KR20190057354A

KR20190057354A - 화합물 또는 그 염, 항염증제, 폐암에 대한 항암제, 화합물 또는 그 염의 제조 방법, 염증성 질환의 치료 방법 및 폐암의 치료 방법

Info

Publication number: KR20190057354A
Application number: KR1020197011657A
Authority: KR
Inventors: 노부히로 도다; 야스히로 히다카; 아키요시 하야시; 다카시 니시자와; 신이치로 나카무라; 오사무 가니에; 요시키 야마구치
Original assignee: 티에프케이 가부시키가이샤
Priority date: 2016-09-23
Filing date: 2017-09-13
Publication date: 2019-05-28
Also published as: CA3038021A1; EP3511419A1; JPWO2018056150A1; CN110121560A; AU2017331889A1; US20190177440A1; WO2018056150A1; JP6656677B2; EP3511419A4

Abstract

항염증제 및 폐암에 대한 항암제 등으로서 사용 가능하며, 안전성이 우수한 새로운 화합물을 제공한다. 본 발명의 화합물 또는 그 염은, 식 (A) 또는 식 (B)로 표시되는 화합물 또는 그 염인 것을 특징으로 한다.

식 (A) 및 식 (B)에서, X¹은 헥소스 또는 수산기이며, X²는 인산기 또는 수산기이다.

Description

화합물 또는 그 염, 항염증제, 폐암에 대한 항암제, 화합물 또는 그 염의 제조 방법, 염증성 질환의 치료 방법 및 폐암의 치료 방법

본 발명은, 화합물 또는 그 염, 항염증제, 폐암에 대한 항암제, 화합물 또는 그 염의 제조 방법, 염증성 질환의 치료 방법 및 폐암의 치료 방법에 관한 것이다.

항염증제 및 폐암에 대한 항암제로서 여러가지 것이 제안되어 있다(예컨대 비특허문헌 1 및 2 참조).

비특허문헌 1 : 와다 코이치로, 카미사키 요시노리 저, 「PPARγ 아고니스트의 항염증 작용 -기초ㆍ임상 연구의 최신 동향-」, 일본 임상, 2010년, 제68권 제2호, p.278-283 비특허문헌 2 : Vincent T. DeVita, Jr. and Edward Chu, "A History of Cancer Chemotherapy", Cancer Res, November 1, 2008, Vol.68, issue.21, p.8643-8653

그러나, 항염증제 및 폐암에 대한 항암제 등으로서 사용 가능하며, 안전성이 우수한 새로운 화합물 및 그 제조 방법이 요구되고 있다.

따라서, 본 발명은, 항염증제 및 폐암에 대한 항암제 등으로서 사용 가능하며, 안전성이 우수한 새로운 화합물 및 그 제조 방법의 제공을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 화합물 또는 그 염은, 식 (A) 또는 식 (B)로 표시되는 화합물 또는 그 염인 것을 특징으로 한다.

식 (A) 및 식 (B)에서,

X¹은 헥소스 또는 수산기이며,

X²는 인산기 또는 수산기이다.

본 발명의 화합물 또는 그 염의 제조 방법은, 로도박터 아조토포르만스(Rhodobacter azotoformans) BP0899주(수탁번호 NITE BP-644) 및 그 배양물 중 적어도 하나로부터, 식 (A) 또는 식 (B)로 표시되는 화합물 또는 그 염을 포함하는 조추출액을 추출하는 조추출 공정과,

상기 조추출액으로부터 식 (A) 또는 식 (B)로 표시되는 화합물 또는 그 염을 단리하는 정제 공정

을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 일련의 연구를 거듭한 결과, 로도박터 아조토포르만스(Rhodobacter azotoformans) BP0899주(수탁번호 NITE BP-644) 또는 그 배양물로부터 얻어지는 식 (A) 또는 식 (B)로 표시되는 화합물 또는 그 염이, 항염증 효과 및 폐암에 대한 항암 효과를 갖는 것을 발견하여 본 발명에 도달했다. 식 (A) 또는 식 (B)로 표시되는 화합물 또는 그 염은, 안전성이 높고, 장기간에 걸쳐 투여 가능하다.

도 1은, 본 발명의 제조 방법에서의 조추출 공정의 일례를 나타내는 플로우차트이다.
도 2는, 본 발명의 제조 방법에서의 정제 공정의 일례를 나타내는 플로우차트이다.
도 3은, 실시예 3에서의 피험액의 IL-8 농도를 나타내는 그래프이다.
도 4는, 실시예 4에서의 피험액의 흡광도를 나타내는 그래프이다.
도 5는, 실시예 5에서의 피험액의 흡광도를 나타내는 그래프이다.
도 6은, 실시예 6에서의 피험액의 TNF-α 농도를 나타내는 그래프이다.
도 7은, 실시예 7에서의 피험액의 TNF-α 농도를 나타내는 그래프이다.
도 8은, 실시예 8-1에서의 피험액의 IL-6 농도를 나타내는 그래프이다.
도 9는, 실시예 9에서의 마우스의 종양 체적을 나타내는 그래프이다.
도 10은, 실시예 2에서, 메틸에스테르화 처리물을 GC-MS 분석에 제공했을 때의 매스 스펙트럼이다.
도 11은, 실시예 2에서, 가수분해 메틸에스테르화 처리물을 GC-MS 분석에 제공했을 때의 매스 스펙트럼이다.
도 12는, 실시예 2에서, 피롤리디드화 처리물을 GC-MS 분석에 제공했을 때의 매스 스펙트럼이다.
도 13은, 실시예 2에서, 가수분해 피롤리디드화 처리물을 GC-MS 분석에 제공했을 때의 매스 스펙트럼이다.
도 14는, 실시예 2에서, 도 12에서의 피크 4의 화합물을 GC-MS 분석에 제공했을 때의 매스 스펙트럼이다.
도 15는, 실시예 2에서, 도 13에서의 피크 D의 화합물을 GC-MS 분석에 제공했을 때의 매스 스펙트럼이다.
도 16a는, 실시예 2에서, 시료 용액을 ¹HNMR 측정에 제공했을 때의 스펙트럼의 일부이다.
도 16b는, 실시예 2에서, 시료 용액을 ¹HNMR 측정에 제공했을 때의 스펙트럼의 일부이다.
도 16c는, 실시예 2에서, 시료 용액을 ¹HNMR 측정에 제공했을 때의 스펙트럼의 일부이다.
도 16d는, 실시예 2에서, 시료 용액을 ¹HNMR 측정에 제공했을 때의 스펙트럼의 일부이다.
도 17a는, 실시예 2에서, 시료 용액을 ¹³CNMR 측정에 제공했을 때의 스펙트럼의 일부이다.
도 17b는, 실시예 2에서, 시료 용액을 ¹³CNMR 측정에 제공했을 때의 스펙트럼의 일부이다.
도 17c는, 실시예 2에서, 시료 용액을 ¹³CNMR 측정에 제공했을 때의 스펙트럼의 일부이다.
도 17d는, 실시예 2에서, 시료 용액을 ¹³CNMR 측정에 제공했을 때의 스펙트럼의 일부이다.
도 18은, 실시예 2에서, 시료 용액을 ³¹PNMR 측정에 제공했을 때의 스펙트럼이다.
도 19는, 실시예 2에서, 시료 용액을 GC-MS 분석에 제공했을 때의 매스 스펙트럼이다.
도 20은, 실시예 2에서, 도 19에서의 m/z=1417.93의 피크의 화합물을 GC-MS/MS 분석에 제공했을 때의 매스 스펙트럼이다.
도 21은, 시료 용액을 GC-MS 분석에 제공했을 때의 매스 스펙트럼이다.
도 22는, 실시예 2에서, 도 21에서의 m/z=538.15의 피크의 화합물을 GC-MS/MS 분석에 제공했을 때의 매스 스펙트럼이다.
도 23은, 실시예 2에서, 도 22에서의 m/z=474.27의 피크의 화합물을 GC-MS/MS/MS 분석에 제공했을 때의 매스 스펙트럼이다.
도 24는, 실시예 2에서, 도 22에서의 m/z=601.17의 피크의 화합물을 GC-MS/MS/MS 분석에 제공했을 때의 매스 스펙트럼이다.
도 25는, 실시예 2에서, 도 24에서의 m/z=557.19의 피크의 화합물을 GC-MS/MS/MS/MS 분석에 제공했을 때의 매스 스펙트럼이다.
도 26은, 실시예 2에서, 도 24에서의 m/z=645.12의 피크의 화합물을 GC-MS/MS/MS/MS 분석에 제공했을 때의 매스 스펙트럼이다.
도 27은, 실시예 8-2에서, PPARγ 유전자의 발현량을 나타내는 그래프이다.
도 28은, 실시예 2에서, 히드라진 분해물의 4 mol/L의 KOH 처리로 유리한 당쇄 부분의 겔 여과 패턴을 나타내는 그래프이다.
도 29는, 실시예 2에서, 시료 A를 ¹HNMR 측정에 제공했을 때의 스펙트럼이다.
도 30은, 실시예 2에서, 시료 A를 2D DQF-COSY 측정에 제공했을 때의 스펙트럼이다.
도 31은, 실시예 2에서, 시료 A를 2D NOESY 측정에 제공했을 때의 스펙트럼이다.
도 32는, 실시예 2에서, 시료 A를 2D ¹H-³¹P HMBC 측정에 제공했을 때의 스펙트럼이다.
도 33은, 실시예 2에서의 시료 A의 모식도이다.

본 발명의 제조 방법에서, 상기 조추출 공정에서의 상기 추출 처리가, 단백질을 불용화하는 유기 용매에 의한 추출 처리이어도 좋다. 이 경우에 있어서, 상기 추출 용매는 페놀이어도 좋다.

본 발명의 제조 방법에서는, 상기 조추출 공정에서, 상기 추출 처리 전에, 상기 로도박터 아조토포르만스(Rhodobacter azotoformans) BP0899주(수탁번호 NITE BP-644) 및 그 배양물 중 적어도 하나에 대해, 색소의 탈색 처리를 행해도 좋다. 이 경우에 있어서, 상기 색소의 탈색 처리는, 아세톤, 메탄올 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나에 의한 탈색 처리이어도 좋다.

본 발명의 제조 방법에서는, 상기 조추출 공정에서, 상기 조추출액에 대해 여과 처리를 행해도 좋다.

본 발명의 제조 방법에서는, 상기 정제 공정에서, 상기 조추출액에 대해, 효소 처리와, 단백질을 불용화하는 유기 용매에 의한 추출 처리를 행해도 좋다. 이 경우에 있어서, 상기 효소 처리는, 핵산 분해 효소 및 단백질 분해 효소 중 적어도 하나에 의한 효소 처리이어도 좋고, 상기 유기 용매는 페놀이어도 좋다.

본 발명의 제조 방법에서는, 상기 정제 공정에서, 상기 추출 처리 후의 추출액에 대해 여과 처리를 행해도 좋다.

본 발명에 대해 이하에 상세히 설명한다.

<신규 화합물>

전술한 바와 같이, 본 발명의 화합물 또는 그 염은, 식 (A) 또는 식 (B)로 표시되는 화합물 또는 그 염인 것을 특징으로 한다. 식 (A) 및 식 (B)에서, X¹과 X²의 조합은, 헥소스와 인산기, 수산기와 수산기, 헥소스와 수산기, 수산기와 인산기의 4종류이며, 헥소스와 인산기, 수산기와 수산기의 조합이 바람직하다. X¹이 헥소스인 경우, 예컨대, 그 2 위치의 탄소에서의 수산기의 산소가, X¹의 결합선인 헥소스의 4 위치의 탄소에 결합하고 있다. 본 발명의 화합물 또는 그 염은, 식 (A) 또는 식 (B)에서, X¹ 및 X²가 각각 헥소스 및 인산기이면, 식 (A1) 또는 식 (B1)로 표시되는 화합물 또는 그 염이 되고, 식 (A) 또는 식 (B)에서, X¹ 및 X²가 모두 수산기이면, 식 (A2) 또는 식 (B2)로 표시되는 화합물 또는 그 염이 된다. 본 발명의 화합물 또는 그 염은, 이하, 「본 발명의 신규 화합물」이라고도 한다. 본 발명의 신규 화합물은, 예컨대 후술하는 제조 방법으로 얻을 수 있다. 다만, 후술하는 제조 방법은 예시에 불과하며, 본 발명을 한정하는 것이 아니다.

본 발명의 신규 화합물에서, 헥소스는, 예컨대 글루코스이어도 좋다.

본 발명의 신규 화합물은, 어떠한 용도로 이용해도 좋지만, 예컨대, 후술하는 항염증제, 폐암에 대한 항암제의 재료 등으로서 이용 가능하다. 본 발명의 신규 화합물은, 후술하는 실시예에서 실증되는 바와 같이, NF-κB(Nuclear Factor-kappa B), TNF-α(Tumor Necrosis Factor-α) 및 IL-6(Interleukin-6) 등의 염증성 사이토카인의 생산을 억제하는 기능을 갖는다. 또한, 본 발명의 신규 화합물은, 후술하는 실시예에서 실증되는 바와 같이, Toll 유사 수용체의 일종인 TLR4(Toll-like receptor 4)를 활성화하는 기능도 갖는다. TLR4의 활성화는, 항염증 작용을 갖는 I형 인터페론의 생산을 재촉하는 것이 알려져 있다(Nina Maeshima and Rachel C. Fernandez, "Recognition of lipid A variants by the TLR4-MD-2 receptor complex", Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, February 2013, volume3, Article3, p.2, FIGURE 2). 따라서, 본 발명의 신규 화합물은 항염증 효과를 갖는다. 또한, 본 발명의 신규 화합물은, 후술하는 실시예에서 실증되는 바와 같이, 폐암의 증식을 억제하는 기능도 갖는다.

<항염증제 및 염증성 질환의 치료 방법>

본 발명의 항염증제는, 본 발명의 화합물 또는 그 염(상기 신규 화합물)이 갖는 항염증 효과에 의해 염증을 억제하는 것이며, 본 발명의 신규 화합물을 포함하고 있는 것 외에는 전혀 제한되지 않는다. 본 발명의 항염증제에 의해 염증을 억제할 수 있는 질환으로는, 예컨대, 궤양성 대장염 및 클론병 등의 염증성 장질환, 건선 및 피부염 등의 염증성 피부질환, 뇌염, 간염, 신장염, 폐렴, 기관지염, 맥관염, 수막염, 갑상선염, 당뇨병, 염증성 담즙질환, 염증을 수반하는 암 등을 들 수 있고, 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 항염증제에 의하면, 본 발명의 신규 화합물이 갖는 항염증 효과에 의해, 염증에 수반되는 동통의 진통 효과도 발휘된다.

