CN102811744A - 用于改善基因调节化合物的递送的化学修饰的细胞渗透性肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于胞内递送运载物的系统，包括选自具有至少4个碳原子的脂肪族线性或分支部分和/或包含2-4个环的环体系的至少一种组分A，所述环可包含选自N、S、O和P的若干个杂原子，其中组分A结合于细胞渗透性肽B和/或其非肽类似物。本发明还涉及该系统在疾病诊断、作为研究工具和作为靶向系统中的用途、包含该系统的组合物尤其是药物组合物、覆盖有该系统的材料以及其中掺有该递送系统的材料。最后，本发明涉及新的肽。

Description

用于改善基因调节化合物的递送的化学修饰的细胞渗透性肽
技术领域
本发明涉及用于胞内递送运载物(或负载物，cargo)的系统，该运载物包括选自具有至少4个碳原子的脂肪族线性或分支基团和/或包含2-4个环的环体系的至少一种组分A，该环可包含选自N、S、O和P的若干个杂原子，其中该(一种或多种)组分A结合于细胞渗透性肽B和/或其非肽类似物。
本发明还涉及所述系统在死亡诊断中作为研究工具和作为靶向系统的用途、包含该系统的组合物并且尤其是药物组合物、覆盖有该系统的材料以及其中合并(或掺入)有该递送系统的材料。最后，本发明涉及新的肽。
背景技术
疏水性质膜构成活体动物中细胞的主要屏障，其允许必要分子的构成性和调节性内流进入而阻止其他大分子进入细胞内部。尽管跨越质膜的能力对于细胞维持非常关键，但是其仍然是推进现有药物开发需要克服的主要障碍之一。在过去的40年中，已开发了若干种用于操纵基因表达的基于寡核苷酸(ON)的方法。所述基础方法涉及使用表达感兴趣的基因的细菌质粒。另外，为了评价不同基因的功能方面，这是在临床环境中可利用的非常具有吸引力的策略，即基因疗法。起初认为基因疗法用于遗传性基因疾病的矫正治疗。然而，在过去的15年中，尽管还研究了其他获得性疾病，但用于癌症的实验性基因疗法已成为经常使用的治疗方法[1]。
已出现了利用较短的ON-序列干扰基因表达的其他多种方法。最近积极开发了基于用于实现基因沉默的短干扰RNA(siRNA)和用于操纵剪切模式的剪切校正ON(SCO)的反义方法[2，3]。尽管它们是调节基因表达的有效化合物，但是其疏水性却阻止了细胞内摄作用。
尽管基因疗法对于未来各种疾病的治疗具有很大潜力，但是它具有一些严重的缺陷。首先，质粒较大，其大小通常超过1MDa，这使其不能透过细胞膜。第二，在临床试验中已使用病毒来实现治疗性基因的细胞内摄作用。尽管提供了递送基因的有效方法，但是这些方法可能会引起严重的免疫应答。因此，为了推进现有的基因疗法，需要更安全的递送系统，优选不依赖于病毒的使用。
因此，人们加强了对有效的非病毒递送载体的研究。在现今的技术领域中，已在利用基于阳离子脂质体(Lipofectamine)或多聚阳离子聚合物的载体，并且这些载体对于常用细胞系的转染非常有效。然而，大部分这些载体要么对血清蛋白敏感、不能转染完整的细胞群、对于“难转染的”细胞无效，要么毒性太强。对于现在市场上销售的载体而言，似乎高效力和高毒性之间存在正相关。因此，急需寻找能够克服上述问题的递送媒介物。
细胞渗透性肽(CPP)是近些年来关注度不断提高的一类肽。这是由于它们具有以相对无毒的方式运送各种本为非渗透性的大分子跨过细胞质膜的显著能力，如[4]中综述。这些肽的长度通常小于30个氨基酸(aa)并且具有阳离子和/或两性性质，其已被广泛用于体外和体内递送各种ON[5]。尽管这些肽一般是无毒的，但是仍存在一些与它们的用途有关的问题[6]。就ON-递送而言，CPP技术的一个缺点在于通常需要使肽共价结合至ON，这是一个繁杂的操作并且通常需要高浓度的肽结合物(轭合物)以获得显著的生物学反应[7，8]。一些研究已令人信服地显示简单地将CPP与ON混合的非共价共温育策略是有效的并且是一种无毒的方式。当使用与未经修饰CPP的共温育策略时，似乎所述复合物仍然被捕获在内涵体中并因此不能发挥生物反应[9]。理想条件下，将CPP设计成能够在胞吞作用之后更有效地逃逸内涵体区室(endosomal compartment)，由此使得它们与寡核苷酸或质粒非共价复合。已尝试将CPP的应用与已知的转染试剂组合以减少获得生物反应所需的转染试剂的量或将CPP与已知的融合肽一起加入。另一种策略是一起加入高浓度的趋溶酶体剂(向溶酶体剂，lysosomotrophic agent)氯喹以增加CPP/ON复合物的效力，这显著增加了转染但是却仅限于体外使用，而且所需要的高浓度氯喹还带来了毒性问题。
相关专利US 2007/0059353公开了一种具有细胞和核进入能力的脂质体。所提供的脂质体在其表面上具有包含多个连续精氨酸残基的肽，特别提供了其中的肽用疏水基团或疏水化合物修饰并且将该疏水基团或疏水化合物插入脂质双层中使得所述肽暴露在该双层表面上的脂质体。除了构建此类复杂载体的困难之外，这一递送系统的问题还在于它们是以脂质体为基础的。若干团队已报导了用基于脂质体的递送系统转染后基因表达谱发生了变化，这在很大程度上阻碍了它们的使用。另外，寡聚精氨酸倾向于保持与内涵体区室结合并因此对于递送而言不是最优的。一种改进的策略是用一种或多种能够促进内涵体逃逸的化学物种(或化学实存物，chemical entity)化学修饰新设计的或现有的CPP。
目前用于内涵体逃逸所选择的药物是氯喹(CQ)及其类似物。它是一种，正如它还被称作，趋溶酶体剂，其抑制内涵体酸化，在较高浓度下导致内涵体溶胀和破裂。
若干美国专利公开了氯喹单独使用或与其他药物组合使用以抵抗各种疾病的用途。例如，第4,181,725号美国专利和A.M.Krieg等人的美国专利申请20040009949公开了氯喹与抑制性核酸组合用于治疗各种自身免疫疾病的用途。
氯喹作为“趋溶酶体”剂能够从细胞内涵体/溶酶体释放物质的能力已被广泛记载。[Marches，2004；A.Cuatraro 1990等]。然而，由于其毒性已要求禁止氯喹的体内使用，因为需要给予高浓度的游离氯喹以到达内涵体。(引用J.M.Benns等人，1stpara.，Bioconj，Chem.11，637-645，(2000)：“尽管已证明氯喹有助于将质粒DNA释放进入细胞质，但是已发现其具有毒性并因此不能在体内使用。”)
最近，标题为“氯喹偶合(偶联)的抗体和其他蛋白质以及它们的合成方法(Chloroquine coupled antibodies and other proteins with methods fortheir synthesis)”的第2007166281号USPTO申请公开了将氯喹和由其衍生的结构偶合于包含能够在可控条件下释放氯喹的可生物裂解连接(biocleavable linkage)的不同的载体组合物。第20070166281号申请的目的在于当载体到达其作用位点后提供使氯喹从蛋白质或肽活性剂或抗体控释。
Kosak及其同事的专利US2006/0040879公开了组合物和用于制备偶合了氯喹的核酸组合物的方法。该现有技术已显示以足够高浓度的游离药物给予的氯喹增强了各种药剂从细胞内涵体释放进入细胞质。这些组合物的目的在于在需要释放核酸的相同位点提供可控量的氯喹，从而降低需要的总体剂量。本专利的目的在于实现与核酸组合物结合的氯喹的控释，这并不是该发明的主题，但是增强并简化了体外和体内基因疗法的递送。
发明内容
本发明提供了用于细胞内运载物递送的系统，其包括克服了非共价基因递送的所述缺陷(即低效和异源递送以及毒性)的新的一系列分子。本发明不需要可生物裂解的连接体(linker)来裂解氯喹类似物。本发明的系统包括不可逆地结合了氯喹的化合物。
该系统包括具有脂肪酸修饰的改进的CPP的化合物，其可用于有效递送多种ON，而不具有现在市场上销售的递送物的毒性。新一代进一步衍生化的CPP能够将药物负载物有效递送至群体中的所有细胞中并将ON从其内涵体捕获(entrapment)中释放。本发明的权利要求描述了经修饰的和衍生化的递送肽以及它们的检测应用；增强的转染、剪接校正和siRNA递送。
附图说明
图1
经修饰的荧光素酶基因的前体-mRNA。将来自在核苷酸705处携带点突变的β-球蛋白基因的内含子2插入荧光素酶基因。用SCO对该位点实施的阻断使剪接重新定向至功能性mRNA。因此，这生成了依赖于SCO到达细胞核这一事实的阳性生物学判读(read-out)。
图2
用未修饰的CPP或与200nM SCO复合的脂质体2000转染试剂(Lipofectamine 2000)处理后的定量摄取和剪接校正。A)Cy5-SCO与不同CPP以1∶5、1∶10和1∶20的摩尔比复合后1小时的摄取。B)用A中相同组的复合物处理后的剪接校正。在无血清DEME中处理2h，然后用完全生长培养基替换培养基并再生长20h。C)用浓度不断增加的SCO处理后的剪接校正，根据制造商的使用说明使用脂质体2000转染试剂(Lipofectamine 2000)。D)与B相同，但是用阻止内涵体酸化的75μM氯喹(CQ)共处理，并因此促进内涵体逃逸。这些结果明确显示未修饰的CPP能够引起SCO摄取但是不能诱导剪接校正。由于氯喹显著增加了剪接校正，有理由推断CPP/SCO复合物仅存在于内涵体区室内。
图3
凝胶阻滞试验。如之前所述形成复合物并跑PAGE胶1h。将肽与磷硫酰2′O-甲基RNA(即SCO)以5、10和20的摩尔比混合。将保留在孔中的物质定义为肽/SCO复合物。M918和紧随其后的TP10是两种最强效的形成复合物的肽。
图4
用与SCO偶合的硬脂酰基修饰的CPP的摄取和剪接校正。A)如图2a进行定量摄取。与硬脂酰化的Arg9或pentratin复合的Cy5-SCO的摄取总体上高于PepFect肽。B)相同的肽和比例用于剪接校正。令人感兴趣的是PepFect3诱导了正确剪接的显著增加而硬脂酰化的pentratin和Arg9的活性可忽略。尽管观察到低摄取，但PepFect2仍具有一些活性。
图5
a)Pepfect递送系统的一般结构，其中A＝脂肪酸或二-四环体系，1-8个拷贝，一些可能在分支的间隔区(spacer)上，B＝细胞渗透性肽或其非肽类似物并且C＝靶向部分例如导向肽(homing peptide)或适体，可为非共价结合。b)脂肪酸的实例：硬脂酸的示意图，c)环体系的实例：N-(2-氨基乙基)-N-甲基-N′-[7-(三氟甲基)-喹啉-4-基]乙烷-1，2-二胺。D)Pepfect递送系统的图示结构和名称。
