JP2023509004A - ニドゲンをベースとする足場タンパク質および治療用ナノ複合体 - Google Patents

ニドゲンをベースとする足場タンパク質および治療用ナノ複合体 Download PDF

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Abstract

本発明は、目的のペプチドが結合する足場として用いるのに適したタンパク質、または目的の剤が結合する複合体内に含まれるタンパク質に関する。本発明はまた、特定のタイプの細胞および組織に目的の剤の複合体を選択的に送達するのに適した複合体に関連し、前記剤は、治療剤または造影剤であり得る。本発明はまた、そのような複合体を含むナノ粒子およびその治療的使用に関する。

Description

本発明は、ナノ構造タンパク質材料の分野、より具体的には治療に用いることができる治療薬運搬ポリペプチドに関する。
ナノ複合体の形態での薬物の全身投与は、遊離分子と比較して、薬物の安定性が向上するという利点がある。ナノスケールの媒体に官能基を化学的に組み込むことにより、ナノ材料の高い表面積／体積比から利益が得られ、細胞ターゲティング等の有益な追加の特性が既存のハイブリッド複合材料に統合され得る。結果として得られる約８～１００ｎｍの薬物担持複合体は、全身投与される場合、肺または他の高度に血管新生される臓器における凝集がない限り腎濾過を回避する。この事実は、材料の適切な物理化学的特性と組み合わされて、循環時間の延長および標的臓器への薬物曝露の延長をもたらし、したがって患者の治療効果および利益を高める可能性がある。
金属、セラミック、ポリマーおよびカーボンナノチューブ等、薬物媒体として調査中の多様な材料のうち、タンパク質は生体適合性および分解性に関して独自の特性を提供し、ナノ毒性の懸念が高まっている状況で、それらは特に好ましいものである。タンパク質のナノ構造材料への自己組織化のエンジニアリングが急速に進歩し、最終的な形状および物理化学的特性の制御が厳しくなるにつれて、タンパク質材料は、媒体として、化学的に結合した薬物から機能的および構造的多様性を獲得する。
実際、細胞毒性「ペイロード（payload）」の抗体への結合による抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の形成により、癌選択的な細胞表面分子への抗体の特異的結合を介した癌細胞への細胞毒性剤の選択的送達のメカニズムが提供されることが示されている。急性骨髄性白血病に対して用いられる非常に強力なＤＮＡ標的抗生物質であるカリケアマイシンと結合した抗ＣＤ３３抗体を含むゲムツズマブオゾガマイシンのように、この戦略の複数の例が効果的であることが証明されている。また、非常に強力な微小管破壊剤であるマイタンシノイドがＡＤＣの最大担持量（payload）について試験され、ＨＥＲ２陽性乳癌を治療するための製剤であるアドトラスツズマブエムタンシンが得られた。
それでもなお、抗体の構造の複雑さは、コストおよび合成の点で厄介な障害となり得る。本発明者らはこれまでに、コアタンパク質へのカチオン性Ｎ末端ドメインおよびＣ末端ポリヒスチジンの付加に基づくナノ構造原理を適用することにより、ナノ医療の分野の探索を行った［Serna, N. et al. 2016. Nanomedicine, 12:1241-51］。これらの末端タグおよびその結果生じる融合全体の電荷バランスは、堅牢なトロイドナノ粒子としてモノマータンパク質の自己組織化およびオリゴマー化を促進し、血漿中で安定であること［Cespedes, M. V. et al. 2014. ACS Nano., 8:4166-4176］、細胞標的ペプチドが付加されると細胞への浸透性が高くなること［Xu, Z. K. et al. 2015. Materials Letters, 154:140-3］が当技術分野で説明されている。これらのタンパク質構造の構成要素には、細胞標的剤、エンドソーム溶解剤または核局在化シグナル等の機能性ペプチドも、モジュール構造化による融合ストレッチの形態で含まれ得る。
現在の治療法は、主に化学療法に最も耐性を有する細胞の腫瘍内クローン選択により引き起こされ得る腫瘍耐性現象に起因して、依然として改善の余地を示していることから、例えば、当技術分野では、治療薬の副作用およびオフターゲット効果を低減しながら、治療の失敗および腫瘍の進行に関与する具体的な腫瘍細胞を標的とすることができる、より具体的な治療アプローチの開発が依然として求められている。
第１の態様において、本発明は、
（ｉ）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、ＪおよびＫと指定される１１種のβ鎖ドメイン、ならびに
（ｉｉ）ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ、ＧＨ、ＨＩ、ＩＪおよびＪＫループと指定される、２つの連続するβ鎖ドメインを接続する１０種のループ領域
を含むポリペプチドであって；
前記ループ領域の少なくとも１つが配列番号６２における同族ループ領域変異体であり、該配列番号６２における同族ループ領域が、配列番号１（ループ領域ＡＢ）、配列番号２（ループ領域ＢＣ）、配列番号３（ループ領域ＣＤ）、配列番号４（ループ領域ＤＥ）、配列番号５（ループ領域ＥＦ）、配列番号６（ループ領域ＦＧ）、配列番号６２のアミノ酸１４９～１５０（ループ領域ＧＨ）、配列番号７（ループ領域ＨＩ）、配列番号８（ループ領域ＩＪ）および配列番号９（ループ領域ＪＫ）で定義され、かつ
前記β鎖ドメインの少なくとも１つが配列番号６２における同族β鎖の変異体であり、同族β鎖ドメインと少なくとも５０％の配列同一性を有し、該配列番号６２における同族β鎖ドメインが、配列番号９（β鎖ドメインＡ）、配列番号１１（β鎖ドメインＢ）、配列番号１２（β鎖ドメインＣ）、配列番号１３（β鎖ドメインＤ）、配列番号１４（β鎖ドメインＥ）、配列番号１５（β鎖ドメインＦ）、配列番号１６（β鎖ドメインＧ）、配列番号１７（β鎖ドメインＨ）、配列番号１８（β鎖ドメインＩ）、配列番号１９（β鎖ドメインＪ）および配列番号２０（β鎖ドメインＫ）で定義されるポリペプチドに関する。
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるポリペプチドを複数含むポリペプチドディスプレイライブラリーであって、前記複数のポリペプチドが、１つ以上のループ領域の配列が異なるポリペプチドによって形成されるポリペプチドディスプレイライブラリーに関する。
第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または本発明の第２の態様によるポリペプチドディスプレイライブラリーのポリペプチドに関する。
第４の態様において、本発明は、本発明の第３の態様によるポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
第５の態様において、本発明は、本発明の第３の態様によるポリヌクレオチド、または本発明の第４の態様によるベクターを含む宿主細胞に関する。
第６の態様において、本発明は、
（ｉ）ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体を含む第１のポリペプチド領域、および
（ｉｉ）目的の剤
を含む複合体に関する。
第７の態様において、本発明は、本発明の第６の態様による複合体を調製する方法であって、
（ｉ）ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体を含む本発明の第６の態様による複合体のポリペプチドであって、活性化形態であるポリペプチドを提供すること、および
（ｉｉ）前記ポリペプチドと、前記ポリペプチド中の反応性基と反応することができる目的の剤とを、前記ポリペプチド中の反応性基と前記目的の剤中の基との間の結合を形成するのに適切な条件下で接触させること
を含む方法に関する。
第８の態様において、本発明は、
（ｉ）ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体を含む第１の領域、および
（ｉｉ）拮抗的なＣＸＣＲ４リガンドを含む第２の領域
を含むポリペプチドに関する。
第９の態様において、本発明は、本発明の第６の態様による複合体を調製する方法であって、
（ｉ）ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体を含む本発明の第６の態様による複合体のポリペプチドを提供すること、および
（ｉｉ）前記ポリペプチドと、前記ポリペプチド中の少なくとも１つの基と反応することができる本発明の第６の態様による複合体の目的の剤の活性化形態とを、前記目的の剤中の反応性基と前記ポリペプチド中の基との間の結合を形成するのに適切な条件下で接触させること
を含む方法に関する。
第１０の態様において、本発明は、本発明の第６の態様による複合体を調製する方法であって、
（ｉ）ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体を含む本発明の第６の態様による複合体のポリペプチドであって、活性化形態であるポリペプチドを提供すること、および
（ｉｉ）前記ポリペプチドと、前記ポリペプチド中の反応性基と反応することができる目的の剤とを、前記ポリペプチド中の反応性基と前記目的の剤中の基との間の結合を形成するのに適切な条件下で接触させること
を含む方法に関する。
第１１の態様において、本発明は、
（ｉ）ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体を含む第１の領域、および
（ｉｉ）拮抗的なＣＸＣＲ４リガンドを含む第２の領域
を含むポリペプチドに関する。
第１２の態様において、本発明は、本発明の第１１の態様によるポリペプチドの複数のコピーを含むナノ粒子を調製する方法であって、前記ポリペプチドの調製物を、前記ポリペプチドの複数のコピーを集合させてナノ粒子とするのに適切な条件下に置くことを含む、方法に関する。
第１３の態様において、本発明は、本発明の第６の態様による複合体の複数のコピー、または本発明の第１１の態様によるポリペプチドの複数のコピーを含むナノ粒子を調製する方法であって、
（ｉ）前記複合体またはポリペプチドの調製物を、前記複合体またはポリペプチドの複数のコピーを集合させてナノ粒子とするのに適切な条件下に置くことを含む方法、または
（ｉｉ）
ｉ．それぞれが
１．ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体である第１のポリペプチド領域、
２．目的の標的と特異的に結合することができる第２のポリペプチドであって、ポリカチオン性ペプチドである第２のポリペプチド、および
３．正に帯電したアミノ酸に富む領域である第３のポリペプチド領域
を含む複数のポリペプチドを、前記ポリペプチドの複数のコピーを含むナノ粒子を形成するのに適切な条件下に置くことであって、
前記ポリカチオン性ペプチドおよび正に帯電したアミノ酸に富む領域がポリペプチドの末端に位置し、該ポリペプチドが活性化形態で提供され、該活性化形態のポリペプチドが反応性基を含む、前記置くこと、および
ｉｉ．工程ｉで得られたナノ粒子と、前記ポリペプチド中の反応性基と反応することができる基を含む目的の剤の活性化形態とを、前記ポリペプチド中の反応性基と前記目的の剤中の基との間の結合を形成するのに適切な条件下で接触させること
を含む方法
から選択される方法に関する。
第１４の態様において、本発明は、第１のタイプの複合体の複数のコピーおよび第２のタイプの複合体の複数のコピーを含むバイパラトピックナノ粒子を調製する方法であって、前記第１および第２のタイプの複合体が第６の態様で定義されるものであり、前記第１および第２のタイプの複合体が異なるポリカチオン性ペプチドを有し、
（ｉ）前記第１のタイプの複合体の調製物と前記第２のタイプの複合体の調製物とを、該２つのタイプの複合体の複数のコピーを集合させてナノ粒子とするのに適切な条件下で接触させることを含む方法、または
（ｉｉ）
ｉ．第１のポリペプチドの調製物と第２のポリペプチドの調製物とを接触させることであって、前記第１および第２のタイプのポリペプチドが、
ａ．ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体である第１のポリペプチド領域、
ｂ．目的の標的と特異的に結合することができる第２のポリペプチド領域であって、前記第２のポリペプチドがポリカチオン性ペプチドであり、かつ／またはそのＮ末端またはＣ末端に位置する正に帯電した追加のペプチド配列およびポリカチオン性の配列を含み、一つのポリペプチドのポリカチオン性ペプチドの配列と他のポリペプチドのポリカチオン性ペプチド配列とが異なる、第２のポリペプチド領域、
ｃ．正に帯電したアミノ酸に富む領域である第３のポリペプチド領域、
ｄ．任意に、ポリカチオン性ペプチドのＮ末端またはＣ末端に位置する正に帯電したペプチド配列、
を含み、
前記ポリカチオン性ペプチドおよび正に帯電したアミノ酸に富む領域が前記ポリペプチドの末端に位置し、
前記第１および第２のポリペプチドが異なるポリカチオン性ペプチドを有し、
前記第１および／または第２のポリペプチドが本発明の第６の態様で定義される複合体として存在し、
前記第１および／または第２のポリペプチドが活性化形態で提供され、該活性化形態のポリペプチドが反応性基を含み、前記置くことが、ポリペプチドの複数のコピーを含むナノ粒子を形成するのに適切な条件下で行われる、前記接触させること、
ｉｉ．工程ｉで得られたナノ粒子と、各ポリペプチド中の反応性基と反応することができる基を含む目的の剤の活性化形態とを、前記ポリペプチド中の反応性基と前記目的の剤中の基との間の結合を形成するのに適切な条件下で接触させること
を含む方法
から選択される方法に関する。
第１５の態様において、本発明は、本発明の第６の態様による少なくとも１つの複合体の複数のコピーおよび本発明の第１１の態様による少なくとも１つのポリペプチドの複数のコピーを含むバイパラトピックナノ粒子を調製する方法であって、前記第１のタイプの複合体のポリカチオン性ペプチドと前記少なくとも１つのポリペプチドの第２の領域の配列とが異なり、
（ｉ）前記少なくとも１つの複合体の複数のコピーと前記少なくとも１つのポリペプチドの複数のコピーの調製物とを、前記２つの複合体の複数のコピーを集合させてナノ粒子とするのに適切な条件下に置くことを含む方法、または
（ｉｉ）
ｉ．第１のポリペプチドの調製物と第２のポリペプチドの調製物とを接触させることであって、前記第１および第２のタイプのポリペプチドが、
ａ．ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体である第１のポリペプチド領域、
ｂ．目的の標的と特異的に結合することができる第２のポリペプチド領域であって、前記第２のポリペプチドがポリカチオン性ペプチドであり、かつ／またはそのＮ末端またはＣ末端に位置する正に帯電した追加のペプチド配列およびポリカチオン性の配列を含み、一つのポリペプチドのペプチドの配列と他のポリペプチドのポリカチオン性ペプチドの配列とが異なる、第２のポリペプチド領域、
ｃ．正に帯電したアミノ酸に富む領域である第３のポリペプチド領域
を含み、
前記ポリカチオン性ペプチドおよび正に帯電したアミノ酸に富む領域が前記ポリペプチドの末端に位置し、
前記第１のポリペプチドが本発明の第６の態様で定義される複合体として存在し、前記第２のポリペプチドが本発明の第１１の態様で定義されるものであり、
前記第１のポリペプチドのポリカチオン性ペプチドと前記第２のポリペプチドのポリカチオン性ペプチドとが異なり、
前記第１および／または第２のポリペプチドが活性化形態で提供され、該活性化形態のポリペプチドが反応性基を含み、前記置くことが、ポリペプチドの複数のコピーを含むナノ粒子を形成するのに適切な条件下で行われ、
ｉｉ．工程ｉで得られたナノ粒子と、各ポリペプチド中の反応性基と反応することができる基を含む目的の剤の活性化形態とを、前記ポリペプチド中の反応性基と前記目的の剤中の基との間の結合を形成するのに適切な条件で接触させること
を含む方法
から選択される方法に関する。
第１６の態様において、本発明は、本発明の第６の態様による複合体の複数のコピー、本発明の第１１の態様によるポリペプチドの複数のコピーを含むか、または本発明の第１２または第１３の態様による方法により得られるナノ粒子に関する。
第１７の態様において、本発明は、第１および第２のタイプの複合体の複数のコピーを含むバイパラトピックナノ粒子であって、前記第１および第２のタイプの複合体の両方が本発明の第６の態様で定義されるものであるか、または本発明の第１１の態様で定義されるポリペプチドとして存在し、前記第１および第２のタイプの複合体が、本発明の第１４または第１５の態様による方法により得られるポリカチオン性ペプチドまたはバイパラトピックナノ粒子が異なるバイパラトピックナノ粒子に関する。
第１８の態様において、本発明は、本発明の第６の態様による複合体の複数のコピーおよび本発明の第１１の態様によるポリペプチドの複数のコピーを含むバイパラトピックナノ粒子であって、前記複合体のポリカチオン領域と前記ポリペプチドの第１の領域とが異なるバイパラトピックナノ粒子、または本発明の第１４または第１５の態様による方法により得られるバイパラトピックナノ粒子に関する。
第１９の態様において、本発明は、医薬で使用するための本発明の第６の態様による複合体、本発明の第１１の態様によるポリペプチド、または本発明の第１６、１７または１８の態様によるナノ粒子に関する。
第２０の態様において、本発明は、本発明の第６の態様による複合体の１つ以上の構成要素、第１１の態様によるポリペプチドの１つ以上の構成要素、または本発明の第１６、第１７または第１８の態様によるナノ粒子の１つ以上の構成要素に対する特異的結合部位を含む標的細胞の画像化の方法であって、
（ｉ）前記細胞を含むサンプルと、本発明の第６の態様による複合体、本発明の第１１の態様によるポリペプチドまたは本発明の第１６、１７または第１８の態様によるナノ粒子とを、前記複合体、ポリペプチドまたはナノ粒子と前記細胞とが結合するのに適切な条件下で接触させることであって、前記目的の剤が造影剤である、接触させること、および
（ｉｉ）前記造影剤により提供される信号を検出することにより細胞を画像化すること
を含む方法に関する。
第２１の態様において、本発明は、標的ペプチドに結合するポリペプチドを同定する方法であって、
ｉ）標的ペプチドと、本発明の第２の態様によるポリペプチドディスプレイライブラリーとを、ポリペプチドと前記標的ペプチドとが相互作用することができる条件下で接触させること、
ｉｉ）前記標的ペプチドと特異的に相互作用したライブラリーのメンバーを回収すること、
ｉｉｉ）前記標的ペプチドと相互作用するポリペプチドの配列を特定すること
を含む方法に関する。
第２２の態様において、本発明は、ペプチドを提示するための本発明の第１の態様によるポリペプチドの使用であって、前記ペプチドがループ領域の１つに見出される使用に関する。
第２３の態様において、本発明は、サンプル中の標的ペプチドの存在を決定する方法であって、
ｉ）サンプル中に存在するタンパク質と、本発明の第１の態様によるポリペプチドとを接触させことであって、前記ポリペプチド中のループ領域の少なくとも１つの配列が前記標的ペプチドに特異的に結合することができる配列である、接触させること、
ｉｉ）前記標的ペプチドと前記ポリペプチドとの間に相互作用があるかどうかを決定し、前記ポリペプチドと前記標的ペプチドとの間に相互作用がある場合には前記標的ペプチドがサンプル中に存在する、決定すること
を含む方法に関する。
図１は、Takagi J. et al. (Nature 424, 969-974, 2003)に示されるヒトニドゲン－１タンパク質の構造を示す。Ｇ１、Ｇ２およびＧ３は、３つの主要な球状ドメインを示す。ＥＧはＥＧＦモジュールを表し、ＴＹはチログロブリンリピートを表し、ＬＹはＬＤＬ受容体ＹＷＴＤリピートを表す。 図２は、Ｔ２２－ＳＴＭ－Ｈ６（Ａ）、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６（Ｂ）およびＴ２２－ＧＦＰ－Ｈ６（Ｃ）のナノ粒子の特性を示す。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析スペクトルを上に示し、抗Ｈｉｓモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット免疫検出を挿入図として示し、ＤＬＳにより測定された各ナノ粒子の体積サイズ分布を下に示す。 図３は、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６ナノ粒子の特性を示す。Ａ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動による炭酸塩（－）および炭酸塩＋塩（＋）緩衝液中のＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６精製ピーク１（Ｐｉｃｏ１）およびピーク２（Ｐｉｃｏ２）のクーマシーブルー染色。Ｂ）抗Ｈｉｓモノクローナル抗体によるＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６タンパク質のウエスタンブロット免疫検出。Ｃ）ＤＬＳにより決定されたＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６ナノ粒子の体積サイズ分布。Ｄ）Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６タンパク質のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析スペクトル。 図４は、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６の標識付けを示す。Ａ）標識されたＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＡＴＴＯ４８８タンパク質のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析スペクトル。３０．３ｋＤａを超える各ピークは、追加のＡＴＴＯ分子の取り込みに対応する。Ｂ）ＤＬＳにより決定されたＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＡＴＴＯ４８８ナノ粒子の体積サイズ分布。 図５は、ＣＸＣＲ４＋細胞におけるＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６タンパク質のＣＸＣＲ４特異的内在化を示す。Ａ）異なる濃度（１ｎＭおよび１０ｎＭ）のＨｅＬａ細胞（ＣＸＣＲ４＋）上で２４時間インキュベートした場合の、標識されたＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＡＴＴＯ４８８ナノ粒子の内在化および競合（＋ＡＭＤ）。ＣＸＣＲ４受容体アンタゴニストＡＭＤ３１００（＋ＡＭＤ）の存在下での細胞取り込み阻害の％が示される。Ｂ）２５ｎＭのＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＡＴＴＯ４８８の存在下で２４時間インキュベートした場合の、ＨｅＬａ細胞の共焦点レーザー顕微鏡画像。細胞核はヘキスト（Hoechst）で染色され、細胞膜はＣｅｌｌＭａｓｋで染色され、細胞内の断続的なパターンはタンパク質ナノ粒子に対応する。 図６は、オリゴＦｄＵと結合したＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６ナノ粒子を示す。Ａ）６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）二官能性リンカーを用いた、タンパク質リジンアミンを介したチオール結合オリゴ５’－（ＦｄＵ）５－ヘキサエチレングリコールチオール－３’（オリゴ－ＦｄＵ－ＳＨ）の二段階反応による共有結合の概略図。Ｂ）Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＦｄＵナノ複合体のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析スペクトル。Ｃ）ＤＬＳにより決定されたＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＦｄＵナノ複合体の体積サイズ分布。 図７は、ＣＸＣＲ４＋細胞に対するオリゴＦｄＵ複合体ナノ粒子の細胞毒性を示す。グラフは、ＭＴＴ生存率試験アッセイにより測定された２５ｎＭもしくは１００ｎＭのＴ２２－ＳＴＭ－Ｈ６－ＦｄＵ、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＦｄＵ、または２つの異なるストックのＴ２２－ＧＦＰ－Ｈ６－ＦｄＵナノ複合体、および１００ｎＭの遊離オリゴＦｄＵ（ＦｄＵ）の存在下で４８時間インキュベーションした場合のＨｅＬａ細胞（ＣＸＣＲ４＋）の生存率（％）を示す。 図８は、ＣＸＣＲ４＋腫瘍モデルにおいて、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＦｄＵナノ複合体がＴ２２－ＳＴＭ－Ｈ６－ＦｄＵまたはＴ２２－ＧＦＰ－Ｈ６－ＦｄＵよりも高い増殖阻害を誘導することを示す。グラフは、２０μｇ ｑ３ｄ ｘ ５用量での各ナノ複合体処理群（ｎ＝４）の腫瘍体積の経時的変化、およびＣＸＣＲ４＋Ｍ５皮下（ＳＣ）結腸直腸癌（ＣＲＣ）モデルでの緩衝液処理（Ｋ、ｎ＝４）との比較を示す。 図９は、ＣＸＣＲ４＋Ｍ５腫瘍組織において、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＦｄＵナノ複合体がＴ２２－ＳＴＭ－Ｈ６－ＦｄＵまたはＴ２２－ＧＦＰ－Ｈ６－ＦｄＵよりも高いアポトーシス誘導を示すことを示す。Ａ）グラフは、実験終了時に緩衝液またはナノ複合体で処理された腫瘍の腫瘍切片において観察されたアポトーシス小体の数を示す。Ｂ）比較した各群で観察されたアポトーシス像（黒い矢印）を特定するＨ＆Ｅ染色切片の代表的な顕微鏡写真。 図１０は、比較した群間で腎臓または肝臓に組織学的変化がないことを示す。コントロール緩衝液処理マウスまたはナノ複合体処理マウスにおける処理終了時に両方の臓器で構造または組織学的な変化がない（炎症またはアポトーシス像が観察されない）ことを示す腎臓および肝臓の組織の代表的なＨ＆Ｅ染色切片。 図１１は、ヘキサヒスチジンタグ付きの単離されたヒトニドゲンＧ２ドメイン、ヘキサヒスチジンタグ付きの単離されたＨ４５９Ａ、Ｒ４６８Ｎ、Ｆ６３９ＳおよびＲ６５０Ａの突然変異を含むヒトニドゲンＧ２ならびにステフィンＡについての固有蛍光と温度との相関関係を示す。矢印はサンプルの加熱を示す。温度の関数としてＣＳＭ値を用いたたＮｉｄｏｍｕｔ２Ｈ６（Ｂ）、ＮｉｄｏＷＴＨ６（Ｃ）およびＳＴＭＨ６（Ｄ）の展開曲線。ＣＳＭ値は、図１ａで例示された実験から算出され、各タンパク質について行われた。黒色および灰色の矢印は、それぞれＴｍおよびＴ開始の値を示す。 図１２は、ニドゲンＧ２ドメインの構造を示す。Ａ）マルチドメインヒトニドゲン１タンパク質およびその天然リガンドとの相互作用の概略図。Ｇ２ドメイン内のβバレル構造を示す。Ｂ）ニドゲンＧ２βバレルドメインの二次構造。灰色の異なるβシート（Ａ～Ｋ）と青色のαヘリックス。Ｃ）左パネルのニドゲンＧ２（ＲＣＳＢ ＰＤＢデータベースのアクセション番号１ＧＬ４、２０１１年７月１３日からのバージョン１．２）および右パネルの緑色蛍光タンパク質（ＲＣＳＢ ＰＤＢデータベース チェーンＡのアクセション番号１ＱＹＯ、２０１１年７月１３日からのバージョン１．２）の３次βバレル構造の模式図。Ｄ）ニドゲンＧ２およびＧＦＰβのバレル構造の重ね合わせ。 図１３は、ＮｉｄｏＭｕｔ２ペプチドの設計を示す。Ａ）ヒトおよびマウスのニドゲンＧ２ドメインの類似性：Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（ＥＭＢＬ－ＥＭＩ）により分析されたヒトニドゲン１タンパク質（２００９年７月７日付けのバージョンのＵｎｉｐｒｏｔデータベースのＰ１４５４３）とマウスニドゲン１タンパク質（２００９年７月７日付けのバージョンのＵｎｉｐｒｏｔデータベースのＰ１０４９３）との間のアミノ酸アラインメント。黒色の線は、Ｇ２βバレルドメインの開始点および終了点を示す。「＊」はアミノ酸の一致を示し、「：」は高い類似性を有するアミノ酸を示し、「．」は低い類似性を有するアミノ酸を示す。Ｂ）ヒトニドゲン１タンパク質、ＨＳＮＢＴ足場タンパク質およびＴ２２－ＨＳＮＢＴ－Ｈ６タンパク質のアミノ酸配列。ヒトニドゲンにおいて、Ｇ２βバレルドメインは黒色で強調され、突然変異の候補アミノ酸は黒色の太字で示されており、かつ下線が引かれている。ＮＩＤＯｍｕｔ２の配列において、組み込まれた突然変異は黒色の太字で示されている。Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６においては、Ｎ末端のＴ２２リガンドは下線付きの黒色で示され、短いリンカーは黒色の太字で示され、組み込まれた突然変異は太字および下線で示され、Ｃ末端のポリヒスチジン尾部は太字の黒のイタリック体で強調されている。 図１４は、図に示したタンパク質の発現試験の細胞溶解物の可溶性画分のウエスタンブロットを示す。 図１５は、図の各パネルに示した選択された候補タンパク質の発現試験後のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析スペクトルを示す。すべてのタンパク質の理論上のサイズは約３０．３ｋＤａである。 図１６は、ＤＬＳにより決定された、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６タンパク質、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６タンパク質、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ４＿Ｔ２１５Ｖ－Ｈ６タンパク質およびＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｈ６タンパク質ならびにそれらのナノ粒子の体積サイズ分布を示す。 図１７Ａは、ＺｎＣｌ２の濃度上昇を伴うインキュベーション後の、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ４＿Ｔ２１５Ｖ－Ｈ６およびＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｈ６の沈殿プロファイルを示す。図１７Ｂは、ＤＬＳにより決定された、異なるＺｎＣｌ２濃度で集合させたＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ４＿Ｔ２１５Ｖ－Ｈ６およびＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｈ６のナノ粒子の体積サイズ分布を示す。 図１８Ａ～Ｃ．炭酸緩衝液および３種のＦＤＡ承認緩衝液（Ａ９、Ｂ６、Ｄ１）中のＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６およびＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｈ６のＣＳＭプロファイル。Ｄ．試験された各緩衝液の主要なイ指標（Ｔｍ、ＴｏｎｓｅｔおよびΔＴ）を示すグラフ。 図１９Ａ～Ｂは、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６－ＦｄＵおよびＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＦｄＵのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析スペクトルを示す。タンパク質重量（３０．３ｋＤａ）に２ｋＤａが追加された各ピークは、追加のｏｌｉｇｏＦｄＵが付加された複合タンパク質に属す。Ｃ．非複合体ネガティブコントロールおよび参照Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＦｄＵポジティブコントロールと共にＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６－ＦｄＵナノ複合体を４８時間インキュベートした後の細胞毒性アッセイ。Ｄ．Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６－ＦｄＵの体積サイズ分布。 図２０は、ＥＰＩ－Ｘ４ベースのＮＰの構造的および機能的特性を示す。Ａ．モジュラータンパク質ＥＰＩＸ４－ＧＦＰ－Ｈ６（上）およびＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６（下）のスキームならびに後者のアミノ酸配列。Ｂ．ＥＰＩＸ４－ＧＦＰ－Ｈ６（左）およびＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６（右）の質量分析。精製時のタンパク質の分子量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット（Ａｎｔｉ－Ｈｉｓ）によって示された。Ｃ．動的光散乱（ＤＬＳ）により決定された流体力学的サイズおよびｐｄｉ（多分散指数）。ピークサイズの値（平均）を示す（ｎｍ単位）。Ｄ．Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧｌカラムＥを用いたＥＰＩＸ４－ＧＦＰ－Ｈ６（黒色）およびＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６（灰色）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。Ｅ．ＥＰＩＸ４－ＧＦＰ－Ｈ６（上）およびＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６（下）タンパク質ＮＰの代表的なＦＥＳＥＭ（直接沈着）。サイズバーは５０ｎｍを表す。Ｆ．４時間における２μＭのＥＰＩＸ４－ＧＦＰ－Ｈ６およびＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６の投与後（濃緑色）のＣＸＣＲ４＋ＨｅＬａ細胞に内在化されたタンパク質量。天然のＣＸＣＲ４リガンドＡＭＤ３１００（薄緑色）により促進される取り込み阻害。細胞内蛍光をそれらの特定の蛍光により補正してタンパク質量を表す値とした。アスタリスクはＥＰＩＸ４－ＧＦＰ－Ｈ６タンパク質およびＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６タンパク質の内在化の有意差を示し、ハッシュはＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６およびＡＭＤ３１００により促進される阻害の有意差を示す（ｐ≦０．００１）。Ｇ．ＥＰＩＸ４－ＧＦＰ－Ｈ６（左）およびＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６（右）に２４時間曝露したＨｅＬａ細胞の共焦点画像。青色：細胞核、赤色：細胞膜、緑色：内在化したＮＰ。サイズバーは１０μｍを表す。すべてのデータは平均±ＳＥＭとして表される。 図２１は、バイパラトピックナノ粒子の形成および特性を示す。Ａ．タンパク質ＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６（上）およびＴ２２－ＢＦＰ －Ｈ６（下）を形成するハイブリッドＮＰのスキーム。Ｂ．０．２％ＳＤＳで分解された制御（controlled）ＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６（黒色）、および透析によりＳＤＳを除去して集合させたＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６（灰色）；動的光散乱（ＤＬＳ）により決定された（上）。Ｔ２２－ＢＦＰ－Ｈ６（灰色）、ＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６（黒色）およびバイパラトピックナノＮＰ（灰色の破線）の流体力学的サイズ比較（下）。ピークサイズ値（平均）は（ｎｍ）およびＰｄｉ（多分散指数）で示される。Ｃ．バイパラトピックＮＰの代表的なＦＥＳＥＭ（直接沈着）。サイズバーは５０ｎｍを表す。Ｄ．バイパラトピックＮＰ形成のＦＲＥＴ分析。バイパラトピックＮＰ、Ｔ２２－ＢＦＰ－Ｈ６およびＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６のモノマー混合物、ならびにＴ２２－ＢＦＰ－Ｈ６およびＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６ ＮＰの混合物のサンプルは、４０５ｎｍの光線で励起され、３５０～６５０ｎｍの発光が収集された。ＢＦＰはドナー蛍光色素として用いられ、ＧＦＰはアクセプターとして用いられた。Ｅ．ＣＸＣＲ４＋ＨｅＬａ細胞（左）およびＳＷ１４１７（右）におけるＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６、Ｔ２２－ＧＦＰ－Ｈ６およびバイパラトピックＮＰ（１μＭ）の細胞内在化の経時的動態。細胞内蛍光を特定の蛍光により補正してタンパク質量を表す値とした。バイパラトピックＮＰおよびそれらを形成する両方のタンパク質の間の有意差（ｐ＜０．０５）は＊で示され、バイパラトピックＮＰおよびＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６の間の有意差は＃で示される。Ｅ．ＣＸＣＲ４＋ＨｅＬａ細胞（左）およびＳＷ１４１７（右）におけるＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６、Ｔ２２－ＧＦＰ－Ｈ６およびバイパラトピックＮＰ（１μＭ）の細胞内在化の経時的動態。細胞内蛍光を特定の蛍光により補正してタンパク質量を表す値とした。バイパラトピックＮＰおよびそれらを形成する両方のタンパク質の間の有意差（ｐ＜０．０５）は＊で示され、バイパラトピックＮＰおよびＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６の間の有意差は＃で示される。Ｆ．１μＭに１時間曝露されたＨｅＬａ細胞におけるＣＸＣＲ４アンタゴニストＡＭＤ３１００（常に１０：１の過剰モル比）によって媒介される取り込み阻害。＆は、ＮＰおよびＡＭＤ３１００により促進される阻害の間の有意差を示す（ｐ≦０．００１）。 図２２は、ＣＸＣＲ４＋ヒト結腸直腸癌の皮下マウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ生体内分布および毒性評価を示す。Ａ．様々な時点の腫瘍において放出された蛍光（ＦＬＩ比として測定）の定量化。Ｂ．ナノ粒子投与後のアポトーシス細胞体の数。コントロールに対するＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６またはバイパラトピックＮＰの有意差（ｐ＜０．０５）は＊で示され、バイパラトピックＮＰおよびＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６の間の有意差は＃で示されます。Ｃ．ナノ粒子投与後の有糸分裂体。ＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６またはバイパラトピックＮＰの間の有意差が示されている（＊ｐ＜０．０５）。Ｄ．処理の５時間後および２４時間後の組織切片（Ｈ＆Ｅ）の組織学的分析による、腎臓、肝臓、腎臓および脾臓における全身毒性の欠如。すべての写真は４００倍で撮影された。すべてのデータは平均±ＳＥＭとして表される。
Ｉ－本発明のポリペプチド
本発明者らは、その天然リガンドに対する親和性の低下を示すように任意に改変されたニドゲンタンパク質由来のＧ２ドメインが足場として作用し、前記Ｇ２ドメイン内のβ鎖と接続する１つ以上のループ領域に挿入されたペプチドを提示するのに十分に安定であることを見出した。さらに、本発明者らは、目的の細胞により発現される受容体に対して親和性を示すリガンドに複合体化された場合、ニドゲンタンパク質のＧ２ドメインを用いて、治療薬および診断薬／造影剤を含む目的の剤を目的の細胞に送達できることを見出した。本発明者らは、ニドゲンＧ２ドメインおよびＣＸＣＲ４特異的リガンドＴ２２を含み、抗癌剤に結合された融合タンパク質が、抗癌剤をＣＸＣＲ４発現細胞に送達することができ、Ｔ２２リガンドとＧＦＰまたはＳｔｅｆｉｎＡ等の異なるタンパク質とが融合した同等の剤によって達成される阻害よりも大幅に優れた程度で細胞の増殖を度阻害し得ることを見出した。
したがって、第１の態様において、本発明は、
（ｉ）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、ＪおよびＫと指定される１１種のβ鎖ドメイン、ならびに
（ｉｉ）ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ、ＧＨ、ＨＩ、ＩＪおよびＪＫループと指定される、２つの連続するβ鎖ドメインを接続する１０種のループ領域
を含むポリペプチドであって；
前記ループ領域の少なくとも１つが配列番号６２における同族ループ領域変異体であり、該配列番号６２における同族ループ領域が、配列番号１（ループ領域ＡＢ）、配列番号２（ループ領域ＢＣ）、配列番号３（ループ領域ＣＤ）、配列番号４（ループ領域ＤＥ）、配列番号５（ループ領域ＥＦ）、配列番号６（ループ領域ＦＧ）、配列番号６２のアミノ酸１４９～１５０（ループ領域ＧＨ）、配列番号７（ループ領域ＨＩ）、配列番号８（ループ領域ＩＪ）および配列番号９（ループ領域ＪＫ）で定義され、かつ
前記β鎖ドメインの少なくとも１つが配列番号６２における同族β鎖の変異体であり、同族β鎖ドメインと少なくとも５０％の配列同一性を有し、該配列番号６２における同族β鎖ドメインが、配列番号９（β鎖ドメインＡ）、配列番号１１（β鎖ドメインＢ）、配列番号１２（β鎖ドメインＣ）、配列番号１３（β鎖ドメインＤ）、配列番号１４（β鎖ドメインＥ）、配列番号１５（β鎖ドメインＦ）、配列番号１６（β鎖ドメインＧ）、配列番号１７（β鎖ドメインＨ）、配列番号１８（β鎖ドメインＩ）、配列番号１９（β鎖ドメインＪ）および配列番号２０（β鎖ドメインＫ）で定義される
ポリペプチドに関する。
ポリペプチドは、以下、「本発明の第１の態様によるポリペプチド」または「本発明のポリペプチド」と呼ばれる。
本明細書で用いられる「ポリペプチド」という用語は、一般に、ペプチド結合で結合された任意の長さのアミノ酸残基の直鎖を指す。本明細書で用いられる「ペプチド」という用語は、ポリペプチドのようにアミノ酸の直鎖を指すが、ポリペプチドのそれよりも短い。ペプチドは一般的に２～５０アミノ酸のアミノ酸鎖を指す。「ペプチド結合」、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、当業者に公知であることが理解されよう。
本発明のポリペプチドは、「ニドゲンＧ２ドメイン」の変異体である。
本明細書で用いられる「ニドゲン－１」という用語は、従来エンタクチンとして知られていた糖タンパク質を指す。ニドゲン－１は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（２００９年７月７日付けのバージョン）においてアクセション番号Ｐ１４５４３－１（配列番号７２）として開示されている。
本明細書で用いられる「ニドゲン－１のＧ２ドメイン」という用語は、上記で定義されたニドゲン１タンパク質のＧ２ドメインを指す。ニドゲン－１のＧ２ドメインは配列番号６２に示される通りであり、これはニドゲン－１タンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸番号４３０～６６７に対応し、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（２００９年７月７日付けのバージョン）の識別番号Ｐ１４５４３－１（配列番号７２）である。別の実施形態において、ニドゲン１のＧ２ドメインは配列番号６４に示される通りであり、これは配列番号６２の最初の２つのアミノ酸を欠き、したがってＵｎｉｐｒｏｔデータベース（２００９年７月７日付けのバージョン）の識別番号Ｐ１４５４３－１のニドゲン－１タンパク質前駆体のアミノ酸配列（配列番号７２）のアミノ酸番号４３２～６６７からなる領域に対応する。野生型のニドゲン－１配列において、Ｇ２ドメインは短いＥＧＦ様ドメインと隣接している。しかしながら、本発明の目的のために、ニドゲン－１のＧ２ドメインは、Ｎ末端またはＣ末端のＥＧＦ様ドメインを欠いている。
一つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｎ末端メチオニン残基を含む。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｎ末端の位置にメチオニンを含まない。
本明細書で用いられる場合、「アミノ酸残基」とは、任意の天然に存在するアミノ酸、任意のアミノ酸誘導体または当技術分野において公知の任意のアミノ酸模倣体（mimic）を指す。特定の実施形態において、前記アミノ酸残基は、アミノ酸、すなわち天然に存在するアミノ酸である。特定の実施形態において、タンパク質またはペプチドの残基は連続的であり、アミノ酸残基の配列を中断する非アミノ酸を含まない。別の実施形態において、配列は１つ以上の非アミノ酸部分を含み得る。特定の実施形態において、タンパク質またはペプチドの残基の配列は、１つ以上の非アミノ酸部分によって中断され得る。
本明細書で用いられる「β鎖」、「β鎖ドメイン」または「β鎖配列」という表現は、一方の鎖のＮＨ基と他方の鎖のＣＯとの間の水素結合を介して別のポリペプチド鎖または配列と接続した拡張したポリペプチド鎖または配列を指す。通常、β鎖の長さは約３～１０アミノ酸であるが、それより長くなることもあり得、例えば１３～１５アミノ酸の長さになることもあり得る。このような鎖間の接続の結果、β鎖は、シートに似たタンパク質二次構造を形成する。前記タンパク質二次構造は、本明細書において「βシート」と呼ばれる。βシート内で、β鎖は、平行、逆平行または混合（平行および逆平行）の様式で配置され得る。平行に配置される場合、β鎖は一方の末端（ＮまたはＣ）からもう一方の末端まで同じ方向に整列する。逆平行に配置される場合、各β鎖は、それが接続されている鎖の方向とは反対の方向に整列する。
本明細書で用いられる「βバレル」という表現は、βシートによって形成されるタンパク質二次構造であって、第１の鎖と最後の鎖とが水素結合によって結合してもたらされる閉じた環状（toroidal）構造を指す。
本明細書で用いられる「αヘリックス」または「アルファヘリックス」という表現は、アミノ酸のＮ－Ｈ基が水素とタンパク質配列の３または４残基前に位置するアミノ酸の骨格のＣ＝Ｏ基とを結合する右側のヘリックスからなるタンパク質の二次構造を指す。
本明細書で用いられる「αヘリックス部分」または「アルファヘリックス部分」という表現は、実質的に１つ以上のαヘリックスを含むタンパク質の二次構造におけるモチーフを指す。
当業者によって理解されるように、本明細書で用いられるβ鎖はタンパク質ドメインを指し、本明細書で用いられるβシートはタンパク質の二次構造を指す。
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドの１１個のβ鎖ドメインは、βシートの二次構造に含まれるか、またはそれを構成する。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドの１２個のβ鎖ドメインは、βバレル二次構造に含まれるか、またはそれを構成する。
本明細書で用いられる「ループ」、「ループ領域」、「ループ配列」、「オメガループ」、「オメガループ領域」または「オメガループ配列」という用語は、任意のアミノ酸配列を有する６つ以上のアミノ酸残基のポリペプチド鎖からなる、不規則的で非反復のタンパク質構造モチーフを指す。ループの開始および終了を構成する残基は、間に通常の二次構造モチーフが介在することなく、間隙を介して互いに接近している。それらは一般に、β鎖等の二次タンパク質構造、またはαヘリックス等の直接二次タンパク質構造に含まれる２つのタンパク質ドメインを接続する。このようなループは、しばしば、ループの一方の端部に接続しているタンパク質ドメインまたはタンパク質二次構造が、ループの他方の端部に接続している別のタンパク質ドメインまたはタンパク質構造に対してその方向（Ｎ－末端からＣ－末端、またはＣ－末端からＮ－末端）を変えることを可能にする。ループはほとんどの場合タンパク質の外表面に位置し、したがって一般にループが属するタンパク質と他の分子との間の相互作用に関与する。
特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、１つ以上のループ領域内に異種ポリペプチドを含むニドゲンＧ２ドメイン変異体である。一つの実施形態において、異種ポリペプチドはループ領域内に挿入されており、すなわちループ領域は、配列番号６２または配列番号６３の同族ループドメインに見られるすべてのアミノ酸を保存するが、異種ポリペプチドは、２つの連続するアミノ酸の間に挿入される。別の実施形態において、１つ以上のループ領域内の異種ポリペプチドは、ループ領域の配列を部分的または完全に置換するループ領域内の挿入として見出される。
異種ポリペプチドの長さは特に限定されるものではない。したがって、異種ポリペプチドは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、少なくとも９５個、少なくとも１００個またはそれ以上のアミノ酸を含み得る。
別の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、１つ以上のループ領域内に異種ポリペプチドを含み、１つ以上のβ鎖に突然変異を含み、突然変異が配列番号１１で定義されるβ鎖Ｂの９位（配列番号６２の３０位のアミノ酸、またはＵｎｉｐｒｏｔデータベース（２００９年７月７日付けのバージョン）のアクセション番号Ｐ１４５４３－１の配列もしくは配列番号７２で定義されるヒトニドゲン１前駆体の４５９位のアミノ酸に対応する）、配列番号１２で定義されるβ鎖Ｃの１位（配列番号６２の３９位のアミノ酸、またはＵｎｉｐｒｏｔデータベース（２００９年７月７日付けのバージョン）のアクセション番号Ｐ１４５４３－１の配列もしくは配列番号７２で定義されるヒトニドゲン１前駆体の４６８位のアミノ酸に対応する）、配列番号１９で定義されるβ鎖Ｊの１０位（配列番号６２の２１０位のアミノ酸、またはＵｎｉｐｒｏｔデータベース（２００９年７月７日付けのバージョン）のアクセション番号Ｐ１４５４３－１の配列もしくは配列番号７２で定義されているヒトニドゲン１前駆体の６３９位のアミノ酸に対応する）、または配列番号２０で定義されるβ鎖Ｋの３位（配列番号６２の２２１位のアミノ酸、またはＵｎｉｐｒｏｔデータベース（２００９年７月７日付けのバージョン）のアクセション番号Ｐ１４５４３－１の配列もしくは配列番号７２で定義されるヒトニドゲン１前駆体の６５０位のアミノ酸に対応する）に位置する。
一つの実施形態において、配列番号１１で定義されるβ鎖Ｂの９位の突然変異はＨ４５９Ａ突然変異であり、配列番号１２で定義されるβ鎖Ｃの１位の突然変異はＲ４６８Ｎ突然変異であり、配列番号１９で定義されるβ鎖Ｊの１０位の突然変異はＦ６３９Ｓ突然変異であり、かつ／または配列番号２０で定義されるβ鎖Ｋの３位の突然変異はＲ６５０Ａである。
一つの実施形態において、ヒトニドゲンＧ２ドメイン変異体は、Ｈ４５９ＡおよびＲ４６８Ｎの突然変異を含む。一つの実施形態において、ヒトニドゲンＧ２ドメイン変異体は、Ｈ４５９ＡおよびＦ６３９Ｓの突然変異を含む。一つの実施形態において、ヒトニドゲンＧ２ドメイン変異体は、Ｈ４５９ＡおよびＲ６５０Ａの突然変異を含む。一つの実施形態において、ヒトニドゲンＧ２ドメイン変異体は、Ｒ４６８ＮおよびＦ６３９Ｓの突然変異を含む。一つの実施形態において、ヒトニドゲンＧ２ドメイン変異体は、Ｒ４６８ＮおよびＲ６５０Ａの突然変異を含む。一つの実施形態において、ヒトニドゲンＧ２ドメイン変異体は、Ｈ４５９Ａ、Ｒ４６８ＮおよびＦ６３９Ｓの突然変異を含む。一つの実施形態において、ヒトニドゲンＧ２ドメイン変異体は、Ｈ４５９Ａ、Ｒ４６８ＮおよびＲ６５０Ａの突然変異を含む。一つの実施形態において、ヒトニドゲンＧ２ドメイン変異体は、Ｒ４６８Ｎ、Ｆ６３９ＳおよびＲ６５０Ａの突然変異を含む。一つの実施形態において、ヒトニドゲンＧ２ドメイン変異体は、Ｈ４５９Ａ、Ｒ４６８Ｎ、Ｆ６３９ＳおよびＲ６５０Ａの突然変異を含む。好ましい実施形態において、ニドゲンＧ２ドメイン変異体は、配列番号６４または６５で定義される配列を有する（以下、ＮＩＤＯｍｕｔ２と呼ばれる）。
別の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、上記の実施形態のいずれかで定義されるニドゲンＧ２ドメイン変異体であり、特に、Ｈ４５９Ａ、Ｒ４６８Ｎ、Ｆ６３９ＳおよびＲ６５０Ａの突然変異を有し、さらに５４３位（配列番号６２の１１４位のヒスチジンに対応する）および５４５位（配列番号６２の１１６位のヒスチジンに対応する）からなる群から選択される位置に突然変異を含むニドゲンＧ２ドメイン変異体である。別の実施形態において、Ｈ５４３位はＬｙｓに突然変異している。別の実施形態において、Ｈ５４５位はＡｓｎに突然変異している。いくつかの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、Ｈ４５９Ａ、Ｒ４６８Ｎ、Ｆ６３９Ｓ、Ｒ６５０ＡおよびＨ５４３Ｋの突然変異を含むニドゲンＧ２ドメイン変異体である。いくつかの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、Ｈ４５９Ａ、Ｒ４６８Ｎ、Ｆ６３９Ｓ、Ｒ６５０ＡおよびＨ５４５Ｎの突然変異を含むニドゲンＧ２ドメイン変異体である。別の実施形態において、ニドゲンＧ２ドメイン変異体は、Ｈ５４３Ｋ突然変異およびＨ５４５Ｎ突然変異を含む。一つの実施形態において、ニドゲンＧ２ドメイン変異体は、Ｈ４５９Ａ、Ｒ４６８Ｎ、Ｆ６３９Ｓ、Ｒ６５０Ａ、Ｈ５４３ＫおよびＨ５４５Ｎの突然変異を含むことを特徴とする配列番号８７を含むかまたはそれからなる（以下、ＮＩＤＯｍｕｔ３と呼ばれる）。
別の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、上記の実施形態のいずれかで定義されるニドゲンＧ２ドメイン変異体であり、特に、下記からなる群から選択される突然変異をさらに含むＮＩＤＯｍｕｔ３変異体である：
－４４９位（配列番号６２の２０位に対応する）のバリンの突然変異。好ましくは、４４９位のバリンはＴｈｒに突然変異している。好ましい実施形態において、ニドゲンＧ２ドメイン変異体は、配列番号８８で定義される配列を有する（以下、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｖ４５Ｔと呼ばれる）。
－５２５位（配列番号６２の９６位に対応する）のバリンの突然変異。好ましくは、４４９位のバリンはＧｌｎに突然変異している。好ましい実施形態において、ニドゲンＧ２ドメイン変異体は、配列番号８９で定義される配列を有する（以下、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｖ２１２Ｑと呼ばれる）。
－５６１位（配列番号６２の１４２位に対応する）のフェニルアラニンの突然変異。好ましくは、５６１位のフェニルアラニンはグルタミン酸に突然変異している。好ましい実施形態において、ニドゲンＧ２ドメイン変異体は、配列番号９０で定義される配列を有する（以下、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｆ１５７Ｅと呼ばれる）。
－６１９位（配列番号６２の１９０位に対応する）のバリンの突然変異。好ましくは、６１９位のバリンはスレオニンに突然変異している。好ましい実施形態において、ニドゲンＧ２ドメイン変異体は、配列番号９１で定義される配列を有する（以下、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｖ２１５Ｔと呼ばれる）。
別の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、上記の実施形態のいずれかで定義されるニドゲンＧ２ドメイン変異体であり、さらにＶ４４９Ｔ、Ｖ５２５Ｑ、Ｆ５６１ＥおよびＶ６１９Ｔの突然変異を含む。いくつかの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、Ｈ４５９Ａ、Ｒ４６８Ｎ、Ｆ６３９Ｓ、Ｒ６５０Ａ、Ｈ５４３Ｋ、Ｖ４４９Ｔ、Ｖ５２５Ｑ、Ｆ５６１ＥおよびＶ６１９Ｔの突然変異を含むニドゲンＧ２ドメイン変異体である。いくつかの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、Ｈ４５９Ａ、Ｒ４６８Ｎ、Ｆ６３９Ｓ、Ｒ６５０Ａ、Ｖ４４９Ｔ、Ｈ５４５Ｎ、Ｖ５２５Ｑ、Ｆ５６１ＥおよびＶ６１９Ｔの突然変異を含むニドゲンＧ２ドメイン変異体である。いくつかの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、Ｈ４５９Ａ、Ｒ４６８Ｎ、Ｆ６３９Ｓ、Ｒ６５０Ａ、Ｈ５４３Ｋ、Ｈ５４５Ｎ、Ｖ４４９Ｔ、Ｖ５２５Ｑ、Ｆ５６１ＥおよびＶ６１９Ｔの突然変異を含むニドゲンＧ２ドメイン変異体である。別の実施形態において、ニドゲンＧ２ドメイン変異体は、配列番号９２で定義される配列を含むかまたはそれからなる（以下、ＮＩＤＯｍｕｔ４と呼ばれる）。
別の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、上記の実施形態のいずれかで定義されるニドゲンＧ２ドメイン変異体であり、特に、さらに６１９位（配列番号６２の１９０位に対応する）のスレオニンの突然変異を含むＮＩＤＯｍｕｔ４である。好ましくは、６１９位のスレオニンはバリンに突然変異している。別の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、６１９位（配列番号６２の１９０位に対応する）のアミノ酸が、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースのアクセション番号Ｐ１４５３４で定義されるヒトニドゲンＧ２ドメインにおいてみられるのと同じ残基、すなわちバリンである、上記の実施形態のいずれかで定義されるニドゲンＧ２ドメイン変異体である。したがって、一つの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、Ｈ４５９Ａ、Ｒ４６８Ｎ、Ｆ６３９Ｓ、Ｒ６５０Ａ、Ｈ５４３Ｋ、Ｈ５４５Ｎ、Ｖ４４９Ｔ、Ｖ５２５ＱおよびＦ５６１Ｅの突然変異を有するニドゲンＧ２ドメイン変異体である。一つの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、配列番号９３の配列を有するニドゲンＧ２ドメイン変異体である（以下、ＮＩＤＯｍｕｔ４＿Ｔ２１５Ｖと呼ばれる）。
別の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、上記の実施形態のいずれかで定義されるニドゲンＧ２ドメイン変異体であり、特に、さらに６１８位（配列番号６２の１８９位に対応する）のシステインの突然変異を含むＮＩＤＯＭｕｔ４である。好ましくは、６１８位のシステインはセリンに突然変異している。したがって、一つの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、Ｈ４５９Ａ、Ｒ４６８Ｎ、Ｆ６３９Ｓ、Ｒ６５０Ａ、Ｈ５４３Ｋ、Ｈ５４５Ｎ、Ｖ４４９Ｔ、Ｖ５２５Ｑ、Ｖ６１９Ｔ、Ｆ５６１ＥおよびＣ６１８Ｓの突然変異を有するニドゲンＧ２ドメイン変異体である。一つの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、配列番号９４の配列を有するニドゲンＧ２ドメイン変異体である（以下、ＮＩＤＯｍｕｔ５と呼ばれる）。
別の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、上記の実施形態のいずれかで定義されるニドゲンＧ２ドメイン変異体であり、特に、下記からなる群から選択される突然変異をさらに含むＮＩＤＯＭｕｔ３変異体である：
－５８０位（配列番号６２の１５１位に対応する）のバリンの突然変異。好ましくは、５８０位のバリンはＴｈｒに突然変異している。一つの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、配列番号９５の配列を有するニドゲンＧ２ドメイン変異体である（以下、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｖ１７６Ｔと呼ばれる）。
－６０４位（配列番号６２の１７５位に対応する）のイソロイシンの突然変異。好ましくは、６０４位のイソロイシンはＴｈｒに突然変異している。一つの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、配列番号９６の配列を有するニドゲンＧ２ドメイン変異体である（以下、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｉ２００Ｔと呼ばれる）。
－６３８位（配列番号６２の２０９位に対応する）のバリンの突然変異。好ましくは、６３８位のバリンはチロシンに突然変異している。一つの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、配列番号９７の配列を有するニドゲンＧ２ドメイン変異体である（以下、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｖ２３６Ｙと呼ばれる）。
－６４１位（配列番号６２の２１２位に対応する）のロイシンの突然変異。好ましくは、６４１位のロイシンはスレオニンに突然変異している。一つの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、配列番号９８の配列を有するニドゲンＧ２ドメイン変異体である（以下、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｌ２３７Ｔと呼ばれる）。
－４６９位（配列番号６２の４０位に対応する）のセリンの突然変異。好ましくは、４６９位のセリンはＩｌｅに突然変異している。一つの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、配列番号９９の配列を有するニドゲンＧ２ドメイン変異体である（以下、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｓ６５Ｉと呼ばれる）。
－５１８位（配列番号６２の８９位に対応する）のアルギニンの突然変異。好ましくは、５１８位のアルギニンはＩｌｅに突然変異している。一つの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、配列番号１００の配列を有するニドゲンＧ２ドメイン変異体である（以下、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｒ１１４Ｉと呼ばれる）。
－６１８位（配列番号６２の１８９位に対応する）のシステインの突然変異。好ましくは、６１８位のシステインはセリンに突然変異している。したがって、一つの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、配列番号１０１の配列を有するニドゲンＧ２ドメイン変異体である（以下、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｃ２１４Ｓと呼ばれる）。
いくつかの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、上記の実施形態のいずれかで定義されるニドゲンＧ２ドメイン変異体であり、特に、さらに４６９位の突然変異（好ましくはＳ４６９Ｉの突然変異）および５１８位の突然変異（好ましくはＲ５１８Ｉの突然変異）を含むＮＩＤＯｍｕｔ３変異体である。したがって、一つの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、Ｈ４５９Ａ、Ｒ４６８Ｎ、Ｆ６３９Ｓ、Ｒ６５０Ａ、Ｈ５４３Ｋ、Ｈ５４５Ｎ、Ｓ４６９ＩおよびＲ５１８Ｉの突然変異を含むニドゲンＧ２ドメイン変異体であり、配列番号１０２の配列に対応する（以下、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｓ６５Ｉ＿Ｒ１１４Ｉと呼ばれる）。
いくつかの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、上記の実施形態のいずれかで定義されるニドゲンＧ２ドメイン変異体であり、特に、さらに４６９位の突然変異（好ましくはＳ４６９Ｉの突然変異）および５１８位の突然変異（好ましくはＲ５１８Ｉの突然変異）を含むＮＩＤＯｍｕｔ５変異体である。したがって、一つの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、配列番号１０３で定義されるＨ４５９Ａ、Ｒ４６８Ｎ、Ｆ６３９Ｓ、Ｒ６５０Ａ、Ｈ５４３Ｋ、Ｈ５４５Ｎ、Ｖ４４９Ｔ、Ｖ５２５Ｑ、Ｖ６１９Ｔ、Ｆ５６１Ｅ、Ｓ４６９ＩおよびＲ５１８Ｉの突然変異を含むニドゲンＧ２ドメイン変異体である（以下、ＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｓ６５Ｉ＿Ｒ１１４Ｉと呼ばれる）。
いくつかの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、上記の実施形態のいずれかで定義されるニドゲンＧ２ドメイン変異体であり、特に、４６９位（配列番号６２の４０位に対応する）のセリンの突然変異をさらに含むＮＩＤＯｍｕｔ５変異体である。好ましくは、４６９位のセリンはＩｌｅに突然変異している。したがって、一つの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、Ｈ４５９Ａ、Ｒ４６８Ｎ、Ｆ６３９Ｓ、Ｒ６５０Ａ、Ｈ５４３Ｋ、Ｈ５４５Ｎ、Ｖ４４９Ｔ、Ｖ５２５Ｑ、Ｖ６１９Ｔ、Ｆ５６１ＥおよびＳ４６９Ｉの突然変異を有するニドゲンＧ２ドメイン変異体である。一つの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、配列番号１０４の配列を有するニドゲンＧ２ドメイン変異体である（以下、ＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｓ６５Ｉと呼ばれる）。
いくつかの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、上記の実施形態のいずれかで定義されるニドゲンＧ２ドメイン変異体であり、特に、５１８位（配列番号６２の８９位に対応する）のアルギニンの突然変異をさらに含むＮＩＤＯｍｕｔ５変異体である。好ましくは、５１８位のアルギニンはＩｌｅに突然変異している。したがって、一つの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、Ｈ４５９Ａ、Ｒ４６８Ｎ、Ｆ６３９Ｓ、Ｒ６５０Ａ、Ｈ５４３Ｋ、Ｈ５４５Ｎ、Ｖ４４９Ｔ、Ｖ５２５Ｑ、Ｖ６１９Ｔ、Ｆ５６１ＥおよびＲ５１８Ｉの突然変異を有するニドゲンＧ２ドメイン変異体である。一つの実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドは、配列番号１０４の配列を有するニドゲンＧ２ドメイン変異体である（以下、ＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｒ１１４Ｉと呼ばれる）。
本発明における使用に適したニドゲンＧ２ドメイン変異体は、以下の表に要約される。
Figure 2023509004000001
異種ポリペプチドはループ領域内に挿入され得、すなわちループ領域は、配列番号６２または配列番号６３の同族ループドメインに見られるすべてのアミノ酸を保存するが、異種ポリペプチドは、２つの連続するアミノ酸の間に挿入される。異種ポリペプチドの長さは特に限定されるものではない。したがって、異種ポリペプチドは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、少なくとも９５個、少なくとも１００個またはそれ以上のアミノ酸を含み得る。
別の実施形態において、異種ポリペプチドは、ループ領域の一部を置換し得、すなわちループ領域は、配列番号６２または配列番号６３の同族ループドメインの配列に関して欠失を含み、欠失された配列は異種ポリペプチドで置換され、２つの連続するアミノ酸の間に挿入される。欠失の長さは、異種ペプチドの長さと同じである必要はないことが理解されよう。したがって、ループ領域は、その領域の全長の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の欠失を含み得る。異種ポリペプチドの長さは特に限定されるものではない。したがって、異種ポリペプチドは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、少なくとも９５個、少なくとも１００個またはそれ以上のアミノ酸を含み得る。
ニドゲンＧ２ドメイン変異体が複数の異種ポリペプチドを含む場合、異種ポリペプチドは同じループ領域内に見出されてもよく、または好ましくは異なるループ領域に見出されてもよい。さらに、ニドゲンＧ２ドメイン変異体が複数の異種ポリペプチドを含む場合、異種ポリペプチドは同じであってもよく異なっていてもよい。
本発明のニドゲンＧ２ドメイン変異体の一部を形成する異種ポリペプチドは、標的ペプチドに特異的に結合する。より好ましくは、異種ポリペプチドは、本発明のニドゲンＧ２ドメイン変異体の他の領域または本発明の第１のポリペプチドの他の領域との特異的結合を示さない標的ペプチドに特異的に結合する。
本発明において「結合する（binding）」、「結合（bond）」、「結合する（binds）」という用語は、特に限定されないが、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス結合、イオン結合または上記の組み合わせのような非共有結合の結果としての、親和性結合分子または特異的結合対の相互作用を指す。
本発明においてポリペプチドの特定のまたは標的分子への結合を指すのに用いられる場合、「特異的に結合する（specifically binds）」、「特異的に結合する（specifically binding）」、「特異的に認識する（specifically recognizes）」または「特異的に相互作用する（specifically interacts）」という表現は、ポリペプチドおよび標的分子の両方の三次元構造の間の相補性によって、好ましくはポリペプチドと標的分子との間の結合が、反応混合物の場合のようにポリペプチドに近接して存在する他の分子とポリペプチドとが結合する前に起こるように、実質的に高い親和性をもってポリペプチドが標的分子と特異的に結合する能力であると理解される。反応混合物中でポリペプチドが標的分子に特異的に結合する能力は、例えば、従来の条件下でポリペプチドと目的の標的分子および（構造的におよび／または機能的に）より近いまたはより遠いいくつかの関連分子との結合を評価することによって試験され得る。ポリペプチドが標的分子に結合するが、標的分子に近い他の関連分子に結合しないかまたは実質的に結合しない場合にのみ、前記結合は標的分子に特異的であると見なされる。ポリペプチドと標的分子との間の結合は、両者の間の結合親和性が１０－６Ｍ未満、１０－７Ｍ未満、１０－８Ｍ未満、１０－９Ｍ未満、１０－１０Ｍ未満、１０－１１Ｍ未満、１０－１２Ｍ未満、１０－１３Ｍ未満、１０－１４Ｍ未満または１０－１５Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）を有する場合、特異的であると見なすことができる。ポリペプチドと標的分子との間の結合、および前記結合のＫＤを決定する方法としては、当分野の専門家によってよく知られている方法が挙げられる。このような方法の非限定的な例としては、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）等のゲルシフトアッセイ、共免疫沈降アッセイおよびそれに続く質量分析、質量分析に関連するガスクロマトグラフィー、質量分析に関連する液体クロマトグラフィー、またはウエスタンブロット分析が挙げられる。さらなる方法としては、オイルクッション法がある［Hesselgesset et al, 1998, J.Immunol., 160:877-883を参照のこと］。
