを、ｍＯｒａｎｇｅ２蛍光ピークに対して正規化した。各測定の後、１０ｍＭＤＴＴをサンプルに添加して、完全なケージ解体を誘発した。

実施例１０．イソペプチド結合形成を介してタンパク質カーゴをＴＲＡＰケージに充填する
遺伝学的融合を使用した堅牢でかつ一般的なシステムにもかかわらず、このストラテジーは、ゲストタンパク質をＡｕ（Ｉ）またはマレイミド架橋剤に曝露する要件において依然として欠点を抱える。この手順は、ゲストタンパク質が、活性に重要である遊離システイン残基を含有する場合、例えばシステイン・プロテアーゼの場合に、特に問題があり得る。問題を克服するために、本発明者らは、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムを使用した会合後担持システムを考案し、１３アミノ酸ペプチドのＳｐｙＴａｇはタンパク質ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと相互作用して、イソペプチド結合を自然発生的に形成する（参照により本明細書によって組み入れられる、ＺａｋｅｒｉＢら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１２、１０９、６９０～６９７）。タンパク質ケージに充填する文脈において、２種のストラテジーが使用され得る（図１４ａ）。ストラテジー１では、ＴＲＡＰケージの内壁がＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを持ち、一方でカーゴがＳｐｙＴａｇを持する。第２のストラテジーでは、ＴＲＡＰケージの内壁がＳｐｙＴａｇを持ち、一方でカーゴがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを持する。本発明者らは、まずＴＲＡＰケージにおけるＧＦＰの捕捉のために、この手法に基づいて様々な構築物を設計した（図１４ｂ）。ストラテジー２に関しては、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを、ＴＲＡＰのＮ末端または内腔に面するループ（具体的には４７と４８との間）のいずれかに導入した。すべての宿主ＴＲＡＰは、精製を容易にするヘキサヒスチジンタグを備え、一方でタグは、カルボキシペプチダーゼまたはＳＵＭＯプロテアーゼのいずれかを使用して切断除去されて、それぞれＳｐｙＴ－ＴＲＡＰまたはＳｐｙＣ－ＴＲＡＰと称される、Ｎ末端にＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを所有するＴＲＡＰ－Ｋ３５Ｃ変種、ならびにＴＲＡＰ－ループＳｐｙＣと称される、内腔ループにＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを有するものを産出し得る。

ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを所有するＴＲＡＰ変種を、実施例９に記載されるように、タグなしのＴＲＡＰ－Ｋ３５Ｃとともに宿主細菌において共産生して、パッチワーク環を産出した。過度のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ部分に起因した不十分なケージ形成を避けるために、本発明者らは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合変種の遺伝子発現レベルを調節する２つの濃度１０または３０ｎｇ／ｍＬのテトラサイクリンを試験した。融合体の変化に富んだ含有量を有するパッチワーク環の産生ならびにＳＵＭＯプロテアーゼによるＨｉｓタグの切断を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって確認した（図１５ａ）。リン酸緩衝液におけるＡｕ（Ｉ）の添加があると、すべての変種はケージ形成を示し、一方で会合効率は、緩衝液のイオン強度を増加させることによってさらに増強した（図１５ｂ）。会合したケージの単離後、それらを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にて、ＳｐｙＴａｇを備えたＧＦＰ（ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰ）の変化に富んだ濃度と混合した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図１６ａ）およびネイティブＰＡＧＥ（図１６ｂ）を使用した分析によって判断される、イソペプチド形成ならびに宿主－ゲスト結び付きがすべての変種に関して観察され、ゲスト・パッケージングの成功を示した。しかしながら、ＳＥＣおよびＴＥＭを使用した、３０ｎｇ／ｍＬテトラサイクリンから獲得されたＳｐｙＣ－ＴＲＡＰケージ・サンプルのさらなる分析は、空のＴＲＡＰケージと比較して溶出時間のわずかなシフト、およびケージ会合体の外部での何らかの物体を示し、ゲストＧＦＰが、ケージから部分的に漏出され得ることを示唆した（図１７）。その一方で、そのような漏出は、ＴＲＡＰ－ループＳｐｙＣケージに関して観察されなかった。単離された充填されたケージのＵＶ－Ｖｉｓ吸光度は、これらのＴＲＡＰケージが、最高約２８個のＧＦＰ分子を担持し得、一方でパッケージング密度は、細菌産生におけるテトラサイクリン濃度またはカプセル化過程における混合比のいずれかを変化させることによって制御され得ることを明らかにした。ＴＲＡＰ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合体とは対照的に、ストラテジー１は、ＳｐｙＴ－ＴＲＡＰ変種が凝集傾向を示し、ゆえに効率的なＡｕ（Ｉ）媒介性ケージ形成が観察されなかったことから困難であることが見出された（図１７ｃ）。すべてを合わせると、ＴＲＡＰ－ループＳｐｙＣ変種が、ゲスト・パッケージングのための最も堅牢でかつ効率的な変種であると結論付けられ得る。