상기 항염증제의 제형은, 예컨대, 산제, 세립제, 과립제, 정제, 피복 정제, 캡슐제, 트로치제, 액제 등을 들 수 있고, 특별히 제한되지 않는다. 또한, 상기 항염증제의 조성은 특별히 제한되지 않고, 본 발명의 신규 화합물 이외에, 예컨대, 부형제, 결합제, 활택제, 붕괴제, 흡수 촉진제, 유화제, 안정화제, 방부제 등의 각종 첨가제 등을 포함하고 있어도 좋다. 또한, 상기 항염증제는, 통상 이용되는 제제화 기술 등에 의해 제조 가능하다.

본 발명의 염증성 질환의 치료 방법은, 상기 신규 화합물을 포함하는 본 발명의 항염증제를 투여하는 공정을 포함한다. 본 발명에서 「치료」란, 예컨대, 증상을 개선하는(좋게 하는) 것, 증상을 해소(완치)하는 것, 증상의 악화를 방지하는 것, 예방 등이 포함되며, 후술하는 폐암의 치료 방법에 있어서 동일하다. 상기 항염증제를 투여하는 동물종으로는, 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 인간, 또는, 원숭이, 소, 돼지, 개, 고양이 등의 비인간 포유류, 닭 등의 조류, 어패류 등을 들 수 있다. 상기 투여 방법으로는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대 경구 투여 또는 비경구 투여를 들 수 있고, 상기 비경구 투여는, 예컨대 경피 흡수, 주사, 좌약 투여 등을 들 수 있다. 상기 항염증제의 투여량은, 예컨대, 동물종, 연령 등에 따라서 적절하게 설정할 수 있고, 특별히 제한되지 않는다.

<폐암에 대한 항암제 및 폐암의 치료 방법>

본 발명의 폐암에 대한 항암제는, 본 발명의 화합물 또는 그 염(상기 신규 화합물)이 갖는 폐암에 대한 항암 효과에 의해 폐암의 증식을 억제하는 것이며, 본 발명의 신규 화합물을 포함하고 있는 것 외에는 전혀 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 폐암의 치료 방법은, 상기 신규 화합물을 포함하는 본 발명의 폐암에 대한 항암제를 투여하는 공정을 포함한다. 상기 항암제의 제형, 상기 항암제를 투여하는 동물종 및 상기 항암제의 투여 방법은, 상기 항염증제의 제형, 상기 항염증제를 투여하는 동물종 및 상기 항염증제의 투여 방법과 동일하다.

<신규 화합물의 제조 방법>

전술한 바와 같이, 본 발명의 화합물 또는 그 염(상기 신규 화합물)의 제조 방법은, 로도박터 아조토포르만스(Rhodobacter azotoformans) BP0899주(수탁번호 NITE BP-644) 및 그 배양물 중 적어도 하나로부터, 식 (A) 또는 식 (B)로 표시되는 화합물 또는 그 염을 포함하는 조추출액을 추출하는 조추출 공정과,

을 포함하는 것을 특징으로 한다.

〔조추출 공정〕

전술한 바와 같이, 상기 조추출 공정은, 로도박터 아조토포르만스(Rhodobacter azotoformans) BP0899주(수탁번호 NITE BP-644) 및 그 배양물 중 적어도 하나로부터, 식 (A) 또는 식 (B)로 표시되는 화합물 또는 그 염을 포함하는 조추출액을 추출하는 공정이다.

우선, 상기 로도박터 아조토포르만스(Rhodobacter azotoformans) BP0899주(수탁번호 NITE BP-644) 및 그 배양물 중 적어도 하나에 대해 설명한다. 상기 로도박터 아조토포르만스(Rhodobacter azotoformans) BP0899주(수탁번호 NITE BP-644) 및 그 배양물 중 적어도 하나는, 하기 (1)∼(30)의 균학적 특징을 갖는 것이 바람직하다. 또, 상기 BP0899주는, 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허생물기탁센터(일본 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8)에 수탁번호 NITEP-644로 기탁되고(수탁일 : 2008년 9월 12일), 또한 수탁번호 NITE BP-644로 국제 기탁되어 있다(이관일 : 2010년 10월 27일).

(1) 세포의 형태 : 막대형 또는 타원형

(2) 다형성 : 없음

(3) 세포의 크기 : 0.8 ㎛×1.0 ㎛

(4) 운동성의 유무 : 있음

(5) 포자의 유무 : 없음

(6) 보통 한천 배양에서의 광택 : 있음

(7) 보통 한천 배양에서의 색소 생산 : 있음

(8) 보통 부용 배양에서의 표면 발육의 유무 : 없음

(9) 보통 부용 배양에서의 배지의 혼탁의 유무 : 있음

(10) 젤라틴 천자 배양에서의 젤라틴 액화 : 음성

(11) 리트머스ㆍ밀크 배양에서의 응고 : 없음

(12) 리트머스ㆍ밀크 배양에서의 액화 : 없음

(13) 그램 염색성 : 음성

(14) 질산염의 환원 : 없음

(15) 탈질 반응 : 없음 또는 있음

(16) MR 테스트 : 음성

(17) 인돌 생산 : 없음

(18) 황화수소의 생성 : 없음

(19) 전분의 가수분해 : 없음

(20) 시트르산의 이용(Christensen) : 없음

(21) 무기 질소원의 이용(암모늄염) : 있음

(22) 카탈라제의 생성 : 양성

(23) 옥시다제의 생성 : 양성

(24) 혐기적 생육성 : 있음

(25) O-F 테스트(산화/발효) : 음성/음성

(26) β-갈락토시다제 활성 : 음성

(27) 아르기닌디히드로라제 활성 : 음성

(28) 리신디카르복시라제 활성 : 음성

(29) 트립토판디아미나제 활성 : 음성

(30) 젤라티나제 활성 : 음성

상기 BP0899주의 16S rRNA의 염기서열은, 서열번호 1로 표시되는 염기서열인 것이 바람직하다.

상기 BP0899주 및 그 배양물 중 적어도 하나는, 암소에서의 호기 배양 조건하에서, 또한, 예컨대 하기 (31)의 표에 나타내는 성질을 나타내도 좋다. 또, 하기 (31)의 표에서, 「-」는 생산 없음을, 「+」는 생산 있음을 나타낸다.

(31) 당류로부터의 산 생산 및 가스 생산

기질 산 생산/가스 생산

L-아라비노스 -/-

D-글루코스 -/-

D-프룩토스 -/-

말토스 -/-

락토스 -/-

D-소르비톨 -/-

이노시톨 -/-

D-자일로스 -/-

D-만노스 -/-

D-갈락토스 -/-

수크로스 -/-

트레할로스 -/-

글리세린 -/-

상기 균학적 특징은, 예컨대, 전배양후, 다시 본배양한 결과로부터 평가해도 좋다. 상기 전배양은, 예컨대, 보통 한천 배지에 상기 BP0899주를 식균하고, 30℃에서 24시간 배양하여 행해도 좋다. 상기 본배양의 조건은, 각 균학적 특징의 평가 방법에 따라서 적절하게 설정할 수 있다. 구체적으로는, 상기 (1)∼(5)의 배양 조건은, 예컨대 보통 한천 배지를 이용하고, 30℃, 암소에서의 호기 배양이며, 상기 (6)∼(7)의 배양 조건은, 예컨대 보통 부용 배지를 이용하고, 30℃, 명소에서의 혐기 배양이며, 상기 (8)∼(12)의 배양 조건은, 예컨대 각 배지를 이용하고, 30℃, 암소에서의 호기 배양이며, 상기 (13), (14), (16), (17), (19)∼(23), (25)의 산화 테스트, (26), (29), (30) 및 (31)은, 예컨대 암소에서의 호기 배양이며, (15), (18), (24), (25)의 발효 테스트, (27) 및 (28)은, 예컨대 암소에서의 혐기 배양이다. 이들 균학적 특징의 시험 방법으로는, 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 방법을 채용할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대 Barrow G. I. 및 Feltham R. K. A. 저 「Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria.」(영국) 3rd edition Cambridge University Press 1993년, 사카자키 등 저 「(신)세균 배지학 강좌ㆍ하」(도쿄) 제2판 킨키대학 출판 1988년, 하세가와 편저 「미생물의 분류와 동정(하)」(도쿄) 학회출판센터 1985년, 토양 미생물 연구회편 「신편 토양 미생물학 실험」(도쿄) 요켄도 1992년 등에 기재된 방법을 들 수 있다. 상기 (15)의 시험 방법은, 예컨대, 상기 「미생물의 분류와 동정(하)」에 기재된 고마가타 등의 방법, Giltay 배지를 이용한 상기 「신편 토양 미생물학 실험」에 기재된 방법, PYN 배지를 이용한 하수법 등을 채용할 수 있다. 상기 고마가타 등의 방법은, 1% 질산나트륨 육즙을 이용한 혐기 배양 조건하에, 생육 및 가스 형성이 확인되는 것을 탈질 반응 양성으로 판정한다. 상기 Giltay 배지를 이용한 방법은, 더람(Durham) 발효관을 넣은 상기 Giltay 배지(pH 7.0∼7.2)를 이용한 혐기 배양 조건하에, 가스 발생 및 짙은 청색을 나타낸 것을 탈질 반응 양성으로 판정한다. 또, 상기 Giltay 배지는, A액(KNO₃ 1 g, 아스파라긴 1 g, 1% 브로모티몰 블루ㆍ알콜 용액 5 mL 및 증류수 500 mL) 및 B액(시트르산나트륨 8.5 g, MgSO₄ㆍ7H₂O 1 g, FeCl₃ㆍ6H₂O 0.05 g, KH₂PO₄ 1 g, CaCl₂ㆍ6H₂O 0.2 g 및 증류수 500 mL)을 혼합한 배지이다. 또한, 상기 시험 방법에는, 예컨대, 시판하는 세균 동정 키트를 사용해도 좋다. 상기 키트로는, 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 세균 동정 키트 API20E(비오멜류사 제조) 등을 사용할 수 있다.

상기 BP0899주 및 그 배양물 중 적어도 하나는, 또한 예컨대 하기 (32)∼(40)의 균학적 특징을 가져도 좋다.

(32) 콜로니의 색 : 적색

(33) 젤라틴 천자 배양 : 생육하지 않음

(34) VP 테스트 : 음성

(35) 시트르산의 이용(Koser) : 있음

(36) 무기 질소원의 이용(질산염) : 있음

(37) 우레아제 활성 : 음성

(38) 생육하는 pH 범위 : 5∼9

(39) D-만니톨로부터의 산 생산 : 생산 있음

(40) D-만니톨로부터의 가스 생산 : 생산 없음

상기 (32)∼(40)의 균학적 특징의 시험 방법으로는, 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 방법을 채용할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대 전술한 문헌 등에 기재된 방법을 들 수 있다. 또한, 상기 시험 방법에는, 예컨대 시판하는 세균 동정 키트를 사용해도 좋다. 상기 키트로는, 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 전술한 세균 동정 키트 등을 사용할 수 있다.

상기 BP0899주의 채취원으로는, 특별히 한정되지 않고, 예컨대 토양, 해수, 강물, 호수물, 연못물 등을 들 수 있다. 또한, 상기 토양으로는, 예컨대 육지, 해저, 강바닥, 호수바닥 및 연못바닥의 흙, 모래 및 진흙 등을 들 수 있고, 특별히 한정되지 않는다.

상기 BP0899주의 단리 방법으로는, 예컨대, 종래 공지의 채취법, 배양법 등을 이용할 수 있고, 특별히 제한되지 않는다. 상기 단리 방법으로는, 예컨대, 채취원이 호수물인 경우, 채취한 호수물을 필터 등에 의해 여과하고, 이 여과액을 한천 배지 등으로 배양하여, 얻어진 콜로니로부터 상기 BP0899주를 단리해도 좋다. 또한, 예컨대 채취원이 진흙인 경우, 채취한 진흙을 완충액 등에 의해 현탁한 후, 이 현탁액을 원심 분리하고, 얻어진 상청을 한천 배지 등으로 배양하여, 얻어진 콜로니로부터 상기 BP0899주를 단리해도 좋다. 상기 단리한 BP0899주는, 또한 예컨대 액체 배지 중에서 배양해도 좋다.

상기 BP0899주의 배양에 있어서, 배지는 특별히 한정되지 않고, 예컨대 저급 지방산 첨가 배지, 말산 첨가 배지, L-건조 표품 복원용 배양기 802 「다이고」(일본제약(주) 제조), MYS 배지(히라이시 및 키타가와, Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries, 1984년, 50권, 11호, p.1929-1937), 개변 MYS 배지, 생육용 배지 등을 들 수 있고, 바람직하게는 저급 지방산 첨가 배지, 말산 첨가 배지, L-건조 표품 복원용 배양기 802 「다이고」(일본제약(주) 제조)이다.

상기 저급 지방산 첨가 배지 및 상기 말산 첨가 배지로는, 예컨대 하기 표 1의 기초 배지에, 비오틴, 비타민 B₁, 니코틴산, 저급 지방산 또는 말산의 나트륨염을 첨가한 배지를 들 수 있다. 상기 저급 지방산으로는, 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 락트산 등이 바람직하다.

상기 개변 MYS 배지, 생육용 배지로는, 예컨대 하기 표 2 및 표 3의 조성의 배지를 들 수 있다.

상기 배양에서, 온도 범위는 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 23∼39℃, 30℃이다.

또한, 상기 배양에서, pH 범위는 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 pH 5.5∼8.5, 6.0∼8.5, 7.0이다.

상기 배양은, 예컨대 호기적 조건하에 행해도 좋고, 혐기적 조건하에 행해도 좋으며, 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 혐기적 조건하이다. 또한, 상기 배양시의 광조건도 특별히 제한되지 않고, 예컨대 암흑 조건이어도 좋고, 조명 조건이어도 좋지만, 바람직하게는 2000 룩스∼10000 룩스의 조도하이다. 상기 배양은, 예컨대 밀폐 조명식 배양조 내에서 행해도 좋다. 또한, 상기 밀폐 조명식 배양조 내에 구비된 교반 장치를 이용하여, 배양액을 교반하면서 배양해도 좋다.