特定の実施形態において、標的分子へのポリペプチドの結合は、ポリペプチドと標的分子との間の結合が１０－６Ｍ未満、１０－７Ｍ未満、１０－８Ｍ未満、１０－９Ｍ未満、１０－１０Ｍ未満、１０－１１Ｍ未満、１０－１２Ｍ未満、１０－１３Ｍ未満、１０－１４Ｍ未満または１０－１５Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）を有する場合、特異的であると見なされる。同様に、ループ領域と特定の標的分子との間の結合は、ループ領域と特定の標的分子との間の結合が１０－６Ｍ未満、１０－７Ｍ未満、１０－８Ｍ未満、１０－９Ｍ未満、１０－１０Ｍ未満、１０－１１Ｍ未満、１０－１２Ｍ未満、１０－１３Ｍ未満、１０－１４Ｍ未満または１０－１５Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）を有する場合、特異的であると見なされる。
本発明のポリペプチドにおいて、ループ領域ＡＢはβ鎖ＡとＢとを接続し、ループ領域ＢＣはβ鎖ＢとＣとを接続し、ループ領域ＣＤはβ鎖ＣとＤとを接続し、ループ領域ＤＥはβ鎖ＤとＥとを接続し、ループ領域ＥＦはβ鎖ＥとＦとを接続し、ループ領域ＦＧ’はβ鎖ＦとＧとを接続し、ループ領域ＧＨはβ鎖ＧとＨとを接続し、ループ領域ＨＩはβ鎖ＨとＩとを接続し、ループ領域ＩＪはβ鎖ＩとＪとを接続し、ループ領域ＪＫはβ鎖ＪとＫとを接続する。
特定の実施形態において、β鎖Ａは、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域ＡＢによりβ鎖Ｂと接続される。別の特定の実施形態において、β鎖Ｂは、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域ＢＣによりβ鎖Ｃと接続される。別の特定の実施形態において、β鎖Ｃは、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域ＣＤによりβ鎖Ｄと接続される。別の特定の実施形態において、β鎖Ｄは、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域ＤＥによりβ鎖Ｅと接続される。別の特定の実施形態において、β鎖Ｅは、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域ＥＦによりβ鎖Ｆと接続される。別の特定の実施形態において、β鎖Ｆは、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域ＦＧによりβ鎖Ｇと接続される。別の特定の実施形態において、β鎖Ｇは、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域ＧＨによりβ鎖Ｈと接続される。別の特定の実施形態において、β鎖Ｈは、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域ＨＩによりβ鎖Ｉと接続される。別の特定の実施形態において、β鎖Ｉは、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域ＩＪによりβ鎖Ｊと接続される。別の特定の実施形態において、β鎖Ｊは、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域ＪＫによりβ鎖Ｋと接続される。
本明細書で用いられる「配列番号６２における同族ループ領域」という表現は、ヒト起源の野生型ニドゲンＧ２ドメインである配列番号６２に現れるループ領域を指す。当業者によって理解されるように、本発明の第１の態様のポリペプチドの各ループ領域は、配列番号６２におけるその同族ループ領域を有する。
当業者によって理解されるように、２つのアミノ酸配列は、それらがある程度の配列同一性を示し、それらが同じタイプのタンパク質ドメインまたはタンパク質二次構造をコードする場合、すなわちそれらがいずれもβ鎖、ループ領域、αヘリックス、αヘリックス部分、βシートまたはβバレルを形成する場合、同じタンパク質ドメインまたは二次タンパク質構造をコードすると見なされる。特定の実施形態において、同一であると見なされる２つのタンパク質ドメインまたは二次タンパク質構造をコードするアミノ酸配列は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７５％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．９５％、少なくとも９９．９７５％、少なくとも９９．９９％の程度の配列同一性を示す。２つのアミノ酸配列の間の同一性の程度は、従来の方法により、例えばＢＬＡＳＴ［Altschul S.F. et al., J. Mol. Biol.,. 1990 Oct 5; 215(3):403-10］等の本技術分野において公知の標準的な配列アラインメントアルゴリズムにより決定することができる。タンパク質内のアミノ酸配列が特定のドメインまたはタンパク質二次構造を形成または維持するかどうかを決定する方法は、当業者によく知られており、タンパク質の原子座標がＸ線結晶構造解析やタンパク質ＮＭＲ等の当業者によく知られている方法に従って取得された後、バイオインフォマティクスツールであるＤＳＳＰｃｏｎｔ（Carter, Andersen & Rost, 2003）およびＳＴＲＩＤＥ（Heinig & Frishman, 2004）等の方法によりタンパク質の二次構造を決定する方法が挙げられる。
ループ領域ＡＢの配列番号６２における同族ループ領域は、配列番号１を含むか、実質的に含むかまたはそれからなる。別の特定の実施形態において、ループ領域ＢＣの配列番号６２における同族ループ領域は、配列番号２を含むか、実質的に含むかまたはそれからなる。別の特定の実施形態において、ループ領域ＣＤの配列番号６２における同族ループ領域は、配列番号３を含むか、実質的に含むかまたはそれからなる。別の特定の実施形態において、ループ領域ＤＥの配列番号６２における同族ループ領域は、配列番号４を含むか、実質的に含むかまたはそれからなる。別の特定の実施形態において、ループ領域ＥＦの配列番号６２における同族ループ領域は、配列番号５を含むか、実質的に含むかまたはそれからなる。別の特定の実施形態において、ループ領域ＦＧの配列番号６２における同族ループ領域は、配列番号６を含むか、実質的に含むかまたはそれからなる。別の特定の実施形態において、ループ領域ＧＨの配列番号６２における同族ループ領域は、配列番号６２におけるアミノ酸１４９～１５０を含むか、実質的に含むかまたはそれからなる。別の特定の実施形態において、ループ領域ＨＩの配列番号６２における同族ループ領域は、配列番号７を含むか、実質的に含むかまたはそれからなる。別の特定の実施形態において、ループ領域ＩＪの配列番号６２における同族ループ領域は、配列番号８を含むか、実質的に含むかまたはそれからなる。別の特定の実施形態において、ループ領域ＪＫの配列番号６２における同族ループ領域は、配列番号９を含むか、実質的に含むかまたはそれからなる。
特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域は、配列番号６２におけるその同族ループ領域変異体である。
本明細書で用いられる「ループ領域変異体」という表現は、その配列中に配列番号６２におけるその同族ループ領域に対して１つ以上のアミノ酸の改変（modification）、挿入および／または欠失を含む、第１の態様のポリペプチドのループ領域を指す。特定の実施形態において、第１の態様のポリペプチドのループ領域は、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ、ＧＨ、ＨＩ、ＩＪおよびＪＫからなるループ領域の群から選択される。
したがって、特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドの少なくとも１つのループ領域変異体は、配列番号６２におけるその同族ループ領域の配列中の少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換または付加による突然変異により生じる。
特定の実施形態において、第１の態様のポリペプチドのループ領域変異体は、配列番号６２における同族ループ領域の配列に対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の程度の配列同一性を有する。２つの配列の間の配列同一性の程度を決定する方法は、上記した通りである。
特定の実施形態において、ループ領域ＡＢは、配列番号６２における同族ループ領域のループ領域変異体である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＢＣは、配列番号６２における同族ループ領域のループ領域変異体である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＣＤは、配列番号６２における同族ループ領域のループ領域変異体である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＤＥは、配列番号６２における同族ループ領域のループ領域変異体である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＥＦは、配列番号６２における同族ループ領域のループ領域変異体である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＦＧは、配列番号６２における同族ループ領域のループ領域変異体である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＧＨは、配列番号６２における同族ループ領域のループ領域変異体である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＨＩは、配列番号６２における同族ループ領域のループ領域変異体である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＩＪは、配列番号６２における同族ループ領域のループ領域変異体である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＪＫは、配列番号６２における同族ループ領域のループ領域変異体である。
特定の実施形態において、本発明のニドゲンＧ２ドメイン変異体のＡＢループ領域の配列は配列番号１の変異体であるが、本発明の第１の態様のポリペプチドのＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ’、ＧＨ、ＨＩ、ＩＪおよびＪＫのループ領域の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つまたはすべての配列が配列番号６２におけるそれらの同族ループ領域の配列と同一である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＡＢの配列は配列番号１の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべての配列が配列番号６２におけるそれらの同族ループ領域の配列である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＡＢの配列は配列番号１の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドの残りの配列は、配列番号６２の残りの配列と同一である。
特定の実施形態において、配列番号１のループ領域ＡＢ変異体は、配列番号１と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域ＡＢの配列は、配列番号１である。
特定の実施形態において、ループ領域ＢＣの配列は配列番号２の変異体である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＢＣの配列は配列番号２の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのＡＢ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ、ＧＨ、ＨＩ、ＩＪおよびＪＫのループ領域の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つまたはすべての配列が、上記で示した配列番号６２におけるそれらの同族ループ領域の配列である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＢＣの配列は配列番号２の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つまたはすべての配列が配列番号６２におけるそれらの同族ループ領域の配列である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＢＣの配列は配列番号２の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドの残りの配列は、配列番号６２の残りの配列と同一である。
特定の実施形態において、配列番号２のループ領域ＢＣ変異体は、配列番号２と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域ＢＣの配列は、配列番号２である。
特定の実施形態において、ループ領域ＣＤの配列は配列番号３の変異体である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＣＤの配列は配列番号３の変異体であり、本発明の第１の態様のＡＢ、ＢＣ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ、ＧＨ、ＨＩ、ＩＪおよびＪＫのループ領域の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべての配列が、上記で示した配列番号６２におけるそれらの同族ループ領域の配列である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＣＤの配列は配列番号３の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべての配列が、配列番号６２におけるそれらの同族ループ領域の配列を有する。別の特定の実施形態において、ループ領域ＣＤの配列は配列番号３の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドの残りの配列は、配列番号６２の残りの配列と同一である。
特定の実施形態において、配列番号３のループ領域ＣＤ変異体は、配列番号３と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域ＣＤの配列は、配列番号３である。
特定の実施形態において、ループ領域ＣＤの配列は、αヘリックス構造を示さないループ領域において同族領域が改変されている配列の、配列番号６２における同族ドメイン変異体である。Hopf et al.（上記）により示されているように、野生型Ｇ２ドメインのＣＤループ領域は、α１、α２およびα３として知られるαヘリックス構造を有する３つの領域を含む。これらの領域は、それぞれ配列番号２１、２２および２３として定義される。これらの領域は、ＣＤループ領域を、β鎖Ｃの終わりとα１との間の領域（以下、Ｃα領域と呼ばれる）、α１とα２との間の領域、α２とα３との間の領域、およびα３とβ鎖Ｄの始まりとの間の領域（以下、αＤ領域と呼ばれる）にそれぞれ対応する４つのループ領域に分割する。一つの実施形態において、Ｃα領域は配列番号２４を含むか、実質的に含むかまたはそれからなる。一つの実施形態において、αＤ領域はアミノ酸ＧＧを含むか、実質的に含むかまたはそれからなる。一つの実施形態において、ループ領域の配列は、配列番号２１、２２および２３の配列が同族領域に関して保存されている配列番号３の同族領域の変異体である。別の実施形態において、ループ領域の配列は配列番号３の同族領域の変異体であり、Ｃα領域に１つ以上の突然変異を含む。別の実施形態において、ループ領域の配列は配列番号３の同族領域の変異体であり、αＤ領域に１つ以上の突然変異を含む。別の実施形態において、ループ領域の配列は配列番号３の同族領域の変異体であり、Ｃα領域およびαＤ領域に１つ以上の突然変異を含む。
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドにおけるＣα領域は、配列番号２４と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域Ｃαの配列は、配列番号２４である。
特定の実施形態において、ループ領域αＤ変異体は、アミノ酸ＧＧからなる配列と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
特定の実施形態において、ループ領域ＤＥの配列は配列番号４の変異体である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＤＥの配列は配列番号４の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＥＦ、ＦＧ、ＧＨ、ＨＩ、ＩＪおよびＪＫのループ領域の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべての配列が、上記で示した配列番号６２におけるそれらの同族ループ領域の配列を含む。別の特定の実施形態において、ループ領域ＤＥの配列は配列番号４の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべての配列が配列番号６２におけるそれらの同族ループ領域の配列である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＤＥの配列は配列番号４の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドの残りの配列は、配列番号６２の残りの配列と同一である。
特定の実施形態において、配列番号４のループ領域ＤＥ変異体は、配列番号４と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域ＤＥの配列は、配列番号４である。
特定の実施形態において、ループ領域ＥＦの配列は配列番号５の変異体である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＥＦの配列は配列番号５の変異体であり、本発明の第１の態様のＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＦＧ、ＧＨ、ＨＩ、ＩＪおよびＪＫのループ領域の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべての配列が、上記で示した配列番号６２におけるそれらの同族ループ領域の配列である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＥＦの配列は配列番号５の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべての配列が、配列番号６２におけるそれらの同族ループ領域の配列である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＥＦの配列は配列番号５の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドの残りの配列は、配列番号６２の残りの配列と同一である。
特定の実施形態において、配列番号５のループ領域ＥＦ変異体は、配列番号５と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域ＥＦの配列は、配列番号５である。
特定の実施形態において、ループ領域ＦＧの配列は配列番号６の変異体である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＦＧの配列は配列番号６の変異体であり、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＧＨ、ＨＩ、ＩＪおよびＪＫの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべての配列が、上記で示した配列番号６２におけるそれらの同族ループ領域の配列である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＦＧの配列は配列番号６の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべての配列が、配列番号６２におけるそれらの同族ループ領域の配列である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＦＧの配列は配列番号６の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドの残りの配列は、配列番号６２の残りの配列と同一である。
特定の実施形態において、配列番号６のループ領域ＦＧ変異体は、配列番号６と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域ＦＧの配列は、配列番号６である。
特定の実施形態において、ループ領域ＧＨの配列は、配列番号６２のアミノ酸１４９～１５０（または配列番号６３のアミノ酸１４７～１４８）に対応する配列ＴＳの変異体である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＧＨの配列は配列番号６２のアミノ酸１４９～１５０に対応する配列の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ、ＨＩ、ＩＪおよびＪＫの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべての配列が、上記で示した配列番号６２におけるそれらの同族ループ領域の配列である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＧＨの配列は配列番号６２のアミノ酸１４９～１５０に対応する配列の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべての配列が、配列番号６２におけるそれらの同族ループ領域の配列である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＧＨの配列は配列番号６２のアミノ酸１４９～１５０に対応する配列の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドの残りの配列は、配列番号６２の残りの配列である。
特定の実施形態において、配列番号６２のアミノ酸１４９～１５０に対応する配列のループ領域ＧＨ変異体は、配列番号６２のアミノ酸１４９～１５０に対応する配列と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域ＧＨの配列は、配列番号６２のアミノ酸１４９～１５０に対応する配列である。
特定の実施形態において、ループ領域ＨＩの配列は配列番号７の変異体である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＨＩの配列は配列番号７の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ、ＧＨ、ＩＪおよびＪＫの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９またはすべての配列が、上記で示した配列番号６２におけるそれらの同族ループ領域の配列である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＨＩの配列は配列番号７の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９またはすべての配列は、配列番号６２におけるそれらの同族ループ領域の配列である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＨＩの配列は配列番号７の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドの残りの配列は、配列番号６２の残りの配列と同一である。
特定の実施形態において、配列番号７のループ領域ＨＩ変異体は、配列番号７と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域ＨＩの配列は、配列番号７である。
特定の実施形態において、ループ領域ＩＪの配列は配列番号８の変異体である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＩＪの配列は配列番号８の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ、ＧＨ、ＨＩおよびＪＫのループ領域の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９またはすべての配列が、上記で示した配列番号６２におけるそれらの同族ループ領域の配列である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＩＪの配列は配列番号８の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべての配列でが、配列番号６２におけるそれらの同族ループ領域の配列である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＩＪの配列は配列番号８の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドの残りの配列は、配列番号６２の残りの配列と同一である。
特定の実施形態において、配列番号８のループ領域ＩＪ変異体は、配列番号８と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域ＩＪの配列は、配列番号８である。
特定の実施形態において、ループ領域ＪＫの配列は配列番号９の変異体である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＪＫの配列は配列番号９の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ、ＧＨ、ＨＩおよびＩＪの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべての配列が、上記で示した配列番号６２におけるそれらの同族ループ領域の配列である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＪＫの配列は配列番号９の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべての配列が、配列番号６２におけるそれらの同族ループ領域の配列である。別の特定の実施形態において、ループ領域ＪＫの配列は配列番号９の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドの残りの配列は、配列番号６２の残りの配列と同一である。
特定の実施形態において、配列番号９のループ領域ＪＫ変異体は、配列番号１０と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域ＪＫの配列は、配列番号９である。
特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域変異体の上流、上流近傍、下流または下流近傍に位置する配列の少なくとも１つは、ループ領域変異体の同族ループ領域に関して同じ位置に配置されている、配列番号６２における配列（その参照配列と呼ばれる）に関して１つ以上のアミノ酸の改変、挿入および／または欠失を含む。しかしながら、少なくとも１つの配列は、配列番号６２を有するポリペプチドにおけるその参照配列としての本発明の第１の態様のポリペプチドにおいて、上記で定義されたのと同一のタンパク質ドメインまたは二次構造をコードする。２つのアミノ酸配列がループ領域、αヘリックス部分またはαヘリックス等の同一のタンパク質ドメインまたは二次構造を形成するかどうかを決定する方法は、上記した２つのアミノ酸配列が同じタンパク質構造を形成するかどうかを決定するための方法である。
特定の実施形態において、参照配列に関して１つ以上のアミノ酸の改変、挿入および／または欠失を含む少なくとも１つの配列は、配列番号６２におけるその参照配列と少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。２つのアミノ酸配列の間の配列同一性の程度を決定する方法は、上記した通りである。
本明細書で用いられる「配列番号６２における同族β鎖ドメイン」という表現は、その間にβ鎖ドメイン変異体が本発明の第１の態様のポリペプチドが位置する配列としての同一のループ領域またはタンパク質二次構造をコードする配列番号６２を有するタンパク質のアミノ酸配列の間に位置する配列番号６２のβ鎖ドメインを指す。当業者によって理解されるように、本発明の第１のポリペプチドの各β鎖ドメインは、配列番号６２にその同族β鎖ドメインを有する。
ニドゲンＧ２ドメイン変異体の各β鎖ドメインは、配列番号６２における同族β鎖と同一であってもよく、またはニドゲンＧ２ドメイン変異体のβ鎖と配列番号６２における同族β鎖ドメインとの間の全体的な配列同一性が少なくとも５０％であり得るように１つ以上のアミノ酸が異なっていてもよい。好ましい実施形態において、ニドゲンＧ２ドメイン変異体のβ鎖と配列番号６２における同族β鎖ドメインとの間の配列同一性は、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。
特定の実施形態において、β鎖ドメインＡは、配列番号６２におけるその同族β鎖ドメインのβ鎖ドメイン変異体である。特定の実施形態において、β鎖ドメインＢは、配列番号６２におけるその同族β鎖ドメインのβ鎖ドメイン変異体である。特定の実施形態において、β鎖ドメインＣは、配列番号６２におけるその同族β鎖ドメインのβ鎖ドメイン変異体である。特定の実施形態において、β鎖ドメインＤは、配列番号６２におけるその同族β鎖ドメインのβ鎖ドメイン変異体である。特定の実施形態において、β鎖ドメインＥは、配列番号６２におけるその同族β鎖ドメインのβ鎖ドメイン変異体である。特定の実施形態において、β鎖ドメインＦは、配列番号６２におけるその同族β鎖ドメインのβ鎖ドメイン変異体である。特定の実施形態において、β鎖ドメインＧは、配列番号６２におけるその同族β鎖ドメインのβ鎖ドメイン変異体である。特定の実施形態において、β鎖ドメインＨは、配列番号６２におけるその同族β鎖ドメインのβ鎖ドメイン変異体である。特定の実施形態において、β鎖ドメインＩは、配列番号６２におけるその同族β鎖ドメインのβ鎖ドメイン変異体である。特定の実施形態において、β鎖ドメインＪは、配列番号６２におけるその同族β鎖ドメインのβ鎖ドメイン変異体である。特定の実施形態において、β鎖ドメインＫは、配列番号６２におけるその同族β鎖ドメインのβ鎖ドメイン変異体である。
特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインは、配列番号６２におけるその同族β鎖の変異体である。
本明細書で用いられる「β鎖ドメイン変異体」という表現は、その配列中に、配列番号６２におけるその同族β鎖ドメインの配列に対して１つ以上のアミノ酸の改変、挿入および／または欠失を含む本発明の第１の態様のポリペプチドからのβ鎖ドメインを指す。特定の実施形態において、第１の態様のポリペプチドからのβ鎖ドメインは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、ＪまたはＫからなる群から選択される。
特定の実施形態において、第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメイン変異体は、配列番号６２におけるその同族β鎖ドメインの配列と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の程度の配列同一性を有する。配列同一性の程度を決定する方法は、上記した通りである。
特定の実施形態において、β鎖ドメインＡについての配列番号６２における同族β鎖ドメインは、配列番号１０を有する。別の特定の実施形態において、β鎖ドメインＢについての配列番号６２における同族β鎖ドメインは、配列番号１１を有する。別の特定の実施形態において、β鎖ドメインＣについての配列番号６２における同族β鎖ドメインは、配列番号１２を有する。別の特定の実施形態において、β鎖ドメインＤについての配列番号６２における同族β鎖ドメインは、配列番号１３を有する。別の特定の実施形態において、β鎖ドメインＥについての配列番号６２における同族β鎖ドメインは、配列番号１４を有する。別の特定の実施形態において、β鎖ドメインＦについての配列番号６２における同族β鎖ドメインは、配列番号１５を有する。別の特定の実施形態において、β鎖ドメインＧについての配列番号６２における同族β鎖ドメインは、配列番号１６を有する。別の特定の実施形態において、β鎖ドメインＨについての配列番号６２における同族β鎖ドメインは、配列番号１７を有する。別の特定の実施形態において、β鎖ドメインＩについての配列番号６２における同族β鎖ドメインは、配列番号１８を有する。別の特定の実施形態において、β鎖ドメインＪについての配列番号６２における同族β鎖ドメインは、配列番号１９を有する。別の特定の実施形態において、β鎖ドメインＫについての配列番号６２における同族β鎖ドメインは、配列番号２０を有する。
したがって、特定の実施形態において、β鎖Ａの配列は配列番号１０の変異体である。別の特定の実施形態において、β鎖ドメインＡの配列は配列番号１０の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのＢ～Ｋのβ鎖ドメインの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべてが、上記で示された配列番号６２におけるそれらの同族β鎖ドメインの配列を有する。別の特定の実施形態において、β鎖Ａの配列は配列番号１０の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべてが、配列番号６２におけるそれらの同族β鎖ドメインの配列を有する。別の特定の実施形態において、β鎖Ａの配列は配列番号１０の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドの残りの配列は、配列番号６２の残りの配列と同一である。
特定の実施形態において、配列番号１０のβ鎖ドメインＡ変異体は、配列番号１１と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインＡの配列は、配列番号１０である。
特定の実施形態において、β鎖Ｂの配列は配列番号１１の変異体である。別の特定の実施形態において、β鎖ドメインＢの配列は配列番号１１の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのＡ、Ｃ～Ｋのβ鎖ドメインの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべてが、上記で示された配列番号６２におけるそれらの同族β鎖ドメインの配列を有する。別の特定の実施形態において、β鎖Ｂの配列は配列番号１１の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべてが、配列番号６２におけるそれらの同族β鎖ドメインの配列を有する。別の特定の実施形態において、β鎖Ｂの配列は配列番号１１の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドの残りの配列は、配列番号６２の残りの配列と同一である。
特定の実施形態において、配列番号１１のβ鎖ドメインＢ変異体は、配列番号１２と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインＢの配列は、配列番号１１である。
特定の実施形態において、β鎖Ｃの配列は配列番号１２の変異体である。別の特定の実施形態において、β鎖ドメインＣの配列は配列番号１２の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのＡ、Ｂ、Ｄ～Ｋのβ鎖ドメインの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべてが、上記で示された配列番号６２におけるそれらの同族β鎖ドメインの配列を有する。別の特定の実施形態において、β鎖Ｃの配列は配列番号１２の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべてが、配列番号６２におけるそれらの同族β鎖ドメインの配列を有する。別の特定の実施形態において、β鎖Ｃの配列は配列番号１２の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドの残りの配列は、配列番号６２の残りの配列と同一である。
特定の実施形態において、配列番号１２のβ鎖ドメインＣ変異体は、配列番号１２と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインＣの配列は、配列番号１２である。
特定の実施形態において、β鎖Ｄの配列は配列番号１３の変異体である。別の特定の実施形態において、β鎖ドメインＤの配列は配列番号１３の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのＡ～Ｃ、Ｅ～Ｋのβ鎖ドメインの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべてが、上記で示された配列番号６２におけるそれらの同族β鎖ドメインの配列を有する。別の特定の実施形態において、β鎖Ｄの配列は配列番号１３の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべてが、配列番号６２におけるそれらの同族β鎖ドメインの配列を有する。別の特定の実施形態において、β鎖Ｄの配列は配列番号１３の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドの残りの配列は、配列番号６２の残りの配列と同一である。
特定の実施形態において、配列番号１３のβ鎖ドメインＤ変異体は、配列番号１３と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインＤの配列は、配列番号１３である。
特定の実施形態において、β鎖Ｅの配列は配列番号１４の変異体である。別の特定の実施形態において、β鎖ドメインＥの配列は配列番号１４の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのＡ～Ｄ、Ｆ～Ｋのβ鎖ドメインの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべてが、上記で示された配列番号６２におけるそれらの同族β鎖ドメインの配列を有する。別の特定の実施形態において、β鎖Ｅの配列は配列番号１４の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべてが、配列番号６２におけるそれらの同族β鎖ドメインの配列を有する。別の特定の実施形態において、β鎖Ｅの配列は配列番号１４の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドの残りの配列は、配列番号６２の残りの配列と同一である。
特定の実施形態において、配列番号１４のβ鎖ドメインＥ変異体は、配列番号１４と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインＥの配列は、配列番号１４である。
特定の実施形態において、β鎖Ｆの配列は配列番号１５の変異体である。別の特定の実施形態において、β鎖ドメインＦの配列は配列番号１５の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのＡ～Ｅ、Ｇ～Ｋのβ鎖ドメインの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべてが、上記で示された配列番号６２におけるそれらの同族β鎖ドメインの配列を有する。別の特定の実施形態において、β鎖Ｆの配列は配列番号１５の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべてが、配列番号６２におけるそれらの同族β鎖ドメインの配列を有する。別の特定の実施形態において、β鎖Ｆの配列は配列番号１５の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドの残りの配列は、配列番号６２の残りの配列と同一である。
特定の実施形態において、配列番号１５のβ鎖ドメインＦ変異体は、配列番号１５と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインＦの配列は、配列番号１５である。
特定の実施形態において、β鎖Ｇの配列は配列番号１６の変異体である。別の特定の実施形態において、β鎖ドメインＧの配列は配列番号１６の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのＡ～ＦおよびＨ～Ｋのβ鎖ドメインの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべてが、上記で示された配列番号６２におけるそれらの同族β鎖ドメインの配列を有する。別の特定の実施形態において、β鎖Ｇの配列は配列番号１６の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべてが、配列番号６２におけるそれらの同族β鎖ドメインの配列を有する。別の特定の実施形態において、β鎖Ｇの配列は配列番号１６の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドの残りの配列は、配列番号６２の残りの配列と同一である。
特定の実施形態において、配列番号１６のβ鎖ドメインＧ変異体は、配列番号１６と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインＧの配列は、配列番号１６である。
特定の実施形態において、β鎖Ｈの配列は配列番号１７の変異体である。別の特定の実施形態において、β鎖ドメインＨの配列は配列番号１８の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのＡ～Ｇ、Ｉ～Ｋのβ鎖ドメインの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべてが、上記で示された配列番号６２におけるそれらの同族β鎖ドメインの配列を有する。別の特定の実施形態において、β鎖Ｈの配列は配列番号１７の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべてが、配列番号６２におけるそれらの同族β鎖ドメインの配列を有する。別の特定の実施形態において、β鎖Ｈの配列は配列番号１７の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドの残りの配列は、配列番号６２の残りの配列と同一である。
特定の実施形態において、配列番号１７のβ鎖ドメインＨ変異体は、配列番号１７と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインＨの配列は、配列番号１７である。
特定の実施形態において、β鎖Ｉの配列は配列番号１８の変異体である。別の特定の実施形態において、β鎖ドメインＩの配列は配列番号１８の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのＡ～Ｈ、Ｊ、Ｋのβ鎖ドメインの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべてが、上記で示された配列番号６２におけるそれらの同族β鎖ドメインの配列を有する。別の特定の実施形態において、β鎖Ｉの配列は配列番号１８の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべてが、配列番号６２におけるそれらの同族β鎖ドメインの配列を有する。別の特定の実施形態において、β鎖Ｉの配列は配列番号１８の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドの残りの配列は、配列番号６２の残りの配列と同一である。
特定の実施形態において、配列番号１８のβ鎖ドメインＩ変異体は、配列番号１９と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインＩの配列は、配列番号１８である。
特定の実施形態において、β鎖Ｊの配列は配列番号１９の変異体である。別の特定の実施形態において、β鎖ドメインＪの配列は配列番号１９の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのＡ～Ｉ、Ｋのβ鎖ドメインの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべてが、上記で示された配列番号６２におけるそれらの同族β鎖ドメインの配列を有する。別の特定の実施形態において、β鎖Ｊの配列は配列番号１９の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべてが、配列番号６２におけるそれらの同族β鎖ドメインの配列を有する。別の特定の実施形態において、β鎖Ｊの配列は配列番号１９の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドの残りの配列は、配列番号６２の残りの配列と同一である。
特定の実施形態において、配列番号１９のβ鎖ドメインＪ変異体は、配列番号１９と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインＪの配列は、配列番号１９である。
特定の実施形態において、β鎖Ｋの配列は配列番号２０の変異体である。別の特定の実施形態において、β鎖ドメインＫの配列は配列番号２０の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのＡ～Ｊのβ鎖ドメインの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべてが、上記で示された配列番号６２におけるそれらの同族β鎖ドメインの配列を有する。別の特定の実施形態において、β鎖Ｋの配列は配列番号２０の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたはすべてが、配列番号６２におけるそれらの同族β鎖ドメインの配列を有する。別の特定の実施形態において、β鎖Ｋの配列は配列番号２０の変異体であり、本発明の第１の態様のポリペプチドの残りの配列は、配列番号６２の残りの配列と同一である。
特定の実施形態において、配列番号２０のβ鎖ドメインＫ変異体は、配列番号２０と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチドのβ鎖ドメインＫの配列は、配列番号２０である。
一つの実施形態において、本発明の第１の態様によるポリペプチドは、同族ループ領域の配列に関して少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換または付加による突然変異により生じる、配列番号６２における同族ループ領域に関して少なくとも１つのループ領域変異体を含む。一つの実施形態において、ニドゲンＧ２ドメイン変異体は、同族ループ領域ＡＢである配列番号１に関してループ領域ＡＢに突然変異を含む。一つの実施形態において、ニドゲンＧ２ドメイン変異体は、同族ループ領域ＢＣである配列番号２に関してループ領域ＢＣに突然変異を含む。一つの実施形態において、ニドゲンＧ２ドメイン変異体は、同族ループ領域ＣＤである配列番号３に関してループ領域ＣＤに突然変異を含む。一つの実施形態において、ニドゲンＧ２ドメイン変異体は、同族ループ領域ＤＥである配列番号４に関してループ領域ＤＥに突然変異を含む。一つの実施形態において、ニドゲンＧ２ドメイン変異体は、同族ループ領域ＥＦである配列番号５に関してループ領域ＥＦに突然変異を含む。一つの実施形態において、ニドゲンＧ２ドメイン変異体は、同族ループ領域ＦＧである配列番号６に関してループ領域ＦＧに突然変異を含む。一つの実施形態において、ニドゲンＧ２ドメイン変異体は、配列番号６２のアミノ酸１４９～１５０に対応する同族ループ領域ＧＨに関してループ領域ＧＨに突然変異を含む。一つの実施形態において、ニドゲンＧ２ドメイン変異体は、同族ループ領域ＨＩである配列番号７に関してループ領域ＨＩに突然変異を含む。一つの実施形態において、ニドゲンＧ２ドメイン変異体は、同族ループ領域ＩＪである配列番号８に関してループ領域ＩＪに突然変異を含む。一つの実施形態において、ニドゲンＧ２ドメイン変異体は、同族ループ領域ＪＫである配列番号９に関してループ領域ＪＫに突然変異を含む。
ニドゲンＧ２ドメイン変異体のαヘリックス部分ＣαＤは、配列番号６２における同族αヘリックス部分と同一であってもよく、またはニドゲンＧ２ドメイン変異体のαヘリックス部分ＣαＤと配列番号６２における配列番号２６の同族αヘリックス部分との間の全体的な配列同一性が少なくとも５０％であり得るように１つ以上のアミノ酸が異なっていてもよい。
好ましい実施形態において、ニドゲンＧ２ドメイン変異体のαヘリックス部分ＣαＤと配列番号６２における配列番号２４の同族αヘリックス部分との間の配列同一性は、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。
配列同一性の程度を決定する方法は、上記した通りである。特定の実施形態において、上記で示したように１つ以上のアミノ酸が異なるαヘリックス部分ＣαＤは、配列番号６２における同族αヘリックス部分のαヘリックス部分変異体と呼ばれる。
特定の実施形態において、第１の態様のポリペプチドはβバレル構造を有する。好ましい実施形態において、第１の態様のポリペプチドは、ニドゲン－１のＧ２ドメインのβバレルドメインのβバレル構造を有する。特定の実施形態において、第１の態様のポリペプチドは、配列番号６２を有する配列のβバレル構造を有する。
ニドゲン－１のＧ２ドメインのβバレルドメインおよび配列番号６２の配列のβバレル構造は、１１本鎖のβバレルからなる。本明細書において、βバレルのβ鎖はＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩと呼ばれる。それらは、第１の態様のポリペプチドのβ鎖Ａ～Ｋの配列番号６２の同族β鎖に対応する。βバレルの内部は、鎖ＩＩＩとＩＶとを接続する疎水性の主にαヘリックス部分によって横断される。バレルのＮ末端側の半分は、埋め込まれたαヘリックス部分によって連結された２つのβメアンダー（beta-meander）（鎖Ｉ～ＩＩＩおよびＩＶ～ＶＩ）で構成される。そして、ポリペプチド鎖はバレルの底を横断し、ドメインのＣ末端の半分に５本鎖のグリークキー（Greek key）モチーフを形成する。
本明細書で用いられる「βメアンダー」という表現は、ヘアピンループによって連結された２つ以上の連続する逆平行β鎖を指す。本明細書で用いられる「ヘアピンループ」という用語は、２～５残基の短いループによって連結された２つの逆平行鎖を指し、前記残基の１つは多くの場合グリシンまたはプロリンであり、これらはいずれも急な屈曲（tight turn）またはβバルジループ（bulge loop）に必要な二面角コンフォメーション（dihedral-angle conformation）を担うことができる。
本明細書で用いられる「グリークキー（Greek key）」という表現は、４つの隣接する逆平行鎖およびそれらの連結ループからなる二次タンパク質構造を指す。この構造では、３つの逆平行鎖がヘアピンで接続され、第４の鎖は第１の鎖に隣接し、より長いループにより第３の差に連結される。
したがって、特定の実施形態において、Ｇ２ドメインの変異体のＡ～Ｃのβ鎖およびＤ～Ｆのβ鎖は、βメアンダーを形成する。別の特定の実施形態において、βメアンダーはＧ２ドメインの変異体のαヘリックス部分ＣαＤによって接続される。別の特定の実施形態において、Ｇ２ドメインの変異体のＧ～Ｋのβ鎖は、５本鎖グリークキーモチーフを形成する。別の特定の実施形態において、Ｇ２ドメインの変異体のβ鎖は、ＡおよびＦのβ鎖を除いて、逆平行に配置されている。
ポリペプチドの二次構造を決定する方法、または２つのアミノ酸配列が同じドメインまたは二次タンパク質構造をコードするかどうかを決定する方法は、上記した通りである。
ＩＩ－ポリペプチドディスプレイライブラリー
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるポリペプチドを複数含むポリペプチドディスプレイライブラリーであって、複数のポリペプチドが、１つ以上のループ領域の配列が異なるポリペプチドによって形成されるポリペプチドディスプレイライブラリーに関する。
本明細書で用いられる「ポリペプチドディスプレイライブラリー」という表現は、異なるアミノ酸配列を有する複数のポリペプチドを含む、ポリペプチドのライブラリーまたはプールを指す。ライブラリーの各ポリペプチドは、本発明の第１の態様において定義された通りであり、１つ以上のループ領域の配列においてライブラリーの少なくとも別のポリペプチドとは異なる。
本明細書で用いられる「１つ以上のループ領域の配列が異なるポリペプチド」という表現は、ライブラリーの各ポリペプチドが、ライブラリーの少なくとも１つの別のポリペプチドのアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列において少なくとも１つの差異を示し、該少なくとも１つの差異がポリペプチドのループ領域のアミノ酸配列に含まれるものであるという事実を指す。したがって、特定の実施形態において、ライブラリーのポリペプチドは、ライブラリーの別のポリペプチドの対応するループ領域とは異なる、第１の態様で定義されるループ領域変異体の少なくとも１つを含む第１の態様のポリペプチドである。特定の実施形態において、ループ領域変異体は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、ＪまたはＫからなる群から選択され、本発明の第１の態様の「ループ領域変異体」の定義および実施形態に記載されている通りのものである。
本明細書で用いられる「ライブラリーの少なくとも１つの別のポリペプチドのアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列において少なくとも１つの差異を示し、該配列がポリペプチドのループ領域のアミノ酸配列に含まれる」という表現は、ライブラリーの第１のポリペプチドの上記で定義されるループ領域変異体が、その配列中に、ライブラリーの第２のポリペプチドにおける対応するループ領域のアミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸の少なくとも１つの挿入、欠失または改変を含むという事実を指す。当業者に理解されるように、第１のポリペプチドにおけるループ領域変異体がループ領域ＡＢである場合、第２のポリペプチドにおける対応するループ領域も第２のポリペプチドにおけるループ領域ＡＢである。第１のポリペプチドにおけるループ領域変異体がループ領域ＢＣである場合、第２のポリペプチドにおける対応するループ領域も第２のポリペプチドにおけるループ領域ＢＣである。第１のポリペプチドにおけるループ領域変異体がループ領域ＣＤである場合、第２のポリペプチドにおける対応するループ領域も第２のポリペプチドにおけるループ領域ＣＤである。第１のポリペプチドにおけるループ領域変異体がループ領域ＤＥである場合、第２のポリペプチドにおける対応するループ領域も第２のポリペプチドにおけるループ領域ＤＥである。第１のポリペプチドにおけるループ領域変異体がループ領域ＥＦである場合、第２のポリペプチドにおける対応するループ領域も第２のポリペプチドにおけるループ領域ＥＦである。第１のポリペプチドにおけるループ領域変異体がループ領域ＦＧである場合、第２のポリペプチドにおける対応するループ領域も第２のポリペプチドにおけるループ領域ＦＧである。第１のポリペプチドにおけるループ領域変異体がループ領域ＧＨである場合、第２のポリペプチドにおける対応するループ領域も第２のポリペプチドにおけるループ領域ＧＨである。第１のポリペプチドにおけるループ領域変異体がループ領域ＨＩである場合、第２のポリペプチドにおける対応するループ領域も第２のポリペプチドにおけるループ領域ＨＩである。第１のポリペプチドにおけるループ領域変異体がループ領域ＩＪである場合、第２のポリペプチドにおける対応するループ領域も第２のポリペプチドにおけるループ領域ＩＪである。第１のポリペプチドにおけるループ領域変異体がループ領域ＪＫである場合、第２のポリペプチドにおける対応するループ領域も第２のポリペプチドにおけるループ領域ＪＫである。
特定の実施形態において、ライブラリーの第１のポリペプチドのループ領域変異体は、ライブラリーの第２のポリペプチドの対応するループ領域と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の程度の配列同一性を示す。別の特定の実施形態において、第１のポリペプチドの全配列は、第２のポリペプチドの全配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７５％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．９５％、少なくとも９９．９７５％、少なくとも９９．９８％、少なくとも９９．９９％、少なくとも９９．９９９％の程度の配列同一性を示す。配列同一性のパーセンテージを決定する方法は、本発明の第１の態様で記載した通りである。
特定の実施形態において、ライブラリーの第１のポリペプチドは、ライブラリーの第２のポリペプチドと呼ばれる、ライブラリーの少なくとも１つの別のポリペプチドにおける対応するループ領域に対して少なくとも２個のループ領域、少なくとも３個ループ領域、少なくとも４個のループ領域、少なくとも５個のループ領域、少なくとも６個のループ領域、少なくとも７個のループ領域、少なくとも８個のループ領域、少なくとも９個のループ領域、少なくとも１０個のループ領域、少なくとも１１個のループ領域のアミノ酸配列における差異を示す。第２のポリペプチドにおける対応するループ領域という用語は、第１のポリペプチドの各ループ領域について上記で示した通りである。アミノ酸配列における差異も上記で定義した通りである。さらに、各アミノ酸配列は、同様に上記で示した第２のポリペプチドにおける対応するループ領域の配列と配列同一性の程度を示す。
特定の実施形態において、ライブラリーのポリペプチドは、それらのループ領域の少なくとも１つによって、例えばサンプル内のそれらに近接して存在する他の分子、好ましくはペプチドまたはタンパク質に特異的に結合することができる。好ましい実施形態において、それらの対応するループ領域の１つ以上におけるアミノ酸配列における差異を示すライブラリーのポリペプチドは、例えばサンプル内でそれらに近接して存在する異なる分子、好ましくはペプチドまたはタンパク質に特異的に結合する。当業者に理解されるように、それらの結合能における差異は、１つのポリペプチドが１つの分子、好ましくはサンプルのペプチドまたはタンパク質と特異的に結合することができ、１つ以上のループ領域における差異を有するライブラリーの別のポリペプチドが１つの分子、好ましくはサンプルのペプチドまたはタンパク質と特異的に結合することができないという点にあり得る。あるいは、１つのポリペプチドが１つ以上の分子、好ましくはペプチドまたはタンパク質に特異的に結合することができるのに対し、１つ以上のループ領域における差異を有するライブラリーの別のポリペプチドが前記１つ以上の分子に特異的に結合することができないが、他の１つ以上の分子、好ましくはサンプル中に存在するペプチドに結合することができるという点にあり得る。特定の実施形態において、ライブラリーの第１のポリペプチドは、ライブラリーの第２のポリペプチドにおける対応するループ領域に対してその配列の差異を示す少なくとも１つのループ領域変異体によって、目的の標的分子、好ましくは目的のペプチドまたはタンパク質に特異的に結合することができるのに対し、ライブラリーの第２のポリペプチドは、前記標的分子に特異的に結合することができない。
別の特定の実施形態において、ライブラリーの第１のポリペプチドのループ領域変異体は標的ペプチドに特異的に結合するのに対し、配列番号６２におけるその同族ループ領域は前記標的ペプチドに特異的に結合することができない。
別の特定の実施形態において、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ、ＧＨ、ＨＩ、ＩＪ、ＪＫから選択される１つのループ領域において同一のループ領域変異体を有するポリペプチドライブラリーのポリペプチドは、該ループ領域変異体を介して特定の標的ペプチドと特異的に結合するのに対し、前記特定のループ領域変異体を有さないライブラリーのポリペプチドは該ループ領域変異体を介して特定の標的ペプチドと特異的に結合しない。
「結合する（bind）」、「結合している（binding）」、「特異的に結合する（specifically bind）」、「特異的に結合する（specifically binding）」、「特異的に相互作用する（specifically interact）」という用語は、本発明の第１の態様において定義されている。ポリペプチドと標的分子との間の結合、およびそのような結合のＫを決定する方法も、上記定義において記載されている。
特定の実施形態において、標的分子へのライブラリーのポリペプチドの結合は、ポリペプチドと標的分子との間の結合が１０－６Ｍ未満、１０－７Ｍ未満、１０－８Ｍ未満、１０-９Ｍ未満、１０－１０Ｍ未満、１０－１１Ｍ未満、１０－１２Ｍ未満、１０－１３Ｍ未満、１０－１４Ｍ未満または１０－１５Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）を有する場合、特異的であると見なされる。同様に、ループ領域、好ましくはループ領域変異体と特定の標的分子との間の結合は、ループ領域と標的分子との間の結合が１０－６Ｍ未満、１０－７Ｍ未満、１０－８Ｍ未満、１０－９Ｍ未満、１０－１０Ｍ未満、１０－１１Ｍ未満、１０－１２Ｍ未満、１０－１３Ｍ未満、１０－１４Ｍ未満または１０－１５Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）を有する場合、特異的であると見なされる。
特定の実施形態において、表現型としての本発明の第２の態様のライブラリーの各ポリペプチドと前記表現型に対応する遺伝子型としての核酸とが直接的または間接的に連結している。
「遺伝子型」という用語は、本発明で用いられる場合、１つまたはいくつかのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸分子、またはコードする配列を含む核酸分子を指す。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の群は、遺伝子型に対応する表現型と一致する。当業者に理解されるように、遺伝子型は、単一のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする単一の核酸分子によって形成され得る。この場合、表現型は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と一致する。核酸は、以下の核酸の定義で特定される核酸のいずれかであり得る。
特定の実施形態において、遺伝子型は、ポリペプチドディスプレイライブラリーの単一のポリペプチドをコードする単一の核酸分子によって形成される。別の特定の実施形態において、遺伝子型は、ポリペプチドディスプレイライブラリーの同じポリペプチドをコードするいくつかの核酸分子によって形成される。別の特定の実施形態において、核酸分子は同じ核酸配列を有する。
ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質という用語の定義は、本発明の第１の態様において記載されている。
「核酸」、「ヌクレオチド配列」または「ポリヌクレオチド」という用語は、本発明において交換可能に用いられ、リボヌクレオシドリン酸エステル（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）またはホスホロチオエートおよびチオエステル等のそれらの任意のホスホエステル類似体の一本鎖または二本鎖の形態のポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ分子が含まれる。また、ＤＮＡ－ＤＮＡ鎖、ＤＮＡ－ＲＮＡ鎖およびＲＮＡ－ＲＮＡ鎖によって形成される二本鎖分子も含まれる。「核酸配列」という用語、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、分子の一次または二次構造のみを指し、特定のタイプの三次構造を限定するものではない。したがって、この用語には、直鎖状または環状のＤＮＡ分子、スーパーコイル状のＤＮＡプラスミドおよび染色体に含まれる二本鎖ＤＮＡが包含される。特定の実施形態において、核酸はＤＮＡ分子である。別の特定の実施形態において、核酸はＲＮＡ分子である。
「表現型」という用語は、本発明で用いられる場合、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、またはペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質の群を指す。核酸をコードする、またはそれをコードする配列を含む核酸は、表現型に対応する遺伝子型である。当業者に理解されるように、本発明の文脈において、表現型は、単一のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質からなってもよい。表現型に関連する遺伝子型は、それをコードする核酸分子または核酸分子の群である。
特定の実施形態において、表現型は、本発明の第１の態様において、および本発明の本態様において上記で定義されるようなポリペプチドライブラリーのポリペプチドである。特定の実施形態において、表現型は、上記で定義されたライブラリーの第１のポリペプチドである。
「表現型に対応する遺伝子型としての核酸と直接的または間接的に連結している表現型」という表現は、本発明で用いられる場合、それをコードする核酸（すなわち、上記で定義された遺伝子型）と連結しているポリペプチドディスプレイライブラリーのポリペプチド（すなわち、上記で定義された表現型）として理解される。連結により、ライブラリーのポリペプチドとそれをコードする核酸とによって形成される複合体がもたらされる。特定の実施形態において、ポリペプチドは複合体の外表面に露出している。したがって、特定の実施形態において、ポリペプチドディスプレイライブラリーは、それをコードする核酸に直接的または間接的に連結している本発明の第１の態様のポリペプチドを含む複合体によって形成される。ポリペプチドは表現型と見なされ、核酸は表現型に対応する遺伝子型と見なされる。
特定の実施形態において、ライブラリーのポリペプチドは、それらをコードするいかなる核酸とも連結されていない。
ライブラリーの各ポリペプチドは、上記のように複合体の一部であるかどうかにかかわらず、「ライブラリーのメンバー」と呼ばれる。したがって、本明細書で用いられるこの用語は、ポリペプチドと核酸とが直接的または間接的に連結され得、核酸がポリペプチドをコードする配列をコードするかまたは含むか、または単にそれをコードする配列を含む核酸にいかなる手段によっても連結されていない、ライブラリーの任意のペプチドを指す。したがって、特定の実施形態において、ライブラリーのメンバーは、上記で定義されたライブラリーのポリペプチドである。別の特定の実施形態において、ライブラリーのメンバーは、それをコードする核酸に直接的または間接的に連結された本発明の第１の態様のポリペプチドを含む複合体である。
直接的な連結は、ライブラリーのポリペプチドとそれをコードする核酸との間の直接的な相互作用からなり、ポリペプチドがそれをコードする核酸に結合または共有結合するポリペプチド－核酸複合体をもたらし、ポリペプチドは、ポリペプチド－核酸複合体の外表面に含まれる。当業者に理解されるように、複合体はまた、追加のタンパク質および／または核酸を含み得る。
特定の実施形態において、複合体のポリペプチドと核酸との結合は直接的なものである。別の特定の実施形態において、複合体のポリペプチドと核酸との結合は間接的であり、ポリペプチドは、核酸に結合する別のペプチド、タンパク質、タンパク質複合体または分子によって、それをコードする核酸に結合するかまたは共有結合する。
本明細書で用いられる「共有結合した（covalently attached）」、「共有結合（covalent attachment）」または「共有結合した（covalently coupled）」という用語は、互いに化学共有結合を介して直接的に共有結合されるか、またはリンカー、ブリッジまたはスペーサー等の１つまたは複数の介在部分を介して互いに間接的に共有結合される２つの分子間の相互作用を指す。
別の特定の実施形態において、ライブラリーのポリペプチドとそれをコードする核酸との間の共有結合は直接的であり、ポリペプチドは、それをコードする核酸と共有結合される。別の特定の実施形態において、ライブラリーのポリペプチドとそれをコードする核酸との間の共有結合は間接的であり、ポリペプチドは、リンカー、ブリッジまたはスペーサー等の１つまたは複数の介在部分を介してそれをコードする核酸と結合される。好ましい実施形態において、それはリンカーを介して結合される。
本明細書で用いられる「リンカー部分」または「リンカー」という用語は、２つの分子または化合物を連結する分子を指す。連結部分はその化学的な性質および／または構造の点で制限されないことも意図されており、したがって、連結部分は、とりわけ多糖、ポリペプチド、脂肪酸、リン脂質またはそれらの化学的誘導体であり得る。さらに、リンカーを介して別の分子と共有結合している分子の少なくとも１つ、または前記分子の両方ともが、ペプチド結合、イソペプチド結合、アミド結合、イミン結合等の任意の化学結合を介してリンカーに結合することが意図される。