この方式で実証された第２のゲストは、ＳｐｙＴａｇ付けされたネオロイキン－２／１５であり（参照により本明細書によって組み入れられる、ＳｉｌｖａＤＡら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１９、５６５、１８６～１９１）、それも、内腔にＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを所有するＴＲＡＰケージ内に担持されることに成功した。光開口性ＴＲＡＰは、２種の変異Ｋ３５ＣおよびＲ６４Ｓを含有しかつＣ末端の２個のリジン残基ｄ７３Ｋおよびｄ７４Ｋを欠く変種と、ＴＲＡＰ－ループＳｐｙＣとから構成され、ＴＲＡＰ環は、光切断性架橋剤１，２－ビスブロモメチル－３－ニトロベンゼン（ＢＢＮ）を用いて互いに接続された（図１８）。ＧＦＰの場合と同様に、ＳｐｙＴａｇ付けされたＮＬ－２をＴＲＡＰケージと混合し、充填されたケージをサイズ排除クロマトグラフィーによって単離した（図１９ａ）。ネガティブ染色ＴＥＭおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用した後続の分析は、ＮＬ－２タンパク質が、イソペプチド結合形成を介してＴＲＡＰ内にパッケージされることに成功したことを明らかにした（図１９ｂ）。

ＨＥＫ－ＢｌｕｅＩＬ－２細胞アッセイを使用して、ＴＲＡＰケージ内にカプセル化されたＳｐｙＴａｇ－ＮＬ－２の特性を査定した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅとは、そのシグナル伝達経路と合わせたヒトＩＬ－２受容体と、付加的な分泌型胚性アルカリ・ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子とを安定して共発現するように操作されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のタイプである。ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）へのＩＬ－２またはＮＬ－２の結合は、転写活性化およびＳＥＡＰの分泌をもたらすシグナル伝達カスケードの開始につながり、比色法によるそのモニタリングを可能にする。

ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞を９６ウェル・プレートに播種した。翌日、ＮＬ－２／１５をカプセル化されたおよび空のＵＶ－光切断性ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＴＲＡＰケージ・サンプルに、１０ｍＭシステイン（クエンチャー）を添加し、ＵＶ光で１０分間処理した。処理サンプルおよび対照を、ｐＭ域の様々な濃度まで細胞培地（ＤＭＥＭ）に希釈した。対照サンプルは、ＵＶ処理前および後の、非コンジュゲートＳｐｙＴａｇ－ＮＬ－２および購入されたヒトＩＬ－２、ＴＲＡＰ環とコンジュゲートしたＳｐｙＴａｇ－ＮＬ－２、および空のＴＲＡＰケージを含んだ。細胞を２４時間刺激し、それに続いて、分泌型ＳＥＡＰの量を査定することを可能にするＱｕａｎｔｉＢｌｕｅアッセイを実施した。