상기 배양 시간은 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 상기 BP0899주의 증식이 정상기에 도달할 때까지이어도 좋다. 상기 BP0899주의 증식이 약 72시간 이내에 정상기에 도달하는 배양 조건하의 경우, 상기 배양 시간은, 예컨대 72시간이어도 좋다.

전술한 바와 같이, 상기 BP0899주의 16S rRNA의 염기서열은, 서열번호 1로 표시되는 염기서열인 것이 바람직하다.

상기 16S rRNA의 염기서열은, 예컨대, 전술한 방법 등에 의해 단리 및 배양한 상기 BP0899주로부터 DNA를 추출하고, 프라이머 등을 이용하여 결정할 수 있다. 상기 DNA의 추출 및 상기 염기서열의 결정 방법은, 예컨대 통상의 방법을 이용할 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 또한, 상기 프라이머는 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 이하의 프라이머 등을 들 수 있다.

상기 BP0899주의 배양물로는, 예컨대, 상기 BP0899주의 균체, 상기 BP0899주의 배양 상청, 상기 BP0899주의 균체 추출물 등을 들 수 있고, 특별히 한정되지 않는다.

상기 배양물은, 예컨대, 상기 균체의 처리물, 상기 배양 상청의 처리물, 상기 균체 추출물의 처리물 등이어도 좋으며, 특별히 한정되지 않는다. 상기 처리물로는, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 상기 배양물의 농축물, 건조물, 동결 건조물, 용매 처리물, 계면 활성제 처리물, 효소 처리물, 단백질 분획물, 초음파 처리물, 마쇄 처리물 등을 들 수 있다. 또한, 상기 배양물은, 예컨대, 상기 균체, 상기 배양 상청, 상기 균체 추출물, 상기 균체의 처리물, 상기 배양 상청의 처리물, 상기 균체 추출물의 처리물 등의 혼합물이어도 좋다. 상기 혼합물로는, 임의의 조합 및 비율로 혼합할 수 있고, 특별히 제한되지 않는다. 상기 조합으로는, 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 상기 균체 및 상기 배양 상청의 혼합물 등을 들 수 있다.

도 1의 플로우차트에, 상기 조추출 공정의 일례를 나타낸다. 도시한 바와 같이, 본 예의 상기 조추출 공정은, 탈색 처리(단계 S11)와, 추출 처리(단계 S12)와, 여과 처리(단계 S13)를 포함한다.

(1) 탈색 처리(단계 S11)

우선, 상기 로도박터 아조토포르만스(Rhodobacter azotoformans) BP0899주(수탁번호 NITE BP-644) 또는 그 배양물에 대해, 색소의 탈색 처리를 행한다. 상기 색소의 탈색 처리는 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 유기 용매에 의한 탈색 처리를 들 수 있다. 상기 유기 용매는, 예컨대, 아세톤, 메탄올, 클로로포름 및 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있다. 상기 탈색 처리는, 예컨대, 상기 균체 또는 상기 배양물을 상기 유기 용매와 혼합함으로써 행할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 비커 내의 상기 BP0899주의 동결 건조 균체 10 g∼60 g에 대하여, 아세톤 25 mL∼150 mL를 더하고, 스터러를 이용하여 충분히 교반한다. 다음으로, 상기 교반한 용액의 상청을 50 mL 코니칼 튜브로 옮겨, 2000 rpm∼5000 rpm, 5분∼10분의 조건으로 원심 분리하여, 얻어진 상청을 제거하고, 침전물에 아세톤 20 mL∼40 mL를 더하여, 상기 비커로 복귀시킨다. 이 조작을, 상기 BP0899주의 색소의 색(갈색)을 육안으로 확인할 수 없게 될 때까지 반복한 후, 상기 침전물을, 아스피레이터를 이용하여 항량(恒量)이 될 때까지 감압 건조하여, 탈색된 건조 균체를 얻는다.

(2) 추출 처리(단계 S12)

다음으로, 상기 탈색 처리 후의 균체 또는 배양물을, 단백질을 불용화하는 유기 용매로 처리하여 단백질을 제거한다. 상기 유기 용매는, 예컨대, 페놀 등을 들 수 있다. 상기 추출 처리는, 예컨대, 상기 균체 또는 배양물을 상기 유기 용매 및 수성 용매와 혼합하고, 상기 유기 용매에 의해 불용화한 단백질을 상기 유기 용매의 상에 분배시키고, 상기 수성 용매의 상에, 목적으로 하는 상기 화합물을 분배시킨다. 구체적으로는, 예컨대, 상기 비커 내의 탈색 건조 균체 10 g∼60 g에, 상기 탈색 건조 균체의 농도가 60 mg/mL∼90 mg/mL가 되도록 주사용수를 더한다. 다음으로, 90% 페놀을 상기 주사용수와 등량 가하고, 핫스터러 상에서 65℃∼70℃에서 20분∼40분 교반하여, 이것을 초회 추출로 한다. 그리고, 상기 교반한 용액을 10℃ 이하가 될 때까지 냉각시킨 후, 원심 분리용 튜브를 이용하여, 8000 rpm∼20000 rpm, 20분∼60분, 2℃∼10℃의 조건으로 원심 분리함으로써, 페놀상과 수상으로 분리하여, 얻어진 상기 수상을 50 mL 코니칼 튜브에 회수하고, 상기 원심 분리용 튜브에 남은 페놀상에, 회수한 수상과 등량의 주사용수를 넣어, 상기 초회 추출과 동일한 조작을 반복했다(2회째 추출). 또한, 상기 초회 추출과 동일한 조작을 한번 더 반복했다(3회째 추출). 이와 같이 하여, 3회분의 추출에 의해 얻어진 수상 500 mL∼1000 mL를 회수한다.

(3) 여과 처리(단계 S13)

다음으로, 추출 처리에서 얻어진 수상에 여과 처리를 하여, 상기 수상에 혼입한 유기 용매(상기 추출 처리에서 이용한 페놀 등의 유기 용매)를 제거한다. 상기 여과로는, 예컨대 초여과 등을 들 수 있다. 상기 여과에서의 분획 분자량은, 예컨대 7000이며, 상기 분획 분자량 미만의 분자를 제거하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 예컨대 상기 회수한 수상을 분획 분자량 7000의 투석 튜브에 넣고, 외액을 증류수 1 L∼10 L로 하여 투석을 행한다. 외액에 페놀의 흡수파장인 270 nm에서의 광의 흡수가 보이지 않게 될 때까지 상기 투석을 반복하여 행하고, 내액을, 상기 본 발명의 신규 화합물을 포함하는 조추출액으로서 회수한다.

〔정제 공정〕

도 2의 플로우차트에 상기 정제 공정의 일례를 나타낸다. 도시한 바와 같이, 본 예의 상기 정제 공정은, 효소 처리(단계 S21)와, 추출 처리(단계 S22)와, 여과 처리(단계 S23)를 포함한다.

(1) 효소 처리(단계 S21)

상기 조추출 공정에서 얻어진 상기 본 발명의 신규 화합물을 포함하는 조추출액에 대해 효소 처리를 행한다. 상기 효소 처리는 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 핵산 분해 효소에 의한 처리, 단백질 분해 효소에 의한 처리를 들 수 있고, 어느 하나의 처리이어도 좋고, 양쪽의 처리이어도 좋다. 후자의 경우, 그 순서는 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 핵산 분해 효소에 의한 처리를 행한 후, 단백질 분해 효소에 의한 처리를 행할 수 있다.

우선, 상기 조추출액에 대해, 핵산 분해 효소에 의한 처리를 한다. 상기 핵산 분해 효소는 특별히 제한되지 않고, 예컨대, RNA 분해 효소, DNA 분해 효소를 들 수 있다. 상기 RNA 분해 효소로는, 특별히 한정하는 것이 아니지만, 예컨대, 시그마사 제조의 리보뉴클리아제 에이(Ribonuclease A), 와코준야쿠 공업(주) 제조의 리보뉴클리아제 에이, 로슈사 제조의 리보뉴클리아제 에이 등을 이용할 수 있다. 상기 DNA 분해 효소로는, 특별히 한정하는 것이 아니지만, 예컨대, 시그마사 제조의 데옥시리보뉴클리아제 아이(Deoxyribonuclease I), 와코준야쿠 공업(주) 제조의 데옥시리보뉴클리아제 아이, 로슈사 제조의 데옥시리보뉴클리아제 아이 등을 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대 상기 조추출액에, 0.2 mg/mL∼1 mg/mL의 RNA 분해 효소와, 1 μg/mL∼10 μg/mL의 DNA 분해 효소를 첨가하여, 30℃∼40℃에서 4시간∼24시간 인큐베이트한다.

다음으로, 상기 조추출액에 대해, 단백질 분해 효소에 의한 처리를 한다. 상기 단백질 분해 효소로는, 특별히 한정하는 것이 아니지만, 예컨대, 시그마사 제조의 프로테이나아제 케이(Proteinase K), 와코준야쿠 공업(주) 제조의 프로테이나아제 케이, 로슈사 제조의 프로테이나아제 케이 등을 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대 상기 조추출액에, 100 μg/mL∼300 μg/mL의 단백질 분해 효소를 첨가하여, 40℃∼50℃에서 2시간∼24시간 인큐베이트한다.

(2) 추출 처리(단계 S22)

다음으로, 상기 조추출액을 단백질을 불용화하는 유기 용매로 처리하여 단백질을 제거한다. 상기 유기 용매는, 예컨대 페놀 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 상기 효소 처리 후의 추출액을, 2000 rpm∼5000 rpm, 20분∼60분의 조건으로 원심 분리한다. 그리고, 얻어진 침전 획분 약 1 mL∼10 mL와 상청 획분 약 50 mL∼100 mL 중, 상기 침전 획분을, 분획 분자량 50000∼100000의 초여과 튜브에 넣고, 외액을 증류수 5 mL∼15 mL로 하여 초여과를 행한다. 얻어진 내액에, 주사용수 10 mL∼60 mL와 90% 페놀 10 mL∼60 mL를 더하고, 핫스터러 상에서 65℃∼70℃에서 20분∼40분 교반하여, 이것을 초회 추출로 한다. 그리고, 상기 교반한 용액을 10℃ 이하가 될 때까지 냉각시킨 후, 원심 분리용 튜브를 이용하여, 8000 rpm∼20000 rpm, 20분∼60분, 2℃∼10℃의 조건으로 원심 분리함으로써, 페놀상과 수상으로 분리하여, 얻어진 상기 수상은 50 mL 코니칼 튜브에 회수하고, 상기 원심 분리용 튜브에 남은 페놀상에, 회수한 수상과 등량의 주사용수를 넣어, 상기 초회 추출과 동일한 조작을 반복했다(2회째 추출). 또한, 상기 초회 추출과 동일한 조작을 한번 더 반복했다(3회째 추출). 이와 같이 하여, 3회분의 추출 조작의 수상을 총 60 mL∼120 mL 회수한다.

(3) 여과 처리(단계 S23)

다음으로, 추출 처리에서 얻어진 수상에 여과 처리를 하여, 상기 수상에 혼입한 유기 용매(상기 추출 처리에서 이용한 페놀 등의 유기 용매)를 제거한다. 상기 여과로는, 예컨대 초여과 등을 들 수 있다. 상기 여과에서의 분획 분자량은, 예컨대 50000∼100000이며, 상기 분획 분자량 미만의 분자를 제거하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 예컨대, 상기 회수한 수상을 분획 분자량 7000의 투석 튜브에 넣고, 외액을 증류수 0.5 L∼1 L로 하여, 24시간∼96시간 투석을 행한다. 얻어진 내액을 분획 분자량 50000∼100000의 초여과 튜브에 넣고, 외액을 증류수 5 mL∼15 mL로 하여 초여과를 행한다. 얻어진 내액을 동결 건조함으로써, 본 발명의 신규 화합물인 식 (A) 또는 식 (B)로 표시되는 화합물 또는 그 염이 얻어진다.

실시예

다음으로, 본 발명의 실시예에 대해 설명한다. 다만, 본 발명은 하기의 실시예에 한정되지 않는다. 시판하는 시약은, 특별히 제시하지 않는 한, 이들의 프로토콜에 기초하여 사용했다.

〔실시예 1〕

하기 방법에 의해, 식 (A)로 표시되는 화합물 및 식 (B)로 표시되는 화합물을 제조했다.

〔1. 조추출 공정〕

(1-1) 탈색 처리(단계 S11)

비커 내의 상기 BP0899주의 동결 건조 균체 20.03 g에 대하여, 아세톤 50 mL를 더하고, 스터러를 이용하여 10분 교반했다. 다음으로, 상기 교반한 용액의 상청을 50 mL 코니칼 튜브로 옮기고, 2000 rpm, 5분의 조건으로 원심 분리하여, 얻어진 상청은 제거하고, 침전물에는 아세톤 20 mL를 더하여 상기 비커로 복귀시켰다. 이 조작을, 상기 BP0899주의 색소의 색(갈색)을 육안으로 확인할 수 없을 때까지 반복했다. 그리고, 탈색된 침전물을, 아스피레이터를 이용하여 항량이 될 때까지 감압 건조하여, 탈색 건조 균체를 얻었다.

(1-2) 추출 처리(단계 S12)

비커에 넣은 상기 탈색 건조 균체 16 g에, 상기 탈색 건조 균체의 농도가 75 mg/mL가 되도록 주사용수를 더했다. 다음으로, 90% 페놀을 상기 주사용수와 등량 가하고, 핫스터러 상에서 65℃∼70℃에서 30분 교반하여, 이것을 초회 추출로 했다. 그리고, 상기 교반한 용액을 10℃ 이하가 될 때까지 냉각시킨 후, 원심 분리용 튜브를 이용하여, 15000 rpm, 40분, 4℃의 조건으로 원심 분리함으로써, 페놀상과 수상으로 분리하여, 얻어진 상기 수상은 50 mL 코니칼 튜브에 회수하고, 상기 원심 분리용 튜브에 남은 페놀상에, 회수한 수상과 등량의 주사용수를 넣어, 상기 초회 추출과 동일한 조작을 반복했다(2회째 추출). 또한, 상기 초회 추출과 동일한 조작을 한번 더 반복했다(3회째 추출). 이와 같이 하여, 3회분의 추출 조작의 수상 450 mL를 회수했다.