特定の実施形態において、ポリペプチドディスプレイライブラリーは、ポリペプチドをコードする核酸に直接的に連結された本発明の第１の態様のポリペプチドを含む複合体によって形成され、ポリペプチド－核酸複合体は、
－それをコードする核酸に結合するライブラリーのポリペプチドからなる複合体、
－それをコードする核酸に結合するライブラリーのポリペプチドおよび追加のタンパク質、ペプチドおよび／または核酸からなる複合体、
－ポリペプチド－核酸複合体、
－リボソームまたはリボソームの一部
からなる群から選択される。
本明細書で用いられる「複合体」という用語は、２つ以上の個々の化合物または分子の共有結合から生じる任意の化合物を指し、上記で定義されるような共有結合である。定義によれば、複合体は自然界では決して見られない。
本発明の第２の態様の複合体に共有結合している個々の化合物は、ライブラリーのポリペプチドおよびそれをコードする核酸である。したがって、特定の実施形態において、本発明の第２の態様の複合体は、コードする核酸に化学共有結合を介して直接付着したライブラリーのポリペプチドを含む。別の特定の実施形態において、本発明の第２の態様の複合体は、コードする核酸にリンカー、ブリッジ、スペーサー、１つの部分または複数の部分等の１つの介在部分または複数の部分を介して付着したライブラリーのポリペプチドを含む。特定の実施形態において、それらはリンカーを介して付着している。
本明細書で用いられる「リボソーム」という用語は、タンパク質合成に不可欠な非常に複雑な細胞機構を指す。リボソームは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子によって指定された順序でアミノ酸を結合する。リボソームは、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）として知られる特殊なＲＮＡと数十（正確な数は種によって異なる）の異なるタンパク質とで構成されている。リボソームタンパク質およびｒＲＮＡは、一般にリボソームの大小のサブユニットとして知られているサイズの異なる２つの異なるリボソームフラグメントに配置される。
本明細書で用いられる「リボソーム部分」という表現は、リボソームの単離された部分を指し、これは、例えば、リボソームの単離された大きいサブユニットまたは小さいサブユニットからなり得る。また、リボソーム部分は、リボソームタンパク質の一部またはｒＲＮＡの一部のみを含むリボソームも指す。
別の特定の実施形態において、本発明の第２の態様のポリペプチド－核酸複合体は、その外表面に、ライブラリーの１つのポリペプチドのみを含む。別の特定の実施形態において、本発明の第２の態様のポリペプチド－核酸複合体は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２５０個、少なくとも５００個、少なくとも１×１０３個のコピーのライブラリーのポリペプチドを含む。特定の実施形態において、前記コピーは同じアミノ酸配列を有する。別の特定の実施形態において、前記複合体は、ライブラリーの他のポリペプチドを含まない。
別の特定の実施形態において、本発明の第２の態様のポリペプチド－核酸複合体は、複合体に含まれるライブラリーのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする１つの核酸のみを含む。前記ポリペプチドおよび前記ポリペプチド配列は、上記の実施形態で特定されたものである。
特定の実施形態において、本発明の第２の態様の複合体は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個のコピーの、複合体に含まれるライブラリーのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸を含む。前記ポリペプチドおよび前記ポリペプチド配列は、上記の実施形態で特定されたものである。特定の実施形態において、前記核酸は同じヌクレオチド配列を有する。
間接的な連結は、ポリペプチドおよび核酸の両方を含む微生物による、ライブラリーのポリペプチドと核酸との間の遺伝子融合からなる。ライブラリーのポリペプチドは、微生物の外表面に含まれている。核酸は、好ましくは微生物の内部に含まれる。
特定の実施形態において、微生物は、その外表面に、ライブラリーの１つのポリペプチドのみを含む。特定の実施形態において、微生物は、その外表面に、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２５０個、少なくとも５００個、少なくとも１×１０３個のコピーのライブラリーのポリペプチドを含む。特定の実施形態において、前記コピーは同じアミノ酸配列を有する。別の特定の実施形態において、前記微生物は、ライブラリーの他のポリペプチドを含まない。
別の特定の実施形態において、微生物は、微生物に含まれるライブラリーのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする１つの核酸のみを含む。前記ポリペプチドおよび前記ポリペプチド配列は、上記の実施形態で特定されたものである。
別の特定の実施形態において、微生物は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個のコピーの、微生物に含まれるライブラリーのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸を含む。前記ポリペプチドおよび前記ポリペプチド配列は、上記の実施形態で特定されたものである。特定の実施形態において、前記核酸は同じヌクレオチド配列を有する。
特定の実施形態において、微生物は複製することができる。特定の実施形態において、複製された微生物は、それが由来する微生物の正確なコピーである。別の特定の実施形態において、前記微生物の複製は、それが由来する微生物に含まれるライブラリーの同じポリペプチドおよびそれをコードする同じ核酸を有する微生物をもたらす。したがって、当業者に理解されるように、微生物の複製は、ライブラリーのポリペプチドの増幅、およびそれをコードする核酸の増幅を可能にする。
特定の実施形態において、微生物は、ファージ、バクテリオファージ、ウイルス、細菌および酵母からなる群から選択される。好ましい実施形態において、微生物はファージである。別の好ましい実施形態において、微生物はバクテリオファージである。
特定の実施形態において、バクテリオファージは、エンテロバクテリアファージＭ１３、Ｔ４バクテリオファージ、Ｔ７バクテリオファージまたはエシェリヒアλウイルスからなる群から選択される。
特定の実施形態において、本発明の第１の態様で説明されているすべての用語および実施形態は、本発明のこの態様に等しく適用可能である。
ＩＩＩ－ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または本発明の第２の態様によるポリペプチドディスプレイライブラリーのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
ポリヌクレオチドという用語は、本発明の第２の態様で定義されている。
特定の実施形態において、上述した本発明の態様のいずれかにおいて説明されているすべての用語および実施形態は、本発明の第３の態様に等しく適用可能である。
第４の態様において、本発明は、本発明の第３の態様によるポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ分子を操作または細胞に導入することができる媒体を指す。ベクターは、直鎖状または環状のポリヌクレオチドであってもよく、またはより大きなポリヌクレオチド、またはウイルスゲノムのＤＮＡもしくはＲＮＡ、ビリオン、およびＤＮＡの操作またはその細胞への導入を可能にする他の生物学的構築物等の他の任意のタイプの構築物であってもよい。「組換えベクター」、「組換えシステム」という用語は、ベクターという用語と交換可能に用いられることが理解される。ベクターは、増殖に適し、ポリヌクレオチドまたは適切な遺伝子構築物または本発明のポリヌクレオチドを生成するのに適した異なる異種生物における発現ベクターを得るのに適したクローニングベクターであり得ることから、当業者は、用いることができるベクターのタイプに関して制限がないことを理解するであろう。したがって、本発明による適切なベクターには、ｐＥＴ（ｐＥＴ１４ｂ等）、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびそれらの誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏＩＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８等のシャトルベクター等の原核生物における発現ベクター、２ミクロンプラスミドのタイプのベクター、組み込みプラスミド、ＹＥＰベクター、セントロメアプラスミド等の酵母における発現ベクター、ｐＡＣシリーズベクターおよびｐＶＬシリーズベクター等の昆虫細胞における発現ベクター、ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥシリーズのベクター等の植物における発現ベクター、ならびにウイルスベクター（アデノウイルス、アデノウイルスに関連するウイルス、レトロウイルスに関連するウイルス、レンチウイルスに関連するウイルス）およびｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ４．１－ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦｌ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ－ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５－Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ－１０、ｐＢＰＶ－１、ｐＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴ１等の非ウイルスベクターをベースと高等真核細胞における発現ベクターが包含される。
本発明のベクターを用いて、該ベクターによって形質転換、トランスフェクトまたは感染され得る細胞を形質転換、トランスフェクトまたは感染させることができる。前記細胞は、原核生物または真核生物であり得る。例えば、ＤＮＡ配列が導入されるベクターは、宿主細胞に導入された場合に該細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体（または複数の染色体）と共に複製するプラスミドまたはベクターであり得る。ベクターは、当業者に公知の従来の方法により得ることができる（Sambrook et al., 2001, “Molecular cloning, to Laboratory Manual”, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. Vol 1-3 a）。
したがって、第５の態様において、本発明は、本発明の第３の態様によるポリヌクレオチドまたは本発明の第４の態様によるベクターを含む宿主細胞に関する。
形質転換、トランスフェクトまたは感染した細胞は、当業者に公知の従来の方法により得ることができる（上記のSambrook et al., 2001）。特定の実施形態において、宿主細胞は、適切なベクターでトランスフェクトまたは感染された動物細胞である。
本発明の第３の態様のポリヌクレオチド、または本発明の第４の態様のベクターを含むのに適した宿主細胞としては、限定されないが、哺乳動物、植物、昆虫、真菌および細菌の細胞が挙げられる。細菌細胞としては、限定されないが、バチルス属（Bacillus）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、リステリア属（Listeria）およびスタフィロコッカス属（Staphylococcus）の種等のグラム陽性細菌細胞、ならびにエシェリヒア属（Escherichia）、サルモネラ属（Salmonella）およびシュードモナス属（Pseudomonas）の細胞等のグラム陰性細菌細胞が挙げられる。真菌細胞としては、好ましくは、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）およびハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）等の酵母の細胞が挙げられる。昆虫細胞としては、限定されないが、ショウジョウバエ（Drosophila）およびＳｆ９の細胞が挙げられる。植物細胞としては、とりわけ、穀物、薬用植物、観賞用植物または球根状植物等の作物植物の細胞が挙げられる。本発明における適切な哺乳動物細胞としては、上皮細胞株（ヒト、ヒツジ、ブタ等）、骨肉腫細胞株（ヒト等）、神経芽細胞腫細胞株（ヒト等）、上皮癌（ヒト等）、グリア細胞（マウス等）、肝細胞株（サル等）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１、ＡＴ１０８０、Ａ５４９、２９３またはＰＥＲ．Ｃ６、ＮＴＥＲＡ－２ヒトＥＣＣ細胞、ｍＥＳＣ株のＤ３細胞、ＨＳ２９３細胞、ＢＧＶ０１細胞、ＳＨＥＦ１細胞、ＳＨＥＦ２細胞、ＨＳ１８１細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、２９３Ｔ細胞、ＲＥＨ細胞、ＭＣＦ－７細胞およびｈＭＳＣ細胞等のヒト胚性幹細胞が挙げられる。
特定の実施形態において、本発明の第１および第２の態様において説明されているすべての用語および実施形態は、本発明の第３の態様に等しく適用可能である。別の実施形態において、本発明の第１、第２および第３の態様において説明されているすべての用語および実施形態は、本発明の第４の態様に等しく適用可能である。別の特定の実施形態において、本発明の第１、第２、第３および第４の態様のすべての用語および実施形態は、本発明の第５の態様に等しく適用可能である。
ＩＶ－本発明の複合体
さらなる態様において、本発明は、
（ｉ）ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体を含むポリペプチド、および
（ｉｉ）目的の剤
を含む複合体に関する。
複合体の一部を形成し、ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体を含む（上記のポイント（ｉ）で特定される）ポリペプチドは、「本発明の第６の態様の複合体のポリペプチド」、「本発明の複合体のポリペプチド」または「複合体のポリペプチド」とも呼ばれる。
本発明の第６の態様の複合体のポリペプチドに含まれるニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体は、「複合体の第１のポリペプチド」、「複合体の第１のポリペプチド領域」、「第１のポリペプチド領域」または「複合体のポリペプチドに含まれる第１のポリペプチド領域」とも呼ばれる。
「複合体」という用語は、本発明の第２の態様で定義されている。本発明の第６の態様の複合体と共有結合している２つの構成要素は、複合体のポリペプチドおよび目的の剤である。以下、本発明の第６の態様の複合体は、「本発明の複合体」とも呼ばれる。
「ポリペプチド」という用語は、本発明の第１の態様で定義されている。「アミノ酸残基」という用語について本発明の第１の態様に示されている定義および実施形態は、本発明の本態様にも適用される。
本明細書で用いられる「目的の剤」という表現は、複合体のポリペプチドと共有結合することができるという条件で、化学構造の制限のない任意の化合物を指す。特定の実施形態において、前記剤は治療薬である。別の特定の実施形態において、前記剤は造影剤である。「治療薬」および「造影剤」という用語は、以下のセクションＩＶ－Ｅ．１およびＩＶ－Ｅ．２で定義される。
ＩＶ．Ａ－複合体の第１のポリペプチド
本発明の複合体は、ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体を含むポリペプチドを含む。
本明細書で用いられる「ニドゲン－１」という用語は、ニドゲンＧ２ドメインの変異体に関する上記の文脈で定義されており、本発明の複合体に等しく適用される。
本明細書で用いられる「ニドゲン－１のＧ２ドメイン」という用語は、上記で定義されたニドゲン１タンパク質のＧ２ドメインを指す。野生型ニドゲン－１配列においては、Ｇ２ドメインは短いＥＧＦ様ドメインに並んで配置されている。しかしながら、本発明の目的のために、ニドゲン－１のＧ２ドメインは、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（２００９年７月７日付けのバージョン）の識別番号Ｐ１４５４３－１（配列番号６２）であるニドゲン－１タンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸番号４３０～６６７によって形成され、Ｎ末端またはＣ末端においてＥＧＦ様ドメインを欠いている。別の実施形態において、ニドゲン１のＧ２ドメインは、配列番号６２（配列番号６３）の最初の２つのアミノ酸を欠いており、したがって、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（２００９年７月７日付けのバージョン）の識別番号Ｐ１４５４３－１（配列番号７２）であるニドゲン－１タンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸番号４３２～６６７からなる領域に対応する。
本明細書で用いられる「機能的に同等の変異体」という表現は、ニドゲン－１のＧ２ドメインの配列、好ましくは配列番号６３の配列、より好ましくは配列番号６２の配列とある程度の配列同一性を示し、かつニドゲン－１のＧ２ドメインの機能が実質的に維持されているすべてのペプチドを指す。本発明の第６の態様の複合体において維持されるＧ２ドメインの機能は、好ましくはそれが複合体の一部ではない場合、ドメインの三次構造であると考えられる。したがって、Ｇ２ドメインの機能的に同等の変異体は、好ましくはそれが複合体の一部ではない場合、ニドゲン－１のＧ２ドメインの三次構造が実質的に維持されている。当業者により理解されるように、維持されるＧ２ドメインの三次構造は、好ましくはニドゲン－１のＧ２ドメインのβバレルドメインの三次構造である。前記構造は、本発明の第１の態様で定義されている。
本明細書で用いられる「実質的に維持されている」という表現は、ニドゲン－１のＧ２ドメインの構造、好ましくはニドゲン－１のＧ２のβバレルドメインの構造が、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、より一層好ましくは１００％維持されると理解される。
パーセンテージで表される場合、タンパク質ドメインの三次構造の維持は、ドメインの三次構造内のドメインの残りのアミノ酸に対して相対的な位置を維持するドメインに対するアミノ酸のパーセンテージとして理解される。タンパク質の原子座標を決定することを可能にするタンパク質の三次構造を決定する方法は、当業者によく知られており、円偏光二色性分析法、Ｘ線結晶構造解析法およびタンパク質ＮＭＲ法が挙げられる。
特定の実施形態において、Ｇ２ドメインの機能的に同等の変異体は、それが本発明の第６の態様の複合体に組み込まれると、上記のニドゲン－１のＧ２ドメインの構造のパーセンテージが実質的に維持される。好ましい実施形態において、Ｇ２ドメインの機能的に同等の変異体が複合体の一部でない場合、ニドゲン－１のＧ２ドメインの構造のパーセンテージが実質的に維持される。好ましい実施形態において、実質的に維持されるＧ２ドメインの構造は、本発明の第１の態様において説明されているニドゲン－１のＧ２ドメインのβバレルドメインの構造である。特定の実施形態において、実質的に維持されるＧ２ドメインが複合体の第１のポリペプチドである場合、実質的に維持されるＧ２ドメインはニドゲン－１のＧ２ドメインのβバレルドメインの構造である。
特定の実施形態において、配列番号６２を有するニドゲン１のＧ２ドメインと機能的に同等の変異体との間の配列同一性の程度は、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％である。別の特定の実施形態において、配列番号６３を有するニドゲン１のＧ２ドメインと機能的に同等の変異体との間の配列同一性の程度は、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％である。２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を決定する方法は、本発明の第１の態様において提供されている。
複合体に組み込まれると、複合体の第１のポリペプチド領域は、ニドゲンＧ２ドメインの細胞機能または生理学的機能を維持する必要はない。したがって、特定の実施形態において、第１のポリペプチド領域は、本発明の融合タンパク質に組み込まれると生理学的機能が低下するニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体である。別の実施形態において、第１のポリペプチド領域は、ニドゲン－１のＧ２の生理学的機能または複合体の外側のニドゲン－１のＧ２ドメインのβバレルドメインの生理学的機能を有さないニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体である。好ましい実施形態において、第１のポリペプチド領域は、ニドゲン－１の野生型Ｇ２ドメインと比較して、またはニドゲン－１のＧ２ドメインの野生型βバレルドメインと比較して、本発明の複合体に組み込まれる前に、生理学的機能が低下しているニドゲンＧ２ドメインの機能的に同等の変異体である。より好ましくは、第１のポリペプチド領域は、不活性化突然変異の存在に起因して、本発明の複合体に組み込まれる前に、ニドゲン－１のＧ２ドメイン、またはニドゲン－１のＧ２ドメインの野生型βバレルドメインのいずれの生理学的機能も有さないタンパク質である。
本明細書で用いられる「生理学的機能」または「細胞機能」という表現は、細胞または生物内のペプチドの機能を指す。したがって、ニドゲン－１のＧ２ドメインの生理学的機能、またはニドゲン－１のＧ２ドメインのβバレルドメインの生理学的機能に言及する場合、上記表現は、ニドゲン－１タンパク質の一部である場合の前記ドメインの機能として理解される。したがって、上記表現は、ニドゲン－１タンパク質が細胞に関与する生化学的経路または分子メカニズムにおけるドメインの役割を指す。したがって、上記表現は、細胞、細胞の外側、または別の細胞の外表面の特定のペプチドまたはタンパク質と相互作用するドメインの能力に直接関係している。したがって、特定の実施形態において、上記表現は、通常のタンパク質結合パートナーと相互作用する、Ｇ２ドメイン、またはＧ２ドメインのβバレルドメインの能力を指す。そのような結合パートナーの非限定的な例としては、コラーゲンＩＶおよびペルレカン（perlecan）が挙げられる。したがって、特定の実施形態において、複合体の第１のポリペプチドは、ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはニドゲン－１のＧ２ドメインのβバレルドメインと、ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはニドゲン－１のＧ２ドメインのβバレルドメインの通常の結合パートナーとの相互作用、好ましくはコラーゲンＩＶおよび／またはペルレカンとの相互作用を阻害する突然変異を含む、ニドゲン－１のＧ２ドメインの機能的に同等の変異体である。
本発明の別の実施形態において、複合体の第１のポリペプチドは、不活性であるニドゲン－１のＧ２ドメインの機能的に同等の変異体である。特定の実施形態において、複合体の第１のポリペプチドは、複合体に組み込まれると不活性である。別の特定の実施形態において、複合体の第１のポリペプチドは、複合体に組み込まれる前にすでに不活性である。
本明細書で用いられる「不活性」という用語は、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質のフラグメントまたはドメインを指す場合、生理学的活性または生物学的活性を有さない、または生物学的機能のための他の高分子と特異的に相互作用する能力を有さないポリペプチド、タンパク質、フラグメントもしくはドメイン、および公知の治療活性（例えば、抗腫瘍活性）を欠くタンパク質のフラグメントまたはドメインとして理解される。複合体の不活性ポリペプチド部分は非反応性であり、目的の剤との結合のための物理的構造として機能する。不活性ポリペプチドは、それ自体が固有の酵素的、生理学的または生物学的な活性を有するモチーフを含まず、免疫反応性を示さず、すなわち適応免疫応答も自然免疫応答も刺激しないことが意図される。
一般に、複合体の第１のポリペプチドの固有の活性は、本発明の目的には無関係であり、目的の剤の生物学的活性に寄与したり、妨害したりしないことが意図される。
特定の実施形態において、複合体の第１のポリペプチドは、本発明の第１の態様に記載されるポリペプチドのいずれかとして、ニドゲン－１のＧ２ドメインの機能的に同等の変異体である。したがって、特定の実施形態において、複合体のポリペプチドは、本発明の第１の態様に記載されているポリペプチドのいずれかと同様に、ニドゲン－１のＧ２ドメインの機能的に同等の変異体である。
別の特定の実施形態において、第１のポリペプチド領域は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（２００９年７月７日付けのバージョン）のアクセション番号Ｐ１４５４３－１で定義されるヒトニドゲン－１の配列のアミノ酸４３０～６６７に対応する配列、すなわち配列番号６２を有する。別の特定の実施形態において、第１のポリペプチド領域は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（２００９年７月７日付けのバージョン）のアクセション番号Ｐ１４５４３－１で定義されるヒトニドゲン－１の配列のアミノ酸４３２～６６７に対応する配列、すなわち配列番号６３を有する。
別の特定の実施形態において、複合体の第１のポリペプチドは、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（２００９年７月７日付けのバージョン）のアクセション番号Ｐ１４５４３－１で定義されるヒトニドゲン－１の配列の番号付けにおける４５９位、４６８位、６３９位、６５０位、５４３位、５４５位、４４９位、５２５位、５６１位、６１８位、６１９位、１５１位、６０４位、６３８位、６４１位、４６９位および５１８位の１つ以上のアミノ酸残基の突然変異を含むニドゲン－１のＧ２ドメインの機能的に同等の変異体である。したがって、別の特定の実施形態において、本発明の第６の態様の複合体のポリペプチドは、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（２００９年７月７日付けのバージョン）のアクセション番号Ｐ１４５４３－１で定義されるヒトニドゲン－１の配列の番号付けにおける４５９位、４６８位、６３９位、６５０位、５４３位、５４５位、４４９位、５２５位、５６１位、６１８位、６１９位、１５１位、６０４位、６３８位、６４１位、４６９位および５１８位の１つ以上のアミノ酸残基の突然変異を含むニドゲン－１のＧ２ドメインの機能的に同等の変異体である。
本明細書で用いられる「突然変異」という用語は、アミノ酸配列中のアミノ酸の任意の改変もしくは欠失、またはアミノ酸配列中のアミノ酸の前または後における少なくとも１つのアミノ酸の挿入を指す。当業者に理解されるように、アミノ酸の改変または欠失の位置は、前記突然変異前のアミノ酸配列中の改変または欠失されたアミノ酸の位置によって言及される。特定の実施形態において、突然変異が挿入である場合、該突然変異の位置は、挿入されたアミノ酸のＮ末端のアミノ酸を参照することによって定義される。別の特定の実施形態において、突然変異が挿入である場合、該突然変異の位置は、挿入されたアミノ酸のＣ末端のアミノ酸を参照することによって定義される。したがって、当業者に理解されるように、上記で示されたタンパク質配列の４５９位、４６８位、６３９位、６５０位、５４３位、５４５位、４４９位、５２５位、５６１位、６１８位、６１９位、１５１位、６０４位、６３８位、６４１位、４６９位および５１８位における１つ以上のアミノ酸残基の突然変異は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（２００９年７月７日付けのバージョン）のアクセション番号Ｐ１４５４３－１で定義されるヒトニドゲン－１のアミノ酸配列における前記位置のアミノ酸の改変または欠失を指す。特定の実施形態において、それは１つ以上の前記アミノ酸のＣ末端における少なくとも１つのアミノ酸の挿入を指す。別の特定の実施形態において、それは１つ以上の前記アミノ酸のＮ末端における少なくとも１つのアミノ酸の挿入を指す。
好ましい実施形態において、突然変異はアミノ酸改変である。特定の実施形態において、上記で示される４５９位における突然変異は、Ｈ４５９Ａ突然変異である。別の好ましい実施形態において、上記で示される４６８位における突然変異は、Ｒ４６８Ｎ突然変異である。別の好ましい実施形態において、上記で示される６３９位における突然変異は、Ｆ６３９Ｓ突然変異である。別の特定の実施形態において、上記で示される６５０位における突然変異は、Ｒ６５０Ａ突然変異である。
したがって、特定の実施形態において、複合体の第１のポリペプチドにおける上記で示される４５９位、４６８位、６３９位または６５０位における１つ以上の突然変異は、Ｈ４５９Ａ突然変異、Ｒ４６８Ｎ突然変異、Ｆ６３９Ｓ突然変異またはＲ６５０Ａ突然変異である。別の特定の実施形態において、複合体のポリペプチドにおける上記で示される４５９位、４６８位、６３９位または６５０位における１つ以上の突然変異は、Ｈ４５９Ａ突然変異、Ｒ４６８Ｎ突然変異、Ｆ６３９Ｓ突然変異またはＲ６５０Ａ突然変異である。
複合体の第１のポリペプチド領域に含めることができる適切なニドゲンＧ２ドメインの変異体としては、限定されないが、それぞれ配列番号６４、６５および８７～１０４として定義されるＮＩＤＯｍｕｔ２、ＮＩＤＯｍｕｔ３、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｖ４５Ｔ、ＮＩＤＯｍｕｔ３＿Ｖ１２１Ｑ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｆ１５７Ｅ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｖ２１５Ｔ、ＮＩＤＯｍｕｔ４、ＮＩＤＯｍｕｔ４＿Ｔ２１５Ｖ、ＮＩＤＯｍｕｔ５、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｖ１７６Ｔ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｉ２００Ｔ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｖ２３６Ｙ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｌ２３７Ｔ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｓ６５Ｉ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｒ１１４Ｉ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｃ２１４Ｓ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｓ６５Ｉ＿Ｒ１１４Ｉ、ＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｓ６５Ｉ＿Ｒ１１４Ｉ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｓ６５Ｉ＿Ｒ１１４ＩおよびＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｓ６５Ｉ＿Ｒ１１４Ｉを担持する変異体を含む、本発明の第１の態様の文脈において上記で定義されたいずれかのニドゲンＧ２ドメイン変異体が挙げられる。
ＩＶ－Ｂ．複合体の第２のポリペプチド領域
本発明の第６の態様の複合体のポリペプチドは、任意に、目的の標的と特異的に結合することができる第２のポリペプチド領域を含む。
目的の標的と特異的に結合することができる第２のポリペプチド領域は、「複合体の第２のポリペプチド」、「複合体の第２のポリペプチド領域」、「第２のポリペプチド領域」または「複合体のポリペプチドに含まれる第２のポリペプチド領域」とも呼ばれる。
「特異的に結合する」という表現は、本発明の第２の態様において定義されている。特定の実施形態において、複合体の第２のポリペプチドは、それが１０－６Ｍ未満、１０－７Ｍ未満、１０－８Ｍ未満、１０－９Ｍ未満、１０－１０Ｍ未満、１０－１１Ｍ未満、１０－１２Ｍ未満、１０－１３Ｍ未満、１０－１４Ｍ未満、１０－１５Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で標的と結合する場合、目的の標的と特異的に結合すると見なされる。ポリペプチドが標的分子と結合することができるかどうかを決定する方法、および前記結合の解離定数を決定する方法は、本発明の第２の態様の「特異的結合」の定義において提供される。
特定の実施形態において、本発明の複合体における第２のポリペプチド領域は、細胞受容体のリガンドである。「細胞受容体」または「細胞表面の受容体」という用語は、「リガンド」と結合する細胞関連タンパク質を意味する。細胞受容体および特定の受容体の特異的リガンドである目的の剤の非限定的な例、またはそれらが結合する細胞タイプは、以下の表２に示されるものである。
Figure 2023509004000002
Figure 2023509004000003
特定の実施形態において、複合体の第２のポリペプチドは、表２に示されるリガンドの群から選択される。
特定の実施形態において、目的の標的は、細胞の表面における受容体であり、複合体の第２のポリペプチドは、細胞における複合体の内在化を促進することができる。複合体の第２のポリペプチドに言及する場合、「細胞における複合体の内在化を促進する」という表現は、ポリペプチドの結合に応答してエンドサイトーシスを受ける細胞表面の受容体に結合するポリペプチドを指す。この結合特異性は、複合体の第２のポリペプチド、およびそれを含む複合体の残りの部分を、受容体を発現する細胞、組織または器官に送達することを可能にする。このようにして、ポリペプチド領域を含む複合体は、動物に投与される時、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで異なるタイプの細胞の集団と接触される時に、特に前記細胞に向けられる。
本明細書で用いられる場合、「内在化」とは、分子または分子を含む構築物が細胞膜の外面上の標的要素に結合し、結果として生じる複合体が細胞によって内在化されるプロセスを指す。得られた複合体は、内在化の後に細胞質内で解離されてもよい。次いで、標的要素は、分子または構築物とともに、特定の細胞区画に局在化され得る。好ましくは、本発明の複合体の第２のポリペプチドは、内在化の促進に加えて、複合体のエンドソーム脱出を促進する。
本明細書で用いられる「エンドソーム脱出を促進する」という表現は、受容体媒介エンドサイトーシスによる内在化後にエンドソーム区画からの複合体の放出を誘導する、複合体の第２のポリペプチドの能力を指す。
複合体の第２のポリペプチドが結合する受容体を発現する細胞によって内在化される本発明の複合体の能力は、複合体のポリペプチドがＧＦＰ等の蛍光タンパク質を含む場合、蛍光法によって便利に決定され得る。このような融合タンパク質は、複合体のポリペプチドをコードする核酸と蛍光タンパク質とがインフレームで融合され、適切な宿主細胞または生物で発現される組換え核酸を調製することによって得ることができる。次いで、融合タンパク質を、上述した受容体を発現する細胞の培養物と接触させるか、またはｉｎ ｖｉｖｏで受容体を発現する組織と適切な時間接触させ、その後に蛍光顕微鏡を用いて、構築物が細胞に透過したかどうかを決定することができる。細胞質における蛍光の存在は、蛍光タンパク質から得られた蛍光顕微鏡画像と既知の細胞質染色で得られたものとを比較することによってさらに調査することができる。
より多くの受容体特異的リガンドを有する、多種多様な取り込み受容体および担体が当技術分野で知られている。
第２のポリペプチドによって標的とされ得る受容体の非限定的な例は、上記で提供される。
特定の実施形態において、複合体の第２のポリペプチドは、ポリカチオン性ペプチドである。本明細書で用いられる「ポリカチオン性ペプチド」または「ポリカチオン性領域」という用語は、正に帯電した複数のアミノ酸を含むポリペプチド配列に対応する。ポリカチオン性ペプチドは、正に帯電したアミノ酸にのみによって形成されてもよく、またはｐＨ７において領域全体の正味電荷が正であるという条件で他のアミノ酸を含んでもよい。
アミノ酸およびそれらの対応するアミノ酸残基は、それらの側鎖に応じて異なる特性を有し、それらは特性に応じてグループ化され得ることが当技術分野でよく知られている。したがって、生理的ｐＨにおいては、５つのアミノ酸が電荷を示し；アルギニン、ヒスチジンおよびリジンは正に帯電し、アスパラギン酸およびグルタミン酸は負に帯電する。当業者は、本発明のポリカチオン性ペプチドが、生理的ｐＨ条件において２つ以上の正電荷の正味電荷を有するポリペプチドに対応することを理解するであろう。したがって、本発明のポリカチオン性ペプチドは、２つ以上の正味の正電荷をもたらすのに十分な正に帯電したアミノ酸残基が常に存在する限り、１つ以上の負に帯電したアミノ酸残基の存在を制限するものではない。
したがって、本発明の一つの実施形態において、本発明のポリカチオン性ペプチドは、
（ｉ）細胞表面の受容体と特異的に相互作用して該細胞への複合体の内在化を促進することができる配列、
（ｉｉ）アルギニンに富む配列、
（ｉｉｉ）ＧＷ－Ｈ１ペプチド、
（ｉｖ）ＣＤ４４リガンド、
（ｖ）血液脳関門を通過できるペプチド、
（ｖｉ）細胞透過性ペプチド、および
（ｖｉｉ）ヌクレオリン結合ペプチド
からなる群から選択される。
（ｉ）細胞表面の受容体と特異的に結合して該細胞への複合体の内在化を促進することができる配列
本明細書で用いられる「細胞表面の受容体と特異的に結合して該細胞への複合体の内在化を促進することができる配列」という用語は、目的の標的と特異的に結合することができるポリペプチドをコードする任意の配列を指し、上記で定義されるように、前記標的は細胞の表面上の受容体であり、上記で定義されるように、前記配列によってコードされるポリペプチドは前記細胞への複合体の内在化を促進する。
複合体の第２のポリペプチドについて上記で提供された実施形態は、前記ポリカチオン性ペプチドにも適用される。
本発明のポリカチオン性ペプチド、好ましくは上記の細胞表面の受容体に特異的に結合することができる配列によって標的化され得る受容体の非限定的な例としては、上記で提供されるいずれかの細胞受容体が挙げられる。特定の実施形態において、受容体は、ＣＸＣＲ４受容体、アンギオテンシン受容体、ボンベシン受容体、ブラジキニン受容体、カルシトニン受容体、ケモカイン受容体、コレシストキニン受容体、コルチコトロピン放出因子受容体、エンドセリン受容体、エフリン受容体、ホルミルペプチド受容体、フリズルド受容体、ガラニン受容体、成長ホルモン分泌促進物質受容体（グレリン）受容体、キスペプチン受容体、メラノコルチン受容体、ニューロペプチドＦＦ／ニューロペプチドＡＦ受容体、ニューロペプチドＳ受容体、ニューロペプチドＷ／ニューロペプチドＢ受容体、ニューロペプチドＹ受容体、ニューロテンシン受容体、オレキシン受容体、ペプチドＰ５１８受容体、ソマトスタチン受容体、タキキニン受容体、トール様受容体、バソプレシンおよびオキシトシン受容体ならびにＶＥＧＦ受容体からなる群から選択される。
本発明の好ましい実施形態において、細胞表面の受容体に特異的に結合し、該細胞への複合体の内在化を促進することができる配列を含むポリカチオン性ペプチドは、ＣＸＣＲ４リガンドである。
本明細書で用いられる「ＣＸＣＲ４」という用語は、Ｇタンパク質共役型の７回膜貫通型ケモカイン受容体を指す。他のケモカイン受容体と同様に、ＣＸＣＲ４は、白血球の方向性のある移動および活性化を仲介することにより、免疫応答および炎症反応において重要な役割を果たす。ＣＸＣＲ４は、胸部、前立腺、卵巣、結腸、結腸直腸、膵臓、腎臓および脳を含む様々な癌細胞および組織、ならびに非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ性白血病において発現または過剰発現する。ＣＸＣＲ４に対する唯一の既知のリガンドは、間質細胞由来因子－１（ＳＤＦ－１またはＣＸＣＬ１２）である。ＣＸＣＲ４とＳＤＦ－１との間の相互作用は、腫瘍の成長、浸潤、血管新生および転移を含む腫瘍形成の複数の段階で重要な役割を果たす。
「特異的に結合する」という表現は、本発明の第２の態様において定義されている。当業者に理解されるように、本明細書で用いられる「ＣＸＣＲ４に特異的に結合する」という表現は、他の分子と実質的に結合することなく、他の受容体または細胞と比較してより頻繁に、より迅速に、より長い持続時間で、および／またはより高い親和性をもって、ＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ４を発現する細胞と結合する本発明の複合体の能力を指す。
結合親和性は、例えば、本発明の第２の態様における「特異的に結合する」の定義において提供される方法のいずれかによって、好ましくは、Tamamura et al.によって記載される方法、オイルクッション法［Hesselgesset et al, 1998, J.Immunol., 160:877-883を参照のこと］によって測定される。前記方法は、ペプチドとＣＸＣＲ４でトランスフェクトされた細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞）および標識されたＣＸＣＲ４リガンド（例えば、１２５Ｉ－ＳＤＦ－１α）とを接触させ、標識されたＣＸＣＲ４リガンドの結合に対する標的ペプチドの阻害パーセンテージを測定することを含む。
特異的な結合は、例えば、ＣＸＣＲ４がリガンドに対する複数の結合部位を有し、低親和性を有するリガンドが標的化に有用であり得る場合、例えば、少なくとも約１０－４ＭのＫｄを有する低親和性標的化剤によって示すことができる。特異的結合はまた、高親和性リガンド、例えば、少なくとも約１０－７Ｍ、少なくとも約１０－８Ｍ、少なくとも約１０－９Ｍ、少なくとも約１０－１０ＭのＫｄを有するリガンドによって示され得るか、または少なくとも約１０－１１Ｍまたは１０－１２Ｍ以上のＫｄを有し得る。低親和性および高親和性の標的化リガンドはいずれも本発明の複合体への組み込みに有用である。
ＣＸＣＲ４を発現する細胞によって内在化される本発明の複合体の能力は、複合体が任意の細胞受容体に結合する複合体の任意の第２のポリペプチドについて上記で示されるように、複合体がＧＦＰ等の蛍光タンパク質を含む蛍光法により決定され得る。より具体的には、ＣＸＣＲ４を発現する細胞によって内在化される複合体は、ポリカチオン性ペプチドをコードする核酸と蛍光タンパク質をコードする核酸とがインフレームで融合され、適切な宿主細胞または生物において発現される組換え核酸を調製することによって得ることができる。次いで、融合タンパク質を、ＣＸＣＲ４を発現する細胞の培養物と接触させるか、またはｉｎ ｖｉｖｏでＣＸＣＲ４を発現する組織と適切な時間接触させ、その後に蛍光顕微鏡を用いて、構築物が細胞に透過したかどうかを決定することができる。細胞質における蛍光の存在は、蛍光タンパク質から得られた蛍光顕微鏡画像と既知の細胞質染色で得られたものとを比較することによってさらに調査することができる。
本発明のより一層好ましい実施形態において、ＣＸＣＲ４リガンドは、ＲＲＷＣＹＲＫＣＹＫＧＹＣＹＲＫＣＲ（配列番号２５）、Ｖ１ペプチド（配列番号２６）、ＣＸＣＬ１２ペプチド（配列番号２７）、ｖＣＣＬ２ペプチド（配列番号２８）、ＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号２９）、または配列番号１３２のペプチド等のそれらの機能的に同等の変異体からなる群から選択される。
配列ＲＲＷＣＹＲＫＣＹＫＧＹＣＹＲＫＣＲ（配列番号２５）は、Ｔ２２ペプチドのアミノ酸配列である。前記ペプチドは、タンパク質ポリフェムシンＩＩ（アメリカカブトガニ（Limulus polyphemus）からの血球破片から抽出された）に由来するペプチドに対応する。ｖＣＣＬ２は、ヒトヘルペスウイルス８によってコードされるヒトケモカインＣＣＬ２のホモログであるウイルスマクロファージ炎症性タンパク質－ＩＩに対応する。Ｖ１ペプチドは、ｖＣＣＬ２のＮ末端の残基１～２１に対応する。間質細胞由来因子１（ＳＤＦ１）としても知られるＣＸＣＬ１２、ＣＸＣモチーフケモカイン１２は、炎症誘発性メディエーターとして機能するケモカインファミリーのメンバーである。Liang, X. 2008. Chem. Biol. Drug. Des. 72:91-110に示されるように、４つのペプチドすべてがＣＸＣＲ４受容体と相互作用することが知られている。
ＥＰＩ－Ｘ４は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の残基４０８～４２３に対応する。また、ＣＸＣＲ４受容体に結合することも説明されている（Zirafi et al., 2015, Cell reports, 11:1-11）。１つの実施形態において、より高い受容体親和性および血清安定性を有する最適化されたＥＰＩ－Ｘ４タンデムバージョン（配列番号１３２）が用いられる。
一つの実施形態において、ポリカチオン性ペプチドは、
－配列ＲＲＸ１ＣＹＲＫＸ２ＰＹＲＸ３ＣＲ（配列番号４１）を有し、Ｘ１がＬ－３－（２－ナフチル）アラニン、Ｘ２がＤ－ＬｙｓおよびＸ３がＬ－シトルリンである、Ｔ１４０ペプチド、
－配列ＲＲＸ１ＣＹＸ２ＫＸ３ＰＹＲＸ４ＣＲ（配列番号４２）を有し、Ｘ１がＬ－３－（２－ナフチル）アラニン、Ｘ２がＬ－シトルリン、Ｘ３がｄＬｙｓおよびＸ４がＬ－シトルリンである、ＴＮ１４００３ペプチド、
－配列ＲＲＸ１ＣＹＥＫＸ２ＰＹＲＸ３ＣＲ（配列番号４３）を有し、Ｘ１がＬ－３－（２－ナフチル）アラニン、Ｘ２がＤ－シトルリンおよびＸ３がＬ－シトルリンである、ＴＣ１４０１２ペプチド、
－配列ＲＲＸ１ＣＹＸ２ＫＸ３ＰＹＲＸ４ＣＲ（配列番号４４）を有し、Ｘ１がＬ－３－（２－ナフチル）アラニン、Ｘ２がＬ－シトルリン、Ｘ３がＤ－ＧｌｕおよびＸ４がＬ－シトルリンである、ＴＥ１４０１１ペプチド、および
－配列ＲＲＸ１ＣＹＸ２ＫＸ３ＰＹＲＸ４ＣＲ（配列番号４５）を有し、Ｘ１がＬ－３－（２－ナフチル）アラニン、Ｘ２がＬ－シトルリン、Ｘ３がＤ－ＬｙｓおよびＸ４がＬ－シトルリンまたはその変異体であり、Ｎ末端のアルギニン残基がアセチル化されている、ＴＺ１４０１１ペプチド（Ａｃ－ＴＺ１４０１１として知られている）
からなる群から選択されるものである。
「機能的変異体」および「機能的に同等の変異体」という用語は交換可能であり、本明細書では、ＣＸＣＲ４に結合し、複合体を内在化する機能が実質的に維持されているという条件で、１つ以上のアミノ酸の改変、挿入および／または欠失によってＴ２２、Ｖ１、ＣＸＣＬ１２、ｖＣＣＬ２および／またはＥＰＩ－Ｘ４ペプチドに由来するすべてのペプチドとして理解される。
一つの実施形態において、カチオン性ポリペプチドの機能的に同等の変異体は、ヒトＴ２２、Ｖ１、ＣＸＣＬ１２、ｖＣＣＬ２および／またはＥＰＩ－Ｘ４ペプチドに関してある程度の同一性を示すものであり、それぞれの配列番号に対して少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を示すものである。２つのアミノ酸配列間の同一性の程度を決定する方法は、本発明の第１の態様において提供される。本発明のカチオン性ポリペプチドは、グリコシル化、アセチル化、イソプレニル化、ミリストイル化、タンパク質分解プロセシング等の翻訳後修飾を含み得る。
あるいは、カチオン性ポリペプチドの適切な機能的変異体は、１つ以上の位置において、上記のＴ２２、Ｖ１、ＣＸＣＬ１２、ｖＣＣＬ２および／またはＥＰＩ－Ｘ４ペプチドに存在するアミノ酸の保存的置換であるアミノ酸を含むものである。「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸を類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸に置換することによるものである。例えば、以下の６つのグループはそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。そのような保存的アミノ酸置換の選択は、当業者の技能の範囲内であり、例えば、Dordo et al. et al. [J. Mol. Biol, 1999, 217;721-739]およびTaylor et al. [J. Theor. Biol., 1986, 119:205-218]に記載されている。
所与のペプチドがその機能的に同等の変異体と見なすことができるかどうかを決定するための適切なアッセイは、例えば、以下のアッセイである：推定上のＴ２２、Ｖ１、ＣＸＣＬ１２、ｖＣＣＬ２またはＥＰＩ－Ｘ４ペプチドの変異体をインフレームでマーカーポリペプチド（例えば、蛍光タンパク質）と融合する。このような融合タンパク質は、ペプチドをコードする核酸と蛍光タンパク質をコードする核酸とがインフレームで融合され、適切な宿主細胞または生物において発現される組換え核酸を調製することによって得ることができる。次いで、融合タンパク質を、細胞ＣＸＣＲ４（例えば、ＨｅＬａ細胞）の培養物と適切な時間接触させ、その後に蛍光顕微鏡を用いて、構築物が細胞に透過したかどうかを決定することができる。ペプチドが対応するペプチドの機能的に同等の変異体である場合、マーカータンパク質は内在化され、細胞の細胞質における蛍光の存在が見えるようになる。さらに、機能的に同等の変異体の性能は、蛍光タンパク質から得られた蛍光顕微鏡画像と既知の細胞質染色（例えば、ＤＡＰＩ）で得られた画像とを比較することによって分析することができる。
（ｉｉ）アルギニンに富む配列
上述したように、アルギニンアミノ酸およびその残基は、生理的ｐＨで正電荷を示す。「アルギニンに富む配列」は、複数のアルギニン残基を含むポリペプチド配列を指すことが理解されよう。したがって、ポリペプチド配列は、その完全配列のアミノ酸残基の３３％、好ましくは４０％、好ましくは４５％、好ましくは５０％、好ましくは５５％、好ましくは６０％、好ましくは６５％、好ましくは７０％、好ましくは７５％、好ましくは８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より一層好ましくは９９％、さらにより一層好ましくは１００％をアルギニン残基として含み得る。アルギニンに富む配列の配列が、配列の１００％未満をアルギニン残基として含むときはいつでも、これらの残基は、互いにすべてが隣接（adjacent）または近接（contiguous）している必要はないことが理解されよう。
当業者は、１つ以上のアルギニン残基を有するポリペプチドは、アルギニン残基の正電荷からだけでなく、正に帯電した他のアミノ酸の正電荷からの結果として、生理的ｐＨにおけるポリペプチドの総正電荷が２以上である限り、ポリカチオン性ペプチドであることを認識するであろう。
本発明の実施形態において、本発明のポリカチオン性ペプチドは、アルギニンに富む配列である。
本発明の好ましい実施形態において、本発明のポリカチオン性ペプチドのアルギニンに富む配列は、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３からなる群から選択される。
（ｉｉｉ）ＧＷ－Ｈ１ペプチド
ＧＷ－Ｈ１ペプチドは、これまでにＣｈｅｎらによって説明されている［Chen, Y-L.S. et al. 2012. Peptides, 36:257-265］。ＧＷ－Ｈ１ペプチドはまず抗菌ペプチドとして選択されたが、細胞膜に結合し、細胞質に内在化し、真核細胞の核に移動する能力によっても特徴付けられる。細胞内に入ると、ＧＷ－Ｈ１はアポトーシスを誘導することができる。ＧＷ－Ｈ１は、両親媒性ヘリックスに折りたたまれることによってその細胞溶解活性を発揮することが提案されている［前出のＣｈｅｎら］。したがって、このペプチドは、細胞膜への結合とそれに続く透過からなる２つの連続したイベントによってその細胞溶解効果を発揮すると考えられている。
本発明の好ましい実施形態において、本発明のポリカチオン性ペプチドは、配列番号４６を有するＧＷ－Ｈ１ペプチドである。
（ｉｖ）ＣＤ４４リガンド
ＣＤ４４は、細胞－細胞相互作用および細胞－マトリックス相互作用、細胞の接着および遊走に関与する細胞表面膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ４４は、炎症や、癌等の疾患に関与している［Bajorath, J. 2000. Proteins. 39:103-111］。多くのアイソフォームが知られており、それらは細胞特異的に発現され、また特異的にグリコシル化されている。
したがって、「ＣＤ４４リガンド」は、ＣＤ４４に結合することができる分子である。ＣＤ４４は、細胞外マトリックスの構成要素であるヒアルロン酸の主要な表面受容体である、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチンのヘパリン結合ドメイン、オステオポンチン、セルグリシン、コラーゲン、ラミニン等の他のリガンドを有している。さらに、ＣＤ４４はメタロプロテイナーゼおよびセレクチンとも相互作用することができる。
本発明の実施形態において、本発明のポリカチオン性ペプチドは、ＣＤ４４リガンドである。本発明の好ましい実施形態において、ＣＤ４４リガンドは、Ａ５Ｇ２７（配列番号３４）およびＦＮＩ／ＩＩ／Ｖ（配列番号３５）からなる群から選択される。
ペプチドＦＮＩ／ＩＩ／Ｖは、フィブロネクチンのＨＢＦＮフラグメントＶに対応する。ペプチドＡ５Ｇ２７は、ラミニンのα５鎖のペプチドに対応する［Pesarrodona, M. et al. 2014. Int. J. of Pharmaceutics. 473:286-295］。
（ｖ）血液脳関門を通過することができるペプチド
脳の病状の治療的アプローチの開発に対する１つの主要な障害が血液脳関門（ＢＢＢ）であることは、当技術分野においてよく知られている。脳は、２つのバリアシステム：血液脳関門（ＢＢＢ）および血液脳脊髄液関門（ＢＣＳＦＢ）の存在によって、潜在的に有毒な物質から保護されている。ＢＢＢは、その表面積がＢＣＳＦＢの表面積の約５０００倍であることから、血清リガンドの取り込みの主要な経路であると考えられている。ＢＢＢを構成する脳内皮は、ＣＮＳの多くの障害に対する潜在的な薬物の使用に対する主要な障害を示す。原則として、小さな親油性分子のみがＢＢＢを通過、すなわち循環している全身の血液から脳に移動することができる。より大きなサイズまたはより高い疎水性を有する多くの薬物は、ＣＮＳ障害を治療するための動物研究において有望な結果を示している。
したがって、「血液脳関門を通過することができるペプチド」は、それ自体、およびそれが結合する任意の分子、好ましくはタンパク質を、血液の流れから中枢神経系に輸送することができるペプチドである。
ペプチド、β－カソモルフィン－５がＢＢＢを克服できることが、１９８３年に報告された［Ermisch, A. et al. 1983. J. of Neurochemistry. 41:1229-1233］。それ以来、ＢＢＢ透過特性を有する他の多くのペプチドが特定され、特性評価され、カタログ化され、Van Dorpe et al.によって報告されたように、２０１２年に包括的なデータベースが確立された［Van Dorpe, S. et al. 2012. Brain Struct. Funct. 217:687-718］。上述したデータベースにリストされているペプチドのほとんどは、本発明の複合体に適している。
本発明の実施形態において、本発明のポリカチオン性ペプチドは、血液脳関門を通過することができるペプチドである。本発明の好ましい実施形態において、血液脳関門を通過することができるペプチドは、Ｓｅｑ－１－７（配列番号３６）、Ｓｅｑ－１－８（配列番号３７）およびＡｎｇｉｏｐｅｐ－２－７（配列番号３８）からなる群から選択される。
（ｖｉ）細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）
「細胞透過性ペプチド」（ＣＰＰ）という用語は、分子カーゴ、特にそれらが含まれるタンパク質の細胞取り込みを促進することができる、典型的には長さが約５～６０アミノ酸残基のペプチドを指す。タンパク質は１つ以上のＣＰＰを示し得る。ＣＰＰはまた、脂質二重層、細胞膜、細胞小器官膜、小胞膜または細胞壁の１つ以上を横切る／通過する分子カーゴの移動または横断を容易にすることができると特徴付けることができる。本明細書において、ＣＰＰはポリカチオン性である。
本明細書で有用なＣＰＰの例、および一般的なＣＰＰのさらなる説明は、Schmidt et al.［2010. FEBS Lett. 584:1806-18l3］、Holm et al.［2006. Nature Protocols 1:1001-1005］、Yandek et al.［2007. Biophys. J. 92:2434-2444］、Morris et al.［2001. Nat. Biotechnol. 19:1173-1176］および米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号において説明されている。ＣＰＰはトランスポーターや受容体に依存せず、他の細胞成分の関与を必要とすることなく、ＣＰＰを含むタンパク質の脂質二重層を直接通過する輸送を促進する。
（ｖｉｉ）ヌクレオリン結合ペプチド
したがって、「ヌクレオリン結合ペプチド」は、細胞内のヌクレオリンタンパク質、好ましくはヌクレオリンの細胞表面発現画分に結合することができるペプチドである。
本発明の実施形態において、本発明のポリカチオン性ペプチドは、ヌクレオリン結合ペプチドである。
ＷＯ２０１１／０３１４７７Ａ２の国際特許出願公開は、本発明の複合体における使用に適したヌクレオリン結合ペプチドの例を多数提供している。
本発明の好ましい実施形態において、本発明のヌクレオリン結合ペプチドは、配列番号４７の配列のペプチドまたは配列番号４８の配列のペプチドである。
ＩＶ－Ｃ．複合体の第３のポリペプチド領域
特定の実施形態において、本発明の第６の態様の複合体のポリペプチドは、正に帯電したアミノ酸に富む領域である第３のポリペプチド領域をさらに含む。
正に帯電したアミノ酸に富む領域であり、複合体のポリペプチドに含まれる第３のポリペプチド領域は、「複合体の第３のポリペプチド」、「複合体の第３のポリペプチド領域」、「第３のポリペプチド領域」または「複合体のポリペプチドに含まれる第３のポリペプチド領域」とも呼ばれる。当業者に理解されるように、「複合体の第３のポリペプチド」、「複合体の第３のポリペプチド領域」または「複合体のポリペプチドに含まれる第３のポリペプチド領域」という表現は、「正に帯電したアミノ酸に富む領域」と交換可能である。
本明細書で用いられる「正に帯電したアミノ酸」、「正に帯電したアミノ酸に富む領域」または「正に帯電したアミノ酸に富む領域である第３のポリペプチド領域」という用語は、複数の正に帯電したアミノ酸を含むことを特徴とする、複合体の第２のポリペプチド領域とは異なる、複合体の第３のポリペプチドのポリペプチド配列を指す。また、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、正に帯電したアミノ酸のみによって形成されてもよく、またはｐＨ７において領域全体の正味電荷が正であるという条件で他のアミノ酸を含んでもよい。したがって、正に帯電したアミノ酸に富む領域配列は、その完全配列のアミノ酸残基の３３％、好ましくは４０％、好ましくは４５％、好ましくは５０％、好ましくは５５％、好ましくは６０％、好ましくは６５％、好ましくは７０％、好ましくは７５％、好ましくは８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より一層好ましくは９９％、さらにより一層好ましくは１００％を正に帯電したアミノ酸残基として含み得る。
正に帯電したアミノ酸に富む領域は、１つのタイプの正に帯電したアミノ酸のみを含んでもよく、または複数のタイプの正に帯電したアミノ酸を含んでもよい。一つの実施形態において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、ポリヒスチジン領域である。一つの実施形態において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、ポリアルギニン領域である。一つの実施形態において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、ポリヒスチジン領域である。一つの実施形態において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、リジンおよびアルギニン残基を含む。一つの実施形態において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、リジンおよびヒスチジン残基を含む。一つの実施形態において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、アルギニンおよびヒスチジン残基を含む。一つの実施形態において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、リジン、アルギニンおよびヒスチジン残基を含む。
いくつかの実施形態において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個または少なくとも１５個の正に帯電したアミノ酸残基を含み、正に帯電したアミノ酸は、ヒスチジン、リジン、アルギニンまたはそれらの組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、１００個未満、９０個未満、８０個未満、７０個未満、６０個未満、５０個未満、４０個未満、３０個未満、２９個未満、２８個未満、２７個未満、２６個未満、２５個未満、２４個未満、２３個未満、２２個未満、２１個未満、２０個未満、１９個未満、１８個未満、１７個未満、１６個未満、１５個未満、１４個未満、１３個未満、１２個未満、１１個未満、１０個未満またはさらに少ない正に帯電したアミノ酸残基を含み、正に帯電したアミノ酸は、ヒスチジン、リジン、アルギニンまたはそれらの組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、２～５０個のアミノ酸、２～４０個のアミノ酸、２～３０個のアミノ酸、２～２５個のアミノ酸、２～２０個のアミノ酸、２～１０個のアミノ酸または２～８個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、３～５０個のアミノ酸、３～４０個のアミノ酸、３～３０個のアミノ酸、３～２５個のアミノ酸、３～２０個のアミノ酸、３～１０個のアミノ酸または３～８個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、４～５０個のアミノ酸、４～４０個のアミノ酸、４～３０個のアミノ酸、４～２５個のアミノ酸、４～２０個のアミノ酸、４～１０個のアミノ酸または４～８個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、５～５０個のアミノ酸、５～４０個のアミノ酸、５～３０個のアミノ酸、５～２５個のアミノ酸、５～２０個のアミノ酸、５～５個のアミノ酸、５～１０個のアミノ酸または５～８個のアミノ酸を含む。
本発明の実施形態において、本発明の複合体の正に帯電したアミノ酸に富む領域は、ポリヒスチジン領域である。本発明の好ましい実施形態において、ポリヒスチジン領域は、２～１０個、好ましくは６個の隣接するヒスチジン残基を含む。
本発明の実施形態において、本発明の複合体の正に帯電したアミノ酸に富む領域は、ポリアルギニン領域である。本発明の好ましい実施形態において、ポリアルギニン領域は、２～１０個、好ましくは６個の隣接するアルギニン残基を含む。
本発明の実施形態において、本発明の融合タンパク質の正に帯電したアミノ酸に富む領域は、ポリリジン領域である。本発明の好ましい実施形態において、ポリリジン領域は、２～１０個、好ましくは６個の隣接するポリリジン残基を含む。
特定の実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、ＲＫＲＫＲＫ（配列番号７７）、ＲＲＲＲＲＲ（配列番号７８）、ＫＫＫＫＫＫ（配列番号７９）、ＨＨＨＨＨＨ（配列番号８０）、ＲＨＲＨＲＨ（配列番号８１）、ＲＫＲＫＲＫＲＫ（配列番号８２）、ＲＫＲＨＲＫ（配列番号８３）、ＲＫＲＨＲＨ（配列番号８４）、ＲＨＲＨＲＨ（配列番号８５）またはＲＫＲＫＲＫＲ（配列番号８６）である。
ＩＶ－Ｄ．複合体のポリペプチドの要素および連結要素の相対位置
本発明の複合体のポリペプチドの異なる要素（複合体の第１、第２および第３のポリペプチド）は、ポリペプチドが好ましくはポリカチオン性ペプチドである第２のポリペプチド、および第３のポリペプチド（または正に帯電したアミノ酸に富む領域）が複合体の任意の位置で機能し、第１のポリペプチドが完全にまたは部分的に機能し続ける（すなわち、ニドゲン－１のＧ２ドメインの構造が実質的に維持される）限り、任意の相対的位置に配置され得る。
本明細書で用いられる場合、ポリペプチドの「Ｎ末端（N-terminal end）」、「Ｎ末端（N-terminus）」および「アミノ末端」という用語は区別されない。同様に、「Ｃ末端（C-terminal end）」、「Ｃ末端（C-terminus）」および「カルボキシ末端」という用語は同等と見なされる。これらの用語は、タンパク質によって構成されるポリペプチド鎖の末端におけるアミノ酸の遊離部分に関し、当業者にとって一般的な使用法である。
したがって、本発明の実施形態において、複合体の第２のポリペプチドが複合体のポリペプチドのＮ末端に位置し、ポリペプチドの正に帯電したアミノ酸に富む領域（すなわち、複合体の第３のポリペプチド）がポリペプチドのＣ末端に位置する。本発明の別の実施形態において、複合体のポリペプチドの正に帯電したアミノ酸に富む領域がポリペプチドのＮ末端に位置し、第２のポリペプチド領域がポリペプチドのＣ末端に位置する。本発明の別の実施形態において、第１のポリペプチド領域が複合体のポリペプチドのＣ末端またはＮ末端のいずれかに位置し、第２のポリペプチドがポリペプチドの中間位置にあり、正に帯電したアミノ酸に富む領域が第１のポリペプチド領域の反対側のポリペプチドの末端にあるか、または正に帯電したアミノ酸に富む領域がポリペプチドの中央位置にあり、第２のポリペプチドが第１のポリペプチド領域の反対側のポリペプチドの末端に位置し得る。
したがって、本発明の複合体のポリペプチドの要素の相対的な順序は：
・Ｎ－第２のポリペプチド領域－第１のポリペプチド領域－正に帯電したアミノ酸に富む領域－Ｃ；
・Ｎ－正に帯電したアミノ酸に富む領域－第１のポリペプチド領域－第２のポリペプチド領域－Ｃ；
・Ｎ－第２のポリペプチド領域－正に帯電したアミノ酸に富む領域－第１のポリペプチド領域－Ｃ；
・Ｎ－正に帯電したアミノ酸に富む領域－第２のポリペプチド領域－第１のポリペプチド領域－Ｃ；
・Ｎ－第１ポリペプチド領域－第２のポリペプチド領域－正に帯電したアミノ酸に富む領域－Ｃ；または
・Ｎ－第１のポリペプチド領域－正に帯電したアミノ酸に富む領域－第２のポリペプチド領域－Ｃ
であり得る。
特定の実施形態において、本発明の第６の態様の複合体のポリペプチド中の要素の順序は、上記に示されたもののいずれかである。
好ましい実施形態において、本発明の第６の態様の複合体のポリペプチド中の要素の順序は、Ｎ－第２のポリペプチド領域－第１のポリペプチド領域－正に帯電したアミノ酸に富む領域－Ｃである。
「Ｎ末端」および「Ｃ末端」という用語は、構成要素が末端から末端まで直接結合する必要があることを意味するものではなく、いずれかの構成要素の末端または構成要素間に挿入されるリンカー／スペーサー等の追加の要素の存在によらず、構成要素が相対的な位置を維持することを意味する。
したがって、本発明の複合体のポリペプチドは、上述した要素（（１）第２のポリペプチド領域、（２）第１のポリペプチド領域および（３）正に帯電したアミノ酸に富む領域）を含み、これらは末端間で結合してもよく、それらの間に挿入され、好ましくはペプチド結合によって連結される１つ以上の任意のペプチドまたはポリペプチドである「リンカー」または「スペーサー」を含んでもよい。
本発明によれば、スペーサーまたはリンカーのアミノ酸配列は、構成要素（１）と（２）の間、および構成要素（２）と（３）との間のヒンジ領域として作用し、ペプチドのスペーサーまたはリンカーの存在によって構成要素（１）、（２）および（３）のいずれの機能も変化させない。この意味で、本発明の好ましい中間アミノ酸配列は、この動きを可能にする構造的延性によって特徴付けられるヒンジ領域である。特定の実施形態において、中間アミノ酸配列は柔軟なリンカーである。リンカー領域の効果は、構成要素（１）と（２）との間および（２）と（３）との間にスペースを提供することである。したがって、構成要素（１）、（２）または（３）の２次構造および３次構造は、他のいずれかの存在によって影響を受けないことが保証される。スペーサーはポリペプチドの性質のものである。リンカーペプチドは、好ましくは、少なくとも２個のアミノ酸、少なくとも３個のアミノ酸、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも６０個のアミノ酸、少なくとも７０個のアミノ酸、少なくとも８０個のアミノ酸、少なくとも９０個のアミノ酸または約１００個のアミノ酸を含む。
スペーサーまたはリンカーは、共有結合によって、好ましくはペプチド結合によって、本発明の複合体のポリペプチドの２つの構成要素に隣接する構成要素に結合することができ；また、好ましくはスペーサーは本質的に機能的であり、かつ／またはタンパク質分解性切断を受ける傾向がなく、かつ／またはシステイン残基を含まない。同様に、スペーサーの三次元構造は、好ましくは直鎖状または実質的に直鎖状である。
スペーサーまたはリンカーペプチドの好ましい例としては、結合ペプチドの機能を実質的に低下させることなく、または少なくとも結合ペプチドの１つの機能を実質的に低下させることなくタンパク質を結合するために用いられるものが挙げられる。より好ましくは、ペプチドを結合するために用いられるスペーサーまたはリンカーは、コイルドコイル構造を含む。