ＳｐｙＴａｇ－ＮＬ－２、ｈＩＬ－２、およびＴＲＡＰ－ＮＬ－２対照サンプルで処理されたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞は、刺激後に非常に同様のレベルの産生されたＳＥＡＰを示し、それは、ＩＬ－２Ｒ結合が、ＴＲＡＰ環へのＮＬ－２／１５のコンジュゲーション、およびＳｐｙＴａｇでのその修飾によって影響を受けないことを示唆する（図２０ａ）。空のＴＲＡＰケージを用いた細胞の処理は、サンプルのＵＶ照射前または後にいかなるシグナル変換ももたらさなかった（図２０ｂ）。

ＳＥＡＰの産生は、ＵＶ照射後の、ＮＬ－２を充填されたＴＲＡＰケージを用いた処理後に目立った（図２０ｂ）。ＵＶ光処理なしのサンプルも、ＩＬ－２Ｒを通じてしかしはるかにより低いレベルでシグナル変換の能力があった。

タンパク質産生：
ＴＲＡＰ－Ｋ３５Ｃ（または、ＮＬ－２カプセル化（ｅｎｃｐｓｕｌａｔｉｏｎ）に関しては、ＴＲＡＰ－Ｋ３５Ｃ、Ｒ６４Ｓ、ｄ７３Ｋ、ｄ７４Ｋ）とともに、ＳＵＭＯの下流または残基４７と４８との間のいずれかに、Ｋ３５Ｃ変異、Ｎ末端Ｈｉｓ６－ＳＵＭＯ、およびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを含有するＴＲＡＰ変種から構成されるパッチワーク構造を、ｍＣｈｅｒｒｙ融合に関するものと本質的に同じプロトコールを使用して産生した。テトラサイクリン（１０または３０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＴＰＧ（０．２ｍＭ）を、タンパク質発現の誘導に使用した。超音波処理による細胞溶解の後、融合タンパク質を、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティー・クロマトグラフィーを使用して可溶性画分から精製した。次いで、Ｈｉｓ６－ＳＵＭＯ単位を、ＳＵＭＯプロテアーゼ１（総タンパク質についての２５単位／ｍｇ）を用いた４℃で一晩の処理によって全長融合体から切断し、その後に、未反応種およびｈｉｓタグ付けされたプロテアーゼを除去するためにＮｉ－ＮＴＡアガロース樹脂を用いた処理が続いた。所望のパッチワーク会合体をサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。タンパク質の忠実度ならびに１１ｍｅｒのＴＲＡＰ環あたりのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの数を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析におけるバンド強度比を使用して推定した。

Ｈ－ＳｐｙＴ－ＧＦＰまたはＨ－ＳｐｙＴ－ＮＬ－２と称される、Ｎ末端Ｈｉｓ６、ならびにＳｐｙＴａｇ付けされたＧＦＰおよびネオロイキン－２／１５を、Ｔ７プロモーターおよびｌａｃオペロン・システムの制御下に、ＣｏｌＥ複製の起点、カナマイシン耐性遺伝子、ｌａｃリプレッサー、およびＨ－ＳｐｙＴ－ＧＦＰまたはＨ－ＳｐｙＴ－ＮＬ－２を有するｐＥＴ２８ベースのプラスミドであるｐＥＴ２８＿Ｈ－ＳｐｙＴ－ＧＦＰまたはｐＥＴ２８＿Ｈ－ＳｐｙＴ－ＮＬ－２で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）系統を使用して産生した。タンパク質を、０．２ｍＭＩＰＴＧを使用して２５℃で２０時間発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティー・クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製した。