(1-3) 여과 처리(단계 S13)

상기 회수한 수상 450 mL를 분획 분자량 7000의 투석 튜브에 넣고, 외액을 증류수 2.5 L로 하여 투석을 행했다. 외액에 페놀의 흡수파장인 270 nm에서의 광의 흡수가 보이지 않게 될 때까지 상기 투석을 22회 행하고, 식 (A)로 표시되는 화합물 및 식 (B)로 표시되는 화합물을 포함하는 조추출액인 내액 75 mL를 회수했다.

[2. 정제 공정]

(2-1) 효소 처리(단계 S21)

우선, 상기 조추출 공정에서 얻은 식 (A)로 표시되는 화합물 및 식 (B)로 표시되는 화합물을 포함하는 조추출액에, 0.5 mg/mL의 RNA 분해 효소(상품명 : 시그마사 제조의 리보뉴클리아제 에이)와, 5 μg/mL의 DNA 분해 효소(시그마사 제조의 데옥시리보뉴클리아제 아이)를 첨가하여, 37℃에서 6시간 인큐베이트했다. 다음으로, 상기 조추출액에, 200 μg/mL의 단백질 분해 효소(시그마사 제조의 프로테이나아제 케이)를 첨가하여, 50℃에서 4시간 인큐베이트한 후, 3000 rpm, 30분의 조건으로 원심 분리했다.

(2-2) 추출 처리(단계 S22)

상기 효소 처리에서의 원심 분리에 의해 얻어진 침전 획분 약 3 mL 이하와 상청 획분 약 72 mL 중, 상기 침전 획분을 분획 분자량 100000의 초여과 튜브에 넣고, 외액을 증류수 15 mL로 하여 초여과를 행했다. 얻어진 내액에 주사용수 30 mL와 90% 페놀 30 mL를 더하고, 핫스터러 상에서 65℃∼70℃에서 30분 교반하여, 이것을 초회 추출로 했다. 그리고, 상기 교반한 용액을 10℃ 이하가 될 때까지 냉각시킨 후, 원심 분리용 튜브를 이용하여, 15000 rpm, 40분, 4℃의 조건으로 원심 분리함으로써, 페놀상과 수상으로 분리하여, 얻어진 상기 수상은 50 mL 코니칼 튜브에 회수하고, 상기 원심 분리용 튜브에 남은 페놀상에, 회수한 수상과 등량의 주사용수를 넣어, 상기 초회 추출과 동일한 조작을 반복했다(2회째 추출). 또한, 상기 초회 추출과 동일한 조작을 한번 더 반복했다(3회째 추출). 이와 같이 하여, 3회분의 추출 조작의 수상 80 mL를 회수했다.

(2-3) 여과 처리(단계 S23)

상기 회수한 수상을 분획 분자량 7000의 투석 튜브에 넣고, 외액을 증류수 1 L로 하여 72시간 투석을 행했다. 얻어진 내액을 분획 분자량 100000의 초여과 튜브에 넣고, 외액을 증류수 15 mL로 하여 초여과를 행했다. 얻어진 내액을 동결 건조함으로써, 정제물 164.53 mg을 얻었다.

〔실시예 2〕

상기 정제물을 질량 분석(mass spectrometry) 및 핵자기 공명(nuclear magnetic resonance, NMR)에 제공하여, 그 구조를 특정했다.

(1) 정제물의 분해물의 질량 분석

상기 정제물을 이하와 같이 하여 분해하여, 상기 정제물의 분해물을 조제했다. 우선, 상기 정제물을, 10 mg/mL의 농도가 되도록 0.1 mol/L의 염산에 용해하고, 상기 용해액을 수욕 중에서 90분간 가열하여, 침전물과 무색 투명한 상청을 얻었다. 다음으로, 상기 침전물을 회수하고, 클로로포름 추출에 제공하여, 클로로포름 획분을 회수했다. 상기 클로로포름 획분에, 38 mg/mL의 농도가 되도록 클로로포름을 추가하고, 이 용해액 6 μL를 박층 크로마토그래피(TLC)에 제공했다. 또, TLC 플레이트로는, 10 cm×10 cm의 실리카겔 60F254 TLC 플레이트(머크사 제조)를, 전개 용매로는, 클로로포름:메탄올:증류수:트리에틸아민=30:13:2:0.1(체적비)의 용액을 사용했다. 그리고, 전개후의 상기 TLC 플레이트에 50%의 황산을 분무하고, 가장 강하게 물든 스폿에 대응하는 겔을 긁어내어, 다시 상기 전개 용매에 용해했다. 그리고, 용매를 제거한 후에, 용매 이외의 획분을 회수하고 동결 건조하여, 이것을 상기 정제물의 분해물(이하, 「분해물」이라고 함)로 했다.

상기 분해물을 각각 이하의 처리에 제공하여, 메틸에스테르화 처리물, 피롤리디드화 처리물, 가수분해 메틸에스테르화 처리물 및 가수분해 피롤리디드화 처리물의 4종류의 시료 용액을 조제했다.

<메틸에스테르화 처리물의 조제>

(I) 상기 분해물 농도가 30 mg/mL가 되도록 조제한 클로로포름 용액 0.1 mL에, 0.2 mg/mL BHT(디부틸히드록시톨루엔) 클로로포름 용액 1 mL를 첨가하여 건고(乾固)시켰다.

(II) 상기 건고물에 5% 염산ㆍ메탄올 1 mL를 첨가하고, 85℃에서 24시간 반응시켰다.

(III) 상기 반응물을 방랭후, 헥산 1 mL, 물 0.5 mL를 첨가하고, 헥산상을 회수했다.

(IV) 상기 회수한 헥산상을, 질소 기류화로 용매 증류 제거하고, 클로로포름 1 mL에 재용해하여, 메틸에스테르화 처리물의 시료 용액을 얻었다.

<피롤리디드화 처리물의 조제>

(I) 상기 메틸에스테르화 처리물의 시료 용액 200 μL를 유리 시험관에 채취했다.

(II) 상기 유리 시험관에, 피롤리딘 400 μL 및 아세트산 40 μL를 첨가하여, 100℃에서 30분간 반응시켰다.

(III) 반응 종료후, 상기 반응물에 디클로로메탄 2 mL와 5% 아세트산 수용액 2 mL를 더하여 흔들어 섞은 후, 디클로로메탄상을 회수했다.

(IV) 상기 회수한 디클로로메탄상으로부터 질소 기류하에 용매를 제거한 후, 클로로포름 200 μL에 재용해하여, 피롤리디드화 처리물의 시료 용액을 얻었다.

<가수분해 메틸에스테르화 처리물의 조제>

(I) 상기 분해물에 대하여, 상기 메틸에스테르화 처리물의 조제에서의 (I)과 동일하게 처리하여, 건고물을 얻었다.

(II) 상기 건고물에 0.5 mol/L NaOHㆍ메탄올 1 mL를 첨가하여, 50℃에서 1시간 반응시켰다.

(III) 상기 반응물을 방랭후, 헥산 1 mL, 1 mol/L 염산 시액 0.5 mL를 첨가하고, 헥산상을 회수했다.

(IV) 상기 회수한 헥산상에 대하여, 상기 메틸에스테르화 처리물의 조제에서의 (IV)와 동일하게 처리하여, 가수분해 메틸에스테르화 처리물의 시료 용액을 얻었다.

<가수분해 피롤리디드화 처리물의 조제>

상기 가수분해 메틸에스테르화 처리물에 대하여, 상기 피롤리디드화 처리물의 조제에서의 (I)∼(IV)와 동일하게 처리하여, 가수분해 피롤리디드화 처리물의 시료 용액을 얻었다.

(1-1) 메틸에스테르화 처리물 및 가수분해 메틸에스테르화 처리물의 GC-MS

상기 메틸에스테르화 처리물 및 상기 가수분해 메틸에스테르화 처리물을, 하기 조건으로 GC-MS(가스 크로마토그래프-매스 스펙트로메트리) 분석에 제공했다.

<GC-MS 조건>

기기 : JMS-700V(니혼덴시(주) 제조)

컬럼 : SPB-1 30 m×0.25 mm 막두께 0.25 ㎛

컬럼 온도 : 50℃(1분 유지)→300℃(+8℃/분으로 승온, 30분 유지)

주입구 온도 : 250℃

검출기 : 수소염 이온화 검출기(FID) 300℃

주입량 : 1 μL(비분할(splitless) 주입)

캐리어 가스 : 헬륨(선속도 30 cm/sec, 정류량 모드)

검출기 : MS

이온화법 : EI(전자 이온화)

이온화 전류 : 300 μA

이온화 에너지 : 70 eV

이온화실 온도 : 300℃

전자 가속 전압 : 10 kV

주사 범위 : m/z=35∼500(sec/scan)

이 결과를 도 10 및 도 11에 나타낸다. 도 10은, 상기 메틸에스테르화 처리물을 GC-MS 분석에 제공했을 때의 매스 스펙트럼이며, 도 11은, 상기 가수분해 메틸에스테르화 처리물을 GC-MS 분석에 제공했을 때의 매스 스펙트럼이다. 도 10 및 도 11에서, 종축은 검출 강도를 나타내고, 횡축은 검출 시간(min)을 나타낸다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 상기 메틸에스테르화 처리물로부터 피크 1∼11이 얻어졌다. 이들 중에서, 검출 강도가 높았던 피크 1, 2, 4, 6 및 7의 화합물을 각각, 또한, 상기와 동일한 조건으로 GC-MS 분석에 제공했다. 얻어진 매스 스펙트럼에 대하여, 형상이 비슷한 매스 스펙트럼을 갖는 구조물을, 데이터베이스(NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library의 NIST MassSpectral Seach Program)의 오토 모드에 의해 라이브러리 검색했다. 그 결과, 피크 1, 2, 4 및 7의 화합물은 각각, 식 (2)∼(5)의 화합물과 높은 유사도를 나타냈다. 또한, 본 발명자들은, 피크 6의 화합물의 매스 스펙트럼이, Strittmatter 등(Strittmatter W. et al(1983), Journal of Bacteriology, Vol.155, No.1, p.153-p.158, Fig2)에 기재된 3-옥소-테트라데칸산 메틸 에스테르의 매스 스펙트럼과 흡사한 것을 발견했다. 이 때문에, 피크 6의 화합물은, 식 (6)의 3-옥소-테트라데칸산 메틸 에스테르라고 추정했다.

또한, 도 11에 나타낸 바와 같이, 상기 가수분해 메틸에스테르화 처리물로부터 피크 A∼I가 얻어졌다. 여기서, 도 10의 매스 스펙트럼과 도 11의 매스 스펙트럼을 비교하면, 도 10의 피크 1, 2 및 4에 대응하는 피크로서, 도 11에서는 각각 피크 A, B 및 D가 확인되었다. 이들 피크 A, B 및 D를 각각, 또한 상기와 동일한 조건으로 GC-MS 분석에 제공했다. 얻어진 매스 스펙트럼에 대하여, 형상이 비슷한 매스 스펙트럼을 갖는 구조물을, 상기 데이터베이스를 이용하여 검색했다. 그 결과, 피크 A, B 및 D는 각각, 식 (7), 식 (3) 및 식 (4)의 화합물과 높은 유사도를 나타냈다.

또, 도 10의 피크 6 및 7에 대응하는 피크는, 도 11에서는 확인되지 않았지만, 이것은 다음 이유에 의한 것으로 생각된다. 즉, 도 10은, 상기 분해물을 가수분해하지 않고 GC-MS 분석에 제공한 결과인 데 비해, 도 11은, 상기 분해물을 가수분해하고, 가수분해에 의해 분리한 물질만을 GC-MS 분석에 제공한 결과이다. 이 때문에, 도 11에서 확인되는 피크는, 상기 분해물 중에서 가수분해되는 에스테르 결합을 갖는 화합물의 피크라고 생각된다. 따라서, 도 11에서 대응하는 피크가 확인되지 않은 도 10의 피크 6 및 7의 화합물은, 가수분해되는 에스테르 결합을 갖지 않는 화합물이라고 추정된다.

도 10 및 도 11의 결과를 정리하여, 도 10에서 검출 강도가 높았던 피크 1, 2, 4 및 7의 화합물을 추정하면, 다음 설명 및 표 4에 나타낸 바와 같다. 우선, 도 10의 피크 1의 화합물은, 전술한 바와 같이, 라이브러리 검색의 결과, 식 (2)의 화합물이라고 추정되었다. 그러나, 피크 1의 화합물이 식 (2)의 화합물인 경우, 도 10에서의 피크 1보다, 짧은 유지 시간(즉 좌측)에 피크가 관찰되어, 정합되지 않는다. 한편, 도 10의 피크 1에 대응하는 도 11의 피크 A의 화합물은, 전술한 바와 같이, 라이브러리 검색의 결과, 식 (7)의 화합물이라고 추정되었다. 피크 A의 화합물이 식 (7)의 화합물인 경우, 도 11에서의 피크 A의 결과와도 정합된다. 이 때문에, 도 10에서의 피크 1의 화합물은, 식 (7)의 화합물이라고 추정했다. 다음으로, 도 10에서의 피크 2의 화합물은, 전술한 바와 같이, 라이브러리 검색의 결과, 식 (3)의 BHT(디부틸히드록시톨루엔)라고 추정되었다. 또한, 도 10의 피크 2에 대응하는 도 11의 피크 B의 화합물도, 전술한 바와 같이, 라이브러리 검색의 결과, 식 (3)의 BHT(디부틸히드록시톨루엔)라고 추정되어, 도 10과 도 11에서 결과는 일치했다. 이 때문에, 도 10에서의 피크 2의 화합물은, 식 (3)의 BHT(디부틸히드록시톨루엔)라고 추정되었지만, 이것은, 상기 분해물에 포함되는 화합물이 아니라, 시료 용액의 조제에서 첨가한 BHT(디부틸히드록시톨루엔)라고 추정되었다. 그리고, 도 10에서의 피크 4의 화합물은, 전술한 바와 같이, 라이브러리 검색의 결과, 식 (4)의 화합물이라고 추정되었다. 또한, 도 10의 피크 4에 대응하는 도 11의 피크 D의 화합물도, 전술한 바와 같이, 라이브러리 검색의 결과, 식 (4)의 화합물이라고 추정되었다. 이 때문에, 도 10에서의 피크 4의 화합물은, 식 (4)의 화합물이라고 추정되었다. 또, 식 (4)의 화합물의 탄소간 이중 결합 결정에 관한 고찰은, 이하의 (1-2)에서 상세히 설명한다. 또한, 도 10의 피크 7의 화합물은, 전술한 바와 같이, 라이브러리 검색의 결과, 식 (5)의 화합물이라고 추정되었다.

