CN113597318A

CN113597318A - 治疗性纳米缀合物及其用途

Info

Publication number: CN113597318A
Application number: CN202080021560.9A
Authority: CN
Inventors: A·维拉维德科拉莱斯; E·威克斯格梅兹; U·尤祖艾塔艾洛尔扎; R·玛古艾斯巴法伊; M·V·塞斯佩德斯纳瓦罗; I·卡萨诺瓦里加特; H·洛佩茨拉古纳
Original assignee: Federation Of Biotechnology Network Research Centers; St Paul's Hospital Foundation; Universitat Autonoma de Barcelona UAB
Current assignee: Federation Of Biotechnology Network Research Centers; St Paul's Hospital Foundation; Universitat Autonoma de Barcelona UAB
Priority date: 2019-01-17
Filing date: 2020-01-16
Publication date: 2021-11-02
Also published as: WO2020148398A8; EP3911367A1; WO2020148398A1; US20220072084A1

Abstract

本发明涉及纳米结构的缀合物，更具体地涉及适于将其经缀合的治疗剂选择性递送至特定细胞和组织类型的纳米结构的融合蛋白。本发明还涉及包含此类纳米结构的蛋白的纳米颗粒及其治疗用途。

Description

治疗性纳米缀合物及其用途

技术领域

本发明涉及纳米结构蛋白材料领域，更具体地涉及可用于治疗的携带治疗剂的融合蛋白。

背景技术

当与游离分子相比时，以纳米缀合物形式的药物的全身给予受益于增强的药物稳定性。通过在纳米级载体中化学并入官能团，还可以将有价值的其它性质(如细胞靶向性)合并到给定的杂化复合材料中，从而从纳米材料的高表面积/体积比中获利。当全身给予时，在肺或其它高度血管化的器官中，在没有聚集的情况下，所得的尺寸在约8至100nm之间的载有药物的缀合物从肾过滤中逃逸。这一事实，与材料的适当的理化性质相结合，可能会导致循环时间延长和药物对靶器官的暴露时间延长，从而增强治疗效果并为患者带来益处。

在包括金属、陶瓷、聚合物和碳纳米管的作为药物载体被研究材料的多样性中，蛋白质在生物相容性和可降解性方面提供了独特的性质，在日益增加的纳米毒理学问题的背景下，这种性质使蛋白质特别具有吸引力。随着蛋白质自组装到纳米结构材料的工程的迅速发展，且对最终的几何结构和物化性质的控制变得更加严格，作为化学偶联药物的载体，蛋白质材料逐渐获得了功能上和结构上的多用性。

实际上，已显示：细胞毒性“有效负载”附着于抗体以形成抗体-药物缀合物(ADC)提供了通过抗体与癌症选择性细胞表面分子的特异性结合，将细胞毒性剂选择性递送至癌细胞的机制。该策略的多个实例已被证明是有效的，像吉妥单抗(gemtuzumabozogamicin)，其包括与高效力靶向DNA的抗生素——用于对抗急性髓性白血病的卡奇霉素(calicheamicin)缀合的抗CD33抗体。此外，美登木素生物碱(maytansinoids)——一种高效力微管破坏剂，作为ADC的有效负载已进行了测试，从而产生用于治疗HER2阳性乳腺癌的制剂曲妥珠单抗-美坦新偶联物(阿多曲妥珠单抗，ado-trastuzumab emtansine)。

然而，就成本与合成而言，抗体的结构复杂性可能成为繁琐的障碍。发明人先前通过应用基于在核心蛋白上添加阳离子N末端结构域和C末端聚组氨酸的纳米构造原理来探究纳米医学领域。[Serna，N.等人2016.Nanomedicine，12∶1241-51]。在本领域中已有描述：这些末端标签和整个融合过程中产生的电荷平衡促进了单体蛋白自组装和低聚化为稳健的环形纳米颗粒，在血浆中是稳定的[Cespedes，M.V.等人2014.ACS Nano.，8∶4166-4176]，并且如若具有细胞靶向肽的能力，则会具有高细胞渗透性。[Xu，Z.K.等人2015.MaterialsLetters，154∶140-3]这些蛋白质结构的构建单元(building blocks)也可以包含形式为具有模块化组织的融合延伸的功能肽，如细胞靶向剂、内吞体裂解剂(endosomolyticagents)或核定位信号。

由于当前的治疗方法仍然显示出失败的余地，主要是由于肿瘤抵抗现象，这可能例如是肿瘤内克隆选择那些对化疗最有抗性的细胞所致，因此本领域仍需开发更具特异性的治疗方法，这种方法可以靶向导致治疗失败和肿瘤进展的具体的肿瘤细胞，同时减少治疗剂的副作用和脱靶作用。

发明内容

在第一方面，本发明涉及融合蛋白，其包含

(i)聚阳离子肽，

(ii)间插多肽(invervening polypeptide)区域，其为Stefin A或其变体，和

(iii)富含带正电荷的氨基酸的区域，

其中间插多肽区域与至少一种澳瑞他汀(Auristatin)分子缀合。

在其它方面中，本发明涉及制备第一方面的融合蛋白的方法、涉及制备包含多拷贝的根据本发明第一方面的融合蛋白的纳米颗粒的方法、涉及包含多拷贝的本发明的融合蛋白的纳米颗粒、或通过本发明的制备多种纳米颗粒的方法所获得的纳米颗粒。

本发明还涉及用于医药的根据本发明的融合蛋白或纳米颗粒。

在最后的方面中，本发明涉及用于治疗癌症的根据本发明的融合蛋白或纳米颗粒。

附图说明

图1.在比较T22-STM-Aur和T22-GFP-Aur的抗肿瘤活性的体内测定中生物发光随时间的演变。两种纳米缀合物均有效，但T22-STM-Aur组的抗肿瘤活性更高。

图2：被白血病细胞浸润的器官(肝(A)、脾(B)和骨髓(C))中离体生物发光的平均水平。

图3：在静脉内给予200μg T22-STM-H6-Aur(澳瑞他汀与蛋白质纳米颗粒T22-STM-H6缀合)后2h、5h或24小时，通过对M5皮下肿瘤的十个苏木精&伊红染色区域计数，与在给予200μg未缀合的蛋白质纳米载体T22-GFP-H6或对照缓冲液后于相同时间点的有丝分裂崩溃(mitotic catastrophe)象的细胞数量相比，有丝分裂崩溃的细胞数量显著增加。M5皮下CRC模型是从结直肠癌患者样品，在瑞士裸鼠中生成的。*p＜0，05。

图4：在皮下结直肠癌模型中给予T22-STM-H6-Aur纳米缀合物后有丝分裂崩溃增加。在静脉内给予200μg T22-STM-H6-Aur(澳瑞他汀与蛋白质纳米颗粒T22-STM-H6缀合)后2h、5h或24小时，通过对M5皮下肿瘤的十个苏木精&伊红染色区域计数，与在给予200μg未缀合的蛋白质纳米载体T22-GFP-H6或对照缓冲液后于相同时间点的有丝分裂崩溃象的数量相比，处于有丝分裂崩溃的细胞数量显著增加。M5皮下CRC模型是从结直肠癌患者样品，在瑞士裸鼠中生成的。*p＜0，05。

图5：在皮下结直肠癌模型中给予T22-GFP-H6-Aur纳米缀合物后有丝分裂崩溃增加。在i.v.给予326μg T22-GFP-H6-Aur(澳瑞他汀与蛋白质纳米颗粒T22-GFP-H6缀合)后2h、5h或24小时，通过对M5皮下肿瘤的五个H&E染色区域计数，与在给予326μg未缀合的蛋白质纳米载体T22-GFP-H6或对照缓冲液后于相同时间点的有丝分裂崩溃象的数量相比，有丝分裂崩溃的细胞数量显著增加。M5皮下CRC模型是从结直肠癌患者样品，在瑞士裸鼠中生成的。*p＜0，05。

具体实施方式

本发明人通过使用融合蛋白测试了纳米结构蛋白结构背后的原理，融合蛋白包括具有细胞选择性作用的聚阳离子肽和没有固有生理或生物活性的蛋白质。融合蛋白随后与治疗剂缀合，发明人观察到，令人惊讶的是，融合蛋白用作治疗剂的有效靶选择性递送系统。

本发明的融合蛋白

因此，在第一方面，本发明涉及融合蛋白，其包含

(i)聚阳离子肽，

(ii)间插多肽区域，其为Stefin A或其变体，和

(iii)富含带正电荷的氨基酸的区域，

其中间插多肽区域与至少一种澳瑞他汀分子缀合。

术语“融合蛋白”在本领域中是公知的，是指人工设计的单条多肽链，其包含来自不同来源的天然和/或人工的两个或更多个序列。按照定义，融合蛋白从未在自然界中发现过。

如本文所用的，术语“单条多肽链”是指融合蛋白的多肽组分可以端对端地缀合，也可以包括插入其间的由共价键连接的一个或多个任选的肽或多肽“连接体”或“间隔区”。

如本文所用的，术语“肽”或“多肽”通常是指通过肽键连接在一起的约2至40个氨基酸残基的线性链。应该理解，术语“肽键”、“肽”、“多肽”和蛋白质是本领域技术人员已知的。从这里开始，将不作区分地使用“肽”和“多肽”。

如本文所用，“氨基酸残基”是指本领域已知的任何天然存在的氨基酸、任何氨基酸衍生物或任何氨基酸模拟物。在某些实施方式中，蛋白质或肽的残基是连续的，没有任何非氨基酸中断氨基酸残基的序列。在其它实施方式中，序列可以包含一个或多个非氨基酸部分。在具体实施方式中，蛋白质或肽的残基的序列可以被一个或多个非氨基酸部分中断。

如本文所用的，术语“缀合物”是指由两种或更多种单独化合物的共价连接产生的任何化合物。在本发明中，缀合物是指共价偶联的间插多肽区域和至少一种治疗剂，为所述直接偶联或通过连接化合物进行偶联。

术语“共价偶联”或“共价连接”是指多肽区域和至少一种治疗剂通过化学共价键彼此直接共价连接，或者另外通过一个或多个间插部分——如连接体、或桥、或间隔区、部分或多个部分——彼此间接地共价连接。

A.聚阳离子肽

如本文所用的，术语“聚阳离子肽”或“第一富含带正电荷的氨基酸的区域”对应于包含多个带正电荷的氨基酸的多肽序列。聚阳离子肽可以仅由带正电荷的氨基酸形成，或者可以包含其它氨基酸，前提是此区域的总净电荷在pH 7下为正。

本领域公知，氨基酸及其对应的氨基酸残基根据其侧链而具有不同的性质，并且可以根据那些性质进行分组。因此，在生理pH下，五种氨基酸显示出电荷：精氨酸、组氨酸、和赖氨酸带正电，而天冬氨酸和谷氨酸带负电。然后，本领域技术人员将认识到，本发明的聚阳离子肽对应于在生理pH条件下具有多于一个正电荷的净电荷的多肽。因此，本发明的聚阳离子肽不受存在一个或多个带负电荷的氨基酸残基的限制，只要总有足够的带正电荷的氨基酸残基产生两个或更多个净正电荷即可。

因此，在本发明的一个实施方式中，本发明的聚阳离子肽选自：

(i)富含精氨酸的序列，

(ii)能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进融合蛋白在所述细胞上的内化的序列，

(iii)GW-H1肽，

(iv)CD44配体，

(v)能够穿过血脑屏障的肽，

(vi)细胞穿透肽，和

(vii)核仁素(核仁蛋白，nucleolin)结合肽。

(i)富含精氨酸的序列

如上所述，精氨酸氨基酸及其残基在生理pH下呈现正电荷。应当理解，“富含精氨酸的序列”是指含有多个精氨酸残基的多肽序列。因此，多肽序列可以包含其完整序列的33％，优选40％、优选45％、优选50％、优选55％、优选60％、优选65％、优选70％、优选75％、优选80％、优选85％、更优选90％、更优选95％、甚至更优选99％、再甚至更优选100％的氨基酸残基为精氨酸残基。将理解的是，无论何时富含精氨酸的序列的序列包含少于100％的该序列作为精氨酸残基时，这些残基都无需相对于彼此是相邻的或连续的。

本领域技术人员将认识到，具有一个或多个精氨酸残基的多肽将是聚阳离子肽，只要该多肽在生理pH下的总正电荷为2或更高，不仅是精氨酸残基的正电荷所致，而且也是任何其它带正电荷的氨基酸所致。

在本发明的实施方式中，本发明的聚阳离子肽是富含精氨酸的序列。

在本发明的优选实施方式中，本发明的聚阳离子肽的富含精氨酸的序列选自SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

(ii)能够与维胞表面上的受体特异性相互作用并促进融合蛋白在所述细胞上的内化的序列

如本文所用的，术语“能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进融合蛋白在所述细胞上的内化的序列”是指与细胞表面上的受体结合的任何多肽序列，其中所述受体响应于所述多肽序列的结合而经历胞吞作用。这种结合特异性允许多肽序列以及作为其部分的融合蛋白的其余部分递送到表达所述受体的细胞、组织或器官。以这种方式，当向动物给予或与不同类型的细胞群体进行体外接触时，包含所述多肽序列的融合蛋白将特异性导向至所述细胞。

术语“受体”表示与被称为“配体”的生物活性分子结合的细胞相关蛋白。“受体”和“配体”都是本领域技术人员通常已知的。

如本文所用，“内化”是指分子或包含分子的构建物结合至细胞膜外表面上的靶元件并且所得的复合物被细胞内化的过程。内化可以通过在细胞质内将所得的复合物进行解离来进行。然后，靶元件连同分子或构建物可定位于特定的细胞区室。优选地，本发明的聚阳离子肽，除了促进内化之外，还将促进融合蛋白的内体逃逸。