ケージ会合および特徴付け：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを含有するパッチワークＴＲＡＰ環（ＴＲＡＰ単量体について４００μＭ）を、６００ｍＭＮａＣｌ（ＴＲＡＰ－Ｋ３５Ｃ、Ｒ６４Ｓ、ｄ７３Ｋ、ｄ７４Ｋを含有するものに関しては２ＭＮａＣｌ）を含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中ＴＰＰＭＳ－Ａｕ（Ｉ）－Ｃｌ（２００μＭ）と混合し、室温で一晩保った。会合したケージを、次いでサイズ排除クロマトグラフィーを使用して単離した。光開口性ケージに関しては、Ａｕ（Ｉ）媒介性ケージ（ＴＲＡＰ単量体について２００μＭ）に、ＤＭＦ（最終５％）中１，２－ブロモメチル－３－ニトロベンゼン（３００μＭ、３当量（ｅｕｉｖ．））を添加し、室温で１時間撹拌した。次いで、β－メルカプトエタノール（４μＬ）を反応に添加し、室温で３０分間さらに撹拌して、未反応のベンジルブロミドをクエンチし、Ａｕ（Ｉ）を除去した。これらの小分子反応物を、Ａｍｉｃｏｎｕｌｔｒａ－４遠心式ユニット（３０，０００分子量カットオフ）を使用した限外濾過によって除去し、結果として生じたケージを、さらなる精製なしでカプセル化に使用した。ケージあたりのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの数を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析におけるバンド強度比を使用して推定した。単離されたケージの形態学を、上で記載されるプロトコールを用いてネガティブ染色ＴＥＭを使用して調べた。

ゲスト担持（小規模）：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを含有するパッチワークＴＲＡＰ環（２０μＭ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒについて）を、ＰＢＳ中Ｈ－ＳｐｙＴ－ＧＦＰ（０～２０μＭ）と混合し、室温で一晩保った。その後、反応混合物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびネイティブＰＡＧＥによって分析した。ネイティブＰＡＧＥ分析に関しては、バンドを、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ染色、ならびにＢｉｏｒａｄＣｈｅｍｉＤｏｃＭＰ撮像装置での青色光励起および発光フィルター（５３０／２８ｎｍ）を使用した蛍光の両方を使用して可視化した。

ゲスト担持（大規模）：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを含有するパッチワークＴＲＡＰ環（２０μＭ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒについて）を、ＰＢＳ中Ｈ－ＳｐｙＴ－ＧＦＰ（２０μＭ）またはＨ－ＳｐｙＴ－ＮＬ－２（４０μＭ）と混合し、室温で一晩保った。次いで、ケージを、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって単離し、その後にＴＥＭおよび分光分析が続いた。ＴＥＭイメージングを、上で記載されるように実施した。ケージあたりのゲストの数を、減衰係数：ε_{ＧＦＰ４８８}＝５２，７００Ｍ^－１ｃｍ^－１、ε_{ＧＦＰ２８０}＝２６，８５０Ｍ^－１ｃｍ^－１、ε_{ＴＲＡＰ２８０}＝８２５０Ｍ^－１ｃｍ^－１を使用して、ＵＶ－１９００ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（島津製作所）で測定された吸光度によって推定した（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ．ｈｔｍｌ）。

ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ－ＩＬ－２レポーター細胞アッセイ
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ－ＩＬ－２細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン、および５０ｕｇ／ｍＬノルモシン（Ｎｏｒｍｏｃｉｎ）を有するＤＭＥＭ－高グルコース培地中で培養した。継代２の後、細胞に、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＣＬＲＳｅｌｅｃｔｉｏｎおよびピューロマイシンも補給して、細胞における持続的な導入遺伝子発現を保証した。播種の前に、ＣＬＲｓｅｌｅｃｔｉｏｎ培地を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、および５０ｕｇ／ｍＬノルモシンを有するＤＭＥＭ－高グルコース培地に交換した。細胞を、培養瓶（ＶＷＲ）の表面から細流（ｓｔｒｅａｍ）によって引き離し、７０×ｇで８分間遠心分離し、ノルモシン添加なしの２ｍｌの新たな培地に再懸濁した。それらの数を査定するために、１０μｌの細胞懸濁液を計数プレート（ＢｉｏＲａｄ）に移し、ＴＣ２０全自動セルカウンター（ＢｉｏＲａｄ）に置いた。細胞を、１×１０^４個の密度で１８０ｕｌ培養培地中にて９６ウェル培養プレート（ＶＷＲ）に播種し、３７℃および５％ＣＯ_２において２時間インキュベートした。