图6
TP10、TP10与氯喹(CQ)以及PepFect3(TP10的硬脂酰化形式)之间促进SCO介导的剪接校正能力的比较。在较低的摩尔比1∶5时，PepFect3诱导正确剪接的荧光素酶增加接近40倍，相比之下TP10增加2倍。然而，PepFect似乎仍有改进空间，因为用TP10和氯喹共处理产生剪接的70倍增加。
图7
PepFect3(N-端硬脂酰化)和PepFect4(Lys7上垂直硬脂酰化)之间递送SCO的比较。两种肽均促进了SCO-介导的剪接校正的剂量依赖性增加。将细胞在无血清培养基中处理4h，然后为细胞替换完全生长培养基，再生长20小时。细胞裂解后将发光数据测量值标准化为每孔中的蛋白质含量并表示为与未处理细胞相比的剪接倍数增加。PepFect3与SCO以摩尔比10复合而PepFect4与SCO以摩尔比7复合。
图8
使用200nM SCO将PepFect3和PepFect4与脂质体2000转染试剂(Lipofectamine 2000)进行比较。尽管PepFect3的活性略低于基于商购脂质体的转染剂Lipofectamine 2000，但是PepFect4的活性超过该活性。如果与以5μM浓度临床前使用的CPP-吗啉轭合物(RXR)4-PMO相比，两种PepFect肽均在低25倍的SCO浓度下显示出优效。如图6进行实验。
图9
在Hela细胞中用PepFect肽转染荧光素酶编码的质粒。根据材料和方法部分的记载形成所有的转染复合物并在处理后24小时监测基因表达。A、C和E示出了来自以不同摩尔比分别与PepFect1、PepFect2或PepFect3复合的pGL3质粒的荧光素酶表达。D)电荷比为1∶1时肽之间的比较。B)用阳性对照脂质体2000转染试剂(Lipofectamine 2000)转染后的荧光素酶表达。
图10
温育24h后，将CHO细胞中的用脂质体2000转染试剂(Lipofectamine2000)与用PepFect3对荧光素酶编码的质粒的转染进行比较。以范围为CR 0.5-2的不同电荷比制备PF3和质粒的复合物并与根据制造商的使用说明使用的脂质体2000转染试剂的转染效率进行比较。将结果表示为相比于仅用质粒处理的细胞的基因表达的倍数增加。该图清楚地表明CR超过1时，PF3的活性大于脂质体2000转染试剂。
图11
在CHO细胞中24h后测量的用PF3或阳离子脂质体(Lipofectamine)进行的EGFP表达质粒的转染。PF3以不同CR与质粒复合并与脂质体2000转染试剂(Lipofectamine 2000)比较。结果显示，尽管脂质体2000转染试剂的总体转染与PF3相当，但是当研究PF3肽时被转染的细胞数目显著更高。这些试验均在无血清培养基中进行。
图12
以不同细胞汇合度(confluency)在HEK293细胞中的质粒转染。基本按照图10进行试验，使用PF4与脂质体2000转染试剂比较。令人惊讶的是，在较高细胞密度并且CR高于1时转染增加，在将质粒运送到肾细胞中时，PF4的活性显著大于脂质体2000转染试剂。
图13
在不同的CR用PF3处理或用阳离子脂质体处理24h后HeLa细胞中的代谢活性。Y轴是相对于未处理细胞的代谢活性细胞的百分比。所述结果来自WST-1测定，其测量线粒体中的代谢活性，明显看出尽管与质粒复合的PF3对增殖的作用可忽略，但是根据制造商的使用说明用脂质体2000转染试剂处理后观察到显著的长期毒性。按照基因递送测定制备复合物，但是在96孔板而不是24孔板中进行处理。
图14
比较PepFect5和脂质体2000转染试剂递送抗-miR21 ON的效力的剂量-反应曲线。当以与ON的摩尔比非常低(为2)使用PepFect5时，两种试剂显示出等效。
图15
100nM浓度下PepFect5和脂质体2000转染试剂递送抗-miR21 ON的比较。当以摩尔比(MR)为5使用PepFect5时，该肽比脂质体2000转染试剂显著更有效。如所预期的，未载体化的ON无活性。
图16
将脂质体2000转染试剂或PepFect5用作siRNA的递送剂时荧光素酶稳定的Hela细胞中荧光素酶下调的剂量-反应曲线。以摩尔比40使PepFect5与siRNA复合，并且用25nM siRNA观察到的基因沉默与使用100nM siRNA的脂质体2000转染试剂所观察到的相当。
图17
比较以两个不同的摩尔比复合的PepFect5(PF5)和PF6在荧光素酶稳定的BHK21细胞中运送siRNA靶向荧光素酶的效力。PF6优于PF5，特别是在低siRNA浓度时，尽管与PF6一起使用的肽的量较低。
图18
荧光素酶稳定的骨肉瘤细胞(U2OS)中高摩尔比(80)形成的PF6/siRNA复合物对荧光素酶下调的剂量-反应曲线。在低至5nM的浓度观察到明显的RNAi。
图19
在完全生长培养基中进行的PF6/siRNA复合物转染的剂量-反应曲线。随着siRNA浓度的增加观察到在荧光素酶稳定的BHK21细胞中荧光素酶表达的剂量依赖性降低。在此，预形成复合物并将其直接加入生长培养基中。转染后24h测量荧光素酶表达。
图20
用以不同摩尔比与50nM siRNA复合的PF6处理24h后BHK21细胞中的RNAi。即使在如10这样的低MR下，也有可能获得荧光素酶稳定的BHK21细胞中大于80％的荧光素酶下调。与使用脂质体2000转染试剂或任何其他基于脂质体的递送系统通常可能获得的作用相比，这是更强的RNAi作用。有趣的是，MR20和MR40之间的响应差异很小。这使得该递送系统比转染量的小变化对转染效率具有显著影响的脂质体2000转染试剂更易于使用。
图21
通过FACS测量的用与脂质体2000转染试剂或PepFect6复合的siRNA靶向EGFP处理后的EGFP稳定的CHO细胞中的下调。a)表示来自未处理细胞的荧光(蓝色)。b)分图示出了用100nM siRNA和脂质体2000转染试剂处理后的EGFP表达。蓝色群体代表非下调细胞，红色群体代表EGFP下调细胞。左下分图c)是仅用与PF6(摩尔比40)复合的25nM siRNA处理的细胞。如图所示，90-95％的细胞具有较低的EGFP表达(红色)。最后，右下分图d)示出了在完全血清培养基中用与PF6复合的100nM siRNA处理后的EGFP表达。处理后48h，约98％的细胞的EGFP表达可忽略。总而言之，就诱导RNAi而言，PF6远比脂质体2000转染试剂更强效，由于观察到几乎完整的RNAi所以该递送似乎是普遍存在的。即使在完全血清培养基中，该肽的作用也比脂质体2000转染试剂更显著。
图22
用siRNA处理48h的活EGFP-CHO细胞中的共聚焦显微分析。100nMsiRNA用作阴性对照并且与100nM siRNA复合的脂质体2000转染试剂用作阳性对照。裸露的siRNA对EGFP表达具有非常小的影响而脂质体2000转染试剂如所预期的在一些细胞中诱导RNAi。与图21中显示的FACS柱状图一致，与50nM siRNA共温育的PF6在无血清培养基和完全生长培养基中均诱导完整的RNAi。而且，与脂质体2000转染试剂只进入细胞中的某一部分(最可能是分裂细胞)相比，PF6/siRNA颗粒以普遍存在的形式进入细胞。
图23
在EGPF-CHO细胞中经过单次siRNA处理后RNAi衰减动力学(decaykinetics)的流式细胞计量分析。以给定浓度的siRNA配制PF6/siRNA颗粒并在血清培养基(FM)或无血清培养基(SFM)中进行处理。然后将该效果与通过与脂质体2000转染试剂或寡核苷酸转染试剂复合的100nMsiRNA诱导的RNAi进行比较。所得结果清楚地表明24h后PF6诱导几乎完整的RNAi，与siRNA浓度无关。应将这一结果与分别用寡核苷酸转染试剂(Oligofectamine)和脂质体2000转染试剂(Lipofectamine 2000)(转染)观察到的20％和55％下降(knock-down)相比较。此外，在最佳条件下，当使用PF6时RNAi响应持续4-5天。MR，摩尔比。
图24
骨肉瘤细胞中HPRT1 mRNA的下调。在所有浓度的两个PF6摩尔比下均观察到显著的下降，而脂质体2000转染试剂在50μM siRNA浓度下未能诱导任何RNAi。在这些实验中，使用Dicer底物siRNA(用dicer加工的较长的形式)。在无血清培养基中处理细胞并在转染后24h通过RT-PCR分析mRNA水平。
图25
siRNA处理20小时后人SHSY5Y神经母细胞瘤细胞中的HPRT1下降。以两种不同的摩尔比配制PF6/siRNA颗粒并系列稀释得到100、50和25nM siRNA的终处理浓度。在完全生长培养基中进行处理并将该RNAi响应与通过与脂质体2000转染试剂复合的100nM siRNA诱导的RNAi响应进行比较。当PF60与siRNA之比为MR40时，与使用100nMRNAi的脂质体2000转染试剂相比，甚至在25nM RNAi浓度下RNAi响应显著更强。这表明PF-系统不仅在血清中具有活性而且能以普遍存在的形式有效转染“难转染的”细胞。
图26
用siRNA靶向HPRT1处理后大鼠原代混合胶质细胞培养物中的RNAi。在含血清条件和在无血清条件下，PF6在引起siRNA-介导的基因沉默方面比脂质体2000转染试剂显著更强效。
图27
用脂质体2000转染试剂或PF6处理24小时后CHO细胞中表达荧光素酶的质粒的转染。在肽与质粒的投料比(charge ratio，CR)为2时，在无血清培养基中观察到与阳离子脂质体相比PF6高一个对数级(log)的转染。甚至在血清培养基中，在CR4的情况下，该肽促使质粒转染的效率是脂质体2000转染试剂的2倍。
图28
Jurkat悬浮细胞中的EGFP质粒的转染。尽管脂质体2000转染试剂几乎完全失活，但是用PF6特别是在较高的投料配比下仍观察到明显的转染。在无血清培养基中在转染后24小时通过FACS测量EGFP表达。b)对应的Jurkat转染的直方图。尽管总体转染水平很低，但是PF6具有转染群体中的大部分细胞的能力。c)不依赖于细胞汇合度的Jurkat质粒转染。有趣的是，用PF6可以不依赖汇合度而转染大部分的细胞。
