KR101579879B1 - ｓｉＲＮＡ 전달을 위한 히알루론산-콜레스테롤 나노파티클 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

ｓｉＲＮＡ 전달을 위한 히알루론산-콜레스테롤 나노파티클 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101579879B1
KR101579879B1 KR1020130107541A KR20130107541A KR101579879B1 KR 101579879 B1 KR101579879 B1 KR 101579879B1 KR 1020130107541 A KR1020130107541 A KR 1020130107541A KR 20130107541 A KR20130107541 A KR 20130107541A KR 101579879 B1 KR101579879 B1 KR 101579879B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sirna
cholesterol
protein
nanoparticle
conjugate
Prior art date
Application number
KR1020130107541A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150028644A (ko
Inventor
안형준
Original Assignee
한국과학기술연구원
경북대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술연구원, 경북대학교 산학협력단 filed Critical 한국과학기술연구원
Priority to KR1020130107541A priority Critical patent/KR101579879B1/ko
Publication of KR20150028644A publication Critical patent/KR20150028644A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101579879B1 publication Critical patent/KR101579879B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6925—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a microcapsule, nanocapsule, microbubble or nanobubble
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트를 포함하는 siRNA 전달용 나노파티클, 상기 나노파티클의 내부에 siRNA 결합 단백질 및 siRNA의 복합체가 봉입된 siRNA 전달용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

ｓｉＲＮＡ 전달을 위한 히알루론산-콜레스테롤 나노파티클 및 이를 포함하는 조성물{Hyaluronic acid-cholesterol nanoparticles for siRNA delivery and composition comprising the same}
본 발명은 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트를 포함하는 siRNA 전달용 나노파티클, 상기 나노파티클의 내부에 siRNA 결합 단백질 및 siRNA의 복합체가 결합되어 있는 siRNA 전달용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
RNA 간섭현상(RNA interference,RNAi)은 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA와 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA로 구성되는 이중사슬 RNA(double strand RNA)을 세포 등에 도입하여 선택적으로 표적 유전자의 mRNA의 분해를 유도하거나 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 현상을 말한다. RNAi 는 처음에 선충에서 발견되었지만, 현재는 효모, 곤충, 식물, 인간 등 각종 동식물에서 매우 잘 보존이 되어 있는 생명현상으로 관찰되고 있다.
Small interference RNA(siRNA)는 RNA 간섭현상(RNAi)을 유도하는 물질로서, 약 20 내지 30개의 뉴클레오타이드(nucleotides)로 구성된 짧은 RNA 이중나선 가닥을 말한다. siRNA를 세포 내로 주입시켜 이 siRNA와 염기서열이 상보적인 mRNA를 표적으로 삼아 유전자 발현을 억제하게 된다. 이에, siRNA는 질병에 대한 치료 효과를 가지며, 쉬운 제조법 및 높은 표적 선택성 등으로 인해 표적이 되는 생명 프로세스를 조절할 수 있는 효과적인 수단으로 각광을 받고 있다.
현재 siRNA를 이용하여 치료할 수 있는 질환으로, 암, 바이러스 감염 질환, 자가면역 질환, 신경퇴행성 질환 등이 연구되고 있으며, 임상적 시도로서 노인성 황반변성 (베바시라닙; Opko Health, Inc., Miami, FL, USA; 임상 3상), 호흡기 신시치아 바이러스 감염증 (ALN-RSV01; Alnylam, Cambridge, MA, USA; 임상 2상)에 대한 치료제로서의 가능성이 보고되었다(Melnikova I. Nat Rev Drug Discov 2007, 6, 863-864). 또한 트랜스페린을 표적으로 하는 사이클로덱스트린 기반의 나노입자 중합체 (CALAA-01; Calando Pharmaceuticals, Pasadena, CA, USA; 임상 1상)를 이용하여 인간 암 치료에서 siRNA의 전달 시스템이 가능함이 보고되었다 (Oh YK. et al., Adv Drug Deliver Rev 2009, 61, 850-862).
그러나, siRNA는 안정성이 낮아 생체 내에서 단시간에 분해되며, siRNA의 음이온성으로 인하여 같은 음전하를 띄는 세포막을 쉽게 투과하기 힘들어 세포 내로의 전달성이 떨어진다는 문제가 있어, 이들의 세포 내 전달을 용이하게 하는 효과적인 전달체 제조 기술이 요구되고 있다. 이와 같이 siRNA를 세포 내로 효율적으로 전달하기 위해서는, 분해효소 저항성을 가지며 장시간 생체 내에서 순환하며 임상적으로 가능한 주입경로를 통해 표적 세포에 도달할 수 있고 세포투과 후에는 효과적인 세포질 방출이 가능한 효과적인 새로운 전달 시스템이 필요하다.