广泛的摄取受体和载体——具有甚至更广泛数量的受体特异性配体——是本领域已知的。

可以被本发明的聚阳离子靶向的受体的非限制性实例包括血管紧张素受体、蛙皮素受体、缓激肽受体、降钙素受体、趋化因子受体、胆囊收缩素受体、促肾上腺皮质激素释放因子受体、内皮素受体、麻黄素受体、甲酰基肽受体、卷曲受体(Frizzled receptor)、甘丙肽受体、生长激素促分泌素受体(饥饿激素)受体、亲吻素(Kisspeptin)受体、黑皮质素受体、神经肽FF受体/神经肽AF受体、神经肽S受体、神经肽W/神经肽B受体、神经肽Y受体、神经降压素受体、食欲肽受体、肽P518受体、生长抑素受体、速激肽受体、Toll样受体、血管加压素和催产素受体以及VEGF受体。

在本发明的优选实施方式中，包含能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进融合蛋白在所述细胞上的内化的序列的聚阳离子肽是CXCR4配体。

如本文所用的，术语“CXCR4”是指G蛋白偶联的七重跨膜趋化因子受体。像其它趋化因子受体一样，CXCR4通过介导白细胞的定向迁移和活化，在免疫和炎性反应中起重要作用。CXCR4在各种癌细胞系和组织中表达或过表达，包括乳腺、前列腺、肺、卵巢、结肠、胰、肾、和脑，以及非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。CXCR4唯一已知的配体是基质细胞衍生因子1(SDF-1，或CXCL12)。CXCR4和SDF-1之间的相互作用在肿瘤发生的多个阶段——包括肿瘤生长、侵袭、血管生成、和转移——中起重要作用。

如本文所用的，表述“特异性结合CXCR4”是指本发明的缀合物与CXCR4或表达CXCR4的细胞以比其与基本上不与其它分子结合的可选受体或细胞的结合更长的持续时间和/或更大的亲和力，更频繁、更迅速地结合的能力。

结合亲和力，例如，如Tamamura等人描述，通过油垫(oil-cushion)法来测量[参见Hesselgesset等人，1998，J.Immunol.，160：877-883]，油垫法包括使肽与CXCR4转染的细胞系(例如，CHO细胞)和标记的CXCR4配体(例如，¹²⁵I-SDF-1α)接触，并测量靶向肽对标记的CXCR4配体的结合的抑制百分数。

特异性结合可以例如通过具有至少约10^-4M的Kd的低亲和力靶向剂来展现，例如，如果CXCR4具有多于一个的配体结合位点，则具有低亲和力的配体可用于靶向。特异性结合也可以通过高亲和力配体来展现，例如具有至少约10^-7M、至少约10^-8M、至少约10^-9M、至少约10^-10M的Kd的配体，或具有的Kd可以是至少约10^-11M或10^-12M或更大。低亲和力靶向配体和高亲和力靶向配体都可用于并入到本发明的缀合物中。

在缀合物包含荧光蛋白(如GFP)的情况下，可以通过荧光法方便地确定本发明的缀合物被表达CXCR4的细胞内化的能力。这样的融合蛋白可以通过制备重组核酸来获得，其中编码T22肽的核酸和荧光蛋白在框内融合并在适当的宿主细胞有机体中表达。然后使融合蛋白与表达CXCR4的细胞的培养物接触或在体内与表达CXCR4的组织接触适当量的时间，此后可以使用荧光显微镜确定构建物是否穿透细胞。通过将由荧光蛋白产生的荧光显微镜图像与用已知细胞质染色获得的荧光显微镜图像进行比较，可以进一步研究细胞质中荧光的存在。

如本文所用的，表述“促进内体逃逸”是指在受体介导的内吞作用内化之后，聚阳离子肽诱导融合蛋白从内体区室释放的能力。

在本发明的甚至更优选的实施方式中，CXCR4配体选自T22肽(SEQ ID NO：5)、V1肽(SEQ ID NO：6)、CXCL12肽(SEQ ID NO：7)、vCCL2肽(SEQ ID NO：8)或其功能上等同的变体。

T22肽对应于衍生自蛋白质鲎肽(polyphemusin)II(从来自Lymulus polyphemus的血细胞碎片中提取)的肽。vCCL2对应于病毒巨噬细胞炎性蛋白II——一种人疱疹病毒8编码的人趋化因子CCL 2的同源物。v 1肽对应于vCCL 2的N末端的1-21位残基。CXCL12——C-X-C基序趋化因子12，也称为基质细胞衍生因子1(SDF1)，是趋化因子家族的成员，其充当促炎介质。已知所有四种肽都与CXCR4受体具有相互作用，如Liang，X.2008.Chem.Biol.Drug.Des.72：91-110中所示的。

在一个实施方式中，靶向肽选自：

-具有序列RRX₁CYRKX₂PYRX₃CR(SEQ ID NO：9)的T140肽，其中X₁是L-3-(2-萘基)丙氨酸，X₂是D-Lys，以及X₃是L-瓜氨酸，

-具有序列RRX₁CYX₂KX₃PYRX₄CR(SEQ ID NO：10)的TN14003肽，其中X₁是L-3-(2-萘基)丙氨酸，X₂是L-瓜氨酸，X₃是dLys，以及X₄是L-瓜氨酸，

-具有序列RRX₁CYEKX₂PYRX₃CR(SEQ ID NO：11)的TC14012肽，其中X₁是L-3-(2-萘基)丙氨酸，X₂是D-瓜氨酸，以及X₃是L-瓜氨酸，

-具有序列RRX₁CYX₂KX₃PYRX₄CR(SEQ ID NO：12)的TE14011肽，其中X₁是L-3-(2-萘基)丙氨酸，X₂是L-瓜氨酸，X₃是D-Glu，以及X₄是L-瓜氨酸，和

-具有序列RRX₁CYX₂KX₃PYRX₄CR(SEQ ID NO：13)的TZ14011肽，其中X₁是L-3-(2-萘基)丙氨酸，X₂是L-瓜氨酸，X₃是D-Lys，以及X₄是L-瓜氨酸或其变体，其中N末端精氨酸残基被乙酰化(已知Ac-TZ14011)。

术语“功能变体”和“功能上等同的变体”是可互换的，并且在本文中应理解为通过一个或多个氨基酸的修饰、插入和/或缺失，从T22、V1、CXCL12、和/或vCCL2肽衍生的所有的那些肽，条件是基本上维持与CXCR4进行结合和使融合蛋白内化的功能。

在一个实施方式中，阳离子多肽的功能上等同的变体是根据其各自的SEQ ID NO，相对于人T22、V1、CXCL12和/或vCCL2肽表现出一定程度的同一性的那些变体，所述的同一性大于至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。两个氨基酸序列之间的同一性程度可以通过常规方法来确定，例如通过现有技术中已知的标准序列比对算法，如，例如BLAST[Altschul S.F.等人，J.Mol.Biol.，.1990 Oct 5；215(3)：403-10]。本发明的阳离子多肽可包括翻译后修饰，如糖基化、乙酰化、异戊二烯基化、豆蔻酰基化、蛋白水解加工等。

可选地，阳离子多肽的适合的功能变体是以下这些：其中一个或多个位置含有这样的氨基酸——所述氨基酸是上述T22、V1、CXCL12、和/或vCCL2肽中存在的氨基酸的保守取代。“保守氨基酸取代”是将一个氨基酸用结构和/或化学性质相似的另一个氨基酸代替所产生的。例如，以下六组各自含有彼此互为保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。这种保守氨基酸取代的选择在本领域普通技术人员的能力范围内，并且例如由Dordo等人，[J.Mol.Biol，1999，217；721-739]和Taylor等人，[J.Theor.Biol.，1986，119：205-218]描述。

用于确定给定肽是否可以视为其功能上等同的变体的适合的测定法是例如以下测定法：将推定的T22、V1、CXCL12或vCCL2肽变体与标记物多肽(例如，荧光蛋白)进行框内融合。这样的融合蛋白可以通过制备重组核酸来获得，其中将编码肽和荧光蛋白的核酸框内融合并在适当的宿主细胞或有机体中表达。然后将融合蛋白与细胞CXCR4(例如，海拉(Hela)细胞)的培养物接触适当量的时间，之后可以使用荧光显微镜确定构建物是否穿透细胞。如果此肽是相应肽的功能上等同的变体，则标记物蛋白将被内化并且细胞的细胞质中荧光的存在将是可见的。此外，可以通过将由荧光蛋白产生的荧光显微镜图像与用已知细胞质染色(例如，DAPI)获得的荧光显微镜图像进行比较来评估此功能上等同的变体的性能。

(iii)GW-H1肽

GW-H1肽先前由Chen和同事[Chen，Y-L.S.等人.2012.Peptides，36：257-265]描述过。首先选择GW-H1肽作为抗微生物肽，但其特征还在于其结合细胞膜、将其自身内化到细胞质中、并且迁移到真核细胞的核中的能力。一旦在细胞内，GW-H1就能够诱导细胞凋亡。已经提出：GW-H1通过折叠成两亲性螺旋而发挥其细胞溶解活性[Chen和同事，同上]。因此，此肽被认为通过两个连续事件发挥其细胞溶解作用，所述两个连续事件包括结合至细胞膜，随后透化。

在本发明的优选实施方式中，本发明的聚阳离子肽是GW-H1肽，其具有SEQ ID NO：14。

(iv)CD44配体

CD44是一种细胞表面跨膜糖蛋白，参与细胞-细胞和细胞-基质相互作用、细胞粘附和迁移。CD44与炎症和疾病诸如癌症有关[Bajorath，J.2000.Proteins.39：103-111]。已知许多同种型，它们以细胞特异性方式表达并且也被差异地糖基化。

因此，“CD44配体”将是能够结合CD44的分子。CD44是(乙酰)透明质酸——细胞外基质的一种组分——的主要表面受体，但它具有其它配体，如硫酸软骨素、纤连蛋白的肝素结合结构域、骨桥蛋白、丝甘蛋白(serglycin)、胶原蛋白和层粘连蛋白。此外，CD44还可以与金属蛋白酶和选择蛋白相互作用。

在本发明的实施方式中，本发明的聚阳离子肽是CD44配体。在本发明的优选实施方式中，CD44配体选自A5G27(SEQ ID NO：15)和FNI/II/V(SEQ ID NO：16)。

肽FNI/II/V对应于纤连蛋白的HBFN片段V。肽A5G27对应于层粘连蛋白的α5链的肽[Pesarrodona，M.等人.2014.Int.J.of Pharmaceutics.473：286-295]。

(v)能够穿过血脑屏障的肽

本领域公知，脑病理学治疗方法发展的一个主要障碍是血脑屏障(BBB)。通过存在以下两种屏障系统来保护脑免受潜在毒性物质的损害：血脑屏障(BBB)和血脑脊液屏障(BCSFB)。BBB被认为是摄取血清配体的主要途径，因为其表面积比BCSFB的表面积大大约5000倍。构成BBB的脑内皮代表了使用潜在药物对抗多种CNS病症的主要障碍。通常，只有小的亲脂性分子可以穿过BBB，即，从循环系统血液到达脑。许多具有较大尺寸或较高疏水性的药物在用于治疗CNS病症的动物研究中显示出具有前景的结果。

因此，“能够穿过血脑屏障的肽”将是能够将自身以及其结合的任何分子(优选蛋白质)，从血流运输到CNS的肽。

在1983年，据报道，一种肽——β-酪啡肽-5(β-Casomorphin-5)可以克服BBB[Ermisch，A.等人1983.J.of Neurochemistry.41：1229-1233]。从那时起，许多其它具有BBB渗透性质的肽被鉴定、表征和分类，并在2012年建立了全面的数据库，如Van Dorpe等人报道的[Van Dorpe，S.等人2012.Brain Struct.Funct.217：687-718]。前述数据库中列举的大多数肽都适用于本发明的融合蛋白。

在本发明的实施方式中，本发明的聚阳离子肽是能够穿过血脑屏障的肽。在本发明的优选实施方式中，能够穿过血脑屏障的肽选自Seq-1-7(SEQ ID NO：17)、Seq-1-8(SEQID NO：18)、和Angiopep-2-7(SEQ ID NO：19)。

(V1)细胞穿透肽(CPP)

术语“穿透细胞的肽”(CPP)是指长度一般约5-60个氨基酸残基的肽，其可以促进细胞摄取分子货物，特别是作为细胞的一部分的蛋白质。蛋白质可以呈现一种或多种CPP。CPP的特征还在于能够促进分子货物移动或行进跨越/穿过脂质双层、细胞膜、细胞器膜、囊泡膜、或细胞壁中的一个或多个。本文中的CPP将是聚阳离子的。

SchmidT等人[2010.FEBS Lett.584：1806-1813]、Holm等人[2006.NatureProtocols1：1001-1005]、Yandek等人[2007.Biophys.J.92：2434-2444]、Morris等人[2001.Nat.Biotechnol.19：1173-1176]、和美国专利申请公开号2014/0068797中公开了可用于本文的CPP的实例，并在一般情况下对CPP作出了进一步的描述。CPP不依赖转运蛋白或受体，促进作为其部分的蛋白质直接穿过脂质双层进行运输，而无需任何其它细胞组分的参与。

(vii)核仁素结合肽

因此，“核仁素结合肽”是这样的肽：能够结合细胞中的核仁素蛋白，优选地结合细胞表面表达的核仁素的部分。在本发明的实施方式中，本发明的聚阳离子肽是核仁素结合肽。

编号为WO 2011/031477 A2的国际专利申请公开提供了适用于本发明的融合蛋白的核仁素结合肽的许多实例。

在本发明的优选实施方式中，本发明的核仁素结合肽是序列SEQ ID NO：20的肽或序列SEQ ID NO：21的肽。

B.间插多肽区域

根据本发明的融合蛋白中的第二个元件是间插多肽，其是Stefin A多肽或其功能上等同的变体。

术语“间插多肽区域”和“间插区域”在本文中被认为是等同的并且用于指代位于聚阳离子肽(i)和带正电荷的氨基酸区域(ii)之间的多肽序列。

如本文所用的，术语“Stefin A”是指半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)家族I(stefins)的小的(98个氨基酸)单体蛋白抑制剂，其利用三个位点，通过第4位甘氨酸、第48位缬氨酸和第73位赖氨酸的关键接触而与其伙伴蛋白——组织蛋白酶(cathepsin)B、C、H、L和S相互作用来抑制组织蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶。