試験されたタンパク質を、１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ－高グルコース中の１０×ストック希釈物として調製した。翌日、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ－ＩＬ－２細胞を、様々な濃度の２０μｌのタンパク質の添加によって刺激し、３７℃および５％ＣＯ_２において２４時間インキュベートした。Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液を、滅菌Ｈ_２Ｏ中でのＱＢ－ｂｕｆｆｅｒおよびＱＢ－Ｒｅａｇｅｎｔの１００×希釈によって調製し、光から保護して１０分間穏やかに振とうしながらインキュベートした。１８０ｕｌのＱｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液を、新たな９６ウェル・プレートの各ウェルに移し、２０μｌのＨＥＫ－Ｂｌｕｅ－ＩＬ－２細胞上清を添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。分泌型胚性アルカリ・ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性を、６３０ｎｍにおける吸光度測定によって査定した。

参考文献
1 Malay、A. D. et al. An ultra-stable gold-coordinated protein cage displaying reversible assembly. Nature 569、438-442 (2019).
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3 Edwardson、T. G.、Mori、T. & Hilvert、D. Rational Engineering of a Designed Protein Cage for siRNA Delivery. J. Am. Chem. Soc. (2018).
4 Azuma、Y.、Zschoche、R.、Tinzl、M. & Hilvert、D. Quantitative packaging of active enzymes into a protein cage. Angew. Chem. Int. Ed. 55、1531-1534 (2016).
5 Dashti、N. H.、Abidin、R. S. & Sainsbury、F. Programmable in vitro coencapsidation of guest proteins for intracellular delivery by virus-like particles. ACS nano 12、4615-4623 (2018).
6 Woersdoerfer、B.、Pianowski、Z. & Hilvert、D. Efficient in vitro encapsulation of protein cargo by an engineered protein container. Journal of the American Chemical Society 134、909-911 (2012).
7 Ho、A.、Schwarze、S. R.、Mermelstein、S. J.、Waksman、G. & Dowdy、S. F. Synthetic protein transduction domains: enhanced transduction potential in vitro and in vivo. Cancer research 61、474-477 (2001).
8 Berry、C. C. Intracellular delivery of nanoparticles via the HIV-1 tat protein. Nanomedicine 3、357 - 365 (2008).
9 Rampersad、S. N. Multiple applications of Alamar Blue as an indicator of metabolic function and cellular health in cell viability bioassays. Sensors 12、12347-12360 (2012).