(1-2) 피롤리디드화 처리물 및 가수분해 피롤리디드화 처리물의 GC-MS

다음으로, 식 (4)의 화합물에서의 탄소간 이중 결합 위치의 결정을 목적으로, 상기 피롤리디드화 처리물 및 상기 가수분해 피롤리디드화 처리물을, 하기 조건으로 GC-MS 분석에 제공했다.

<GC-MS 조건>

기기 : JMS-700V(니혼덴시(주) 제조)

컬럼 : SPB-1 30 m×0.25 mm 막두께 0.25 ㎛

컬럼 온도 : 100℃(1분 유지)→300℃(+10℃/분으로 승온, 30분 유지)

주입구 온도 : 280℃

검출기 : 수소염 이온화 검출기(FID) 300℃

주입량 : 1 μL(비분할 주입)

캐리어 가스 : 헬륨(선속도 30 cm/sec, 정류량 모드)

검출기 : MS

이온화법 : EI

이온화 전류 : 300 μA

이온화 에너지: 70 eV

이온화실 온도 : 300℃

전자 가속 전압: 10 kV

주사 범위 : m/z=35∼500(sec/scan)

이 결과를 도 12 및 도 13에 나타낸다. 도 12는, 상기 피롤리디드화 처리물을 GC-MS 분석에 제공했을 때의 매스 스펙트럼이며, 도 13은, 상기 가수분해 피롤리디드화 처리물을 GC-MS 분석에 제공했을 때의 매스 스펙트럼이다. 도 12 및 도 13에서, 종축은 검출 강도를 나타내고, 횡축은 시간(min)을 나타낸다.

도 12에서의 피크 4 및 도 13에서의 피크 D의 화합물을 각각, 또한 상기와 동일한 조건으로 GC-MS 분석에 제공했다. 그 결과, 피크 4의 화합물로부터는, 도 14에 나타내는 매스 스펙트럼이 얻어지고, 피크 D의 화합물로부터는, 도 15에 나타내는 매스 스펙트럼이 얻어졌다. 도 14 및 도 15에서, 종축은 검출 강도를 나타내고, 횡축은 m/z 값을 나타낸다. 여기서, 식 (8)에 나타낸 바와 같이, 히드라진이 결합한 탄소로부터 세어, 4번째와 5번째의 탄소 사이에서 절단된 경우, 분자량은 140이 된다. 이 때문에, 히드라진이 결합한 탄소로부터 세어, 7번째와 8번째의 탄소 사이에서 절단된 경우, 이중 결합이 없으면 m/z=182가 검출되지만, 이 위치에 이중 결합이 있기 때문에, m/z=180이 검출되었다. 이상으로부터, 식 (4)의 화합물에서의 탄소간 이중 결합은, 카르보닐 결합의 탄소로부터 세어 7번째와 8번째의 사이에 존재한다고 추정되었다.

이상, 상기 (1-1) 및 상기 (1-2)의 결과를 정리하면, 상기 분해물 중에는, 식 (4)∼(7)의 4종의 화합물이 포함되는 것이 추정되었다. 또한, 식 (5) 및 식 (6)의 화합물은, 전술한 바와 같이, 상기 분해물을 가수분해에 의해 분리한 물질만을 GC-MS 분석한 바, 도 11에서 피크가 확인되지 않았기 때문에, 에스테르 결합을 갖지 않는 화합물이라고 추정되었다.

(2) 정제물의 분해물의 구조 분석

상기 (1)에서 얻은 분해물의 농도가 30 mg/mL가 되도록 조제한 클로로포름 용액 0.1 mL로부터 용매를 제거하고, 중 DMSO 600 μL를 첨가하고 5 mm 시험관으로 옮겨, 이것을 시료 용액으로 했다.

<¹HNMR 측정 및 ¹³CNMR 측정>

상기 시료 용액을, 하기 측정 조건으로 ¹HNMR 측정 및 ¹³CNMR 측정에 제공했다.

(측정 조건)

장치 : UNITY INOVA 500형(바리안사 제조)

관측 주파수 : 499.8 MHz(¹H핵)

125.7 MHz(¹³C핵)

용매 : 중 DMSO

기준(※) : 용매 : ¹H핵(2.49 ppm), ¹³C핵(39.7 ppm)

온도 : 70℃로 설정

측정법 : ¹³CNMR, DEPT, NOESY, ROESY, COSY, TOCSY, HSQC, HMBC

※70℃에서의 중 DMSO에서의 화학 시프트의 값은, Alba 등(Alba S. et al(2004), Glycobiology, vol.14, No.9, p.805-p.815)에 기재된 값을 사용했다.

<³¹PNMR 측정>

200 μL의 85% 인산이 들어간 3 mm 시험관을, 상기 시료 용액이 들어간 상기 5 mm 시험관에 삽입했다. 이 때, 관측된 85% 인산 유래의 시그널을 0.000 ppm에 맞추고, 그 후, 상기 3 mm 시험관을 뽑아내고, 상기 시료 용액을 하기 측정 조건으로 ³¹PNMR 측정에 제공했다.

(측정 조건)

장치 : UNITY INOVA 500형(바리안사 제조)

관측 주파수 : 499.8 MHz(³¹P핵)

용매 : 중 DMSO

기준 : 85% 인산(외부 표준) : 0.000 ppm

온도 : 25℃로 설정

이 결과를 도 16∼도 18에 나타낸다. 도 16a∼도 16d는 ¹HNMR 측정의 스펙트럼이고, 도 17a∼도 17d는 ¹³CNMR 측정의 스펙트럼이고, 도 18은 ³¹PNMR 측정의 스펙트럼이다. 도 16∼도 18에서, 종축은 검출 강도를 나타내고, 횡축은 화학 시프트 값(ppm)을 나타낸다.

도 16∼도 18의 스펙트럼으로부터, 상기 분해물은, 상기 4종의 화합물과 글루코사민 2 분자를 포함하는 식 (9)의 화합물이라고 추정되었다. 식 (9)에서, 2 분자의 글루코사민에 결합하고 있는 상기 4종의 화합물은, 좌측으로부터 순서대로, 식 (7)의 화합물, 식 (5)의 화합물, 식 (4)의 화합물, 식 (7)의 화합물 및 식 (6)의 화합물이다. 또, 식 (9) 중의 숫자는, 도 16의 ¹HNMR 측정의 스펙트럼에서의 피크의 숫자에 대응하고, 식 (9) 중의 알파벳(대문자)은, 도 17의 ¹³CNMR 측정의 스펙트럼에서의 피크의 알파벳(대문자)에 대응하고, 식 (9) 중의 알파벳(소문자)은, 도 18의 ³¹PNMR 측정의 스펙트럼에서의 피크의 알파벳(소문자)에 대응한다.

(3) 정제물의 분해물의 질량 분석

상기 분해물이 식 (9)의 화합물인 것을 더 증명하기 위해, 이하의 분석을 행했다.

상기 (1)에서 얻은 분해물의 농도가 30 mg/mL가 되도록 조제한 클로로포름 용액을 메탄올에 의해 40000배 희석한 용액을 시료 용액으로 하여, 하기 조건으로 GC-MS 분석에 제공했다.

<GC-MS 조건>

기기 : amaZon ETD (Bruker Daltonics사 제조)에 ESI 인터페이스를 장착

측정 모드 : ESI-IT-MS, 네거티브 모드

이 결과를 도 19에 나타낸다. 도 19는, 상기 시료 용액을 GC-MS 분석에 제공했을 때의 매스 스펙트럼이다. 도 19에서, 종축은 검출 강도를 나타내고, 횡축은 m/z 값을 나타낸다. 도 19에 나타낸 바와 같이 복수의 피크가 확인되었지만, 상기 분해물의 추정 화합물인 식 (9)의 화합물의 분자량에 가장 가까운 피크는 m/z=1417.93의 피크이다. 이 때문에, m/z=1417.93이 상기 분해물의 피크라고 판단하고, 이 피크를, 또한 동일한 조건으로 GC-MS/MS 분석에 제공했다.

이 결과를 도 20에 나타낸다. 도 20은, 도 19에서의 m/z=1417.93의 피크의 화합물을 GC-MS/MS 분석에 제공했을 때의 매스 스펙트럼이다. 도 20에서, 종축은 검출 강도를 나타내고, 횡축은 m/z 값을 나타내고, 괄호 내의 수치는 m/z 값을 나타낸다.

도 20으로부터, 다음의 것이 추정되었다. 피크 1의 화합물은, 전술한 바와 같이 식 (9)의 화합물이라고 추정되었다. 피크 2의 화합물은, 피크 1의 m/z 값(1417)으로부터 피크 2의 m/z 값(1229)을 뺀 차분값이 188이기 때문에, 상기 분해물로부터 분자량이 약 188인 식 (7)의 화합물이 분리된 화합물이라고 추정되었다. 피크 3의 화합물은, 피크 1의 m/z 값(1417)으로부터 피크 3의 m/z 값(1194)을 뺀 차분값이 223이기 때문에, 상기 분해물로부터 분자량이 약 223인 식 (4)의 화합물이 분리된 화합물이라고 추정되었다. 피크 4의 화합물은, 피크 1의 m/z 값(1417)으로부터 피크 4의 m/z 값(1042)을 뺀 차분값이 375이기 때문에, 상기 분해물로부터 분자량이 약 188인 식 (7)의 화합물이 2개 분리된 화합물이라고 추정되었다. 이와 같이, 식 (9)의 화합물로부터 식 (7)의 화합물 또는 식 (4)의 화합물이 분리된 화합물을, 피크 2∼4로서 확인할 수 있었다. 이것으로부터, 상기 분해물 중에는, 적어도 식 (7)의 화합물 및 식 (4)의 화합물의 2개는 포함되어 있는 것을 확인할 수 있고, 상기 (2)에서 추정한 상기 분해물의 추정 구조식 (9)를 더 지지하는 결과가 얻어졌다.

(4) 정제물의 질량 분석

상기 정제물을, Leone 등(Serena Leone et al, "Structural elucidation of the core-lipid A backbone from the lipopolysaccharide of Acinetobacter radioresistens S13, an organic solvent tolerant Gram-negative bacterium", Carbohydrate Research, April 10, 2006, Vol.341, issue.5, p.582-590)에 기재된 방법에 의해 히드라진 분해하여, 히드라진 분해물 105.4 mg을 얻었다. 상기 히드라진 분해물 농도가 2.1 mg/mL가 되도록 증류수에 용해하고, 메탄올에 의해 200배 희석한 용액을 시료 용액으로 하여, 하기 조건으로 GC-MS 분석에 제공했다.

<GC-MS 조건>

기기 : amaZon ETD(Bruker Daltonics사 제조)에 전기분무 이온화(ESI) 인터페이스를 장착

측정 모드 : ESI-IT-MS, 네거티브 모드

이 결과를 도 21에 나타낸다. 도 21은, 상기 시료 용액을 GC-MS 분석에 제공했을 때의 매스 스펙트럼이다. 도 21에서, 종축은 검출 강도를 나타내고, 횡축은 m/z 값을 나타내고, 괄호 중의 수치는 검출되는 이온의 가수(價數)를 나타낸다.

도 21에 나타내는 복수의 피크 중 가장 큰 피크(m/z=538.15)의 화합물을, 동일한 조건으로 GC-MS/MS 분석에 제공하여, 도 22에 나타내는 매스 스펙트럼을 얻었다. 또한, 도 22에 나타내는 복수의 피크 중 m/z=474.27의 피크의 화합물 및 m/z=601.17의 피크의 화합물을, 또한 동일한 조건으로 각각 GC-MS/MS/MS 분석에 제공하여, 도 23 및 도 24에 나타내는 매스 스펙트럼을 얻었다. 또한, 도 24에 나타내는 복수의 피크 중 m/z=557.19의 피크의 화합물 및 m/z=645.12의 피크의 화합물을, 또한 동일한 조건으로 각각 GC-MS/MS/MS/MS 분석에 제공하여, 도 25 및 도 26에 나타내는 매스 스펙트럼을 얻었다. 도 22∼도 26에서, 종축은 검출 강도를 나타내고, 횡축은 m/z 값을 나타내고, 괄호 중의 수치는 검출되는 이온의 가수를 나타낸다.

도 22∼도 26에는, 매스 스펙트럼에 더하여, 각 피크에 대응한다고 추정되는 화합물의 모식도를 나타냈다. 상기 모식도에서, P는 식 (10)의 구조식을, Hex는 식 (11)의 구조식을, Kdo는 식 (12)의 구조식을, HexU는 식 (13)의 구조식을, HexN은 식 (14)의 구조식을, F는 상기 (2)에서 추정한 4종의 화합물의 어느 것을 나타낸다. 또, 도 22∼도 26에서, Hex는 글루코스(Glc)이다.

(5) 정리

상기 (1)∼(4)의 결과를 정리하면, 상기 정제물은, 식 (A) 및 식 (B)에서, X¹ 및 X²가 각각 헥소스 및 인산기인 화합물(식 (A1)로 표시되는 화합물 및 식 (B1)로 표시되는 화합물)을 포함하는 것이 특정되었다. 또, 상기 (2)에서는, 식 (9)에 나타낸 바와 같이, β-1,6-디글루코사민 골격의 1 위치의 탄소에는 히드록실기가 결합하고 있다고 추정되었다. 한편, 상기 (4)에서는, 도 21의 모식도에 나타낸 바와 같이, β-1,6-디글루코사민 골격의 1 위치의 탄소에는 인산기가 결합하고 있다고 추정되었다. 이것에 관해서는, 다음 이유에 의해, 후자의 인산기가 바른 구조라고 특정했다. 즉, 상기 (2)에서는, 상기 정제물에 소정 처리를 하여 상기 분해물을 얻고 있지만, 이 과정에서 약산을 이용할 때, 글루코사민 2 분자 중의 우측의 글루코사민에 결합하고 있는 인산기가 탈락하고, -OH기로 치환되는 빈도가 높은 것이 일반적으로 알려져 있기 때문이다.