在优选的实施方式中，在本发明中用作间插多肽的Stefin A是无生物学活性的，即它不能抑制半胱氨酸蛋白酶抑制剂I家族的半胱氨酸蛋白酶。在根据本发明的融合蛋白中使用的Stefin A的生物学活性的缺乏可以常规方式，通过使用例如在Woodman等人(J.Mol.Biol.(2005)352，1118-1133)中描述的测定，在Stefin A变体的存在下测量组织蛋白酶B和/或H活性来确定。

在另一个实施方式中，本发明中使用的Stefin A是人Stefin A多肽，其序列在NCBI数据库中提供，登录号为NP_005204.1(发布日期为2018年11月23日)或其无生物学活性的变体。本发明还考虑了将人Stefin A，如大鼠Stefin A)、牛Stefin A(NCBI数据库中的登录号为NP_001161296，发布日期为2018年11月11日)、小鼠Stefin A(NCBI数据库中的登录号为NP_001028411.1，发布日期为2018年11月10日)或其无生物学活性的变体。

术语“功能上等同的变体”在本文中用于指代Stefin A时，是指由添加、缺失或取代来自所述Stefin A的序列的一个或多个氨基酸残基产生的任何多肽或肽，并且其基本上维持野生型Stefin A在形成融合蛋白的部分时形成纳米颗粒的能力，该融合蛋白的侧翼是本发明中所定义的聚阳离子肽和富含带正电荷的氨基酸的区域。Stefin A变体形成纳米颗粒的能力可以通过例如动态光散射和MALDI-TOF质谱分析法测定，如实施例中解释的。应当理解，在根据本发明的融合蛋白中使用的Stefin A功能上等同的变体，在能够维持野生型Stefin A在形成侧翼是聚阳离子肽的融合蛋白的部分时形成纳米颗粒的能力的同时是无生物活性的。

根据本发明的Stefin A的功能变体包括显示与所述Stefin A的序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的多肽，其保留了组装具有内腔的24聚体蛋白质的能力。同样，根据本发明的Stefin A的功能上等同的变体在形成侧翼是本发明中所定义的聚阳离子肽和富含带正电荷的氨基酸的区域的融合蛋白的部分时将优选地维持形成纳米颗粒的能力，该能力是野生型Stefin A的能力的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％。两种蛋白质或肽之间的同一性程度可以通过使用本领域技术人员公知的计算机执行的算法和方法来确定。作为说明，两个氨基酸序列之间的同一性通过使用BLASTP算法(BLAST Manual，Altschul，S.，等人，NCBI NLM NIHBethesda，Md.20894，Altschul，S.，等人，J.Mol.Biol.，1990，215：403-410)确定。铁蛋白纳米颗粒的重新组装可以用天然凝胶电泳或尺寸排阻色谱法(Anal Biochem.1987，166(2)：235-45)评估。

可选地，合适的Stefin A多肽的功能变体是其中一个或多个位置含有作为存在于Stefin A多肽中的氨基酸的保守取代的氨基酸的那些功能变体。“保守氨基酸取代”是将一个氨基酸用结构和/或化学性质相似的另一个氨基酸代替所产生的。例如，以下六组各自含有彼此互为保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。这种保守氨基酸取代的选择在本领域普通技术人员的能力范围内，并且例如由Dordo等人，[J.Mol.Biol，1999，217；721-739]和Taylor等人，[J.Theor.Biol.，1986，119：205-218]描述。

在一个实施方式中，Stefin A变体可以是自其N末端缺失至少1个氨基酸和/或自其C末端缺失至少1个氨基酸的Stefin A片段。在本发明的上下文中考虑的Stefin A的功能变体包括其序列源自上述序列，自其N末端缺失至少1个氨基酸、至少2个氨基酸、至少3个氨基酸、至少4个氨基酸、至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30个氨基酸、至少40个氨基酸、至少50个氨基酸、至少60个氨基酸、至少70个氨基酸、至少80个氨基酸、至少90个氨基酸、至少100个氨基酸，和/或自其C末端缺失至少1个氨基酸、至少2个氨基酸、至少3个氨基酸、至少4个氨基酸、至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30个氨基酸、至少40个氨基酸、至少50个氨基酸、至少60个氨基酸、至少70个氨基酸、至少80个氨基酸、至少90个氨基酸、至少100个氨基酸的多肽。

应当理解，间插肽一旦被并入本发明的融合蛋白中就需要具有生理功能。因此，连接根据本发明的融合蛋白的不同元件的连接体区域不被认为是间插区域。因此，在优选实施方式中，间插区域包括至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个或更多个氨基酸。

根据本发明的融合蛋白中的间插多肽是Stefin A，也称为半胱氨酸蛋白酶抑制剂A。在优选实施方式中，Stefin A是人类来源的，具有序列SEQ ID NO：22。在又一个实施方式中，半胱氨酸蛋白酶抑制剂是具有选自G4W、G4R、V48D、V48L、G50S、K71N、S72G、L73P、L82R、T83S突变的一个或多个突变的Atefin A变体。在其它实施方式中，Atefin A变体相对于SEQID NO：22中所示的序列包含以下突变：

-G4W、V48D、K71N、S72G和L73P，对应于在Woodward等人(J.Mol.Biol.(2005)352，1118-1133)中和在Hoffman等人，Protein Engineering，Design&Selection第23卷第5期第403-413页，2010)中定义为STM突变体的突变体。

-G4R、V48L、G50S、K71N、S72G、L73P、L82R和T83S，对应于在Hoffman等人(同上)中定义为SQM突变体的突变体)。

-G4R，对应于在Hoffman等人(同上)中定义为SUM突变体的突变体)。

-V48L和G50S，对应于在Hoffman等人(同上)中定义为SUM突变体的突变体)。

-K71N、S72G、L73P、L82R和T83S，对应于在Hoffman等人(同上)中定义为SUC突变体的突变体)。

-V48L、G50S、K71N、S72G、L73P、L82R和T83S，对应于在Hoffman等人(同上)中定义为SDM突变体的突变体)。

C.富含带正电荷的氨基酸的区域

如本文所用的，术语“带正电荷的氨基酸”或“第二富含带正电荷的氨基酸的区域”是指不同于聚阳离子区域或第一富含带正电荷的氨基酸的区域的多肽序列，其特征在于其包含多个带正电荷的氨基酸。另外，富含带正电荷的氨基酸的区域可以仅由带正电荷的氨基酸形成，或者可以包含其它氨基酸，前提是此区域在pH 7下的总净电荷为正。因此，富含带正电荷的氨基酸的区域序列可包含其完整序列的33％，优选40％、优选45％、优选50％、优选55％、优选60％、优选65％、优选70％、优选75％、优选80％、优选85％、更优选90％、更优选95％、甚至更优选99％、又甚至更优选100％的氨基酸残基作为带正电荷的氨基酸残基。

富含带正电荷的氨基酸的区域可以仅包含一种类型的带正电荷氨基酸，或者可以包含多于一种类型的带正电荷的氨基酸。在一个实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域是聚组氨酸区域。在一个实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域是聚精氨酸区域。在一个实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域是聚组氨酸区域。在一个实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域包含赖氨酸残基和精氨酸残基。在一个实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域包含赖氨酸残基和组氨酸残基。在一个实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域包含精氨酸残基和组氨酸残基。在一个实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域包含赖氨酸残基、精氨酸残基和组氨酸残基。

在一些实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、或至少15个带正电的氨基酸残基，其中带正电的氨基酸可以是组氨酸、赖氨酸、精氨酸或其组合。

在一些实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域包括少于100个、少于90个、少于80个、少于70个、少于60个、少于50个、少于40个、少于30个、少于29个、少于28个、少于27个、少于26个、少于25个、少于24个、少于23个、少于22个、少于21个、少于20个、少于19个、少于18个、少于17个、少于16个、少于15个、少于14个、少于13个、少于12个、少于11个、少于10个或更少的带正电荷的氨基酸残基，其中带正电荷的氨基酸可以是组氨酸、赖氨酸、精氨酸或其组合。

在一些实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域包含2与50之间个氨基酸、2与40之间个氨基酸、2与30之间个氨基酸、2与25之间个氨基酸、2与20之间个氨基酸、2与10之间个氨基酸或2与8之间个氨基酸。

在一些实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域包含3与50之间个氨基酸、3与40之间个氨基酸、3与30之间个氨基酸、3与25之间个氨基酸、3与20之间个氨基酸、3与10之间个氨基酸或3与8之间个氨基酸。在一些实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域包含4与50之间个氨基酸、4与40之间个氨基酸、4与30之间个氨基酸、4与25之间个氨基酸、4与20之间个氨基酸、4与10之间个氨基酸或4与8之间个氨基酸。在一些实施方式中，富含带正电荷的氨基酸的区域包含5与50之间个氨基酸、5与40之间个氨基酸、5与30之间个氨基酸、5与25之间个氨基酸、5与20之间个氨基酸、5与10之间个氨基酸或5与8之间个氨基酸。

在本发明的实施方式中，本发明的融合蛋白的富含带正电荷的氨基酸的区域是聚组氨酸区域。在本发明的优选实施方式中，聚组氨酸区域包含2与10之间个连续的组氨酸残基。

在本发明的实施方式中，本发明的融合蛋白的富含带正电荷的氨基酸的区域是聚精氨酸区域。在本发明的优选实施方式中，聚精氨酸区域包含2与10之间个连续的精氨酸残基。

在本发明的实施方式中，本发明的融合蛋白的富含带正电荷的氨基酸的区域是聚赖氨酸区域。在本发明的优选实施方式中，聚赖氨酸区域包含2与10之间个连续的聚赖氨酸残基。

D.融合蛋白的元件和连接元件的相对位置

本发明的融合蛋白的不同元件(聚阳离子肽、间插多肽区域、和富含带正电荷的氨基酸的区域)可以以任何相对顺序放置，前提是聚阳离子肽和富含带正电荷的氨基酸的区域在融合蛋白的任何位置上都具有功能，并且间插多肽区域仍保留全部或部分功能。

如本文所用的，术语多肽的“N末端”、“N端”、和“氨基末端”是没有区分的。同样，术语“C末端”、“C端”、和“羧基末端”被认为是等同的。这些术语是本领域技术人员关于蛋白质所包含的多肽链末端的氨基酸的游离部分所常用的。

因此，在本发明的实施方式中，融合蛋白的聚阳离子肽位于蛋白质的N末端，而融合蛋白的富含带正电荷的氨基酸的区域位于蛋白质的C末端。在本发明的另一实施方式中，融合蛋白的富含带正电荷的氨基酸的区域位于蛋白质的N末端，而融合蛋白的聚阳离子肽位于蛋白质的C末端。在本发明的另一实施方式中，间插多肽区域可以位于融合蛋白的C末端或N末端，而聚阳离子肽位于融合蛋白的中间位置并且富含带正电荷的氨基酸的区域位于融合蛋白的与间插多肽区域相对的末端，或者富含带正电荷的氨基酸的区域位于融合蛋白的中间位置，而聚阳离子肽位于融合蛋白的与间插多肽区域相对的末端。

因此，根据本发明的融合蛋白的元件的相对顺序可以是：

■N-聚阳离子肽-间插区域多肽-富含带正电荷的氨基酸的区域-C；

■N-富含带正电荷的氨基酸的区域-间插区域多肽-聚阳离子肽-C；

■N-聚阳离子肽-富含带正电荷的氨基酸的区域-间插区域多肽-C；

■N-富含带正电荷的氨基酸的区域-聚阳离子肽-间插区域多肽-C；

■N-间插区域多肽-聚阳离子肽-富含带正电荷的氨基酸的区域-C；或

■N-间插区域多肽-富含带正电荷的氨基酸的区域-聚阳离子肽-C

术语“N末端”和“C末端”并不意味着这些组分需要端对端地直接缀合，而是它们维持相对的位置顺序，而不管组分末端的或间插在其之间的其它元件(如连接体/间隔区)的存在。

因此，本发明的融合蛋白包含上述元件((1)聚阳离子肽，(2)间插多肽区域，和(3)富含带正电荷的氨基酸的区域)，并且这些可以端对端地缀合，而且也可以包括间插其之间，优选地通过肽键连接的一种或多种任选的肽或多肽“连接体”或“间隔区”。

根据本发明，间隔区或连接体氨基酸序列可以充当组分(1)和(2)以及(2)和(3)之间的铰链区，从而允许这些组分在维持单独结构域的三维形式的同时彼此独立地移动，使得肽间隔区或连接体的存在不改变组分(1)、(2)和(3)中的任一个的功能。在这个意义上，根据本发明的优选的中间氨基酸序列将是铰链区，其特征在于允许此运动的结构延展性。在一个具体实施方式中，所述中间氨基酸序列是柔性连接体。连接体区域的作用是在组分(1)和(2)以及(2)和(3)之间提供空间。因此确保了组分(1)、(2)或(3)的二级和三级结构不受其它任何一个的存在的影响。间隔区具有多肽性质。连接体肽优选包含至少2个氨基酸、至少3个氨基酸、至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30个氨基酸、至少40个氨基酸氨基酸、至少50个氨基酸、至少60个氨基酸、至少70个氨基酸、至少80个氨基酸、至少90个氨基酸或大约100个氨基酸。