기존의 siRNA 전달체로, siRNA를 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터가 사용되거나, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴, 양이온성 인지질 나노입자, 양이온성 고분자, 또는 리포좀에 기반한 전달체가 주로 사용되었다. 그러나, 바이러스성 전달체의 경우 바이러스 벡터의 표면 단백질의 면역원성으로 인한 면역 부작용을 일으켜 체내 안정성이 보장되지 못하는 문제가 지적되었다.
이제까지 가장 많이 보고가 되고 있는 양이온성 분자 또는 양이온성 합성 고분자를 이용한 전달체의 경우 플리스미드 DNA에서는 우수한 전달효율을 보여왔으나 플리스미드 DNA와 비교시 상대적으로 길이가 20 - 23mer에 불과한 siRNA의 낮은 음이온 밀도와 고유의 견고한 구조 때문에 세포 내로의 수송 효율이 낮다는 문제점을 안고 있다 (Lee SH. et al., Acc. Chem. Res. 2012, 45, 1014-1025). 즉, 양이온-음이온 정전기적 상호작용에 의하여 siRNA와 양이온성 고분자 전달체의 결합이 형성될 때 siRNA의 낮은 음이온 밀도와 고유의 견고한 구조는 siRNA/전달체 복합체가 촘촘한 구조를 형성하는 것을 방해하여 느슨하게 결합된 siRNA/전달체 복합체 구조를 형성하게 됨으로써, 결합된 siRNA가 쉽게 분해효소나 혈액내의 음전하를 띄는 단백질의 공격을 받게 된다.
또한 양이온성 합성 고분자 전달체의 경우 높은 양이온 전하 밀도와 제한된 생분해성으로 인해 세포 내로의 siRNA 전달과정에서 세포막 혹은 미토콘드리아 막을 파괴함으로써 세포괴사나 세포사멸이 유발될 수 있는 세포 독성에 대한 문제점이 있어 왔다 (Cho KC. et al., Macromol. Res. 2006, 14, 348-353). 따라서 독성문제를 해결하기 위해 독성이 감소된 다양한 신규 양이온성 고분자를 제조하거나 기존의 양이온성 고분자를 변형함으로써 독성이 감소된 양이온성 고분자 전달체를 개발하여 왔으나 여전히 siRNA가 지니는 낮은 전하 밀도와 고유의 견고한 구조 때문에 세포 내로의 수송효율이 낮다는 문제점이 남아있다.
또한, 히알루론산은 암세포 표면에 풍부하게 존재하는 CD44, RHAMM 막수용체의 결합리간드로서 많은 종류의 암조직에서 신생혈관생성에 관여하기 때문에 약물전달체의 구성성분으로 많은 이용을 받아 왔으나, 히알루론산 자체의 음전하 성질로 인하여 siRNA와의 복합체 형성에 어려움이 있으며 따라서 siRNA 복합체 형성을 위하여 세포독성이 강한 양이온성 폴리머를 같이 사용해야한다는 문제점을 안고 있다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트를 포함하는 siRNA 전달용 나노파티클을 개발하여, 기존의 양전하-음전하간의 정전기적 상호적용을 이용하는 siRNA 복합체 형성법을 대체할 수 있는 기술을 제시함으로써 생체적합성 및 암표적성이 우수한 siRNA 전달체를 제공하도록 하였다.
본 발명의 목적은 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트를 포함하는 siRNA 전달용 나노파티클을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노파티클을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클, 및 상기 나노파티클의 내부에 결합된, siRNA 결합 단백질 및 siRNA의 복합체를 포함하는, siRNA 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 siRNA 전달용 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 해결하기 위한 양태로서, 본 발명은 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트를 포함하는 siRNA 전달용 나노파티클에 관한 것이다.
본 발명에서, '히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트'는 음전하성 성질을 가지는 히알루론산을 콜레스테롤로 화학개질하여 양친매성을 나타내도록 한 것이다. 기존 약물 전달체로서의 히알루론산은 물에만 용해가능하여 소수성 물질을 결합시킬 대 반응 효율이 낮을 뿐 아니라 음전하성을 나타내어 siRNA를 전달하는 것이 어려운 단점이 있었다. 이에 본 발명자들은 물에 용해되는 히알루론산 고분자에 소수성 물질인 콜레스테롤을 결합시킴으로써 양친매성을 나타내는 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트를 제조하여, siRNA 결합 단백질 및 siRNA의 복합체 형성이 안정적으로 이루어질 수 있도록 하였다.