Claims

選択された数のＴＲＡＰ環およびその中にカプセル化された少なくとも１種のゲストカーゴを含む、人工ＴＲＡＰケージ。
ゲストカーゴは、タンパク質、酵素、抗原、抗体、タンパク質高分子、脂質、ペプチド、核酸、小分子カーゴ、ペプチド核酸、炭素ベースの構造、金属、毒素、またはナノ粒子を含む群から選択される、請求項１に記載のケージ。
核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡを含む群から選択される、請求項２に記載のケージ。
酵素は、代謝障害もしくは疾患における過剰発現、または代謝障害もしくは疾患における過少発現と関連した酵素である、請求項２に記載のケージ。
酵素は、ヒドロゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、リパーゼ、リアーゼ、リガーゼ、プロテアーゼ、トランスフェラーゼ、レダクターゼ、リコンビナーゼ、およびヌクレアーゼ酸修飾酵素を含む群から選択される、請求項４に記載のケージ。
治療剤は、がん治療薬、抗感染症治療薬、血管疾患治療薬、免疫治療薬、セノリティック、および神経学的治療薬を含む群から選択される、請求項２に記載のケージ。
金属は、鉄、亜鉛、白金、銅、ナトリウム、カドミウム、ランタニド、ガドリニウム、テクネチウム、カルシウム、カリウム、クロム、マグネシウム、モリブデン、およびその塩または複合体を含む群から選択される、請求項２に記載のケージ。
毒素は、リガンド標的毒素、プロテアーゼ活性化毒素、メリチン、および毒素ベースの自殺遺伝子治療薬を含む群から選択される、請求項２に記載のケージ。
ゲストカーゴはタンパク質であり、好ましくは、タンパク質は、蛍光タンパク質、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、またはネオロイキン－２／１５（ＮＬ－２）である、請求項１から８のいずれか一項に記載のケージ。
ケージは複数のゲストカーゴを含み、ゲストカーゴは互いに同じでありまたは異なり、請求項２から９に記載のケージの任意の組み合わせである、請求項１から９のいずれか一項に記載のケージ。
少なくとも１種の外的装飾をさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のケージ。
外的装飾の少なくとも１種は、内的ゲストカーゴを含有するケージの細胞内送達を促進する細胞透過剤を含む、請求項１１に記載のケージ。
細胞透過剤はＰＴＤ４である、請求項１２に記載のケージ。
ＴＲＡＰケージにおけるＴＲＡＰ環の数は６～６０個である、請求項１から１３のいずれか一項に記載のケージ。
ＴＲＡＰケージにおけるＴＲＡＰ環の数は、１２、２０、または２４個、好ましくは２４個である、請求項１４に記載のケージ。
ＴＲＡＰケージ内腔の内面は極度に帯電しており、ＴＲＡＰケージタンパク質は、Ｅ４８ＱまたはＥ４８Ｋ変異を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のケージ。
人工ＴＲＡＰケージタンパク質は、Ｋ３５Ｃ、Ｋ３５Ｈ、Ｒ６４Ｓ、Ｅ４８Ｑ、Ｅ４８Ｋ、Ｋ３５Ｃ／Ｒ６４Ｓ、Ｋ３５Ｈ／Ｒ６４Ｓ、Ｓ３３Ｃ、Ｓ３３Ｈ、Ｓ３３Ｃ／Ｒ６４Ｓ、Ｓ３３Ｈ／Ｒ６４Ｓ、Ｓ３３Ｃ／Ｋ３５Ｈ、Ｓ３３Ｈ／Ｋ３５Ｈ、Ｓ３３Ｃ／Ｋ３５Ｃ、Ｓ３３Ｈ／Ｋ３５Ｃ、Ｋ３５Ｃ／Ｅ４８Ｑ、Ｋ３５Ｃ／Ｅ４８Ｋ、Ｋ３５Ｈ／Ｅ４８Ｑ、Ｋ３５Ｈ／Ｅ４８Ｋ、Ｓ３３Ｃ／Ｅ４８Ｑ、Ｓ３３Ｃ／Ｅ４８Ｋ、Ｓ３３Ｃ／Ｅ４８Ｑ、およびＳ３３Ｃ／Ｅ４８Ｋを含む群から選択される変異のいずれか１つまたは複数を含むように改変されている、請求項１から１６のいずれか一項に記載のケージ。