(6) 당쇄 부분의 NMR 해석

상기 (4)에서 얻은 히드라진 분해물을 4 mol/L의 KOH로 처리하고, 유리된 당쇄 부분을 겔 여과 컬럼 크로마토그래피(Bio-Rad사 제조의 Bio-gel P4 미디아 엑스트라 파인(media Extra fine) <45 ㎛(습윤) : #150-4128)에 의해 분획ㆍ정제했다. 도 28의 그래프에 그 겔 여과 패턴을 나타낸다.

도 28에서의 분획 번호 14-18을 합한 것(건조 중량 4.8 mg)을 500 μL의 D₂O(99.96% D)에 용해하여, NMR 측정용의 시료(이하, 「시료 A」라고 함)로 했다. NMR 측정은 하기 조건으로 실시했다.

(측정 조건)

장치 : DRX500 및 ADVANCE600 분광기(BrukerBioSpin사 제조)

프로브 : 극저온 TXI 프로브, TXI 프로브 및 BBO 프로브

프로브 온도 : 25℃

측정법 : 1D ¹H, 1D ¹H-선택성 TOCSY, ¹H-선택성 NOESY, ¹H-선택성 ROSEY, 1D ¹³C, 1D ³¹P, 2D ¹H-¹H DQF-COSY, HOHANA, NOESY, ROESY, ¹H-¹³C HSQC-TOCSY, ¹H-¹³C HSQC-NOESY, ¹H-¹³C HMBC, ¹H-³¹P HMBC

우선, 각 당 잔기의 아노머 위치에 유래하는 시그널(H1)을 동정하고, 아노머 위치의 시그널을 거점으로 하여, DQF-COSY, HOHANA, ¹H-¹³C HSQC-TOCSY 스펙트럼으로부터 잔기 내의 시그널(글루코스 잔기 및 글루코사민 잔기의 경우는 H2-H6, 글루쿠론산 잔기의 경우는 H2-H5)을 동정했다. 이 결과를 도 29 및 도 30에 나타낸다. 도 29는, 상기 시료 A를 ¹HNMR 측정에 제공했을 때의 스펙트럼이고, 도 30은, 상기 시료 A를 2D DQF-COSY 측정에 제공했을 때의 스펙트럼이다. 또, 도 29 및 도 30에서, Glc는 도 22∼도 26에서의 Hex에, KDO는 도 22∼도 26에서의 Kdo에, GlcA는 도 22∼26에서의 HexU에, GlcN은 도 22∼26에서의 HexN에 대응하며, 이후 동일하다. KDO의 경우는, 3 위치의 프로톤(H3ax, H3eq)을 거점으로 하여, KDO 잔기 내의 시그널(H4-H8)의 귀속을 행했다.

당 잔기 사이의 결합에 대해서는, NOESY 스펙트럼 중에서 관측되는 당 잔기 사이의 NOE 시그널(도 31) 및 ¹H-¹³C HMBC 스펙트럼 중에서 관측되는 당 잔기 사이의 상관 시그널에 의해 동정을 행했다. 도 31은, 상기 시료 A를 2D NOESY 측정에 제공했을 때의 스펙트럼이다.

각 당 잔기의 결합 양식(α/β)에 대해서는, ¹J(C1, H1)에 의해 하기와 같이 결정했다.

¹J(C1, H1)

GlcN-1 174 Hz(α)

GlcN-2 164 Hz(β)

GlcA 171 Hz(α)

Glc-1 173 Hz(α)

Glc-2 171 Hz(α)

인산기의 존재 및 결합 부위에 대해서는, 1D ³¹P 및 ¹H-¹³C HMBC에 의해 명확하게 했다. 이 결과를 도 32에 나타낸다. 도 32는, 시료 A를 2D ¹H-³¹P HMBC 측정에 제공했을 때의 스펙트럼이다. 2개의 인산기 중, 하나는 GlcN-1의 1 위치에, 또 하나는 GlcN-2의 4 위치에 결합했다.

이상의 결과로부터, 상기 시료 A의 구조는, 도 33의 모식도에 나타내는 것으로 특정되었다. 이 결과로부터, 상기 (4)에서 얻은 히드라진 분해물의 히드라진 분해전의 화합물은, 식 (A) 및 식 (B)에서, X¹ 및 X²가 모두 수산기인 화합물(식 (A2)로 표시되는 화합물 및 식 (B2)로 표시되는 화합물)을 포함하는 것이 특정되었다. 이들 화합물의 단당류의 기호를 이용한 구조식은 하기와 같다. 또, 도 33에는, 의자형 배좌에 의한 당쇄 구조식을 나타내고 있다.

식 (A2)로 표시되는 화합물

식 (B2)로 표시되는 화합물

〔실시예 3〕

식 (A1)로 표시되는 화합물, 식 (B1)로 표시되는 화합물, 식 (A2)로 표시되는 화합물 및 식 (B2)로 표시되는 화합물이 항염증 효과를 갖는 것을 확인했다.

(1) 피험액의 조제

실시예 1에서 얻은 정제물(식 (A1)로 표시되는 화합물, 식 (B1)로 표시되는 화합물, 식 (A2)로 표시되는 화합물 및 식 (B2)로 표시되는 화합물의 혼합물)을, 2 mg/mL의 농도가 되도록 주사용수에 용해하여 4℃에서 보존한 용액을, 37℃에서 5분 가열하고, 37℃, 1분의 조건으로 초음파 처리했다. 상기 초음파 처리 후의 상기 용액 10 μL를, 하기 조성의 배양액 990 μL에 첨가하여 충분히 혼합하고, 상기 정제물의 농도가 20000 ng/mL인 용액을 조제하고, 이것을 상기 배양액을 이용하여 단계적으로 희석함으로써, 2000 ng/mL, 200 ng/mL, 20 ng/mL, 2 ng/mL 및 0.2 ng/mL인 총 6종류의 피험액을 얻었다. 또, 상기 6종류의 피험액은 세포에 첨가할 때 2배 희석되기 때문에, 상기 정제물의 최종 농도는 각각 10000 ng/mL, 1000 ng/mL, 100 ng/mL, 10 ng/mL, 1 ng/mL 및 0.1 ng/mL가 된다.

[배양액의 조성]

DMEM 배지 500 mL

소태아 혈청 55.5 mL

페니실린-스트렙토마이신-글루타민(100×) 5.6 mL

(2) 피험액의 첨가

인간 TLR4 유전자를 도입한 인간 태아 유래 신장 세포(InvivoGen사 제조)에 상기 배양액을 첨가하여, 상기 세포의 농도가 4×10⁵ 세포/mL가 되는 용액을 조제했다. 상기 용액을, 96 웰 평저 플레이트에 100 μL씩(즉, 4×10⁴ 세포/100 μL/웰)이 되도록 파종했다. 파종후, 37℃, 5% CO₂하에서 24시간 배양한 후 배양 상청을 제거하고, 새로운 상기 배양액을 각 웰에 100 μL씩 첨가했다. 다음으로, 상기 피험액을 각 웰에 100 μL씩 첨가했다. 상기 피험액의 첨가후, 37℃, 5% CO₂하에서 24시간 배양했다.

(3) IL-8의 농도의 측정

각 웰의 배양 상청을 회수하고, Human IL-8 ELISA MAX(등록상표) 스탠다드(Biolegend사 제조)를 이용하여, 인터류킨 8(Interleukin-8 : IL-8)의 농도를 측정했다.

측정 결과를 도 3의 그래프에 나타낸다. 도 3에서, 종축은 IL-8의 농도를 나타내고, 횡축은 피험액의 농도를 나타낸다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 피험액의 농도 의존적으로 IL-8의 농도가 상승했다. 여기서, IL-8의 생산량은, 일반적으로 TLR4 활성화의 지표가 되는 것이 알려져 있고, 또한 전술한 바와 같이, TLR4의 활성화는, 항염증 작용을 갖는 I형 인터페론의 생산을 재촉하는 것이 보고되어 있다. 즉, IL-8의 농도의 상승은 항염증 작용의 활성화를 의미한다. 이 때문에, 이들 결과로부터, 상기 정제물(식 (A1)로 표시되는 화합물, 식 (B1)로 표시되는 화합물, 식 (A2)로 표시되는 화합물 및 식 (B2)로 표시되는 화합물의 혼합물)이 항염증 작용을 갖는 것이 확인되었다. 또, 상기 정제물 대신, 식 (A1)로 표시되는 화합물, 식 (B1)로 표시되는 화합물, 식 (A2)로 표시되는 화합물 또는 식 (B2)로 표시되는 화합물을 이용하더라도 동등한 결과가 얻어졌다.

〔실시예 4〕

(1) 피험액의 조제

실시예 3에서의 「(1) 피험액의 조제」와 동일하게 하여, 상기 정제물의 농도가 20000 ng/mL인 용액을 조제하고, 이것을, 하기 조성의 배양액을 이용하여 단계적으로 희석함으로써, 100 ng/mL 및 10000 ng/mL인 총 2종류의 피험액을 얻었다. 또, 상기 2종류의 피험액은 세포에 첨가할 때 100배 희석되기 때문에, 상기 정제물의 최종 농도는 각각 1 ng/mL 및 100 ng/mL가 된다.

[배양액의 조성]

RPMI1640 배지 500 mL

비동화 소태아 혈청 55.5 mL

페니실린-스트렙토마이신-글루타민(100×) 5.6 mL

(2) 피험액의 첨가

마우스 마크로파지 세포(RAW264.7, ATCC)에 상기 배양액을 첨가하여, 상기 세포의 농도가 1.067×10⁶ 세포/mL가 되는 용액을 조제했다. 상기 용액을, 6 웰 플레이트에 3 mL씩(즉, 3.2×10⁶ 세포/3 mL/웰)이 되도록 파종했다. 파종후, 37℃, 5% CO₂하에서 2시간 배양한 후, 상기 피험액을 각 웰에 30 μL씩 첨가했다. 상기 피험액의 첨가후, 37℃, 5% CO₂하에서 24시간 배양했다. 다음으로, 상기 각 웰의 배양 상청을 15 mL 튜브에 회수했다. 그리고, 상기 각 웰에 새로운 상기 배양액 1 mL를 첨가하여 웰 전체에 골고루 퍼지게 한 후, 상기 15 mL 튜브에 회수하는 작업을 2회 반복했다. 그 후, 상기 15 mL 튜브에 회수한 상기 배양액을, 1000 rpm, 3분의 조건으로 원심 분리한 후 상청을 제거하고, 또한 37℃의 새로운 상기 배양액 3 mL를 첨가하여 현탁하고, 다시 동일한 조건으로 원심 분리했다. 원심 분리후 상청을 제거하고, 침전에 37℃의 새로운 상기 배양액 2 mL를 첨가하여 현탁했다. 그리고, 상기 현탁액을 2 mL씩, 새로운 상기 배양액 1 mL가 미리 첨가되어 있는 상태의 각 웰에 첨가했다. 그 후, 새로운 상기 배양액 30 μL를 첨가했다(이하, 이 공정을 「배양액 첨가 공정」이라고 함). 첨가후, 37℃, 5% CO₂하에서 30분 배양한 후, 상기 각 웰의 배양 상청을 15 mL 튜브에 회수하고, 1000 rpm, 3분의 조건으로 원심 분리하여 상청을 아스피레이터에 의해 제거했다. 또한, 배양 상청을 제거한 상기 6 웰 플레이트의 각 웰에, 냉각시킨 PBS(인산 완충 식염수)/포스파타아제 억제액 3 mL를 첨가하고, 피펫팅에 의해 세포를 박리하고, 세포 현탁액을 상기 15 mL 튜브에 첨가했다. 상기 15 mL 튜브를, 1000 rpm, 3분의 조건으로 원심 분리하고, 상청을 아스피레이터에 의해 제거한 후, 상기 15 mL 튜브에 냉각시킨 상기 PBS/포스파타아제 억제액 0.5 mL를 첨가하여 현탁함으로써 세포 현탁액을 조제했다. 상기 세포 현탁액으로부터, 뉴클리어 엑스트렉트(Nuclear Extract) 키트(액티브 모티프사 제조)를 이용하여 핵단백질을 추출했다.

(3) 핵내 NF-κB량의 측정

트랜스 AM NF-κB p65 키트(액티브 모티프사 제조)를 이용하여 흡광도를 측정함으로써, 상기 핵단백질 중의 NF-κB량을 확인했다.

확인 결과를 도 4의 그래프에 나타낸다. 도 4에서, 종축은 흡광도를 나타내고, 횡축은 피험액의 농도를 나타낸다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 피험액의 농도가 높을수록 흡광도가 낮은 값이 되었기 때문에, 상기 핵단백질 중의 NF-κB량은, 피험액의 농도가 높을수록 적어지는 것을 알았다. 이 결과로부터, 상기 정제물에 의해, 염증성 사이토카인의 일종인 NF-κB의 생산이 억제되는, 즉, 상기 정제물(식 (A1)로 표시되는 화합물, 식 (B1)로 표시되는 화합물, 식 (A2)로 표시되는 화합물 및 식 (B2)로 표시되는 화합물의 혼합물)이 항염증 효과를 갖는 것이 확인되었다. 또, 상기 정제물 대신, 식 (A1)로 표시되는 화합물, 식 (B1)로 표시되는 화합물, 식 (A2)로 표시되는 화합물 또는 식 (B2)로 표시되는 화합물을 이용하더라도 동등한 결과가 얻어졌다.