본 발명에서, 'siRNA 전달용 나노파티클'은 상기 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트가 수용액 상에서 양친매성 성질로부터 유래하는 자가조립(self-assembly)를 통해 형성되는 것으로, 수용액상에서 매우 안정한 구조를 유지한다. 특히, siRNA 전달체에서 널리 사용되는 양이온성 고분자 전달체와는 달리 음이온성 고분자 전달체로서 생체독성이 낮다는 특징이 있다.
바람직하게, 상기 나노파티클의 직경은 150nm 내지 450nm일 수 있으며, 보다 바람직하게 190nm 내지 410nm일 수 있다. 실시예 1-3에서는 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트의 물리화학적 물성 테스트를 통하여 생성된 나노파티클의 직경이 HA-Chol3 나노파티클은 410 nm, HA-Chol13 나노파티클은 268 nm, HA-Chol24 나노파티클은 190 nm임을 확인하였다.
또 다른 바람직한 양태로서 본 발명은, 상기 '히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트'에서 콜레스테롤 비율이 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트의 2중량% 내지 30 중량%인 나노파티클에 관한 것이다. 바람직하게는 3.6중량%에서 24중량%의 콜레스테롤이 결합될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 24중량%의 콜레스테롤 함량일 수 있다.
본 발명에서 상기 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트는 히알루론산을 구성하는 당 잔기 100개마다 콜레스테롤 분자가 1에서 50개까지 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 결합반응에 의해 화학결합 된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 콜레스테롤이 3 내지 24개까지 결합된 것일 수 있다. 또한, 실시예 1-3에서는 나노파티클을 형성함에 있어서 콜레스테롤의 상대적인 양에 따라 나노파티클을 형성하는 최소농도가 결정되며, 임계회합농도(critical aggregation concentration, CAC) 측정에서 콜레스테롤의 상대적 결합비율이 2.6% (HA-Chol3), 12.7% (HA-Chol13), 24% (HA-Chol24)일 경우 각각 0.15 mg/mL, 0.025 mg/mL, 0.006 mg/mL임을 확인하였다.
또한, 실시예 2에서는 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클이 siRNA 결합 단백질 및 siRNA의 복합체와 결합하는 것을 관찰하였으며, 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클 중 HA-Chol24을 포함하는 것이 가장 우수한 약 11%의 siRNA 봉입효율을 나타내었다.
또 다른 양태로서 본 발명은, 콜레스테롤 말단에 아민기를 도입하는 단계;
가교제의 존재 하에서, 아민기가 도입된 콜레스테롤 및 히알루론산을 반응시시켜 콘쥬게이트를 제조하는 단계; 및 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트를 수용액 내에서 자가조립시키는 단계를 포함하는, 나노파티클을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 콜레스테롤 말단에 아민기를 도입하는 방법으로, 에틸렌디아민(ethylenediamine, EDTA)와 콜레스테릴 클로로포르메이트(cholesteryl chloromate)를 반응시키는 것을 이용할 수 있으며, 그 외 디에틸렌트리아민, 테트라에틸렌펜타아민, 트리에탄올아민 등 아민기를 도입할 수 있는 물질과의 반응을 통해 콜레스테롤 말단에 아민기를 도입할 수 있다.
본 발명에서 아민기가 도입된 콜레스테롤 및 히알루론산을 반응시켜 콘쥬게이트를 형성하는 데 사용되는 가교제로서, EDC cross linker (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) DCC cross linker (N,N'-dicyclohexylcarbodiimide) 등이 사용될 수 있으며, 이는 카르복실기와 아민기를 결합시켜 에스터 결합을 형성하기 위해 사용되는 것으로서 zero-length crosslinker이면 상기 예시에 제한되지 않고 사용될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클, 및 상기 나노파티클의 내부에 결합된, siRNA 결합 단백질 및 siRNA의 복합체를 포함하는, siRNA 전달용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 'siRNA 전달용 조성물' 이란, 다양한 목적의 siRNA가 RNA 결합 2b 단백질에 결합하여 복합체를 형성한 후 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클의 내부에 결합함으로써 안전하게 세포 내로 투과될 수 있도록 하는 것이다. 세포 내에 투과된 siRNA는 타겟 유전자를 사일런싱(silencing)할 수 있다.