图29
用与SCO复合的PF5类似物处理后Hela细胞中的剪接校正。在这一条件下，使用具有与四个1-萘氧基乙酸(1-naftoxy acetic acid)形成垂直分支的赖氨酸的TP10代替氟喹部分来评价融合性质(fusogenic property)的重要性。该图示出了使用200nM SCO，在血清培养基和无血清培养基中，以5至25的不同肽/SCO摩尔比处理的Hela pluc705细胞中相对于对照的荧光素酶表达的成倍增加。相比于之前观察到的PF5的100倍增加，这些结果表明该肽的活性显著较低，在剪接时达到12倍增加。
图30
A，用Pefect14/SCO复合物处理24h后Hela细胞中的剪接校正。PF14复合物具有高活性，与摩尔比和血清的存在无关。在200nM SCO浓度下，与脂质体2000转染试剂相比，PF14将SCO递送至细胞内部的活性显著更高。甚至在如50nM SCO这样的低浓度下也观察到剪接的50倍增加。B)该图示出了在血清培养基中以30至40的不同肽/siRNA摩尔比处理稳定表达荧光素酶基因的BHK-21细胞后相对于对照的荧光素酶表达百分数，并与根据制造商的使用说明进行的阳离子脂质体转染相比较。在摩尔比为35时，PF14的活性事实上比阳离子脂质体更高，即使是使用低4倍的siRNA浓度时也是如此。
图31
用PF3、PF5或它们的混合物处理细胞后Hela细胞中的剪接校正。当使用PF3和PF5的混合物时，与以相同的摩尔量单独使用每一种肽相比，剪接增加了将近4倍。
具体实施方式
本发明涉及被设计用于胞内运载物(或负载物，cargo)递送的系统，其包括选自具有至少4个碳原子的脂肪族线性或分支部分和/或包含2-4个环的环体系的至少一种组分A，该环可包含选自N、S、O和P的若干个杂原子，其中(一种或多种)组分A结合于细胞渗透肽B和/或其非肽类似物，并且其中所述递送系统能够通过共价或非共价结合递送运载物。该递送系统被称作PepFect(参见示例性的表1和图5c)。
根据该递送系统的一种实施方式，其进一步包括至少一个组分C，其为能够到达感兴趣的特定细胞或组织的靶向部分。该靶向部分可以是适体或诸如导向肽的靶向肽或受体配体。
根据该递送系统的另一种实施方式，其进一步包括被递送至细胞、组织中或跨越细胞层的运载物。
可将一种或多种组分A、一种或多种组分C以及一种或多种运载物共价偶合至肽(B)的氨基酸侧链和/或N-和/或C-端。在一些PepFect化合物中，使用分支的树状结构的间隔区。可通过非共价或共价结合(covalentconjugation)来添加靶向部分C。
该细胞递送系统可包括通过肽键彼此结合的多于一种肽B。
此外，组分A、C和运载物中的一种或多种可通过间隔臂与一个或多个肽B结合。
根据本发明，该递送系统可包括在无任何运载物的条件下以任意顺序彼此偶合的一种或多种组分A、一种或多种肽B、一种或多种靶向组分C。一个或多个肽B可与一种或多种组分A在无任何靶向组分C且无任何运载物的条件下以任意顺序偶合。这些可被递送用于在后续阶段进一步偶合运载物。本发明涉及通过使用此类递送系统向靶细胞体内或体外递送运载物的方法。
一个或多个肽B和一种或多种运载物可在无任何靶向组分C的条件下以任意顺序与一种或多种组分A偶合。一个或多个肽B和一种或多种运载物可以任意顺序与一种或多种组分A以及一种或多种靶向组分C偶合。
本发明还涉及新的细胞渗透性肽以及如何生产所述PepFect构建体的方法。
组分A
组分A可以是一种或若干种具有至少4个碳原子的脂肪族线性或分支部分和/或包含2-4个环的环体系，该环可包含选自N、S、O和P的若干个杂原子，其中(一种或多种)组分A结合于细胞渗透性肽B和/或其非肽类似物。
A还可以是衍生自任意有机化合物优选脂肪酸的任何酰基、硬脂酰基、胆汁酸或其衍生物、胆甾醇基、胆酸、脱氧胆酸盐、石胆酸盐或棕榈酸盐。
脂肪族组分A可以具有4-30个碳原子并且可以是脂肪酸。这样的脂肪族酸可以包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个碳原子或这些数字产生的任意区间。其还可以是它们的衍生物。(一个或多个)官能团可以不是羧酸而是-OH、-SH、-NH2、-CHO、COXR中的任一种或多种但不限于此，其中X是O或S，R是任意脂肪族或芳香部分，或盐形成中的反离子例如Na+、K+等，或卤素。根据一种实施方式，脂肪酸可包含10-30个碳原子并且可选自硬脂酸或其C18衍生物或月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、花生四烯酸和山萮酸，它们结合于细胞渗透性肽的侧链残基、C端或N端。而且，该链可含有饱和/不饱和键。
此外，组分A还可以是由2-4个饱和或不饱和的3-8元环组成的二-四稠环体系的一个或多个拷贝，其环体系中可包含选自N、S、O、B或P的一个或若干个杂原子。其可以是联苯基、二苯醚、胺、硫化物或周位和/或邻位稠合的且选自但不限于喹啉、异喹啉、喹噁啉、戊搭烯(并环戊二烯，pentalene)、萘、庚搭烯(庚间三烯并庚间三烯，heptalene)、辛搭烯(并环辛二烯，octalene)、降莰烷(norbonane)、金刚烷、吲哚、二氢吲哚、甘菊环烃(环戊并环庚五烯，azulene)、苯并吖庚因(benzazepine)、吖啶、蒽、联苯撑、苯并菲和苯并蒽以及它们的类似物，但不限于此。这样的类似物可包含一个或多个羧基和/或一个或多个另外的官能团，例如但不限于一个或多个胺、一个或多个硫醇、一个或多个羟基、一个或多个酯以及一个或多个醛。
根据一种实施方式，组分A的四个拷贝可通过赖氨酸分支间隔而结合于侧链残基上。
这些环体系还可被例如具有pH缓冲能力的其他基团取代以使内涵体不稳定或者是用于核苷酸相互作用的缩合部分(condensing moiety)。取代基的实例可以是但不限于一个至若干个伯胺、仲胺和/或叔胺，被取代或以任何脂肪族或芳香族部分或它们组合被包括其中，还以线性、分支或环状方式或它们的组合被零至若干个原子间隔开。
实例为N′-(7-氯喹啉-4-基)-N，N-二乙基-戊烷-1，4-二胺(氯喹)或其衍生物、二-四环体系(萘和/或由联苯基连接)、4-8元环、环体系中的一个至若干个杂原子结合至如1所述的建构体(图5)的任意位置。另一有用的实例是N-(2-氨基乙基)-N-甲基-N′-[7-(三氟甲基)-喹啉-4-基]乙烷-1，2-二胺。它们可具有长度不同的(一个或多个)间隔臂(图5c)。
通过偶合(偶联)至多个赖氨酸残基的活化的琥珀酰化侧链来完成喹啉类似物的引入，这提供了与载体共价结合的多个拷贝的喹啉类似物。实施例12中描述了优选的条件。
本发明还涉及合成喹啉类似物偶合肽或其非肽类似物的方法，该方法包括(a)活化肽上的赖氨酸的步骤和(b)共价偶合喹啉类似物。为了能够偶合氯喹-胺衍生物(进一步公开于实施例12)，通过用琥珀酸酐对赖氨酸残基的ε氨基进行合适的修饰达到对肽的赖氨酸侧基(pendant group)的活化。将如此获得的肽的多个羧基进一步原位活化，即与喹啉类似物的偶合同时进行。这一操作优于迄今为止的文献中描述的操作，其中形成半稳定的活性酯例如NHS，然后偶合由胺衍生化的羟基氯喹。本文描述的方法是新颖的并达到对反应更好的控制和更高的产率。该喹啉类似物是新颖的，据我们所知，文献中没有通过伯二胺衍生物进行氯-三氟甲基-喹啉的氨基烷基化的记载。
通过例如在烷基链末端引入额外的胺来促进共价结合。烷基链的功能是为芳香性环体系相互作用提供空间和缓冲能力。氯喹类似物由用三氟甲基、具有被许多原子间隔的两个胺的烷基链以及位于烷基链的另一末端与第二个胺间隔若干个原子用于进一步结合的官能团取代的喹啉系统组成，但不限于此。
优选四个拷贝的组分A通过赖氨酸分支间隔区而结合(或轭合)至侧链。
本发明进一步意在包括将多个拷贝的喹啉衍生物偶合(偶联)至包含合适数量的多聚(L-赖氨酸)侧基的肽B，均通过琥珀酸酐或本领域技术人员已知的任何其他合适的衍生化试剂修饰。
肽组分B
肽组分B可选自以下序列的一个或多个拷贝：
  序列  SEQ ID No
  AGYLLGKINLKALAALAKKIL  1.
  AGYLLGKLLOOLAAAALOOLL  2.
  RKKRKKKRXRHXRHXRHXR  3.
  MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV  4.
  RKKRKKK(HXH)4  5.
  LLOOLAAAALOOLL  6.
  RQIKIWFQNRRMKWKK  7.
  RRRRRRRRR  8.
  MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV  9.
  GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV  10.
  FILFILFILGGKHKHKHKHKHK  11.
  FILFILFILGKGKHKHKHKHKHK  12.
  FILFILFILGKGKHRHKHRHKHR  13.
  AGYLLGKINLKALAALAKKIL  14.
  GDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTL  15.
  PFLDRLRRDQKSLRGRGSTL  16.
  PFLNRLRRDQKSLRGRGSTL  17.
  PFLDRLRRNQKSLRGRGSTL  18.
  PFLNRLRRNQKSLRGRGSTL  19.
  PFLNRLRRNLKSLRGRLSTL  20.
  PFLDRKRRDQKSLRGRGSTL  21.
  RHRHRHHHGGPFLDRLRRDQKSLRGRGSTL  22.
  PNNVRRDLDNLHACLNKAKLTVSRMVTSLLEK  23.
  PNNVRRDLDNLHAMLNKAKLTVSRMVTSLLEK  24.
  PNNVRRDLNNLHAMLNKAKLTVSRMVTSLLQK  25.
  PFLNRLRRNLKSLRGRLSTL  26.
  PFLNRKRRNLKSLRGRLSTL  27.
  INLKALAALAKKIL  28.