间隔区或连接体可以通过共价键(优选通过肽键)与在本发明的缀合物的两个组分侧翼的组分结合；并且还优选地，间隔区本质上是功能缺失的、和/或不易受蛋白水解切割、和/或不包含任何半胱氨酸残基。类似地，间隔区的三维结构优选是线性的或基本上线性的。

间隔区肽或连接体肽的优选实例包括已经用于结合蛋白质而基本上不使经结合的肽的功能恶化或至少基本上不使经结合的肽之一的功能恶化的那些肽。更优选地，用于结合肽的间隔区或连接体包含卷曲螺旋结构。

连接体肽的优选实例包括选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的2种或更多种氨基酸。柔性连接体的优选实例是聚甘氨酸连接体。连接体序列/间隔区序列的可能性实例包括SGGTSGSTSGTGST(SEQ ID NO：23)、AGSSTGSSTGPGSTT(SEQ ID NO：24)或GGSGGAP(SEQ IDNO：25)。这些序列已被用于将设计的卷曲螺旋与其它蛋白质结构域结合[Muller，K.M.，Arndt，K.M.和Alber，T.，Meth.Enzymology，2000，328：261-281]。适合的连接体的其它非限制性实例包括氨基酸序列GGGVEGGG(SEQ ID NO：26)、鼠IgG3的上铰链区的10个氨基酸残基的序列(PKPSTPPGSS，SEQ ID NO：27)，其已被用于通过卷曲螺旋来产生二聚化抗体[Pack，P.和Pluckthun，A.，1992，Biochemistry 31：1579-1584]，序列APAETKAEPMT的肽(SEQIDNO：28)、序列GAP的肽、序列AAA的肽和序列AAALE的肽(SEQ ID NO：29)。

可选地，本发明的缀合物的组分可以通过包含蛋白酶的切割靶标的序列的肽来连接，从而允许分离任何组分。适于将其并入到本发明的多肽中的蛋白酶切割位点包括肠激酶(切割位点DDDDK，SEQ ID NO：30)、因子Xa(切割位点IEDGR，SEQ ID NO：31)、凝血酶(切割位点LVPRGS，SEQ ID NO：32)、TEV蛋白酶(切割位点ENLYFQG，SEQ ID NO：33)、PreScission蛋白酶(切割位点LEVLFQGP，SEQ ID NO：34)、内含肽等。

因此，在本发明的实施方式中，聚阳离子肽通过连接体与间插多肽区域结合。在本发明的另一实施方式中，间插多肽区域通过连接体与富含带正电荷的氨基酸的区域结合。在本发明的另一实施方式中，聚阳离子肽通过连接体与间插多肽区结合，并且间插多肽区域也通过连接体与富含带正电荷的氨基酸的区域结合。

如本领域技术人员将认识到的，将聚阳离子肽与间插多肽区域连接并将间插多肽区域与富含带正电荷的氨基酸的区域连接的连接体可以包含相同的序列或不同的序列，但存在上述限制，即连接体的存在和/或序列不导致聚阳离子肽、间插多肽区域、和/或富含带正电荷的氨基酸的区域的功能改变(例如，但不限于，由于融合蛋白的二级或三级结构修饰或二硫键的形成)。

关于融合蛋白元件从N末端到C末端的相对位置的前述考虑也适用于元件之间存在连接体的情况，而不依赖于连接体的数目或连接体放置在哪些元件之间。因此，元件的可能组合和相对顺序将如下所示(其中保留了上述元件的编号：(1)聚阳离子肽，(2)间插多肽区域，(3)富含带正电荷的氨基酸的区域)：

■N-(1)-(2)-(3)-C

■N-(1)-连接体-(2)-(3)-C

■N-(1)-(2)-连接体-(3)-C

■N-(1)-连接体-(2)-连接体-(3)-C

■N-(3)-(2)-(1)-C

■N-(3)-连接体-(2)-(1)-C

■N-(3)-(2)-连接体-(1)-C

■N-(3)-连接体-(2)-连接体-(3)-C

■N-(2)-(1)-(3)-C

■N-(2)-连接体-(1)-(3)-C

■N-(2)-(1)-连接体-(3)-C

■N-(2)-连接体-(1)-连接体-(3)-C

■N-(2)-(3)-(1)-C

■N-(2)-连接体-(3)-(1)-C

■N-(2)-(3)-连接体-(1)-C

■N-(2)-连接体-(3)-连接体-(1)-C

■N-(1)-(3)-(2)-C

■N-(1)-(3)-连接体-(2)-C

■N-(1)-连接体-(3)-(2)-C

■N-(1)-连接体-(3)-连接体-(2)-C

■N-(3)-(1)-(2)-C

■N-(3)-连接体-(1)-(2)-C

■N-(3)-(1)-连接体-(2)-C

■N-(3)-连接体-(1)-连接体-(2)-C

在本发明的优选实施方式中，本发明的融合蛋白的连接体包含序列GGSSRSS(SEQID NO：35)、GGGNS序列的序列(SEQ ID NO：36)。

E.澳瑞他汀

本发明的融合蛋白的间插多肽区域是与作为治疗剂的澳瑞他汀结合的蛋白质。

如本文所用的，术语澳瑞他汀是指起微管抑制剂作用的抗有丝分裂剂家族的任何成员。澳瑞他汀衍生物也包括在术语“澳瑞他汀”的定义内。澳瑞他汀的实例包括但不限于澳瑞他汀E(AE)、一甲基澳瑞他汀E(MMAE)、一甲基澳瑞他汀F(MMAF)和多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物。在一个实施方式中，澳瑞他汀是“一甲基澳瑞他汀E”或“MMAE”，其对应于名称为IUPAC：

(2S)-N-[(2S)-1-[[(3R，4S，5S)-1-[(2S)-2-[(1R，2R)-3-[[(1S，2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-甲基氨基]-3-甲基-1-氧代丁-2-基]-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺和CAS登录号474645-27-7的化合物。

将要理解，MMAE的活性可因其与融合多肽的缀合而降低，本发明考虑到澳瑞他汀一旦被递送至细胞内部，其细胞毒性活性是未缀合的治疗剂活性的至少100％、至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％或更低。可选地，由于本发明的目的是通过提高治疗剂的选择性并减少其脱靶效应来促进治疗剂的作用，因此考虑了与融合蛋白缀合的治疗剂的作用可以是协同的并且超过特定治疗剂所已知的参数化值。因此，意图使与本发明的融合蛋白缀合的治疗剂的一些实施方式还显示单独的所述治疗剂的功能性的至少101％、至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少175％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少1000％、或更高。

F.治疗剂与间插区域的连接

治疗剂与本发明的融合蛋白缀合。如前所述，意图将治疗剂缀合至融合蛋白的间插区域，而就N末端和C末端而言，不限制间插区域内的缀合位置。因此，治疗剂可以在相对于N末端和C末端等距离的位置处、或者其可以更靠近它们中的任一个而缀合至间插多肽区域。因此，治疗剂可以以距N末端或C末端80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、30、25、20、15、20、10个或更少氨基酸残基的距离、或以距N末端或C末端相同个残基的距离而缀合至间插多肽区域。

治疗剂缀合位置的唯一预期的限制是治疗剂和融合蛋白的元件是功能性的，并且治疗剂的缀合不干扰治疗剂或融合蛋白的活性。因此，治疗剂、聚阳离子肽、和富含带正电荷的氨基酸的区域分别相对于非缀合形式的融合蛋白和治疗剂，保存其功能性的至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、优选95％、更优选99％、甚至更优选100％。

意图使治疗剂可以与融合蛋白的间插多肽的残基直接缀合，或者其键可以由连接部分介导。如本文所用的，“连接部分”涉及将治疗肽连接至融合蛋白的间插区域的分子。还意图使连接部分在其化学性质和/或结构上不受限制；因此，连接部分可以是多糖、多肽、脂肪酸、磷脂、或其化学衍生物等。还意图使治疗剂可以通过任何化学键(如肽键、异肽键、酰胺键、亚胺键等)结合至连接部分。

本领域技术人员将认识到，无论何时偶联剂介导治疗剂和融合蛋白之间的缀合，关于融合蛋白的元件和治疗剂的功能性的先前规定也适用。因此，无论何时治疗剂通过连接部分与融合蛋白缀合，治疗剂、聚阳离子肽、和富含带正电荷的氨基酸的区域分别相对于非缀合形式的融合蛋白和治疗剂，均保存其功能性的至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、优选95％、更优选99％、甚至更优选100％，而不管间插区域中缀合的位置、连接部分的化学组成或结构以及连接部分和治疗剂之间与连接部分和间插区域之间的键(一个或多个)的化学性质如何。

因此，在本发明的实施方式中，治疗剂直接结合至融合蛋白的间插多肽区域。

在本发明的另一实施方式中，治疗剂通过连接部分结合至融合蛋白的间插区域。

在本发明的优选实施方式中，介导治疗剂与融合蛋白的间插区域的键的连接部分是6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。在另一优选实施方式中，介导治疗剂与融合蛋白的间插区域的键的连接部分是4-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。

在本发明的一些实施方式中，使治疗剂与融合蛋白的间插区域结合的连接部分易于被细胞质中存在的酶加工，一旦缀合至融合蛋白的治疗剂在细胞中被内化，就从融合蛋白释放治疗剂。

如本领域技术人员将认识到的，融合蛋白的间插区域的多肽链的许多残基不仅提供了其中治疗剂可以结合或连接的多个位置，还提供了将多于一分子的相同或不同治疗剂连接至相同融合蛋白的可能性。如前所述，意图维持关于融合蛋白的元件以及治疗剂(一种或多种)的功能性的规定，并且意图使相同或不同治疗剂的分子数的增加、不同治疗剂的结合、它们的化学性质、或它们的结合位置不影响每种治疗剂的有效性和功能性。

因此，在本发明的另一个实施方式中，融合蛋白的间插多肽与多种治疗剂缀合，其中所述多种治疗剂相同或不同。

G.报告蛋白

在本发明的另一实施方式中，本发明的融合蛋白还包含报告蛋白。

本领域技术人员将认识到，术语“报告蛋白”是指由“报告基因”的表达产生的蛋白质。报告蛋白是公知的，并且在本领域中常用作适用于多种目的的标记物，如报告基因在组织、细胞或亚细胞位置中的表达定位、蛋白质-蛋白质相互作用、跨细胞质膜或内膜的运输、囊泡转运、配体-受体相互作用等。

在本发明背景下有用的报告蛋白包括来自Photinus pyralis的萤光素酶-4-单加氧酶、β-半乳糖苷酶、胸苷激酶等。报告蛋白还包括已经讨论过的荧光蛋白。

本发明的融合蛋白所包含的报告蛋白与富含带正电荷的氨基酸的区域直接相邻或被连接体隔开。然而，根据前述关于融合蛋白的元件的相对位置的考虑，保留了富含带正电荷的氨基酸的区域的相对位置。因此，与融合蛋白的位置无关，荧光蛋白总是直接与之相邻或通过连接体与之隔开。

因此，在本发明的包含荧光蛋白的实施方式中，本发明的融合蛋白的元件的可能的相对位置将适合以下方案(其中RP是指报告蛋白，并且保留了上述元件的编号：(1)聚阳离子肽，(2)间插多肽区域，(3)带正电荷的氨基酸区域)：

■N-(1)-(2)-RP-(3)-C

■N-(1)-连接体-(2)-RP-(3)-C

■N-(1)-(2)-连接体-RP-(3)-C

■N-(1)-连接体-(2)-连接体-RP-(3)-C

■N-(3)-RP-(2)-(1)-C

■N-(3)-RP-连接体-(2)-(1)-C

■N-(3)-RP-(2)-连接体-(1)-C

■N-(3)-RP-连接体-(2)-连接体-(3)-C

■N-(1)-(2)-RP-连接体-(3)-C

■N-(1)-连接体-(2)-RP-连接体-(3)-C

■N-(1)-(2)-连接体-RP-连接体-(3)-C

■N-(1)-连接体-(2)-连接体-RP-连接体-(3)-C

■N-(3)-连接体-RP-(2)-(1)-C

■N-(3)-连接体-RP-连接体-(2)-(1)-C

■N-(3)-连接体-RP-(2)-连接体-(1)-C

■N-(3)-连接体-RP-连接体-(2)-连接体-(3)-C

■N-(2)-(1)-RP-(3)-C

■N-(2)-连接体-(1)-RP-(3)-C

■N-(2)-(1)-连接体-RP-(3)-C

■N-(2)-连接体-(1)-连接体-RP-(3)-C

■N-(2)-RP-(3)-(1)-C

■N-(2)-(3)-RP-(1)-C

■N-(2)-连接体-RP-(3)-(1)-C

■N-(2)-连接体-(3)-RP-(1)-C

■N-(2)-RP-(3)-连接体-(1)-C

■N-(2)-(3)-RP-连接体-(1)-C

■N-(2)-连接体-RP-(3)-连接体-(1)-C

■N-(2)-连接体-(3)RP--连接体-(1)-C

■N-(1)-RP-(3)-(2)-C

■N-(1)-(3)-RP-(2)-C

■N-(1)-RP-(3)-连接体-(2)-C

■N-(1)-(3)-RP-连接体-(2)-C

■N-(1)-连接体-RP-(3)-(2)-C

■N-(1)-连接体-(3)-RP-(2)-C

■N-(1)-连接体-RP-(3)-连接体-(2)-C

■N-(1)-连接体-(3)-RP-连接体-(2)-C

■N-RP-(3)-(1)-(2)-C

■N-(3)-RP-(1)-(2)-C

■N-RP-(3)-连接体-(1)-(2)-C

■N-(3)-RP-连接体-(1)-(2)-C

■N-RP-(3)-(1)-连接体-(2)-C

■N-(3)-RP-(1)-连接体-(2)-C

■N-RP-(3)-连接体-(1)-连接体-(2)-C

■N-(3)-RP-连接体-(1)-连接体-(2)-C

本发明的优选融合蛋白

在优选的实施方式中，融合蛋白是T22-STM-H6-Aur，其包含：

(i)作为聚阳离子肽的T22肽，

(ii)作为间插多肽区域的STM，对应于含有G4W、V48D、K71N、S72G和L73P突变的人Stefin A的变体，

(iii)作为富含带正电荷的氨基酸的区域的六组氨酸区域，

(iv)作为治疗剂的澳瑞他汀。

本发明的融合蛋白和纳米缀合物的化学计量

与本发明的融合蛋白缀合的治疗剂的数量不作具体限制，将取决于间插多肽中可用于与治疗剂化学缀合的可用残基的数量。由于大多数缀合是通过存在于形成间插多肽的部分的氨基酸侧链中的氨基或巯基发生的，因此与融合蛋白缀合的治疗剂的数量将取决于赖氨酸残基和精氨酸残基的数量(对于通过侧链中的氨基进行的缀合)或取决于半胱氨酸残基的数量(对于通过侧链中的巯基进行的缀合)以及缀合反应的产率。人Stefin A含有总共一个精氨酸残基和12个赖氨酸残基，这意味着存在13个含有侧链的位点，其可通过澳瑞他汀活化或衍生化。因此，取决于反应产率，本发明的融合蛋白与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个澳瑞他汀分子缀合。在其中间插多肽是含有G4W、V48D、K71N、S72G和L73P突变的Stefin A STM变体的情况下，赖氨酸残基之一被突变为天冬酰胺，这导致了这样的Stefin A变体：含有12个具有侧链的位点，其可通过澳瑞他汀活化和衍生化。因此，取决于反应产率，本发明的融合蛋白与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个澳瑞他汀分子缀合。