본 발명에서 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트는 양친매성 성질로부터 유래하는 자가조립현상으로 수용액에서 나노파티클을 형성하며, 이렇게 형성된 나노파티클은 수용액상에서 매우 안정한 구조를 유지한다. 실시예 1-3에서는 6일동안 수용액상에서의 나노파티클 크기를 측정한 결과 나노파티클간의 침전이 발생하지 않으며 일정한 나노파티클 크기를 유지하는 것을 확인하였다.
또한, RNA 결합 단백질은 호모다이머(homodimer)가 형성하는 결합자리에 siRNA에 결합하도록 함으로써 siRNA 결합 단백질 및 siRNA의 복합체를 형성하여, siRNA의 음이온을 중성화한다. 또한 본 발명에서는 소수성 상호작용을 이용하여 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클 내부에 결합시킴으로써 외부 공격으로부터 siRNA를 보호하여 생체 내 안정성을 높일 수 있어, 효과적인 siRNA 전달체로 이용할 수 있도록 하였다. 본 발명 실시예 2에서는 RNA 결합 단백질의 하나인 2b 단백질이 없는 경우 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클이 siRNA와의 결합을 형성하지 못하는 것을 관찰하였으며, 이로부터 RNA 결합 단백질이 siRNA 전달에 필요하다는 것을 확인하였다.
바람직하게, 본 발명에서, 상기 'siRNA 결합 단백질' 은 토마토 아스퍼미 바이러스(tomato aspermy virus)의 2b 단백질일 수 있다. 상기 RNA 결합 2b 단백질은 토마토 아스퍼미 바이러스(tomato aspermy virus)에 존재하는 단백질로서, 길이에 제한없이 이중가닥 RNA와 높은 친화력으로 결합하는 단백질일 수 있다. 본 발명의 siRNA 결합 단백질은 단일가닥 RNA 및 이중가닥 DNA와는 결합하지 않는 특이성을 가지므로, siRNA를 전달하기에 적합하며, RNA 결합 2b 단백질은 호모다이머(homodimer)를 형성함으로써 siRNA와 복합체를 형성하게 된다. 또한, 실시예 2에서는 RNA 결합 2b 단백질은 siRNA와 몰비 기준으로 2:1로 결합함을 전기영동 분석을 이용하여 확인하였다.
더욱 바람직하게, 본 발명은, 상기 토마토 아스퍼미 바이러스의 2b 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것이 아니며, siRNA와 결합체를 형성할 수 있는 한, 상기 서열번호 1의 일부를 치환, 삽입 및/또는 결실한 변형체를 모두 포함할 수 있다.
바람직하게 본 발명의 siRNA 전달용 조성물에서의 siRNA 는 표적 유전자와 동일한 세포에 존재하는 경우에 siRNA의 서열에 상보적인 mRNA의 분해를 매개함으로써, 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 억제할 수 있는 이중가닥 RNA(duplex RNA), 또는 단일가닥 RNA 내부에서 이중가닥의 형태를 띄는 단일가닥 RNA를 지칭한다. 이중가닥 사이의 결합은, 뉴클레오티드 간의 수소 결합을 통해 이루어지며, 이중가닥 내부의 모든 뉴클레오티드가 상보적으로 서로 결합해야 하는 것은 아니며, 상기 양 가닥은 분리되어 있거나(separate) 분리되어 있지 않을 수 있다. 상기 siRNA의 길이는 20 내지 30 개의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있으며, siRNA를 이용하여 치료할 수 있는 질환에 대해 치료효과를 나타낼 수 있는 것이면, siRNA의 종류는 제한되지 않는다.
특히 본 발명에서 siRNA는 siRNA 결합 단백질에 결합한 후 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트가 수용액 상에서 양친매성 성질로부터 유래하는 자가조립(self-assembly)를 통해 형성된 나노파티클 내부에 보호되는 것을 특징으로 하므로, siRNA 전달용 조성물에 결합된 siRNA는 외부와 물리적으로 차단되어 뉴클레아제(nuclease)와 같은 분해효소로부터 자유로워 안정성이 우수하며, 외부에 노출된 히알루론산-콜레스테롤 나노파티클에 의하여 효과적으로 표적 세포에 결합한 후 엔도시토시스(endocytosis)에 의하여 세포 내로 투과될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트를 수용액 내에서 자가조립하여 나노파티클을 제조하는 단계; siRNA 결합 단백질에 siRNA를 결합시켜 siRNA 결합 단백질 및 siRNA의 복합체를 제조하는 단계; 및 상기 나노파티클 내부에 상기 siRNA 결합 단백질 및 siRNA의 복합체를 봉입하는 단계를 포함하는, siRNA 전달용 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
보다 바람직하게 본 발명은, 상기 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트는, 콜레스테롤 말단에 아민기를 도입하는 단계; 및 가교제의 존재 하에서 아민기가 도입된 콜레스테롤 및 히알루론산을 반응시키는 단계에 의하여 제조된 것인 방법에 관한 것이다.