リンカーペプチドの好ましい例は、グリシン、セリン、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択される２つ以上のアミノ酸を含む。柔軟なリンカーの好ましい例は、ポリグリシンリンカーである。リンカー／スペーサー配列として考えられる例としては、ＧＧＳＳＲＳＳ（配列番号３９）、ＧＧＳＳＲＳＳＳ（配列番号７６）、ＳＧＧＴＳＧＳＴＳＧＴＧＳＴ（配列番号４９）、ＡＧＳＳＴＧＳＳＴＧＰＧＳＴＴ（配列番号５０）またはＧＧＳＧＧＡＰ（配列番号５１）が挙げられる。これらの配列は、設計されたコイルドコイルと他のタンパク質ドメインとを結合するために用いられる［Muller, K.M., Arndt, K.M. and Alber, T., Meth. Enzymology, 2000, 328: 261-281］。適切なリンカーのさらなる非限定的な例は、アミノ酸配列ＧＧＧＶＥＧＧＧ（配列番号５２）、コイルドコイルによる二量体化抗体の生成に用いられるマウスＩｇＧ３の上部ヒンジ領域の１０アミノ酸残基の配列（ＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳ、配列番号５３）［Pack, P. and Pluckthun, A., 1992, Biochemistry 31:1579-1584］、配列ＡＰＡＥＴＫＡＥＰＭＴ（配列番号５４）のペプチド、配列ＧＡＰのペプチド、配列ＡＡＡのペプチドおよび配列ＡＡＡＬＥ（配列番号５５）のペプチドを含む。別の好ましい実施形態において、リンカーはＧＧＳＳＲＳＳ（配列番号３９）である。
あるいは、本発明の複合体のポリペプチドの構成要素は、その配列がプロテアーゼの切断標的を含み、任意の成分の分離を可能にするペプチドによって接続され得る。本発明の複合体のポリペプチドへの組み込みに適したプロテアーゼ切断部位としては、エンテロキナーゼ（切断部位ＤＤＤＤＫ、配列番号５６）、第Ｘａ因子（切断部位ＩＥＤＧＲ、配列番号５７）、トロンビン（切断部位ＬＶＰＲＧＳ、配列番号５８）、ＴＥＶプロテアーゼ（切断部位ＥＮＬＹＦＱＧ、配列番号５９）、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（切断部位ＬＥＶＬＦＱＧＰ、配列番号６０）、インテイン等が挙げられる。
好ましい実施形態において、Ｎ末端位置のポリペプチドは、リンカー、好ましくは上記のリンカーの例のいずれかから選択されるリンカーによって、複合体のポリペプチドの中間位置のポリペプチドと接続する。別の好ましい実施形態において、中間位置のポリペプチドは、リンカー、好ましくは上記のリンカーの例のいずれかから選択されるリンカーによって、複合体のポリペプチドのＣ末端位置のポリペプチドと接続する。したがって、本発明の一つの実施形態において、第２のポリペプチドは、リンカーを介して第１のポリペプチド領域と接続される。本発明の別の実施形態において、第１のポリペプチド領域は、リンカーを介して正に帯電したアミノ酸に富む領域と接続される。本発明のさらに別の実施形態において、第２のポリペプチドは、リンカーを介して第１のポリペプチド領域と接続され、第１のポリペプチド領域もまた、リンカーを介して正に帯電したアミノ酸に富む領域と結合される。
したがって、特定の実施形態において、第２のポリペプチド領域は、第１のペプチドリンカーを介して第１のポリペプチド領域と接続され、かつ／または第１のポリペプチド領域は、第２のペプチドリンカーを介して第３のポリペプチド領域と接続される。特定の実施形態において、第１のペプチドリンカーは、ＧＧＳＳＲＳＳ配列（配列番号３９）、ＧＧＳＳＲＳＳＳ（配列番号７６）またはＧＧＧＮＳ配列（配列番号４０）を含む。好ましい実施形態において、第１のペプチドリンカーは、ＧＧＳＳＲＳＳ配列（配列番号３９）を含む。別の好ましい実施形態において、第１のペプチドリンカーは、ＧＧＳＳＲＳＳ（配列番号３９）を含む。
当業者に理解されるように、第２のポリペプチドと第１のポリペプチド領域とを接続するリンカーと、第１のポリペプチド領域と正に帯電したアミノ酸に富む領域とを接続するリンカーとは、リンカーの存在および／または配列が第２のポリペプチド、第１のポリペプチド領域および／または正に帯電したアミノ酸に富む領域の機能的変化（限定されないが、例えば、複合体のポリペプチドの二次もしくは三次構造の改変、またはジスルフィド結合の形成に起因するもの）をもたらさないという上述した制限内において、同じ配列または異なる配列を含み得る。
複合体のポリペプチドの要素のＮ末端からＣ末端までの相対位置に関する上述の留意事項は、それらの数またはどの要素が間に配置されているかに関係なく、それらの間にリンカーが存在する場合にも当てはまる。したがって、要素の可能な組み合わせおよび相対的な順序は以下の通りである（要素についての上記の番号付けは保持される：（１）第２のポリペプチド、（２）第１のポリペプチド、（３）正に帯電したアミノ酸に富む領域）：
・Ｎ－（１）－（２）－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－（２）－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－（２）－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－（２）－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（３）－（２）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－リンカー－（２）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－（２）－リンカー－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－リンカー－（２）－リンカー－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－（１）－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－リンカー－（１）－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－（１）－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－リンカー－（１）－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－（３）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－リンカー－（３）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－（３）－リンカー－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－リンカー－（３）－リンカー－（１）－Ｃ
・Ｎ－（１）－（３）－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－（３）－リンカー－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－（３）－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－（３）－リンカー－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－（１）－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－リンカー－（１）－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－（１）－リンカー－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－リンカー－（１）－リンカー－（２）－Ｃ。
本発明の好ましい実施形態において、本発明の複合体のポリペプチドのリンカーは、配列ＧＧＳＳＲＳＳ（配列番号３９）または配列ＧＧＧＮＳ（配列番号４０）を含む。
好ましい実施形態において、Ｎ末端位置のポリペプチドは、プロテアーゼ切断部位を介して、好ましくは上記で提供されるプロテアーゼ切断部位の例のいずれかから選択されるプロテアーゼ切断部位を介して、複合体のポリペプチドの中間位置のポリペプチドと接続する。別の好ましい実施形態において、中間位置のポリペプチドは、プロテアーゼ切断部位を介して、好ましくは上記で提供される切断部位の例のいずれかからのプロテアーゼ切断部位を介して、複合体のＣ末端位置のポリペプチドと接続する。
別の実施形態において、第２のポリペプチドは、プロテアーゼ切断部位を介して第１のポリペプチド領域と接続される。本発明の別の実施形態において、第１のポリペプチド領域は、プロテアーゼ切断部位を介して正に帯電したアミノ酸に富む領域と接続される。本発明のさらに別の実施形態において、第２のポリペプチドは、プロテアーゼ切断部位を介して第１のポリペプチド領域と接続され、第１のポリペプチド領域もまた、プロテアーゼ切断部位を介して正に帯電したアミノ酸に富む領域と結合される。
当業者に理解されるように、第２のポリペプチドと第１のポリペプチド領域とを接続するプロテアーゼ切断部位と、第１のポリペプチド領域と正に帯電したアミノ酸に富む領域とを接続するプロテアーゼ切断部位とは、プロテアーゼ切断部位の存在および／または配列によって第２のポリペプチド、第１のポリペプチド領域および／または正に帯電したアミノ酸に富む領域の機能的変化（限定されないが、例えば、複合体のポリペプチドの二次もしくは三次構造の改変、またはジスルフィド結合の形成に起因するもの）をもたらさないという上述した制限内において、同じ配列または異なる配列を含み得る。
複合体のポリペプチドの要素のＮ末端からＣ末端までの相対位置に関する上述の留意事項は、それらの数またはどの要素が間に配置されているかに関係なく、それらの間にプロテアーゼ切断部位が存在する場合にも当てはまる。したがって、要素の可能な組み合わせおよび相対的な順序は以下の通りである（要素についての上記の番号付けは保持される：（１）第２のポリペプチド、（２）第１のポリペプチド、（３）正に帯電したアミノ酸に富む領域）：
・Ｎ－（１）－（２）－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－プロテアーゼ切断部位－（２）－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－（２）－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－プロテアーゼ切断部位－（２）－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃ
・Ｎ－（３）－（２）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－プロテアーゼ切断部位－（２）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－（２）－プロテアーゼ切断部位－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－プロテアーゼ切断部位－（２）－プロテアーゼ切断部位－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－（１）－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－プロテアーゼ切断部位－（１）－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－（１）－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－プロテアーゼ切断部位－（１）－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－（３）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－プロテアーゼ切断部位－（３）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－（３）－プロテアーゼ切断部位－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－プロテアーゼ切断部位－（３）－プロテアーゼ切断部位－（１）－Ｃ
・Ｎ－（１）－（３）－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－（３）－プロテアーゼ切断部位－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－プロテアーゼ切断部位－（３）－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－プロテアーゼ切断部位－（３）－プロテアーゼ切断部位－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－（１）－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－プロテアーゼ切断部位－（１）－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－（１）－プロテアーゼ切断部位－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－プロテアーゼ切断部位－（１）－プロテアーゼ切断部位－（２）－Ｃ。
特定の実施形態において、複合体は、複合体の２つのポリペプチドを接続するリンカー、および複合体の他の２つのポリペプチドを接続するプロテアーゼ切断部位を含む。この場合、複合体の要素のＮ末端からＣ末端までの相対位置に関する上述の留意事項は、リンカーおよびそれらの間のプロテアーゼ切断部位の存在下でも、それらの数またはどの要素が間に配置されているかに関係なく適用される。したがって、要素の可能な組み合わせおよび相対的な順序は以下の通りである（要素についての上記の番号付けは保持される：（１）第２のポリペプチド、（２）第１のポリペプチド、（３）正に帯電したアミノ酸に富む領域）：
・Ｎ－（１）－リンカー－（２）－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－プロテアーゼ切断部位－（２）－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－（２）－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－プロテアーゼ切断部位－（２）－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－リンカー－（１）－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－プロテアーゼ切断部位－（１）－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－リンカー－（３）－プロテアーゼ切断部位－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－プロテアーゼ切断部位－（３）－リンカー－（１）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－（３）－プロテアーゼ切断部位－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－プロテアーゼ切断部位－（３）－リンカー－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－リンカー－（１）－プロテアーゼ切断部位－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－プロテアーゼ切断部位－（１）－リンカー－（２）－Ｃ。
好ましい実施形態において、複合体のポリペプチドにおける要素の組み合わせおよび相対的順な序は、Ｎ－（１）－リンカー－（２）－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃである。したがって、好ましい実施形態において、第２のポリペプチドは、リンカーを介して第１のポリペプチド領域に接続され、第１のポリペプチドは、プロテアーゼ切断部位を介して第３のポリペプチド領域に接続される。
別の好ましい実施形態において、リンカーは、配列ＧＧＳＳＲＳＳ（配列番号３９）、ＧＧＳＳＲＳＳＳ（配列番号７６）または配列ＧＧＧＮＳ（配列番号４０）、好ましくは配列ＧＧＳＳＲＳＳ（配列番号３９）を含む。
好ましい実施形態において。本発明の第６の態様の複合体は、以下の要素を含むポリペプチドを含む：
Figure 2023509004000004
別の特定の実施形態において、正に帯電したアミノ酸、好ましくはアルギニンまたはリジン、より好ましくはリジンが、第６の態様の複合体の第１のポリペプチド領域と第３のポリペプチド領域との間に含まれる。
別の好ましい実施形態において、本発明の複合体の一部を形成するポリペプチドは、配列番号６１のアミノ酸配列を含むか、実質的に含むかまたはそれからなり、任意にアミノ末端にメチオニンを含む。
いくつかの実施形態において、本発明の複合体の一部を形成するポリペプチドは、配列番号６１または１０６～１２４のいずれかのアミノ酸配列を含むか、実質的に含むかまたはそれからなり、任意にアミノ末端にメチオニンを含む、
特定の実施形態において、本発明の第６の態様の複合体の目的の剤は、治療薬または造影剤である。
ＩＶ－Ｅ．目的の剤
特定の実施形態において、本発明の第６の態様の複合体の目的の剤は、治療薬または造影剤である。
ＩＶ－Ｅ．１ 治療薬
本明細書で用いられる「治療薬」という用語は、化学構造の制限なしに、状態、障害または疾患の治療（therapy）および／または処置（treatment）に適した任意の化合物を指す。
治療薬の性質は、それが複合体中で活性を維持するか、または細胞の内部に送達された場合に活性化され得るものであれば、本発明を特に限定するものではない。したがって、細胞の内部に送達された場合に治療薬が活性を示すか、または複合体化されていない治療薬の少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％またはそれ未満の活性を示すという条件で、任意の治療薬を複合体に用いることができる。あるいは、本発明の目的は、治療薬の選択性を高め、そのオフターゲット効果を低減することによって治療薬の作用を促進することであるため、複合体のポリペプチドに結合された治療薬の効果は相乗的であり得、特定の治療薬についてすでに知られているパラメータ化された値を超え得ると考えられる。したがって、本発明の複合体のポリペプチドに結合された治療薬のいくつかの実施形態はまた、治療薬単独の場合の機能の少なくとも１０１％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、少なくとも１５０％、少なくとも１７５％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、５００％、少なくとも１０００％またはそれ以上を示すことが意図される。
本発明の実施形態において、本発明の複合体のポリペプチドに結合された治療薬は、
（ｉ）化学療法剤、
（ｉｉ）細胞毒性ポリペプチド、
（ｉｉｉ）抗血管新生ポリペプチド、
（ｉｖ）腫瘍抑制遺伝子によってコードされるポリペプチド、
（ｖ）アポトーシス促進性ポリペプチド、
（ｖｉ）抗転移活性を有するポリペプチド、
（ｖｉｉ）腫瘍に対する免疫応答を活性化することができるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、
（ｖｉｉｉ）抗血管新生分子、および
（ｉｘ）毒素
からなる群から選択される。
特定の実施形態において、複合体のポリペプチドは複数の治療薬と結合され、該複数の治療薬は同じであるかまたは異なる。
（ｉ）化学療法剤
特定の実施形態において、治療薬は化学療法剤である。
「化学療法剤」という用語は、抗癌剤を指すことが理解されよう。
本明細書で用いられる場合、抗癌剤は、例え短期であっても、癌に関連する症状の全部または一部を阻害することを含む、癌の発生または進行を少なくとも部分的に阻害する薬剤である。
いくつかの抗癌剤はＤＮＡ損傷剤として分類することができ、それらとしては、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド、ランプトテシン、トポテカン、テニポシド、ミトキサントロン）、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、シスプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イフォスファミド、メルファラン、コランブシル、ブスルファン、チオテパ、カルムスチン、ロムスチン、カルボプラチン、ダカルバジン、プロカルバジン）、ＤＮＡ鎖切断誘導剤（例えば、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトマイシンＣ）、抗微小管剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン）、抗代謝剤（例えば、シタラビン、メトトレキサート、ヒドロキシ尿素、５－フルオロウラシル、フロクスウリジン、６－チオグアニン、６－メルカプトプリン、フルダラビン、ペントスタチン、クロロデオキシアデノシン）、アントラサイクリン、ビンカアルカロイドおよびエピポドフィロトキシンが挙げられる。
抗癌剤のさらなる例としては、限定されないが、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バティマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビザントレン塩酸塩；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；ブレオマイシン硫酸塩；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ）；ブレキナールナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベタイマー；カルボプラチン（プラチナ含有レジメン）；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン（プラチナ含有レジメン）；クラドリビン；クリスナトールメシル酸塩；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；ジアジクオン；ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）；ドキソルビシン；ドロロキシフェン；ドロモスタノロン；ドゥアゾマイシン；エダトレキサート；エフロルニチン；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；エピルビシン；エルブロゾール；エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ）、エソルビシン；エストラムスチン；エタニダゾール；エトポシド；エトプリン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；フルダラビン；５－フルオロウラシル；フルロシタビン；フォスキドン；フォストリエシン；ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ）、ゲムシタビン；ヒドロキシ尿素；イダルビシン；イフォスファミド；イルモフォシン；イマチニブメシル酸塩（ＧＬＥＥＶＡＣ）；インターフェロンα－２ａ；インターフェロンα－２ｂ；インターフェロンα－ｎｌ；インターフェロンα－ｎ３；インターフェロンβ－Ｉａ；インターフェロンγ－Ｉｂ；イプロプラチン；イリノテカン；ランレオチド；レナリドマイド（ＲＥＶＬＬＭ１Ｄ、ＲＥＶＩＭＩＤ）；レトロゾール；リュープロリド；リアロゾール；ロメトレキソール；ロムスチン；ロソキサントロン；マソプロコール；マイタンシン；メクロレタミン；メゲストロール；メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトプリン；メトウレデパ；ミチンドマイド；マイトカルシン；マイトクロミン；マイトギリン；マイトマルシン；マイトマイシン；マイトスパー；マイトタン；ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペメトレキセド（ＡＬＩＭＴＡ）、ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペントモン；ペプロマイシン；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピリトレキシム；イセチオネート；ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマー；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン；ピューロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；セムスチン；シムトラゼン；シトグルシド；スパルフォセート；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌール；タリソマイシン；タムスロシン；タキソール；タキソテール；テコガラン；テガフール；テロキサントロン；テモポルフィン；テモゾロミド（ＴＥＭＯＤＡＲ）；テニポシド；テロキシロン；テストトラクトン；サリドマイド（ＴＨＡＬＯＭＩＤ）およびその誘導体；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トポテカン；トレミフェン；トレストロン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；ツブロゾール；ウラシル；マスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン；ビンクリスチン；ビンデシン；ビンエピジン；ビングリシネート；ビンロイロシン；ビノレルビン；ビンロシジン；ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシンが挙げられる。
一つの実施形態において、抗癌剤は、数単位の抗癌分子を含むオリゴマーとして提供される。一つの実施形態において、抗癌剤は、いくつかのフロクスウリジン分子を含むフロクスウリジンのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。フロクスウリジンのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個またはそれ以上のフロクスウリジン分子を含む。好ましい実施形態において、フロクスウリジンのポリヌクレオチドは、フロクスウリジンのペンタヌクレオチド、すなわち５個のフロクスウリジン分子を含むオリゴヌクレオチドである。
抗癌剤は、限定されないが、チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、ＭＡＰキナーゼ阻害剤またはＥＧＦＲ阻害剤を含む酵素阻害剤であってもよい。チロシンキナーゼ阻害剤は、限定されないが、ゲニステイン（４’，５，７－トリヒドロキシイソフラボン）、チルホスチン２５（３，４，５－トリヒドロキシフェニル），メチレン］－プロパンジニトリル、ヘルビマイシンＡ、ダイゼイン（４’，７－ジヒドロキシイソフラボン）、ＡＧ－１２６、トランス－１－（３’－カルボキシ－４’－ヒドロキシフェニル）－２－（２’’，５’’－ジヒドロキシフェニル）エタンまたはＨＤＢＡ（２－ヒドロキシ５－（２，５－ジヒドロキシベンジルアミノ）－２－ヒドロキシ安息香酸であり得る。ＣＤＫ阻害剤は、限定されないが、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５７、ｐｌ５、ｐｌ６、ｐｌ８またはｐｌ９であり得る。ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、ＫＹ１２４２０（Ｃ２３Ｈ２４Ｏ８）、ＣＮＩ－１４９３、ＰＤ９８０５９または４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－メチルスルフィニルフェニル）－５－（４－ピリジル）１Ｈ－イミダゾールであり得る。ＥＧＦＲ阻害剤は、限定されないが、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ）、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ）、ＷＨＩ－Ｐ９７（キナゾリン誘導体）、ＬＦＭ－Ａ１２（レフルノミド代謝物類似体）、ＡＢＸ－ＥＧＦ、ラパチニブ、カネルチニブ、ＺＤ－６４７４（ＺＡＣＴＩＭＡ）、ＡＥＥ７８８およびＡＧ１４５８であり得る。
抗癌剤は、限定されないが、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ）、ペガプタニブ（ＭＡＣＵＧＥＮ）、ソラフェニブ、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ）、バタラニブ、ＺＤ－６４７４（ＺＡＣＴＩＭＡ）、アネコルタブ（ＲＥＴＡＡＮＥ）、スクアラミン乳酸塩およびセマホリンを含むＶＥＧＦ阻害剤であり得る。抗癌剤は、限定されないが、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病に適応）、ゲムツズマブ（ＭＹＬＯＴＡＲＧ、ｈＰ６７．６、抗ＣＤ３３、急性骨髄性白血病等の白血病に適応）、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ）、トシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ、抗ＣＤ２０、Ｂ細胞悪性腫瘍に適応）、ＭＤＸ－２１０（ＨＥＲ－２／ｎｅｕ腫瘍遺伝子タンパク質産物および免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＩ型Ｆｃ受容体（ＦｃγＲＩ）に同時に結合する二重特異性抗体）、オレゴボマブ（ＯＶＡＲＥＸ、卵巣癌に適応）、エドレコロマブ（ＰＡＮＯＲＥＸ）、ダクリズマブ（ＺＥＮＡＰＡＸ）、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ、ＲＳＶ感染等の呼吸器疾患に適応）、イブリツモマブチウキセタン（ゼバリン、非ホジキンリンパ腫に適応）、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ）、ＭＤＸ－４４７、ＭＤＸ－２２、ＭＤＸ－２２０（抗ＴＡＧ－７２）、Ｉ０Ｒ－Ｃ５、１０Ｒ－Ｔ６（抗ＣＤ１）、ＩＯＲ ＥＧＦ／Ｒ３、セロゴバブ（ＯＮＣＯＳＣＩＮＴ ＯＶ １０３）、エプラツズマブ（ＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ）、ペムツモマブ（ＴＨＥＲＡＧＹＮ）およびグリオマブ－Ｈ（脳腫瘍、黒色腫に適応）を含む抗体または抗体フラグメントであり得る。
本発明の特定の実施形態において、血管新生阻害剤として作用するタンパク質は、腫瘍を標的とすることが意図されている。これらの薬物としては、上記の抗血管新生ポリペプチドに加えて、マリマスタット；ＡＧ３３４０；ＣＯＬ－３、ＢＭＳ－２７５２９１、サリドマイド、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、２－メトキシエストラジオール、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭｌＯｌ、ペントサンポリサルフェート、アンジオポエチン２（レジェネロン）、ヘルビマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチンフラグメント、リノミド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニスタイン、ＴＮＰ４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン、アンジオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ－１４７０、血小板第４因子またはミノサイクリンが挙げられる。
他の適切な活性剤は、ＤＮＡ切断剤である。方法の実施に用いられる複合体に細胞毒素として含めるのに適したＤＮＡ切断剤の例としては、限定されないが、アントラキノン－オリゴピロール－カルボキサミド、ベンズイミダゾール、レイナマイシン；ダイネマイシンＡ；エンジイン；および生物学的に活性なそれらの類似体または誘導体（すなわち、実質的に同等の生物学的活性を有するもの）が挙げられる。例えば、Islam et al., J. Med. Chem. 34 2954-61, 1991；Skibo et al., J. Med. Chem. 37:78-92, 1994；Behroozi et al., Biochemistry 35:1568-74, 1996；Helissey et al., Anticancer Drug Res. 11:527-51, 1996；Unno et al., Chem. Pharm. Bull. 45:125-33, 1997；Unno et al., Bioorg. Med. Chem., 5:903-19, 1997；Unno et al., Bioorg. Med. Chem., 5: 883-901, 1997；およびXu et al., Biochemistry 37:1890-7, 1998)に既知の類似体および誘導体が開示されている.他の例としては、限定されないが、エンジインキノンイミン（米国特許第５，６２２，９５８号）；２，２ｒ－ビス（２－アミノエチル）－４－４’－ビチアゾール［Lee et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 40:151-7, 1996］；エピリチシン－サレン．銅複合体［Routier et al., Bioconjug. Chem., 8: 789-92, 1997］が挙げられる。
上述した化学療法剤のいくつかは、代謝拮抗剤として共通のカテゴリーにまとめることができる。本明細書で用いられる「代謝拮抗剤」は、正常な代謝の一部である代謝物の利用を阻害する化合物を指す。代謝拮抗剤は、葉酸の利用を妨げる葉酸拮抗剤のように、それらが干渉する代謝物と構造が類似していることがよくある。代謝拮抗剤の非限定的な例としては、以下の化合物が挙げられる：ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルムスチン、カルボプラチン、クロロデオキシアデノシン、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、プロカルバジン、ＳＮ－３８、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビン。
特定の実施形態において、抗癌剤は代謝拮抗剤である。別の特定の実施形態において、代謝拮抗剤は、ピリミジン類似体またはそのオリゴマー形態である。別の特定の実施形態において、ピリミジン類似体は、フロクスウリジンまたはその五量体形態である。
本明細書で用いられる「ピリミジン類似体」という用語は、ピリミジンの構造を模倣するヌクレオシド類似体代謝拮抗剤を指す。ピリミジン類似体は核酸合成を阻害する。それらの抗増殖効果は、ＤＮＡへの取り込みによって達成され、鎖の終結とＤＮＡ合成の阻害を引き起こす。それらはまた、ＤＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオチドレダクターゼ等の核酸合成に関与する酵素を阻害し得る。ピリミジン類似体の非限定的な例としては、アザシチジン、６－アザウラシル、シタラビン、デシタビン、ゲムシタビン、トロキサシタビン、フロクスウリジン、フルオロウラシル、カペシタビン、テガフールウラシルが挙げられる。
本明細書で用いられる「フロクスウリジン」という用語は、代謝拮抗剤として分類される抗癌剤を指し、これはデオキシウリジンとして分類されるピリミジン類似体である。この抗癌剤のＩＵＰＡＣ名は、５－フルオロ－１－［４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンである。
本明細書で用いられる「そのオリゴマー形態」という表現は、特定の数の単位に限定されないポリマーとは対照的に、いくつかの繰り返し単位によって形成される分子を指し、各単位はモノマーと呼ばれる。一般に、オリゴマー中のモノマーの数は５～１００個である。したがって、本明細書において、ピリミジン類似体のオリゴマー形態は、いくつかのピリミジン類似体の配列によって形成される分子を指す。特定の実施形態において、ピリミジン類似体のオリゴマー形態またはポリマー形態は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個またはそれ以上のピリミジン類似体の配列を含む分子を指す。別の特定の実施形態において、それは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個またはそれ以上のピリミジン類似体の配列からなる分子を指す。
特定の実施形態において、ピリミジン類似体のオリゴマー形態またはポリマー形態は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個またはそれ以上のフロクスウリジンの配列を含む分子である。別の特定の実施形態において、ピリミジン類似体のオリゴマー形態は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個またはそれ以上のフロクスウリジンの配列からなる分子である。
「その五量体形態」という表現は、フロクスウリジン類似体を指す場合、５個のフロクスウリジンの配列を含むか、またはそれからなる分子として理解される。
（ｉｉ）細胞毒性ポリペプチド
本明細書で用いられる場合、「細胞毒性ポリペプチド」という用語は、細胞機能を阻害することができる薬物を指す。薬物は増殖を阻害してもよく、細胞に毒性を示してもよい。細胞によって内在化された場合に細胞代謝を阻害または有害に変化させるか、または何らかの方法で細胞の成長または増殖を阻害するポリペプチドは、この用語の範囲内に含まれ、限定されないが、細胞内に輸送された場合その毒性作用が媒介される薬物、およびその毒性作用が細胞表面において媒介される薬物が挙げられる。有用な細胞毒性ポリペプチドとしては、細菌毒素等のタンパク性毒素が挙げられる。
本発明による複合体への組み込みに有用なタンパク性細胞毒素の例としては、限定されないが、１型および２型のリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）が挙げられる。有用な１型の植物ＲＩＰとしては、限定されないが、ジアンチン３０、ジアンチン３２、リクニン、サポリン１～９、ヤマゴボウ（pokeweed）活性化タンパク質（ＰＡＰ）、ＰＡＰ ＩＩ、ＰＡＰ－Ｒ、ＰＡＰ－Ｓ、ＰＡＰ－Ｃ、マパルミン、ドデカンドリン、ブリオジン－Ｌ、ブリオジン、コリシン１および２、ルフィン－Ａ、ルフィン－Ｂ、ルフィン－Ｓ、１９Ｋ－タンパク質合成阻害タンパク質（ＰＳＩ）、１５Ｋ－ＰＳＩ、９Ｋ－ＰＳＩ、α－キリロウィン、β－キリロウィン、ジェロニン、モモルジン、モモルジン－ＩＩ、モモルジン－Ｉｃ、ＭＡＰ－３０、α－モモルカリン、β－モモルカリン、トリコサンチン、ＴＡＰ－２９、トリコキリン；大麦ＲＩＰ；亜麻ＲＩＰ、トリチン、トウモロコシＲＩＰ、アスパリン１および２が挙げられる［Stirpe et al., 1992. Bio/Technology 10:405-12］。有用な２型のＲＩＰとしては、限定されないが、ボルケンシン、リシン、ニグリン－ｂ、ＣＩＰ－２９、アブリン、モデシン、エブリチン－α、エブリチン－β、エブルチン－γ、ビルクミン、ポレクチン、およびそれらの生物学的に活性な酵素サブユニットが挙げられる［Stirpe et al., 1992. Bio/Technology 10:405-12；Pastan et al., 1992. Annu. Rev. Biochem. 61:331-54；Brinkmann and Pastan, 1994. Biochim. et Biophys. Acta 1198:27-45,；およびSandvig and Van Deurs, 1996. Physiol. Rev. 76:949-66］。
細胞毒素として有用な細菌毒素の例としては、限定されないが、志賀毒素および志賀様毒素（すなわち、同じ活性または構造を有する毒素）、ならびにそれらの触媒サブユニットおよび生物学的に機能的なフラグメントが挙げられる。これらの細菌毒素も２型ＲＩＰである［Sandvig and Van Deurs, 1996. Physiol. Rev. 76:949-66；Armstrong, 1995. J. Infect. Dis., 171:1042-5; Kim et al., 1997. Microbiol. Immunol. 41:805-8；およびSkinner et al., 1998. Microb. Pathog. 24:117-22］。有用な細菌毒素のさらなる例としては、限定されないが、シュードモナス外毒素およびジフテリア毒素が挙げられる［Pastan et al., 1992. Annu. Rev. Biochem. 61:331-54；およびBrinkmann and Pastan, 1994. Biochim. et Biophys. Acta 1198:27-45］。毒素酵素サブユニットの短縮型および変異体も、細胞毒素部分としても用いることができる（Pastan et al., Annu. Rev. Biochem. 61:331-54；Brinkmann and Pastan, Biochim. et Biophys. Acta 1198:27-45, 1994；Mesri et al., J. Biol. Chem. 268:4852-62, 1993；Skinner et al., Microb. Pathog. 24:117-22, 1998；および米国特許第５，０８２，９２７号）。他の標的薬剤としては、限定されないが、コリシンＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ１～９、クロアシンＤＦ１３および真菌ＲＮａｓｅ、α－サルシンを含む３４種を超える記載されたＲＮａｓｅ毒素のコリシンファミリーが挙げられる［Ogawa et al. 1999. Science 283: 2097-100；Smarda et al., 1998. Folia Microbiol (Praha) 43:563-82；Wool et al., 1992. Trends Biochem. Sci., 17: 266-69］。
（ｉｉｉ）抗血管新生ポリペプチド
腫瘍細胞の増殖は、癌の進行を伴う広範な腫瘍血管新生に大きく依存する。したがって、抗血管新生剤による新しい血管形成の阻害および既存の血管の標的破壊が、腫瘍治療に対する効果的かつ比較的非毒性のアプローチとして導入されてきた。
本明細書で用いられる「抗血管新生ポリペプチド」という用語は、血管新生を阻害することができるポリペプチドを意味する。適切な抗血管新生ポリペプチドとしては、限定されないが、アンギオスタチン、エンドスタチン、抗血管新生抗トロンビンＩＩＩ、ＷＯ２００７１１５３７６に記載されているｓＦＲＰ－４、ならびにアニビズマブ、ベバシズマブ（アバスチン）、Ｆａｂ ＩＭＣ１１２１およびＦ２００Ｆａｂ等の抗ＶＥＧＦ抗体が挙げられる。
（ｉｖ）腫瘍抑制遺伝子によってコードされるポリペプチド
本明細書で用いられる場合、「腫瘍抑制因子」は、細胞の無秩序な増殖を抑制するという通常の生物学的役割を有する遺伝子または遺伝子産物である。腫瘍抑制因子の機能的対応物は癌遺伝子であり、正常な細胞増殖を促進する遺伝子は「癌原遺伝子」として知られている。そのような遺伝子または遺伝子産物を活性化する突然変異は、それをさらに「癌遺伝子」に変換し、細胞増殖活性が継続されるが無秩序であり、腫瘍抑制遺伝子および遺伝子産物の例は文献においてよく知られており、ＰＴＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ１６、ＡＰＣ、ＲＢ、ＷＴ１、ＥＸＴ１、ｐ５３、ＮＦ１、ＴＳＣ２、ＮＦ２、ＶＨＬ、ＳＴ７、ＳＴ１４、ＰＴＥＮ、ＡＰＣ、ＣＤ９５およびＳＰＡＲＣが挙げられる。
（ｖ）アポトーシス促進性ポリペプチド
本明細書で用いられる「アポトーシス促進性ポリペプチド」という用語は、細胞または細胞集団において細胞死を誘導することができるタンパク質を指す。アポトーシスに関与するこれらのタンパク質の過剰発現は、アポトーシスの結果に向けて、抗アポトーシス因子とアポトーシス促進因子との間の微妙なバランスを動かす。適切なアポトーシス促進性ポリペプチドとしては、限定されないが、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＯＫ／ＭＴＤ、ＢＩＤ、ＢＡＤ、ＢＩＫ／ＮＢＫ、ＢＬＫ、ＨＲＫ、ＢＩＭ／ＢＯＤ、ＢＮＩＰ３、ＮＩＸ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、ＥＧＬ－Ｉおよびウイルスホモログ、カスパーゼ－８等のカスパーゼ、アデノウイルスＥ４ｏｒｆ４遺伝子、ｐ５３経路遺伝子、ＴＮＦ、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ等のアポトーシス促進性リガンド、および／またはＴＮＦＲ、Ｆａｓ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１およびＴＲＡＩＬ－Ｒ２等のそれらの受容体等のＢＣＬ－２ファミリーのタンパク質のアポトーシス促進性メンバーが挙げられる。
（ｖｉ）抗転移活性を有するポリペプチド
本明細書で用いられる「転移抑制剤」という用語は、転移（二次腫瘍）が癌を有する生物の体内に広がるのを遅らせるかまたは防ぐように作用するタンパク質を指す。適切な転移抑制因子としては、限定されないが、ＢＲＭＳ１、ＣＲＳＰ３、ＤＲＧ１、ＫＡＩ１、ＫＩＳＳ－１、ＮＭ２３、ＴＩＭＰファミリータンパク質およびウテログロビン等のタンパク質が挙げられる。
（ｖｉｉ）腫瘍に対する免疫応答を活性化することができるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
本明細書で用いられる場合、免疫刺激性ポリペプチド剤は、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて、それが投与される対象において免疫応答を活性化または刺激すること（既存の免疫応答を増強することを含む）ができるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。免疫刺激性ペプチドの適切な非限定的な例としては、フラゲリン、ムラミルジペプチド、インターロイキンを含むサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５（またはこれらのサイトカインのスーパーアゴニスト／変異型）、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３－リガンド等）、免疫刺激抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ３、またはこれらの分子の一本鎖／抗体フラグメント）等が挙げられる。
（ｖｉｉｉ）抗血管新生分子
特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質の介在領域は、腫瘍を標的とする血管新生阻害剤として作用するタンパク質に対応することも意図される。これらの薬剤としては、上記の抗血管新生ポリペプチドに加えて、マリマスタット；ＡＧ３３４０；ＣＯＬ－３、ＢＭＳ－２７５２９１、サリドマイド、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、２－メトキシエストラジオール、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭｌＯｌ、ペントサンポリサルフェート、アンジオポエチン２（レジェネロン）、ヘルビマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチンフラグメント、リノミド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニスタイン、ＴＮＰ４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン、アンジオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ－１４７０、血小板第４因子およびミノサイクリンが挙げられる。また、限定されないが、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ）、ペガプタニブ（ＭＡＣＵＧＥＮ）、ソラフェニブ、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ）、バタラニブ、ＺＤ－６４７４（ＺＡＣＴＩＭＡ）、アネコルテーブ（ＲＥＴＡＡＮＥ）、スクアラミン乳酸塩およびセマホリンを含むＶＥＧＦ阻害剤が挙げられる。
（ｉｘ）毒素
本明細書で用いられる場合、「毒素」という用語は、異なる生物から得られる非タンパク性／非ポリペプチド性細胞毒性化合物、ならびにそれらの同じ化合物の化学修飾誘導体および化学合成によって得られる化合物を指す。生物学的起源を有するこのカテゴリーの化合物は、微生物（細菌、古細菌、原生動物または単細胞真菌）または多細胞生物（多細胞真菌、植物、または軟体動物のような動物）から得ることができる。これらの毒素の化学組成および構造は、それらの非ポリペプチド性を超えて決して制限されないことが意図され、したがって、構造に関与するアミノ酸がペプチド結合によって結合されていない限り、それらの基本組成の一部としてであろうとも、化学誘導の結果であろうとも、１つ以上のアミノ酸はそれらの構造の一部であり得る。
本発明に適した毒素の例は、カリケアマイシンγ１、ドラスタチン１０、メイタンシノイド（ＤＭ１）およびピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ）である。
（ｘ）追加の治療薬
本発明の複合体の特定の実施形態において、治療薬は、以下の表４の第３列に示される治療薬から選択される。
Figure 2023509004000005
Figure 2023509004000006
Figure 2023509004000007
本発明の複合体の特定の実施形態において、第２のポリペプチド領域は、表４に示されるリガンドから選択されるリガンドであり、目的の剤は、表４において前記リガンドと同じ列に示される治療薬から選択される。別の特定の実施形態は、疾患または障害の治療における使用のための、このセクションの既出の実施形態で定義された本発明の複合体を指し、疾患または障害は表４に示されるものから選択される。別の特定の実施形態は、表４において、複合体の第２のポリペプチド領域が示される列に対応するものから選択される疾患または障害の治療における使用のための、このセクションの既出の実施形態で定義された本発明の複合体を指す。
ＩＶ－Ｅ．２ 造影剤
「造影剤」という用語は、本明細書では、生体適合性の化合物を指すために用いられ、その使用は、画像の異なる領域間のコントラストを増加させることによって、画像の異なる部分の区別を容易にする。したがって、「造影剤」という用語は、（例えば、ＭＲＩの場合のように）そのような剤がなくても生成され得る画像の品質を高めるために用いられる剤、および（例えば、核イメージングの場合のように）画像を生成するための前処理のための剤を包含する。適切な造影剤としては、限定されないが、放射性核種イメージング、コンピュータ断層撮影、ラマン分光法、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、および光学イメージングのための造影剤が挙げられる。
放射性核種イメージングのための造影剤としては、ヨウ素１２３、テクネチウム９９、インジウム１１１、レニウム１８８、レニウム１８６、銅６７、ヨウ素１３１、イットリウム９０、ヨウ素１２５、アスタチン２１１、ガリウム６７、イリジウム１９２、コバルト６０、ラジウム２２６、金１９８、セシウム１３７およびリン３２のイオンが挙げられる。蛍光発生剤の例としては、ガドリニウムおよびレノグラフィンが挙げられる。常磁性イオンの例としては、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（Ｈ）３銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）およびエルビウム（ＩＩＩ）のイオンが挙げられる。
光学イメージングのための造影剤としては、例えば、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、インドシアニングリーン、オレゴングリーン、オレゴングリーン誘導体、ローダミングリーン、ローダミングリーンの誘導体、エオシン、エリスロシン、テキサスレッド、テキサスレッドの誘導体、マラカイトグリーン、ナノゴールドスルホスクシンイミジルエステル、カスケードブルー、クマリン誘導体、ナフタレン、ピリジルオキサゾール誘導体、カスケードイエロー染料、ダポキシル染料が挙げられる。光学イメージングのための造影剤としてはまた、本明細書において、それらが蛍光を示すことを可能にする原子構造を有するタンパク質を指す蛍光タンパク質が挙げられ、これは当技術分野でよく知られている現象である。本発明の複合体に適した一般的に用いられる蛍光タンパク質の非限定的な例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、Aequorea victoriaにより最初に発見された）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質、またはその他の変異体であり、これらの例はKremers et al. [Kremers, G-J- et al. 2011. J.Cell Sci. 124:157-160]において見出すことができる。
本発明の複合体に適した蛍光タンパク質のさらなる非限定的な例は、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、強化シアン蛍光タンパク質ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、強化ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、エメラルド、トパーズ（ＴＹＦＰ）、ヴィーナス、シトリン、ｍシトリン、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ｍＣＦＰｍ、セルリアン、Ｔ－サファイア、ＣｙＰｅｔ、ＹＰｅｔ、ｍＫＯ、ＨｃＲｅｄ、ｔ－ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－一量体、Ｊ－レッド、二量体２、ｔ－二量体（１２）、ｍＲＦＰ１、ポシロポリン、レニラＧＦＰ、モンスターＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、カエデタンパク質およびキンドリングタンパク質、Ｂ－フィコエリトリン、Ｒ－フィコエリトリンおよびアロフィコシアニンを含むフィコビリタンパク質およびフィコビリタンパク質複合体である。別の実施形態において、造影剤は、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅｌ、ｍＲａｓｐｂｅｒｙ、ｍＧｒａｐｅ２、ｍＰｌｕｍからなる群から選択される蛍光タンパク質［Shaner et al. (2005) Nat. Methods 2:905-909］等である。
磁気共鳴イメージング装置のための造影剤は、ガドリニウムキレート、マンガンキレート、クロムキレート、１９Ｆおよび鉄粒子である。
ＭＲＩ造影剤としては、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）およびエルビウム（ＩＩＩ）が挙げられる。
ＩＶ－Ｅ．３ 目的の剤と複合体のポリペプチドとの結合
複合体のポリペプチドは、目的の単一の剤または複数の剤と複合体化することができる。複数の剤が複合体のポリペプチドに複合体化される場合、前記剤は同じであってもよく、異なっていてもよい。特定の実施形態において、複数の目的の剤は治療薬であり、上記で定義されたように、それらは同じ治療薬であるかまたは異なる治療薬である。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は造影剤であり、上記で定義されたように、それらは同じ造影剤であるかまたは異なる造影剤である。
以下は、任意の目的の剤、すなわち、上記で定義された治療薬、造影剤、複数の治療薬および複数の造影剤に適用される。したがって、特定の実施形態において、剤に関する以下の実施形態のいずれかは、「剤」という用語を「治療薬」に置換することによって治療薬に適用される。別の特定の実施形態において、剤に関する以下のいずれかの実施形態は、「剤」という用語を「造影剤」で置換することによって造影剤に適用される。別の特定の実施形態において、以下のいずれかの実施形態は、「複数の剤」という表現を「複数の治療薬」に置換することによって複数の治療薬に適用され、前記複数の治療薬は上記で定義した通りである。別の特定の実施形態において、以下のいずれかの実施形態は、「複数の剤」という表現を「複数の造影剤」に置換することによって複数の造影剤に適用され、前記複数の造影剤は上記で定義した通りである。
１つ以上の目的の剤は、複合体のポリペプチドの任意の配列に複合体することができる。
したがって、特定の実施形態において、目的の剤は、第１のポリペプチド領域に複合体化される。特定の実施形態において、目的の剤は、複合体の第２のポリペプチド領域に複合体化される。別の特定の実施形態において、目的の剤は、複合体の第３のポリペプチド領域に複合体化される。別の特定の実施形態において、目的の剤は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の連結領域のいずれかに複合体化される。別の特定の実施形態において、目的の剤は、第２のポリペプチド領域と第３のポリペプチド領域との間の連結領域に複合体化される。別の特定の実施形態において、目的の剤は、第２のポリペプチド領域と第３のポリペプチド領域との間の連結領域に複合体かされる。別の特定の実施形態において、目的の剤は、第１のポリペプチド領域と第２のポリペプチド領域との間のプロテアーゼ切断部位に複合体化される。別の特定の実施形態において、目的の剤は、第１のポリペプチド領域と第３のポリペプチド領域との間のプロテアーゼ切断部位に複合体化される。別の特定の実施形態において、目的の剤は、第２のポリペプチド領域と第３のポリペプチド領域との間のプロテアーゼ切断部位に複合体化される。
特定の実施形態において、複数の目的の剤は、複合体の同じポリペプチド領域に複合体化される。好ましい実施形態において、複数の目的の剤は、第１のポリペプチド領域に複合体化される。特定の実施形態において、複数の目的の剤は、複合体の第２のポリペプチド領域に複合体化される。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、複合体の第３のポリペプチド領域に複合体化される。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、複合体のポリペプチドの３つのすべてのポリペプチド領域に複合体化される。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、ポリペプチドの第１および第２のポリペプチド領域に複合体化される。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、複合体の第１および第３のポリペプチド領域に複合体化される。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、複合体の第２および第３のポリペプチド領域に複合体化される。
別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、複合体のポリペプチドの連結領域に複合体化される。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、第２のポリペプチド領域と第１のポリペプチド領域との間の連結領域に複合体化される。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、第１のポリペプチド領域と第３のポリペプチド領域との間の連結領域に複合体化される。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、第２のポリペプチド領域と第３のポリペプチド領域との間の連結領域に複合体化される。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、複合体のポリペプチドのプロテアーゼ切断部位に複合体化される。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、第２のポリペプチド領域と第１のポリペプチド領域との間のプロテアーゼ切断部位に複合体化される。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、第１のポリペプチド領域と第３のポリペプチド領域との間のプロテアーゼ切断部位に複合体化される。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、第２のポリペプチド領域と第３のポリペプチド領域との間のプロテアーゼ切断部位に複合体化される。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、ポリペプチドのすべてのプロテアーゼ切断部位に複合体化される。
別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、上記のポリペプチド領域のいずれか、および複合体のポリペプチドの連結領域に複合体化される。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、上記のポリペプチド領域のいずれか、および第２のポリペプチド領域と第１のポリペプチド領域との間の連結領域に複合体化される。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、上記のポリペプチド領域のいずれか、および第１のポリペプチド領域と第３のポリペプチド領域との間の連結領域に複合体化される。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、上記のポリペプチド領域のいずれか、および第２のポリペプチド領域と第３のポリペプチド領域との間の連結領域に複合体化される。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、上記のポリペプチドのポリペプチド領域のいずれか、およびポリペプチドのすべての連結領域に複合体化される。
別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、上記のポリペプチド領域のいずれか、および複合体のポリペプチドのプロテアーゼ切断部位に複合体化される。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、上記のポリペプチド領域のいずれか、および第１のポリペプチド領域と第２のポリペプチド領域との間のプロテアーゼ切断部位に複合体化される。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、ポリペプチドのポリペプチド領域のいずれか、および第１のポリペプチド領域と第３のポリペプチド領域との間のプロテアーゼ切断部位に複合体化される。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、ポリペプチドのポリペプチド領域のいずれか、および第２のポリペプチド領域と第３のポリペプチド領域との間のプロテアーゼ切断部位に複合体化される。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、上記のポリペプチド領域、およびポリペプチドのすべての切断部位に複合体化される。
別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、ポリペプチドの連結領域、およびポリペプチドのプロテアーゼ切断部位に複合体化される。別の特定の実施形態において、複数の目的の剤は、上記のポリペプチド領域のいずれか、連結領域、および複合体のポリペプチドのプロテアーゼ切断部位に複合体化される。
上述したように、目的の剤は複合体のポリペプチドに複合体化され、そのＮ末端およびＣ末端に関してポリペプチド内の複合体化の位置は制限されないことが意図される。したがって、目的の剤は、複合体のポリペプチドにおいてＮ末端およびＣ末端に関して等距離の位置に複合体化されてもよく、またはそれらのいずれかに近くてもよい。したがって、目的の剤は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のアミノ酸残基から５００個、４５０個、４００個、３５０個、３２５個、３００個、２７５個、２５０個、２３６個、２３０個、２２０個、２１０個、２００個、１９０個、１８０個、１７０個、１６０個、１００個、９０個、８０個、７５個、７０個、６５個、６０個、５５個、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、３０個、２５個、２０個、１５個、２０個、１０個、５個またはそれ以下のアミノ酸残基の距離でポリペプチド領域に複合体化されてもよく、またはポリペプチドのＮ末端またはＣ末端の同じ残基でポリペプチド領域に複合体化されてもよい。この段落は、ポリペプチドに複合体化された各剤に適用され、複数の剤が複合体のポリペプチドに複合体化される。
目的の剤の結合位置について意図される唯一の制限は、剤およびポリペプチドの要素が機能的であり、剤の結合がいずれの剤、ポリペプチドまたは複合体の活性にも干渉しないことである。
したがって、目的の剤、第２のポリペプチド、第１のポリペプチド領域、および正に帯電したアミノ酸に富む領域について、それらの非複合体化形態に対してそれらの機能性の少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、より一層好ましくは１００％が保存される。これは、複合体のポリペプチドにおける結合の位置に関係なく適用される。この段落は、複数の剤が複合体のポリペプチドに複合体化されるポリペプチドに複合体化された各剤にも適用される。剤は、複合体のポリペプチドの残基に直接結合するか、または連結部分を介して間接的に結合することができると意図される。
したがって、特定の実施形態において、目的の剤は、複合体のポリペプチドに直接結合する。別の特定の実施形態において、目的の剤は、連結部分を介して複合体のポリペプチドに結合する。
複数の剤が複合体のポリペプチドに複合体化される別の特定の実施形態において、それらのすべてはポリペプチドの残基に直接結合する。複数の剤が複合体のポリペプチドに結合する別の特定の実施形態において、それらの一部はポリペプチドの残基に直接結合し、残りは連結部分を介して間接的に結合する。別の特定の実施形態において、すべての剤は連結部分を介して結合する。
「連結部分」または「リンカー」という表現は、本発明の第２の態様ですでに定義されている。
当業者は、連結部が目的の剤と複合体のポリペプチドとの間の結合を媒介する場合には、複合体のポリペプチドの要素および剤の機能性に関して上述した規定が適用されると理解するであろう。したがって、目的の剤が連結部分を介して複合体のポリペプチドに結合する場合には、複合体のポリペプチドにおける結合の位置、連結部分の化学組成または構造、ならびに連結部分と剤との間の結合の化学的性質および連結部分と複合体のポリペプチドとの間の結合の化学的性質に関わらず、目的の剤、第２のポリペプチド領域、第１のポリペプチド領域、および正に帯電したアミノ酸に富む領域について、それらの非複合体化形態に対してそれらの機能性の少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、より一層好ましくは１００％が保存される。これは、複数の剤が複合体のポリペプチドに複合体化される場合、すべての目的の剤に適用される。
本発明の好ましい実施形態において、剤と複合体のポリペプチドとの間の結合を媒介する連結部分は、６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルまたは４－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルである。複数の剤が複合体のポリペプチドに複合体化される別の特定の実施形態において、剤と複合体のポリペプチドとの結合を媒介するすべての連結部分は、６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルまたは４－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルである。複数の剤が複合体のポリペプチドに複合体化される別の特定の実施形態において、剤と複合体のポリペプチドへとの結合を媒介する連結部分の一部は、６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルまたは４－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
別の好ましい実施形態において、剤と複合体のポリペプチドとの間の結合を媒介する連結部分は、ポリペプチドの側鎖に存在するスルフヒドリル基および目的の剤の活性基と反応することができる部分である。ポリペプチドの側鎖に存在するスルフヒドリル基と反応することができる適切な連結基としては、限定されないが、マレイミド試薬、ハロアセチル、アジリジン、アクリロイル、アリール化剤、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、ＴＮＢ－チオールおよびジスルフィド還元剤が挙げられる。これらの基のほとんどは、アルキル化（通常はチオエーテル結合の形成）またはジスルフィド交換（ジスルフィド結合の形成）のいずれかによってスルフヒドリルに結合する。
いくつかの実施形態において、連結部分は、複合体の一部を形成するポリペプチドと接続される連結部分の一部、および目的の剤と接続される連結部分の一部を接続するスペーサー領域を含む。いくつかの実施形態において、連結部分はスペーサーによって目的の剤と接続され、連結部分は対象のスペーサー剤とポリペプチドとを接続する。一つの実施形態において、連結部分はポリペプチドと接続され、連結部分はスペーサー－ポリペプチドと目的の剤とを接続する。
本明細書で用いられる場合、「スペーサー」という用語は、少なくとも２つの他の部分を互いに接続する部分を指す。いくつかの実施形態において、スペーサーはポリマーである。