〔실시예 5〕

본 예에서는, 다음 2점 외에는 실시예 4와 동일하게 실험하여 흡광도를 측정함으로써, 상기 핵단백질 중의 NF-κB량을 확인했다. 즉, 본 예에서는, 피험액으로서, 상기 정제물의 농도가 100 ng/mL, 10000 ng/mL 및 1000000 ng/mL인 3종류의 피험액을 이용했다. 또, 상기 3종류의 피험액은 세포에 첨가할 때 100배 희석되기 때문에, 상기 정제물의 최종 농도는 각각 1 ng/mL, 100 ng/mL 및 10000 ng/mL이 된다. 또한, 본 예에서는, 실시예 3에서의 상기 배양액 첨가 공정에서, 상기 배양액 30 μL 대신, 최종 농도 100 ng/mL의 그램 음성균인 판토에아 아글로메란스(Pantoea agglomerans)로부터 정제한 LPS(지질다당류, 판토에아 아글로메란스, 자연면역응용 기술연구소(주) 제조, 이하 「LPSp」라고 함)를 포함하는 상기 배양액 30 μL를 첨가했다.

확인 결과를 도 5의 그래프에 나타낸다. 도 5에서, 종축은 흡광도를 나타내고, 횡축은 피험액의 농도를 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 피험액의 농도가 높을수록 흡광도가 낮은 값이 되었기 때문에, 상기 핵단백질 중의 NF-κB량은, 피험액의 농도가 높을수록 적어지는 것을 알았다. 이 결과로부터, 상기 정제물에 의해, 염증성 사이토카인의 일종인 NF-κB의 생산이 억제되는, 즉, 상기 정제물(식 (A1)로 표시되는 화합물, 식 (B1)로 표시되는 화합물, 식 (A2)로 표시되는 화합물 및 식 (B2)로 표시되는 화합물의 혼합물)이 항염증 효과를 갖는 것이 확인되었다. 또, 상기 정제물 대신, 식 (A1)로 표시되는 화합물, 식 (B1)로 표시되는 화합물, 식 (A2)로 표시되는 화합물 또는 식 (B2)로 표시되는 화합물을 이용하더라도 동등한 결과가 얻어졌다.

〔실시예 6〕

(1) 피험액의 조제

실시예 3에서의 「(1) 피험액의 조제」와 동일하게 하여 상기 정제물의 농도가 20000 ng/mL인 용액을 조제하고, 이것을 하기 조성의 배양액을 이용하여 단계적으로 희석함으로써, 2 ng/mL, 0.2 ng/mL 및 0.02 ng/mL인 총 3종류의 피험액을 얻었다. 또, 상기 3종류의 피험액은 세포에 첨가할 때 2배 희석되기 때문에, 상기 정제물의 최종 농도는 각각 1 ng/mL, 0.1 ng/mL 및 0.01 ng/mL이 된다.

[배양액의 조성]

RPMI1640 배지 500 mL

소태아 혈청 55.5 mL

황산카나마이신 0.11 mL

암피실린나트륨 0.134 mL

(2) 피험액의 첨가

마우스 마크로파지 세포(RAW264.7, ATCC)에 상기 배양액을 첨가하여, 상기 세포의 농도가 4×10⁵ 세포/mL가 되는 용액을 조제했다. 상기 용액을, 96 웰 평저 플레이트에 100 μL씩(즉, 4×10⁴ 세포/100 μL/웰)이 되도록 파종했다. 파종후, 37℃, 5% CO₂하에서, 상기 세포가 웰의 바닥에 접착하여 신전(伸展)할 때까지 2시간 배양했다. 다음으로, 상기 피험액을 각 웰에 100 μL씩 첨가했다. 상기 피험액의 첨가후, 37℃, 5% CO₂하에서 24시간 배양했다. 배양후, 각 웰의 배양 상청을 제거하고, 새롭게 상기 배양액 150 μL를 첨가하여(이하, 이 공정을 「배양액 첨가 공정」이라고 함), 37℃, 5% CO₂하에서 24시간 배양했다.

(3) TNF-α 농도의 측정

배양후, 각 웰의 배양 상청 50 μL를 회수하여 새로운 96 웰 평저 플레이트의 각 웰로 옮기고, 마우스 TNF-α 측정 키트(Biolegend사 제조)를 이용하여 흡광도를 측정하고, TNF-α 농도로 환산했다.

측정 결과를 도 6의 그래프에 나타낸다. 도 6에서, 종축은 TNF-α 농도를 나타내고, 횡축은 피험액의 농도를 나타낸다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 피험액의 농도가 높을수록 TNF-α 농도가 낮은 값이 되었기 때문에, TNF-α의 생산은, 피험액의 농도가 높을수록 적어지는 것을 알았다. 이 결과로부터, 상기 정제물에 의해, 염증성 사이토카인의 일종인 TNF-α의 생산이 억제되는, 즉, 상기 정제물(식 (A1)로 표시되는 화합물, 식 (B1)로 표시되는 화합물, 식 (A2)로 표시되는 화합물 및 식 (B2)로 표시되는 화합물의 혼합물)이 항염증 효과를 갖는 것이 확인되었다. 또, 상기 정제물 대신, 식 (A1)로 표시되는 화합물, 식 (B1)로 표시되는 화합물, 식 (A2)로 표시되는 화합물 또는 식 (B2)로 표시되는 화합물을 이용하더라도 동등한 결과가 얻어졌다.

〔실시예 7〕

본 예에서는, 이하의 2점 외에는 실시예 6과 동일하게 실험하여, 각 웰의 배양 상청 50 μL를 회수하여 TNF-α 농도를 측정했다. 즉, 본 예에서는, 피험액으로서, 상기 정제물의 농도가 20 μg/mL, 2 μg/mL, 200 ng/mL, 20 ng/mL 및 2 ng/mL인 총 5종류의 피험액을 이용했다. 또, 상기 5종류의 피험액은 세포에 첨가할 때 2배 희석되기 때문에, 상기 정제물의 최종 농도는 각각 10 μg/mL, 1 μg/mL, 100 ng/mL, 10 ng/mL 및 1 ng/mL가 된다. 또한, 본 예에서는, 실시예 5에서의 상기 배양액 첨가 공정에서, 상기 배양액 150 μL 대신, 최종 농도 100 ng/mL의 LPSp를 포함하는 상기 배양액 150 μL를 첨가했다.

측정 결과를 도 7의 그래프에 나타낸다. 도 7에서, 종축은 TNF-α 농도를 나타내고, 횡축은 피험액의 농도를 나타낸다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 피험액의 농도가 높을수록 TNF-α 농도가 낮은 값이 되었기 때문에, TNF-α의 생산은 피험액의 농도가 높을수록 적어지는 것을 알았다. 이 결과로부터, 상기 정제물에 의해, 염증성 사이토카인의 일종인 TNF-α의 생산이 억제되는, 즉, 상기 정제물(식 (A1)로 표시되는 화합물, 식 (B1)로 표시되는 화합물, 식 (A2)로 표시되는 화합물 및 식 (B2)로 표시되는 화합물의 혼합물)이 항염증 효과를 갖는 것이 확인되었다. 또, 상기 정제물 대신, 식 (A1)로 표시되는 화합물, 식 (B1)로 표시되는 화합물, 식 (A2)로 표시되는 화합물 또는 식 (B2)로 표시되는 화합물을 이용하더라도 동등한 결과가 얻어졌다.

〔실시예 8〕

〔실시예 8-1〕

(1) 피험액의 조제

실시예 3에서의 「(1) 피험액의 조제」와 동일하게 하여 상기 정제물의 농도가 20000 ng/mL의 용액을 조제하고, 이것을 하기 조성의 배양액을 이용하여 단계적으로 희석함으로써, 400 ng/mL, 4000 ng/mL 및 40000 ng/mL인 총 3종류의 피험액을 얻었다. 또, 상기 3종류의 피험액은 세포에 첨가할 때 4배 희석되기 때문에, 상기 정제물의 최종 농도는 각각 100 ng/mL, 1000 ng/mL 및 10000 ng/mL가 된다.

[배양액의 조성]

RPMI1640 배지 500 mL

비동화 소태아 혈청 55.5 mL

페니실린-스트렙토마이신-글루타민(100×) 5.6 mL

(2) 피험액의 첨가

인간 말초혈 단구 유래 세포(THP-1, DS 파마 바이오메디컬(주) 제조)에 상기 배양액을 첨가하여, 상기 세포의 농도가 4×10⁵ 세포/mL가 되는 용액을 조제했다. 상기 용액을 24 웰 플레이트에 500 μL씩(즉, 2.0×10⁵ 세포/500 μL/웰)이 되도록 파종했다. 파종후, 상기 배양액 250 μL 또는 40 ㎛ol/L의 GW9662(와코준야쿠 공업(주) 제조)를 함유하는 상기 배양액 250 μL를 각 웰에 첨가했다. 또, 상기 GW9662는, 핵내 수용체의 일종인 PPARγ(퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 γ)의 저해제이다. 첨가후, 37℃, 5% CO₂하에서 1시간 배양했다. 그 후, 상기 피험액을 각 웰에 250 μL씩 첨가하여, 37℃, 5% CO₂하에서 22시간 배양했다. 배양후, 각 웰의 배양 상청을 2 mL 튜브에 회수했다. 또한, 각 웰에 새로운 상기 배양액 0.5 mL를 첨가하여 웰 전체에 골고루 퍼지게 하고, 상기 2 mL 튜브에 회수했다. 비어 있는 각 웰에는, 새로운 상기 배양액 0.49 mL를 첨가해 두었다. 상기 2 mL 튜브에 회수한 상기 배양액을, 1000 rpm, 5분의 조건으로 원심 분리하여 상청을 제거하고, 또한, 새로운 상기 배양액 1 mL를 첨가하여 현탁하고, 다시 동일한 조건으로 원심 분리했다. 원심 분리후 상청을 제거하고, 각 웰 중의 0.49 mL의 배양액을 상기 2 mL 튜브에 첨가하여 현탁하고, 각 웰에 다시 복귀시켰다. 그리고, 각 웰에, 배양액 250 μL 또는 40 ㎛ol/L의 상기 GW9662를 함유하는 배양액 250 μL를 첨가하여, 37℃, 5% CO₂하에서 1시간 배양했다. 배양후, 각 웰에 대하여, 상기 LPSp의 최종 농도가 100 ng/mL가 되도록, LPSp을 포함하는 배양액 250 μL를 첨가하여, 37℃, 5% CO₂하에서 22시간 배양했다.

(3) IL-8의 농도의 측정

배양후, 각 웰의 배양 상청을 튜브에 회수하여 원심 분리하여 상청을 1.5 mL 튜브에 회수하고, Human IL-6 ELISA MAX Deluxe(Biolegend사)를 이용하여 흡광도를 측정하고, 인터류킨 6(Interleukin6 : IL-6)의 농도를 환산했다.

측정 결과를 도 8의 그래프에 나타낸다. 도 8에서, 종축은 IL-6의 농도를 나타내고, 횡축은 피험액의 농도를 나타낸다. 도 8에 나타낸 바와 같이, GW9662-의 경우, 즉, PPARγ이 저해되지 않았을 때에는, 피험액의 농도가 높을수록 IL-6 농도가 낮은 값이 되었기 때문에, IL-6의 생산은, 피험액의 농도가 높을수록 적어지는 것을 알았다. 이것에 대하여, GW9662+의 경우, 즉, PPARγ이 저해되어 있을 때에도, 피험액의 농도가 높을수록 IL-6 농도가 낮은 값이 되었기 때문에, IL-6의 생산은, 피험액의 농도가 높을수록 적어지는 것이 알았지만, 그 감소의 정도는 PPARγ이 저해되지 않았을 때만큼 현저하지 않았다. 이 결과로부터, 상기 정제물에 의해, 염증성 사이토카인의 일종인 IL-6의 생산이 억제되는, 즉, 상기 정제물(식 (A1)로 표시되는 화합물, 식 (B1)로 표시되는 화합물, 식 (A2)로 표시되는 화합물 및 식 (B2)로 표시되는 화합물의 혼합물)이 항염증 효과를 갖는 것이 확인되었다. 또한, 상기 정제물(식 (A1)로 표시되는 화합물, 식 (B1)로 표시되는 화합물, 식 (A2)로 표시되는 화합물 및 식 (B2)로 표시되는 화합물의 혼합물)에 의한 IL-6의 생산 억제에는, PPARγ이 관여하고 있는 것이 시사되었다. 또, 상기 정제물 대신, 식 (A1)로 표시되는 화합물, 식 (B1)로 표시되는 화합물, 식 (A2)로 표시되는 화합물 또는 식 (B2)로 표시되는 화합물을 이용하더라도 동등한 결과가 얻어졌다.

〔실시예 8-2〕

식 (A1)로 표시되는 화합물, 식 (B1)로 표시되는 화합물, 식 (A2)로 표시되는 화합물 및 식 (B2)로 표시되는 화합물이 PPARγ 유전자의 발현을 촉진하는 것을, 이화학 연구소가 개발한 CAGE(유전자 발현의 캡 분석)법에 의해 확인했다.

상기 THP-1 세포에 실시예 8-1(2)와 동일한 배양액을 첨가하여, 상기 세포의 농도가 5×10⁵ 세포/mL가 되는 용액을 조제했다. 이 용액의 PPARγ 유전자의 발현량을 상기 CAGE법에 의해 측정한 바, 3.97 TPM(Tags Per Million)이었다. 상기 측정후, 이 세포 용액을 다음의 4군으로 나누었다. 즉, 상기 세포 용액에 최종 농도 1 μg/mL가 되도록 상기 정제물의 용액을 첨가한 군(실시예 8-2A), 상기 세포 용액에 최종 농도 10 μg/mL가 되도록 상기 정제물의 용액을 첨가한 군(실시예 8-2B), 상기 세포 용액에 아무것도 첨가하지 않은 군(비교예 8-2A) 및 상기 세포 용액에 100 ng/mL가 되도록 LPSp 용액을 첨가한 군(비교예 8-2B)의 총 4군이다. 상기 4군을 3시간 배양후, 상기 CAGE법에 의해 PPARγ 유전자의 발현량을 측정했다. 이 결과를 도 27에 나타낸다. 도 27은, PPARγ 유전자의 발현량을 나타내는 그래프이다. 도 27에서, 횡축은 배양 시간을 나타내고, 종축은 PPARγ 유전자의 발현량(TPM)을 나타낸다. 도 27에 나타낸 바와 같이, 실시예 8-2A에서는, 3시간 동안에 PPARγ 유전자의 발현량이 3.97 TPM으로부터 5.86 TPM으로 대폭 증가하고, 실시예 8-2B에서도, 3시간 동안에 PPARγ 유전자의 발현량이 3.97 TPM으로부터 5.90 TPM으로 대폭 증가했다. 이것에 대하여, 비교예 8-2A에서는, 3시간 동안에 PPARγ 유전자의 발현량이 3.97 TPM으로부터 3.89 TPM으로 약간 감소하고, 비교예 8-2B에서는, 3시간 동안에 PPARγ 유전자의 발현량이 3.97 TPM으로부터 4.31 TPM으로 증가했지만, 증가의 정도는 현저하지 않았다. 이 결과로부터, 상기 정제물(식 (A1)로 표시되는 화합물, 식 (B1)로 표시되는 화합물, 식 (A2)로 표시되는 화합물 및 식 (B2)로 표시되는 화합물의 혼합물)이 PPARγ 유전자의 발현을 촉진하는 것이 확인되었다. 또, 상기 정제물 대신, 식 (A1)로 표시되는 화합물, 식 (B1)로 표시되는 화합물, 식 (A2)로 표시되는 화합물 또는 식 (B2)로 표시되는 화합물을 이용하더라도 동등한 결과가 얻어졌다.