바람직하게, 상기 siRNA 결합 단백질은 토마토 아스퍼미 바이러스(tomato aspermy virus)에서 유래한 RNA 결합 2b 단백질일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 siRNA 전달용 조성물을 포함하는, siRNA 관련 질환의 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 siRNA 전달용 조성물을 통해 siRNA는 안전하게 세포 내로 투과될 수 있으며, 세포 내 투과 후, 나노파티클 내부에서 siRNA 결합 단백질과 결합되어 있던 siRNA는 세포 내 엔도솜(endosome)의 산성 조건에서 2b 단백질과 해리되며 순차적으로 히알루론산-콜레스테롤 나노파티클로부터도 해리될 수 있다. 그 결과, siRNA가 엔도솜으로부터 세포질로 방출(endosomal escape)됨으로써 효과적으로 mRNA의 발현을 억제할 수 있다. 따라서, 질환 유전자를 포함하는 타겟 유전자 발현을 억제하고 질병치료가 가능하게 할 수 있다.
본 발명에서 siRNA는 질환 관련 유전자의 mRNA의 발현을 억제함으로써 질환 치료 효과를 유도할 수 있는 것이라면 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 20 내지 30 개의 뉴클레오티드로 이루어진 것을 포함한다.
상기 siRNA 관련 질환은 이에 한정되지는 않지만, siRNA로 치료할 수 있음이 알려진 질환들을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 암, 노인성 황반변성, 바이러스 감염 질환, 자가면역 질환 및 신경퇴행성 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 질환을 포함할 수 있다. 상기 암은 유방암, 폐암, 두경부암, 뇌암, 복부암, 결장암, 식도암, 위암, 위장암, 간암, 설암, 신경아세포종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 빌립스 종양, 망막아세포종, 다발성 골수종, 피부암, 림프종 및 혈액암 등을 포함하나 특별히 이에 한정되지 않는다.
상기 치료용 조성물은 사람을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당해 분야 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 치료용 조성물은 일반적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화 할 수 있다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명로 표시되는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘, 탈크 등의 윤활제가 부가될 수 있다.
경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 포함될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등의 부형제가 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함될 수 있으며, 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 치료용 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏당 0.1 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 히알루론산 및 콜레스테롤의 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클및 siRNA 전달용 조성물은 각종 분해효소와 같은 외부공격으로부터 siRNA의 안정성을 확보할 수 있고, siRNA를 효과적으로 세포 및 생체 조직에 전달하여 타겟 유전자를 사일런싱(silencing)할 수 있으므로 siRNA 치료제, 세포기반 약물 스크리닝 조성물 및 연구용 siRNA 전달체로 효과적으로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 siRNA 전달용 조성물의 구성성분을 모식화한 것으로서, 히알루론산(HA) 및 콜레스테롤(Chol) 콘쥬게이트로부터 형성되는 나노파티클 내부에 RNA 결합 2b 단백질 및 siRNA의 복합체를 위치시키는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트의 합성과정을 나타낸 것으로, 1H NMR 분석결과를 포함한다.
도 3은 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트의 물리화학적 특성을 나타낸 것이다(a: 서로 다른 콜레스테롤 함량(degree of substitution, DS)을 지닌 히알루론산-콜레스테롤 (HA-Chol) 콘쥬게이트, b: 콜레스테롤 함량 (히알루론산 100개 당 잔기마다 결합되어 있는 콜레스테롤 개수, c: 분자량, d: dynamic light scattering으로 측정된 나노파티클의 사이즈, e: 나노파티클의 표면전하, f: 나노파티클의 수용액상에서의 polydispersity index).
도 4는 동적광산란법(dynamic light scattering, DLS)으로 측정된 HA-Chol24 나노파티클의 크기 분포를 나타낸 것으로, 네모박스 안에 TEM이미지를 나타내었다.