本明細書で用いられる場合、「ポリマー」という用語は、直鎖状形、環状、分岐鎖状、架橋もしくは樹状またはそれらの組み合わせで化学結合によって接続された繰り返し構造単位、すなわちモノマーを含む分子を意味し、合成起源もしくは生物学的起源または両方の組み合わせであり得る。モノマーは同一であってもよく、その場合ポリマーはホモポリマーであり、またはモノマーは異なっていてもよく、その場合ポリマーはヘテロポリマーである。ヘテロポリマーは「コポリマー」と呼ばれることもあり、例えば、異なるタイプのモノマーが交互に配置される交互コポリマー、異なるタイプのモノマーが繰り返し配列に配置される周期的コポリマー；異なるタイプのモノマーがランダムに配置される統計コポリマー（statistical copolymer）；１つのタイプのモノマーのみからなる異なるホモポリマーのブロックが共有結合によって結合されるブロックコポリマー；および異なるモノマーの組成がポリマー鎖に沿って徐々に変化するグラジエントコポリマーが挙げられる。いくつかの実施形態において、ポリマーは１つ以上の他の部分を含み、特定の実施形態において、他の部分は、Ｃ１－５０アルキル、Ｃ２－５０アルケニル、Ｃ２－５０アルキニル、Ｃ３－１０シクロアルキル、３～１０員のヘテロシクリル、８～１１員のヘテロビシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニルおよびテトラリニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、スペーサーは、ＰＥＧベースのスペーサーである。
本明細書で用いられる場合、スペーサーに関する「ＰＥＧベース」という用語は、スペーサーがＰＥＧを含むことを意味する。そのようなＰＥＧベースの部分または試薬は、少なくとも２０％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、少なくとも６０（ｗ／ｗ）のＰＥＧ、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ、または少なくとも９５％（ｗ／ｗ）のＰＥＧのような少なくとも１０％（ｗ／ｗ）のＰＥＧを含む。ＰＥＧベースの部分または試薬の残りの重量％は：Ｃ１－５０アルキル、Ｃ２－５０アルケニル、Ｃ２－５０アルキニル、Ｃ３－１０シクロアルキル、３～１０員のヘテロシクリル、８～１１員のヘテロビシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニルおよびテトラリニル；－ＣＲ＜、＞Ｃ＜または－Ｎ＜等の分岐点；および破線が部分または試薬の残りの部分との結合を示し、－Ｒおよび－Ｒａがそれぞれ独立して－ＨおよびＣｉ－６アルキルからなる群から選択される結合であって；その部分および結合は任意にさらに置換されている；からなる群から選択されるような他の部分であり得る。
本発明のいくつかの実施形態において、剤と複合体のポリペプチドとを結合する連結部分は、細胞質に存在する酵素によって処理されやすく、融合タンパク質に複合体化された治療薬が細胞に内在化されると該治療薬が融合タンパク質から放出される。
さらに、いくつかの剤は、同じ分子の複数のコピーが一緒に結合され、ポリマーの各モノマーが前記分子の１つであるポリマーを形成するように重合され得る。このようなポリマーの非限定的な例は、５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（ＦｄＵ）であり、これはオリゴ－ＦｄＵをもたらす。本発明のいくつかの実施形態は、そのようなポリマーを含み得ることが意図される。また、本発明のいくつかの別の実施形態は、剤が互いの生理学的効果または生物学的効果を妨害しないという条件で、２つ以上の異なる分子の剤のポリマーを含み得ることが意図される。当業者は、目的の剤のポリマーを特徴とする本発明のそれらの実施形態が、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０またはそれ以上の割合で１種以上の異なる目的の剤が２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、１５個、３０個、４０個、５０個またはそれ以上の重合された分子を特徴とし得ることを理解するであろう
ＩＶ－Ｆ．レポータータンパク質
本発明の別の実施形態において、本発明の複合体のポリペプチドは、レポータータンパク質をさらに含む。
当業者は、「レポータータンパク質」という用語を、「レポーター遺伝子」の発現から生じるタンパク質を指すものとして理解するであろう。レポータータンパク質は、組織、細胞または細胞小器官の位置、タンパク質間相互作用、形質膜または細胞内膜を透過する輸送、小胞輸送、リガンド－受容体相互作用等におけるレポーター遺伝子の発現の位置のような複数の目的に適したマーカーとしてよく知られており、当技術分野で一般的に用いられる。
本発明において有用なレポータータンパク質としては、フォティナス・ピラリス（Photinus pyralis）由来のルシフェラーゼ－４－モノオキシゲナーゼ、β－ガラクトシダーゼ、チミジンキナーゼ等が挙げられる。レポータータンパク質には、すでに説明した蛍光タンパク質も含まれる。
本発明の複合体のポリペプチドに含まれるレポータータンパク質は、正に帯電したアミノ酸に富む領域に直接隣接しているか、またはリンカーによって分離されている。しかしながら、正に帯電したアミノ酸に富む領域の相対的位置は、融合タンパク質の要素の相対的位置に関する上述した留意事項に従っている。したがって、融合タンパク質内の正に帯電したアミノ酸に富む領域の位置とは無関係に、蛍光タンパク質は、直接またはリンカーによって分離されて、常にそれに隣接している。
したがって、蛍光タンパク質を含む本発明の実施形態において、本発明の複合体のポリペプチドの要素について可能な相対位置は、以下のスキームに適合する（ここで、ＲＰはレポータータンパク質を指し、要素についての上記の番号付けは保持される：（１）第２のポリペプチド領域、（２）第１のポリペプチド領域、（３）正に帯電したアミノ酸領域）：
・Ｎ－（１）－（２）－ＲＰ－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－（２）－ＲＰ－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－プロテアーゼ切断部位－（２）－ＲＰ－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－（２）－リンカー－ＲＰ－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－（２）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－（２）－リンカー－ＲＰ－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－プロテアーゼ切断部位－（２）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－（２）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－プロテアーゼ切断部位－（２）－リンカー－ＲＰ－（３）－Ｃ
・Ｎ－（３）－ＲＰ－（２）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－ＲＰ－リンカー－（２）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（２）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－ＲＰ－（２）－リンカー－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－ＲＰ－（２）－リンカー－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－ＲＰ－リンカー－（２）－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（３）－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（２）－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃ
・Ｎ－（３）－ＲＰ－リンカー－（２）－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃ
・Ｎ－（３）－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（２）－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－（２）－ＲＰ－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－（２）－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－（２）－ＲＰ－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－プロテアーゼ切断部位－（２）－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－（２）－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－プロテアーゼ切断部位－（２）－ＲＰ－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－（２）－リンカー－ＲＰ－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－（２）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－（２）－リンカー－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－（２）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－（２）－リンカー－ＲＰ－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－プロテアーゼ切断部位－（２）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－プロテアーゼ切断部位－（２）－リンカー－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－プロテアーゼ切断部位－（２）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－（２）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－（２）－リンカー－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－（２）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－プロテアーゼ切断部位－（２）－リンカー－ＲＰ－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（３）－リンカー－ＲＰ－（２）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－（２）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－リンカー－ＲＰ－リンカー－（２）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（２）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－リンカー－（２）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－リンカー－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（２）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－リンカー－ＲＰ－（２）－リンカー－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－（２）－プロテアーゼ切断部位－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－リンカー－ＲＰ－（２）－プロテアーゼ切断部位－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－（２）－リンカー－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－リンカー－ＲＰ－リンカー－（２）－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（３）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（２）－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃ
・Ｎ－（３）－リンカー－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（２）－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃ
・Ｎ－（３）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－リンカー－（２）－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃ
・Ｎ－（３）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（２）－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（３）－リンカー－ＲＰ－リンカー－（２）－プロテアーゼ切断部位－（３）－Ｃ
・Ｎ－（３）－リンカー－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（２）－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（３）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－リンカー－（２）－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－（１）－ＲＰ－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－リンカー－（１）－ＲＰ－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－プロテアーゼ切断部位－（１）－ＲＰ－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－（１）－リンカー－ＲＰ－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－（１）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－リンカー－（１）－リンカー－ＲＰ－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－プロテアーゼ切断部位－（１）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－リンカー－（１）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－プロテアーゼ切断部位－（１）－リンカー－ＲＰ－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－ＲＰ－（３）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－（３）－ＲＰ－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－リンカー－ＲＰ－（３）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－（３）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－リンカー－（３）－ＲＰ－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－プロテアーゼ切断部位－（３）－ＲＰ－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－ＲＰ－（３）－リンカー－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－ＲＰ－（３）－プロテアーゼ切断部位－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－（３）－ＲＰ－リンカー－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－（３）－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－リンカー－ＲＰ－（３）－リンカー－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－（３）－プロテアーゼ切断部位－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－リンカー－ＲＰ－（３）－プロテアーゼ切断部位－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－（３）－リンカー－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－リンカー－（３）－ＲＰ－リンカー－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－プロテアーゼ切断部位－（３）－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－リンカー－（３）－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－プロテアーゼ切断部位－（３）－ＲＰ－リンカー－（１）－Ｃ
・Ｎ－（１）－ＲＰ－（３）－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－（３）－ＲＰ－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－ＲＰ－（３）－リンカー－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－ＲＰ－（３）－プロテアーゼ切断部位－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－（３）－ＲＰ－リンカー－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－（３）－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－ＲＰ－（３）－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－（３）－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－（３）－ＲＰ－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－プロテアーゼ切断部位－（３）－ＲＰ－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－ＲＰ－（３）－リンカー－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－（３）－プロテアーゼ切断部位－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－ＲＰ－（３）－プロテアーゼ切断部位－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－プロテアーゼ切断部位－ＲＰ－（３）－リンカー－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－（３）－ＲＰ－リンカー－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－プロテアーゼ切断部位－（３）－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－（３）－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－プロテアーゼ切断部位－（３）－ＲＰ－リンカー－（２）－Ｃ
・Ｎ－ＲＰ－（３）－（１）－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－ＲＰ－（１）－（２）－Ｃ
・Ｎ－ＲＰ－（３）－リンカー－（１）－（２）－Ｃ
・Ｎ－ＲＰ－（３）－プロテアーゼ切断部位－（１）－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－ＲＰ－リンカー－（１）－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（１）－（２）－Ｃ
・Ｎ－ＲＰ－（３）－（１）－リンカー－（２）－Ｃ
・Ｎ－ＲＰ－（３）－（１）－プロテアーゼ切断部位－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－ＲＰ－（１）－リンカー－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－ＲＰ－（１）－プロテアーゼ切断部位－（２）－Ｃ
・Ｎ－ＲＰ－（３）－リンカー－（１）－リンカー－（２）－Ｃ
・Ｎ－ＲＰ－（３）－プロテアーゼ切断部位－（１）－プロテアーゼ切断部位－（２）－Ｃ
・Ｎ－ＲＰ－（３）－リンカー－（１）－プロテアーゼ切断部位－（２）－Ｃ
・Ｎ－ＲＰ－（３）－プロテアーゼ切断部位－（１）－リンカー－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－ＲＰ－リンカー－（１）－リンカー－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（１）－プロテアーゼ切断部位－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－ＲＰ－リンカー－（１）－プロテアーゼ切断部位－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－ＲＰ－プロテアーゼ切断部位－（１）－リンカー－（２）－Ｃ。
ＩＶ－Ｇ．本発明の好ましい複合体
本発明の好ましい実施形態は、構成要素が上記の表３に定義されている通りであり、目的の剤がフロクスウリジンまたはフロクスウリジンペンタヌクレオチドの１つ以上のコピーである複合体である。より好ましい実施形態において、上記で定義された複合体は、複合体を形成するポリペプチドの第１の領域の側鎖におけるアミノ基またはチオール基と、２～３５原子の連結部分によって結合されているかまたは結合していない治療薬におけるチオール基またはヒドロキシ基またはリン酸基またはアミノ基またはカルボキシ基との間の連結から生じる。
ＩＶ－Ｈ．本発明の複合体の化学量論
本発明の融合タンパク質に複合体化される目的の剤の数は、特に限定的ではないが、目的の剤との化学的複合体化に利用できる本発明のポリペプチド中の利用可能な残基の数に依存する。ほとんどの結合は、複合体のポリペプチドの一部を形成するアミノ酸の側鎖に存在するアミノ基またはスルフヒドリル基を介して起こるため、複合体のポリペプチドに結合する剤の数は、リジン残基およびアルギニン残基の数に依存するか（側鎖のアミノ基を介した結合の場合）、またはシステイン残基の数に依存し（側鎖のスルフヒドリル基を介した結合の場合）、かつ結合反応の収率に依存する。したがって、本発明の特定の実施形態において、本発明の複合体のポリペプチドは、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、１７個、２０個、２５個、３０個の目的の剤と結合する。
剤がポリマーとして提供される特定の場合において、剤の数はまた、ポリマー中のモノマーの数に依存することが理解されよう。ＦｄＵオリゴマーの特定の場合、所与の複合体中の目的の剤の数は、複合体のポリペプチドに結合したオリゴマーの数にモノマーの数を掛けた結果である。ＦｄＵ五量体の好ましい場合において、好ましい実施形態としては、本発明のポリペプチドあたり少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７５個、８５個、１００個、１２５個、１５０個またはそれ以上の治療薬であって、それぞれ分子あたり１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、１７個、２０個、２５個または３０個のＦｄＵ五量体に対応する治療薬を含む複合体が挙げられる。
さらに、本発明によるナノ粒子は、本発明の複合体の複数のコピーの集合から生じる。好ましい実施形態において、ナノ粒子は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１７個、２０個、２５個、より好ましくは少なくとも１５個の本発明の複合体のモノマーを含む。
したがって、各ナノ粒子に結合する目的の剤の総数は、（ｉ）複合体の各ポリペプチドと結合した剤の数、（ｉｉ）剤のオリゴマー化状態、および（ｉｉｉ）ナノ粒子を形成する複合体の数に依存する。好ましい実施形態において、ナノ粒子は、少なくとも３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、６５個、７０個、５７個、８０個、８５個、９０個、５９個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、２７５個、３００個の目的の剤と結合する。さらに好ましい実施形態において、ナノ粒子は、少なくとも３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、６５個、７０個、５７個、８０個、８５個、９０個、５９個、１００個、より好ましくは少なくとも６０個のＦｄＵ五量体分子と結合する。
特定の実施形態において、本発明の第１、第２、第３、第４および第５の態様において説明されているすべての用語および実施形態は、本発明の第６の態様に等しく適用可能である。ｉ
Ｖ－本発明の複合体を調製する方法
第７の態様において、本発明は、本発明の第６の態様の複合体を調製する方法であって：
（ｉ）ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体を含む本発明の第６の態様の複合体のポリペプチドを提供する工程、および
（ｉｉ）前記ポリペプチドと、前記ポリペプチド中の少なくとも１つの基と反応することができる本発明の第６の態様の複合体の目的の剤の活性化形態とを、前記目的の剤中の反応性基と前記ポリペプチド中の基との間の結合を形成するのに適切な条件下で接触させる工程
を含む方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、本発明の第６の態様の複合体を調製する方法であって：
（ｉ）ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体を含む本発明の第６の態様の複合体のポリペプチドであって、活性化形態であるポリペプチドを提供する工程、および
（ｉｉ）前記ポリペプチドと、前記ポリペプチド中の反応性基と反応することができる目的の剤とを、前記ポリペプチド中の反応性基と前記目的の剤中の基との間の結合を形成するのに適切な条件下で接触させる工程
を含む方法に関する。
当業者は、本明細書で用いられる「反応性基」が、分子の任意の部分であって、他の分子の他の部分と、通常は１つ以上の追加の分子の放出を伴ってそれら２つの分子が一緒に結合するような方法で化学的に結合することができる部分を指すと理解するであろう。１つの非限定的な例であるカルボキシル基とアミン基との間のペプチド結合の形成のように多くのそのような反応が当技術分野で知られている。
本明細書で分子を指すときに用いられる「活性化」とは、化学修飾を含む修飾型の分子を指し、それにより分子は、従来は該分子に存在しなかった方法で化学反応することができるか（例えば、活性化により従来は存在しなかった反応性基が付加され、従来は実現できなかった結合が可能になる）、または反応性が増大する（すなわち、不活性化状態と比較して、分子と他の分子との反応により低い活性化エネルギーを必要とする）。本発明は、目的の剤を活性化し、次いで活性化剤と複合体のポリペプチドとを接触させるか、または複合体のポリペプチドを活性化し、次いで活性化ポリペプチドと目的の剤とを接触させる可能性を企図する。いずれの場合にも、ポリペプチドまたは目的の剤の活性化は、通常、活性化される分子と活性化される分子に反応性基を導入する試薬とを反応させることにより行われる。目的の剤または複合体のポリペプチドの活性化を可能にする反応性基の例としては、限定されないが、当業者に一般的に知られている他の多くのもののなかで、カルボキシル部分、アミン部分、イミン部分、チオール部分、スルホン部分、ヒドロキシル部分、硫酸塩部分およびリン酸部分が挙げられる。目的の剤の活性化形態は、本明細書では「活性化された目的の剤」とも呼ばれる。複合体のポリペプチドの活性化形態は、本明細書では「活性化ポリペプチド」とも呼ばれる。本発明の第６の態様に記載されるように、活性化ポリペプチド中の１つ以上の反応性基は、目的の剤が複合体化されるポリペプチドの領域に位置する。したがって、特定の実施形態において、反応性基は、第１のポリペプチド領域、第２のポリペプチド領域、第３のポリペプチド領域、前記ポリペプチド領域のいずれかの間のリンカー、または複合体の前記ポリペプチド領域の間のプロテアーゼ切断部位に位置する。別の特定の実施形態において、反応性基は、第１のポリペプチド領域、および／または第２のポリペプチド領域、および／または第３のポリペプチド領域、および／または前記ポリペプチド領域のいずれかの間のリンカー、および／または複合体の前記ポリペプチド領域の間のプロテアーゼ切断部位に位置する。
好ましい実施形態において、反応性基は、複合体のポリペプチドに含まれる第１のポリペプチド領域に位置する。特定の実施形態において、反応性基は、複合体の第１のポリペプチド領域に位置し、また上述した第６の態様の複合体のポリペプチドに含まれる他の領域にも位置する。
連結部分が複合体のポリペプチドと目的の剤との間の結合を媒介する本発明の実施形態において、連結部分は、目的の剤中の基および複合体のポリペプチド中の基と反応する二官能性架橋剤、より好ましくは、中でもチオエーテル、アミノ結合、炭素－窒素二重結合、またはKalia J et al.（Advances in bioconjugation. Curr Org Chem 2010 January, 14(2):138-147）に開示されているような付加環化により生じる結合を用いて、連続的（活性された剤と反応した後にポリペプチドと反応するか、またはポリペプチドと反応した後に活性化された剤と反応するかのいずれか）または同時に目的の剤中の基および複合体のポリペプチド中の基と反応するヘテロ二官能性架橋剤である。例えば、典型的なチオール反応性官能基としては、ヨードアセトアミド、マレイミドおよびジスルフィドが挙げられる。さらに、タンパク質は、活性化エステル（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル）を提示する小分子または表面で処理して、リジン側鎖およびＮ末端のアミノ基とアミド結合を形成することができる。別の実施形態において、連結部分は、チオール基と反応することができる反応性基およびアミノ基と反応することができる反応性基を含むヘテロ二官能性架橋剤である。一つの実施形態において、ヘテロ二官能性架橋剤は、６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
好ましい実施形態において、連結部分は、第１の工程で活性化された目的の剤と反応し、第２の工程で複合体のポリペプチドと反応する。別の実施形態において、連結部分は、第１の工程で複合体のポリペプチドと反応し、第２の工程で目的の剤と反応する。
本発明の第６の態様の複合体のポリペプチドと目的の剤の活性化形態とを接触させる工程は、それらの間の結合を確立する反応に有利な媒体中で行われることが意図される。反応に適した媒体は、水性緩衝液および非水性緩衝液を含めて当業者に一般的に知られている。固体支持体は、活性化された剤の合成、ならびに複合体のポリペプチド、目的の剤および１つを含む実施形態における連結部分の複合体化をもたらす反応工程のいずれかのために、媒体と組み合わせて用いることも意図される。さらに、ポリペプチドと治療薬との間の複合体を調製する方法は、ポリペプチド、活性化された目的の剤および連結部分を含むことに限定されず、いくつかの実施形態は、反応において１つ以上の触媒および補因子の使用も含むことが意図される。
したがって、本発明の一つの実施形態において、目的の剤の活性化形態は、複合体のポリペプチド、好ましくは複合体のポリペプチドに含まれる第１のポリペプチド領域の側鎖の少なくとも１つと反応する基を含む。当業者が理解するように、「ポリペプチドの側鎖」は、ポリペプチド配列のアミノ酸残基の側鎖を指す。
別の好ましい実施形態において、残基は外側のリジンである。本発明のさらに好ましい実施形態において、複合体のポリペプチドの側鎖の少なくとも１つと反応する活性化された目的の剤、好ましくは化学療法剤の基は、チオール基である。
本発明のより一層好ましい実施形態において、活性化された治療薬は、活性化された化学療法剤、より好ましくはチオール官能化オリゴフロクスウリジンである。
好ましい実施形態において、連結部分は、６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルであり、活性化された剤と、このセクションで前述した実施形態で示された複合体のポリペプチドにおける側鎖との間の結合を媒介する。より一層好ましい実施形態において、連結部分の６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルは、第１の工程において目的の剤、好ましくは活性化ＦｄＵ、より一層好ましくはスルフヒドリルで官能化されたＦｄＵに結合され、第２の工程において複合体のポリペプチドの側鎖、より好ましくは複合体のポリペプチドの外側のリジン、より一層好ましくは本発明の複合体の第１のポリペプチド領域の外側のリジンに結合される。
本発明の別の好ましい実施形態において、活性化された治療薬は、活性化された化学療法剤、より好ましくはアミノ官能化オリゴフロクスウリジンである。
好ましい実施形態において、連結部分は、６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルであり、活性化された剤と、このセクションで前述した実施形態で示された複合体のポリペプチドにおける側鎖との間の結合を媒介する。より一層好ましい実施形態において、連結部分の６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルは、第１の工程において目的の剤、好ましくは活性化ＦｄＵ、より一層好ましくはアミノで官能化されたＦｄＵに結合され、第２の工程において複合体のポリペプチドの側鎖、より好ましくは複合体のポリペプチドの外側のシステイン、より一層好ましくは本発明の複合体の第１のポリペプチド領域の外側のシステインに結合される。
本発明の別の好ましい実施形態において、活性化された治療薬は、活性化された化学療法剤、より好ましくはカルボキシ官能化オリゴフロクスウリジンである。
好ましい実施形態において、活性化ＦｄＵ、より一層好ましくは活性化形態のカルボン酸で官能化されたＦｄＵは、目的の剤中のカルボキシル基と、ポリペプチド中の反応性基（例えば、目的の剤中のカルボキシル基と共にアミド結合を形成することができるアミノ基）、複合体のポリペプチドの側鎖、より好ましくは複合体のポリペプチドの外側のリジン、より一層好ましくは複合体の第１のポリペプチド領域の外側のリジンとを反応させる。
さらに好ましい実施形態において、目的の剤、より好ましくはＦｄＵまたはその五量体形態はアミノ基で官能化され、連結部分は、目的の剤中のアミノ基およびポリペプチド中の反応性基と反応する二官能性試薬である。いくつかの実施形態において、二官能性試薬は、アミノ基と反応する部分（例えば、目的の剤中のアミノ基とアミド基を形成することができるカルボキシレート基）と、タンパク質の側鎖中のスルフヒドリル基と反応する部分（例えば、ポリペプチドの側鎖中のスルフヒドリル基とチオエーテルを形成することができるマレイミド基）とを含む。
さらに好ましい実施形態において、目的の剤、より好ましくはＦｄＵまたはその五量体形態はカルボキシル基で官能化され、連結部分は、目的の剤中のカルボキシル基およびポリペプチド中の反応性基と反応する二官能性試薬である。いくつかの実施形態において、二官能性試薬は、カルボキシル基と反応する部分（例えば、目的の剤中のカルボキシル基とアミド基を形成することができるアミノ基）と、タンパク質の側鎖のスルフヒドリル基と反応する部分（例えば、ポリペプチドの側鎖のスルフヒドリル基とチオエーテルを形成することができるマレイジイミド基）またはタンパク質のアミノ基と反応する部分とを含む。
本発明の文脈において目的の剤とポリペプチドとの間で用いられ得る追加のリンカーとしては、参照によりそれらの内容が本明細書に組み込まれるLeung et al. (Antibodies 2020, 9, 2; doi:10.3390/antib9010002)（Figure 6を参照のこと）およびBargh et al. (Chem. Soc. Rev., 2019, DOI: 10.1039/c8cs00676h)に開示されているような、抗体－薬物複合体の調製に一般的に用いられるものが挙げられる。
したがって、本発明の一つの実施形態において、複合体のポリペプチドの活性化形態は、目的の剤の少なくとも１つの部分と反応する基を含む。本発明のさらに好ましい実施形態において、複合体の活性化ポリペプチドと反応する目的の剤、好ましくは化学療法剤の基は、チオール基である。
本発明のさらに好ましい実施形態において、複合体の活性化ポリペプチドは、ポリペプチドの側鎖中の１つ以上のアミノ基と、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド基等の活性化カルボキシル基を含む二官能性試薬とを反応させることによって得られる。一つの実施形態において、二官能性試薬は、必要に応じて、剤中のアミノ基、チオール基またはヒドロキシル基と反応することができる第２の活性化カルボキシル基を含む。
さらに好ましい実施形態において、連結部分は、６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルであり、複合体のポリペプチド中のアミノ基と目的の剤中のチオール基との間の結合を媒介する。より一層好ましい実施形態において、連結部分の６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルは、第１の工程において複合体のポリペプチド、より好ましくは複合体のポリペプチドの外側のリジンに結合され、第２の工程において剤中の側鎖、好ましくは活性化された剤のチオール基に結合される。
さらに好ましい実施形態において、連結部分は、６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルであり、複合体のポリペプチド中のチオール基と目的の剤中のアミノ基との間の結合を媒介する。より一層好ましい実施形態において、連結部分の６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルは、第１の工程において複合体のポリペプチド、より好ましくは複合体のポリペプチドの外側のシステインに結合され、第２の工程において目的の剤、好ましくは目的の剤中のアミノ基に結合される。
さらに好ましい実施形態において、連結部分は、６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルであり、複合体のポリペプチド中のチオール基と目的の剤中のアミノ基との間の結合を媒介する。より一層好ましい実施形態において、連結部分の６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルは、第１の工程において、目的の剤、好ましくは目的の剤中のアミノ基に結合され、第２の工程において、複合体のポリペプチド、より好ましくは複合体のポリペプチドの外側のシステインのチオール基に結合される。
特定の実施形態において、前述した本発明の態様で説明されたすべての用語および実施形態は、本発明の第７の態様に等しく適用可能である。
ＶＩ－拮抗的なＣＸＣＲ４リガンドを含む本発明のポリペプチド
本発明らは、拮抗的なＣＸＣＲ４リガンドおよびニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその変異体を含む融合タンパク質が、ＣＸＣＲ４発現細胞を標的とし、透過することができることを観察した。さらに、この融合タンパク質がポリカチオン領域の存在によってさらに改変されると、融合タンパク質は自発的に集合してナノ粒子となり、ＣＸＣＲ４発現細胞を標的にして透過し、ＣＸＣＲ４発現細胞においてアポトーシスを誘導することもできる。
したがって、別の態様において、本発明は、
（ｉ）ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体を含む第１の領域、および
（ｉｉ）拮抗的なＣＸＣＲ４リガンドを含む第２の領域
を含むポリペプチド（本発明の第２のポリペプチド、本発明の融合タンパク質、本発明のＣＸＣＲ４拮抗性ポリペプチドとしても知られる）に関する。
第１の領域は、本発明の第１のポリペプチドの文脈、および本発明の複合体の一部を形成するポリペプチドの第１の領域の文脈において上記で定義されており、本発明の第２のポリペプチドに等しく適用される。いくつかの実施形態において、第１の領域は、ニドゲン－１のＧ２ドメインの機能的に同等の変異体であり、該ニドゲン－１のＧ２ドメインの機能的に同等の変異体は、本発明の第１のポリペプチドにおいて上記で定義された変異体のいずれかである。いくつかの実施形態において、第１の領域が、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースのアクセション番号Ｐ１４５４３－１で定義されるヒトニドゲン－１の配列のアミノ酸４３０～６６７を含む、請求項５３または５４に記載のポリペプチド。いくつかの実施形態において、第１の領域の一部を形成するニドゲン－１のＧ２ドメインの機能的に同等の変異体は、２００９年７月７日付けのバージョンのＵｎｉＰｒｏｔデータベースのアクセション番号Ｐ１４５４３－１で定義されるヒトニドゲン－１の配列の番号付けに関し、４５９位、４６８位、６３９位、６５０位、５４３位、５４５位、４４９位、５２５位、５６１位、６１８位、６１９位、１５１位、６０４位、６３８位、６４１位、４６９位および５１８位の１つ以上のアミノ酸残基における突然変異を含む。したがって、別の特定の実施形態において、本発明の第６の態様の複合体のポリペプチドは、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（２００９年７月７日付けのバージョン）のアクセション番号Ｐ１４５４３－１で定義されるヒトニドゲン－１の配列の番号付けに関し、４５９位、４６８位、６３９位、６５０位、５４３位、５４５位、４４９位、５２５位、５６１位、６１８位、６１９位、１５１位、６０４位、６３８位、６４１位、４６９位および５１８位の１つ以上のアミノ酸残基における突然変異を含むニドゲン－１のＧ２ドメインの機能的に同等の変異体である。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド領域に含まれ得るニドゲンＧ２ドメイン変異体は、限定されないが、それぞれ配列番号６４、６５および８７～１０４で定義されるＮＩＤＯｍｕｔ２、ＮＩＤＯｍｕｔ３、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｖ４５Ｔ、ＮＩＤＯｍｕｔ３＿Ｖ１２１Ｑ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｆ１５７Ｅ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｖ２１５Ｔ、ＮＩＤＯｍｕｔ４、ＮＩＤＯｍｕｔ４＿Ｔ２１５Ｖ、ＮＩＤＯｍｕｔ５、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｖ１７６Ｔ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｉ２００Ｔ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｖ２３６Ｙ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｌ２３７Ｔ、ＮＩＤＯｍｕｔ３＿Ｓ６５Ｉ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｒ１１４Ｉ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｃ２１４Ｓ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｓ６５Ｉ＿Ｒ１１４Ｉ、ＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｓ６５Ｉ＿Ｒ１１４Ｉ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｓ６５Ｉ＿Ｒ１１４ＩおよびＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｓ６５Ｉ＿Ｒ１１４Ｉを有する変異体を含む、本発明の第１の態様の文脈において上記で定義されたニドゲンＧ２ドメイン変異体のいずれかを含む。
本発明の第２のポリペプチドの第２の領域は、拮抗的なＣＸＣＲ４リガンドを含む。本明細書で用いられる「拮抗的なＣＸＣＲ４リガンド」という用語は、ＣＸＣＲ４に特異的に結合することができ、アゴニストとの相互作用に応答して分子の生物学的活性を低減、阻害または防止する任意のポリペプチド、ペプチドまたはペプチド模倣物を指す。一つの実施形態において、拮抗的なＣＸＣＲ４リガンドは、競合的アンタゴニスト、すなわち、必ずしも受容体を活性化することなく、内因性リガンドまたはアゴニストと同じ結合部位（活性部位）でＣＸＣＲ４と可逆的に結合するアンタゴニストである。
所与のペプチドがＣＸＣＲ４と結合することができるかどうかを決定するための適切な方法は、本発明の複合体の文脈において上記で定義されており、本発明のポリペプチドに等しく適用可能である。いくつかの実施形態において、第２の領域は、１０－６Ｍ未満、１０－７Ｍ未満、１０－８Ｍ未満、１０－９Ｍ未満、１０－１０Ｍ未満、１０－１１Ｍ未満、１０－１２Ｍ未満、１０－１３Ｍ未満、１０－１４Ｍ未満または１０－１５Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）でＣＸＣＲ４と特異的に結合することができる。ポリペプチドが標的分子と結合することができるかどうかを決定する方法、および前記結合の解離定数を決定する方法は、本発明の第２の態様の「特異的結合」の定義において提供される。
本発明による使用に適したアンタゴニストは、天然リガンドＣＸＣＬ１２によるＣＸＣＲ４への結合に対して０．１μＭ以下、０．２μＭ以下、０．３μＭ以下、０．４μＭ以下、０．５μＭ以下、０．６μＭ以下、０．７μＭ以下、０．８μＭ以下、０．９μＭ以下、１μＭ以下、２μＭ以下、３μＭ以下、４μＭ以下、５μＭ以下、６μＭ以下、７μＭ以下、８μＭ以下、９μＭ以下、１０μＭ以下、１５μＭ以下、２０μＭ、３０μＭ以下、４０μＭ以下、５０μＭ以下、６０μＭ以下、７０μＭ以下、８０μＭ以下、９０μＭ以下または１００μＭ以下のＩＣ５０で競合することで特徴付けられる。
分子が拮抗的なＣＸＣＲ４リガンドであるかどうかを決定するための適切な方法は、例えば、参照によりそれらの内容が本明細書に組み込まれるZirafi et al. (Cell Rep. 2015, 11, 737)に示されている方法である。これらの方法としては、ＣＸＣＬ１２とＣＸＣＲ４との結合を阻害するアンタゴニストの能力の検出に基づくアッセイ（分子がリガンドであるかどうかの決定のため）、およびＨＥＸ２９３細胞等のＣＸＣＲ４発現細胞からのＣａ２＋の放出を阻害する分子の能力の検出に基づく方法、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞のＣＸＣＬ１２指向性トランスウェル移行（CXCL12-directed traswell migration）を阻害する分子の能力に基づく方法および／またはヒトＣＤ３４＋幹細胞のＣＸＣＬ１２誘導性移行を阻害する分子の能力の検出に基づく方法（分子がアンタゴニストとして作用するかどうかを決定するため）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本発明による拮抗的なＣＸＣＲ４リガンドを有するポリペプチドの第２の領域は、正に帯電したアミノ酸領域をさらに含む。
正に帯電したペプチド配列は、１種類の正に帯電したアミノ酸のみを含んでもよく、複数の種類の正に帯電したアミノ酸を含んでもよい。一つの実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、ポリアルギニン領域である。一つの実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、ポリリジン領域である。一つの実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、ポリヒスチジン領域である。一つの実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、リジン残基およびアルギニン残基を含む。一つの実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、リジン残基およびヒスチジン残基を含む。一つの実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、アルギニン残基およびヒスチジン残基を含む。一つの実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、リジン残基、アルギニン残基およびヒスチジン残基を含む。
いくつかの実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個または少なくとも１５個の正に帯電したアミノ酸残基を含み、該正に帯電したアミノ酸はアルギニン、リジン、ヒスチジンまたはそれらの組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、１００個未満、９０個未満、８０個未満、７０個未満、６０個未満、５０個未満、４０個未満、３０個未満、２９個未満、２８個未満、２７個未満、２６個未満、２５個未満、２４個未満、２３個未満、２２個未満、２１個未満、２０個未満、１９個未満、１８個未満、１７個未満、１６個未満、１５個未満、１４個未満、１３個未満、１２個未満、１１個未満、１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満またはそれ以下の正に帯電したアミノ酸残基を含み、該正に帯電したアミノ酸は、アルギニン、リジン、ヒスチジンまたはそれらの組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、２～５０個のアミノ酸、２～４０個のアミノ酸、２～３０個のアミノ酸、２～２５個のアミノ酸、２～２０個のアミノ酸、２～１０個のアミノ酸、２～８個のアミノ酸、３～７個のアミノ酸、４～７個のアミノ酸または５～７個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、３～５０個のアミノ酸、３～４０個のアミノ酸、３～３０個のアミノ酸、３～２５個のアミノ酸、３～２０個のアミノ酸、３～１０個のアミノ酸または３～８個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、４～５０個のアミノ酸、４～４０個のアミノ酸、４～３０個のアミノ酸、４～２５個のアミノ酸、４～２０個のアミノ酸、４～１０個のアミノ酸または４～８個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、５～５０個のアミノ酸、５～４０個のアミノ酸、５～３０個のアミノ酸、５～２５個のアミノ酸、５～２０個のアミノ酸、５～１０個のアミノ酸または５～８個のアミノ酸を含む。
別の実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個のアミノ酸、好ましくは６個のアミノ酸を含む。
本発明の一つの実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、アルギニン残基およびリジン残基を含む。本発明の好ましい実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、１～５個のアルギニン、好ましくは３個のアルギニン、および１～５個のリジン、好ましくは３個のリジンを含む。
本発明の一つの実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、アルギニン残基およびヒスチジン残基を含む。本発明の好ましい実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、１～５個のアルギニン、好ましくは３個のアルギニン、および１～５個のヒスチジン、好ましくは３個のヒスチジンを含む。
本発明の一つの実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、リジン残基およびヒスチジン残基を含む。本発明の好ましい実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、１～５個のリジン、好ましくは３個のリジン、および１～５個のヒスチジン、好ましくは３個のヒスチジンを含む。
本発明の実施形態において、本発明の複合体の正に帯電したペプチド配列は、ポリアルギニン領域である。本発明の好ましい実施形態において、ポリアルギニン領域は、２～１０個、好ましくは６個の隣接するアルギニン残基を含む。
本発明の実施形態において、本発明の複合体の正に帯電したアミノ酸に富む領域は、ポリリジン領域である。本発明の好ましい実施形態において、ポリリジン領域は、２～１０個、好ましくは６個の隣接するリジン残基を含む。
本発明の実施形態において、本発明の融合タンパク質の正に帯電したアミノ酸に富む領域は、ポリヒスチジン領域である。本発明の好ましい実施形態において、ポリヒスチジン領域は、２～１０個、好ましくは６個の隣接するポリヒスチジン残基を含む。
特定の実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、ＲＫＲＫＲＫ（配列番号７７）、ＲＲＲＲＲＲ（配列番号７８）、ＫＫＫＫＫＫ（配列番号７９）、ＨＨＨＨＨＨ（配列番号８０）、ＲＨＲＨＲＨ（配列番号８１）、ＲＫＲＫＲＫＲＫ（配列番号８２）、ＲＫＲＨＲＫ（配列番号８３）、ＲＫＲＨＲＨ（配列番号８４）またはＲＨＲＨＲＨ（配列番号８５）である。
好ましい実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、最適化されたＥＰＩ－Ｘ４の配列（配列番号２９）のＮ末端またはＣ末端、好ましくは最適化されたＥＰＩ－Ｘ４の配列（配列番号２９）のＣ末端に結合している。好ましい実施形態において、正に帯電したペプチド配列は、ＥＰＩ－Ｘ４の配列（配列番号１３２）のＮ末端またはＣ末端、好ましくはＥＰＩ－Ｘ４の配列（配列番号１３２）のＣ末端に結合している。
いくつかの実施形態において、本発明の第２のポリペプチドは、正に帯電したアミノ酸に富む領域である第３のポリペプチド領域をさらに含む。本発明の第２のポリペプチドの第３の領域として作用し得る適切な正に帯電したアミノ酸に富む領域は、本発明による複合体の第３のポリペプチド領域に関して上記で定義された通りである。好ましい実施形態において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、ポリヒスチジン領域である。本発明の好ましい実施形態において、ポリヒスチジン領域は、２～１０個、好ましくは６個の隣接するヒスチジン残基を含む。好ましい実施形態において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、ポリアルギニン領域である。本発明の好ましい実施形態において、ポリアルギニン領域は、２～１０個、好ましくは６個の隣接するアルギニン残基を含む。好ましい実施形態において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、ポリリジン領域である。本発明の好ましい実施形態において、ポリアルギニン領域は、２～１０個、好ましくは６個の隣接するリジン残基を含む。
好ましい実施形態において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、配列ＲＫＲＫＲＫ（配列番号７７）、ＲＲＲＲＲＲ（配列番号７８）、ＫＫＫＫＫＫ（配列番号７９）、ＨＨＨＨＨＨ（配列番号８０）、ＲＨＲＨＲＨ（配列番号８１）、ＲＫＲＫＲＫＲＫ（配列番号８２）、ＲＫＲＨＲＫ（配列番号８３）、ＲＫＲＨＲＨ（配列番号８４）またはＲＨＲＨＲＨ（配列番号８５）を含むかまたはそれからなる。
いくつかの実施形態において、本発明の第２のポリペプチドの第１、第２および第３の領域は、以下の順序で本発明の第２のポリペプチド内に位置する：
・Ｎ－第１のポリペプチド領域－第２のポリペプチド領域－第３のポリペプチド領域－Ｃ；
・Ｎ－第１のポリペプチド領域－第３のポリペプチド領域－第２のポリペプチド領域－Ｃ；
・Ｎ－第２のポリペプチド領域－第１のポリペプチド領域－第３のポリペプチド領域－Ｃ；
・Ｎ－第２のポリペプチド領域－第３のポリペプチド領域－第１のポリペプチド領域－Ｃ
・Ｎ－第３のポリペプチド領域－第１のポリペプチド領域－第２のポリペプチド領域－Ｃ；
・Ｎ－第３のポリペプチド領域－第２のポリペプチド領域－第１のポリペプチド領域－Ｃ。
したがって、本発明の第２のポリペプチドの要素は末端間で接続し得るが、好ましくはペプチド結合によって連結され、それらの間に挿入された１つ以上の任意のペプチドまたはポリペプチドである「リンカー」または「スペーサー」を含み得る。１つ以上のリンカーペプチドは、好ましくは少なくとも２個のアミノ酸、少なくとも３個のアミノ酸、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも６０個のアミノ酸、少なくとも７０個のアミノ酸、少なくとも８０個のアミノ酸、少なくとも９０個のアミノ酸または約１００個のアミノ酸を含む。リンカーペプチドの好ましい例は、グリシン、セリン、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択される２個以上のアミノ酸を含む。柔軟なリンカーの好ましい例は、ポリグリシンリンカーである。リンカー／スペーサー配列として考えられる例としては、ＧＧＳＳＲＳＳ（配列番号３９）、ＧＧＳＳＲＳＳＳ（配列番号７６）、ＳＧＧＴＳＧＳＴＳＧＴＧＳＴ（配列番号４９）、ＡＧＳＳＴＧＳＳＴＧＰＧＳＴＴ（配列番号５０）またはＧＧＳＧＧＡＰ（配列番号：５１）が挙げられる。これらの配列は、設計されたコイルドコイルと他のタンパク質ドメインとを結合するために用いられてきた［Muller, K.M., Arndt, K.M. and Alber, T., Meth. Enzymology, 2000, 328: 261-281］。適切なリンカーのさらなる非限定的な例は、アミノ酸配列ＧＧＧＶＥＧＧＧ（配列番号５２）、コイルドコイルによる二量体化抗体の生成に用いられるマウスＩｇＧ３の上部ヒンジ領域の１０アミノ酸残基の配列（ＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳ、配列番号５３）［Pack, P. and Pluckthun, A., 1992, Biochemistry 31:1579-1584］、配列ＡＰＡＥＴＫＡＥＰＭＴ（配列番号５４）のペプチド、配列ＧＡＰのペプチド、配列ＡＡＡのペプチドおよび配列ＡＡＡＬＥ（配列番号５５）のペプチドを含む。好ましい実施形態において、リンカーはＧＧＳＳＲＳＳ（配列番号３９）である。
いくつかの実施形態において、本発明の第２のポリペプチドの異なる領域を接続するリンカーの存在に応じて、また本発明の第２のポリペプチドを形成する要素の順序に応じて、本発明の第２のポリペプチドは、以下の要素の配置を有し得る（ここで、要素についての上記の番号付けは以下の通りである：（１）第１の領域ポリペプチド、（２）第２のポリペプチド領域、（３）第３のポリペプチド領域）：
・Ｎ－（１）－（２）－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－（２）－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－（２）－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－（２）－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（３）－（２）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－リンカー－（２）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－（２）－リンカー－（１）－Ｃ
・Ｎ－（３）－リンカー－（２）－リンカー－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－（１）－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－リンカー－（１）－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－（１）－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－リンカー－（１）－リンカー－（３）－Ｃ
・Ｎ－（２）－（３）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－リンカー－（３）－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－（３）－リンカー－（１）－Ｃ
・Ｎ－（２）－リンカー－（３）－リンカー－（１）－Ｃ
・Ｎ－（１）－（３）－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－（３）－リンカー－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－（３）－（２）－Ｃ
・Ｎ－（１）－リンカー－（３）－リンカー－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－（１）－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－リンカー－（１）－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－（１）－リンカー－（２）－Ｃ
・Ｎ－（３）－リンカー－（１）－リンカー－（２）－Ｃ。
拮抗的なＣＸＣＲ４リガンドを有する好ましい融合タンパク質は、以下の表に定義される通りである。
Figure 2023509004000008
Figure 2023509004000009
ＶＩＩ－本発明のナノ粒子およびその調製方法
さらなる態様において、本発明は、本発明の第６の態様による複合体の複数のコピーを含むナノ粒子を調製する方法であって、前記複合体の調製物を、前記複合体の複数のコピーを集合させてナノ粒子とするのに適切な条件下に置くことを含む方法に関する。
「複合体」という用語は、本発明による複合体の文脈において上記で定義されており、本発明の方法に等しく適用可能である。
別の態様において、本発明は、本発明の第６の態様による複合体の複数のコピーを含むナノ粒子を調製する方法であって、
（ｉ）それぞれが
１．ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体である第１のポリペプチド領域、
２．目的の標的と特異的に結合することができる第２のポリペプチドであって、ポリカチオン性ペプチドである第２のポリペプチド、および
３．正に帯電したアミノ酸に富む領域である第３のポリペプチド領域
を含む複数のポリペプチドを、前記ポリペプチドの複数のコピーを含むナノ粒子を形成するのに適切な条件下に置くことであって、
前記ポリカチオン性ペプチドおよび正に帯電したアミノ酸に富む領域がポリペプチドの末端に位置し、該ポリペプチドが活性化形態で提供され、該活性化形態のポリペプチドが反応性基を含む、前記置くこと、および
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られたナノ粒子と、前記ポリペプチド中の反応性基とを反応することができる基を含む目的の剤の活性化形態とを、前記ポリペプチド中の反応性基と前記目的の剤の基との間の結合を形成するのに適切な条件下で接触させること
を含む方法に関する。
「第１のポリペプチド領域」、「第２のポリペプチド領域」および「第３のポリペプチド領域」という用語は、本発明の複合体を形成するポリペプチドの文脈において上記で定義されており、複合体の複数のコピーを含むナノ粒子を得る方法に等しく適用可能である。
本明細書で用いられる「ポリペプチドの複数のコピーを含むナノ粒子を形成するのに適切な条件」という用語は、サンプル中のポリペプチドのかなりの割合をナノ粒子に組み込むのに適した任意の条件を指す。一つの実施形態において、前記条件は、集合させる複合体またはポリペプチドを低塩緩衝液中でインキュベートすることを含む。
当業者が理解するように、「ナノ粒子」は、サイズがナノメートルで測定される微細な粒子である。本発明のナノ粒子は、前のセクションで定義された本発明の第６の態様の複合体または複合体のポリペプチドの複数のコピーの集合から生じるナノ粒子を含む。上記の方法（ｉ）および（ｉｉ）において、ナノ粒子の調製に用いられる本発明の第６の態様の複合体または複合体のポリペプチドは、熱力学的に非共有静電結合を形成しやすく、低塩緩衝液の条件で自発的に集合する。特定の実施形態において、本発明の第６の態様の複合体の熱力学的に有利な複合体またはポリペプチドは、本発明の第６の態様の複合体のポリペプチドに含まれる第１、第２および第３のポリペプチド領域を含む。特定の実施形態において、ポリペプチド、または複合体に含まれるポリペプチドは、本発明の第６の態様で定義されるポリペプチドであり、第２のポリペプチド領域は、第１のポリペプチド領域のＮ末端に位置するポリカチオン性ペプチドであり、第３のポリペプチド領域は、複合体の第１のポリペプチド領域のＣ末端に位置する。
特定の実施形態において、本発明の第８の態様の方法（ｉ）において、複合体の複数のコピーを集合させてナノ粒子とするのに適切な条件は、低塩緩衝液中でのインキュベーションを含む。別の特定の実施形態において、本発明の第８の態様の方法（ｉｉ）において、ポリペプチドの複数のコピーを集合させてナノ粒子とするのに適切な条件は、低塩緩衝液中でのインキュベーションを含む。
「低塩緩衝液」という表現は、水に１種以上の塩を溶解することにより生じる、ｐＨの変化を緩和する能力を有する任意の緩衝液を含み、溶解される１種以上の塩の量は、例えば細胞質または細胞外培地等の生理液の浸透圧と同じかまたは低い浸透圧をもたらす。したがって、低塩緩衝液は、ｐＨおよび浸透圧を生理学的値の範囲内に保つと理解され、生理学的温度の範囲内で用いられる。
当業者は、生理学的温度の範囲が１５～４５℃の間、より好ましくは２０～４０℃の間、より一層好ましくは２５～３９℃の間、さらにより一層好ましくは３０～３７℃の間で振れ得ることを理解するであろう。当業者はまた、低塩緩衝液の浸透圧が１００～４００ミリオスモル／Ｌ（ｍＯｓｍ／Ｌ）、好ましくは１５０～３５０ｍＯｓｍ／Ｌ、より好ましくは２００～３００ｍＯｓｍ／Ｌ、より一層好ましくは２２５～２７５ｍＯｓｍ／Ｌの範囲にあることを理解するであろう。
いくつかの実施形態において、低塩緩衝液は、ｐＨ４～ｐＨ７、好ましくはｐＨ５～ｐＨ６、より好ましくは約ｐＨ５．３、ｐＨ６．５またはｐＨ７．２のｐＨを有する。
いくつかの実施形態において、低塩緩衝液は、炭酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、トリス緩衝液およびリン酸緩衝液からなる群から選択される。例えば、本発明に適した低塩緩衝液は、例えば、トリス－デキストロース緩衝液（２０ｍＭトリス＋５％デキストロース、ｐＨ７．４）、トリス－ＮａＣｌ緩衝液（２０ｍＭトリス、５００ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）、ＰＢＳ－グリセロール緩衝液（当技術分野でよく知られているリン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ、ｐＨ７．４、＋１０％グリセロール）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）－デキストロース（当技術分野でよく知られている２０ｍＭトリス－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５、２００ＮａＣｌ、＋５％デキストロース）、トリス緩衝生理食塩水－Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）緩衝液（１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）、または当技術分野において知られているｐＨ６未満の任意の生理緩衝液である。
一つの実施形態において、低塩緩衝液は、ポリソルベート８０および／またはスクロースをさらに含む。さらに別の実施形態において、低塩緩衝液中のスクロースは、２０～１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは５０～９０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは７０ｍｇ／ｍｌの濃度である。
一つの実施形態において、低塩緩衝液は、ポリソルベート８０（０．４ｍｇ／ｍｌ）、スクロース（８０ｍｇ／ｍｌ）、クエン酸ナトリウム二水和物（２．７ｍｇ／ｍｌ）および無水クエン酸（０．１４６ｍｇ／ｍｌ）を含み、ｐＨが約６．５のクエン酸緩衝液である。
一つの実施形態において、低塩緩衝液は、スクロース（７０ｍｇ／ｍｌ）、氷酢酸（０．１２ｍｇ／ｍｌ）、酢酸ナトリウム三水和物（２．４５ｍｇ／ｍｌ）を含み、ｐＨが約５．３の酢酸緩衝液である。
別の実施形態において、低塩緩衝液は、ポリソルベート８０（０．０５ｍｇ／ｍｌ）、スクロース（５０ｍｇ／ｍｌ）、リン酸二水素ナトリウム一水和物（０．２２ｍｇ／ｍｌ）、リン酸二水素ナトリウム無水物（０．４９ｍｇ／ｍｌ）を含み、ｐＨが約７．２のリン酸緩衝液である。