可使用合成装置例如在433A型Applied Biosystems分步合成仪上合成这些肽。使用4-甲基二苯甲胺-聚苯乙烯树脂(MBHA)通过t-Boc化学以产生酰胺化的C-端或在Rink树脂上通过F-moc化学来组装氨基酸。
另外，肽B可选自包含Ny1-Bx1-Ny2-Bx2-Ny3的序列的肽，其中B是碱性氨基酸(例如arg、lys、orn、或his)，N是中性氨基酸(例如leu、ile、ala、val、phe、trp、ser、thr、gly、cys、gln、met、pro、tyr)并且x和y是2至8的整数。
根据一种实施方式，肽B选自LLOOLAAAALOOLL[SEQ ID No 6]并且尤其是AGYLLGKLLOOLAAAALOOLL[SEQ ID No 2]或INLKALAALAKKIL[SEQ ID No 28]并且尤其是AGYLLGKINLKALAALAKKIL[SEQ ID No 1]以及氨基酸的缺失、加入、插入和置换。本发明还涉及与这些序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同源性的肽。本发明还涉及具有相同性质的上述肽的亚片段。
肽B还可是CPP的非肽类似物或CPP或其非肽类似物的乱序组分(scrambled component)。
本文中的术语非肽类似物用于描述包含至少一个非编码的氨基酸和/或具有导致氨基酸序列中没有肽连接(即，在一个氨基酸的羧基和另一氨基酸的氨基之间形成的CO-NH键)的骨架修饰的任何氨基酸序列。非编码的氨基酸的实例为D型氨基酸、二氨基酸、二苯胺、Gly、Pro以及Pyr衍生物。
此外，该氨基酸序列可为酰胺化的或以游离酸的形式存在。
乱序组分B表示具有相同的氨基酸组成但是具有完全随机化顺序的肽。另外，部分颠倒序列是以相反的顺序添加原始序列的两个或多个氨基酸的序列。
可向这些序列加入、插入、置换氨基酸(也包括非天然氨基酸)或使氨基酸(也包括非天然氨基酸)缺失氨基酸而不改变它们的整体细胞渗透能力。
细胞渗透性肽B和/或其非肽类似物的C-端可被修饰并且选自半胱胺或含硫醇的化合物、线性或分支、环状或非环状含胺化合物，并优选具有一个另外的官能团的化合物，该官能团例如但不限于COXR，其中X是O或S，R是任何脂肪族或芳香性基团或者，盐形成中的反离子例如Na、K等、卤素、-OH、-NHR，其中R是保护基团或任何脂肪族或芳香性基团，-SSR其中R是保护基团/活化基团或任何脂肪族或芳香性基团。
物种B(或实体B)的C-端的巯基酰胺基团(或半胱酰胺基团，cysteamide group)使其具有独特的性质，该基团可在血清中被活化并由此形成二聚体。该二聚体化反应由存在于血清中的氧化酶催化。根据本发明，一个肽分子的巯基酰胺基团可与另一个肽分子的巯基酰胺基团在氧化反应中发生相互作用。一个这样的序列是AGYLLGKINLKALAALAKKIL-巯基酰胺。这样的反应会导致通过在位于两个不同的巯基酰胺修饰的肽上的巯基之间产生二硫桥而形成肽二聚体。因此，当暴露于氧化环境中时巯基酰胺修饰的肽的巯基(-SH)形成二硫键(S-S键、二硫桥、C-S-S-C)。
所述递送系统包含至少一个肽B，其可以是不同的或相同的肽。因此，它可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9和10个肽B。它们可以是二聚体或多个CPP并且可以是环状的和/或分支的。
组分C
C组分是靶向部分，例如已知或未知受体的配体。底物可以是适体和/或靶向肽。
适体是结合于特定分子靶标例如蛋白质或代谢物的双链DNA或单链RNA分子。
靶向肽是结合于特异性分子靶标例如蛋白质或代谢物的肽，例如导向肽。导向肽是通常通过噬菌体展示被选择用于结合某些组织或细胞类型的肽序列。
另外，组分C是将递送系统引导至某些细胞类型或组织的另一分子，公知的实例是作为肿瘤靶标的生长因子的过表达。
靶向部分C还可以作为组合物的一部分与所述递送系统的组分A和B非共价复合。
一般而言，细胞选择性CPP可用于将任何类型的药品或药物物质靶向运输至各种特异的真核和/或原核细胞靶标。例如，此类运载物的细胞选择性运输用于传染性疾病例如由病毒、细菌或寄生虫感染引起的疾病的改进的治疗或预防。
在本发明的另一种实施方式中，提供了能够选择性进入某一细胞类型/组织/器官或运输仅在某一细胞类型、组织或器官类型中被活化的运载物的细胞渗透性肽和/或其非肽类似物。
我们已经示出了添加用于将递送系统靶向至特定的细胞类型或组织的部分不会破坏递送性质。例如Pepfect7(垂直的(ortogonally)SA并且具有CREKA N-端)能够在HeLa和CHO细胞中递送SCO和质粒(数据未示出)。
间隔区
间隔区用于组分A、C和运载物与组分B的结合。
根据一种实施方式，所述间隔区包含一个或多个氨基酸，例如赖氨酸单元，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸，例如赖氨酸单元，其可以是直链或支链的并用官能团或另外的碳原子修饰用于进一步结合。
所述间隔区是具有一个至若干个促进组分A或树状结构结合的取代基的线性或支链基团，所述树状结构优选由以树状形式排列的赖氨酸或鸟氨酸残基组成但不限于此，如图1的实例所描绘的，其包含1、2、3、4或非限制数量的Lys或Orn残基。该树可具有任意数量的支链并由任意数量的分支单元例如赖氨酸或鸟氨酸残基(本文中以Lys示出)组成；“Nic”可以是烟酸、苯甲酸、喹啉酸、萘羧酸、氯喹或其衍生物，或任何其他有机分子。
间隔区优选用于通过组分B的侧链来轭合四个拷贝的环体系(组分A)。该间隔区可以是树枝状聚合物(dendrimer)。
树枝状聚合物是重复分支的分子，在这种情况下优选其具有肽骨架。
本文列出的不带有运载物的用于胞内递送的Pepfect系统的实例如下所示：
表1.根据上文所述包括C-端修饰的细胞渗透性肽(CPP)的序列
Figure BDA0000061149520000181
X：4-氨基丁酸，Cya：巯基酰胺，Y：己酸，sa：琥珀酸
qn：新的2-4环体系，例如喹啉和萘类似物
根据本发明，提供了一系列新的CPP，尤其是具有硬脂酰基修饰的CPP。例如(PepFect1-4和PepFect14)可用于利用非共价方法有效递送SCO。已显示在细胞内部运送SCO方面，PepFect肽与市售的转染试剂脂质体2000转染试剂等效或甚至比其更有效，并且毒性更低。另外，Pepfect1-4的低毒性使它们适用于转染脂质体2000转染试剂不起作用的敏感细胞系统。另外，PepFect肽比常规使用的CPP更强效并且远比临床前使用的CPP-轭合物(RXR)4-PMO更有效。另外，可有效地开发该肽已用于质粒转染，以及用于难转染的原代胶质细胞这一难题。此外，更重要的是仅需要非常少量的递送物和ON就能够获得生物学响应，这减少了劳动和成本。
可对PepFect5-13类似物进行进一步修饰。不用硬脂酸物质修饰或除了用硬脂酸物质修饰之外，这些还可轭合于具有赖氨酸树的例如一个或多个如四个促进ON从泡状隔室(vesicular compartment)释放的QN类似物。这些不仅具有运输在细胞核中发挥作用的ON化合物的活性而且还能够有效用于递送具有胞质活性的ON例如抗-miR和siRNA。事实上，就在各种细胞类型中递送siRNA而言，PepFect5和PepFect6，特别是肽PepFect6的活性显著高于脂质体2000转染试剂。尽管在任何给定的siRNA浓度下阳离子脂质体/siRNA复合物很少产生大于80％的基因表达下调，但是与siRNA复合的两种PepFect均能够在低siRNA浓度下引起几乎完整的RNAi。此外，它们转染完整的细胞群而不仅仅是分裂细胞。最后，PepFect6甚至在含血清培养基中也具有高活性并且能够转染包括SHSY-5Y、N2a、Jurkat悬浮细胞、胚性成纤维素细胞和原代胶质细胞在内的非常“难转染的”细胞。上述性质和与脂质体2000转染试剂或寡核苷酸转染试剂相比更低的毒性使这一特别的载体非常独特。
表2示出了已经受用PF6进行siRNA处理的细胞的表格
Figure BDA0000061149520000191
运载物(或负载物，cargo)
运载物(或负载物，cargo)可选自基因调节化合物，例如寡核苷酸或质粒。它们可通过共价结合或复合物形成与递送系统结合。
寡核苷酸家族包括用于mRNA沉默的反义寡核苷酸，用于操纵前体-mRNA剪接方式的剪接校正寡核苷酸、以及用于基因沉默的短干扰RNA。
运载物可选自由寡核苷酸及其被修饰形式、单链寡核苷酸(DNA、RNA、PNA、LNA以及所有合成寡核苷酸)、双链寡核苷酸(siRNA、shRNA、陷阱dsDNA(decoy dsDNA)等)、质粒及其其他变异体、用于抑制病毒复制的合成核苷酸类似物或抗病毒ON。
所述递送系统使得能够在正确的胞内位置释放ON(作为运载物)而不需额外添加氯喹。因为四个拷贝的环体系A的结合使氯喹类似物的局部作用增加。这对于体内应用是有价值的性质。而且，通过将氯喹与肽结合(或轭合)，可将有效浓度降低多于一个log，这很可能解释了在100μM浓度下观察到的氯喹的毒性减小。
据估算，20-30％的所有引起疾病的突变影响前体-mRNA剪接。若干遗传性疾病和其他疾病，包括β-地中海贫血(β-thalassemia)、囊性纤维病、肌营养不良、癌症、和数种神经性疾病均与选择性剪接中的变化相关。破坏剪接的大部分突变是典型剪接位点的内含子或外显子区段中的单核苷酸置换。这些突变引起外显子跳跃、使用邻近的假3′-或5′剪接位点、或保留突变的内含子。突变还能够在外显子和内含子中引入新的剪接位点。
最早记载的剪接突变之一发现于β-地中海患者中，其中β-球蛋白前体-mRNA的内含子2中的突变产生了异常的5′剪接位点，同时激活了隐蔽的3′剪接位点。这继续导致了内含子保留(intron inclusion)和非功能性蛋白。已在囊性纤维病跨膜传导调节基因中鉴定出相同类型的突变，引起异常剪接和囊性纤维病的发展。以进行性退化性肌病为特征的杜兴氏肌营养不良(DMD)及其较轻微的等位基因病贝克尔氏肌营养不良(BMD)均由肌营养不良蛋白基因中的突变引起。该基因中的大多数无义突变引起蛋白质合成的提前终止并导致严重的DMD，而调控序列中的无义突变产生外显子的部分框内跳跃并与较轻的BMD相关。而且，还已知若干种类型的癌症由影响选择性剪接的突变引起。因此，通过使用特异结合于这些内含子/外显子突变的寡核苷酸序列，掩蔽了这些突变并恢复剪接。
另外，本发明涉及体内或体外向靶细胞递送运载物的方法。PepFect和本文所述的ON(siRNA、质粒、SCO(剪接校正Ons))之间形成复合物可在小体积的无菌水中在RT下进行30分钟，然后，在大多数试验中，加入完全含血清培养基。与运载物形成复合物的实例：在1/10终处理体积(即50μl)中在MQ水中以不同的摩尔比(1∶0-1∶20)将磷硫酰2′O甲基RNA(SCO)或抗-miR212′OMe RNA与CPP混合。在RT下使复合物形成约30分钟。30分钟后，将复合物加入在450μl新鲜无血清培养基中生长的细胞中。
运载物(或负载物)还可以选自荧光标记物、包含与失活肽偶合的可裂解位点的细胞或连接子(linker)、肽配体、细胞毒性肽、生物活性肽、诊断剂、蛋白质、药物例如抗癌药、抗生素、化疗药物。
所述运载物可通过共价或非共价键结合至任意组分A、B和/或C。根据一种实施方式，该运载物可结合至肽组分B。在本发明的一种实施方式中，细胞渗透性肽可通过S-S桥与所述运载物偶合(偶联)。在自然条件下，将运载物偶合至CPP的方法是多种多样的，可根据CPP的性质、运载物和预期用途进行单独选择。偶合方式可选自共价和非共价结合，如生物素-亲和素结合、酯键、酰胺键、抗体结合等。
抗癌药物可以是烷化剂、抗代谢物和细胞毒性抗生素。烷化剂可以包括4-[4-双(2-氯乙基)氨基)苯基]丁酸(苯丁酸氮芥)或3-[4-(双(2-氯乙基)氨基)苯基]-L-丙氨酸(美法仑)、抗代谢物是N-[4-(N-(2，4-二氨基-6-蝶啶基甲基)甲基氨基)-苯甲酰基]-L-谷氨酸(甲氨蝶呤)以及细胞毒性抗生素是(8S，10S)-10-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-来苏-己吡喃基)氧基]-8-乙醇酰基-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-1-甲氧基-5，12-并四苯二酮(naphthacenedione)(多柔比星)。