另外，根据本发明的纳米颗粒是由多拷贝的本发明的融合蛋白的组装产生。在优选实施方式中，纳米颗粒包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、20、25个，更优选至少15个本发明的融合蛋白的单体。

因此，附着至每个纳米颗粒的治疗剂的总数将取决于(i)缀合至每个融合蛋白的治疗剂的数量，(ii)治疗剂的低聚状态和(iii)形成纳米颗粒的融合蛋白的数量。在优选实施方式中，纳米颗粒与至少30、35、40、45、50、60、65、70、57、80、85、90、59、100、125、150、175、200、225、250、275、300个治疗剂缀合。在另一优选实施方式中，纳米颗粒与至少30、35、40、45、50、60、65、70、57、80、85、90、59、100个治疗剂分子缀合，更优选与至少60个治疗剂分子缀合。

制备本发明的融合蛋白的方法

在第二方面中，本发明涉及制备根据本发明的融合蛋白的方法，包括以下步骤：

a)提供融合蛋白，其包含

i.聚阳离子肽，

ii.间插多肽区域，其是stefin A或其变体，和

iii.富含带正电荷氨基酸的区域，

其中聚阳离子肽和富含带正电荷的氨基酸的区域位于蛋白的末端，和

b)使所述融合蛋白与治疗剂的活化形式接触，其中所述治疗剂的活化形式含有能够与融合蛋白的间插区域中的至少一个基团反应的反应性基团，并且其中在足以在治疗剂中的反应性基团和间插多肽区域中的基团之间形成键的条件下进行接触。

在第三方面中，本发明涉及制备根据本发明的融合蛋白的方法，包括以下步骤：

a)提供融合蛋白，其包含

i.聚阳离子肽，

ii.间插多肽区域，其为Stefin A或其变体，和

iii.富含带正电荷的氨基酸的区域，

其中聚阳离子肽和富含带正电荷的氨基酸的区域位于蛋白的末端，并且其中融合蛋白通过间插多肽内至少一个残基中的能够与澳瑞他汀分子中的至少一个基团反应的至少反应性基团的存在而被活化，和

b)使所述活化的融合蛋白与澳瑞他汀接触，澳瑞他汀含有能够与融合蛋白中的反应性基团反应的基团，并且其中所述接触在足以在融合蛋白中的反应性基团与澳瑞他汀E之间形成键的条件下进行。

上文已经详细描述了术语“融合蛋白”、“聚阳离子肽”、“Stefin A”、“Stefin A的变体”、“澳瑞他汀”和“富含带正电荷的氨基酸的区域”，并且它们的含义同样适用于如本文所述的用于制备融合蛋白的方法。

本领域技术人员将认识到，如本文所用的，“反应性基团”是指这样的分子的任何部分，其能够以使得将两个分子结合在一起的方式与另一分子的另一部分进行化学反应，通常释放一个或多个其它分子。许多这样的反应是本领域已知的，诸如在羧基和胺基之间形成肽键是其中的一个非限制性实例。

如本文所用的，“活化”，当指代分子时，是指分子的修饰形式(version)，其含有化学修饰，由此所述分子能够以分子中先前不存在的方式进行化学反应(例如，活化添加了先前不存在的部分，从而允许之前不可行的键)或能够以提高的反应性进行化学反应(意味着分子与另一分子的反应所需的活化能比失活状态下的活化能低)。本发明考虑了活化治疗剂然后使活化的治疗剂与融合蛋白接触或活化融合蛋白然后使活化的融合蛋白与治疗剂接触的可能性。

在两种情况下，融合蛋白的活化或治疗剂的活化通常通过使待活化分子与将反应性基团引入待活化分子的合适部分中的试剂反应来进行。允许治疗剂或融合蛋白活化的反应性基团的实例包括但不限于羧基、胺、亚胺、硫醇、砜、羟基、硫酸根(硫酸盐，sulfate)、和磷酸根(磷酸盐，phosphate)部分，其中许多是本领域技术人员通常已知的。治疗剂的活化形式在本文中也称为“活化的治疗剂”。融合蛋白的活化形式在本文中也称为“活化的融合蛋白”。活化的融合蛋白中的一个或多个反应性基团位于间插区域中，但不排除在融合蛋白的其它区域中也可以发现另外的反应性基团。

在本发明的其中连接部分介导融合蛋白和治疗剂之间的键的那些实施方式中，连接部分是双功能交联剂，并且更优选地是异双功能交联剂，其利用Kalia J等人Advancesinbioconjugation.Curr Org Chem2010年1月，14(2)：138-147中公开的其它键如硫醚、酰胺键、碳氮双键、或环加成反应所产生的键与治疗剂中的基团和融合蛋白中的基团顺序地(或是先与活化的治疗剂反应然后与融合蛋白反应，或是先与融合蛋白反应然后与活化的治疗剂反应)或同时地反应。作为示例，典型的硫醇反应性官能团包括碘乙酰胺、马来酰亚胺、和二硫化物。另外，可以用展示活化酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯)的小分子或表面来处理蛋白质，从而与赖氨酸侧链上的氨基和N末端形成酰胺键。在另一实施方式中，连接部分是杂双功能交联剂，其含有能够与硫醇基反应和与氨基反应的反应性基团。在一个实施方式中，异双功能交联剂是6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。

在优选实施方式中，连接部分在第一步骤中与活化的治疗剂反应并在第二步骤中与融合蛋白反应。在另一实施方式中，连接部分在第一步骤中与融合蛋白反应并在第二步骤中与治疗剂反应。

意图使将本发明的融合蛋白与活化形式的治疗剂接触的步骤在有利于在它们之间建立键的反应的介质中进行。适用于这种反应的介质是本领域技术人员公知的，包括水性缓冲液和非水性缓冲液。还意图使固体载体(supports)可以结合介质一起用于导致活化的治疗剂和融合蛋白、治疗剂、还有包括了连接部分的实施方式中的连接部分的缀合物的合成的任何反应步骤。此外，意图使用于制备融合蛋白与治疗剂之间的缀合物的方法不限于融合蛋白、活化的治疗剂、和连接部分，而且一些实施方式还包括在反应中使用一种或多种催化剂和辅助因子。

因此，在本发明的一个实施方式中，治疗剂的活化形式含有与融合蛋白的肽区域中(优选在融合蛋白的间插区域中)的残基的至少一个侧链反应的基团。

在另一优选的实施方式中，所述残基是外部赖氨酸。在本发明的另一优选实施方式中，与融合蛋白的间插区域的侧链反应的活化的治疗剂(优选是化疗剂)的基团是硫醇基。

在其它优选实施方式中，连接部分是4-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，其介导活化的治疗剂与本章节前述实施方式中指示的融合蛋白的肽区域的残基侧链之间的缀合。在其它更优选实施方式中，在第一步骤中，使连接部分4-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯与澳瑞他汀结合，并在第二步骤中与融合蛋白残基中的侧链(更优选与融合蛋白的外部赖氨酸，甚至更优选与融合蛋白间插区域的外部赖氨酸)结合。

还意图使本发明的活化的融合蛋白与治疗剂接触的步骤在有利于在它们之间建立键的反应的介质中进行。适用于反应的介质是本领域技术人员公知的，包括水性缓冲液和非水性缓冲液。还意图使固体载体可以结合介质用于导致融合蛋白和治疗剂、还有包括了连接部分的实施方式中的连接部分的缀合物合成的任何反应步骤。此外，意图使用于制备融合蛋白与治疗剂之间的缀合物的方法不限于融合蛋白、活化的治疗剂、和连接部分，而是一些实施方式还包括在反应中使用一种或多种催化剂和辅助因子。

因此，在本发明的一个实施方式中，融合蛋白的活化形式含有与治疗剂中的至少一个部分反应的基团。在本发明的其它优选实施方式中，与活化的融合蛋白反应的治疗剂(优选化疗剂)的基团是硫醇基。

在本发明的甚至更优选的实施方式中，活化的融合蛋白剂是氨基官能化的融合蛋白，其中形成间插多肽的部分的氨基酸侧链中的一个或多个氨基被具有硫醇反应性的活化基团修饰。在其它优选实施方式中，连接部分是4-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，其介导融合蛋白中的氨基与治疗剂中的硫醇基之间的缀合。在又更优选的实施方式中，连接部分4-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在第一步骤中与融合蛋白结合，更优选与融合蛋白的外部赖氨酸结合，并在第二步骤中与融合蛋白残基中的治疗剂侧链结合。

本发明的纳米颗粒及其制备方法

在另一方面，本发明涉及包含多个拷贝的根据本发明第一方面的融合蛋白的纳米颗粒。

如本领域技术人员将认识到的，“纳米颗粒”是其尺寸以纳米测量的微观颗粒。本发明的纳米颗粒包括由多个拷贝的本发明的融合蛋白的聚集产生的纳米颗粒，如先前章节所定义的。在用本发明的融合蛋白制备纳米颗粒的方法中，本发明的融合蛋白制剂包括本发明的融合蛋白的单体形式，其在热力学上有利于形成非共价静电结合(unions)并在低盐缓冲液的条件下自发聚集。

本领域技术人员将认识到，纳米颗粒的尺寸可以在1与1000nm之间的范围内，更优选在2与500nm之间和5与500nm之间，甚至更优选在5与250nm之间，并且甚至更优选在10与100nm之间。

另外，根据本发明的纳米颗粒由多个拷贝的本发明的融合蛋白的组装产生。在优选的实施方式中，纳米颗粒包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、20、25个，更优选至少15个本发明的融合蛋白的单体。

在另一方面，本发明涉及制备包含多个拷贝的根据本发明第一方面的融合蛋白的纳米颗粒的方法，所述方法包括将所述融合蛋白的制剂置于低盐缓冲液中。

将理解的是，表述“低盐缓冲液”包括由一种或多种盐溶解于水中而产生的任何缓冲溶液，其具有适度的pH变化的能力，例如，其中溶解的一种或多种盐的量所导致的同渗容摩(重量克分子渗透浓度，osmolarity)低于或等于生理流体(如细胞质或细胞外介质)的同渗容摩。因此，低盐缓冲液被理解为将pH和同渗容摩保持在生理值范围内，并将在生理温度范围内使用。

本领域技术人员将认识到，生理温度范围可以在15与45℃之间，更优选在20与40℃之间，甚至更优选在25与39℃之间，又甚至更优选在30与37℃之间摆动。本领域技术人员还将认识到，低盐缓冲液的同渗容摩将在100与400毫渗透压摩尔/L(mOsm/L)之间的范围内，优选在150与350mOsm/L之间，更优选在200与300mOsm/L之间，甚至更优选在225与275mOsm/L之间。

适用于本发明的低盐缓冲液例如是Tris-右旋糖缓冲液(20mM Tris+5％右旋糖，pH 7.4)、Tris-NaCl缓冲液(20mM Tris，500NaCl，pH 7.4)、PBS-甘油缓冲液(磷酸盐缓冲盐水，PBS，pH 7.4，其是本领域公知的，+10％甘油)、Tris缓冲盐水(TBS)-右旋糖(20mMTris-HCl缓冲液pH 7.5，是本领域公知的，200NaCl，+5％右旋糖)、Tris缓冲盐水-吐温20(TBST)缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.5、200mM NaCl，+0.01％吐温20)，或本领域已知的pH不低于6的任何生理缓冲液。

在本发明的优选实施方式中，本发明的方法的低盐缓冲液选自碳酸盐缓冲液、Tris缓冲液和磷酸盐缓冲液。

在本发明的特别优选的实施方式中，本发明的方法的低盐缓冲液是碳酸盐缓冲液，其包含浓度在100与300nM之间的碳酸氢钠。在本发明的另一特别优选的实施方式中，本发明的方法的低盐缓冲液是Tris缓冲液，其包含浓度在10与30nM之间的Tris。在本发明的方法的另一特别优选的实施方式中，本发明的低盐缓冲液是磷酸盐缓冲液，其包含总浓度在5mM与20mM之间的Na₂HPO₄和NaH₂PO₄。