いくつかの実施形態において、ナノ粒子を得る方法を行うのに適した低塩緩衝液は、
○４０～１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは８０ｍｇ／ｍｌの濃度のスクロース、
○０．０１～１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは４ｍｇ／ｍｌの濃度のポリソルベート８０、
○２．７ｍｇ／ｍｌの濃度のクエン酸ナトリウム二水和物、
○０．１４６ｍｇ／ｍｌの濃度の無水クエン酸
を含み、ｐＨがｐＨ５～ｐＨ９、好ましくはｐＨ７～ｐＨ８、より好ましくはｐＨ６．５のＡ９緩衝液である。
いくつかの実施形態において、ナノ粒子を得る方法を行うのに適した低塩緩衝液は、
－５０～９０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは７０ｍｇ／ｍｌの濃度のスクロース、
－０．０５～２５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１２ｍｇ／ｍｌの濃度の氷酢酸、
－１～４ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは２．４５ｍｇ／ｍｌの濃度の酢酸ナトリウム三水和物
を含み、ｐＨがｐＨ４～ｐＨ７、好ましくはｐＨ５～ｐＨ６、より好ましくはｐＨ５．３のＢ６緩衝液である。
いくつかの実施形態において、ナノ粒子を得る方法を行うのに適した低塩緩衝液は、
－４０～６０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５０ｍｇ／ｍｌの濃度のスクロース、
－０．０１～１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度のポリソルベート８０、
－０．１～０．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２２ｍｇ／ｍｌの濃度のリン酸一ナトリウム一水和物（sodium phosphate monobasic monohydrate）、
－０．２～１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．４９ｍｇ／ｍｌの濃度のリン酸二ナトリウム無水物
を含み、ｐＨがｐＨ５～ｐＨ９、好ましくはｐＨ７～ｐＨ８、より好ましくはｐＨ７．２のＤ１緩衝液である。
本発明者らはさらに、２つのタイプの融合タンパク質をオリゴマー化させることによってバイパラトピックナノ粒子を生成した：第１のタイプの融合タンパク質はＴ２２ ＣＸＣＲ４リガンドおよび足場タンパク質を含み、第２のタイプの融合タンパク質はＥＰＩ－Ｘ４拮抗性ＣＸＣＲ４リガンドおよび同じ足場を含む。これらのバイパラトピックナノ粒子は、Ｔ２２ＣＸＣＲ４リガンドを含む融合タンパク質またはＥＰＩ－Ｘ４ＣＸＣＲ４リガンドを単独で含む融合タンパク質である単一タイプの融合タンパク質によって形成されるナノ粒子よりも、ｉｎ ｖｉｔｏｒｏでＣＸＣＲ４＋細胞においてより高いレベルの内在化を示した。マウスモデルに投与した場合、バイパラトピックナノ粒子は、単一タイプの融合タンパク質を含む２種類のモノパラトピックナノ粒子のいずれよりも、腫瘍細胞におけるより高いレベルの内在化および腫瘍細胞におけるより多くのアポトーシス体を示した。
別の態様において、本発明は、本発明の第６の態様による２つの異なるタイプの複合体の複数のコピーを含むバイパラトピックナノ粒子を調製する方法であって、第１のタイプの複合体の第２のポリペプチドの配列と第２のタイプの複合体の第２のポリペプチドの配列とが異なり、前記２つのタイプの複合体の調製物を低塩緩衝液中に置くことを含む方法に関する。
第９の態様において、本発明は、第１のタイプの複合体の複数のコピーおよび第２のタイプの複合体の複数のコピーを含むバイパラトピックナノ粒子を調製する方法であって、前記第１および第２のタイプの複合体が異なるポリカチオン性ペプチド配列を有し、前記第１のタイプの複合体の調製物と前記第２のタイプの複合体の調製物とを、該２つのタイプの複合体の複数のコピーを集合させてナノ粒子とするのに適切な条件下で接触させることを含む方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、本発明による第１のタイプの複合体の複数のコピーおよび本発明による第２のタイプの複合体の複数のコピーを含むバイパラトピックナノ粒子を調製する方法であって、前記第１および第２のタイプの複合体が異なるポリカチオン性ペプチド配列を有し、
ｉ．第１のポリペプチドの調製物と第２のポリペプチドの調製物とを接触させることであって、前記第１のタイプおよび第２のポリペプチドが、
（ｉ）ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体である第１のポリペプチド領域、
（ｉｉ）目的の標的と特異的に結合することができる第２のポリペプチド領域であって、前記第２のポリペプチドがポリカチオン性ペプチドであり、かつ一つのポリペプチドのポリカチオン性ペプチドの配列と他のポリペプチドのポリカチオン性ペプチドの配列とが異なる、第２のポリペプチド領域、
（ｉｉｉ）正に帯電したアミノ酸に富む領域である第３のポリペプチド領域
を含み、
前記ポリカチオン性ペプチドおよび前記正に帯電したアミノ酸に富む領域が前記ポリペプチドの末端に位置し、
前記ポリペプチドが活性化形態で提供され、該活性化形態のポリペプチドが反応性基を含み、前記置くことが、ポリペプチドの複数のコピーを含むナノ粒子を形成するのに適切な条件下で行われ、
ｉｉ．工程ｉで得られたナノ粒子と、各ポリペプチド中の反応性基と反応することができる基を含む目的の剤の活性化形態とを、前記ポリペプチド中の反応性基と前記目的の剤中の基との間の結合を形成するのに適切な条件下で接触させこと
を含む方法に関する。
本明細書で用いられる場合、「バイパラトピックナノ粒子」という用語は、少なくとも２つのタイプの複合体によって形成されるナノ粒子を指し、該２つのタイプの複合体は、目的の標的と特異的に結合する配列の性質が異なるポリペプチドを含み、これらの配列は異なる受容体に対するリガンドであるか、より好ましくは同じ受容体に対する２つの異なるリガンドのいずれかである。
上記の方法において第１のタイプまたは第２のタイプの複合体として用いることができる適切な複合体は、本発明による複合体の文脈において上記で定義された通りである。いくつかの実施形態において、複合体を形成するポリペプチドの第１の領域は、それぞれ配列番号６４、６５および８７～１０４として定義されるＮＩＤＯｍｕｔ２、ＮＩＤＯｍｕｔ３、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｖ４５Ｔ、ＮＩＤＯｍｕｔ３＿Ｖ１２１Ｑ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｆ１５７Ｅ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｖ２１５Ｔ、ＮＩＤＯｍｕｔ４、ＮＩＤＯｍｕｔ４＿Ｔ２１５Ｖ、ＮＩＤＯｍｕｔ５、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｖ１７６Ｔ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｉ２００Ｔ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｖ２３６Ｙ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｌ２３７Ｔ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｓ６５Ｉ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｒ１１４Ｉ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｃ２１４Ｓ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｓ６５Ｉ＿Ｒ１１４Ｉ、ＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｓ６５Ｉ＿Ｒ１１４Ｉ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｓ６５＿Ｒ１１４ＩおよびＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｓ６５Ｉ＿Ｒ１１４Ｉからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、複合体を形成するポリペプチドの第２の領域は、ＣＸＣＲ４リガンド、より好ましくは配列ＲＲＷＣＹＲＫＣＹＫＧＹＣＹＲＫＣＲ（配列番号２５）を有するＴ２２ペプチド、Ｖ１ペプチド（配列番号２６）、ＣＸＣＬ１２ペプチド（配列番号２７）、ｖＣＣＬ２ペプチド（配列番号２８）および最適化されたＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号ＮＯ：２９）またはＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号１３２）であり、ＥＰＩ－Ｘ４配列または最適化されたＥＰＩ－Ｘ４配列は、ポリカチオン性ペプチド、好ましくは配列ＲＫＲＫＲＫ（配列番号７７）を有するペプチドと融合物として提供されてもよい。いくつかの実施形態において、複合体の一部を形成するポリペプチドの第３の領域は、ＲＫＲＫＲＫ（配列番号７７）、ＲＲＲＲＲＲ（配列番号７８）、ＫＫＫＫＫＫ（配列番号７９）、ＨＨＨＨＨＨ（配列番号８０）、ＲＨＲＨＲＨ（配列番号８１）、ＲＫＲＫＲＫＲＫ（配列番号８２）、ＲＫＲＨＲＫ（配列番号８３）、ＲＫＲＨＲＨ（配列番号８４）またはＲＨＲＨＲＨ（配列番号８５）からなる群から選択される正に帯電したアミノ酸に富む領域である。
いくつかの実施形態において、バイパラトピックナノ粒子を調製する方法において用いられる第１および第２のタイプの複合体はいずれもＣＸＣＲ４リガンドを含み、前記リガンドは配列ＲＲＷＣＹＲＫＣＹＫＧＹＣＹＲＫＣＲ（配列番号２５）を有するＴ２２ペプチド、および最適化されたＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号２９）またはＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号１３２）であり、最適化されたＥＰＩ－Ｘ４配列またはＥＰＩ－Ｘ４配列はポリカチオン性ペプチド、好ましくは配列ＲＫＲＫＲＫ（配列番号７７）を有するペプチドとの融合物として提供され得る。
上述したバイパラトピックナノ粒子を調製する方法において、ナノ粒子の調製に用いられる２つのタイプの複合体の複合体またはポリペプチドは、熱力学的に非共有静電結合を形成しやすく、低塩緩衝液の条件で自発的に集合する。バイパラトピックナノ粒子を調製する方法において、２つの複合体の複数のコピーを集合させてバイパラトピックナノ粒子とするのに適した条件は、本発明の第８の態様による方法において複合体の複数のコピーを集合させてナノ粒子とするのに適切な条件と同様である。
一つの実施形態において、低塩緩衝液は、ポリソルベート８０および／またはスクロースをさらに含む。さらに別の実施形態において、低塩緩衝液中のスクロースは、２０～１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは５０～９０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは７０ｍｇ／ｍｌの濃度である。
一つの実施形態において、低塩緩衝液は、ポリソルベート８０（０．４ｍｇ／ｍｌ）、スクロース（８０ｍｇ／ｍｌ）、クエン酸ナトリウム二水和物（２．７ｍｇ／ｍｌ）および無水クエン酸（０．１４６ｍｇ／ｍｌ）を含み、ｐＨが約６．５のクエン酸緩衝液である。
一つの実施形態において、低塩緩衝液は、スクロース（７０ｍｇ／ｍｌ）、氷酢酸（０．１２ｍｇ／ｍｌ）、酢酸ナトリウム三水和物（２．４５ｍｇ／ｍｌ）を含み、ｐＨが約５．３の酢酸緩衝液である。
別の実施形態において、低塩緩衝液は、ポリソルベート８０（０．０５ｍｇ／ｍｌ）、スクロース（５０ｍｇ／ｍｌ）、リン酸二水素ナトリウム一水和物（０．２２ｍｇ／ｍｌ）、リン酸二水素ナトリウム無水物（０．４９ｍｇ／ｍｌ）を含み、ｐＨが約７．２のリン酸緩衝液である。
好ましい実施形態において、バイパラトピックナノ粒子を得る方法において用いられる緩衝液は、Ａ９緩衝液、Ｂ６緩衝液およびＤ１緩衝液を含む群から選択され、その組成は上記に記載されている。
本発明の好ましい実施形態において、本発明の第８の態様の方法（ｉｉ）において、複合体のポリペプチドの複数のコピーを集合させてナノ粒子とするのに適切な低塩緩衝液は、炭酸緩衝液、トリス緩衝液およびリン酸緩衝液からなる群から選択される。
本発明の特に好ましい実施形態において、本発明の第８の態様の方法（ｉｉ）の低塩緩衝液は、１００～３００ｎＭの濃度で重炭酸ナトリウムを含む炭酸塩緩衝液である。本発明の別の特に好ましい実施形態において、本発明の第８の態様の方法（ｉｉ）の低塩緩衝液は、１０～３０ｎＭの濃度でトリスを含むトリス緩衝液である。本発明の第８の態様の方法（ｉｉ）の別の特に好ましい実施形態において、本発明の低塩緩衝液は、５～２０ｍＭの総濃度でＮａ２ＨＰＯ４およびＮａＨ２ＰＯ４を含むリン酸緩衝液である。
本発明のより一層好ましい実施形態において、本発明の第８の態様の方法（ｉｉ）の低塩緩衝液は、デキストロースおよび／またはグリセロールをさらに含む。
本発明のさらにより一層好ましい実施形態において、本発明の第８の態様の方法（ｉｉ）の低塩緩衝液は、６．５～８．５のｐＨを有する。
第１０の態様において、本発明は、本発明による複合体の複数のコピーまたは本発明による拮抗的なＣＸＣＲ４リガンドを含むポリペプチドの複数のコピーを含むナノ粒子、または上記で説明したいずれかの方法によって得られるナノ粒子に関する。これらのナノ粒子は、単一のタイプの複合体または単一のタイプのポリペプチドによって形成され、したがって、それらは単一特異性（すなわち、ナノ粒子を形成するすべての複合体またはポリペプチドが単一のタイプの標的分子に結合する）であり、およびモノパラトピック（すなわち、ナノ粒子を形成するすべての複合体またはポリペプチドが標的分子の同じ領域に結合する）であると理解されるであろう。
したがって、本発明のナノ粒子は、本発明の第６の態様の複合体の複数のコピーの集合体を含み、生理学的条件におけるそれらの共有的な結合および連結に有利に作用するそれらの構造中の領域間の静電相互作用により生成される。ナノ粒子を調製するための本発明の方法は、本発明の第６の態様の複合体の調製物または複合体のポリペプチドの調製物を低塩緩衝液に入れることを含むので、このようにして形成されたナノ粒子はまた、本発明の第６の態様の複合体の複数のコピーの集合体を含むと理解される。
特定の実施形態において、複合体は、本発明の第６の態様で定義される複合体として存在し、複合体の第２のポリペプチド領域は、複合体の第１のポリペプチド領域のＮ末端に位置するポリカチオン性ペプチドであり、複合体の第３のポリペプチド領域は、複合体の第１のポリペプチド領域のＣ末端に位置する。
いくつかの実施形態において、本発明によるナノ粒子は、ナノ粒子を形成する複合体のポリカチオン性ペプチドがＣＸＣＲ４リガンドであることを特徴とする。いくつかの実施形態において、ナノ粒子を形成する複合体またはポリペプチドのポリカチオン領域は、配列ＲＲＷＣＹＲＫＣＹＫＧＹＣＹＲＫＣＲ（配列番号２５）、Ｖ１ペプチド（配列番号２６）、ＣＸＣＬ１２（配列番号２７）ペプチド、ｖＣＣＬ２（配列番号２８）およびそれらの機能的に同等の変異体からなる群から選択される。ナノ粒子が本発明による拮抗的なＣＸＣＲ４リガンドを含むポリペプチドの複数のコピーの集合から生じるいくつかの実施形態において、拮抗的なＣＸＣＲ４リガンドは最適化されたＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号２９）、ＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号１３２）またはそれらの機能的に同等の変異体である。いくつかの実施形態において、ＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号２９）または最適化されたＥＰＩ－Ｘ４配列は、ＲＫＲＫＲＫ（配列番号７７）配列に結合される。
第１１の実施形態において、本発明は、本発明の第１のタイプの複合体および第２のタイプの複合体の複数のコピーを含むバイパラトピックナノ粒子であって、前記第１および第２のタイプの複合体のポリカチオン性ペプチドが異なるバイパラトピックナノ粒子に関する。いくつかの実施形態において、本発明によるナノ粒子は、ナノ粒子を形成する第１のタイプの複合体および第２のタイプの複合体のポリカチオン性ペプチドがＣＸＣＲ４リガンドであることを特徴とする。いくつかの実施形態において、ナノ粒子を形成する複合体またはポリペプチドのポリカチオン領域は、配列ＲＲＷＣＹＲＫＣＹＫＧＹＣＹＲＫＣＲ（配列番号２５）、Ｖ１ペプチド（配列番号２６）、ＣＸＣＬ１２ペプチド（配列番号２７）、ｖＣＣＬ２（配列番号２８）およびそれらの機能的に同等の変異体からなる群から選択される。ナノ粒子が本発明による拮抗的なＣＸＣＲ４リガンドを含むポリペプチドの複数のコピーの集合から生じるいくつかの実施形態において、拮抗的なＣＸＣＲ４リガンドは最適化されたＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号２９）、ＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号１３２）またはそれらの機能的に同等の変異体である。いくつかの実施形態において、最適化されたＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号２９）またはＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号１３２）は、ＲＫＲＫＲＫ（配列番号７７）配列に結合される。
第１２の実施形態において、本発明は、本発明による複合体の複数のコピーを含むバイパラトピックナノ粒子であって、ポリカチオン領域がＣＸＣＲ４リガンドであり、ポリペプチドの複数のコピーが本発明による拮抗的なＣＸＣＲ４リガンドを含むバイパラトピックナノ粒子に関する。拮抗的なＣＸＣＲ４リガンドを含む複合体およびポリペプチドは、ＣＸＣＲ４内の異なる領域に結合し、したがって、単一特異性であるにもかかわらず、それらはバイパラトピックであることが理解されよう。
いくつかの実施形態において、バイパラトピックナノ粒子の複合体に含まれるＣＸＣＲ４リガンドは、配列ＲＲＷＣＹＲＫＣＹＫＧＹＣＹＲＫＣＲ（配列番号２５）、Ｖ１ペプチド（配列番号２６）、ＣＸＣＬ１２ペプチド（配列番号２７）、ｖＣＣＬ２ペプチド（配列番号２８）、最適化されたＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号２９）、ＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号１３２）およびそれらの機能的に同等の変異体を含むペプチドからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、バイパラトピックナノ粒子を形成するポリペプチドに含まれるＣＸＣＲ４拮抗的リガンドは、最適化されたＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号２９）およびその機能的に同等の変異体である。いくつかの実施形態において、最適化されたＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号２９）は、ＥＰＩ－Ｘ４配列とＲＫＲＫＲＫ配列（配列番号７７）との融合から生じるポリカチオン領域の一部を形成して提供される。
一つの実施形態において、本発明によるバイパラトピックナノ粒子は、ポリカチオン性ペプチドが配列ＲＲＷＣＹＲＫＣＹＫＧＹＣＹＲＫＣＲを含む本発明による複合体によって、およびＣＸＣＲ４拮抗的リガンドが最適化されたＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号２９）であるＣＸＣＲ４拮抗的リガンドを含むポリペプチドによって、任意にポリカチオン性配列、好ましくはＲＫＲＫＲＫ配列（配列番号７７）との融合ペプチドの一部を形成することによって形成される
本発明によるバイパラトピックナノ粒子の好ましい形態は、表３で定義される好ましい複合体のいずれか、および表５で定義されるアンタゴニストリガンドを含む好ましい融合タンパク質のいずれかによって形成される。バイパラトピックナノ粒子の一部を形成する第１のタイプの複合体（表３に例示されているもの）は、上記で定義した目的の剤を含まない。いくつかの実施形態において、バイパラトピックナノ粒子の一部を形成する第１のタイプの複合体は、目的の剤、好ましくは本発明の複合体の文脈において上記で定義されたもののいずれか、より好ましくはフロクスウリジン、より一層好ましくはフロクスウリジン五量体を含む。
特定の実施形態において、「ナノ粒子のポリペプチド」、「ナノ粒子の第１のポリペプチド」、「ナノ粒子の第２のポリペプチド」、「ナノ粒子のポリカチオン性ペプチド」、「ナノ粒子のＣＸＣＲ４リガンド」、「ナノ粒子の第３のポリペプチド」、「ナノ粒子のポリペプチド領域」、「ナノ粒子の目的の剤」、「目的の剤とナノ粒子との間の連結部分」または「正に帯電したペプチド配列」は、集合して本発明のナノ粒子となった複合体の部分であってナノ粒子の対応する構成要素を指す。したがって、構成要素は、本発明の複合体の文脈において上記で定義された通りであり、したがって、本発明の複合体の対応する部分としてのものである。
当業者は、本発明のバイパラトピックナノ粒子を含む本発明のナノ粒子のサイズが、１～１０００ｎｍ、より好ましくは２．５～５００ｎｍ、より一層好ましくは５～２５０ｎｍ、さらにより一層好ましくは１０～１００ｎｍの範囲にあり得ることを理解するであろう。
本発明の好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子は、１０～１００ｎｍの直径を有する。別の好ましい実施形態において、本発明のバイパラトピックナノ粒子は、１０～１００ｎｍの直径を有する。
当業者に理解されるように、本発明のバイパラトピックナノ粒子は、本発明のナノ粒子の１つと見なされる。したがって、好ましい実施形態において、「本発明のナノ粒子」または「ナノ粒子」に言及する場合、本明細書で定義されるようなバイパラトピックナノ粒子もまた指定される。
特定の実施形態において、本発明の第１、第２、第３、第４、第５、第６および第７の態様に記載されているすべての用語および実施形態は、本発明の第８の態様に等しく適用可能である。別の実施形態において、本発明の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７および第８の態様に記載されているすべての用語および実施形態は、本発明の第９の態様に等しく適用可能である。
ＶＩＩＩ－本発明の複合体およびナノ粒子の医薬的使用
第１２の態様において、本発明は、医薬における使用のための本発明による複合体またはナノ粒子に関する。別の態様において、本発明は、本発明の複合体の一部を形成する治療薬に応答する疾患に罹患している患者の治療のための、本発明による複合体またはナノ粒子の使用に関する。
本明細書で用いられる場合、「治療する（treat）」、「治療（reatment）」および「治療する（treating）」という用語は、状態、障害または疾患の進行、重症度および／または継続期間の軽減もしくは改善、または１つ以上の症状（好ましくは１つ以上の認識可能な症状）、状態、障害または疾患の改善を指す。「治療する」、「治療」および「治療する」という用語はまた、必ずしも患者によって認識可能ではない状態、障害または疾患の少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善を指す。さらに、「治療する」、「治療」および「治療する」とはまた、物理的に、例えば認識可能な症状の安定化によって、生理的に、例えば身体的なパラメータの安定によって、またはそれらの両方によって状態、障害または疾患の進行を阻害することを指す。「治療する」、「治療」および「治療する」とはまた、状態、障害または疾患の軽減または安定化も指し得る。
当業者は、本発明の複合体またはナノ粒子は、医薬において使用することにより、治療反応を誘導するために患者に投与することができることを理解するであろう。
治療反応には、患者が罹患している病的状態または疾患の原因の抑制、軽減または阻止；状態または疾患の兆候の除去、軽減、阻止または改善；または患者における状態または疾患の進行の減衰、停止または減速が含まれる。
当業者は、医薬における使用に適した本発明の複合体またはナノ粒子が、薬学的に許容可能な担体を伴って提示され得ることを理解するであろう。本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、非毒性、不活性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料または任意のタイプの製剤補助剤を意味する。Remington's Pharmaceutical Sciences. Ed. by Gennaro, Mack Publishing, Easton, Pa., 1995には、医薬組成物の処方に用いられる様々な担体およびその調製のための既知の技術が開示されている。
したがって、本発明の複合体またはナノ粒子および薬学的に許容可能な担体を含む組成物は、医薬組成物である。
本発明の医薬組成物は、経口経路および非経口経路を含む当技術分野で知られている任意の手段によって患者に投与することができる。そのような実施形態によれば、本発明の組成物は、注射（例えば、静脈内、皮下または筋肉内、腹腔内への注射）によって、直腸に、膣に、局所的に（粉末、クリーム、軟膏または滴等による）、または吸入（スプレー等による）によって投与され得る。
ＶＩＩ．Ａ－癌の治療における本発明の複合体またはナノ粒子の使用
本発明の別の実施形態は、癌の治療における使用のための本発明の複合体もしくはナノ粒子またはそれらの対応する医薬組成物であって、複合体のポリペプチドまたは少なくともナノ粒子のポリペプチドが細胞表面の受容体と特異的に相互作用して細胞への複合体またはナノ粒子の内在化を促進することができる配列を含み、前記受容体を発現する細胞が癌中に存在する腫瘍細胞である複合体、ナノ粒子または医薬組成物に関する。
特定の実施形態において、使用のための前記複合体の目的の剤、または使用のための前記ナノ粒子の目的の剤、または使用のための対応する医薬組成物の複合体もしくはナノ粒子の目的の剤は、
（ｉ）化学療法剤、
（ｉｉ）細胞毒性ポリペプチド、
（ｉｉｉ）抗血管新生ポリペプチド、
（ｉｖ）腫瘍抑制遺伝子によってコードされるポリペプチド、
（ｖ）アポトーシス促進性ポリペプチド、
（ｖｉ）抗転移活性を有するポリペプチド、
（ｖｉｉ）腫瘍に対する免疫応答を活性化することができるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、
（ｖｉｉｉ）抗血管新生分子、および
（ｉｘ）毒素
からなる群から選択される治療薬である。
本明細書で用いられる場合、「治療する（treat）」、「治療（treatment）」および「治療する（treating）」という用語は、癌の進行、重症度および／または継続期間の軽減もしくは改善、または１つ以上の癌の症状（好ましくは、１つ以上の認識可能な症状）の改善を指す。「治療する」、「治療」および「治療する」という用語はまた、腫瘍の成長等、必ずしも患者によって認識可能ではない、癌の少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善を指す。さらに、「治療する」、「治療」および「治療する」とはまた、物理的に、例えば認識可能な症状の安定化によって、生理的に、例えば身体的なパラメータの安定化によって、またはそれらの両方によって、癌の進行を阻害することを指す。「治療する」、「治療」および「治療する」とはまた、腫瘍サイズまたは癌性細胞数の減少または安定化も指し得る。
「癌」という用語は、他の組織、器官または一般に生体の離れた部位に浸潤または拡散（転移）する可能性のある、異常な制御されていない細胞の成長および増殖（新生組織形成）を伴う一群の疾患を指し；転移は、悪性の癌および癌性腫瘍の特徴の１つである。癌細胞の異常な成長および／または増殖は、それらの正常な生理機能を変化させる遺伝的要因と環境要因の組み合わせの結果である。癌性細胞の成長および／または増殖の異常は、影響を受ける細胞型、組織および器官の機能不全または機能喪失によって、生理学的障害、および多くの場合、個体の死をもたらす。
「癌」という用語には、限定されないが、腺腫、血管肉腫、星状細胞腫、上皮性腫瘍、胚細胞腫、グリア芽腫、神経膠腫、血管内皮腫、血管肉腫、血腫、肝芽腫、白血病、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、神経芽細胞腫、肝胆道癌、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫および奇形腫等の腫瘍に加えて；限定されないが、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、腎臓癌、脳腫瘍、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、心臓癌、小腸癌、脾臓癌、腎臓癌、膀胱癌、頭部癌、頸部癌、皮膚癌、骨癌、骨髄腫、血液癌、胸腺癌、子宮癌、睾丸癌、肝胆道系癌および肝臓癌が含まれる。さらに、この用語には、末端黒子型黒色腫、光線角化症腺癌（actinic keratosis adenocarcinoma）、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、星状細胞腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、気管支腺癌、毛細血管癌腫、癌腫、癌肉腫、胆管癌、嚢胞腺腫、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、上衣系肉腫、ユーイング肉腫、限局性結節性過形成、胚細胞腫瘍、グリア芽腫、グルカゴン産生腫瘍、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝細胞腺腫、肝細胞腺腫症、肝細胞癌、肝胆汁性癌、膵島細胞腫、上皮内癌、扁平上皮細胞上皮内癌、潤性扁平上皮癌、大細胞癌、平滑筋肉腫、黒色腫、悪性黒色腫、悪性中皮腫瘍、髄芽細胞腫、髄様上皮腫、粘膜表皮癌、神経芽細胞腫、神経上皮腺癌、結節性黒色腫、骨肉腫、漿液性乳頭状腺癌、下垂体部腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽細胞腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、小赤血球癌（microcytic carcinoma）、軟部組織癌、ソマトスタチン産生腫瘍、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、未分化癌、ブドウ膜黒色腫、いぼ状癌、ビポーマ（vipoma）、腎芽細胞腫、脳内癌、頭頸部癌、直腸癌、星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、小赤血球癌および非小赤血球癌、転移性黒色腫、アンドロゲン非依存性転移性前立腺癌、アンドロゲン依存性転移性前立腺癌および乳癌が含まれる。
したがって、本発明の好ましい実施形態において、治療薬は、
（ｉ）化学療法剤、
（ｉｉ）細胞毒性ポリペプチド、
（ｉｉｉ）抗血管新生ポリペプチド、
（ｉｖ）腫瘍抑制遺伝子によってコードされるポリペプチド、
（ｖ）アポトーシス促進性ポリペプチド、
（ｖｉ）抗転移活性を有するポリペプチド、
（ｖｉｉ）腫瘍に対する免疫応答を活性化することができるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、
（ｖｉｉｉ）抗血管新生分子、および
（ｉｘ）毒素
からなる群から選択される。
本発明の特定の実施形態において、治療薬は、ＢＡＫ、ＰＵＭＡ、ＧＷ－Ｈ１のＢＨ３ドメイン、およびジフテリア毒素Ｉの活性セグメント、およびシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）の毒素Ａからなる群から選択される抗腫瘍ペプチドである。
本明細書で用いられる「ＢＡＫ」は、抗アポトーシスタンパク質を不活性化し、ミトコンドリア膜を透過性にし、その結果のチトクロームＣおよび他のミトコンドリア細胞死因子の放出を介するカスパーゼ依存性アポトーシス経路によってプログラムされた細胞死を誘発する、Ｂｃｌ－２タンパク質ファミリーに属するよく知られたアポトーシス促進因子を指す［Llambi, F. et al. 2011. Mol. Cell, 44:517-31において見られる］。一つの実施形態において、ＢＡＫは、全長ＢＡＫ（配列番号６７）を指す。別の実施形態において、ＢＡＫは、機能的ＢＨ３ドメイン（配列番号６８）を含むその任意の短縮型を指す。
本明細書で用いられる場合、「ＰＵＭＡ」は、アポトーシス促進性および抗アポトーシス性のＢｃｌ－２ファミリーのタンパク質と相互作用することによって細胞死を誘発するＢＨ３（Ｂｃｌ－２ホモロジー３）のみのタンパク質（BH3-only protein）である配列番号６９に対応する完全な配列によって特徴付けられるタンパク質を指す。
本明細書で用いられる場合、ＧＷ－Ｈ１は、両親媒性ヘリックスに折り畳まれることによってその細胞溶解活性を発揮する配列番号４６の配列を有するポリペプチドを指す。
ジフテリア毒素Ｉ（配列番号７０）（コリネバクテリウム・ジフテリア（Corynebacterium diphtheriae）種の細菌によって産生される）およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの外毒素（配列番号７１）は、ＡＤＰリボシル化毒素のファミリーに属する。いずれの毒素も真核生物の伸長因子－２（ｅＥＦ－２）に作用するタンパク質であり、それらを包含する細胞の翻訳活性を基本的に阻害し、アポトーシスを誘導する。いずれの毒素の構造も、受容体結合ドメイン（細胞の表面受容体に結合してエンドサイトーシスを誘導する；ジフテリア毒素の場合はヘパリン結合表皮成長因子前駆体、外毒素Ａの場合はＣＤ９１）、転位ドメイン、およびｅＥＦ－２への作用を実行する触媒ドメイン（概要はShapira, A. & Benhar, I., 2010, Toxins, 2:2519-2583に記載されている）を提示する。
本発明のより一層好ましい実施形態において、本発明の複合体または本発明のナノ粒子のポリカチオン性ペプチドはＣＸＣＲ４リガンドであり、本発明の複合体またはナノ粒子によって治療される標的となる癌は、ＣＸＣＲ４受容体を発現する細胞を含むことにより特徴付けられる。より好ましい実施形態において、ＣＸＣＲ４を発現または過剰発現する癌細胞は、転移性幹細胞である。本明細書で用いられる「転移性幹細胞」という用語は、転移の開始および転移の維持に関与する細胞を指す。
本発明のより一層好ましい実施形態において、本発明の複合体またはナノ粒子のＣＸＣＲ４リガンドは、Ｔ２２ペプチド（配列番号２５）、Ｖ１ペプチド（配列番号２６）、ＣＸＣＬ１２ペプチド（配列番号２７）、ｖＣＣＬ２ペプチド（配列番号２８）、最適化されたＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号２９）、ＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号１３２）またはそれらの機能的に同等の変異体を含む群から選択される。
本発明の別のより好ましい実施形態において、本発明の複合体またはナノ粒子により治療される癌は、膵臓癌および結腸直腸癌からなる群から選択される。
本発明の別の好ましい実施形態において、本発明の複合体およびナノ粒子は、癌性腫瘍の治療に用いられ、該癌性腫瘍は原発腫瘍または転移である。
特定の実施形態において、本発明の上記の態様で説明されたすべての用語および実施形態は、本発明の第１２の態様に等しく適用可能である。
ＶＩＩ．Ｂ－細菌感染症の治療における本発明の複合体またはナノ粒子の使用
本発明の別の実施形態は、細菌感染によって引き起こされる疾患の治療における使用のための本発明の複合体またはナノ粒子に関する。
本明細書で用いられる場合、「治療する（treat）」、「治療（treatment）」および「治療する（treating）」という用語は、細菌感染の進行、重症度および／または継続期間の軽減もしくは改善、または１つ以上の細菌感染の症状（好ましくは、１つ以上の認識可能な症状）の改善を指す。「治療する」、「治療」および「治療する」という用語はまた、細菌毒素の存在等、必ずしも患者によって認識可能ではない、細菌感染の少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善を指す。さらに、「治療する」、「治療」および「治療する」とはまた、物理的に、例えば認識可能な症状の安定化によって、生理的に、例えば身体的なパラメータの安定化によって、またはそれらの両方によって、細菌感染の進行を阻害することを指す。「治療する」、「治療」および「治療する」とはまた、細菌細胞数の減少または安定化も指し得る。
本明細書で用いられる「細菌」という用語は、細菌ドメイン（domain Bacteria）の原核生物を指す。本発明の方法において用いることができる細菌属の非限定的な例としては：アクチノマイセス（Actinomyces）、バチルス（Bacillus）、バクテリオイデス（Bacteroides）、バルトネラ（Bartonella）、ボルデテラ（Bordetella）、ボレリア（Borrelia）、ブルセラ（Brucella）、ブルクホルデリア（Burkholderia）、カンピロバクター（Campylobacter）、クラミジア（Chlamydia）、クロストリジウム（Clostridium）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、コキシエラ（Coxiella）、エルリチア（Ehrlichia）、エンテロコッカス（Enterococcus）、エシェリヒア（Eschericia）、フランシセラ（Francisella）、ハモフィラス（Haemophilus）、ヘリコバクター（Helicobacter）、クレブシエラ（Klebsiella）、レジオネラ（Legionella）、レプトスピラ（Leptospira）、リステリア（Listeria）、モラクセラ（Moraxella）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、マイコプラズマ（Mycoplasma）、ネイセリア（Neisseria）、ノカルディア（Nocardia）、シュードモナス（Pseudomonas）、リケッチア（Rickettsia）、サルモネラ（Salmonella）、シゲラ（Shigella）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、ストレプトバチルス（Streptobacillus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、トレポネマ（Treponema）、ウレアプラスマ（Ureaplasma）、ビブリオ（Vibrio）およびエルシニア（Yersinia）が挙げられる。細菌ドメインの個々の原核生物は細菌と呼ばれる。
本発明は、限定されないが、中でもＮ．ゴノレア（N. gonorrhea）およびＮ．メニンギティデス（N. meningitides）を含むネイセリア種（Neisseria spp.）、ストレプトコッカス・ピオゲネ（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・アガラクティア（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）；ハモフィラス・ダクレイ（Haemophilus ducreyi）；ブランハメラ・カタラハリス（Branhamella catarrhalis）としても知られるＭ．カタラリス（M. catarrhalis）を含むモラクセラ種（Moraxella spp.）；Ｂ．ペルツシス（B. pertussis）、Ｂ．パラペルツシス（B. parapertussis）およびＢ．ブロンキセプティカ（B. bronchiseptica）を含むボルデテラ種（Bordetella spp.）、Ｍ．ツベルクロシス（M. tuberculosis）、Ｍ．ボビス（M. bovis）、Ｍ．レプラ（M. leprae）、Ｍ．アビウム（M. avium）、Ｍ．パラツベルクロシス（M. paratuberculosis）、Ｍ．スメグマティス（M. smegmatis）を含むマイコバクテリウム種（Mycobacterium spp.）；Ｌ．ニューモフィラ（L. pneumophila）を含むレジオネラ種（Legionella spp.）、腸毒性Ｅ．コリ（enterotoxic E. coli）、腸管出血性Ｅ．コリ（enterohemorragic E. coli）および腸管病原性Ｅ．コリ（enteropathogenic E. coli）を含むエシェリヒア種（Escherichia spp.）、Ｖ．コレラ（V. cholera）を含むビブリオ種（Vibrio spp.）、Ｓ．ソネイ（S. sonnei）、Ｓ．ディセンテリア（S. dysenteriae）、Ｓ．フレクスネリ（S. flexnerii）を含むシゲラ種（Shigella spp.）；Ｙ．エンテロコリティカ（Y. enterocolitica）、Ｙ．ペスティス（Y. pestis）、Ｙ．シュードツベルクロシス（Y. pseudotuberculosis）を含むエルシニア種（Yersinia spp.）；Ｃ．ジェジュニ（C. jejuni）を含むカンピロバクター種（Campylobacter spp.）、Ｓ．ティフィ（S. typhi）、Ｓ．エンテリカ（S. enterica）およびＳ．ボンゴリ（S. bongori）を含むサルモネラ種（Salmonella spp.）；Ｌ．モノサイトゲネス（L. monocytogenes）を含むリステリア種（Listeria spp.）；Ｈ．ピロリ（H. pylori）を含むヘリコバクター種（Helicobacter spp.）、Ｐ．アエルギノサ（P. aeruginosa）を含むシュードモナス種（Pseudomonas spp.）；Ｓ．アウレウス（S. aureus）、Ｓ．エピデルミディス（S. epidermidis）を含むスタフィロコッカス種（Staphylococcus spp.）；Ｅ．ファエカリス（E. faecalis）、Ｅ．ファエシウム（E. faecium）を含むエンテロコッカス種（Enterococcus spp.）；Ｃ．テタニ（C. tetani）、Ｃ．ボツリナム（C. botulinum）、Ｃ．ディフィシレ（C. difficile）を含むクロストリジウム種（Clostridium spp.）、Ｂ．アントラシス（B. anthracis）を含むバチルス種（Bacillus spp.）；Ｃ．ジフテリア（C. diphtheria）を含むコリネバクテリウム種（Corynebacterium spp.）、Ｂ．ブルグドルフェリ（B. burgdorferi）、Ｂ．ガリニ（B. garinii）、Ｂ．アフゼリ（B. afzelii）、Ｂ．アンデルソンフィ（B. andersonfi）、Ｂ．ヘルムシ（B. hermsii）を含むボレリア種（Borrelia spp.）；Ｅ．エクイ（E. equi）を含むエルリチア種（Ehrlichia spp.）およびヒト顆粒球エルリチア症病原体；Ｒ．リケットシ（R. rickettsii）を含むリケッチア種（Rickettsia spp.）；Ｃ．トラコマティス（C. trachomatis）、クラミジア・ニューモニア（Chlamydia pneumoniae）、Ｃ．シッタシ（C. psittaci）を含むクラミジア種（Chlamydia spp.）；Ｌ．インテロガンス（L. interrogans）を含むレプトスピラ種（Leptospira spp.）；Ｔ．パリダム（T. pallidum）、Ｔ．デンティコラ（T. denticola）、Ｔ．ヒオディセンテリア（T. hyodysenteriae）を含むトレポネマ種（Treponema spp.）、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）、Ｓ．ニューモニア（S. pneumoniae）を含むストレプトコッカス種（Streptococcus spp.）、Ｈ．インフルエンザＢ型（H. influenzae type B）および分類不可能なＨ．インフルエンザ（non typeable H. influenza）を含むハモフィラス種（Haemophilus spp.）等の細菌の感染を治療するための融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞またはナノ粒子が企図される。
ＶＩＩ．Ｃ－ウイルス感染症の治療における本発明の複合体またはナノ粒子の使用
本発明の別の実施形態は、ウイルス感染によって引き起こされる疾患の治療における使用のための本発明の複合体またはナノ粒子であって、ポリカチオン性ペプチドが、感染を引き起こすウイルスに感染した細胞の細胞表面の受容体と特異的に相互作用することができ、介在するポリペプチド領域が抗ウイルス剤である複合体またはナノ粒子に関する。
本明細書で用いられる場合、「治療する（treat）」、「治療（treatment）」および「治療する（treating）」という用語は、ウイルス感染の進行、重症度および／または継続期間の軽減もしくは改善、または１つ以上のウイルス感染の症状（好ましくは、１つ以上の認識可能な症状）の改善を指す。「治療する」、「治療」および「治療する」という用語はまた、ウイルス力価等、必ずしも患者によって認識可能ではない、細菌感染の少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善を指す。さらに、「治療する」、「治療」および「治療する」とはまた、物理的に、例えば認識可能な症状の安定化によって、生理的に、例えば身体的なパラメータの安定化によって、またはそれらの両方によって、ウイルス感染の進行を阻害することを指す。「治療する」、「治療」および「治療する」とはまた、ウイルス力価の低下または安定化も指し得る。
本明細書で用いられる「ウイルス」という用語は、生物の生細胞内でのみ複製することができる小さな感染性病原体を指す。本発明の方法において用いられ得るウイルスファミリーの非限定的な例としては、アデノウイルス科（Adenoviridae）、アフリカブタ熱様ウイルス、アレナウイルス科（Arenaviridae）、アルテリウイルス科（Arteriviridae）、アストロウイルス科（Astroviridae）、バキュロウイルス科（Baculoviridae）、ビルナウイルス科（Birnaviridae）、ブニヤウイルス科（Bunyaviridae）、カリシウイルス科（Caliciviridae）、サーコウイルス科（Circoviridae）、コロナウイルス科（Coronaviridae）、デルタウイルス（Deltavirus）、フィロウイルス科（Filoviridae）、フラビウイルス科（Flaviviridae）、ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）、ヘペウイルス科（Hepeviridae）、ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）、オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）、ピコルナウイルス科（Picomaviridae）、ポックスウイルス科（Poxyviridae）、レオウイルス科（Reoviridae）、レトロウイルス科（Retroviridae）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）が挙げられる。
本発明の融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞またはナノ粒子による治療に適しているウイルス感染の例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１）、ＨＳＶ１またはＨＳＶ２のようなヒトヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、特にヒトＥｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス等の肝炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス等のパラミクソウイルス、風疹ウイルス、はしかウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス、フラビウイルス（例えば、黄熱ウイルス、デングウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）、インフルエンザウイルス、ロタウイルス等のウイルスの感染が挙げられる。
本発明のさらに好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞またはナノ粒子の抗ウイルス剤は、
（ｉ）細胞毒性ポリペプチド、
（ｉｉ）アポトーシス促進性ポリペプチド、
（ｉｉｉ）自殺遺伝子によってコードされるポリペプチド、および
（ｉｖ）抗レトロウイルスポリペプチド
からなる群から選択される。
細胞毒性ポリペプチド（ｉ）、アポトーシス促進性ポリペプチド（ｉｉ）および自殺遺伝子によってコードされるポリペプチドは、融合タンパク質に対応するセクションにおいて既に説明されている。
抗レトロウイルス剤は、抗菌剤の抗ウイルス剤クラスのサブタイプの１つである。抗レトロウイルス剤は、レトロウイルスによって引き起こされるウイルス感染症の治療に特に用いられる。レトロウイルスは、いくつか例を挙げると、アルファレトロウイルス（Alpharetrovirus）、ベータレトロウイルスおよびレンチウイルス（Lentivirus）等の属を含むレトロウイルス科（Retroviridae）のウイルスを含む。それらは、一本鎖のプラス鎖ＲＮＡゲノムウイルスであることが特徴である。レトロウイルスは、独自の逆転写酵素を介して、宿主細胞のゲノムに組み込まれるレトロウイルスのゲノムの二本鎖ＤＮＡコピーを生成する。当業者は、「抗レトロウイルス剤」が、任意の段階でレトロウイルスの通常の複製サイクルを阻害することができる任意の分子または化合物を含むことを理解するであろう。したがって、本明細書で用いられる抗レトロウイルスポリペプチド（ｉｖ）は、抗レトロウイルス特性を有するポリペプチドを指す。
本発明に適した抗レトロウイルスポリペプチドは、例えば、「融合阻害剤」としても知られる「侵入阻害剤」であり、宿主細胞へのレトロウイルスの結合、融合および侵入を阻害するペプチドである。このグループの例は、ＨＩＶ－１の融合機構と競合する生体模倣ペプチドのエフビルチド、およびケモカイン受容体ＣＣＲ２およびＣＣＲ５をブロックするペプチドのペプチドＴである。
侵入阻害剤として含まれるのは、レトロウイルスが細胞と融合するために用いられる受容体に特異的な抗体である。抗体による遮断に適したこれらの受容体の非限定的な例は、ＣＤ４、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４である。
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、「抗原」と呼ばれる特定のタンパク質に対して特異的な結合活性を示す糖タンパク質を指す。「抗体」という用語は、全長のモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、またはそれらのフラグメントを含み、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト由来の抗体を含む。「モノクローナル抗体」は、単一部位または抗原「決定基」に対して向けられた均質で特異性の高い抗体集団である。「ポリクローナル抗体」には、異なる抗原決定基に対して向けられた不均質な抗体集団が含まれる。
本明細書で用いられる場合、本発明に適した抗体には、全長の抗体（例えばＩｇＧ）だけでなく、その抗原結合フラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、非ヒト由来の抗体、組換え抗体、および遺伝子工学技術によって産生される免疫グロブリンに由来するポリペプチド、例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、重鎖またはそのフラグメント、軽鎖またはそのフラグメント、ＶＨまたはその二量体、ＶＬまたはその二量体、ジスルフィド架橋によって安定化されたＦｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、一本鎖可変領域ドメインを有する分子（Ａｂｓ）、ミニボディ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、および抗体を含む融合タンパク質、または所望の特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された構造が含まれる。本発明の抗体はまた、二重特異性抗体であり得る。抗体フラグメントは、抗原結合フラグメントを指し得る。抗体としては、任意のクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（またはそれらのサブクラス）およびＩｇＭの抗体が挙げられ、抗体は特定のクラスである必要はない。
したがって、本発明のより一層好ましい実施形態は、ＨＩＶ感染症の治療における使用のための本発明の融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞またはナノ粒子であって、ポリカチオン性ペプチドがＣＸＣＲ４リガンドであり、細胞がＨＩＶ感染細胞である融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞またはナノ粒子に関する。
本発明のさらにより一層好ましい実施形態は、ウイルス感染の治療における使用のための、本発明の融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞またはナノ粒子であって、ＣＸＣＲ４リガンドが配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８ならびにそれらの機能的に同等の変異体からなる群から選択される融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞またはナノ粒子に関する。
ＶＩＩ．Ｄ－神経変性疾患の治療における本発明の複合体またはナノ粒子の使用
本発明の別の実施形態において、本発明は、神経変性疾患の治療における使用のための本発明の複合体またはナノ粒子であって、ポリカチオン性ペプチドが血液脳関門を通過することができるペプチドであり、介在するポリペプチド領域がシャペロンまたはタンパク質集合の阻害剤である複合体またはナノ粒子に関する。
タンパク質集合は、細胞内または細胞外にかかわらず、誤って折り畳まれたタンパク質の蓄積に起因する生物学的現象である。得られるタンパク質集合体は疾患を引き起こす可能性があり、実際、アミロイドーシスとして知られる幅広い疾患に関与していることが分かっている。アミロイドーシスには、ＡＬＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病およびプリオン病のようないくつかのよく研究されている神経変性疾患が含まれる。
適切なシャペロンまたはタンパク質集合の阻害剤は、上記で定義された通りである。本発明による融合タンパク質、ナノ粒子、ベクターまたは宿主細胞を用いて治療することができる疾患としては、アルツハイマー病、ピック病、α１－アンチトリプシン欠乏症、パーキンソン病およびその他のシヌクレイノパチー、クロイツフェルト－ヤコブ病、緑内障における網膜神経節細胞変性、脳β－アミロイドーシス血管症、プリオン病、タウオパシー、前頭側頭葉硬化症、ＩＩ型糖尿病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病および他のトリヌクレチド反復障害、家族性デンマーク認知症、家族性イギリス認知症、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、アレクサンダー病、セイピノパシー、家族性アミロイドーシス神経障害、老人性全身性アミロイドーシス、リゾチームアミロイドーシス、フィブリノーゲンアミロイドーシス、透析アミロイドーシス、封入体筋炎／ミオパシー、白内障、ロドプシン突然変異を伴う色素性網膜炎、甲状腺髄様癌、心臓心房アミロイドーシス、下垂体プロラクチノーマ、遺伝性格子状角膜変性症、皮膚苔癬アミロイドーシス、マロリー体、角膜ラクトフェリンアミロイドーシス、肺胞性タンパク症、歯原性腫瘍アミロイド、精嚢アミロイド、アポリポタンパク質Ｃ２アミロイドーシス、アポリポタンパク質Ｃ３アミロイドーシス、Ｌｅｃｔ２アミロイドーシス、インスリンアミロイドーシス、ガレクチン－７アミロイドーシス（原発性限局性皮膚アミロイドーシス）、コルネオデスモシンアミロイドーシス、エンフビルチドアミロイドーシス、嚢胞性線維症、鎌状赤血球病、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、ＡＬアミロイドーシス、ＡＨアミロイドーシス、ＡＡアミロイドーシス、大動脈中膜アミロイドーシス、ＡｐｏＡＩアミロイドーシス、ＡｐｏＡＩＩアミロイドーシス、ＡｐｏＡＩＶアミロイドーシスおよびフィンランド型家族性アミロイドーシスが挙げられる。
したがって、本発明の好ましい実施形態は、神経変性疾患の治療における使用のための本発明の複合体またはナノ粒子であって、介在するポリペプチド領域がシャペロンまたはタンパク質集合の阻害剤であり、血液脳関門を通過することができるポリカチオン性ペプチドが、Ｓｅｑ－１－７、Ｓｅｑ－１－８およびＡｎｇｉｏｐｅｐ－２－７からなる群から選択される。
ＩＸ－標的細胞を画像化する方法
別の態様において、本発明は、本発明の複合体またはナノ粒子を用いることにより、細胞サンプル内の特定の細胞または細胞群の存在を検出することを可能にする方法に関する。
したがって、第１３の態様において、本発明は、本発明の第６の態様による複合体の１つ以上の構成要素、または第９の態様によるナノ粒子の1つ以上の構成要素に対する特異的結合部位を含む標的細胞の画像化の方法であって、
（ｉ）前記細胞を含むサンプルと、本発明の第６の態様による複合体または本発明の第１０または第１１の態様によるナノ粒子とを、前記複合体または前記ナノ粒子と前記細胞とが結合するのに適切な条件下で接触させことであって、前記目的の剤が造影剤である、接触させること、および
（ｉｉ）前記造影剤により提供される信号を検出することにより細胞を画像化すること
を含む方法に関する。
本明細書で用いられる「画像化の方法」という表現は、標的細胞を含むサンプルの画像の部分と、前記細胞を含まない画像の部分との間のコントラストを増大させることによって、細胞サンプル中の標的細胞を視覚化することを可能にする任意の方法を指す。ここでいうコントラストの増大は、上記のセクションＩＶ－Ｅ．２で定義されているように、一般的に造影剤によって媒介される。特定の実施形態において、造影剤は、前記セクションで指定されたもののいずれかである。
本明細書で用いられる「標的細胞」という用語は、該標的細胞の表面の特異的結合部位の存在に関連する少なくとも１つの目的の特徴を示す細胞を指す。特定の実施形態において、前記細胞は、本発明の第６の態様で特定される細胞受容体を含む細胞のいずれかである。
好ましい実施形態において、細胞は、ＣＸＣＲ４受容体を発現または過剰発現する。別の好ましい実施形態において、標的細胞は、本発明の第６の態様の「癌」の定義で指定された癌のいずれかの癌細胞である。好ましくは、前記細胞は、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、腎臓癌、脳腫瘍、非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ球性白血病からの細胞である。
本明細書で用いられる「結合部位」という用語は、結合対の任意の対を指し、結合対の他の部分が本発明の複合体またはナノ粒子の構成要素の１つであり、好ましくは本発明の複合体またはナノ粒子の第２のポリペプチドである。「結合対」という表現は、別の分子と相互作用して結合し、結合複合体をもたらすことができる分子であって、第１および第２の構成要素が水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス結合、イオン結合等の非共有結合またはそれらの組み合わせによって互いに結合する分子を指す。結合対は、タンパク質／タンパク質相互作用、ペプチド／タンパク質相互作用、タンパク質領域／タンパク質相互作用、抗原／抗体、抗原／抗体フラグメントまたはハプテン／抗ハプテン等の任意のタイプの相互作用の一部であり得る。「結合している（binding）」または「結合した（bound）」という用語は、本発明の第２の態様で定義されている。
特定の実施形態において、結合部位は、上記のセクションＩＶ－Ｂで指定された目的の標的のいずれかである。別の特定の実施形態において、結合部位は細胞受容体である。特定の実施形態において、結合部位は上記のセクションＩＶ－Ｂで指定されたものから選択される細胞受容体である。特定の実施形態において、結合部位はＣＸＣＲ４受容体である。当業者に理解されるように、前記目的の標的および細胞受容体は、本発明の複合体または本発明のナノ粒子の第２のポリペプチドの結合に必ずしも特異的ではない。目的の標的は、本発明の複合体またはナノ粒子の任意の構成要素の結合、または複合体またはナノ粒子の複数の構成要素の結合にも特異的であり得る。
特定の実施形態において、標的細胞は２つ以上の結合部位を含み、結合部位のいくつかは本発明の複合体または本発明のナノ粒子の１つの構成要素の結合に特異的であり、残りの結合部位は少なくとも別の構成要素の結合に特異的である。
当業者に理解されるように、本発明の複合体またはナノ粒子の構成要素は：本発明の複合体または本発明のナノ粒子の第１、第２および第３のポリペプチド領域、該ポリペプチド領域の間の連結部分、該ポリペプチド領域の間のプロテアーゼ切断部位、本発明のポリペプチドまたはナノ粒子の目的の剤、または該目的の剤と本発明の複合体または本発明のナノ粒子の複合体のポリペプチドとの間の連結部分であり得る。
特定の実施形態において、標的細胞の結合部位と結合する複合体またはナノ粒子の１つ以上の構成要素は、本発明の複合体またはナノ粒子の第２のポリペプチドであり、該ポリペプチドは本発明の第６の態様において定義されたものである。特定の実施形態において、第２のポリペプチドはポリカチオン性ペプチドである。好ましい実施形態において、ポリカチオン性ペプチドはＣＸＣＲ４リガンドである。より好ましい実施形態において、ポリカチオン性ペプチドは、セクションＩＶ－Ｂの（ｉ）で指定されたＣＸＣＲ４リガンドの群から選択されるＣＸＣＲ４リガンドである。
本発明の画像化方法の好ましい実施形態において、標的細胞はＣＸＣＲ４を発現または過剰発現し、本発明の複合体またはナノ粒子の１つ以上の構成要素はポリカチオン性ペプチドであり、ＣＸＣＲ４のリガンドである。好ましい実施形態において、リガンドは、セクションＩＶ－Ｂの（ｉ）で指定されたＣＸＣＲ４リガンドから選択される。
当業者に理解されるように、ナノ粒子がバイパラトピックナノ粒子である場合、標的細胞の結合部位と結合するナノ粒子の２つの異なる複合体の１つ以上の構成要素は、本発明のバイパラトピックナノ粒子を形成する各複合体の第２のポリペプチドであり、該ポリペプチドはバイパラトピックナノ粒子の異なる複合体間で異なり、本発明の第６の態様で定義されるものから選択される。
特定の実施形態において、バイパラトピックナノ粒子の２つの複合体のうちの１つの第２のポリペプチド領域はポリカチオン性ペプチドである。好ましい実施形態において、ポリカチオン性ペプチドはＣＸＣＲ４リガンドである。より好ましい実施形態において、ポリカチオン性ペプチドは、セクションＩＶ－Ｂの（ｉ）で指定されたＣＸＣＲ４リガンドの群から選択されるＣＸＣＲ４リガンドである。別の特定の実施形態において、バイパラトピックナノ粒子の両方の複合体の第２のポリペプチド領域はポリカチオン性ペプチドである。好ましい実施形態において、両方の複合体のポリカチオン性ペプチドはＣＸＣＲ４リガンドである。より好ましい実施形態において、両方の複合体のポリカチオン性ペプチドは、セクションＩＶ－Ｂの（ｉ）で指定されたＣＸＣＲ４リガンドの群から選択されるＣＸＣＲ４リガンドであり、それぞれのポリカチオン性ペプチドは異なる。好ましい実施形態において、バイパラトピックナノ粒子の１つの複合体のポリカチオン性ペプチドは、Ｔ２２ペプチド（配列番号２５、ＲＲＷＣＹＲＫＣＹＫＧＹＣＹＲＫＣＲ）である。別の好ましい実施形態において、バイパラトピックナノ粒子の１つの複合体のポリカチオン性ペプチドは、最適化されたＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号２９）である。より好ましい実施形態において、バイパラトピックナノ粒子の１つの複合体のポリカチオン性ペプチドは、Ｔ２２ペプチド（配列番号２５、ＲＲＷＣＹＲＫＣＹＫＧＹＣＹＲＫＣＲ）であり、バイパラトピックナノ粒子の他の複合体のポリカチオン性ペプチドは、最適化されたＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号２９）である。
本明細書で用いられる「サンプル」または「生物学的サンプル」という用語は、生物、好ましくは被験体から単離された生物学的材料を指す。本発明の第１３の態様の生物学的サンプルは、サンプル中に存在する標的細胞を検出するのに適した任意の生物学的材料を含む。生物学的サンプルは、被験体の細胞および／または非細胞材料を含んでもよい。サンプルは、例えば、組織生検、固形腫瘍生検、血液、唾液、脳脊髄液、尿、便、骨髄、乳頭吸引物、固形腫瘍生検、血漿、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、糞便、頬側または頬側咽頭の拭い液、精液、手術試料、生検から得られた試料、およびバイパラフィンに包埋された組織サンプル等の任意の適切な組織または生体液から単離することができる。
サンプルは、本発明の複合体または本発明のナノ粒子と、細胞の結合部位と前記複合体または前記ナノ粒子との結合に適切な条件下で接触させられる。「結合に適切な条件下」という表現は、該条件が、好ましくは複合体またはナノ複合体を、ＢＳＡまたはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の細胞に対して毒性ではない溶液で希釈することを含むことを意味する。これらの追加の剤は、非特異的なバックグラウンドの低減にも役立つ傾向がある。
「適切な（suitable）」または「適した（adequate）」条件とはまた、インキュベーションが、効果的な結合を可能にするのに十分な温度または期間であるということを意味する。本発明の複合体またはナノ粒子は、任意の適切な時間、例えば少なくとも５分、少なくとも１５分、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間インキュベートされる。それらは、細胞の生存および結合部位への複合体またはナノ粒子の結合を可能にする温度で行われる。好ましくは、前記温度は１５～４５℃、好ましくは２５℃、より好ましくは３７℃、または室温である。
インキュベーション後、サンプル中の過剰の複合体および／またはナノ粒子は、この当技術分野の専門家によってよく知られている方法であって、ＰＢＳ等の適切な媒体の使用を含む方法によって除去される。培地には、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤が含まれてもよい。サンプル中の過剰の複合体および／またはナノ粒子は、任意の適切な時間、例えば、各洗浄について１～３０分または３～１０分で洗浄することができる。洗浄は、前記細胞の担体の穏やかな振とうまたは揺り動かしを含んでもよい。洗浄温度は、細胞が生存することができ、結合が破壊されないような温度である。例えば、温度は１５～４５℃であり得、好ましくは２５℃、より好ましくは３７℃、または室温であり得る。細胞内の結合部位に結合したポリペプチドによって形成される、すなわち標的細胞の結合部位に結合した本発明の複合体またはナノ粒子によって形成される複合体を洗浄するための適切なプロトコルは、当技術分野においてよく知られている。
サンプル中の細胞のイメージングには、サンプル中に存在する複合体またはナノ複合体に存在するイメージング剤によって放出される信号の検出が含まれる。当業者に理解されるように、洗浄工程の後、複合体およびナノ複合体は、主に、サンプル中に存在する標的細胞の結合部位と結合したものである。したがって、サンプル中の造影剤によって放出される信号を間接的に検出することにより、サンプル中に存在する標的細胞を検出することが可能になる。造影剤を検出するために用いられる技術は、用いられる造影剤に依存するであろう。このような技術は、当技術分野の専門家によってよく知られており、特定の造影剤を検出することができるカメラに結合された顕微鏡の使用を含み得る。例えば、造影剤が蛍光剤である場合、上記技術は蛍光顕微鏡の使用を含み得、造影剤が放射性ヌクレオチドである場合、上記技術は放射線ルミネセンス顕微鏡または単一細胞放射線ルミネセンス顕微鏡の使用を含み得る。特定のタイプの造影剤を検出するのに適した方法は、当技術分野で周知であり、このセクションで指定される造影剤の各グループについて、セクションＩＶ～Ｂ．１に示されるタイプのものである。
特定の実施形態において、画像化方法は、サンプル中に存在する標的細胞、およびサンプル中の前記標的細胞の量を決定することを可能にする。当業者に理解されるように、画像化方法は、サンプル中に存在する標的細胞の量を、コントロールサンプル中に存在する細胞の量と比較することを可能にする。
特定の実施形態において、上述した本発明の態様で説明されたすべての用語および実施形態は、本発明の第１３の態様に等しく適用可能である。
Ｘ－標的ペプチドに結合するポリペプチドを同定する方法
本発明の第１の態様によるポリペプチドは、ループ領域ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ、ＧＨ、ＨＩ、ＩＪおよびＪＫの１つ以上に挿入される異種ペプチドを提示することができる。これらの変異体ポリペプチドは、異なるポリペプチドがライブラリーの異なるメンバーによって提示されるペプチドライブラリーとして提供することができる。これらのライブラリーは、標的ポリペプチドに結合するライブラリーのメンバーを選択し、結合に関与するポリペプチドライブラリーのメンバー内のペプチドの配列を決定することによって、標的ペプチドと結合することができるペプチドの同定に用いることができる。したがって、別の態様において、本発明は、標的ペプチドに結合するポリペプチドを同定する方法に関する。