所述递送系统还进一步包括至少一种显像剂(或成像剂)和/或标记分子和/或化疗药物。由此本发明的递送系统可被用作化疗药物和/或显像剂。这样的组合物也可以包括靶向序列。化疗药物和/或显像剂可用于递送抗病毒寡核苷酸。
标记分子可以是用于标记或定量胞内mRNA的分子信标(molecularbeacon)，包括基于淬灭荧光的信标和基于FRET技术的信标。
分子信标是诸如单链寡核苷酸的分子，其具有以发夹结构排列的内部荧光团和对应的淬灭部分从而使这两个部分靠近。结合靶核酸序列或暴露于其他结构修饰后，所述荧光团与淬灭部分分离以使得能够检测到所述荧光团。最经常使用的分子信标是用于检测特异性DNA或RNA基序(motif)的寡核苷酸杂交探针。类似地，FRET探针是位置相近的成对荧光探针。选择荧光团使得其中一个的发射光谱与另一个的激发光谱显著重叠。从供体荧光团到受体荧光团的能量转移与距离相关的，因此基于FRET技术的信标能够用于研究使两个荧光团的分子接近产生变化的各种生物学现象。
所述递送系统还可与循环清除修饰剂(circulation clearance modifier)例如PEG结合(或轭合)或复合。这样的系统可用于延迟运载物递送。循环清除修饰剂是延长药物在体内的半衰期的分子，例如聚乙二醇化(pegyl)、白蛋白结合或序列加帽。
所述递送系统可用于疾病诊断、用作研究工具或用作靶向系统。
本发明还涉及包含一种或多种如本文定义的递送系统的组合物。在这样的组合物中，所述递送系统可包括不同的组分A、和/或不同的肽B、和/或不同的靶向组分C和/或不同的运载物。所述递送系统可包含如上所述的A、B、C和运载物的不同组合。
本发明还涉及包含如上定义的递送系统和/或组合物的药物组合物。
其还涉及一种或多种递送系统在制造药物组合物中的用途。
尤其是该组合物可包含具有叠加(或加和，additative)或协同作用的至少两种不同的递送系统。这些可能以不同比率存在于组合物中。例如，所述组合物可包含表1公开的Pepfect的任意组合，例如Pepfect5和Pepfect6。
这样的组合物还可包含相同或不同的递送系统中的至少两种肽的混合物，其中每一种肽使复合物具有不同的性质，例如靶向和转染。
这样的药物组合物可以是口服剂量单位形式；注射液；栓剂；凝胶剂；以及乳剂并可包含赋形剂、润滑剂、粘结剂、崩解剂、增溶剂、助悬剂、等渗剂、缓冲剂、安抚剂(soothing agent)、防腐剂、抗氧剂、着色剂、甜味剂。
例如，所述递送剂还可用作抗微生物组合物、类似裂解肽(lyticpeptide)的细胞渗透性肽。
本发明还涉及用本发明的一种或多种递送系统覆盖的材料。
另外，本发明涉及将权利要求1-16中任一项所述的一种或多种递送系统合并入(或掺入到)其中的材料。可将本发明的递送系统掺入树枝状聚合物、脂质体等中。脂质体是由磷脂组成的复合结构并且可含有少量的其他分子。
本发明还涉及含有式Ny1-Bx1-Ny2-Bx2-Ny3形式的新的肽，其中B是碱性氨基酸(例如arg、lys、orn、或his)，N是中性氨基酸(例如leu、ile、ala、val、phe、trp、ser、thr、gly、cys、gln、met、pro、tyr)并且x和y是2至8的整数。
本发明尤其涉及其中的物种(或实存物)B选自LLOOLAAAALOOLL[SEQ ID No 6]且尤其是AGYLLGKLLOOLAAAALOOLL[SEQ ID No 2]或INLKALAALAKKIL[SEQ ID No 28]且尤其是AGYLLGKINLKALAALAKKIL[SEQ ID No 1]以及具有氨基酸的缺失、加入、插入和置换的序列的肽。本发明还涉及与这些序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同源性的肽。本发明还涉及具有相同性质的上述肽的亚片段。
如前所述，CPP能够与运载物(或负载物)偶合(偶联)以作为将所述运载物运送至细胞、各种细胞区室、组织或器官中的载体。所述运载物选自由任何药理学感兴趣的运载物，例如肽、多肽、蛋白质、小分子物质、药物、单核苷酸、寡核苷酸、多聚核苷酸、反义分子、双链和单链DNA、RNA和/或任何人工的或部分人工的核酸例如PNA、低分子量分子、糖类、质粒、抗生素物质、细胞毒性剂和/或抗病毒剂组成的组。此外，对运载物的运输可用作递送的研究工具(例如标签和标记物)以及用于改变膜电位和/或性质，所述运载物可以是例如标记物分子，例如生物素。
在意图将运载物运输通过血脑屏障方面，胞内和胞外运载物二者是同等优选的运载物。
本文所述的所有实施方式的所有具体细节均可能变化。当例如描述与递送系统的组分A、B和C相关的特定化学组分时，在所述递送系统被掺入树枝状聚合物或脂质体时、用所述递送系统覆盖的材料时以及用循环清除修饰剂覆盖所述递送系统时仍然适用。
现通过以下实施方式的描述进一步说明本发明，包括附图简述、材料和方法、包括附图和图例说明以及序列表在内的实施例，但是应理解的是本发明范围不限于任何具体描述的实施方式或细节。
实施例和实验例
以下通过实施例和与不同PepFect系统以及与当今市场上占主导地位的用于体内转染的脂质体2000转染试剂的比较来描述本发明。首先描述了对递送系统的改进和改良。接着描述了用各种方法检测以证明PepFect对于递送剪接校正ON、质粒以及miRNA和siRNA的多种用途。此外，通过较低的毒性、同源转染和在“难转染细胞”中的高产率转染显示了与根据制造商的使用说明应用的脂质体2000转染试剂相比的总体改进。所有试验均在多于一种细胞类型中进行并且大多数情况下在血清存在下进行。
材料和方法
肽和寡核苷酸的合成
在433A型Applied Biosystem分步合成仪上合成PepFect1、PepFect2、PepFect3、PepFect4、penetratin[10]、TP10[11]、M918[12]、Arg9[13]和硬脂酰基-Arg9形式的肽。通过t-Boc化学利用4-甲基二苯甲胺-聚苯乙烯树脂(MBHA)来组装肽以产生酰胺化的C-端。还可使用本领域技术人员公知的标准Fmoc SPPS条件来合成固相肽合成(SPPS)。本发明中使用的肽是在SYRO多重肽合成仪(MultiSyn Tech GmbH)上用标准方案获得的。所述方法涉及在HBTU活化试剂和作为碱组分的DIEA的辅助下从肽的羧基端到N-端重复偶合Fmoc-保护的氨基酸。所使用的聚苯乙烯树脂固相载体是Rink酰胺树脂(优选置换水平为每克树脂0.4至0.6毫当量)。氨基酸购自法国Neosystem公司并且被偶合为羟基苯并三唑(HOBt)酯。用HF将肽从树脂上裂解后，通过反相HPLC lomega C18柱纯化合成产物并利用Perkin Elmer prOTOFTM2000 MALDI O-TOF质谱仪进行分析。肽的质量与理论值相关性良好。肽序列示于表1。
对于分支间隔区：与树脂结合的完全保护的序列Fmoc-AGYLLGK(ε-Mtt)INLKALAALAKKIL-Rink(Rink＝Rink酰胺树脂，如没有另外说明，所有氨基酸均由标准保护基团保护)用作起始材料。遵循一般手册操作(步骤1至步骤7)以获得四个游离羧基的分支结构(被设计为四个拷贝的新QN类似物的结合点)。每一步骤之后，进行定性茚三酮颜色检测(Kaiser test)以监测反应的完全度。
1.用35％哌啶处理肽树脂40分钟以实现氨基的脱保护。
2.偶合(偶联)硬脂酸(优选的方法是使用DCM作为溶剂，BOP/DIEA用于活化并偶合1小时)。
3.用1％TFA、3-4％TIS、DCM重复洗涤(共处理1-1.5小时)除去Mtt。为了确保完全除去，加入未添加TIS的DCM中的1％TFA以监测离去三苯甲基(trityl group)的黄色。
4.将3-5当量的Fmoc-Lys(Fmoc)-OH偶合45分钟。优选的偶合(偶联)试剂是BOP(甚至更优选其非致癌类似物PyBOP)或DIPCDI/HOAt。
5.根据步骤1除去Fmoc。
6.重复步骤4和5。
7.在3当量DIEA存在下在DMF中偶合1.5当量的琥珀酸酐10分钟。
在具有OligosyntTM15预填充合成柱的
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oligopilotTM plus 10上合成磷硫酰2′-O-甲基RNA寡核苷酸。以5当量过量加入0.1M浓度的亚磷酰胺(Phosphoroamidite)(ChemGenes Corporation，Boston，MA)并且偶合(偶联)试剂的循环时间是5分钟。在3分钟内用3-甲基吡啶/乙腈中的0.2M双-苯基乙酰基二硫化物(ISIS Pharmaceuticals，Carlsbad，CA)(1∶1)中进行硫醇化作用，每个合成循环用3ml。将寡核苷酸从固相载体裂解并于55℃在25％氢氧化铵水溶液(Merck，Darmstadt，德国)中脱保护过夜。用
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100系统和碱性NaCl缓冲液用填充了SourceTM15Q阴离子交换介质的TricoTM柱进行纯化。用HiTrapTM脱盐柱对纯化的寡核苷酸进行后续处理，然后用DNAPacTM-100分析柱(Dionex，Sunnyvale，CA)进行HPLC分析(Agilent 1100，Santa Clara，CA)以验证＞97％的全长纯度。通过在FinniganTMLGQTMDeca XP plus质谱仪(ThermoFischer Scientific，Waltham，MA)上进行质量分析验证正确产物。
细胞培养
使Hela pLuc705细胞(由R.Kole和B.Leblue提供)和hek 293细胞在含glutamax的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中生长，其中添加了0.1mM非必需氨基酸、1.0mM丙酮酸钠、10％FBS、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和200μg/ml潮霉素。CHO细胞在含glutamax的DMEM-F12培养基中生长，其中添加了0.1mM非必需氨基酸、1.0mM丙酮酸钠、10％FBS、100U/ml青霉素、和100mg/ml链霉素。BHK21细胞在生长GMEM+2mM谷氨酰胺+5％胰蛋白磷酸盐肉汤+5-10％胎牛血清中。细胞于37℃在5％CO2气氛下生长。所有培养基和化学试剂均购自Invitrogen(瑞典)。
复合物形成
ON/CPP复合物的形成：在1/10终处理体积中(即50μl)在MQ水中将磷硫酰2′O甲基RNA(SCO)或抗-miR21 2′OMe RNA(含33％LNA取代)与CPP以不同摩尔比(1∶0-1∶20)混合。在RT下使复合物形成30分钟，同时用新鲜的无血清DMEM(450μl)替换24孔板中的培养基。之后，向各孔中加入复合物。使SCO的终浓度在200nM保持恒定并变化肽的浓度或者用400nM SCO以给定的摩尔比形成复合物然后在水中系列稀释。当使用商购转染剂Lipofectamine 2000(Promega，USA)时，根据使用制造商的说明制备复合物。用基本相似的方法形成PepFect/siRNA复合物，但是用100nM siRNA作为起始浓度并且摩尔比范围为20-40。通过进行系列稀释得到较低的浓度。
质粒/CPP复合物的形成：在1/10终处理体积中(50μl)在MQ水中将0.5μg的pGL3荧光素酶表达质粒或pEGFP-C1质粒以不同的投料比(1∶1-1∶4)与CPP混合。30分钟后，将复合物加入在450μl无血清培养基中生长的细胞中。当使用脂质体2000转染试剂(Lipofectamine 2000)(Promega，USA)时，根据制造商的使用说明制备复合物(Promega，USA)。
凝胶移动检测
如前所述将肽与SCO混合。将0.5μg的SCO与浓度不断增加的肽混合以使得肽/SCO的摩尔比范围达到5至20。通过在包含溴乙啶(Sigma，瑞典)的TBE缓冲液中于150V在20％聚丙烯酰胺凝胶上电泳1h对复合物进行分析。用IR LAS-1000Llte v2.1软件在Fujifilm LAS-1000 IntelligentDark box II中照相。