〔실시예 9〕

식 (A1)로 표시되는 화합물, 식 (B1)로 표시되는 화합물, 식 (A2)로 표시되는 화합물 및 식 (B2)로 표시되는 화합물이 폐암에 대한 항암 효과를 갖는 것을 확인했다.

(1) 담암 마우스의 제작

루이스 폐암 유래 세포주(루이스 폐암종 : 3LL, JCRB 세포 뱅크로부터 입수)의 현탁액을, 1 마리당의 암세포 투여량이 2.5×10⁵ 세포/200 μL가 되도록, 6 주령의 수컷 C57 BL/6J 마우스 5 마리의 배 측부에 피하 투여했다. 투여로부터 2주후, 상기 마우스 1 마리로부터 종양을 적출하여, 디쉬 위에서 PBS(-)를 이용하여 세정했다. 다음으로, 세정한 상기 종양을 사방 2 mm 정도로 잘게 썰어 종양 단편으로 하고, 상기 종양 단편을 50 mL 튜브로 옮겨 콜라게나제액 5 mL를 첨가하고, 37℃에서 10분 따뜻하게 했다. 그 후, 상기 종양 단편을 포함하는 콜라게나제액을 피펫팅함으로써 더욱 작은 종양 단편으로 하고, 상기 종양 단편을 포함하는 콜라게나제액을 별도의 50 mL 튜브로 옮겨 빙상에서 냉각시켰다. 냉각후, 상기 종양 단편을 포함하는 콜라게나제액에 콜라게나제액 5 mL를 더 첨가하고, 동일한 조작을, 종양 단편을 관찰할 수 없게 될 때까지 5회 반복했다. 그 후, 상기 종양 단편을 포함하는 콜라게나제액을 셀 스트레이너(메쉬 사이즈 70 ㎛, BD사 제조)로 여과하고, 여과액을 1200 rpm, 7분의 조건으로 원심 분리했다. 원심 분리후 상청을 제거하고, 침전에 RPMI1260 배지(혈청 무첨가) 20 mL를 첨가하여 전도 혼화에 의해 현탁한 후, 1200 rpm, 7분의 조건으로 원심 분리했다. 원심 분리후 상청을 제거하고, 침전에 PBS(-)를 첨가하여 2회 세정한 후, PBS(-) 10 mL를 첨가하고 현탁하여 암세포 현탁액을 조제했다. 상기 암세포 현탁액을, 1 마리당의 암세포 투여량이 2.5×10⁵ 세포/200 μL가 되도록, 상기 마우스 12 마리의 배 측부에 피하 투여했다. 투여로부터 14일후, 상기 마우스 10 마리로부터 종양을 적출하여, 전술한 것과 동일한 방법으로 암세포 현탁액을 조제했다. 상기 암세포 현탁액을, 1 마리당의 암세포 투여량이 2.5×10⁵ 세포/50 μL가 되도록, 상기 마우스 108 마리의 복부 피내에 투여했다. 투여후, 각 마우스의 종양 사이즈가 직경 5 mm 정도가 된 시점(투여후 8일째)에서, 마우스를 하기에 나타내는 6군(각 군 n=6)으로 나누었다.

ip=복강내 투여

po=자유 섭취

CY=시클로포스파미드(항암제)

(2) 약제의 투여

군을 나눈 후에, 각 군에 상기 표 5에 나타내는 물질을 투여했다. 상기 정제물의 투여는, 실시예 9-1 및 실시예 9-2의 복강내 투여(ip)에서는, 마우스에서의 상기 정제물의 섭취량이 0.5 mg/10 mL/kg이 되도록 군을 나눈 직후에 1회 행하고, 실시예 9-3 및 실시예 9-4의 자유 섭취(po)의 경우는, 상기 정제물의 농도가 1 μg/mL인 용액이 들어간 급수병을 이용하여, 군을 나눈 직후부터 시작했다. 또, 급수병은 3일마다 새로운 것으로 교환했다. 비교예 9-1의 생리식염수의 투여는, ip에 의해, 마우스의 생리식염수 섭취량이 10 mL/kg이 되도록, 군으로 나눈 직후에 1회 행했다. 실시예 9-2, 실시예 9-4 및 참고예 9-1에서의 CY(시클로포스파미드, 폐암에 대한 항암제, 와코준야쿠 공업(주) 제조)의 투여는, ip에 의해, 마우스의 CY 섭취량이 100 mg/10 mL/kg이 되도록, 군으로 나눈 직후에 1회 행했다.

(3) 종양 체적의 계측

군으로 나눈 날을 0일째로 하여, 3일째, 6일째 및 9일째에, 캘리퍼스를 이용하여 종양의 장직경 및 단직경을 측정하고, 그것을 기초로 종양 체적을 산출했다. 종양 체적의 산출은, Shime 등(Shime H, et al, "Toll-like receptor 3 signaling converts tumor-supporting myeloid cells to tumoricidal effectors", Proc Natl Acad Sci USA, February 7, 2012, Vol.109, no.6, p.2066-2071)에 기재된 방법에 따라서, 계산식 : 장직경(mm)×단직경(mm)²×0.4=종양 체적(㎣)에 의해 행했다.

계측 결과를 도 9의 그래프에 나타낸다. 도 9에서, 종축은 종양 체적(㎣)을 나타내고, 횡축은 군으로 나눈 날을 0일째로 했을 때의 군으로 나눈 후의 경과일수를 나타낸다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 상기 정제물을 투여한 실시예 9-1 및 실시예 9-2에서는, 생리식염수를 투여한 비교예 9-1과 비교하여 종양 체적이 작았다. 이것으로부터, 상기 정제물(식 (A1)로 표시되는 화합물, 식 (B1)로 표시되는 화합물, 식 (A2)로 표시되는 화합물 및 식 (B2)로 표시되는 화합물의 혼합물)은 폐암에 대한 항암 효과를 갖는 것이 확인되었다. 또한, 상기 정제물에 더하여, CY를 투여한 실시예 9-2 및 실시예 9-4에서는, CY만을 투여한 참고예 9-1과 비교하여 종양 체적이 작았다. 이것으로부터, 상기 정제물(식 (A1)로 표시되는 화합물, 식 (B1)로 표시되는 화합물, 식 (A2)로 표시되는 화합물 및 식 (B2)로 표시되는 화합물의 혼합물)은 CY의 폐암에 대한 항암 효과를 증강하는 효과를 갖는 것이 확인되었다. 또, 상기 정제물 대신, 식 (A1)로 표시되는 화합물, 식 (B1)로 표시되는 화합물, 식 (A2)로 표시되는 화합물 또는 식 (B2)로 표시되는 화합물을 이용하더라도 동등한 결과가 얻어졌다.

이상, 실시형태 및 실시예를 참조하여 본 발명을 설명했지만, 본 발명은 상기 실시형태 및 실시예에 한정되는 것이 아니다. 본 발명의 구성이나 상세에는, 본 발명의 범위 내에서 당업자가 이해할 수 있는 여러가지 변경을 할 수 있다.

이 출원은, 2016년 9월 23일에 출원된 일본 특허 출원 2016-186116 및 2016년 12월 8일에 출원된 일본 특허 출원 2016-238863을 기초로 하는 우선권을 주장하고, 그 개시가 모두 여기에 포함된다.

이상과 같이, 본 발명의 화합물 또는 그 염은, 항염증제 및 폐암에 대한 항암제 등으로서 사용 가능한 것이다. 본 발명의 화합물 또는 그 염은, 안전성이 높기 때문에 장기간에 걸쳐 투여할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> TFK Co.,Ltd. <120> Compounds or salt thereof, anti-inflammatory agent, anti-cancer agent against lung cancer, method of producing compound or salts thereof,method of treating inflammatory diseases and method of treating lung cancer <130> TF16007WO <150> JP 2016-186116 <151> 2016-09-23 <150> JP 2016-186116 <151> 2016-09-23 <160> 9 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1427 <212> DNA <213> Rhodobacter azotoformans <400> 1 gagtttgatc ctggctcaga atgaacgctg gcggcaggcc taacacatgc aagtcgagcg 60 aagtcttcgg acttagcggc ggacgggtga gtaacgcgtg ggaacatgcc caaaggtacg 120 gaatagcccc gggaaactgg gagtaatacc gtatgtgccc ttcgggggaa agatttatcg 180 cctttggatt ggcccgcgtt ggattaggta gttggtgggg taatggccta ccaagccgac 240 gatccatagc tggtttgaga ggatgatcag ccacactggg actgagacac ggcccagact 300 cctacgggag gcagcagtgg ggaatcttag acaatgggcg caagcctgat ctagccatgc 360 cgcgtgatcg atgaaggcct tagggttgta aagatctttc aggtgggaag ataatgacgg 420 taccaccaga agaagccccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggagggggc 480 tagcgttatt cggaattact gggcgtaaag cgcacgtagg cggactggaa agtcaggggt 540 gaaatcccgg ggctcaaccc cggaactgcc tttgaaactc ccagtcttga ggtcgagaga 600 ggtgagtgga attccgagtg tagaggtgaa attcgtagat attcggagga acaccagtgg 660 cgaaggcggc tcactggctc gatactgacg ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag 720 gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgaatg ccagtcgtcg ggcagcatgc 780 tgttcggtga cacacctaac ggattaagca ttccgcctgg ggagtacggc cgcaaggtta 840 aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag 900 caacgcgcag aaccttacca acccttgaca tggcgatcgc ggttccagag atggttcctt 960 cagttcggct ggatcgcaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1020 ttcggttaag tccggcaacg agcgcaaccc acgtcctcag ttgccagcat tcagttgggc 1080 actctgggga aactgccggt gataagccgg aggaaggtgt ggatgacgtc aagtcctcat 1140 ggcccttacg ggttgggcta cacacgtgct acaatggcag tgacaatggg ttaatcccaa 1200 aaagctgtct cagttcggat tggggtctgc aactcgaccc catgaagtcg gaatcgctag 1260 taatcgcgta acagcatgac gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1320 acaccatggg aattggttct acccgaaggc ggtgcgccaa cctcgcaaga ggaggcagcc 1380 gaccacggta ggatcagtga ctggggtgaa gtcgtaacaa ggtagcc 1427 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a primer <400> 2 gagtttgatc ctggctcag 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a primer <400> 3 ctcctacggg aggcagcag 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a primer <400> 4 ggattagata ccctggtagt c 21 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a primer <400> 5 gcaacgagcg caaccc 16 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a primer <400> 6 gtattaccgc ggctgctg 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a primer <400> 7 taccagggta tctaatcc 18 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a primer <400> 8 ccattgtagc acgtgt 16 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a primer <400> 9 aaggaggtga tccagcc 17

Claims

식 (A) 또는 식 (B)로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그 염.

식 (A) 및 식 (B)에 있어서,
X¹은 헥소스 또는 수산기이며,
X²는 인산기 또는 수산기이다.
제1항에 기재된 화합물 또는 그 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 항염증제.
제1항에 기재된 화합물 또는 그 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 폐암에 대한 항암제.
로도박터 아조토포르만스(Rhodobacter azotoformans) BP0899주(수탁번호 NITE BP-644) 및 그 배양물 중 적어도 하나로부터, 식 (A) 또는 식 (B)로 표시되는 화합물 또는 그 염을 포함하는 조추출액을 추출하는 조추출 공정과,
상기 조추출액으로부터 식 (A) 또는 식 (B)로 표시되는 화합물 또는 그 염을 단리하는 정제 공정
을 포함하는 것을 특징으로 하는 식 (A) 또는 식 (B)로 표시되는 화합물 또는 그 염의 제조 방법.

식 (A) 및 식 (B)에 있어서,
X¹은 헥소스 또는 수산기이며,
X²는 인산기 또는 수산기이다.
제4항에 있어서, 상기 조추출 공정에서의 추출 처리가 단백질을 불용화하는 유기 용매에 의한 추출 처리인 제조 방법.
제5항에 있어서, 상기 유기 용매가 페놀인 제조 방법.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조추출 공정에서, 상기 추출 처리 전에, 로도박터 아조토포르만스(Rhodobacter azotoformans) BP0899주(수탁번호 NITE BP-644) 및 그 배양물 중 적어도 하나에 대해 색소의 탈색 처리를 행하는 제조 방법.
제7항에 있어서, 상기 색소의 탈색 처리가 아세톤, 메탄올 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나에 의한 탈색 처리인 제조 방법.
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조추출 공정에서, 상기 조추출액에 대해 여과 처리를 행하는 제조 방법.
제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제 공정에서, 상기 조추출액에 대해, 효소 처리와, 단백질을 불용화하는 유기 용매에 의한 추출 처리를 행하는 제조 방법.
제10항에 있어서, 상기 효소 처리가 핵산 분해 효소 및 단백질 분해 효소 중 적어도 하나에 의한 효소 처리인 제조 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 유기 용매가 페놀인 제조 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제 공정에서, 상기 추출 처리 후의 추출액에 대해 여과 처리를 행하는 제조 방법.
염증성 질환의 치료 방법으로서,
제1항에 기재된 화합물 또는 그 염을 포함하는 항염증제를 투여하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
폐암의 치료 방법으로서,
제1항에 기재된 화합물 또는 그 염을 포함하는 폐암에 대한 항암제를 투여하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.