ケージの開口はプログラム可能である、請求項１から１７のいずれか一項に記載のＴＲＡＰケージ。
ケージのプログラム可能な開口は、ＴＲＡＰケージにおいてＴＲＡＰ環を適所に保つ分子または原子架橋剤の選択に依存している、請求項１８に記載のＴＲＡＰケージ。
架橋剤は、（ｉ）還元応答性／感受性リンカー、それによって、ケージは還元条件下で開く；または（ｉｉ）光活性化可能なリンカー、それによって、ケージは光に曝露されると開く、のいずれかである、請求項１９に記載のＴＲＡＰケージ。
その内的ゲストカーゴの細胞内送達のための送達ビヒクルとしての、請求項１から２０のいずれか一項に記載の人工ＴＲＡＰケージの使用。
ワクチンとしての、請求項１から２０のいずれか一項に記載の人工ＴＲＡＰケージの使用。
がん、血管疾患、心血管疾患、糖尿病、感染症、自己免疫病状、神経変性疾患、細胞老化疾患、関節炎、および呼吸器疾患を含む群から選択される病気または病態の治療のための、請求項１から２０のいずれか一項に記載の人工ＴＲＡＰケージの使用。
（ｉ）適切な発現システムにおけるＴＲＡＰ環単位の発現、および発現システムからの前記単位の精製によってＴＲＡＰ環単位を獲得する工程；
（ｉｉ）架橋剤との少なくとも１つの遊離チオール連結を介したＴＲＡＰ環単位のコンジュゲーション；
（ｉｉｉ）ゲストカーゴを捕捉するための適切な内面環境を提供するための、ＴＲＡＰ環単位の修飾；
（ｉｖ）ゲストカーゴがカプセル化されるケージ内腔を提供するための、自己会合によるＴＲＡＰケージの形成；ならびに
（ｖ）ゲストカーゴをカプセル化したＴＲＡＰケージの精製および単離
を含む、カプセル化されたゲストカーゴを有する人工ＴＲＡＰケージを作製する方法。
工程（ｉｉｉ）の修飾は、
（ｉ）ＴＲＡＰケージ内腔の内面を極度に帯電させる工程；
（ｉｉ）ＴＲＡＰケージ内腔の内面へのゲストカーゴの遺伝学的融合；
（ｉｉｉ）ＴＲＡＰケージ内腔の内面へのゲストカーゴのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇコンジュゲーション；ならびに
（ｉｖ）化学的および酵素的方法の両方における共有結合形成を介したもの
を含む群から選択される、請求項２４に記載の方法。
工程（ｉｉ）は、まず、少なくとも１種の金属架橋剤、好ましくは原子金属架橋剤を介したＴＲＡＰ環単位のコンジュゲーションを含み、次いで、金属架橋剤を分子架橋剤で置き換える工程を含む、請求項２４または２５に記載の方法。
内面の工程（ｉ）の極度に帯電させる工程は、ケージ内腔の内面での正味の正または正味の負電荷のいずれかを提供する、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の方法。
人工ＴＲＡＰケージタンパク質は、Ｋ３５Ｃ、Ｋ３５Ｈ、Ｒ６４Ｓ、Ｅ４８Ｑ、Ｅ４８Ｋ、Ｋ３５Ｃ／Ｒ６４Ｓ、Ｋ３５Ｈ／Ｒ６４Ｓ、Ｓ３３Ｃ、Ｓ３３Ｈ、Ｓ３３Ｃ／Ｒ６４Ｓ、Ｓ３３Ｈ／Ｒ６４Ｓ、Ｓ３３Ｃ／Ｋ３５Ｈ、Ｓ３３Ｈ／Ｋ３５Ｈ、Ｓ３３Ｃ／Ｋ３５Ｃ、Ｓ３３Ｈ／Ｋ３５Ｃ、Ｋ３５Ｃ／Ｅ４８Ｑ、Ｋ３５Ｃ／Ｅ４８Ｋ、Ｋ３５Ｈ／Ｅ４８Ｑ、Ｋ３５Ｈ／Ｅ４８Ｋ、Ｓ３３Ｃ／Ｅ４８Ｑ、Ｓ３３Ｃ／Ｅ４８Ｋ、Ｓ３３Ｃ／Ｅ４８Ｑ、およびＳ３３Ｃ／Ｅ４８Ｋを含む群から選択される変異のいずれか１つまたは複数を含むように改変される、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の方法。
ＴＲＡＰ^{Ｋ３５ＣＥ４８Ｑ}に対するパート（ｉｉｉ）のケージ形成工程は、ｐＨ９～１１で炭酸水素ナトリウム緩衝液中にて実施される、請求項２８に記載の方法。