定量摄取
用200nM Cy5标记的以摩尔比与肽复合的SCO处理实验前24小时接种的100 000个Hela pLuc 705细胞1h。处理后，在胰蛋白酶消化前在HKR中洗涤细胞两次。于4℃将细胞在1000g下离心5分钟并用250μl0.1M NaOH将细胞沉淀裂解30分钟，之后将200μl裂解物转移至黑色96-孔板中。在Spectra Max Gemeni XS荧光计(Molecular devices，USA)上于643/670nm处测量荧光，利用荧光素线性特性并标准化(或归一化)至蛋白质的量(Lowry BioRad，USA)重新计算为内标化合物(internalizedcompound)的量。
荧光素酶测定
剪接校正试验：在所有试验中于试验前24小时将100 000个Hela pLuc705细胞接种至24孔板。在无血清培养基中用复合物处理细胞4h，然后换成血清培养基再处理20小时。之后，用Hepes Krebs Ringer(HKR)缓冲液洗涤细胞两次并在室温下在HKR中用100μl 0.1％曲通(triton)×100裂解15分钟。用Promega荧光素酶测定系统在Flexstation II(Moleculardevices，USA)上测量荧光素酶活性。将RLU值标准化(或归一化)至蛋白质含量，并将结果表示为RLU/mg或与未处理细胞相比剪接的成倍增加。在使用促进内涵体逃逸的试剂氯喹的试验中，将复合物与75μM氯喹在无血清DMEM中共温育2h，然后使细胞在完全DMEM中生长20h。
质粒转染：对于质粒转染，在处理前24h接种80 000个CHO或Jurkat细胞。在无血清DMEMF12中用pGL3/CPP复合物处理细胞4小时，然后替换为完全培养基再生长20小时。使细胞被裂解并根据剪接校正测定进行分析。
siRNA转染：如其他试验，接种包括HeLa、BHK21和U2OS细胞在内的不同的荧光素酶稳定细胞系。在无血清培养基或完全生长培养基中处理细胞4h，然后向孔中加入1ml完全生长培养基。使细胞被裂解并如前文所述在20小时后测量发光。将发光标准化(或归一化)为每一个孔中的蛋白质含量并将来自未处理细胞的RLU/mg值当做100％。接着将不同的处理表示为未处理细胞的百分比。
微小RNA-21测定：将携带一个内部萤火虫荧光素酶基因(fireflyluciferase gene)和在3′UTR携带微小RNA-21靶位点的第二海肾荧光素酶基因(renilla luciferase gene)的质粒psi-CHECK2转染至在6cm培养皿中生长的HeLa细胞。转染后一天，通过胰蛋白酶消化使细胞分离，并以70000个细胞/孔的密度接种至24孔板中。又过了24h后，如之前对SCO所述用抗miR-21复合物处理细胞。使细胞被裂解，然后检测充当转染内标的萤火虫荧光素酶的表达，然后检测海肾荧光素酶表达。如果ON到达了细胞质，miR21被隐蔽起来并预期海肾荧光素酶表达增加，生成与剪接校正测定相似的阳性判读。将未处理细胞的萤火虫/海肾荧光素酶之比设定为1并将处理后的海肾荧光素酶增加表示为与未处理细胞相比的成倍增加。使用HeLa细胞是因为已知它们表达高水平的miR21。
毒性测定
使用Promega Cytox-ONETM测定测量膜完整性。简言之，在用肽处理前两天将104个细胞接种至96孔板中的无血清DMEM中。30分钟后，将培养基转移至黑色荧光板上并用Cyto Tox-ONETM试剂温育10分钟，然后加入终止溶液。在560/590nm处测量荧光。将未处理细胞定义为0，将HKR中在0.18％曲通(triton)中通过裂解释放的LDH定义为100％裂解。
Wst-1测定
用Wst-1增殖测定评价肽的长期毒性作用。在处理前两天以104个细胞/孔将HeLa pLuc 705细胞接种至96孔板。在100μl血清或无血清DMEM中用复合物处理细胞24h。然后根据制造商的使用说明(Sigma，瑞典)将细胞暴露于Wst-1。在吸光度读数仪Digiscan(Labvision，瑞典)上测量吸光度(450-690nm)。将未处理细胞定义为100％存活。
FACS
转染前一天将24孔板接种EGFP稳定的CHO细胞。转染当天，用PF6-siRNA复合物转染细胞，siRNA∶PF6的摩尔比为a)对于无血清培养基温育：1∶20和1∶40，siRNA浓度为50nM、25nM和12.5nM；以及1∶80，siRNA浓度为20nM、10nM和5nM。b)对于完全培养基温育：1∶20和1∶40，siRNA浓度为100nM、50nM和25nM。对于对照试验，用Lipofectamine(100nM siRNA和2.8μl Lipofectamine)用EGFP siRNA转染细胞，或不用复合物或仅用siRNA实施假转染(以得到原始EGFP水平)。转染过程中的温育体积是500μl。在无血清培养基中或完全培养基中按要求将复合物与细胞温育4小时。然后向各孔中加入1ml完全培养基并使细胞生长24h(或可替代地生长48小时)。
在测试当天，用PBS洗涤细胞，并用胰蛋白酶消化从孔分离。使用125μl胰蛋白酶溶液。细胞分离后，加入500μl完全培养基并将细胞转移至埃彭道夫管中。500×g离心10min，除去上清并重悬浮在500μl添加了2％FBS的PBS中(该FBS非常重要，当试管在等待被分析时其使细胞保持较好的形状)。将细胞悬液转移至FACS管中并将它们置于冰上。尽快进行分析。在FACS中测量细胞悬液。在FSC-SSC图上界定活细胞群。在FSC/FITC-A或SSC/FITC-A图上找出假转染细胞的gate(具有原始EGFP水平的细胞的gate/cloud)。用相同的gate检测样品。具有原始EGFP水平的位于cloud之外的以及具有较低EGFP水平的细胞被计数为发生了siRNA转染的细胞。将结果表示为用siRNA转染的细胞的百分比。可替代地，用FITC-A直方图基于假转染细胞以相似的方式选择gate。
实施例1(图1-图3)：通过细胞渗透性肽进行的剪接校正
为了评价不同的未修饰CPP将寡核苷酸运输至细胞内的效力，我们使用所谓的剪接校正测定[14]。这一测定基于被稳定转染的HeLa细胞系，HeLa pLuc 705细胞。所述细胞具有稳定的质粒转染，所述质粒携带被来自β-球蛋白前体-mRNA的内含子2(携带隐蔽剪接位点)的插入中断的编码荧光素酶的序列(图1)。在正常条件下，该隐蔽剪接位点能够激活异常剪接位点，使具有内含子保留的成熟mRNA增加，因此得到非功能性的荧光素酶蛋白。然而，如果该异常剪接位点被SCO遮蔽，则荧光素酶的前体-mRNA很可能被加工并产生功能性荧光素酶。通过使用HeLapLuc 705细胞，可通过测量荧光素酶活性来评价各种载体的核递送效率。
在第一组试验中，我们欲评价若干已建立的CPP采用共温育策略将剪接校正磷硫酰2′O-甲基RNA(即SCO)递送至细胞内的能力[15]。如图2a所示，所有被检测的未修饰CPP均能够在暴露后1h内转移至细胞内，穿膜肽(penetratin)是最有效的肽。然而，任何一种肽都不能将生物活性SCO运输至细胞的细胞核中，这可从荧光素酶表达的不显著增加得以解释(图2b)。为证实该阴性结果不是由失活的SCO引起，用脂质体2000转染试剂作为递送载体进行对照试验。如图2c所示，随着SCO浓度的增加观察到正确剪接的荧光素酶的剂量依赖性增加。低活性的另一可能的原因是CPP和SCO之间不能形成复合物。然而，这个原因也被排除了，因为在凝胶延迟测定中所有的肽均促进复合物形成(图3)。这些结果共同表明，虽然CPP能够将SCO运输至细胞内，但是它们很可能仍然被捕获在内涵体区室中。这一点进一步得到了共聚焦显微数据的支持，其中，如果不是全部的话，大量标记的SCO存在于间隔的区室内，例如内涵体或溶酶体(数据未示出)。更重要的是，当用趋溶酶体剂氯喹一起处理细胞时，除Arg9之外所有肽的剪接校正显著增加(图2d)。有趣的是，尽管穿膜肽(penetratin)产生最高的定量摄取但是TP10优于其他的肽。综合考虑，这表明共温育策略促进了细胞摄取而不是可生物利用的递送。此外，得到了高细胞摄取与被运输运载物的高活性不相关的结论。
实施例2(图2、图4、图6)：促进剪接校正的双功能CPP
接着，尝试在CPP中引入修饰以增加它们的效率。将脂肪酸部分(即硬脂酸)引入现有的CPP中，并且还引入新设计的序列中(参见图5)。后一种肽PepFect1的设计原理是形成双功能肽，一个基团用于促进内涵体逃逸(即(RHbutRH)4)，一部分实现核仁递送(RKKRKKK)。尽管在用肽核酸作为共价轭合物的转染中该肽非常强效，但是它不能在非共价环境中运输SCO(数据未示出)。因此，该肽是N-端硬脂酰化的。同样，另外四种之前检测的CPP也是硬脂酰化的，并将M918[12]和TP10[11]分别重新命名为PepFect2和PepFect3。有趣的是，在所检测的任何摩尔比下硬脂酰化的Arg9和穿膜肽(penetratin)均不能促进剪接校正。然而，当与SCO的摩尔比达到10∶1时PepFect3非常强效，几乎达到了与使用脂质体2000转染试剂时相同的荧光素酶表达水平(图4)。在使用PepFect3的条件下，摄取与剪接校正之间存在正相关性，而其他的肽不存在这样的相关性。事实上，使用PepFect3的剪接校正与TP10和氯喹一起使用时几乎一样高(图6)。因为TP10和与SCO复合的PepFect3之间的定量摄取的差异不显著(图2a和图4a)，由此得到该活性的增加是由内涵体释放增加引起的结论。出人意料的是，在剪接校正测定中只有PepFect3是有活性的而PepFect2仅具有很小的活性(图4b)。
越来越多的疾病例如β-地中海贫血、囊性纤维化病、肌营养不良、癌症等都是由导致异常剪接的突变引起的，所述异常剪接现在可使用不同的SCO得以恢复[3，17，18]。然而，需要高剂量的SCO以在体内获得显著的生物学作用。因此，这些结果对于由缺陷性选择性剪接引起的各种疾病的未来治疗具有非常广阔的前景。
实施例3(图7-图8)：脂肪酸修饰位置的评价
为了评价和表征脂肪酸修饰的位置，比较PepFect3(N端硬脂酰基修饰)和PepFect4(在Lys7上侧链被硬脂酰化)递送SCO的效率。图7示出了PepFect4在促进剪接校正中比PepFect3更有效，甚至在较低的摩尔比的情况下也是如此。而且，与脂质体2000转染试剂相比，PepFect4更强效。有趣的是，在低25倍的SCO浓度下，两种PepFect的活性均显著高于临床前使用的共价CPP-吗啉结合物(轭合物)RXR4-PMO(图8)。
实施例4(图9-图12)：用PepFect3和PepFect4递送质粒
在下一组试验中，评价了上述PepFect肽促进4.7kbp表达荧光素酶的pGL3质粒的摄取和表达的能力。出人意料的是，所有的PepFect肽均能够显著增加基因递送(图9)。而且，在投料比为1∶1至1∶1.5时，PepFect3是最有效的肽。这些结果表明所述肽还能够有效用于更生物学相关的质粒和ON的基因递送。以CR范围为0.5-2的不同投料比制备PF3和质粒的复合物并与根据制造商的使用说明应用的脂质体2000转染试剂进行比较。将结果表示为与仅用质粒处理的细胞相比基因表达的成倍增加。图10中的图示出了CR大于1时，PF3的活性高于脂质体2000转染试剂。另一优势是图11所示的同源转染。传统的转染试剂需要一定的细胞汇合度以达到最佳功能，然而图12显示PF4转染与接种的细胞数量无关但效果一样好。
实施例5(图11和图13)：PepFect的毒性小于LF2000
当用于活组织时，保持尽可能低的毒性作用是很重要的。如图11所示，转染前在不同的样品中接种相同数量的细胞，然而，处理后阳离子脂质体处理的细胞中细胞数量较少。PepFect3的毒性低于脂质体2000转染试剂(图13)并且可能由此提供用于基因疗法的新的非病毒工具。
实施例6.(图14-图15)：通过PepFect5递送微小RNA
微小RNA(miRNA)代表了在植物、非脊椎动物和脊椎动物的基因组中被编码的一类新的非编码RNA。微小RNA基于(部分)序列互补性调节靶mRNA的翻译和稳定性。miRNA变化与人类癌症的起始和发展有关。已显示miR-21起到癌基因的作用并通过调节诸如bcl-2的基因来调节肿瘤产生，因此其可作为新的治疗靶[19]。