在本发明的甚至更优选的实施方式中，本发明的方法的低盐缓冲液还包含右旋糖和/或甘油。

在本发明再更优选的实施方式中，本发明的方法的低盐缓冲液具有在6.5与8.5之间的pH。

在本发明的甚至更优选的实施方式中，本发明的方法的低盐缓冲液选自：

(i)166mM NaHCO₃，pH 7.4

(ii)20mM Tris，500mM NaCl，5％右旋糖，pH 7.4

(iii)140mM NaCl，7.5mM Na₂HPO₄，2.5mM NaH₂PO₄，10％甘油，pH 7.4。

在本发明的另一方面中，本发明涉及包含多个拷贝的本发明第一方面的融合蛋白的纳米颗粒或根据本发明的用于制备纳米颗粒的方法制备的纳米颗粒。

因此，本发明的纳米颗粒包含多个拷贝的本发明的融合蛋白的聚集体(aggregates)，这是由它们的结构中区域之间的静电相互作用而导致的，有利于它们在生理条件下进行非共价结合和偶联。由于本发明的用于制备纳米颗粒的方法包括将本发明的融合蛋白制剂置于低盐缓冲液中，因此应理解，由此形成的纳米颗粒还包含多个拷贝的融合蛋白的聚集体。

在本发明的优选实施方式中，本发明的纳米颗粒具有在10与100nm之间的直径。

在另一方面，本发明涉及制备根据本发明的纳米颗粒的方法，其中纳米颗粒最初由融合蛋白在其与治疗剂缀合之前的组装形成，并且在第二步骤中，纳米颗粒与治疗剂接触，使得一个或多个拷贝的治疗剂与预先形成的纳米颗粒缀合。因此，取决于纳米颗粒是否被活化或其中治疗剂被活化，本发明涉及用于获得根据本发明的纳米颗粒的方法，所述方法包括

a)放置融合蛋白的制剂，其包含

(i)聚阳离子肽，

(ii)间插多肽区域，其为Stefin A或其变体，和

(iii)富含带正电荷的氨基酸的区域，

其中聚阳离子肽和富含带正电荷的氨基酸的区域位于蛋白的末端，并且其中融合蛋白以活化形式提供，其中融合蛋白的所述活化形式在间插区域中含有反应性基团，所述反应性基团能够与澳瑞他汀反应，并且其中所述放置在足以形成包含多个拷贝的融合蛋白的纳米颗粒的条件下进行，和

b)在足以在融合蛋白中的反应性基团与澳瑞他汀之间形成键的条件下使所述纳米颗粒与澳瑞他汀接触。

可选地，本发明还涉及制备根据本发明的纳米颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：

b)放置融合蛋白的制剂，其包含

i.聚阳离子肽，

ii.间插多肽区域，其为stefin A或其变体，和

iii.富含带正电荷的氨基酸的区域，

其中聚阳离子肽和富含带正电荷的氨基酸的区域位于蛋白的末端，并且其中所述放置在足以形成包含多个拷贝的融合蛋白的纳米颗粒的条件下进行，和

b)使所述融合蛋白与活化形式的澳瑞他汀接触，其中所述活化形式的澳瑞他汀含有能够与融合蛋白的间插区域中的至少一个基团反应的反应性基团，并且其中所述接触在足以在澳瑞他汀中的反应性基团和间插多肽区域中的一个或多个基团之间形成键的条件下进行。

上文已经详细定义了术语“融合蛋白”、“聚阳离子肽”、“间插多肽区域”、“stefinA”、“Stefin A的变体”、“富含带正电荷的氨基酸的区域”、“纳米颗粒”和“活化”，并且这些术语同等适用于根据本发明的用于获得纳米颗粒的方法。

澳瑞他汀或融合蛋白的活化可基本上如上文所述在用于获得根据本发明的融合蛋白的方法的情况下进行。在一个实施方式中，融合蛋白内或澳瑞他汀内允许融合蛋白或澳瑞他汀被活化的基团包括但不限于，羧基、胺、亚胺、硫醇、砜、羟基、硫酸根、和磷酸根部分，其中许多是本领域技术人员通常已知的。在优选的实施方式中，活化的融合蛋白中的一个或多个反应性基团位于间插区域中，但不排除在融合蛋白的其它区域中也可以发现另外的反应性基团。

在优选的实施方式中，介导融合蛋白和治疗剂之间的键的连接部分是双功能交联剂，并且更优选地是异双功能交联剂。在优选的实施方式中，连接部分在第一步骤中与活化的治疗剂反应并在第二步骤中与融合蛋白反应。在另一个实施方式中，连接部分在第一步骤中与融合蛋白反应并在第二步骤中与治疗剂反应。

因此，在本发明的一个实施方式中，治疗剂的活化形式含有与融合蛋白的肽区域中(优选在融合蛋白的间插区域中)的残基的至少一个侧链反应的基团。在另一个优选的实施方式中，所述残基是外部赖氨酸。在本发明的另一优选实施方式中，与融合蛋白的间插区域的侧链反应的活化的治疗剂(优选是化疗剂)的基团是硫醇基。

在进一步优选的实施方式中，连接部分是4-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，其介导活化的治疗剂与本章节前述实施方式中指示的融合蛋白的肽区域的残基侧链之间的缀合。在又更优选的实施方式中，在第一步骤中，将连接部分4-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯与澳瑞他汀结合，并在第二步骤中与融合蛋白残基中的侧链(更优选与融合蛋白的外部赖氨酸，甚至更优选与融合蛋白间插区域的外部赖氨酸)结合。

本发明的融合蛋白和纳米颗粒的治疗用途

在另一方面中，本发明涉及用于医学的根据本发明的融合蛋白或纳米颗粒。在另一方面中，本发明涉及根据本发明的融合蛋白或纳米颗粒在治疗患有对形成本发明融合蛋白的部分的治疗剂有反应的疾病的患者中的用途。

如本文所用的，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或改善状况、障碍或疾病的进展、严重性和/或持续时间，或改善状况、障碍或疾病的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨别的症状)。术语“治疗(treat、treatment和treating)”还指改善状况、障碍或疾病的不一定能被患者辨别的至少一种可测量的物理参数。此外，“治疗(treat、treatment和treating)”还指在物理上通过例如，稳定可辨别的症状，在生理上通过例如，稳定物理参数，或者在这两方面上抑制状况、障碍或疾病的进展。“治疗(treat、treatment和treating)”也可以指状况、障碍或疾病的减少或稳定。

本领域技术人员将理解，通过在医学中使用，本发明的融合蛋白或纳米颗粒可向患者给予以诱导治疗反应。

治疗反应包括抑制、减少或停止(arrest)患者遭受的病理状况或疾病的原因；消除、减少、停止或改善状况或疾病的症状；或消灭、停止或减缓患者的状况或疾病的进展。

本领域技术人员将认识到，适用于医学的本发明的融合蛋白或纳米颗粒可以与药学上可接受的载体一起提供。如本文所用的，术语“药学上可接受的载体”是指任何类型的无毒、惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或配制辅料。Remington′sPharmaceutical Sciences.Ed.by Gennaro，Mack Publishing，Easton，Pa.，1995公开了用于配制药物组合物的各种载体及制备其的已知技术。

因此，包含本发明的融合蛋白或纳米颗粒和药学上可接受的载体的组合物是药物组合物。

本发明的药物组合物可以通过本领域已知的任何方式(包括口服途径和胃肠外途径)向患者给予。根据这样的实施方式，本发明的组合物可以通过注射(例如，静脉内、皮下或肌内、腹膜内注射)、直肠、阴道、局部(如通过粉末、乳膏、软膏或滴剂)或通过吸入(如通过喷雾)给予。

A-本发明的融合蛋白或纳米颗粒在治疗癌症中的用途。

本发明的另一实施方式涉及本发明的融合蛋白和纳米颗粒、或其对应的药物组合物，其中聚阳离子肽是能够与细胞表面上的受体特异性相互作用的序列，所述序列能够促进融合蛋白内化至细胞中，用于治疗癌症。

如本文所用的，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或改善癌症的进展、严重性和/或持续时间，或改善癌症的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨别的症状)。术语“治疗(treat、treatment和treating)”还指改善癌症的不一定能被患者辨别的至少一种可测量的物理参数，如肿瘤的生长。此外，“治疗(treat、treatment和treating)”还指在物理上通过例如，稳定可辨别的症状，在生理上通过例如，稳定物理参数，或者在这两方面上抑制癌症的进展。“治疗(treat、treatment和treating)”也可以指肿瘤尺寸或癌细胞计数的减少或稳定。

术语“癌症”是指这样的一组疾病：涉及异常、不受控制的细胞生长和增殖(瘤形成)，有可能侵入或扩散(转移)到有机体的其它组织、器官或一般而言远处的部分；转移是癌症和癌性肿瘤的恶性的标志之一。癌细胞的异常生长和/或增殖是遗传因素和环境因素的改变其正常生理的组合的结果。癌细胞的生长和/或增殖异常导致生理障碍，并且在许多情况下，由于受影响的细胞类型、组织和器官的功能障碍或功能丧失，导致个体死亡。

术语“癌症”包括但不限于，乳腺癌、心脏癌、小肠癌、结肠癌、脾癌、肾癌、膀胱癌、头癌、颈癌、卵巢癌、前列腺癌、腺癌、脑癌、胰腺癌、皮肤癌、骨癌、骨髓癌、血癌、胸腺癌、子宫癌、睾丸癌、肝胆系统癌和肝癌；除肿瘤之外，诸如但不限于腺瘤、血管肉瘤、星形细胞瘤、上皮癌、生殖细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、血管内皮瘤、血管肉瘤、血肿、肝母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、肝胆癌、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤和畸胎瘤。此外，此术语包括脚拇指恶性黑素瘤(acrolentiginousmelanoma)、光化性角化病、腺癌、腺样囊样癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞癌(adenosquamuscarcinoma)、星形细胞肿瘤、巴多林腺癌(前庭大腺癌，Bartholin gland carcinoma)、基底细胞癌、支气管腺癌、毛细血管类癌、癌、癌肉瘤、胆管癌(cholangiocarcinoma)、囊腺瘤、内胚窦瘤(endodermal sinus tumor)、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样腺癌(endometrioid adenocarcinoma)、室管膜肉瘤、尤文肉瘤、局灶性结节性增生(focalnodular hyperplasia)、生殖细胞肿瘤、成胶质细胞瘤、胰高血糖素瘤(glucagonoma)、血管母细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝腺瘤(hepatic adenoma)、肝腺瘤(hepaticadenomastosis)、肝细胞癌、肝胆癌(hepatobilliary cancer)、胰岛瘤、上皮内瘤变(intraepithelial neoplasia)、鳞状细胞上皮内瘤变(squamous cell intraepithelialneoplasia)、浸润性鳞状细胞癌、大细胞癌、平滑肌肉瘤、黑素瘤、恶性黑素瘤、恶性间皮瘤、肌瘤(medulobastoma)、髓上皮瘤、黏液表皮样癌、神经母细胞瘤、神经上皮腺癌、结节状黑素瘤、骨肉瘤、乳头状浆液性腺癌(papillary serous adenocarcinoma)、垂体瘤、浆细胞瘤、假性肉瘤、肺母细胞瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌、微细胞癌、软组织癌、生长抑素分泌肿瘤、鳞状癌、鳞状细胞癌、未分化癌、葡萄膜黑素瘤、疣状癌(verrucous carcinoma)、血管活性肠肽瘤(vipoma)、肾母细胞瘤(维尔姆瘤，Wilm tumor)、脑内癌、头颈癌、直肠癌、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、微细胞癌和非微细胞癌、转移性黑素瘤、雄激素非依赖性转移性前列腺癌、雄激素依赖性转移性前列腺癌和乳腺癌。

在本发明的甚至更优选的实施方式中，本发明的融合蛋白或纳米颗粒的聚阳离子肽是CXCR4配体，并且待用本发明的融合蛋白或纳米颗粒治疗的靶向癌症的特征在于包含表达CXCR4受体的细胞。在更优选的实施方式中，表达或过表达CXCR4的细胞癌细胞是转移性干细胞。如本文所用，术语“转移性干细胞”是指负责转移起始和转移维持的细胞。

在本发明又更优选的实施方式中，本发明的融合蛋白或纳米颗粒的CXCR4配体选自T22肽、V1肽、CXCL12肽、vCCL2肽或其功能上等同的变体。

在本发明的另一个更优选的实施方式中，待用本发明的融合蛋白或纳米颗粒治疗的癌症选自胰腺癌和结直肠癌。

在本发明的另一个更优选的实施方式中，待用本发明的融合蛋白或纳米颗粒治疗的癌症是白血病。

如本文所用，术语“白血病”泛指造血器官的进行性恶性疾病并且通常以白细胞及其前体在血液和骨髓中的增殖和发育异常为特征。可用本文提供的化合物或方法治疗的示例性白血病包括，例如，急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病、成人T细胞性白血病、白细胞缺少性白血病、非白血性白血病(a leukocythemic leukemia)、嗜碱性白血病、胚细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚细胞性白血病、嗜酸细胞性白血病、格罗斯氏白血病、毛细胞性白血病、成血细胞性白血病(hemoblastic leukemia)、成血细胞性白血病(hemocytoblastic leukemia)、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞白血病、白细胞减少性白血病、淋巴细胞性白血病(lymphatic leukemia)、成淋巴细胞白血病、淋巴细胞性白血病(lymphocytic leukemia)、成淋巴白血病、类淋巴白血病、淋巴肉瘤细胞性白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、小原粒型白血病、单核细胞性白血病、成髓细胞白血病、髓细胞性白血病、髓样粒细胞性白血病、粒-单核细胞型白血病、内格利白血病、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞性白血病、前髓细胞性白血病、里德尔细胞性白血病、希林氏白血病、干细胞白血病、亚白血性白血病、或未分化细胞性白血病。