ＴＲＡＰ^{Ｋ３５ＣＥ４８ｋ}に対するパート（ｉｉｉ）のケージ形成工程は、ｐＨ１０～１０．５で炭酸水素ナトリウム緩衝液中にて実施される、請求項２８に記載の方法。
ゲストカーゴは、ＴＲＡＰケージの会合前または後のいずれかに担持され得る、請求項２４から３０のいずれか一項に記載の方法。
工程（ｉｉ）のＴＲＡＰケージ内腔の内面へのゲストカーゴの遺伝学的融合は、内腔の内面に面するＴＲＡＰ^Ｋ３５ＣのＮ末端へのゲストカーゴのＮ末端融合を介したものである、請求項２４から３１のいずれか一項に記載の方法。
工程（ｉｉｉ）のＴＲＡＰケージ内腔の内面へのゲストカーゴのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇコンジュゲーションにおいて、ＴＲＡＰケージに会合した場合に内部に面する残基４７と４８との間のＴＲＡＰ環のループ領域にＳｐｙＣａｔｃｈｅｒが導入され、ゲストカーゴがＳｐｙＴａｇを含有する、請求項３２に記載の方法。
酵素的修飾は、ソルターゼ、アスパラギニル・エンドプロテアーゼ、トリプシン関連酵素、およびサブチリシン由来変種を含む群から選択されるペプチド・リガーゼを介したものであり、共有結合性の化学結合形成は、ひずみ促進型アルキン－アジド環化付加および疑似ペプチド結合を含み得る、請求項２４から３３のいずれか一項に記載の方法。
請求項２４から３４のいずれか一項に記載の方法によって産生された、ＴＲＡＰケージ。
医薬としての、請求項１から２０のいずれか一項に記載のケージの使用。
患者に、請求項１から２０のいずれか一項に記載のケージを投与する工程を含む、患者を治療する方法。
患者における疾患を治療することにおけるまたはワクチンとしての使用のための、請求項１から２０のいずれか一項に記載のケージ。
Ｋ３５Ｃ、Ｋ３５Ｈ、Ｒ６４Ｓ、Ｅ４８Ｑ、Ｅ４８Ｋ、Ｋ３５Ｃ／Ｒ６４Ｓ、Ｋ３５Ｈ／Ｒ６４Ｓ、Ｓ３３Ｃ、Ｓ３３Ｈ、Ｓ３３Ｃ／Ｒ６４Ｓ、Ｓ３３Ｈ／Ｒ６４Ｓ、Ｓ３３Ｃ／Ｋ３５Ｈ、Ｓ３３Ｈ／Ｋ３５Ｈ、Ｓ３３Ｃ／Ｋ３５Ｃ、Ｓ３３Ｈ／Ｋ３５Ｃ、Ｋ３５Ｃ／Ｅ４８Ｑ、Ｋ３５Ｃ／Ｅ４８Ｋ、Ｋ３５Ｈ／Ｅ４８Ｑ、Ｋ３５Ｈ／Ｅ４８Ｋ、Ｓ３３Ｃ／Ｅ４８Ｑ、Ｓ３３Ｃ／Ｅ４８Ｋ、Ｓ３３Ｃ／Ｅ４８Ｑ、およびＳ３３Ｃ／Ｅ４８Ｋを含む群から選択される変異のいずれか１つまたは複数を含むように改変された、人工ＴＲＡＰケージタンパク質。
核酸、酵素、治療剤、小分子、有機または無機ナノ粒子、ペプチド、金属、抗原、抗体、および毒素、ならびに治療的価値があるすべての前述のもののその断片を含む群から選択される１種または複数の内的ゲストカーゴを持つ人工ＴＲＡＰケージの治療有効量を投与する工程を含む、がん、血管疾患、心血管疾患、糖尿病、感染症、自己免疫病状、神経変性疾患および神経疾患、細胞老化疾患、関節炎、ならびに呼吸器疾患を含む群から選択される病状に罹患した、療法を必要とする個体の治療の方法。
核酸、酵素、治療剤、小分子、有機または無機ナノ粒子、ペプチド、金属、抗原、抗体、および毒素、ならびに治療的価値があるすべての前述のもののその断片を含む群から選択される１種または複数の内的ゲストカーゴを持つ人工ＴＲＡＰケージの治療有効量を投与する工程を含む、がん、血管疾患、心血管疾患、糖尿病、感染症、自己免疫病状、神経変性疾患および神経疾患、細胞老化疾患、関節炎、ならびに呼吸器疾患を含む群から選択される病状により、ワクチン接種を必要とする個体にワクチン接種する方法。
ＴＲＡＰケージ治療薬は、鼻腔内吸入または注射を介して投与される、請求項４０または４１に記載の方法。