ｉ
第１４の態様において、本発明は、標的ペプチドに結合するポリペプチドを同定する方法であって、
ｉ）標的ペプチドと、本発明の第２の態様によるポリペプチドディスプレイライブラリーとを、ポリペプチドと前記標的ペプチドとが相互作用することができる条件下で接触させること、
ｉi）前記標的ペプチドと特異的に相互作用したライブラリーのメンバーを回収すること、および
ｉｉ）前記標的ペプチドと相互作用するポリペプチドの配列を特定すること
を含む方法に関する。
本明細書で用いられる「標的ペプチド」という用語は、機能、配列または構造の制限のない任意の目的のペプチドを指す。
「ポリペプチドと標的ペプチドとが相互作用することができる条件下」という表現は、標的ペプチドおよびポリペプチドライブラリーのメンバーの完全性を維持することが可能であり、ライブラリーのポリペプチドおよび標的ペプチドの少なくとも三次構造が維持され、したがって標的ペプチドに対して結合親和性を有するライブラリーのポリペプチドが標的ペプチドに特異的に結合することができる条件を指す。前記条件は、ポリペプチドがその完全性を維持することが可能な特定の緩衝液でライブラリーのメンバーを希釈することを含む。前記緩衝液は、当技術分野の専門家によってよく知られており、ＢＳＡ、ウシγグロブリン（ＢＧＧ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を含み得る。前記条件はまた、ポリペプチドおよび標的ペプチドが、特異的結合が効果的に起こるのに適切な期間および温度でインキュベートされることを意味する。前記条件は、当技術分野の専門家によってよく知られており、典型的には、好ましくは１５～４５℃、好ましくは２５℃、より好ましくは３７℃、または室温で１～４時間のインキュベーションを含むか、または４℃で一晩のインキュベーションであり得る。
「ポリペプチドライブラリーのメンバー」という用語は、本発明の第１の態様で定義されている。したがって、特定の実施形態において、ライブラリーのメンバーは、本発明の第２の態様で定義されるようなライブラリーのポリペプチドである。別の特定の実施形態において、本発明の第２の態様で定義されるように、ライブラリーのメンバーは、それをコードする核酸に直接連結された本発明の第１の態様のポリペプチドを含む複合体である。別の特定の実施形態において、ライブラリーのメンバーは、本発明の第２の態様で定義されるようなライブラリーのポリペプチドを含む微生物である。
「結合する（binding）」および「特異的に結合する（specifically binding）」という用語は、本発明の第１の態様で定義されている。特定の実施形態において、本態様の文脈における「結合」および「相互作用」という用語は交換可能である。別の特定の実施形態において、本方法は、標的ペプチドに特異的に結合するポリペプチドを同定することを目的とし、前記ポリペプチドは、標的ペプチドとの間の結合親和性が１０－６Ｍ未満、１０－７Ｍ未満、１０－８Ｍ未満、１０－９Ｍ未満、１０－１０Ｍ未満、１０－１１Ｍ未満、１０－１２Ｍ未満、１０－１３Ｍ未満、１０－１４Ｍ未満または１０－１５Ｍ未満である場合、標的ペプチドに特異的に結合すると見なされる。
特定の実施形態において、標的ペプチドは固体支持体に固定化されている。
固体支持体の非限定的な例としては、ポリマー（アガロース、セファロース、セルロース、ニトロセルロース、アルギン酸塩、テフロン、ラテックス、アクリルアミド、ナイロン、プラスチック、ポリスチレン、シリコーン等）、ガラス、シリカ、セラミックおよび金属が挙げられる。そのような固体支持体は、粒子（微粒子を含む）、シート、ディップスティック、ゲル、フィルター、膜、マイクロファイバーストリップ、チューブ、ウェル、プレート（６ウェルプレート、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート等を含むマイクロプレート等）、繊維、キャピラリー、コーム、ピペットチップ、マイクロアレイチップ等の任意の形態をとることができる。いくつかの実施形態において、ビオチン結合部分は固体支持体の表面に結合している。いくつかの実施形態において、固体支持体の表面は、多孔質、粒子状、繊維状、ウェブ状または焼結表面等の不規則な表面を含む。
いくつかの実施形態において、固体支持体は、マイクロプレート、マイクロアレイチップおよび微粒子から選択される。いくつかの実施形態において、固体支持体は、少なくとも部分的にポリマーから構成される。いくつかの実施形態において、微粒子固体支持体は、単分散または多分散の球状ビーズを含む。単分散微粒子はサイズが実質的に均一であり（すなわち、直径の標準偏差が５％未満である）、多分散微粒子はサイズが異なります。いくつかの実施形態において、微粒子は、全体にわたって同じポリマーで構成されるか、またはコアシェルポリマーであり、微粒子のコアは１つのポリマーで構成され、外層（または「シェル」）は別のポリマーで構成される。いくつかの実施形態において、微粒子は磁性である。
いくつかの実施形態において、標的ペプチドはリンカー部分を介して固体支持体に結合している。特定の実施形態において、前記リンカーはプロテアーゼ切断部位を含む。
この方法の第２の工程では、標的ペプチドに特異的に結合している１つ以上のライブラリーのメンバーが回収される。標的ポリペプチドに特異的に結合するそれらのポリペプチドを工程（ｉｉ）で同定するために、標的ポリペプチドとライブラリーにある非変異型または天然型のポリペプチドとを接触させる別個の結合反応（以下、「ネガティブセレクション工程」と呼ばれる）が並行して行われるべきであることが理解される。好ましくは、前記非変異型または天然型はライブラリーのメンバーと同一であるが、ループ領域は、異種ペプチドまたはポリペプチドの挿入によって改変されていない。標的ポリペプチドがポリペプチドディスプレイライブラリーのメンバーと結合するが、その非変異型または天然型とは結合しない場合にのみ、ポリペプチドライブラリーのメンバーは、標的ポリペプチドに特異的に結合することができるものとして選択される。したがって、例えば、ポリペプチドライブラリーが、配列番号６２または６３で定義されるようなループ領域ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ、ＧＨ、ＨＩ、ＩＪおよびＪＫの１つ以上が異種ペプチドの挿入によって改変されたヒトニドゲンＧ２ドメインの多様な形態によって形成される場合、該異種ペプチドに特異的に結合しないペプチドを除外するために用いられるネガティブセレクション工程が、それぞれ配列番号６２または６３のポリペプチドを用いて行われる。ポリペプチドライブラリーは、４５９位、４６８位、６３９位、６５０位、５４３位、５４５位、４４９位、５２５位、５６１位、６１８位、６１９位、１５１位、６０４位、６３８位、６４１位、４６９位および５１８位におけるに１つ以上の突然変異を含む多様な形態のヒトニドゲンＧ２ドメインによって形成され得、前記番号付けはＵｎｉＰｒｏｔデータベース（２００９年７月７日付けのバージョン）のアクセション番号Ｐ１４５４３－１で定義された完全長のヒトニドゲン－１の番号付けに対応している。いくつかの実施形態において、ポリペプチドライブラリーは、上記で定義されたようなＨ４５９Ａ、Ｒ４６８Ｎ、Ｆ６３９Ｓ、Ｒ６５０Ａ、Ｈ５４３Ｋ、Ｈ５４５Ｎ、Ｖ４４９Ｔ、Ｖ５２５Ｑ、Ｖ６１９Ｔ、Ｆ５６１Ｅ、Ｃ６１８Ｓ、Ｓ４６９Ｉ、Ｒ５１８Ｉの１つ以上の突然変異を含む多様な形態のニドゲンＧ２ドメインによって形成される。ポリペプチドライブラリーで用いられ得る適切なニドゲンＧ２ドメイン変異体としては、限定されないが、それぞれ配列番号６４、６５、８７～１０４として定義されたＮＩＤＯｍｕｔ２、ＮＩＤＯｍｕｔ３、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｖ４５Ｔ、ＮＩＤＯｍｕｔ３＿Ｖ１２１Ｑ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｆ１５７Ｅ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｖ２１５Ｔ、ＮＩＤＯｍｕｔ４、ＮＩＤＯｍｕｔ４＿Ｔ２１５Ｖ、ＮＩＤＯｍｕｔ５、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｖ１７６Ｔ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｉ２００Ｔ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｖ２３６Ｙ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｌ２３７Ｔ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｓ６５Ｉ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｒ１１４Ｉ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｃ２１４Ｓ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｓ６５Ｉ＿Ｒ１１４Ｉ、ＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｓ６５Ｉ＿Ｒ１１４Ｉ、ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｓ６５Ｉ＿Ｒ１１４ＩおよびＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｓ６５Ｉ＿Ｒ１１４Ｉを有する変異体であって、ループ領域ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ、ＧＨ、ＨＩ、ＩＪおよびＪＫの１つ以上が異種ペプチドの挿入によって改変され、異種ペプチドに特異的に結合しないペプチドを除外するために用いられるネガティブセレクション工程が、上記で定義されたポリペプチドであって異種ペプチドを欠いたポリペプチドを用いて行われた変異体を含む、上記の本発明の態様の文脈で定義されたニドゲンＧ２ドメイン変異体が挙げられる。
その目的のために、まず標的ペプチドを洗浄して、標的ペプチドに結合していないライブラリーのメンバーを除去する。洗浄条件は当技術分野の専門家によく知られており、ＰＢＳ等の適切な培地の使用が含まれる。培地には、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤が含まれていてもよい。標的ペプチドは、任意の適切な時間、例えば各洗浄について１～３０分または３～１０分で洗浄することができる。洗浄は、標的ペプチドの担体の穏やかな振とうまたは揺り動かしを含み得る。洗浄温度は、標的ペプチドとライブラリーのポリペプチドとの間の結合が破壊されないような温度である。例えば、洗浄温度は１５～４５℃、または３０～４０℃とすることができる。通常、洗浄温度は約３７℃または室温である。
標的ペプチドが洗浄されると、標的ペプチドに結合したライブラリーのメンバーが回収される。この回収は、標的ペプチドに結合したライブラリーのポリペプチドを溶出することからなってもよい。上記の溶出には、さまざまな手法を用いることができる。例えば、溶出は、複合体の「ライブラリーの標的ペプチドメンバー」を、ｐＨ３～６、好ましくはｐＨ４等の、両者の間の結合を破壊する低ｐＨ条件下でインキュベートすることによって行うことができる。溶出は、複合体をＤＴＴと共にインキュベートすることによって行われてもよい。あるいは、ポリペプチドおよび標的ペプチドの複合体全体を回収することができる。例えば、標的ペプチドが標的支持体に固定化される場合、該固定化は、プロテアーゼ切断部位を含むリンカーによって媒介され得、これが切断されて複合体全体が回収される。上記の方法は、当技術分野の専門家によってよく知られている。
特定の実施形態において、工程ｉ）およびｉｉ）は、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも１０回、好ましくは少なくとも２回繰り返される。前記反復のそれぞれにおいて、工程ｉ）で用いられるポリペプチドライブラリーのメンバーは、工程ｉｉ）で回収されるメンバーに対応する。
したがって、別の特定の実施形態において、第１４の態様の方法の工程ｉ）およびｉｉ）は、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも１０回、好ましくは少なくとも２回繰り返され、各反復において工程ｉ）で用いられるポリペプチドライブラリーが、工程（ｉｉ）で回収されるライブラリーのメンバーによって形成される。
第３のステップにおいて、ライブラリーのポリペプチドが同定される。ポリペプチドの同定は、ライブラリーのポリペプチドの配列を決定することを含む。
前記決定は、いくつかの方法により媒介され得る。例えば、前記決定は、質量分析等の当業者に周知の任意の技術によって、前記ポリペプチドの配列を決定することから簡単に構成することができる。
ライブラリーのメンバーがライブラリーの表現型としてのポリペプチドである場合、本発明の第２の態様で定義されるように、前記表現型に対応する遺伝子型としての核酸に直接的または間接的に連結され、ライブラリーのポリペプチドの配列の決定は、前記核酸の配列決定からなることができる。本発明の第２の態様で言及される「遺伝子型」の定義に示されるように、核酸は、それに直接または間接的に連結されるライブラリーのポリペプチドをコードするか、またはコードする配列を含む。ポリペプチドに直接的または間接的に連結される核酸の配列を決定する方法は、当技術分野の専門家によってよく知られている。例えば、それらは、ＰＣＲによる、または核酸がＲＮＡ分子である場合には逆転写酵素およびそれに続くＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）による、核酸配列を増幅することを含み得る。次いで、増幅されたｃＤＮＡは、当業者にとって周知の技術によって配列決定される。前記配列決定技術の非限定的な例としては、周知のサンガー法、パイロ配列決定、合成による配列決定、またはライゲーションによる配列決定が挙げられる。あるいは、核酸が直接的または間接的に連結されているライブラリーのポリペプチドから核酸が単離され、次いで、核酸がＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲによって増幅され、上述したように配列決定される第１の工程を含み得る。核酸をポリペプチドから分離する技術は、当業者によく知られている。前記技術の非限定的な例としては、ポリペプチドと他の分子との相互作用の破壊、または単にポリペプチドの分解を可能にする任意の技術が挙げられる。これらの技術としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤、プロテイナーゼＫ等のプロテイナーゼとのインキュベーションによるタンパク質の分解、または単に高温、好ましくは４０～９５℃、より好ましくは６０℃でのインキュベーションによるタンパク質の変性による核酸とポリペプチドとの結合を破壊が挙げられる。次いで、核酸は、フェノール／クロロホルム、シリカ法、または核酸がＲＮＡの場合のグアニジンチオシアン酸塩－フェノール－クロロホルム抽出等のよく知られた技術によってタンパク質から単離される。核酸がポリペプチドに間接的に連結され、例えば細菌または酵母細胞等の微生物の細胞内に含まれる場合、核酸の分離は、細胞膜を分解することを可能にする技術を含み得る。前記技術はまた、当技術分野の専門家によく知られており、例えば、ポリペプチドと別の分子との相互作用を破壊するための上記の技術のいずれかからなり得る。上述したポリペプチドから核酸を分離するための方法のいくつかは、Kelly M. Elkins, 2013, Forensic DNA Biologyに詳細に記載されている。
したがって、特定の実施形態において、標的ペプチドと相互作用するポリペプチドの配列の同定には、前記ペプチドの配列を決定することが含まれる。別の特定の実施形態において、標的ペプチドと相互作用するポリペプチドの配列の同定には、それに直接的または間接的に連結しそれをコードする核酸の配列を決定することが含まれる。
特定の実施形態において、ライブラリーのいくつかのポリペプチドは、標的ペプチドに特異的に結合することができる。この場合、この方法は、標的ペプチドに結合するポリペプチドを同定するためのものであり、この方法の工程ｉｉｉ）は、標的ペプチドと相互作用するポリペプチドの配列を同定することからなる。１つのポリペプチドの配列を同定するために上記で提供されたのと同じ方法が、いくつかのポリペプチドの配列の同定にも適用可能である。したがって、特定の実施形態において、標的ペプチドと相互作用するポリペプチドの配列の同定は、それらのそれぞれに直接的または間接的に連結された核酸に対する配列を決定することを含む。
別の特定の実施形態において、工程ｉｉ）の後、本方法は、回収されたライブラリーのメンバーを増幅する追加の工程を含む。前記増幅は、回収されたポリペプチドライブラリーのメンバーを用いて宿主生物を形質転換すること、または単に回収されたライブラリーのメンバーを増幅することからなり得る。例えば、ライブラリーのメンバーが本発明の第２の態様に記載される微生物であり、ファージ、バクテリオファージまたはウイルス等の生物の感染時に複製することができる場合、工程ｉｉ）で回収されるライブラリーのメンバーは、ライブラリーのメンバーに感染したバクテリアを培養することにより増幅され得る。前記メンバーが、本発明の第２の態様に記載された細菌または酵母等の複製可能な微生物である場合、ライブラリーのメンバーの増幅は、単に前記微生物を培養することからなり得る。
したがって、特定の実施形態において、標的ペプチドに結合する１つ以上のポリペプチドを同定する方法は：
ｉ）標的ペプチドと、本発明の第２の態様によるポリペプチドディスプレイライブラリーとを、前記ポリペプチドと前記標的ペプチドとが相互作用することができる条件下で接触させること、
ｉｉ）前記標的ペプチドと相互作用したライブラリーのメンバーを回収すること、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で回収されたライブラリーのメンバーを増幅すること、
ｉｖ）前記標的ペプチドと相互作用するポリペプチドの配列を特定すること
を含む。
特定の実施形態において、工程ｉ）～ｉｉｉ）は少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも１０回、好ましくは少なくとも２回繰り返され、各反復の工程ｉ）で用いられるポリペプチドライブラリーは、工程（ｉｉ）で回収されるライブラリーのメンバーを形成し、工程ｉｉｉ）で増幅される。
特定の実施形態において、上述の本発明の態様で説明されたすべての用語および実施形態は、本発明の第４の態様に等しく適用可能である。
ＸＩ－本発明の第１の態様のポリペプチドの使用
本発明の第１の態様に示されるように、本態様のポリペプチドは、ループ領域への挿入として、またはループ領域の部分的または完全な置換として、１つ以上のループ領域内に１つ以上の異種ペプチドを組み込むのに適している。次いで、これらの変異体ポリペプチドを用いて、「目的のペプチド」として定義することができる１つ以上の異種ペプチドを提示することができる。したがって、第１５の態様において、本発明は、ペプチドを提示するための、本発明の第１の態様によるポリペプチドの使用に関し、前記ペプチドは、ループ領域の１つに見出される。
本明細書で用いられる「提示するため」という表現は、異種ペプチドを目的の要素の近接にもたらすポリペプチドの能力を指す。本明細書で用いられる「目的のペプチド」という用語は、それが本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域の１つに見出され得るという事実に加えて、いかなる機能、配列または構造的特徴によっても制限されない。一つの実施形態において、異種ポリペプチドは１つ以上のループ領域内に挿入され、すなわち、ループ領域は配列番号６２または配列番号６３の同族ループドメインに見られるすべてのアミノ酸を保存するが、異種ポリペプチドは２つの連続するアミノ酸の間に挿入される。別の実施形態において、１つ以上のループ領域内の異種ポリペプチドは、ループドメインの配列を部分的または完全に置換するループ領域内の挿入物として見出される。複数のペプチドが本発明のポリペプチドの異なるループに提示される別の実施形態において、１つ以上のペプチドは、ループ領域への挿入物として位置し得、１つ以上のペプチドは、部分または完全なループ領域の置換であり得る。
提示される異種ポリペプチドまたはペプチドの長さは、特に限定的ではない。したがって、異種ポリペプチドは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、少なくとも９５個、少なくとも１００個またはそれ以上のアミノ酸を含み得る。
特定の実施形態において、目的のペプチドは本発明の第６の態様で定義される目的の剤のいずれかであり、好ましくは、目的のペプチドはセクションＩＶ－Ｅ．１で定義される治療薬、特に細胞毒性ポリペプチド、抗血管新生ポリペプチド、腫瘍抑制遺伝子によってコードされるポリペプチド、アポトーシス促進性ポリペプチド、抗転移活性を有するポリペプチド、腫瘍に対する免疫応答を活性化することができるポリペプチドによってコードされるポリペプチド、抗血管新生分子または毒素である。
「結合する（bind）」および「特異的に結合する（specifically bind）」という用語は、本発明の第１の態様で定義されている。ポリペプチドと標的分子との間の結合、および結合複合体のＫＤを決定する方法は、上述した本発明の第１の態様の定義において提供されている。特定の実施形態において、目的のペプチドとポリペプチドの最後の１つのループ領域との間の特異的結合は、１０－６Ｍ未満、１０－７Ｍ未満、１０－８Ｍ未満、１０－９Ｍ未満、１０－１０Ｍ未満、１０－１１Ｍ未満、１０－１２Ｍ未満、１０－１３Ｍ未満、１０－１４Ｍ未満または１０－１５Ｍ未満のＫｄを有する。
特定の実施形態において、第１の態様のポリペプチドが目的のペプチドを提示する、またはもたらす目的の要素は、細胞である。好ましい実施形態において、前記要素はサンプル中の細胞である。別の特定の実施形態において、前記要素は、それが由来する組織または生物から単離された細胞である。別の特定の実施形態において、前記目的の要素は、サンプル中の別のペプチド、タンパク質または核酸である。
「サンプル」という用語は、本発明の第１３の態様で定義されている。本態様で言及されるサンプルは目的の要素を含み、該要素は、好ましくは上記で指定された通りである。
特定の実施形態において、本発明は、ペプチドを提示するための、本発明の第１の態様によるポリペプチドの非治療的使用であって、前記ペプチドがループ領域の１つに見出される使用に関する。
特定の実施形態において、上述した本発明の態様で説明されたすべての用語および実施形態は、本発明の第１５の態様に等しく適用可能である。
ＸＩＩ－サンプル中の標的ペプチドの存在を決定する方法
上述した態様で示したように、本発明の第１の態様のポリペプチドは、標的分子または標的ペプチドに特異的に結合することができる。したがって、本発明の第１の態様のポリペプチドは、サンプル中のペプチドの存在を決定するのに有用であり得る。
したがって、第１６の態様において、本発明は、サンプル中の標的ペプチドの存在を決定する方法であって：
（ｉ）サンプル中に存在するタンパク質と、本発明の第１の態様によるポリペプチドとを接触させることであって、前記ポリペプチド中のループ領域の少なくとも１つの配列が前記標的ペプチドに特異的に結合することができる配列である、接触させること、
（ｉｉ）前記標的ペプチドと前記ポリペプチドとの間に相互作用があるかどうかを決定すること
を含み、
前記ポリペプチドと前記標的ペプチドとの間に相互作用がある場合には前記標的ペプチドはサンプル中に存在する方法に関する。
「サンプル」という用語は、本発明の第１３の態様で定義されている。本発明の第１４の態様のサンプルは、サンプル中に存在するペプチドを検出するのに適した任意の生物学的材料を含む。
本明細書で用いられる「標的ペプチド」という表現は、それが本発明の第１の態様のポリペプチドのループ領域の少なくとも１つの配列に特異的に結合するという事実に加えて、いかなる機能的、配列または構造的特徴によっても制限されない。
特定の実施形態において、標的ペプチドは本発明の第１３の態様のものであり、ポリペプチドは、標的ペプチドに特異的に結合するものとして同定された前記態様のものである。
少なくとも１つのループ領域の前記配列と標的ペプチドとの間の特異的結合は、１０－６Ｍ未満、１０－７Ｍ未満、１０－８Ｍ未満、１０－９Ｍ未満、１０－１０Ｍ未満、１０－１１Ｍ未満、１０－１２Ｍ未満、１０－１３Ｍ未満、１０－１４Ｍ未満または１０－１５Ｍ未満のＫＤを有する。「特異的結合」という用語は、本発明の第１の態様で定義されている。ポリペプチドと標的ペプチドとの間の結合を決定する方法もまた、本発明の第１の態様において提供されている。
サンプル中に存在するタンパク質と、標的ペプチドと特異的に結合することができる第１の態様のポリペプチドとを接触させることは、一般的に、単に前記ポリペプチドと前記サンプルとを、前記ペプチドと前記標的ペプチドとが相互作用することができる条件下で混合することである。したがって、特定の実施形態において、本方法の工程ｉ）は、上述した条件下で行われる。「ポリペプチドと標的ペプチドとが相互作用することができる条件下」という表現は、本発明の第１４の態様で定義されている。この定義は、「ライブラリーのメンバー」または「ライブラリーのポリペプチド」という用語を「第１の態様のポリペプチド」に置き換えることによって、本発明の本発明の態様に適用される。
相互作用があるかどうか、すなわちポリペプチド－標的ペプチド複合体の形成があるかどうかの決定は、いくつかの方法で行うことができる。
一方では、これは、最初に固体支持体に標的ペプチドを結合させることであって、該支持体に結合し、該ペプチドに特異的な特定の抗体、または該ペプチド中に存在するヒスチジンタグまたはビオチン等のタグに特異的な抗体によって結合させることによって行われる。次いで、第１の態様のポリペプチドを添加し、過剰な試薬を洗い流す。次いで、固体支持体における第１の態様のポリペプチドの存在が決定される。当技術分野で知られているように、様々なブロッキングおよび洗浄工程を利用することができる。洗浄条件は、本発明の第１４の態様で指定されたもののいずれかであり得る。当業者に理解されるように、洗浄工程の後、検出される第１の態様のポリペプチドは、標的ペプチドに結合したものである。したがって、第１の態様のポリペプチドの検出は、標的ペプチドへのポリペプチドの結合の間接的な指標であり、したがって、サンプル中の前記ペプチドの存在の間接的な指標である。
サンプル中のポリペプチドまたはペプチドの存在を検出する技術は、当技術分野の専門家によく知られている。例えば、ポリペプチドを標識し、前記標識を検出することができる。前記標識は、任意の放射性、蛍光、生物学的または酵素的なタグであり得る。前記ラベルを検出する方法は、当技術分野の専門家によく知られている。そのような標識の使用に関する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号が挙げられる。あるいは、当技術分野で知られているように、一次および二次抗体等の二次結合リガンドおよび／またはビオチン／アビジンリガンド結合配列を用いることにより、さらなる利点を見出だすことができる。サンプル中のポリペプチドを検出するための二次リガンドの使用に基づく技術の非限定的な例としては、ウエスタンブロットまたはイムノブロット、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）またはＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）が挙げられる。
一方で、相互作用があるかどうかの決定は、最初に第１の態様のポリペプチドと固体支持体とを、前記固体支持体に結合し前記ポリペプチドに特異的な抗体によって結合させることによって行われ得る。次いで、標的ペプチドを含むと思われるサンプルを添加し、過剰な試薬を洗い流す。最後に、固体支持体中の目的のペプチドの存在が決定される。
残りの工程は、この場合において検出されるポリペプチド－標的ペプチド複合体の部分が標的ペプチドであり、標的ペプチドと結合した標識（上述されたもの）または標的ペプチドに特異的な二次リガンド（上述されたもの）であることを除いて、標的ペプチドが固体支持体に固定化されている上述した工程と同じあり得る。したがって、この場合、標的ペプチドの検出は、ポリペプチドと標的ペプチドとの結合の間接的な指標であり、したがってサンプル中のペプチドの存在の間接的な指標である。
当技術分野の専門家によく知られているように、サンプル中または固体支持体に結合したポリペプチドまたはペプチドの存在を決定することを可能にする上記の技術のいずれも、サンプル中または固体支持体に結合した前記ポリペプチドまたはペプチドの量を決定することも可能にする。したがって、サンプル中の標的ペプチドの存在を決定する方法は、標的ペプチドの存在を決定することができるだけでなく、形成されたポリペプチド－標的ペプチド複合体の量、したがってサンプル中の標的ペプチドの量も決定することを可能にする。
したがって、特定の実施形態において、本発明はまた、サンプル中の標的ペプチドの量を決定する方法であって：
ｉ）サンプル中に存在するタンパク質と、本発明の第１の態様によるポリペプチドとを接触させることであって、前記ポリペプチド中のループ領域の少なくとも１つの配列が、ポリペプチド－標的ペプチド複合体を形成することができる条件下で前記標的ペプチドに特異的に結合することができる配列である、前記接触させること、
ｉｉ）形成されたポリペプチド－標的ペプチド複合体の量を決定すること
を含み、
前記形成されたポリペプチド－標的ペプチド複合体の量が前記サンプル中の標的ペプチドの量を示す方法に関する。
本明細書で用いられる「ポリペプチド－標的ペプチド複合体を形成することができる条件下」という表現は、ポリペプチドと標的ペプチドとが相互作用することが可能な上述したのと同じ条件を指す。
第１４の態様の特定の実施形態において、第１の態様のポリペプチドは固体支持体に固定化されている。特定の実施形態において、前記固体支持体は、本発明の第１４の態様で指定されたもののいずれかである。特定の実施形態において、ポリペプチドは、リンカー部分を介して固体支持体と結合している。
第１４の態様の別の特定の実施形態において、標的ペプチドは固体支持体に固定化されている。特定の実施形態において、前記固体支持体は、本発明の第１４の態様で指定されたもののいずれかである。特定の実施形態において、ポリペプチドは、リンカー部分を介して固体支持体と結合している。
特定の実施形態において、上述した本発明の態様で説明されたすべての用語および実施形態は、本発明の第１６の態様に等しく適用可能である。
別の実施形態において、本発明の任意の態様および実施形態で用いられる「からなる（consist）」および「含む（compise）」、「からなる（consisting）」および「含む（comprising）」という用語は交換可能である。
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下記の実施例により本発明を説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではなく、単なる例示と見なされるべきである。
タンパク質ナノ粒子の製造および精製
Ｔ２２－ＧＦＰ－Ｈ６、Ｔ２２－ＳＴＭ－Ｈ６および配列番号６１のＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６、モジュラータンパク質をコードするプラスミドベクターで、エシェリヒア・コリ（E. coli）発現系を形質転換し、初期の指数増殖期にイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導して、ルリアブロス（ＬＢ）培地中で様々なタンパク質を一晩（Ｏ／Ｎ）産生した。ＮＩＤＯｍｕｔ２ペプチドは、配列番号６１のペプチドに対応する。次いで、遠心分離（５０００ｇで５分）によって細胞を回収し、プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ－Ｆｒｅｅ、Ｒｏｃｈｅ製）の存在下で洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８）に再懸濁し、フレンチプレスで破砕した（１１００ｐｓｉで２～３ラウンド）。次いで、細胞可溶性画分を遠心分離（１５．０００ｇで４５分）によって分離し、可溶性タンパク質を固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製した。そのために、可溶性画分を固定化ニッケル含有ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）に充填し、タンパク質をＡＫＴＡピュアシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）で溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８）の直線勾配で溶出した。最後に、精製されたタンパク質を、Ｔ２２－ＳＴＭ－Ｈ６およびＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６については炭酸ナトリウム緩衝液（１６６ｍＭ ＮａＣＯ３Ｈ、ｐＨ８）に対して、Ｔ２２－ＧＦＰ－Ｈ６については塩緩衝液を含む炭酸ナトリウム（１６６ｍＭ ＮａＣＯ３Ｈ、３３３ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８）に対して透析した。
タンパク質の純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）およびモノクローナル抗Ｈｉｓ抗体（Ｓａｎｔａ ＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）を用いたウエスタンブロット免疫染色により決定された。タンパク質の完全性は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって検証され、タンパク質量はブラッドフォードアッセイによって定量化され、ナノ粒子のサイズは動的光散乱により決定された。
ナノ複合体の製造
タンパク質－ＦｄＵナノ複合体は、６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）二官能性リンカーを用いて、タンパク質リジンアミンを介して、タンパク質ナノ粒子と、５単位の５’－（ＦｄＵ）５－ヘキサエチレングリコールチオール－３’（ＦｄＵ）を含むオリゴマーとを共有結合させることによって生成された。そのために、チオール結合ＦｄＵオリゴマーを最初にＥＭＣＳ二官能性リンカーのマレイミド基と１：１のモル比で、室温（ＲＴ）で１０分間エステル基を付加して反応させた。次いで、ＦｄＵ分子を含む活性エステル基を、タンパク質ナノ粒子内の外側リジンアミン基と１：５のモル比で、室温で一晩反応させた。最後に、タンパク質－ＦｄＵナノ複合体をそれぞれの保存緩衝液に対して透析して、反応していない遊離オリゴ－ＦｄＵ分子を除去した。最終的な複合生成物は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析および動的光散乱によって特性化され、複合ＦｄＵ／タンパク質のモル比は、ＵＶ－可視光分光光度計により２６０ｎｍでのＵＶ光吸収（本実施例のＦｄＵオリゴマーが４４５００Ｍ－１．ｃｍ－１のモル吸光係数で光を吸収する波長）によって計算された。すべてのナノ複合体は、タンパク質単位あたり平均２～１０個のオリゴＦｄＵ分子を組み込み、元の平均ナノ粒子サイズを維持していた。
Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６ ＮＰｓ蛍光標識
細胞内追跡のために、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６分子をＡＴＴＯ４８８蛍光分子で共有結合的に標識した。そのために、エステル結合ＡＴＴＯ４８８分子（Ｓｉｇｍａ）をＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６分子の外側のリジンアミン基と１：２（タンパク質：色素分子）で室温で１時間反応させた。次いで、標識されたナノ粒子をそれらの保存緩衝液（炭酸ナトリウム緩衝液）に対して４℃で一晩透析して、非結合の遊離ＡＴＴＯ４８８分子を除去した。標識されたナノ粒子を、最終的にＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析および動的光散乱によって特性化した。
動的光散乱
すべてのタンパク質ナノ粒子およびナノ複合体の体積サイズ分布を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）により６３３ｎｍでの動的光散乱（ＤＬＳ）によって３回測定した。すべてのナノ粒子およびナノ複合体はナノメートルの範囲内にあり、１０～５０ｎｍの平均ナノ粒子サイズを示した。
ナノ粒子ＣＸＣＲ４依存性の内在化
ＣＸＣＲ４受容体特異的内在化を、ＣＸＣＲ４＋ヒト子宮頸部ＨｅＬａ細胞上において標識されたＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＡＴＴＯ４８８ナノ粒子を用いて研究した。そのために、ＡＴＣＣ（ＣＣＬ－２）で取得したＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレート上で、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ製）を添加したＭＥＭ－α培地（Ｇｉｂｃｏ製）により、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気で７０％コンフルエンスに達するまで培養した。次いで、標識されたＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＡＴＴＯ４８８ナノ粒子を、ＨｅＬａ細胞と共に、Ｌ－グルタミンを添加した無血清ＯｐｔｉＰＲＯ培地（Ｇｉｂｃｏ製）により、さまざまな時間および濃度でインキュベートした。次いで、細胞に外的に付着しているタンパク質を完全に除去するため「過酷な（harsh）」トリプシン消化の後に、細胞の蛍光を、４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザー（ＡＴＴＯ４８８分子励起用）およびＤ検出器（５３０／３０ｎｍフィルター）を用いて、ＦＡＣＳ－Ｃａｎｔｏフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）により分析した。
競合アッセイのために、細胞をＣＸＣＲ４特異的アンタゴニストＡＭＤ３１００（オクタ塩酸塩水和物－Ｓｉｇｍａ製）と共に１時間プレインキュベートした後、標識されたＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＡＴＴＯ４８８ナノ粒子を添加した。
共焦点レーザー顕微鏡
標識されたＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＡＴＴＯ４８８ナノ粒子の細胞内局在も、ＨｅＬａ細胞で共焦点レーザー顕微鏡によって研究した。そのために、ＨｅＬａ細胞をＭａｔＴｅｋ培養皿（ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐ．製）で、１０％ウシ胎児血清を添加したＭＥＭα培地で７０％コンフルエンスに達するまで培養した。次いで、標識されたＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＡＴＴＯ４８８ナノ粒子を、ＨｅＬａ細胞と共に、Ｌ－グルタミンを添加した無血清ＯｐｔｉＰＲＯ培地（Ｇｉｂｃｏ製）により、さまざまな時間および濃度でインキュベートした。次いで、細胞膜および核をＣｅｌｌＭａｓｋＴＭ ＤｅｅｐＲｅｄおよびＨｏｅｓｃｈｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ製）でそれぞれ１０分間染色した後、ＰＢＳで洗浄した。生細胞を、Ａｐｏ６３ｘ／１．４（オイルＨＣ ｘ ＰＬ ＡＰＯλブルー）対物レンズおよびブルーダイオード（４０５ｎｍ）、アルゴンレーザー（４８８ｎｍ）、ＨｅＮｅレーザー（６３３ｎｍ）を用いて、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ－ＳＰ５共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ製）により最終的に記録し、細胞核、細胞膜および標識されたナノ粒子をそれぞれ視覚化した。
ＭＴＴ
ナノ複合体（Ｔ２２－ＧＦＰ－Ｈ６－ＦｄＵ、Ｔ２２－ＳＴＭ－Ｈ６－ＦｄＵ、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＦｄＵ）を含むＦｄＵのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を、発光細胞生存率アッセイを用いてＣＸＣＲ４＋ＨｅＬａ細胞で評価した。そのために、ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレート上で、１０％ウシ胎児血清を添加した９０μｌのＭＥＭα培地で２４時間培養した。次いで、１０μｌの異なる濃度のＦｄＵ含有タンパク質ナノ複合体を添加し、さらに４８時間インキュベートした。最後に、細胞生存率を、供給元の指示に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）により決定した。
ＣＸＣＲ４＋結腸直腸癌モデルの作製
すべてのｉｎ ｖｉｖｏ手順は、サンパウ病院の動物倫理委員会によって承認され、欧州理事会の指令に従って行われた。特定病原体不在（ＳＰＦ）の条件下で維持された、体重が１８～２０ｇの５週齢の雌ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ製、Ｌ－Ａｂｒｅｓｌｌｅ、フランス）を用いて、ＣＸＣＲ４過剰発現（ＣＸＣＲ４＋）皮下（ＳＣ）結腸直腸（ＣＲＣ）異種移植マウスモデルを作製し、ナノ複合体の抗腫瘍効果の研究を行った。その目的のために、ドナー動物の腫瘍株として永続化された、患者由来のＭ５結腸直腸腫瘍組織を用いた。したがって、これらの動物から得られた１０ｍｇのＭ５ ＳＣ ＣＲＣ腫瘍組織を、ＮＳＧマウスの皮下組織に移植した。
Ｍ５ ＣＸＣＲ４＋ＳＣ ＣＲＣモデルにおけるナノ複合体の抗腫瘍効果
腫瘍が１２０～２００ｍｍ３の範囲内の体積に達した時点で、マウスをランダムに４つの群に割り当てた：１つはコントロール群（Ｋ、ｎ＝４）であり、３つは実験群である：Ｔ２２－ＳＴＭ－ＦｄＵ（ｎ＝４）；Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－ＦｄＵ（ｎ＝４）およびＴ２２－ＧＦＰ－ＦｄＵ（ｎ＝４）。すべての実験群に、５回の投与を３日ごとに２０μｇの投与計画に従う反復投与スケジュールで、対応するナノ複合体の静脈内注射を行った。コントロール群には、同じスケジュールに従って、ｐＨ８、１６６ｍＭのＮａＨＣＯ３を２００μｌ投与した。３日ごとにノギスを用いて長い（Ｄ）および短い（ｄ）腫瘍の直径を登録することにより、時間の経過に伴う腫瘍体積の変化を測定して、抗腫瘍効果を腫瘍の成長の阻害として評価した。腫瘍体積を、楕円体の式、体積＝１／２（Ｄ×ｄ２）を用いて計算した。ナノ複合体の投与開始から１４日後にマウスを安楽死させ、アポトーシス誘導の評価のために皮下腫瘍を採取し、組織学的分析のために肝臓および腎臓の組織を処理した。実験期間中、マウスの体重を週に２回記録した。
腫瘍におけるアポトーシス誘導の評価および正常組織における組織学
腫瘍、肝臓および腎臓の組織を収集し、リン酸緩衝液中の４％ホルムアルデヒドで２４時間固定し、次いで、組織学的分析のためにパラフィンに包埋した。実験の最後（最後のナノ粒子投与の２日後）に、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のために処理された厚さ４μｍの腫瘍の切片についてアポトーシス誘導分析を行った。２人の独立した研究者によって評価された盲検サンプルについいて、Ｈ＆Ｅ染色腫瘍スライスの１０個の高倍率視野（倍率４００倍）あたりの細胞死体の数を数えることによって、アポトーシス誘導を評価した。組織病理学的分析のために、肝臓および腎臓も採取した。代表的な写真を、Ｃｅｌｌ∧Ｂソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ ｖ ３．３、長野、日本）を用いて撮影した。
固有蛍光の測定
蛍光スペクトルを、Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ分光蛍光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、モルグレイブ、オーストラリア）で記録した。パス長１０ｍｍの石英セルおよびサーモスタット付きホルダーを用いた。励起および発光スリットを５ｎｍに設定した。励起波長（λｅｘ）を２９５ｎｍに設定した。発光スペクトルを、３１０～４５０ｎｍの範囲で取得した。タンパク質濃度は、炭酸緩衝液（１６６ｍＭ ＮａＣＯ３Ｈ、ｐＨ８）中で０．２ｍｇ／ｍＬとした。加熱に対するコンフォメーションの安定性を評価するために、１℃／分のスキャン速度で各温度での蛍光スペクトルを取得し、各スペクトルのスペクトル質量中心（ＣＳＭ）を計算した。ＣＳＭは、蛍光スペクトルピークの加重平均である。また、ＣＳＭは、タンパク質環境へのＴｒｐの相対的な曝露にも関連している。ＴｒｐのＣＳＭの最大赤方偏移（maximum red-shift）は、大きな溶媒露出性（solvent accessibility）（Li, T. M. et al., Biochemistry 1976, 15, 5571-80；Ruan, K and Weber, G, Biochemistry 1989, 28 (5), 2144-53およびMohana-Borges, R. et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1999, 96 (14), 7888-93）およびタンパク質のフォールディングとの互換性を有する。
各蛍光発光について、スペクトル質量中心（ＣＳＭ）を方程式１（Eq.1）に従って計算した（Lakowicz, J. R. et al., 1991, Biophys Chem 39(1), 79-84）。Ｉｉは波長λｉにおける強度測定である。
Figure 2023509004000020
アンフォールディング温度の決定
中点アンフォールディング温度（Ｔｍ）を、ＣＳＭ対Ｔｏ曲線の変曲点に対応する温度値として決定した。また、ＣＳＭ値が上昇し始める温度としてＴ開始を決定した。
統計分析
マンホイットニーＵ検定を用いて、群間の腫瘍体積またはアポトーシス小体の数の違いをペアごとに比較した。差異はｐ＜０．０５で有意であると見なした。すべての統計分析はＳＰＳＳバージョン１１．０パッケージ（ＩＢＭ、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いて行われ、値は平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。
新しいタンパク質クローンの取得と特性化：Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６ならびにそのすべての誘導体Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３＿Ｖ４５Ｔ－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３＿Ｖ１２１Ｑ－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３＿Ｆ１５７Ｅ－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３＿Ｖ２１５Ｔ－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ４＿Ｔ２１５Ｖ－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ４－Ｈ６およびＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｈ６
新しいＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６およびそのすべての誘導体Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３＿Ｖ４５Ｔ－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３＿Ｖ１２１Ｑ－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３＿Ｆ１５７Ｅ－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３＿Ｖ２１５Ｔ－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ４＿Ｔ２１５Ｖ－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ４－Ｈ６およびＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｈ６をコードする遺伝子は、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製）により提供され、ｐＥＴ２６ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ製）にサブクローン化した。タンパク質をコードするプラスミドをエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＢＬ２１ ＤＥ３株（Ｎｏｖａｇｅｎ株）に形質転換し、ルリアブロス（ＬＢ）培地中で、２０℃で一晩（Ｏ／Ｎ）０．１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導してタンパク質を生成した。次いで、遠心分離（５０００ｇで１５分）によって細胞を回収し、プロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）ＥＤＴＡ－Ｆｒｅｅ、Ｒｏｃｈｅ製）の存在下で洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８）に再懸濁した。次いで、細胞をＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ－Ｃ５システム（Ａｖｅｓｔｉｎ製）で８０００ｐｓｉで３ラウンド破壊した。タンパク質を含む細胞溶解物の可溶性画分を遠心分離（１５０００ｇで４５分）で分離し、次いでＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）に充填して、ＡＫＴＡピュアシステム（ＧＥヘルスケア製）により固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）で精製した。タンパク質の溶出を、溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８）の直線勾配により行った。次いで、精製したタンパク質画分を炭酸ナトリウム（１６６ｍＭ ＮａＣＯ３Ｈ、ｐＨ８）に対して透析した。タンパク質の純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動、およびそれに続く抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）を用いたウエスタンブロット免疫検出により決定した。タンパク質の完全性を、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によっても決定した。タンパク質の最終濃度を、ブラッドフォードのアッセイおよびＮａｎｏｄｒｏｐにより決定した。
他の緩衝液での安定性を検討するために、精製されたタンパク質画分を選択されたＦＤＡ承認緩衝液およびコントロールとしての炭酸塩に対して透析した。タンパク質濃度は、最初に炭酸緩衝液で２．０ｍｇ／ｍｌに設定し、０．５ｍｌの新しい各緩衝液に透析した。サンプルを１５０００ｇで１５分間遠心分離して沈殿物を除去し、残存する可溶性タンパク質濃度をブラッドフォードのアッセイおよびＮａｎｏｄｒｏｐで測定した。
タンパク質Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６およびそのすべてのさらなる誘導体の形態計測的特性評価
タンパク質ナノ粒子の体積サイズ分布を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）で、動的光散乱（ＤＬＳ）により６３３ｎｍで３回測定した。
タンパク質Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６およびそのすべてのさらなる誘導体の分析のための実験で用いられるタンパク質のオリゴ－ＦｄＵ複合化
Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６およびＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６を、二官能性リンカーを用いた２段階反応で、露出したリジンのアミン基を介してオリゴ５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（ｏｌｉｇｏＦｄＵ）分子に共有結合させた。そのために、最初にＴＣＥＰを添加してｏｌｉｇｏＦｄＵ分子のチオール基を保護するＳＳ結合を切断し、ＮＡＰ－１０セファデックス重力カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）を用いて生成物から不純物を除去した。次いで、チオール－オリゴＦｄＵ分子と６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル二官能性リンカー（ＥＭＣＳ）とを１：１のモル比で、チオール－マレイミド反応により室温で３０分間反応させた。最後に、得られたヒドロキシスクシンイミド官能化ｏｌｉｇｏＦｄＵ分子と外側のリジンのアミノ基とを１：５のモル比で、室温で５時間反応させ、続いてＺｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて精製し、炭酸緩衝液に対して透析して非共有結合したｏｌｉｇｏＦｄＵ分子を除去した。反応効率を最終的にＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によってチェックし、複合体オリゴＦｄＵ分子をモル吸光係数（ε：４３５００Ｍ－１．ｃｍ－１）のＵＶ／可視光分光光度計で２６０ｎｍのＦｄＵ吸光度により決定した。吸光度の値を、同等の濃度における非複合体タンパク質のベースライン２６０ｎｍの吸光度を差し引くことによって補正した。
新しいタンパク質Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６およびそのすべてのさらなる誘導体の分析のために行われたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存率アッセイ
ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－２）を、不透明な９６ウェルプレートで、５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気下で、１０％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ製）を含む９０μｌのＭＥＭα培地（Ｇｉｂｃｏ製）でインキュベートした。次いで、１０μｌのＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６－ＦｄＵナノ複合体およびＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＦｄＵナノ複合体をコントロールＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６とともに最終濃度２５ｎＭで添加し、さらに４８時間インキュベートした。細胞生存率を、Ｖｉｃｔｏｒ３発光プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製）でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）によって最終的に試験した。すべてのサンプルを３回分析し、データを生存率の平均％（コントロール細胞に対する）＋／－標準誤差として表した。
ＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６、Ｔ２２－ＧＦＰ－Ｈ６およびＴ２２－ＢＦＰ－Ｈ６タンパク質のタンパク質設計、生産および精製
モジュラータンパク質をコードする合成遺伝子を、社内で設計した。用いたＥＰＩＸ－４配列は、高い受容体親和性を有する最適化された二量体型であった。ＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６の場合、ＥＰＩＸ－４リガンドの後に６つのカチオン性アミノ酸配列（ＲＫＲＫＲＫ）を追加して、タンパク質の自己集合化を促進させた。また、ＥＰＩＸ－４とタンパク質足場ＧＦＰとの間に、柔軟なリンカー（ＧＧＳＳＲＳＳ）を追加し、ＣＸＣＲ４受容体に結合するためのリガンドの近接性（accessibility）を付与した。遺伝子コドンの用法を最適化してＥ．コリ（E. coli）にプラスミドｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ製）を挿入し、コンストラクトをＧｅｎｅａｒｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）によって得た。ベクターの組換え型を、Ｅ．コリ（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｆ－ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ－、ｍＢ－）ｇａｌ ｄｃｍ ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ製）で形質転換した。５００ｍＬセル三角フラスコ内のＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で、２０℃で一晩（Ｏ／Ｎ）０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド）を添加してコードされたタンパク質を産生させた。培養細胞のＯＤ５５０が約０．５に達した時点で細菌細胞を回収し、４℃で、７０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤カクテルＣｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ－Ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ製）の存在下で洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８）に再懸濁した。細菌細胞を１２００ＰＳＩのフレンチプレスで３ラウンド破砕し、遠心分離（４５分、１５０００ｇ、４℃）を行い、可溶性画分をＡＫＴＡ精製器ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＨｉｓＴｒａｐキレートＨＰカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製した。サンプルをろ過し（０．２２μｍ）、カラムに注入した後、収集する画分を溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８）で溶出した。精製タンパク質画分を炭酸緩衝液（１６６ｍＭＮａＣＯ３Ｈ、ｐＨ８）に対して透析した。さらに、ＣＸＣＲ４を標的とするタンパク質Ｔ２２－ＧＦＰ－Ｈ６およびＴ２２－ＢＦＰ－Ｈ６を産生させ、上述したようにバイパラトピックナノ粒子を形成するために精製した（U. Unzueta et al., Nanotechnology 2017, 28, 505102）。ＢＦＰは、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのアクセション番号ＥＦ０６４２５８．１で提供されるタンパク質に対応している。
ＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６、Ｔ２２－ＧＦＰ－Ｈ６および／またはＴ２２－ＢＦＰ－Ｈ６のタンパク質の特性化
組換えタンパク質の完全性を、質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）、ＴＧＸ（Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ ｅＸｔｅｎｄｅｄ）ステインフリーアクリルアミドゲル電気泳動（ＢｉｏＲａｄ製）、および抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（１：１０００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ製、ｒｅｆ．５７５９８））を用いたウエスタンブロット分析によって確認した。タンパク質濃度を、アルブミン（Ｒｏｃｈｅ製）標準曲線を用いたブラッドフォード（バイオラッド）アッセイにより決定した。精製タンパク質について、ＧＦＰ蛍光発光（５１０ｎｍ）を、４５０ｎｍの励起波長で、Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて測定した。ナノ粒子の体積およびサイズの分布を、石英キュベットを用いてＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）により６３３ｎｍの動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。
ＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６、Ｔ２２－ＧＦＰ－Ｈ６および／またはＴ２２－ＢＦＰ－Ｈ６タンパク質により産生されたナノ粒子の超微細構造の特性化
近接状態（nearly state）のタンパク質ナノ粒子のサイズおよび形状を、電界放出型走査電子顕微鏡（ＦＥＳＥＭ）Ｍｅｒｌｉｎ（Ｚｅｉｓｓ）によって評価した。タンパク質サンプルをシリコンウェハ上に直接載せ、過剰の液体をワットマン濾紙で吸い取り、風乾し、コーティングすることなく高解像度のレンズ内二次電子検出器を備えたＦＥＳＥＭ Ｚｅｉｓｓ Ｍｅｒｌｉｎ操作および１ｋＶで観察した。ナノ粒子の代表的な画像を、高倍率（８０，０００倍～３００，０００倍）の範囲で撮影した。
ＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６、Ｔ２２－ＧＦＰ－Ｈ６および／またはＴ２２－ＢＦＰ－Ｈ６タンパク質を用いた細胞培養、フローサイトメトリーおよび細胞毒性アッセイ
実験を、ＣＸＣＲ４＋の頸部および結腸直腸の細胞株（それぞれＨｅＬａおよびＳＷ１４１７）で行った。ＨｅＬａ細胞をイーグル最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ製）で培養し、ＳＷ１４１７をダルベッコの改良イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ製）で培養した。両方の細胞株に１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を添加し、３７℃および５％（ＨｅＬａ）または１０％（ＳＷ１４１７）のＣＯ２の加湿雰囲気で培養した。
タンパク質の内在化を試験するために、細胞を２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ製）に２４時間播種した（３００００細胞／ウェル）。短時間経過後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。次いで、Ｌ－グルタミンを添加したＯｐｔｉＰｒｏ培地で希釈した１μＭおよび２μＭのタンパク質をインキュベートし、細胞株に適切な条件下で異なる時間インキュベートした。次いで、過酷なトリプシン消化（１ｍｇ／ｍｌで１５分間）（Ｇｉｂｃｏ製）を行い、細胞膜の外側に結合したタンパク質粒子を除去した。細胞内緑色蛍光を、ＦＡＣＳ－Ｃａｌｉｂｕｒシステム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）で、励起波長４８８ｎｍの１５ｍＷ空冷アルゴンイオンレーザーを用いたフローサイトメトリーによって分析した。蛍光発光をＤ検出器（５３０／３０ｎｍバンドパスフィルター）で測定し、精製タンパク質の特異的蛍光によって手動で補正して、比較のために内在化したタンパク質の量を表すデータを取得した。競合アッセイでは、特定のＣＸＣＲ４アンタゴニストＡＭＤ３１００（オクタ塩酸塩水和物、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）を１：１０（タンパク質：ＡＭＤ３１００）のモル比で、ナノ粒子を添加する１時間前に添加した。すべての実験を３回行った。
バイパラトピックナノ粒子の製造と特性化
Ｔ２２－ＧＦＰ－Ｈ６、Ｔ２２－ＢＦＰ－Ｈ６およびＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６タンパク質ナノ粒子（１．５ｍｇ／ｍｌ）をさまざまな方法で分解した。Ｔ２２－ＧＦＰ－Ｈ６およびＴ２２－ＢＦＰ－Ｈ６のサンプルでは、ＮａＣｌ（最終濃度５００ｍＭ Ｎａ＋）およびイミダゾール（最終濃度３００ｍＭ）を炭酸緩衝液（１６６ｍＭ ＮａＣＯ３Ｈ、ｐＨ８）に添加し、ＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６では０．２％ＳＤＳを炭酸緩衝液（１６６ｍＭ ＮａＣＯ３Ｈ、ｐＨ８）に添加し、室温で２時間静置した。
Ｔ２２－ＧＦＰ－Ｈ６／ＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６およびＴ２２－ＢＦＰ－Ｈ６／ＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６バイパラトピックナノ粒子を、構成するブロックをそれぞれ１：１のモル比で混合することによって生成させ、続いて、炭酸緩衝液（１６６ｍＭ ＮａＣＯ３Ｈ、ｐＨ８）に対してそれらを透析した。徹底的な透析を行った（室温で３０分ごとに４回交換し、４℃でＯ／Ｎで１回交換し、最後に３０分ごとに４回交換した）。Ｔ２２－ＢＦＰ－Ｈ６／ＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６バイパラトピックナノ粒子をＦＲＥＴおよび共焦点顕微鏡実験に用い、Ｔ２２－ＧＦＰ－Ｈ６／ＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６をＦＥＳＥＭ、細胞培養およびｉｎ ｖｉｖｏ実験に用いた。
ＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６が異種ナノ粒子を形成し、同時にＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６およびＴ２２－ＢＦＰ－Ｈ６タンパク質を運ぶことができるかどうかを判断するために、ＦＲＥＴ分析を行った。タンパク質ナノ粒子の蛍光発光は、Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）で、３８７ｎｍで励起して測定した。発光は４００～６００ｎｍから収集した。
ＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６、Ｔ２２－ＧＦＰ－Ｈ６および／またはＴ２２－ＢＦＰ－Ｈ６タンパク質の使用を伴う実験のための共焦点アッセイ
ＨｅＬａ細胞を、Ｍａｔ－Ｔｅｋプレート（２５，０００細胞／ウェル）上で、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ製）を添加したイーグル最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ製）で、３７℃および５％で２４時間増殖させた。次いで、Ｌ－グルタミンを添加したＯｐｔｉＰｒｏ培地に２μＭのタンパク質ナノ粒子を添加し、適切な細胞条件で２４時間インキュベートした。タンパク質への曝露の際に、細胞核を５μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ製）で標識し、原形質膜を２．５μｇ／ｍｌのＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ製）により室温で１０分間標識した。６３倍（１．４ＮＡ）の油浸対物レンズを用いて、倒立型ＴＣＳ ＳＰ５ライカスペクトル共焦点顕微鏡（ライカ製）で共焦点画像を得た。励起には、４０５ｎｍの青色ダイオードレーザー（核酸）、４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザー（ナノ粒子）、および６３３ｎｍのＨｅＮｅレーザー（細胞膜）を介して到達した。共焦点ピンホールを１エアリーユニットに設定し、ナイキストサンプリング基準を満たすようにｚスタック取得間隔を選択した。Ｉｍａｒｉｓ Ｘ６４ ｖ．７．２．１ソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ製）のＳｕｒｐａｓｓモジュールを用いて、共焦点画像を処理した。
ＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６、Ｔ２２－ＧＦＰ－Ｈ６および／またはＴ２２－ＢＦＰ－Ｈ６タンパク質の使用を含む実験の統計分析
細胞内在化、競合アッセイならびに疾患に罹患した臓器におけるアポトーシスおよび有糸分裂病巣の数の対比較を、Ｔｕｋｅｙの検定で行った。すべての統計テストを、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍバージョン８．０を用いて行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの実験の両方のすべての定量値は、平均±平均の標準誤差（ｘ±ＳＥＭ）として表される。群間の差異は、ｐ＜０．０５で有意であると見なされる。
実施例１：Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６タンパク質ナノ粒子の特性化