在本发明的甚至更优选的实施方式中，本发明的融合蛋白或纳米颗粒的聚阳离子肽是CXCR4配体，并且待用本发明的融合蛋白或纳米颗粒治疗的白血病的特征在于包含表达CXCR4受体的细胞。在更优选的实施方式中，待治疗的白血病是CXCR4+AML。

在本发明的另一个优选实施方式中，本发明的融合蛋白和纳米颗粒用于治疗癌性肿瘤，其中癌性肿瘤是原发性肿瘤或转移。

本发明的其它方面

1.融合蛋白，其包含

(i)聚阳离子肽，

(ii)间插多肽区域，其为stefin A或其变体，和

(iii)富含带正电荷的氨基酸的区域，

其中间插多肽区域与至少一种澳瑞他汀分子缀合。

2.根据方面1的融合蛋白，其中聚阳离子肽选自

(i)能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进融合蛋白在所述细胞上的内化的序列，

(ii)富含精氨酸的序列，

(iii)GWH1肽，

(iv)CD44配体，

(v)能够穿过血脑屏障的肽，

(vi)细胞穿透肽，和

(vii)核仁素结合肽。

3.根据方面2的融合蛋白，其中聚阳离子肽包含能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进融合蛋白在所述细胞上的内化的序列，所述序列是CXCR4配体。

4.根据方面3的融合蛋白，其中CXCR4配体是选自以下的肽：包含序列RRWCYRKCYKGYCYRKCR(SEQ ID NO：5)的肽、V1肽(SEQ ID NO：6)、CXCL12(SEQ ID NO：7)肽、vCCL2(SEQ ID NO：8)或其功能上等同的变体。

5.根据方面2的融合蛋白，其中聚阳离子肽是包含选自RRRRRRRRR(SEQ ID NO：1)、RRRGRGRRR(SEQ ID NO：2)、RARGRGRRR(SEQ ID NO：3)和RARGRGGGA(SEQ ID NO：4)的序列的富含精氨酸的序列。

6.根据方面2的融合蛋白，其中聚阳离子肽是CD44配体A5G27(SEQ ID NO：15)或FNI/II/V(SEQ ID NO：16)。

7.根据方面2的融合蛋白，其中聚阳离子肽是能够穿过血脑屏障的肽，选自Seq-1-7(SEQ ID NO：17)、Seq-1-8(SEQ ID NO：18)、Angiopep-2-7(SEQ ID NO：19)。

8.根据方面1至7中任一项的融合蛋白，其中富含带正电荷的氨基酸的区域是聚组氨酸区域。

9.根据方面8的融合蛋白，其中聚组氨酸区域包含2与10之间个连续的组氨酸残基。

10.根据方面8的融合蛋白，其中所述聚组氨酸区域选自由HAAHAH序列、HTHTHTHTH序列和HEHEHEHEH序列组成的组。

11.根据方面1至10中任一项的融合蛋白，其中Stefin A是人Stefin A，并且其中氨基酸71至73被异源肽插入所替换。

12.根据方面11的融合蛋白，其中异源肽插入由氨基酸NGP组成。

13.根据方面12的融合蛋白质组，其中Stefin A包含V48D突变和/或G4W突变。

14.根据方面1至13中任一项的融合蛋白质组，其中澳瑞他汀是一甲基澳瑞他汀e。

15.根据方面1至14中任一项的融合蛋白，其中聚阳离子肽位于融合蛋白的N末端，而富含带正电荷的氨基酸的区域位于融合蛋白的C末端，或者其中富含带正电荷的氨基酸的区域位于融合蛋白的N末端，而聚阳离子肽位于融合蛋白的C末端。

16.根据方面1至15中任一项的融合蛋白，其中聚阳离子区通过第一肽连接体连接至间插多肽和/或其中间插多肽通过第二肽连接体连接至富含带正电荷的氨基酸的区域。

17.根据方面16的融合蛋白，其中第一肽连接体包含GGSSRSS序列(SEQ ID NO：35)或GGGNS序列(SEQ ID NO：36)。

18.根据方面1至14中任一项的融合蛋白，其中间插多肽包含至少3个拷贝的澳瑞他汀E。

19.用于制备根据方面1至18中任一项的融合蛋白的方法，包括

a)提供融合蛋白，其包含

i.聚阳离子肽，

ii.间插多肽区域，其为stefin A或其变体，和

iii.富含带正电荷的氨基酸的区域，

b)使所述融合蛋白与能够与融合蛋白的间插区域中的至少一个基团反应的澳瑞他汀E的活化形式接触，并且其中接触在足以在澳瑞他汀E中的反应性基团和间插多肽区域中的基团之间形成键的条件下进行。

20.根据方面19的方法，其中澳瑞他汀E的活化形式含有与间插多肽区域中的至少一个侧链反应的基团。

21.根据方面20的方法，其中与间插多肽区域中的至少一个侧链反应的基团是硫醇基。

22.用于制备纳米颗粒的方法，所述纳米颗粒包含多个拷贝的根据方面1至15中任一项的融合蛋白，所述方法选自

(i)方法，其包括将所述融合蛋白的制剂放置在足以将多个拷贝的融合蛋白组装成纳米颗粒的条件下，或

(ii)方法，其包括

i.将包含以下的融合蛋白的制剂放置在足以形成包含多个拷贝的融合蛋白的纳米颗粒的条件下：

1.聚阳离子肽，

2.间插多肽区域，其为Stefin A或其变体，和

3.富含带正电荷的氨基酸的区域，

其中聚阳离子肽和富含带正电荷的氨基酸的区域位于蛋白的末端，并且其中融合蛋白以活化形式提供，其中融合蛋白的所述活化形式在间插区域中含有反应性基团，和

ii.使所述纳米颗粒与活化形式的澳瑞他汀E接触，所述活化形式的澳瑞他汀E包含能够与融合蛋白中的反应性基团反应的基团，其中所述接触在足以在融合蛋白中的反应性基团和澳瑞他汀E中的基团之间形成键的条件下进行。

23.根据方面22的方法，其中低盐缓冲液选自碳酸盐缓冲液、Tris缓冲液和磷酸盐缓冲液。

24.根据方面23的方法，其中碳酸盐缓冲液包含浓度在100与300mM之间的碳酸氢钠，Tris缓冲液包含浓度在10与30mM之间的Tris和/或其中磷酸盐缓冲液包含总浓度在5mM与20mM之间的Na₂HPO₄和NaH₂PO₄。

25.根据方面22至24的方法，其中低盐缓冲液还包含右旋糖和/或甘油。

26.根据方面22至25中任一项的方法，其中缓冲液的pH在6，5与8，5之间。

27.根据方面22至26中任一项的方法，其中缓冲液选自

(i)166mM NaHCO₃，pH 7.4，

(ii)20mM Tris 500mMNaCl5％右旋糖pH 7.4，和

(iii)140mM NaCl，7.5mM Na2HPO₄，2.5mM NaH2PO410％甘油pH7.4。

28.纳米颗粒，其包含多个拷贝的根据方面1至18中任一项的融合蛋白或已通过根据方面22至27中任一项的方法获得。

29.根据方面28的纳米颗粒，其直径在10与100nm之间。

30.用于医学的根据方面1至18中任一项的融合蛋白或根据方面28或29的纳米颗粒。

31.根据方面1至18中任一项的融合蛋白或根据方面28或29的纳米颗粒，其中聚阳离子肽是能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进融合蛋白在所述细胞上的内化的序列，其中所述细胞是存在于癌症中的肿瘤细胞，用于治疗癌症。

32.用于根据方面31用途的融合蛋白或纳米颗粒，其中聚阳离子肽是CXCR4配体，并且其中癌症的特征在于其包括表达或过表达CXCR4的癌细胞。

33.用于根据方面32用途的融合蛋白或纳米颗粒，其中CXCR4配体选自包含序列RRWCYRKCYKGYCYRKCR(SEQ ID NO：1)的肽、V1肽(SEQ ID NO：2)、CXCL12肽(SEQ ID NO：3)、vCCL2肽(SEQ ID NO：4)或其功能上等同的变体。

34.用于根据方面32或33用途的融合蛋白或纳米颗粒，其中表达或过表达CXCR4的癌细胞是转移性干细胞。

35.用于根据方面31至34用途的融合蛋白或纳米颗粒，其中癌症是胰腺癌或结直肠癌。

36.用于根据方面31至35中任一项用途的融合蛋白或纳米颗粒，其中肿瘤癌症是原发性肿瘤或转移。

实施例

实施例1

治疗性纳米缀合物的合成

T22-STM-H6-Aur治疗性纳米缀合物的合成。

在室温下，使T22-STM-H6蛋白质纳米颗粒(在166mM NaCO3H pH＝8的缓冲液中)与马来酰亚胺官能化的一甲基澳瑞他汀E(MMAE)(重悬在50％PBS/50％乙腈中)以1∶50的蛋白质：MMAE之比，在一锅(one-pot)反应中反应4h。随后将生成的纳米缀合物装入之前装有Ni²⁺(NiCl₂)的HiTrap螯合HP柱(GE Healthcare)中，进行IMAC亲和色谱法，并用洗涤缓冲液(20mM Tris，500mM NaCl，10mM咪唑pH＝8)以恒定流动在柱内洗涤30min以便去除未反应的MMAE分子，之后再用洗脱缓冲液(20mM Tris，500mM NaCl，500mM咪唑pH＝8)进行一步等度洗脱。然后使用12-14MWCO膜，在4℃下O/N，将洗脱的纳米缀合物针对166mM NaCO3H pH＝8的缓冲液透析(dyalized)以去除含高浓度咪唑的洗脱缓冲液。最终的纳米缀合物最后在无菌层流罩内通过0.22μm孔过滤器过滤以供产物灭菌。通过动态光散射和MALDI-TOF质谱分析法对所得的T22-STM-H6-澳瑞他汀纳米缀合物进行理化表征。

T22-GFP-H6-Aur治疗性纳米缀合物的合成。

在室温下，使T22-GFP-H6蛋白质纳米粒子(在166mM NaCO3H pH＝8的缓冲液中)与马来酰亚胺官能化的一甲基澳瑞他汀E(MMAE)(重悬在50％PBS/50％乙腈中)以1∶50的蛋白质：MMAE之比，在一锅反应中反应4h。随后将生成的纳米缀合物装入之前装有Ni²⁺(NiCl₂)的HiTrap螯合HP柱(GE Healthcare)中，进行IMAC亲和色谱法，并用洗涤缓冲液(20mM Tris，500mM NaCl，10mM咪唑pH＝8)以恒定流动在柱内洗涤30min以便去除未反应的MMAE分子，之后再用洗脱缓冲液(20mM Tris，500mM NaCl，500mM咪唑pH＝8)进行一步等度洗脱。然后使用12-14MWCO膜，在4℃下O/N，将洗脱的纳米缀合物针对166mM NaCO3H pH＝8的缓冲液透析以去除含高浓度咪唑的洗脱缓冲液。最终的纳米缀合物最后在无菌层流罩内通过0.22μm孔过滤器过滤以供产物灭菌。通过动态光散射和MALDI-TOF质谱分析法对所得的T22-GFP-H6-澳瑞他汀纳米缀合物进行理化表征。

实施例2

T22-STM-H6-Aur纳米缀合物的表征和药物/纳米颗粒比的测定

T22-GFP-H6的纳米颗粒平均由15个单体形成，并且T22-GFP-H6-FdU的每个单体都结合约4分子的低聚-FdU。这相当于每个纳米颗粒约60分子的低聚-FdU。至于T22-GFP-H6-澳瑞他汀，数据显示每个蛋白质其结合多至30个澳瑞他汀，这相当于每个纳米颗粒约450个澳瑞他汀。

T22-STM-H6的纳米颗粒平均由15-20个单体形成。质谱分析法表明不少于3个澳瑞他汀分子与每个蛋白质单体结合，并且每个单体至少多达超过15个澳瑞他汀分子。

实施例3

在扩散的CXCR4+AML小鼠模式中，与T22-GFP-H6-澳瑞他汀相比T22-STM-H6-澳瑞他汀的抗肿瘤作用的评估

方法

用萤光素酶转染的THP1细胞(THP-1-Luci；1×10⁶个细胞/200μL)静脉内(IV)注射NSG(NOD-scid IL2Rγ^缺失(null))雌性小鼠(5周龄)。小鼠被随机分为三个不同的实验组。一组(VEH；n＝3)用纳米缀合物的媒介物(缓冲液NaCO₃H+NaCl pH＝8)IV注射，实验组(T22-STM-AUR；n＝2)用100μg的T22-STM-H6-澳瑞他汀IV注射，以及阳性对照组(T22-GFP-AUR；n＝1)用100μg的T22-GFP-H6-澳瑞他汀IV注射。所有化合物每天给予，共9剂。使用IVIS Spectrum设备每周3次监测小鼠中AML扩散的演变，直到安乐死当天。与BLI分析在同一天测量动物体重。在第一只动物出现相关疾病迹象，如无法行动或体重减轻10％的当天对所有小鼠实施安乐死。切除浸润组织(骨髓、肝和脾)分析离体BLI水平。在体内和离体研究中，生物发光测量均表示为BLI的总通量(光子/秒；辐射光子)±SE。

结果

在静脉内注射表达高水平CXCR4受体的人细胞系THP-1后，在扩散的AML小鼠模型中体内评估纳米缀合物T22-STM-H6-澳瑞他汀的抗肿瘤活性。注射细胞后两天，开始每日给予纳米缀合物或媒介物。使用可监测THP-1 AML细胞发出的生物发光的设备IVIS Spectrum对白血病细胞的扩散进行非侵入性评估。从第6-8天直到实验结束，纳米缀合物处理的(T22-STM-H6-澳瑞他汀和T22-GFP-H6-澳瑞他汀)小鼠显示的发光强度低于媒介物。这些观察到的组间差异从第8天直到第13天逐渐增加，即使在第10天给予最后一剂纳米缀合物后过了三天期间也是如此(图1和图2)。此外，在离体测定中对白血病细胞(骨髓、肝和脾)浸润的器官的测量也显示出白血病扩散减少(图3)。在实验过程中体重没有改变，并且在通过H&E染色对所有器官进行组织病理学分析后，在尸体检验过程中没有在宏观上观察到毒性迹象，也没有在显微镜下观察到毒性迹象。