本文中我们示出了与阳离子脂质体相比通过PepFect5递送miR-21(图14)。二者在较低的ON摩尔比时等效。然而，在摩尔比为5时，PepFect5显著更佳(图15)。
实施例7(图16-图19)：比较PepFect5和PepFect6的siRNA递送
在该实施例中，不用硬脂酸物质修饰或除了用硬脂酸物质修饰之外，还将其结合(轭合)于促进肽从泡状区室释放的具有四个氯喹类似物的赖氨酸树(图5)。该构建体不仅具有运输在细胞核中发挥作用的ON化合物的活性，而且还可以有效应用于胞质活性ON例如siRNA(图16和图17)的递送。事实上，PepFect5和PepFect6，并且特别是后一种肽，在各种细胞类型中递送siRNA的活性显著高于脂质体2000转染试剂(图16-图18)。尽管在任何给定的siRNA浓度下阳离子脂质体/siRNA复合物很少产生大于80％的基因表达下调，但是与siRNA复合的两种PepFect在低siRNA浓度下实现几乎完全的RNAi。另外，PepFect6在完全生长培养基、含血清的培养基中也是有效的(图19)。其原因可能是与缺乏硬脂酰基团的PepFect5相比，它具有硬脂酸基团和氯喹树的双重修饰。
实施例8.(图20-图28)PepFect转染：同源、稳定并且在难转染的细胞 中有效
用户友好的试剂应耐受例如复合物形成中摩尔比的细微变化。PF6在不同摩尔比下几乎是等效的(图20)：用与50nM siRNA复合的PF6处理24小时后的BHK21细胞中的RNAi。即使在例如10这样低的MR下，在荧光素酶稳定的BHK21细胞中也可获得大于80％的荧光素酶下调。与使用脂质体2000转染试剂或任何其他基于脂质体的递送系统通常可获得的结果相比，这是更强的RNAi作用。有趣的是，在MR20和MR40之间，响应的差异非常低。这使得与转染量的小变化对转染效率具有显著影响的脂质体2000转染试剂相比，该递送系统更加用户友好。除了在含血清培养基中具有高效率(图21-图27)之外，PepFect6构建体转染完整的细胞群而不仅仅是分裂细胞(图21)。这一点通过图22中的荧光显微术进一步可视化。此外，较长的siRNA(即所谓的dicer底物)也能够通过PF6有效递送(图24)。图23示出了在EGFP-CHO细胞中单次siRNA处理后RNAi衰减动力学的分析。以给定的siRNA浓度制成PF6/siRNA颗粒并在含血清培养基或无血清培养基中进行处理。然后将该作用与通过与脂质体2000转染试剂或寡核苷酸转染试剂复合的100nM siRNA诱导的RNAi比较。结果明确显示，24h后PF6已经诱导几乎完全的RNAi，与siRNA浓度无关。应将该结果与使用寡核苷酸转染试剂和脂质体2000转染试剂分别观察到的20％和55％下降进行比较。此外，在最佳条件下，当使用PF6时，RNAi响应持续4-5天。最后，PepFect6还能够转染许多非常“难转染的”细胞，包括SHSY-5Y(图25)、N2a、大鼠原代胶质细胞(图26)和Jurkat悬浮细胞(图28)。上述性质和与脂质体2000转染试剂或寡核苷酸转染试剂相比更低的毒性使得这种特别的载体非常独特。
实施例9(图29)：选择性环体系修饰
在图29中，我们证明了物质A不必要是喹啉类似物。萘衍生物和相似的环结构执行相似的功能。用与SCO复合的PF5类似物处理后在HeLa细胞中的剪接校正。在这种情况下，使用具有与四个拷贝的1-萘氧基丙酸(1-naftoxy propanoic acid)形成垂直分支的赖氨酸的TP10代替喹啉类似物来评价融合性质的重要性。该结果显示，与之前在PF5中观察到的100倍增加相比，剪接增加了12倍。
实施例10.(图30)：新的细胞渗透性序列：PepFect14
在PepFect递送系统中检测了若干种不同的细胞渗透性肽，本实施例是被称作Pepfect14的具有硬脂酰基结合的新序列的一个实例。如图30所示，PepFect14能够在血清存在下有效递送siRNA和SCO二者。
实施例11(图31)：可将PepFect递送系统混合产生叠加效应
另外，可如图31所示将PepFect递送系统混合在一起，不同比例的PF3和PF5协同发挥作用并且与两种PepFects自身相比能够更好地递送SCO。另外，可类似地混合两种或多种PepFect递送系统的组合物以产生另外的性质，例如靶向或半衰期延长。
实施例12.合成新的氨基-喹啉衍生物，N-(2-氨基乙基)-N-甲基-N′-[7-(三氟 甲基)-喹啉-4-基]乙烷-1，2-二胺
利用PEG 400浴将安装有磁力搅拌器的50mL圆底烧瓶中的3.8g(16.3mmol)4-氯-7-(三氟甲基)喹啉和12倍摩尔过量的N-甲基-2，2′-二氨基二乙胺(25ml)的混合物在2.5h内边搅拌边从室温加热至80℃，然后在3h内使温度升高至130℃，并且最后于140℃加热2.5h。将该反应混合物冷却至室温，加入冷DCM使其立即沉淀，滤掉沉淀物。用5％NaHCO3水溶液洗涤有机层两次，然后用水洗涤两次。在无水MgSO4上干燥有机相，减压(旋转蒸发器)除去溶剂并且将残余物留在冷冻干燥器中。得到重量为4.5g(MW312.3)，14.4mmol，产率为83％的粗产物，未对其进行进一步纯化而用于与肽结合(轭合)。
N-(2-氨基乙基)-N-甲基-N′-[7-(三氟甲基)-喹啉-4-基]乙烷-1，2-二胺与琥珀酸修饰的多个赖氨酸残基的侧链偶合(偶联)，提供多个拷贝的与载体分子共价结合的ON类似物。用3当量的TBTU/HOBt和6当量的DIEA实现固相载体上游离羧基的活化。将待结合的过量(2-5当量)新喹啉衍生物(N-(2-氨基乙基)-N-甲基-N′-[7-(三氟甲基)-喹啉-4-基]乙烷-1，2-二胺溶于DMF并与活化剂一起同时加入肽-树脂中以通过其游离氨基基团使QN类似物与活化的树脂偶合(偶联)。为了确保完全偶合(偶联)，由于不能够通过Kaiser测定来监测，可以使该反应进行较长的时间(通常过夜)。
参考文献：
1.Cross，D.& Burmester，J.K.Gene therapy for cancer treatment：past，present andfuture，Clin Med Res 4，218-27(2006)。
2.Kim，D.H.& Rossi，J.J.Strategies for silencing human disease using RNAinterference，Nat Rev Genet 8，173-84(2007).
3.Mercatante，D.R.，Sazani，P.& Kole，R.Modification of altemative splicing byantisense oligonucieotides as a potential chemotherapy for cancer and otherdiseases，Curr Cancer Drug Targets 1，211-30(2001).
4.EL-Andaloussi，S.，Holm，T.& Langel，Cell-penetrating peptides：mechanisms andapplications.Curr Pharm Des 11，3597-611(2005).
5.Mae，M.& Langel，U.Cell-penetrating peptides as vectors for peptide，protein andoligonucleotide delivery.Curr Opin Pharmacol 6，509-14(2006).
6.EI-Andaloussl，S.，Jarver，P.，Johansson，H.J.& Langel，U.Cargo-dependentcytotoxicity and delivery efficacy of cell-penetrating peptides：a comparative study.Biochem J 407，285-92(2007).
7.Abes，S.et al.Vectorization of morpholino oligomers by the(R-Ahx-R)4 peptideallows efficient splicing correction in the absence of endosomolytic agents.J ControlRelease 116，304-13(2006).
8.Bendifallah，N.et al.Evaluation of cell-penetrating peptides(CPPs)as vehicles forintracellular delivery of antisense peptide nuceic acid(PNA)，Bioconjug Chem 17，750-8(2006).
9.Lundberg，P.，EI-Andaloussi，S.，Sutlu，T.，Johansson，H.& Langel，U.Delivery ofshort interfering RNA using endosomolytic cell-penetrating peptides.Faseb J 21，2664-71(2007).
10.Derossi，D.，Joliot，A，H.，Chassaing，G.& Prochiantz，A.The third helix of theAntennapedia homeodomain translocates through biological membranes，J BiolChem 269，10444-50(1994).
11.Soomets，U.et al.Deletion analogues of transportan Biochim Biophys Acta 1467，165-76(2000).
12.EI-Andaloussi，S.，Johansson，H.J.，Holm，T.& Langel，U.A Novel Cell-penetratingPeptide，M918，for Efficient Delivery of Proteins and Peptide Nucleic Acids.Mol Ther15，1820-6(2007).
13.Wender，P.A.et al.The design，synthesis，and evaluation of molecules that enable orenhance cellular uptake：peptoid molecular transporters，Proc Natl Acad Sci USA97，13003-8(2000).
14.Kang，S.H.，Cho，M.J.& Kole，R.Up-regulation of luciferase gene expression withantisense oligonucleotides：implications and applications in functional assaydevelopment，Biochemistry 37，6235-9(1998).
15.Morris，M.C.，Vidal，P.，Chaloin，L.，Heitz，F.& Divita，G.A new peptide vector forefficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells.Nucleic Acids Res 25，2730-6(1997).
16.Morris，M.C.，Chaloin，L，Mery，J.，Heitz，F.& Divita，G.A novel potent strategy forgene delivery using a single peptide vector as a carrier，Nucleic Acids Res 27，3510-7(1999).
17.Du，L，Pollard，J.M.& Gatti，R.A Correction of prototypic ATM splicing mutations andaberrant ATM function with antisense morpholino oligonucleotides.Natt AcadSci USA 104，6007-12(2007).