ヒトニドゲン（Ｐ１４５４３）は、コラーゲンＩＶ、ペルレカンおよびラミニンと高い親和性で自然に結合する、基底膜（basement membrane）からの１３６．４ｋＤａの構造タンパク質である。このタンパク質は、おそらくコラーゲンＩＶとラミニンネットワークとを連結することにより発生中の細胞外マトリックス形成の制御に重要な役割を果たす３つの球状ドメインで構成されている。Ｇ２ドメインには、中央にαヘリックスを有する１１本鎖のβバレル（図１２Ａ、Ｂ）が含まれており、アエクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）の緑色蛍光タンパク質と同様のフォールディングを有している（図１２Ｃ、Ｄ）。
第１の工程では、ＧＦＰ様のヒトタンパク質足場を生成するために、マウスニドゲンＧ２結晶構造（１ＧＬ４）およびＧＦＰβバレル（１Ｑ４Ａ）の重ね合わせを行い、一致しないドメインフラグメントを除去して、完全に重なる正確なＧ２ドメイン配列を選択した。マウスのニドゲン配列は、現在利用可能な唯一の分解された構造であり、ヒトのニドゲンＧ２と配列が高度に相同である（図１３Ａ）。この意味で、両方の構造において最初に重なる残基であり（骨格構造ｒｍｓｄ＝１．６７）、非常に柔軟なアミノ酸である直前のＧｌｙ４２９が先行するＮ末端リガンドの望ましくないフォールディングパターンを生成し得ることから、設計されたヒトニドゲンタンパク質はＳｅｒ４３０から開始することとした。したがって、設計されたタンパク質は、ヒトニドゲン（２００９年７月７日付けのバージョンのＵｎｉｐｒｏｔデータベースのアクセション番号Ｐ１４５４３）のＳｅｒ４３０～Ａｌａ６６７のアミノ酸を含み、配列番号６２を有している。
第２の工程では、生物学的に中性のタンパク質足場を生成するために、ニドゲンのＧ２ドメインとペルレカン等の記載された天然リガンドとの相互作用に関係するさまざまな残基を選択的に突然変異させることとした。アミノ酸Ｈｉｓ４５６、Ａｒｇ６５０、Ｒ４６８およびＦ６３９を突然変異させた。１３Ｂに示すように、このモデルに従ってＧ２βバレルと相互作用すると相互作用ホットスポットにおける影響が確認され、選択した残基がペルレカンによって完全に埋もれた（図１３Ｂ）。
最後に、超分子組織の観点から、ＧＦＰベースのナノ粒子モデルのタンパク質－タンパク質接触に関与することが示唆された残基は、その相対的なニドゲンβバレル構造において非常に類似している（同じグループ）ことが見出され、それらがニドゲン由来の構成ブロックのオリゴマー化における相同相互作用点であることが示唆された。この意味で、突然変異する候補である選択されたアミノ酸は、示差されたタンパク質相互作用領域（具体的にはＦ６３９）とわずかに重複しているものの、導入された突然変異（Ｆ６３９Ｓ）はこのタンパク質間接触点に有利に作用する。したがって、その将来のオリゴマー化能力に対するニドゲンＧ２の突然変異の考えられる影響はすべて除去された。これらすべての分析を考慮すると、下記の突然変異が２００９年７月７日付けのバージョンのＵｎｉｐｒｏｔデータベースのアクセション番号Ｐ１４５４３（配列番号７２）のヒトニドゲンのＳｅｒ４３０～Ａｌａ６６７の配列に組み込まれ：Ｈ４５９Ａ、Ｒ４６８Ｎ、Ｆ６３９ＳおよびＲ６５０Ａ、ＮＩＤＯｍｕｔ２と名付けられ（図１３Ｂ）、配列番号６４として示されている。
遺伝子工学により、モジュール式の自己集合化タンパク質の合理的な設計と組換え生産が可能となった。本実施例では、１）Ｎ末端カチオン性ＣＸＣＲ４特異的リガンド（Ｔ２２）、２）構造的に安定で生物学的に中性のタンパク質足場、すなわち突然変異したヒトニドゲン－１のＧ２ドメイン（ＮＩＤＯｍｕｔ２、配列番号６４）、ステフィンＡ三重変異タンパク質（Stefin A Triple Mutant Protein（ＳＴＭ））または緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein（ＧＦＰ））および３）Ｃ末端ポリヒスチジンを含む３種の異なるモジュラータンパク質を組換え方式で設計し、Ｅ．コリ（E. coli）中で産生した（配列番号６１のＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６、Ｔ２２－ＳＴＭ－Ｈ６およびＴ２２－ＧＦＰ－Ｈ６）。産生されたタンパク質は、ＩＭＡＣアフィニティークロマトグラフィーによって正常に精製され、完全長であり、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析およびウエスタンブロット免疫検出により決定されるように純粋なタンパク質が得られた。それらはすべて、動的光散乱により決定されるように、Ｔ２２－ＳＴＭ－Ｈ６では２５ｎｍ、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６では１２ｎｍ、Ｔ２２－ＧＦＰ－Ｈ６では１１ｎｍの範囲の通常サイズのナノ粒子で自己集合化した（図２および図３）。分子量３０．３ｋＤａを示すＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６タンパク質は、細胞内追跡の目的のためのＡＴＴＯ４８８蛍光色素分子によって正常に標識され、これはＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によってピーク（約６００Ｄａの分子量の追加を有する）であって、追加のＡＴＴＯ４８８分子の収集に対応する各ピークによって決定される（図４）。
実施例２：配列番号６１のＣＸＣＲ４依存性内在化を伴うＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６
標識されたＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＡＴＴＯ４８８ナノ粒子は、ＣＸＣＲ４依存プロセスでＨｅＬａ細胞に内在化することができ、これはフローサイトメーターで測定された細胞内蛍光の蓄積により決定された（図５）。ＨｅＬａは、ＣＸＣＲ４受容体を高度に過剰発現する腫瘍細胞である。ＣＸＣＲ４を介したナノ粒子の取り込みは、ＨｅＬａ細胞とＣＸＣＲ４特異的アンタゴニストＡＭＤ３１００とのプレインキュベーションによってＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＡＴＴＯ４８８の内部移行が効率的に阻害される競合アッセイによって実証された。共焦点レーザー顕微鏡画像は、ＣＸＣＲ４＋ＨｅＬａ細胞内のＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＡＴＴＯ４８８ナノ粒子の断続的な細胞内核周囲蓄積を示した。
実施例３：Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＦｄＵナノ複合体の特性化
Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＦｄＵナノ複合体の特性化をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって行い、追加のオリゴＦｄＵ分子の取り込みに対応する３０．３ｋＤａを超える追加のピーク（約２ｋＤａの質量増分）が検出された。図６Ｂでは、最大３個のｏｌｉｇｏＦｄＵ分子の取り込みに対応するピークが検出された。Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＦＵナノ複合体を、動的光散乱法により決定されるナノメーターサイズのナノ粒子サイズの範囲に維持した。ＭＴＴ細胞生存率アッセイで測定をし、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＦｄＵは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＸＣＲ４＋ＨｅＬａ細胞に対してＴ２２－ＳＴＭ－Ｈ６－ＦｄＵナノ複合体またはＴ２２－ＧＦＰ－Ｈ６－ＦｄＵナノ複合体と同様の細胞毒性活性を示した（図７）。３つの異なるナノ複合体が異なる濃度（２５ｎＭおよび１００ｎＭ）で存在するＨｅＬａ細胞のインキュベーションによって、ナノモル範囲（ＩＣ５０＜２５ｎＭ）のＩＣ５０で非常に効率的な細胞生存率阻害がもたらされ、すべての場合において、等モル濃度の遊離オリゴＦｄＵよりも有意に効率的であった（図７）。
実施例４：Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＦｄＵナノ複合体はＣＸＣＲ４＋Ｍ５ ＳＣ ＣＲＣモデルにおいてＴ２２－ＳＴＭ－Ｈ６－ＦｄＵまたはＴ２２－ＧＦＰ－Ｈ６－ＦｄＵよりも高い抗腫瘍効果を示す
ＣＸＣＲ４の過剰発現が高いことから、ＣＸＣＲ４＋Ｍ５ ＣＲＣモデルを用いて、３つの比較したナノ複合体（Ｔ２２－ＳＴＭ－Ｈ６－ＦｄＵ、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＦｄＵおよびＴ２２－ＧＦＰ－Ｈ６－ＦｄＵ）の相対的な効力を評価した。この特徴は、ＣＸＣＲ４＋癌細胞を標的とすることができ、したがってＣＸＣＲ４＋ＣＲＣ幹細胞を選択的に排除することができる３種のナノ複合体の効力を識別するために非常に関連している。
２０μｇ ｑ３ｄｘ５の投与量でナノ複合体を繰り返し静脈内投与した後、時間の経過に伴う腫瘍体積を測定したところ、３種のすべてのナノ複合体では、担体で処理した動物と比較して腫瘍増殖の有意な減少を誘発した。腫瘍サイズの縮小は、Ｔ２２－ＳＴＭ－Ｈ６－ＦｄＵまたはＴ２２－ＧＦＰ－Ｈ６－ＦｄＵによる治療後よりも、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＦｄＵナノ複合体による治療後の方が顕著であった。さらに、実験の終了時点で、腫瘍体積の減少（ｍｍ３）は、コントロール群の腫瘍体積（１２８５．２±１４９．４）と比較の比較において、Ｔ２２－ＳＴＭ－Ｈ６－ＦｄＵについて登録された差（６９９．２±１４４．６、ｐ＝０．０２７）またはＴ２２－ＧＦＰ－Ｈ６－ＦｄＵについて登録された差（６６１．２±１６９．２、ｐ＝０．０５０）よりも、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＦｄＵ（４５６．５±１３４．９）で有意に高かった（ｐ＝０．０１８）（図８）。
実施例５：Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＦｄＵナノ複合体はＣＸＣＲ４＋Ｍ５ ＳＣ ＣＲＣモデルでＴ２２－ＳＴＭ－Ｈ６－ＦｄＵまたはＴ２２－ＧＦＰ－Ｈ６－ＦｄＵよりもアポトーシスの誘導物質として高い効力を示す
最後のナノ複合体投与の２日後に安楽死させたマウスにおけるＨ＆Ｅ染色腫瘍組織切片の１０倍の高倍率視野におけるアポトーシス誘導の評価により、コントロール担体処理群（７．４±０．８）について登録されたもの、またはＴ２２－ＳＴＭ－Ｈ６－ＦｄＵ処理腫瘍（１２．０±１．７、ｐ＝０．０１８）もしくはＴ２２－ＧＦＰ－Ｈ６－ＦｄＵ処理腫瘍（１２．３±１．５、ｐ＝０．０１８）においてカウントされたものと比較して、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＦｄＵについて有意に高いアポトーシス数値がもたらされた（２２．７±２．９、ｐ＜０．００１）。対照的に、Ｔ２２－ＳＴＭ－Ｈ６－ＦｄＵまたはＴ２２－ＧＦＰ－Ｈ６－ＦｄＵで治療した腫瘍とコントロール腫瘍との間では、アポトーシス誘導に有意差は観察されなかった。
すなわち、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＦｄＵナノ複合体は、Ｔ２２－ＳＴＭ－Ｈ６－ＦｄＵナノ複合体またはＴ２２－ＧＦＰ－Ｈ６－ＦｄＵナノ複合体よりもはるかに強力な抗腫瘍効果を誘導する。この知見および他の２種のナノ複合体よりも処理された腫瘍で有意に多くのアポトーシスの数値を誘発するという事実は、上述したように、ヒトニドゲンタンパク質の突然変異Ｇ２ドメインを組み込んだナノ複合体が、このナノ複合体の開発および臨床転用（clinical tanslation）への用途に選択されるものであることを示唆するものである。重要なことに、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６－ＦｄＵナノ複合体によって示される強力な抗腫瘍活性は、治療終了時の肝臓または腎臓における組織学的変化の欠如を含む正常な臓器において毒性がない場合に観察され（図１０）、他の２つのナノ複合体と比較して有意に高い治療指数を示す。
実施例６：配列番号６２を有するニドゲンの単離された天然Ｇ２ドメインおよび配列番号６４を有するＨ４５９Ａ、Ｒ４６８Ｎ、Ｆ６３９ＳおよびＲ６５０Ａの突然変異を含むＮＩＤＯｍｕｔ２変異体は熱安定性ポリペプチドである
ＮｉｄｏＷＴＨ６およびＳＴＭＨ６のサンプルからの中点アンフォールディング温度（Ｔｍ）は、検討した温度範囲で最大アンフォールディング状態に達していなかったため決定できなかった。この挙動は、非常に安定なタンパク質であるＴ２２－ＧＦＰ－Ｈ６でも説明されている（Sanchez, JM et al., Biomacromolecules, 2018, 19:3788-3797; doi:10.1021/acs.biomac.8b00924）。一方、Ｎｉｄｏｍｕｔ２Ｈ６からＴｍ＝５５℃が取得されたが、この場合、２つの熱遷移が観察された。ここでも、より高いＴｍを得ることができなかった（図１１）。あるいは、最大ＣＳＭ値がタンパク質のアンフォールディング状態を表すと仮定して、Ｔｍ値（表７、斜体の数字）が提案される。
Figure 2023509004000021
分析されたすべてのタンパク質は、熱安定性（Ｔｍ＞６５℃）タンパク質および中程度の熱安定性（Ｔｍ＜６５℃）タンパク質４であり、これらはすべてヒトＩ型コラーゲンよりも安定しており（Leikina et al, (PNAS, 2002, 31314-1318)）よりも安定しており、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）と同程度のＴｍ値を有する（Pico, G (Int. J. Biol. Macromol. 1997, 20: 63-7）)。
実施例７．タンパク質Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６およびそのすべてのさらなる誘導体の発現試験
それぞれの新しい突然変異タンパク質Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３＿Ｖ４５Ｔ－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３＿Ｖ１２１Ｑ－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３＿Ｆ１５７Ｅ－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３＿Ｖ２１５Ｔ－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ４＿Ｔ２１５Ｖ－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ４－Ｈ６およびＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｈ６について、直接産生および精製されたＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｈ６を除いて、生存率および品質を評価するための第１のアプローチとして発現試験を行った。すべての培養物は２０ｍＬのＬＢ培地で培養され、Ｏ／Ｎ誘導後のＯＤは３．３～４．５に達した。各タンパク質は、細胞溶解物のウエスタンブロットによって正常に検出された（図１４）。分子量は予想されるマーカーバンド内にあり、突然変異Ｆ１５７Ｅ（Ｔ２２ＮＩＤＯｍｕｔ３＿Ｆ１５７Ｅ－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ４＿Ｖ２１５Ｔ－Ｈ６およびＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ４）を組み込んだタンパク質はわずかに高いバンドを示したことに注目される。Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３＿Ｖ１２１Ｑ－Ｈ６およびＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３＿Ｆ１５７Ｅ－Ｈ６の研究は、これらのタンパク質の主要な画分が不溶性の形態で生成されたため、この時点で中止された。
実施例８．Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６およびそのすべてのさらなる誘導体のスケールアップされたタンパク質生産
この試験に続いて、タンパク質生産を２Ｌ三角フラスコ中の５００ｍＬのＬＢ培地に拡大し、金属アフィニティークロマトグラフィーを介して精製を行った。収量を表８に示す。タンパク質は効率的に精製され（純度＞９５％）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウエスタンブロットおよびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによってその完全性が再度裏付けられた（図１５）。１３３ｍＭのＮａＣＯ３Ｈ緩衝液で透析した後、すべてのタンパク質は安定していた。
Figure 2023509004000022
実施例９．得られたナノ粒子のサイズ分布
Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ４＿Ｔ２１５Ｖ－Ｈ６およびＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｈ６は、最大生産量（それぞれ、２４ｍｇ／Ｌ、２６ｍｇ／Ｌおよび２８ｍｇ／Ｌ）特性を進めるために選択された。この時点で、各候補の体積サイズ分布をＤＬＳを介して調査した（図１６）。３種の候補はすべて、ＺｎＣｌ２（０．０４ｍＭ）を用いてナノ粒子に集合する前後のサイズが元のＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６と同等であった。Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｈ６のみが、より大きなサイズのナノ粒子を示したが、目的のナノスケール（１０～１００ｎｍの範囲）内に十分収まっていた。Ｚｎがこの集合を仲介するために用いられることから、新しいタンパク質がＺｎ誘導沈殿に耐性があるかどうかを試験するために、最大０．１６ｍＭのＺｎＣｌ２の濃度の増加に対して沈殿アッセイを行うことが適切であると考えられた（図１７Ａ）。Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６に由来するすべての新しいタンパク質が、元の可溶性タンパク質に対して最大６６％の損失を示したコントロールＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６とは対照的に、Ｚｎと接触したときに可溶性を維持する能力を継承することが実証された。さらに、以前のほとんどのＺｎ濃度で行われたナノ粒子サイズ評価（図１７Ｂ）により、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６ナノ粒子が、１７ｎｍの安定したサイズで最小の分散で集合したものであることが明らかになった。
実施例１０．緩衝液での安定性の検討
得られたタンパク質の安定性を、ＦＤＡが承認した３種の緩衝液、およびコントロール緩衝液としての炭酸塩について検討した。この目的のために、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６（コントロール）、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６およびＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｈ６をさらに評価して、より複雑な緩衝液における透析後に全体的な安定性および溶解性を改善できるかどうかを検討した。選択された３種のＦＤＡ承認緩衝液の組成を表９に示す。
Figure 2023509004000023
上述の緩衝液で透析した後、重炭酸ナトリウムコントロールを含むほとんどの条件で沈殿が明らかであった（表１０）。しかしながら、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６およびＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６は緩衝液Ｂ６に非常に良好に溶解し、緩衝液Ａ９はＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｈ６に最適であることが示された。
Figure 2023509004000024
各タンパク質の固有の蛍光を用いて、温度に関連するアンフォールディングパラメータを評価した。ＣＳＭプロファイル（図１８Ａ～Ｃ）により、ＦＤＡが承認した３種の緩衝液すべてが、通常の炭酸緩衝液（１３３ｍＭ ＮａＣＯ３Ｈ、ｐＨ８）よりもタンパク質の安定性に貢献していることが示唆された。この傾向はＡ～Ｃのグラフから明らかであり、炭酸水素緩衝液（Ｃ）に属する実線は、ほとんどの温度点において他の緩衝液よりも高いＣＳＭ値を維持している。この傾向は、緩衝液Ａ９、Ｂ６およびＤ１がタンパク質をよりコンパクトな状態で保持していることを示唆するものである。どの緩衝液が実際に各タンパク質により良い安定性をもたらしているかを評価するために、主要な指標が各ＣＳＭグラフから抽出され、図１８Ｄに示されている。理想的な候補は、３つのインデックスＴｍ、Ｔ開始およびΔＴのすべてについて高い値を示す必要がある。３種のタンパク質候補を比較すると、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６は、１番目に緩衝液Ａ９、２番目にＢ６に対して高い値を示す。沈殿および安定性のデータを考慮すると、このタンパク質の最良の選択は緩衝液Ｂ６であり、安定性の指標が高く、透析中の沈殿がほとんど見られない。より優れた安定性の指標を示す２番目のタンパク質はＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ５－Ｈ６であり、安定性および沈殿の点で最良のプロファイルを有する緩衝液Ｄ１を提供する。
実施例１１－薬物複合体
Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６およびＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６を、同様の手順と同一のモル比でｏｌｉｇｏＦｄＵに結合した。クリーンな複合体サンプルのＯｌｉｇｏＦｄＵおよびタンパク質の定量化では、Ｔ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６およびＴ２２－ＮＩＤＯｍｕｔ２－Ｈ６について、それぞれ１．７９ＦｄＵ／タンパク質および０．９６ＦｄＵ／タンパク質のペイロード（payload）が示された。ペイロードの推定および結合の有効性を、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦを介して確認した（図１９Ａ～Ｂ）。両方のナノ複合体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで同様の細胞毒性効果を示した（ＣＸＣＲ４＋ＨｅＬａ細胞株、２５ｎＭ濃度のナノ複合体薬物）。注目すべきことに、同じタンパク質濃度の非複合体タンパク質Ｔ２２－Ｎｉｄｏｍｕｔ３－Ｈ６では、細胞毒性が引き起こされなかった（図１９Ｃ）。ナノ粒子への２２－ＮＩＤＯｍｕｔ３－Ｈ６－ＦｄＵの集合は、２ｍＭのＺｎＣｌ２を含む炭酸塩緩衝液で達成され；ナノ粒子のサイズは、非複合体型のタンパク質で見られるように１７ｎｍのままであった（図１９Ｄ）。
実施例１２．ナノ粒子ＥＰＩＸ４－ＲＫ－ＧＦＰ－Ｈ６
ヒトリガンドＥＰＩ－Ｘ４の能力を、タンパク質ベースの自己集合化ナノ粒子の腫瘍ホーミングペプチドとして試験され、また、Ｔ２２とともに、ＣＸＣＲ４過剰発現腫瘍細胞を標的にして内部移行するバイパラトピックナノ粒子を形成する可能性を試験した
この目的に対処するために、癌治療に適したサイズの自己集合化タンパク質担体を生成することを目的として、ＥＰＩ－Ｘ４ペプチド配列を提示するための合理的なタンパク質設計を行った（図２０Ａ）。より高い受容体親和性および血清安定性を備えた最適化されたタンデム型のＥＰＩ－Ｘ４を、Ｈ６タグ付きＧＦＰのＮ末端に配置した。アミノ末端のカチオン性ペプチドおよびポリヒスチジン（Ｈ６）カルボキシ末端の組み合わせは、二価のカチオン配位を介して約１０～８０ｎｍのサイズのナノ粒子に集合するタンパク質の制御；血管透過性および保持（ＥＰＲ）効果と細胞取り込みを改善するだけでなく、腎濾過を最小限に抑えるための理想的なサイズ（腎臓のカットオフは約６～８ｎｍ）に有利に働く。ＥＰＩ－Ｘ４ポリペプチド配列には、カチオン性残基が２５％しか存在しない。したがって、追加のカチオン性アミノ酸（ＲＫＲＫＲＫ）［２１］がＥＰＩ－Ｘ４に組み込まれ、ＥＰＩ－Ｘ４の代替プレゼンテーションで５０％に到達させた（図２０Ａ）。
２つの型のタンパク質（すなわち、ＥＰＩＸ４－ＧＦＰ－Ｈ６およびＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６）はエシェリヒア・コリ（Echerichia coli）で効率的に産生され、予想される分子量を有する純粋な完全長ポリペプチドとして精製された（図２０Ｂ）。親型（ＥＰＩＸ４－ＧＦＰ－Ｈ６）はさまざまなサイズ（４．８～８ｎｍのモノマーまたはダイマー形態から１０および５０ｎｍのナノ粒子まで）のナノ粒子実体の形態で不安定なオリゴマー化に至ったが、余分なカチオン配列を運ぶタンパク質型（ＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６）は、約４０ｎｍ（Ｐｄｉ＝０．３４３）の通常のナノ粒子として自発的に自己集合化した（図２０ＣおよびＤ）。これと一致するように、またこれらの結果を完全に裏付けるように、ＦＥＳＥＭ試験により、超微細構造形態計測を備えたトロイド（リング状）材料が示され（図２０Ｅ）、動的光散乱（ＤＬＳ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって得られた測定値が確認された。
培養ＣＸＣＲ４＋ＨｅＬａ細胞に曝露すると、ＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６のみが標的細胞に効率的に透過し、特定の受容体エントリーによって細胞内に蓄積し、これは化学薬品ＣＸＣＲ４アンタゴニストＡＭＤ３１００による阻害によって確認された（図２０Ｆ）。さらに、共焦点画像はこれらのデータを完全に裏付けており、細胞膜に結合したタンパク質を伴わないＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６の細胞内位置を示す（図２０Ｇ）。ＥＰＩＸ－４リガンドは、ＣＸＣＲ４の２番目の細胞外ループとの相互作用による受容体内在化アンタゴニストとして上記で説明されている。ＥＰＩＸ－４の後にカチオン配列を合理的に追加することによりタンパク質の自己集合化が促進され、天然リガンド（ＣＸＣＬ１２）の作用機序を模倣する可能性もある。アルギニン残基のセットとＣＸＣＲ４Ｎ末端との間の相互作用によって、受容体への迅速な結合および効率的な固定が促進され、細胞内在化が促進される。
実施例１３．バイパラトピックナノ粒子
同じコンストラクト内の異なる細胞リガンドの組み合わせは、癌治療における魅力的なアプローチであり、細胞特異性を劇的に高め、薬剤耐性の発生を回避する可能性がある。弱い界面活性剤を用いてＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６タンパク質ナノ粒子を８．７ｎｍの構築ブロックに分解し、透析によって親ナノ粒子と同じサイズの材料に再集合させた（図２１Ｂ）。さらに、バイパラトピックナノ粒子は、いずれもＣＸＣＲ４標的化タンパク質であるＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６の分解された部分とＴ２２－ＢＦＰ－Ｈ６とを混合することによって、正常に生成された（図２１Ａ）。得られたバイパラトピックナノ粒子は、元のＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６（図１Ｅ）またはＴ２２－ＢＦＰ－Ｈ６（U. Unzueta et al., Nanotechnology 2017, 28, 505102）と形態学的に区別することができない（図２１Ｃ）約１８ｎｍ（図２１Ｂ）の単分散集団（ＰｄＩ＝０．１７９）を示した。また、同じ部分における両方のタンパク質の存在は、３８７ｎｍでの励起時にバイパラトピックナノ粒子に対して異なるタンパク質モノマーの蛍光発光スキャンを比較することにより決定される、Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）（青色から緑色への蛍光）によって裏付けられた。この最後の場合において、ＢＦＰが３８７ｎｍで励起されると、ＢＦＰの蛍光発光エネルギーがＧＦＰ発色団に伝達され、５１０ｎｍでのＧＦＰ蛍光発光のみが観察された（図２１Ｄ）。
バイパラトピックナノ粒子の生物学的特性を評価するために、ＣＸＣＲ４＋細胞株（子宮頸癌ＨｅＬａ細胞株およびヒト結腸直腸ＳＷ１４１７細胞株）を、生成されたナノ粒子に異なる時間で曝露した。バイパラトピックナノ粒子は、受容体の特異性を失うことなく（図２１Ｆ）、細胞標的化特性を維持した（図２１Ｅ）。細胞の取り込みに関して、Ｔ２２－ＧＦＰ－Ｈ６は短時間で高い取り込みを示し、ＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６は長時間の取り込みを示し；バイパラトピックナノ粒子は、両者の取り込み挙動を組み合わせて、短時間でさらに良好な細胞取り込みを示した（図２１Ｅ）。共焦点顕微鏡により細胞の内在化を確認し、緑および青のタンパク質の共局在によってバイパラトピックナノ粒子形成の発生が裏付けられた。
この段階で、標的となるナノ粒子の可能性を詳細に評価するために、患者由来のＭ５結腸直腸癌のＣＸＣＲ４＋マウスモデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏの生体内分布分析を行った。全身投与後、マウスを異なる時点（０．５時間、１時間、２時間、５時間および２４時間）で２００μｇの単回投与で治療した。バイパラトピックナノ粒子は、ＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６ナノ粒子よりもはるかに速い腫瘍蓄積を誘発し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析で予測されるように、より短い時間（０．５～２時間）でより高いレベルの細胞内物質に至った（図２１Ｆ）。一方、ＥＰＩＸ４－（ＲＫ）－ＧＦＰ－Ｈ６は進行性の蓄積を示し、５時間でピークに達し、少なくとも２４時間は比較的安定したままであった（図２２Ａ）。正常組織を分析すると、すべての型のナノ粒子について非腫瘍組織で蛍光が検出されなかったことから、ＣＸＣＲ４標的化のｉｎ ｖｉｖｏでの特異性が非常に高いことがわかる。興味深いことに、腎臓に長時間蛍光がないことは、このヘテロマーオリゴマープラットフォームが親型と同様にｉｎ ｖｉｖｏでナノ粒子の安定性を維持していることを示す（表１１）。さらに、組織病理学的分析により、ＣＸＣＲ４－組織（腎臓および肝臓）またはＣＸＣＲ４＋（脾臓）のいずれにも全身毒性がないことが裏付けられた（図２２Ｄ）。
Figure 2023509004000025
さらに、時間の経過とともに、アポトーシスイベントの劇的な増大が観察され、腫瘍サンプル中の有糸分裂細胞の数が減少し、いずれも５時間の時点で有意であった（図２２Ｃ）。バイパラトピックナノ粒子の急速な取り込みは、他の型の材料よりも高いレベルの受容体内在化を引き起こした。この事実により、２４時間でかなり多くのアポトーシス小体が誘発される（図２２Ｂ）。これらのナノ粒子のより長い投与は、化学療法の組み合わせ（M. V. Cespedes, et al., EMBO Mol Med 2018, 10）または有毒なタンパク質の融合（R. Diaz et al., Small 2018, 14, e1800665；L. Sanchez-Garcia et al., J Control Release 2018, 274, 81）のいずれかによっても促進され得る持続的なカスパーゼ－３活性化による細胞死が引き起こされ得る（M. V. Cespedes et al., Sci Rep 2016, 6, 35765）。
まとめると、これらすべての観察結果は、ヒト腫瘍ホーミングペプチドとしてのＥＰＩ－Ｘ４の高い可能性を強く支持している。適切なタンパク質工学により、ｉｎ ｖｉｖｏでの強力なＣＸＣＲ４標的化を備える標準的で安定したタンパク質ナノ粒子が得られた。さらに、このタンパク質材料の可塑性により、構造的に堅牢なバイパラトピックナノ粒子タイプで、短時間で高い浸透性を示し、親の特異性と生体内分布パターンを維持する別のＣＸＣＲ４標的タンパク質と組み合わせることができる。
バイパラトピックナノ粒子の抗腫瘍活性に関して、これらの結果によれば、いずれもＣＸＣＲ４アンタゴニストであり、おそらく異なるＣＸＣＲ４ドメインと相互作用するリガンドであるＥＰＩ－Ｘ４およびＴ２２の多価提示が、おそらくより速い内在化速度、およびバイパラトピック設定でのアポトーシスの誘導の強化の原因であることが示唆される。したがって、治療後２４時間に達した４００倍の倍率の腫瘍領域あたり約３０のアポトーシス像のピークは、細胞死誘導に関して、フロクスウリジンまたは細菌毒素の触媒ドメイン等の強力な細胞毒性薬を組み込むＴ２２に基づくナノ粒子での治療後の結腸直腸腫瘍モデルにおける従来の結果に示されるのと同様の大きさである（L. Sanchez-Garcia et al., J Control Release 2018, 274, 81；M. V. Cespedes, et al., J Control Release 2020, 320, 96）。

Claims (103)

  1. （ｉ）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、ＪおよびＫと指定される１１種のβ鎖ドメイン、ならびに
    （ｉｉ）ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ、ＧＨ、ＨＩ、ＩＪおよびＪＫループと指定される、２つの連続するβ鎖ドメインを接続する１０種のループ領域
    を含むポリペプチドであって；
    前記ループ領域の少なくとも１つが配列番号６２における同族ループ領域変異体であり、該配列番号６２における同族ループ領域が、配列番号１（ループ領域ＡＢ）、配列番号２（ループ領域ＢＣ）、配列番号３（ループ領域ＣＤ）、配列番号４（ループ領域ＤＥ）、配列番号５（ループ領域ＥＦ）、配列番号６（ループ領域ＦＧ）、配列番号６２のアミノ酸１４９～１５０（ループ領域ＧＨ）、配列番号７（ループ領域ＨＩ）、配列番号８（ループ領域ＩＪ）および配列番号９（ループ領域ＪＫ）で定義され、かつ
    前記β鎖ドメインの少なくとも１つが配列番号６２における同族β鎖の変異体であり、同族β鎖ドメインと少なくとも５０％の配列同一性を有し、該配列番号６２における同族β鎖ドメインが、配列番号９（β鎖ドメインＡ）、配列番号１１（β鎖ドメインＢ）、配列番号１２（β鎖ドメインＣ）、配列番号１３（β鎖ドメインＤ）、配列番号１４（β鎖ドメインＥ）、配列番号１５（β鎖ドメインＦ）、配列番号１６（β鎖ドメインＧ）、配列番号１７（β鎖ドメインＨ）、配列番号１８（β鎖ドメインＩ）、配列番号１９（β鎖ドメインＪ）および配列番号２０（β鎖ドメインＫ）で定義される、
    ポリペプチド。
  2. 前記ループ領域の少なくとも１つの変異体が、前記同族ループ領域の配列中の少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換または付加による突然変異から生じる、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. １つ以上のβ鎖に突然変異を含み、該突然変異が、配列番号１１で定義されるβ鎖Ｂの９位、配列番号１１で定義されるβ鎖Ｃの１位、配列番号１２で定義されるβ鎖Ｃの１位、配列番号１９で定義されるβ鎖Ｊの１０位、または配列番号２０で定義されるβ鎖Ｋの３位に位置する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
  4. １つ以上の突然変異を含み、前記突然変異が４５９位、４６８位、６３９位、６５０位、５４３位、５４５位、４４９位、５２５位、５６１位、６１８位、６１９位、５８０位、６０４位、６３８位、６４０位、６４１位、４６９位および／または５１８位に位置し、前記番号が２００９年７月７日付けのバージョンのＵｎｉｐｒｏｔデータベースのアクセション番号Ｐ１４５４３－１のタンパク質配列で定義されるものである、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  5. 前記配列番号６２の４５９位、４６８位、６３９位、６５０位、５４３位、５４５位、４４９位、５２５位、５６１位、６１８位、６１９位、５８０位、６０４位、６３８位、６４１位、４６９位および／または５１８位の１つ以上の突然変異が、Ｈ４５９Ａ、Ｒ４６８Ｎ、Ｆ６３９Ｓ、Ｒ６５０Ａ、Ｈ５４３Ｋ、Ｈ５４５Ｎ、Ｖ４４９Ｔ、Ｖ５２５Ｑ、Ｆ５６１Ｅ、Ｖ６１９Ｔ、Ｖ６１９Ｔ、Ｃ６１８Ｓ、Ｖ５８０Ｔ、Ｉ６０４Ｔ、Ｖ６４０Ｙ、Ｌ６４１Ｔ、Ｓ４６９ＩおよびＲ５１８Ｉである、請求項４に記載のポリペプチド。
  6. 前記１つ以上の突然変異が表１に定義されるものである、請求項４または５に記載のポリペプチド。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチドを複数含むポリペプチドディスプレイライブラリーであって、前記複数のポリペプチドが、１つ以上のループ領域の配列が異なるポリペプチドによって形成される、ポリペプチドディスプレイライブラリー。
  8. 前記ライブラリーにおいて、表現型としての各ポリペプチドと前記表現型に対応する遺伝子型としての核酸とが直接的または間接的に連結している、請求項７に記載のポリペプチドディスプレイライブラリー。
  9. 請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または請求項７または８に記載のディスプレイライブラリーの複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド集合体。
  10. 請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  11. 請求項９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  12. （ｉ）ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体を含む第１のポリペプチド領域、および
    （ｉｉ）目的の剤
    を含む、複合体。
  13. 前記ポリペプチドが、請求項１～６のいずれかで定義されるニドゲン－１のＧ２ドメインの機能的に同等の変異体である、請求項１２に記載の複合体。
  14. 前記ポリペプチド領域が、２００９年７月７日付けのバージョンのＵｎｉＰｒｏｔデータベースのアクセション番号Ｐ１４５４３－１で定義されるヒトニドゲン－１の配列のアミノ酸４３０～６６７を含む、請求項１２または１３に記載の複合体。
  15. 前記ポリペプチドが、１つ以上の突然変異を含むニドゲン－１のＧ２ドメインの機能的に同等の変異体であり、前記突然変異が４５９位、４６８位、６３９位、６５０位、５４３位、５４５位、４４９位、５２５位、５６１位、６１８位、６１９位、５８０位、６０４位、６３８位、６４０位、６４１位、４６９位および／または５１８位に位置し、前記番号が２００９年７月７日付けのバージョンのＵｎｉｐｒｏｔデータベースのアクセション番号Ｐ１４５４３－１のタンパク質配列で定義されるものである、請求項１２～１４のいずれかに記載の複合体。
  16. 前記配列番号６２の４５９位、４６８位、６３９位、６５０位、５４３位、５４５位、４４９位、５２５位、５６１位、６１８位、６１９位、５８０位、６０４位、６３８位、６４１位、４６９位および／または５１８位の１つ以上の突然変異が、Ｈ４５９Ａ、Ｒ４６８Ｎ、Ｆ６３９Ｓ、Ｒ６５０Ａ、Ｈ５４３Ｋ、Ｈ５４５Ｎ、Ｖ４４９Ｔ、Ｖ５２５Ｑ、Ｆ５６１Ｅ、Ｖ６１９Ｔ、Ｖ６１９Ｔ、Ｃ６１８Ｓ、Ｖ５８０Ｔ、Ｉ６０４Ｔ、Ｖ６４０Ｙ、Ｌ６４１Ｔ、Ｓ４６９ＩおよびＲ５１８Ｉである、請求項１５に記載の複合体。
  17. 前記１つ以上の突然変異が表１に定義されるものである、請求項１５または１６に記載の複合体。
  18. 前記ポリペプチドが、目的の標的と特異的に結合することができる第２のポリペプチド領域をさらに含む、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の複合体。
  19. 目的の標的と特異的に結合することができる前記第２のポリペプチド領域がポリカチオン性ペプチドである、請求項１８に記載の複合体。
  20. 前記ポリカチオン性ペプチドが、
    （ｉ）細胞表面の受容体と特異的に結合して該細胞への複合体の内在化を促進することができる配列、
    （ｉｉ）アルギニンに富む配列、
    （ｉｉｉ）ＧＷＨ１ペプチド、
    （ｉｖ）ＣＤ４４リガンド、
    （ｖ）血液脳関門を通過できるペプチド、
    （ｖｉ）細胞透過性ペプチド、および
    （ｖｉｉ）ヌクレオリン結合ペプチド
    からなる群から選択される、請求項１９に記載の複合体。
  21. 前記ポリカチオン性ペプチドが、細胞表面の受容体と特異的に相互作用し、該細胞へ
    の複合体の内在化を促進することができる配列を含み、前記配列がＣＸＣＲ４リガンドである、請求項２０に記載の複合体。
  22. 前記ＣＸＣＲ４リガンドが、配列ＲＲＷＣＹＲＫＣＹＫＧＹＣＹＲＫＣＲ（配列番号２５）を含むペプチド、Ｖ１ペプチド（配列番号２６）、ＣＸＣＬ１２ペプチド（配列番号２７）、ｖＣＣＬ２（配列番号２８）、ＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号２９）またはそれらの機能的に同等の変異体からなる群から選択されるペプチドである、請求項２１に記載の複合体。
  23. 前記ＣＸＣＲ４リガンドのＮ末端またはＣ末端、好ましくはＣＸＣＲ４リガンドのＣ末端に位置する、正に帯電したペプチド配列、好ましくはＲＫＲＫＲＫ（配列番号７７）を含む、請求項２２に記載の複合体。
  24. 前記ＣＸＣＲ４リガンドがＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号２９）またはその機能的に同等の変異体である、請求項２３に記載の複合体。
  25. 前記ポリカチオン性ペプチドが、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号３０）、ＲＲＲＧＲＧＲＲＲ（配列番号３１）、ＲＡＲＧＲＧＲＲＲ（配列番号３２）およびＲＡＲＧＲＧＧＧＡ（配列番号３３）からなる群から選択される配列を含むアルギニンに富む配列である、請求項２０に記載の複合体。
  26. 前記ポリカチオン性ペプチドがＣＤ４４リガンドＡ５Ｇ２７（配列番号３４）またはＦＮＩ／ＩＩ／Ｖ（配列番号３５）である、請求項２０に記載の複合体。
  27. 前記ポリカチオン性ペプチドが、Ｓｅｑ－１－７（配列番号３６）、Ｓｅｑ－１－８（配列番号３７）、Ａｎｇｉｏｐｅｐ－２－７（配列番号３８）からなる群から選択される、血液脳関門を通過することができるペプチドである、請求項２０に記載の複合体。
  28. 前記ポリペプチドが、正に帯電したアミノ酸に富む領域である第３のポリペプチド領域をさらに含む、請求項１２～２７のいずれか一項に記載の複合体。
  29. 前記正に帯電したアミノ酸に富む領域がポリヒスチジン領域である、請求項２８に記載の複合体。
  30. 前記ポリヒスチジン領域が２～１０個の隣接するヒスチジン残基を含む、請求項２９に記載の複合体。
  31. 前記ポリカチオン性ペプチドが前記ポリペプチドのＮ末端に位置し、かつ前記正に帯電したアミノ酸に富む領域が前記ポリペプチドのＣ末端に位置するか、または前記正に帯電したアミノ酸に富む領域が前記ポリペプチドのＮ末端に位置し、かつ前記ポリカチオン性ペプチドが前記ポリペプチドのＣ末端に位置する、請求項１２～３０のいずれか一項に記載の複合体。
  32. 前記目的の剤が治療薬または造影剤である、請求項１２～３１のいずれか一項に記載の複合体。
  33. 前記治療薬が
    （ｉ）化学療法剤、
    （ｉｉ）細胞毒性ポリペプチド、
    （ｉｉｉ）抗血管新生ポリペプチド、
    （ｉｖ）腫瘍抑制遺伝子によってコードされるポリペプチド、
    （ｖ）アポトーシス促進性ポリペプチド、
    （ｖｉ）抗転移活性を有するポリペプチド、
    （ｖｉｉ）腫瘍に対する免疫応答を活性化することができるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、
    （ｖｉｉｉ）抗血管新生分子、および
    （ｉｘ）毒素
    からなる群から選択される、請求項３２に記載の複合体。
  34. 前記ポリペプチドと複数の治療薬とが結合し、前記複数の治療薬が同じであるかまたは異なる、請求項３２または３３に記載の複合体。
  35. 前記治療薬が化学療法剤である、請求項３３または３４に記載の複合体。
  36. 前記化学療法剤が代謝拮抗剤である、請求項３５に記載の複合体。
  37. 前記代謝拮抗剤がピリミジン類似体またはそのオリゴマー形態である、請求項３６に記載の複合体。
  38. 前記ピリミジン類似体がフロクスウリジンまたはその五量体形態である、請求項３７に記載の複合体。
  39. 前記第２のポリペプチド領域と前記第１のポリペプチド領域とが第１のペプチドリンカーを介して接続されており、かつ／または前記第１のポリペプチド領域と前記第３のポリペプチド領域とが第２のペプチドリンカーを介して接続されている、請求項２８～３８のいずれか一項に記載の複合体。
  40. 請求項１２～３９のいずれか一項に記載の複合体を調製する方法であって、
    （ｉ）ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体を含む請求項１２～３９のいずれか一項に記載の複合体のポリペプチドを提供すること、および
    （ｉｉ）前記ポリペプチドと、前記ポリペプチド中の少なくとも１つの基と反応することができる請求項１２～３９のいずれか一項に記載の複合体の目的の剤の活性化形態とを、前記目的の剤中の反応性基と前記ポリペプチド中の基との間の結合を形成するのに適切な条件下で接触させること
    を含む、方法。
  41. 前記目的の剤の活性化形態が、前記ポリペプチドの側鎖の少なくとも１つと反応する基を含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記ポリペプチド領域の側鎖の少なくとも１つと反応する基が、チオール基、アミノ基またはカルボン酸基である、請求項４１に記載の方法。
  43. 請求項１２～３９のいずれか一項に記載の複合体を調製する方法であって、
    （ｉ）ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体を含む請求項１２～３９のいずれか一項に記載の複合体のポリペプチドであって、活性化形態であるポリペプチドを提供すること、および
    （ｉｉ）前記ポリペプチドと、前記ポリペプチド中の反応性基と反応することができる目的の剤とを、前記ポリペプチド中の反応性基と前記目的の剤中の基との間の結合を形成するのに適切な条件下で接触させること
    を含む、方法。
  44. （ｉ）ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体を含む第１の領域、および
    （ｉｉ）拮抗的なＣＸＣＲ４リガンドを含む第２の領域
    を含むポリペプチド。
  45. 前記第１の領域が、請求項１～６のいずれかで定義されるニドゲン－１のＧ２ドメインの機能的に同等の変異体である、請求項４４に記載のポリペプチド。
  46. 前記第１の領域が、２００９年７月７日付けのバージョンのＵｎｉＰｒｏｔデータベースのアクセション番号Ｐ１４５４３－１で定義されるヒトニドゲン－１の配列のアミノ酸４３０～６６７を含む、請求項４４または４５に記載のポリペプチド。
  47. 前記ポリペプチドが、１つ以上の突然変異を含むニドゲン－１のＧ２ドメインの機能的に同等の変異体であり、前記突然変異が４５９位、４６８位、６３９位、６５０位、５４３位、５４５位、４４９位、５２５位、５６１位、６１８位、６１９位、５８０位、６０４位、６３８位、６４０位、６４１位、４６９位および／または５１８位に位置し、前記番号が２００９年７月７日付けのバージョンのＵｎｉｐｒｏｔデータベースのアクセション番号Ｐ１４５４３－１のタンパク質配列で定義されるものである、請求項４４または４５に記載のポリペプチド。
  48. 前記配列番号６２の４５９位、４６８位、６３９位、６５０位、５４３位、５４５位、４４９位、５２５位、５６１位、６１８位、６１９位、５８０位、６０４位、６３８位、６４１位、４６９位および／または５１８位の１つ以上の突然変異が、Ｈ４５９Ａ、Ｒ４６８Ｎ、Ｆ６３９Ｓ、Ｒ６５０Ａ、Ｈ５４３Ｋ、Ｈ５４５Ｎ、Ｖ４４９Ｔ、Ｖ５２５Ｑ、Ｆ５６１Ｅ、Ｖ６１９Ｔ、Ｖ６１９Ｔ、Ｃ６１８Ｓ、Ｖ５８０Ｔ、Ｉ６０４Ｔ、Ｖ６４０Ｙ、Ｌ６４１Ｔ、Ｓ４６９ＩおよびＲ５１８Ｉである、請求項４７に記載のポリペプチド。
  49. 前記１つ以上の突然変異が表１に定義されるものである、請求項４７または４８に記載のポリペプチド。
  50. 前記第２の領域がＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号２９）またはその機能的に同等の変異体を含む、請求項４４～４９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  51. 前記第２の領域が正に帯電したアミノ酸領域をさらに含む、請求項５０に記載のポリペプチド。
  52. 前記第２の領域のアミノ酸の少なくとも５０％が正に帯電したアミノ酸である、請求項５１に記載のポリペプチド。
  53. 前記正に帯電したアミノ酸領域がＲＫＲＫＲＫ配列を含む、請求項５１または５２に記載のポリペプチド。
  54. 前記第１の領域が前記ポリペプチドのＮ末端に位置し、前記正に帯電したアミノ酸に富む領域が前記ポリペプチドのＣ末端に位置する、請求項４４～５３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  55. 前記ポリペプチドが、正に帯電したアミノ酸に富む領域である第３のポリペプチド領域をさらに含む、請求項４４～５４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  56. 前記正に帯電したアミノ酸に富む領域がポリヒスチジン領域である、請求項５５に記載のポリペプチド。
  57. 前記ポリヒスチジン領域が２～１０個の隣接するヒスチジン残基を含む、請求項５６に記載のポリペプチド。
  58. 前記第１の領域が前記ポリペプチドのＮ末端に位置し、前記第３の領域が前記ポリペプチドのＣ末端に位置する、請求項５５～５７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  59. 請求項４４～５８のいずれか一項に記載のポリペプチドの複数のコピーを含むナノ粒子を調製する方法であって、前記ポリペプチドの調製物を、前記ポリペプチドの複数のコピーを集合させてナノ粒子とするのに適切な条件下に置くことを含む、方法。
  60. 請求項２８～３９のいずれか一項に記載の複合体の複数のコピーまたは請求項５５～５８のいずれか一項に記載のポリペプチドの複数のコピーを含むナノ粒子を調製する方法であって、
    （ｉ）前記複合体またはポリペプチドの調製物を、前記複合体またはポリペプチドの複数のコピーを集合させてナノ粒子とするのに適切な条件下に置くことを含む方法、または
    （ｉｉ）
    ｉ．それぞれが
    １．ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体である第１のポリペプチド領域、
    ２．目的の標的と特異的に結合することができる第２のポリペプチドであって、ポリカチオン性ペプチドである第２のポリペプチド、および
    ３．正に帯電したアミノ酸に富む領域である第３のポリペプチド領域
    を含む複数のポリペプチドを、前記ポリペプチドの複数のコピーを含むナノ粒子を形成するのに適切な条件下に置くことであって、
    前記ポリカチオン性ペプチドおよび正に帯電したアミノ酸に富む領域がポリペプチドの末端に位置し、該ポリペプチドが活性化形態で提供され、該活性化形態のポリペプチドが反応性基を含む、前記置くこと、および
    ｉｉ．工程ｉで得られたナノ粒子と、前記ポリペプチド中の反応性基と反応することができる基を含む目的の剤の活性化形態とを、前記ポリペプチド中の反応性基と前記目的の剤中の基との間の結合を形成するのに適切な条件下で接触させること
    を含む方法
    から選択される、方法。
  61. 前記第１、第２および第３のポリペプチド領域が、請求項１３～３１および４５～５８のいずれか一項に記載の複合体において定義されるものである、請求項６０に記載の方法。
  62. 第１のタイプの複合体の複数のコピーおよび第２のタイプの複合体の複数のコピーを含むバイパラトピックナノ粒子を調製する方法であって、前記第１および第２のタイプの複合体が請求項２８～３９のいずれか一項で定義されるものであり、前記第１および第２のタイプの複合体が異なるポリカチオン性ペプチド配列を有し、
    （ｉ）前記第１のタイプの複合体の調製物と前記第２のタイプの複合体の調製物とを、該２つのタイプの複合体の複数のコピーを集合させてナノ粒子とするのに適切な条件下で接触させることを含む方法、または
    （ｉｉ）
    ｉ．第１のポリペプチドの調製物と第２のポリペプチドの調製物とを接触させることであって、前記第１および第２のタイプのポリペプチドが、
    ａ．ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体である第１のポリペプチド領域、
    ｂ．目的の標的と特異的に結合することができる第２のポリペプチド領域であって、前記第２のポリペプチドがポリカチオン性ペプチドであり、かつ／またはそのＮ末端またはＣ末端に位置する正に帯電した追加のペプチド配列およびポリカチオン性の配列を含み、一つのポリペプチドのポリカチオン性ペプチドの配列と他のポリペプチドのポリカチオン性ペプチドの配列とが異なる、第２のポリペプチド領域、
    ｃ．正に帯電したアミノ酸に富む領域である第３のポリペプチド領域、
    ｄ．任意に、ポリカチオン性ペプチドのＮ末端またはＣ末端に位置する正に帯電したペプチド配列
    を含み、
    前記ポリカチオン性ペプチドおよび正に帯電したアミノ酸に富む領域が前記ポリペプチドの末端に位置し、
    前記第１および第２のポリペプチドが異なるポリカチオン性ペプチドを有し、
    前記第１および／または第２のポリペプチドが請求項２８～３９のいずれか一項に記載の複合体において定義されるものであり、
    前記第１および／または第２のポリペプチドが活性化形態で提供され、該活性化形態のポリペプチドが反応性基を含み、前記置くことが、ポリペプチドの複数のコピーを含むナノ粒子を形成するのに適切な条件下で行われる、前記接触させること、
    ｉｉ．工程ｉで得られたナノ粒子と、各ポリペプチド中の反応性基と反応することができる基を含む目的の剤の活性化形態とを、前記ポリペプチド中の反応性基と前記目的の剤中の基との間の結合を形成するのに適切な条件下で接触させること
    を含む方法
    から選択される、方法。
  63. 前記第１、第２および第３のポリペプチド領域が、請求項１３～３１のいずれか一項の複合体において定義されるものである、請求項６２に記載の方法。
  64. 請求項２８～３９のいずれか一項に記載の少なくとも１つの複合体の複数のコピーおよび請求項５５～５８のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチドの複数のコピーを含むバイパラトピックナノ粒子を調製する方法であって、前記第１のタイプの複合体のポリカチオン性ペプチドと前記少なくとも１つのポリペプチドの第２の領域の配列とが異なり、
    （ｉ）前記少なくとも１つの複合体の複数のコピーと前記少なくとも１つのポリペプチドの複数のコピーの調製物とを、前記２つの複合体の複数のコピーを集合させてナノ粒子とするのに適切な条件下に置くことを含む方法、または
    （ｉｉ）
    ｉ．第１のポリペプチドの調製物と第２のポリペプチドの調製物とを接触させることであって、前記第１および第２のタイプのポリペプチドが、
    ａ．ニドゲン－１のＧ２ドメインまたはその機能的に同等の変異体である第１のポリペプチド領域、
    ｂ．目的の標的と特異的に結合することができる第２のポリペプチド領域であって、前記第２のポリペプチドがポリカチオン性ペプチドであり、かつ／またはそのＮ末端またはＣ末端に位置する正に帯電した追加のペプチド配列およびポリカチオン性の配列を含み、一つのポリペプチドのペプチドの配列と他のポリペプチドのポリカチオン性ペプチドの配列とが異なる、第２のポリペプチド領域、
    ｃ．正に帯電したアミノ酸に富む領域である第３のポリペプチド領域
    を含み、
    前記ポリカチオン性ペプチドおよび正に帯電したアミノ酸に富む領域が前記ポリペプチドの末端に位置し、
    前記第１のポリペプチドが請求項２８～３９のいずれか一項で定義される複合体として存在し、前記第２のポリペプチドが請求項５５～５８のいずれか一項で定義されるものであり、
    前記第１のポリペプチドのポリカチオン性ペプチドと前記第２のポリペプチドのポリカチオン性ペプチドとが異なり、
    前記第１および／または第２のポリペプチドが活性化形態で提供され、該活性化形態のポリペプチドが反応性基を含み、前記置くことが、ポリペプチドの複数のコピーを含むナノ粒子を形成するのに適切な条件下で行われ、
    ｉｉ．工程ｉで得られたナノ粒子と、各ポリペプチド中の反応性基と反応することができる基を含む目的の剤の活性化形態とを、前記ポリペプチド中の反応性基と前記目的の剤中の基との間の結合を形成するのに適切な条件下で接触させること
    を含む方法
    から選択される、方法。
  65. 代替（ｉ）の複合体およびポリペプチドの第１、第２および第３のポリペプチド領域、または代替（ｉｉ）の第１および第２のポリペプチドの第１、第２および第３のポリペプチド領域が、請求項１３～３１および４４～５８のいずれか一項の複合体において定義されるものである、請求項６４に記載の方法。
  66. 代替（ｉ）の複合体のポリカチオン性ペプチド、または代替（ｉｉ）の第１のポリペプチドのポリカチオン性ペプチドが、配列ＲＲＷＣＹＲＫＣＹＫＧＹＣＹＲＫＣＲ（配列番号２５）、Ｖ１ペプチド（配列番号２６）、ＣＸＣＬ１２（配列番号２７）ペプチド、ｖＣＣＬ２（配列番号２８）およびそれらの機能的に同等の変異体からなる群から選択される、請求項６４または６５に記載の方法。
  67. 代替（ｉ）の複合体のポリカチオン性ペプチド、または代替（ｉｉ）の第１のポリペプチドのポリカチオン性ペプチドが、配列ＲＲＷＣＹＲＫＣＹＫＧＹＣＹＲＫＣＲ（配列番号２５）、Ｖ１ペプチド（配列番号２６）、ＣＸＣＬ１２ペプチド（配列番号２７）、ｖＣＣＬ２（配列番号２８）およびそれらの機能的に同等の変異体から選択され、好ましくはＲＲＷＣＹＲＫＣＹＫＧＹＣＹＲＫＣＲ（配列番号２５）であり、代替（ｉ）のポリペプチドのポリカチオン性ペプチド、または代替（ｉｉ）の第２のポリペプチドのポリカチオン性ペプチドが、ＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号２９）またはその機能的に同等の変異体である、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記ＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号２９）とＲＫＲＫＲＫ配列（配列番号７７）とが結合されている、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記ポリペプチドの複数のコピーを集合させてナノ粒子とするのに適切な条件が、低塩緩衝液中でのインキュベーションを含む、請求項５９～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記低塩緩衝液が、炭酸塩緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液およびリン酸緩衝液からなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記緩衝液のｐＨがｐＨ４～ｐＨ８、好ましくはｐＨ５～ｐＨ７．５であり、より好ましくは約ＰＨ５．３、ＰＨ６．５またはＰＨ７．２である、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液および／またはリン酸緩衝液が、ポリソルベート８０および／またはスクロースをさらに含む、請求項７０または７１に記載の方法。
  73. 前記スクロースが２０ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの濃度で見出される、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記スクロースが５０ｍｇ／ｍｌ～９０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは７０ｍｇ／ｍｌの濃度で見出される、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記クエン酸緩衝液が、ポリソルベート８０（０．４ｍｇ／ｍｌ）、スクロース（８０ｍｇ／ｍｌ）、クエン酸ナトリウム二水和物（２．７ｍｇ／ｍｌ）および無水クエン酸（０．１４６ｍｇ／ｍｌ）を含み、ｐＨが約６．５である、請求項７０～７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記酢酸緩衝液が、スクロース（７０ｍｇ／ｍｌ）、氷酢酸（０．１２ｍｇ／ｍｌ）、酢酸ナトリウム三水和物（２．４５ｍｇ／ｍｌ）を含み、ｐＨが約５．３である、請求項７０～７４のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記リン酸緩衝液が、ポリソルベート８０（０．０５ｍｇ／ｍｌ）、スクロース（５０ｍｇ／ｍｌ）、リン酸二水素ナトリウム一水和物（０．２２ｍｇ／ｍｌ）、リン酸二水素ナトリウム無水物（０．４９ｍｇ／ｍｌ）を含み、ｐＨが約７．２である、請求項７０～７４のいずれか一項に記載の方法。
  78. 請求項２８～３９のいずれか一項に記載の複合体の複数のコピー、請求項５５～５８のいずれか一項に記載のポリペプチドの複数のコピーを含むか、または請求項５９～７７のいずれか一項に記載の方法により得られる、ナノ粒子。
  79. 第１および第２のタイプの複合体の複数のコピーを含むバイパラトピックナノ粒子であって、前記第１および第２のタイプの複合体の両方が請求項２８～３９のいずれか一項で定義されるものであるか、または請求項５５～５８のいずれか一項で定義されるポリペプチドとして存在し、前記第１および第２のタイプの複合体が、請求項６２～７７のいずれか一項に記載の方法により得られるポリカチオン性ペプチドまたはバイパラトピックナノ粒子において異なる、バイパラトピックナノ粒子。
  80. 前記第１のタイプの複合体および第２のタイプの複合体のポリカチオン性ペプチドがＣＸＣＲ４リガンドであり、好ましくは配列ＲＲＷＣＹＲＫＣＹＫＧＹＣＹＲＫＣＲ（配列番号２５）を含むペプチド、Ｖ１ペプチド（配列番号２６）、ＣＸＣＬ１２ペプチド（配列番号２７）、ｖＣＣＬ２ペプチド（配列番号２８）、ＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号２９）およびそれらの機能的に同等の変異体からなる群から選択される、請求項７９に記載のバイパラトピックナノ粒子。
  81. 前記第１のタイプの複合体のポリカチオン性ペプチドが、配列ＲＲＷＣＹＲＫＣＹＫＧＹＣＹＲＫＣＲを含むペプチドからなり、前記第２のタイプの複合体のポリカチオン性ペプチドがＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号２９）である、請求項８０に記載のバイパラトピックナノ粒子。
  82. 請求項２８～３９のいずれか一項に記載の複合体の複数のコピーおよび請求項５５～５８のいずれか一項に記載のポリペプチドの複数のコピーを含むバイパラトピックナノ粒子であって、前記複合体のポリカチオン性領域と前記ポリペプチドの第１の領域とが異なるバイパラトピックナノ粒子、または請求項６２～７７のいずれか一項に記載の方法により得られるバイパラトピックナノ粒子。
  83. 前記複合体のポリカチオン性ペプチドがＣＸＣＲ４リガンドであり、好ましくは配列ＲＲＷＣＹＲＫＣＹＫＧＹＣＹＲＫＣＲ（配列番号２５）を含むペプチド、Ｖ１ペプチド（配列番号２６）、ＣＸＣＬ１２ペプチド（配列番号２７）およびｖＣＣＬ２ペプチド（配列番号２８）からなる群から選択される、請求項８２に記載のバイパラトピックナノ粒子。
  84. 前記拮抗的ＣＸＣＲ４リガンドがＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号２９）である、請求項８３に記載のバイパラトピックナノ粒子。
  85. 直径が１～１００ｎｍである、請求項７８～８４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  86. 医薬における使用のための、請求項１２～３９のいずれか一項に記載の複合体、請求項４４～５８のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項７８～８５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  87. 癌の治療における使用のための請求項１２～３９のいずれか一項に記載の複合体、請求項４４～５８のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項７８～８５のいずれか一項に記載のナノ粒子であって、前記複合体またはポリペプチドが、細胞表面の受容体と特異的に相互作用して細胞への複合体またはナノ粒子の内在化を促進することができる配列を含み、前記細胞が癌中に存在する腫瘍細胞である、複合体、ポリペプチドまたはナノ粒子。
  88. 前記ナノ粒子を形成する複合体またはポリペプチドのポリカチオン性ペプチドがＣＸＣＲ４リガンドであり、前記癌が、ＣＸＣＲ４を発現または過剰発現する癌細胞を含む、請求項８７に記載の複合体、ポリペプチドまたはナノ粒子。
  89. 前記ＣＸＣＲ４リガンドが、配列ＲＲＷＣＹＲＫＣＹＫＧＹＣＹＲＫＣＲ（配列番号２５）を含むペプチド、Ｖ１ペプチド（配列番号２６）、ＣＸＣＬ１２ペプチド（配列番号２７）、ｖＣＣＬ２ペプチド（配列番号２８）、ＥＰＩ－Ｘ４配列（配列番号２９）からなる群から選択される、請求項８８に記載の使用のための複合体またはナノ粒子。
  90. 前記ＣＸＣＲ４リガンドが、配列ＲＲＷＣＹＲＫＣＹＫＧＹＣＹＲＫＣＲ（配列番号２５）を有するペプチドである、請求項８９に記載の使用のための複合体またはナノ粒子。
  91. 前記ＣＸＣＲ４リガンドがＥＰＩ－Ｘ４ペプチド（配列番号２９）である、請求項９０に記載の使用のための複合体またはナノ粒子。
  92. 前記ナノ粒子が、請求項７９～８５のいずれか一項で定義されるバイパラトピックナノ粒子である、請求項８６～９１のいずれか一項に記載の使用のためのナノ粒子。
  93. 前記ＣＸＣＲ４を発現または過剰発現する癌細胞が転移性幹細胞である、請求項８８～９２のいずれか一項に記載の使用のための複合体、ポリペプチドまたはナノ粒子。
  94. 前記癌が膵臓癌または結腸直腸癌である、請求項８７～９３のいずれか一項に記載の使用のための複合体、ポリペプチドまたはナノ粒子。
  95. 前記癌が原発腫瘍または転移である、請求項８７～９４のいずれか一項に記載の使用のための複合体、ポリペプチドまたはナノ粒子。
  96. 請求項１２～３９のいずれか一項に記載の複合体の１つ以上の構成要素、請求項４４～５８のいずれか一項に記載のポリペプチドの１つ以上の構成要素、または請求項７８～８５のいずれか一項に記載のナノ粒子の１つ以上の構成要素に対する特異的結合部位を含む標的細胞の画像化の方法であって、
    （ｉ）前記細胞を含むサンプルと、請求項１２～３９のいずれか一項に記載の複合体、請求項４４～５８のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項７８～８５のいずれか一項に記載のナノ粒子とを、前記複合体、ポリペプチドまたはナノ粒子と前記細胞とが結合するのに適切な条件下で接触させることであって、前記目的の剤が造影剤である、接触させること、および
    （ｉｉ）前記造影剤により提供される信号を検出することにより細胞を画像化すること
    を含む、方法。
  97. 前記細胞がＣＸＣＲ４を発現または過剰発現し、前記複合体またはナノ粒子の１つ以上の構成要素がポリカチオン性ペプチドであり、前記ポリカチオン性ペプチドがＣＸＣＲ４リガンドである、請求項９６に記載の方法。
  98. 標的ペプチドに結合するポリペプチドを同定する方法であって、
    ｉ）標的ペプチドと、請求項７または８に記載のポリペプチドディスプレイライブラリーとを、ポリペプチドと前記標的ペプチドとが相互作用することができる条件下で接触させること、
    ｉｉ）前記標的ペプチドと特異的に相互作用したライブラリーのメンバーを回収すること、および
    ｉｉｉ）前記標的ペプチドと相互作用するポリペプチドの配列を特定すること
    を含む、方法。
  99. 工程ｉ）～ｉｉ）が少なくとも１回繰り返され、各繰り返しにおいて工程ｉ）で用いられるポリペプチドライブラリーが工程（ｉｉ）で回収されたライブラリーのメンバーによって形成される、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記標的ペプチドが固体支持体に固定化される、請求項９８または９９に記載の方法。
  101. ペプチドを提示するための請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用であって、前記ペプチドがループ領域の１つに見出される、使用。
  102. サンプル中の標的ペプチドの存在を決定する方法であって、
    ｉ）サンプル中に存在するタンパク質と、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチドとを接触させることであって、前記ポリペプチド中のループ領域の少なくとも１つの配列が前記標的ペプチドに特異的に結合することができる配列である、接触させること、
    ｉｉ）前記標的ペプチドと前記ポリペプチドとの間に相互作用があるかどうかを決定し、前記ポリペプチドと前記標的ペプチドとの間に相互作用がある場合には前記標的ペプチドがサンプル中に存在する、決定すること
    を含む、方法。
  103. 前記ポリペプチドが固体支持体に固定化される、請求項１０２に記載の方法。
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