实施例4

在皮下结直肠癌模型中给予T22-SM-H6-Aur和T22-GFP-H6-Aur纳米缀合物后有丝分裂崩溃增加。

M5皮下CRC模型是从结直肠癌患者样品，在瑞士裸鼠中生成的。将200μg的T22-STM-H6-Aur缀合物(澳瑞他汀与蛋白质纳米颗粒T22-STM-H6缀合)或326μg的T22-GFP-H6-Aur缀合物(澳瑞他汀与蛋白质纳米颗粒T22-GFP-H6缀合)向动物i.v.给予，并在缀合物给予后2h、5h、24小时通过对五个H&E染色区域进行计数来确定有丝分裂崩溃的细胞数量，并与在给予等量相应的未缀合纳米载体T22-STM-H6、T22-GFP-H6或对照缓冲液后有丝分裂崩溃的细胞数量进行比较。用T22-STM-H6-Aur纳米缀合物处理的小鼠的结果在图4中显示，而用T22-GFP-H6-Aur纳米缀合物处理的小鼠的结果在图5中显示。

结果表明，与用未缀合的纳米载体或用对照缓冲液处理的小鼠相比，用缀合的纳米载体处理的小鼠的肿瘤中有丝分裂崩溃的细胞数量显著增加。

实施例5

纯化后组氨酸源蛋白质构建体的生化表征，经标准碳酸钠缓冲液或含盐的相同缓冲液透析的富含组氨酸的蛋白质的体积大小分布

结果在表1中显示。

序列表

<110> 巴塞罗那自治大学

圣十字圣保罗医院基金会

生物技术网络研究中心联合会

<120> 治疗性纳米缀合物及其用途

<130> P16858EP00

<160> 36

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 聚阳离子肽

<400> 1

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 聚阳离子肽

<400> 2

Arg Arg Arg Gly Arg Gly Arg Arg Arg

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 聚阳离子肽

<400> 3

Arg Ala Arg Gly Arg Gly Arg Arg Arg

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 聚阳离子肽

<400> 4

Arg Ala Arg Gly Arg Gly Gly Gly Ala

1 5

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T22肽

<400> 5

Arg Arg Trp Cys Tyr Arg Lys Cys Tyr Lys Gly Tyr Cys Tyr Arg Lys

1 5 10 15

Cys Arg

<210> 6

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> V1肽

<400> 6

Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Cys Leu Gly Tyr Gln

1 5 10 15

Lys Arg Pro Leu Pro

20

<210> 7

<211> 67

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CXCL12肽

<400> 7

Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser

1 5 10 15

His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro

20 25 30

Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln

35 40 45

Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys

50 55 60

Ala Leu Asn

65

<210> 8

<211> 68

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> vCCL2肽

<400> 8

Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Cys Leu Gly Tyr Gln

1 5 10 15

Lys Arg Pro Leu Pro Gln Val Leu Leu Ser Ser Trp Tyr Pro Thr Ser

20 25 30

Gln Leu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg

35 40 45

Gln Val Cys Ala Asp Lys Asp Trp Val Lys Lys Leu Met Gln Gln Leu

50 55 60

Pro Val Thr Ala

65

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T140肽

<220>

<221> 各种各样的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是L-3-(2-萘基l)丙氨酸

<220>

<221> 各种各样的特征

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是D-Lys

<220>

<221> 各种各样的特征

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是L-瓜氨酸

<400> 9

Arg Arg Xaa Cys Tyr Arg Lys Xaa Pro Tyr Arg Xaa Cys Arg

1 5 10

<210> 10

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TN14003肽

<220>

<221> 各种各样的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是L-3-(2-萘基l)丙氨酸

<220>

<221> 各种各样的特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是L-瓜氨酸

<220>

<221> 各种各样的特征

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是D-Lys

<220>

<221> 各种各样的特征

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是L-瓜氨酸

<400> 10

Arg Arg Xaa Cys Tyr Xaa Lys Xaa Pro Tyr Arg Xaa Cys Arg

1 5 10

<210> 11

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TC 14012肽

<220>

<221> 各种各样的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是L-3-(2-萘基l)丙氨酸

<220>

<221> 各种各样的特征

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是D-瓜氨酸

<220>

<221> 各种各样的特征

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是L-瓜氨酸

<400> 11

Arg Arg Xaa Cys Tyr Glu Lys Xaa Pro Tyr Arg Xaa Cys Arg

1 5 10

<210> 12

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TE14011肽

<220>

<221> 各种各样的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是L-3-(2-萘基l)丙氨酸

<220>

<221> 各种各样的特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是L-瓜氨酸

<220>

<221> 各种各样的特征

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是D-谷氨酸

<220>

<221> 各种各样的特征

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是L-瓜氨酸

<400> 12

Arg Arg Xaa Cys Tyr Xaa Lys Xaa Pro Tyr Arg Xaa Cys Arg

1 5 10

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TZ14011肽

<220>

<221> 各种各样的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是L-3-(2)-萘基l)丙氨酸

<220>

<221> 各种各样的特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是L-瓜氨酸

<220>

<221> 各种各样的特征

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是D-赖氨酸

<220>

<221> 各种各样的特征

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是L-瓜氨酸

<400> 13

Arg Arg Xaa Cys Tyr Xaa Lys Xaa Pro Tyr Arg Xaa Cys Arg

1 5 10

<210> 14

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GW-H1肽

<400> 14

Gly Tyr Asn Tyr Ala Lys Lys Leu Ala Asn Leu Ala Lys Lys Phe Ala

1 5 10 15

Asn Ala Leu Trp

20

<210> 15

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A5G27

<400> 15

Arg Leu Val Ser Tyr Asn Gly Ile Ile Phe Phe Leu Lys

1 5 10

<210> 16

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FNI/II/V

<400> 16

Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu

1 5 10 15

Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly

20 25 30

Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr

35 40 45

Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile

50 55 60

Gly Arg Lys Lys Thr

65

<210> 17

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Seq-1-7肽

<400> 17

Lys Tyr Leu Ala Tyr Pro Asp Ser Val His Ile Trp Arg Lys Arg Lys

1 5 10 15

Arg Lys

<210> 18

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Seq-1-8肽

<400> 18

Lys Tyr Leu Ala Tyr Pro Asp Ser Val His Ile Trp Arg Lys Arg Lys

1 5 10 15

Arg Lys Arg

<210> 19

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Angiopep-2-7肽

<400> 19

Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr

1 5 10 15

Glu Glu Tyr Arg Lys Arg

20

<210> 20

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 核仁素结合肽

<400> 20

Lys Asp Glu Pro Gln Arg Arg Ser Ala Arg Leu Ser Ala Lys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Pro Lys Pro Glu Pro Lys Pro Lys Lys Ala Pro Ala Lys Lys

20 25 30

<210> 21

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 核仁素结合肽

<400> 21

Lys Asp Glu Pro Gln Arg Arg Ser Ala Arg Leu Ser Ala Lys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Pro Lys Pro Glu Pro Lys Pro Lys Lys Ala Pro Ala Lys Lys Arg

20 25 30

Lys Arg Lys Arg Lys Arg Lys

35

<210> 22

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Stefin A

<400> 22

Met Ile Pro Gly Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile

1 5 10 15

Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn

20 25 30

Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Val

35 40 45

Ala Gly Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr

50 55 60

Met His Leu Lys Val Phe Lys Ser Leu Pro Gly Gln Asn Glu Asp Leu

65 70 75 80

Val Leu Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr

85 90 95

Gly Phe

<210> 23

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接体序列

<400> 23

Ser Gly Gly Thr Ser Gly Ser Thr Ser Gly Thr Gly Ser Thr

1 5 10

<210> 24

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接体序列

<400> 24

Ala Gly Ser Ser Thr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Gly Ser Thr Thr

1 5 10 15

<210> 25

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接体序列

<400> 25

Gly Gly Ser Gly Gly Ala Pro

1 5

<210> 26

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接体序列

<400> 26

Gly Gly Gly Val Glu Gly Gly Gly

1 5

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接体序列

<400> 27

Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser

1 5 10

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接体序列

<400> 28

Ala Pro Ala Glu Thr Lys Ala Glu Pro Met Thr

1 5 10

<210> 29

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接体序列

<400> 29

Ala Ala Ala Leu Glu

1 5

<210> 30

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白酶切割位点

<400> 30

Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 31

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白酶切割位点

<400> 31

Ile Glu Asp Gly Arg

1 5

<210> 32

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白酶切割位点

<400> 32

Leu Val Pro Arg Gly Ser

1 5

<210> 33

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白酶切割位点

<400> 33

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

1 5

<210> 34

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白酶切割位点

<400> 34

Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro

1 5

<210> 35

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接体序列

<400> 35

Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser

1 5

<210> 36

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接体序列

<400> 36

Gly Gly Gly Asn Ser

1 5

Claims

1.融合蛋白，其包含

(i)聚阳离子肽，

(ii)间插多肽区域，其为stefin A或其变体，和

(iii)富含带正电荷的氨基酸的区域，

其中所述间插多肽区域与至少一种澳瑞他汀分子缀合。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述聚阳离子肽选自

(i)能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进所述融合蛋白在所述细胞上的内化的序列，

(ii)富含精氨酸的序列，

(iii)GWH1肽，

(iv)CD44配体，

(v)能够穿过血脑屏障的肽，

(vi)细胞穿透肽，和

(vii)核仁素结合肽。

3.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中CXCR4配体是选自以下的肽：包含序列RRWCYRKCYKGYCYRKCR(SEQ ID NO:5)的肽、V1肽(SEQ ID NO:6)、CXCL12(SEQ ID NO:7)肽、vCCL2(SEQ ID NO:8)或其功能上等同的变体。

4.根据权利要求1至7中任一项所述的融合蛋白，其中所述富含带正电荷的氨基酸的区域是聚组氨酸区域。

5.根据权利要求1至10中任一项所述的融合蛋白，其中Stefin A是人Stefin A，其中所述Stefin A包含V48D突变、G4W突变，并且其中氨基酸71至73被由氨基酸NGP组成的异源肽插入所替换。

6.根据权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白质组，其中所述澳瑞他汀是一甲基澳瑞他汀E。

7.根据权利要求1至14中任一项所述的融合蛋白，其中所述聚阳离子肽位于所述融合蛋白的N末端，而所述富含带正电荷的氨基酸的区域位于所述融合蛋白的C末端，或者其中所述富含带正电荷的氨基酸的区域位于所述融合蛋白的N末端，而所述聚阳离子肽位于所述融合蛋白的C末端。

8.用于制备根据权利要求1至18中任一项所述的融合蛋白的方法，包括

(i)提供融合蛋白，其包含

i.聚阳离子肽，

ii.间插多肽区域，其为stefin A或其变体，和

iii.富含带正电荷的氨基酸的区域，

其中所述聚阳离子肽和所述富含带正电荷的氨基酸的区域位于所述蛋白的末端，和

(ii)使所述融合蛋白与能够与所述融合蛋白的间插区域中的至少一个基团反应的澳瑞他汀E的活化形式接触，并且其中所述接触在足以在所述澳瑞他汀E中的反应性基团和所述间插多肽区域中的基团之间形成键的条件下进行。

9.用于制备纳米颗粒的方法，所述纳米颗粒包含多个拷贝的根据权利要求1至15中任一项所述的融合蛋白，所述方法选自

(i)方法，其包括将所述融合蛋白的制剂放置在足以将多个拷贝的所述融合蛋白组装成纳米颗粒的条件下，或

(ii)方法，其包括

i.将包含以下的融合蛋白的制剂放置在足以形成包含多个拷贝的所述融合蛋白的纳米颗粒的条件下：

1.聚阳离子肽，

2.间插多肽区域，其为Stefin A或其变体，和

3.富含带正电荷的氨基酸的区域，

其中所述聚阳离子肽和所述富含带正电荷的氨基酸的区域位于所述蛋白的末端，并且其中所述融合蛋白以活化形式提供，其中所述融合蛋白的所述活化形式在所述间插区域中含有反应性基团，和

ii.使所述纳米颗粒与活化形式的澳瑞他汀E接触，所述活化形式的澳瑞他汀E能够包含能够与所述融合蛋白中的反应性基团反应的基团，其中所述接触在足以在所述融合蛋白中的反应性基团和所述澳瑞他汀E中的基团之间形成键的条件下进行。

10.纳米颗粒，其包含多个拷贝的根据权利要求1至18中任一项所述的融合蛋白或其已通过根据权利要求22至27中任一项所述的方法获得。

11.根据权利要求1至18中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求28或29所述的纳米颗粒，用于医学。

12.根据权利要求1至18中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求28或29所述的纳米颗粒，其中所述聚阳离子肽是能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进所述融合蛋白在所述细胞上的内化的序列，其中所述细胞是存在于癌症中的肿瘤细胞，用于治疗癌症。

13.用于根据权利要求31的用途的融合蛋白或纳米颗粒，其中所述聚阳离子肽是CXCR4配体，并且其中所述癌症的特征在于其包括表达或过表达CXCR4的癌细胞。

14.用于根据权利要求32的用途的融合蛋白或纳米颗粒，其中所述CXCR4配体选自包含序列RRWCYRKCYKGYCYRKCR(SEQ ID NO:1)的肽、V1肽(SEQ ID NO:2)、CXCL12肽(SEQ ID NO:3)、vCCL2肽(SEQ ID NO:4)或其功能上等同的变体。

15.用于根据权利要求31至34用途的融合蛋白或纳米颗粒，其中所述癌症是胰腺癌或结直肠癌。