18.Garcia-Blanco，M.A.，Baraniak，A.P.& Lasda，E.L.Alternative splicing in disease andtherapy，Nat Biotechnot 22.535-46(2004).19.Si M-L，Zhu S，Wu H，Lu Z，Wu F，MoYY，miR-21-mediated tumor growth.Oncogene 26：2799-2803.(2007).
Figure IDA0000061149570000011
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Figure IDA0000061149570000061
Figure IDA0000061149570000081

Claims (25)

1.一种用于胞内运载物递送的系统，包含选自具有至少4个碳原子的脂肪族线性或分支部分和/或包含2-4个环的环体系的至少一种组分A，所述环可含有选自N、S、O和P的若干个杂原子，其中，所述(一种或多种)组分A结合于细胞渗透性肽B和/或其非肽类似物。
2.根据权利要求1所述的系统，其中，组分A和B各自具有至少一个用于结合的官能团。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的系统，进一步包含至少一种组分C，所述组分C为靶向部分。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的系统，进一步包含一种运载物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的系统，其中，一种或多种组分A、一种或多种组分C以及一种或多种运载物结合于肽B和/或其非肽类似物的侧链、和/或N-端和/或C-端。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的系统，包含多于一种肽B。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的递送系统，其中，所述物种A选自疏水物种，优选具有10-30个碳原子的脂肪酸或其衍生物，优选硬脂酸或其C18衍生物，例如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、花生四烯酸和山萮酸；包含杂原子的和/或被取代的2-4环体系，例如喹啉或萘类似物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的系统，其中，所述组分A、C和所述运载物中的至少一种与间隔臂结合。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的系统，其中，所述物种B选自以下序列的一个或多个拷贝
SEQ ID NO：1.AGYLLGKINLKALAALAKKIL
SEQ ID NO：2AGYLLGKLLOOLAAAALOOLL
SEQ ID NO：3RKKRKKKRXRHXRHXRHXR
SEQ ID NO：4MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV
SEQ ID NO：5RKKRKKK(HXH)4
SEQ ID NO：6LLOOLAAAALOOLL
SEQ ID NO：7RQIKIWFQNRRMKWKK
SEQ ID NO：8RRRRRRRRR
SEQ ID NO：9MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV
SEQ ID NO：10GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV
SEQ ID NO：11FILFILFILGGKHKHKHKHKHK
SEQ ID NO：12FILFILFILGKGKHKHKHKHKHK
SEQ ID NO：13FILFILFILGKGKHRHKHRHKHR
SEQ ID NO：14YLLGKINLKALAALAKKIL
SEQ ID NO：15GDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTL
SEQ ID NO：16PFLDRLRRDQKSLRGRGSTL
SEQ ID NO：17PFLNRLRRDQKSLRGRGSTL
SEQ ID NO：18PFLDRLRRNQKSLRGRGSTL
SEQ ID NO：19PFLNRLRRNQKSLRGRGSTL
SEQ ID NO：20PFLNRLRRNLKSLRGRLSTL
SEQ ID NO：21PFLDRKRRDQKSLRGRGSTL
SEQ ID NO：22RHRHRHHHGGPFLDRLRRDQKSLRGRGSTL
SEQ ID NO：23PNNVRRDLDNLHACLNKAKLTVSRMVTSLLEK
SEQ ID NO：24PNNVRRDLDNLHAMLNKAKLTVSRMVTSLLEK
SEQ ID NO：25PNNVRRDLNNLHAMLNKAKLTVSRMVTSLLQK
SEQ ID NO：26PFLNRLRRNLKSLRGRLSTL
SEQ ID NO：27PFLN RKRRNLKSLRGRLSTL
SEQ ID NO：28INLKALAALAKKIL
10.根据权利要求1-9中任一项所述的系统，其中，所述物种B选自含有式Ny1-Bx1-Ny2-Bx2-Ny3的序列的肽，其中B是碱性氨基酸，N是中性氨基酸，并且x1、x2、y1、y2和y3是2至8的整数。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的系统，其中，所述物种B选自LLOOLAAAALOOLL[SEQ ID No：6]，尤其是AGYLLGKLLOOLAAAALOOLL[SEQ ID No：2]或INLKALAALAKKIL[SEQ ID No：28]并且尤其是AGYLLGKINLKALAALAKKIL[SEQ ID No：1]以及氨基酸的缺失、加入、插入和置换。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的系统，其中，所述细胞渗透性肽B和/或其非肽类似物的C端被修饰。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的系统，其中，所述运载物选自由寡核苷酸及其被修饰的形式组成的组中，包括单链寡核苷酸(DNA、RNA、PNA、LNA以及所有的合成寡核苷酸)、双链寡核苷酸(siRNA、shRNA、陷阱dsDNA等)、质粒以及合成核苷酸类似物的其他变体。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的系统，其中，所述运载物选自由与荧光标记物、细胞或肿瘤导向肽、适体、受体配体、包含与失活肽偶合的可裂解位点的间隔区、肽配体、细胞毒性肽、生物活性肽、诊断试剂、蛋白质、药物例如抗癌药物或抗生素组成的组中的一个或多个成员连接的组。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的系统，进一步包含至少一种显像剂和/或标记分子。
16.根据权利要求15所述的系统，其中，所述标记分子是用于标记或定量胞内mRNA的分子信标，包括基于淬灭荧光的信标和基于FRET技术的信标。
17.根据权利要求1-6中任一项所述的系统，包括与其结合的循环清除修饰剂，如PEG。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的系统在疾病的诊断、用作研究工具和用作靶向系统中的应用。
19.一种包含多于一种如权利要求1-18中任一项所述的递送系统的组合物，其中，所述递送系统包含不同的组分A、和/或不同的肽B、和/或不同的组分C和/或不同的运载物并且还可以包含循环清除修饰剂，如PEG。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中，所述递送系统包含至少两种不同的肽B并且还可以包含循环清除修饰剂，如PEG。
21.一种药物组合物，包含如权利要求1-17中任一项所述的递送系统和/或如权利要求19和20中任一项所述的组合物。
22.一种材料，其覆盖有一种或多种如权利要求1-17中任一项所述的递送系统。
23.一种材料，所述材料中合并有一种或多种如权利要求1-17中任一项所述的递送系统。
24.一种肽，含有式Ny1-Bx1-Ny2-Bx2-Ny3的序列，其中，B是碱性氨基酸，N是中性氨基酸并且x以及y1、y2和y3是2至8的整数。
25.根据权利要求24所述的肽，其中，所述物种B选自LLOOLAAAALOOLL[SEQ ID NO：6]，尤其是AGYLLGKLLOOLAAAALOOLL[SEQ ID NO：2]或INLKALAALAKKIL[SEQ ID NO：28]并且尤其是AGYLLGKINLKALAALAKKIL[SEQ ID NO：1]以及氨基酸的缺失、加入、插入和置换。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107236022A (zh) * 2017-06-06 2017-10-10 中国医学科学院医药生物技术研究所 细胞穿透肽的亲脂性化合物偶联物及其在抗菌中的应用
CN107427548A (zh) * 2014-12-08 2017-12-01 Jjsk 研发私人有限公司 载体分子组合物及相关方法

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011115555A1 (en) * 2010-03-16 2011-09-22 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab System for improved delivery of gene modulating compounds
CA2811113A1 (en) 2010-11-09 2012-05-18 The Regents Of The University Of California Skin permeating and cell entering (space) peptides and methods of use thereof
EP2491952A1 (en) * 2011-02-22 2012-08-29 Cepep III AB A system for cargo delivery into the cells
CN110251682B (zh) 2011-11-24 2022-12-06 苏州宝时得电动工具有限公司 多肽序列设计及其在多肽介导的siRNA传递中的应用
US9234048B2 (en) 2012-01-18 2016-01-12 Wisconsin Alumni Research Foundation Boronate-mediated delivery of molecules into cells
US9732101B2 (en) 2012-01-18 2017-08-15 Wisconsin Alumni Research Foundation Bioreversible boronates for delivery of molecules into cells
CA2922698C (en) 2013-08-29 2023-01-03 City Of Hope Cell penetrating conjugates comprising non-cell penetrating antibodies covalently attached to one or more phosphorothioate nucleic acids
US10010562B2 (en) 2013-11-06 2018-07-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Dual molecular delivery of oligonucleotides and peptide containing conjugates
WO2016136707A1 (ja) * 2015-02-27 2016-09-01 学校法人常翔学園 膜透過性ペプチド鎖を有する多糖誘導体
KR20230156367A (ko) 2016-05-18 2023-11-14 싱가포르 헬스 서비시즈 피티이 엘티디 약제학적 조성물 및 자가면역 질환의 치료에 있어 이의 용도
JP7013626B2 (ja) * 2018-01-05 2022-02-01 国立医薬品食品衛生研究所長 細胞膜透過ペプチド、構築物、及び、カーゴ分子を細胞内に輸送する方法
US11987647B2 (en) 2018-05-09 2024-05-21 Ohio State Innovation Foundation Cyclic cell-penetrating peptides with one or more hydrophobic residues
US20210244824A1 (en) * 2018-07-02 2021-08-12 Ohio State Innovation Foundation Polypeptide conjugates for intracellular delivery of nucleic acids
CA3206148A1 (en) 2021-01-24 2022-07-28 Michael David FORREST Therapeutic modifiers of the reverse mode of atp synthase
EP4296274A1 (en) * 2022-06-23 2023-12-27 Universidade de Santiago de Compostela Peptides for intracellular delivery
GB202214599D0 (en) 2022-10-04 2022-11-16 Univ Tartu Novel cell penetrating peptides and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070129305A1 (en) * 2005-12-06 2007-06-07 Centre National De La Recherche Scient. Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
WO2008043366A2 (en) * 2006-10-13 2008-04-17 Københavns Universitet Three-domain compounds for transmembrane delivery

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2298067A1 (en) * 1997-07-24 1999-02-04 Ulo Langel Conjugates of transporter peptides and nucleic acid analogs, and their use
WO2005117928A1 (en) * 2004-05-30 2005-12-15 Cemines, Inc. Compositions and methods for the treatment of skin cancer
US20060040879A1 (en) * 2004-08-21 2006-02-23 Kosak Kenneth M Chloroquine coupled nucleic acids and methods for their synthesis
WO2007069068A2 (en) * 2005-12-16 2007-06-21 Diatos Cell penetrating peptide conjugates for delivering nucleic acids into cells
EP1797901A1 (en) * 2005-12-16 2007-06-20 Diatos Cell penetrating peptide conjugates for delivering nucleic acids into cells
EP2491952A1 (en) * 2011-02-22 2012-08-29 Cepep III AB A system for cargo delivery into the cells

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070129305A1 (en) * 2005-12-06 2007-06-07 Centre National De La Recherche Scient. Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
WO2008043366A2 (en) * 2006-10-13 2008-04-17 Københavns Universitet Three-domain compounds for transmembrane delivery

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107427548A (zh) * 2014-12-08 2017-12-01 Jjsk 研发私人有限公司 载体分子组合物及相关方法
CN107236022A (zh) * 2017-06-06 2017-10-10 中国医学科学院医药生物技术研究所 细胞穿透肽的亲脂性化合物偶联物及其在抗菌中的应用
CN107236022B (zh) * 2017-06-06 2020-09-29 中国医学科学院医药生物技术研究所 细胞穿透肽的亲脂性化合物偶联物及其在抗菌中的应用
CN112107676A (zh) * 2017-06-06 2020-12-22 中国医学科学院医药生物技术研究所 一种脂肽及其在抗菌中的应用
CN112107676B (zh) * 2017-06-06 2022-05-31 中国医学科学院医药生物技术研究所 一种脂肽及其在抗菌中的应用

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