도 5는 시간에 따른 3종류의 HA-Chol 나노파티클(HA-Chol3, HA-Chol13, HA-Chol24)의 사이즈 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 3종류의 HA-Chol 나노파티클(HA-Chol3, HA-Chol13, HA-Chol24)에 대하여 피렌 들뜸 스펙트럼(pyrene excitation spectrum)으로부터 측정된 임계회합농도(critical aggregation concentration)을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 2b 단백질과 siRNA의 결합비율을 확인하기 위해서 2b 단백질의 농도에 따라 결합하는 siRNA의 양을 정량분석한 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 히알루론산 및 콜레스테롤 나노파티클에 봉입된 2b 단백질 및 siRNA 복합체의 반응시간에 따른 결합효율을 나타낸 것이다.
도 9는 나노파티클/2b 단백질/siRNA 복합체를 히알루로니다제(hyaluronidase) 분해효소 처리를 한 후 해리된 siRNA의 양을 시간별로 나타낸 것이다.
도 10은 30% FBS(fatal bovine serum) 조건 하에서 naked siRNA와 siRNA 전달용 나노파티클에 결합되어 있는 siRNA의 안정성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 siRNA 전달용 나노파티클에 결합되어 있는 siRNA가 pH가 감소할수록 해리되는 것을 보여주는 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 2b 단백질에 결합되어 있는 siRNA가 pH가 감소할수록 해리되는 것을 보여주는 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 MTT 분석를 통하여 본 발명의 나노파티클/2b 단밸질/siRNA 복합체의 농도에 따른 세포 독성 및 생체적합성을 시험한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 마우스 대식세포를 이용하여 TNF-α 분석을 통해 본 발명의 나노파티클/2b 단밸질/siRNA 복합체의 선천성 면역반응(innate immune response)을 분석한 것을 나타낸 것이다.
도 15는 형광체 Cy5.5와 FITC로 각각 표지된 Cy5.5-HA-Chol 나노파티클/2b 단백질/FITC-siRNA 복합체가 B16F10 암세포에 세포 투과되는 것을 보여주는 형광현미경 분석결과를 나타낸 것이다.
도 16은 저해제인 클로르프로마진(chlorpromazine), 아밀로라이드(amiloride), 필리핀 III(filipin III) 및 사이토칼라신 D(cytochalasin D)를 각각 처리하였을 때, 세포 투과가 감소되는 것을 FACS 분석을 통해서 나타낸 것이다.
도 17은 HA-Chol 나노파티클/2b 단백질/siRNA 복합체를 형광단백질 RFP가 발현되는 암세포 (RFP/B16F10)에 처리한 후, 형광현미경을 이용하여 RFP 형광세기의 정량분석 결과 및 시간에 따른 유전자 발현 억제 효과를 분석한 결과를 나타낸 것이다(Control; RFG 유전자가 발현되는 B16F10 암세포, HA-Chol/2b/siRNA; HA-Chol 나노파티클/2b 단백질/siRNA 복합체을 이용하여 siRNA를 세포에 주입, HA-Chol/2b/sc siRNA; RFP 유전자에 매칭하지 않는 scramble siRNA를 siRNA 전달용 나노파티클에 봉입하여 세포에 주입, LF/siRNA; 기존 siRNA 전달체인 리포펙타민 사용, HA-Chol; siRNA 없이 siRNA 전달용 나노파티클만을 주입).
도 18은 HA-Chol 나노파티클/2b 단백질/siRNA 복합체를 형광단백질 RFP가 발현되는 암세포 (RFP/B16F10)에 처리한 후, RT-PCR을 수행하여 RFP 유전자의 mRNA가 siRNA에 의하여 분해되었음을 확인한 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 HA-Chol 나노파티클/2b 단백질/siRNA 복합체를 형광단백질 RFP가 발현되는 암세포 (RFP/B16F10)에 처리한 후, 웨스턴블롯(western blot)을 수행하여 RFP 유전자의 mRNA가 siRNA에 의하여 분해되어 RFP 단백질의 발현이 감소되었음을 나타낸 것이다.
도 20은 HA-Chol 나노파티클/2b 단백질/siRNA 복합체를 형광단백질 RFP가 발현되는 암세포 (RFP/B16F10)에 처리한 후, Flow cytometry를 이용하여 형광단백질 RFP의 유전자 발현이 대조군에 비하여 감소된 것을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클 및 2b 단백질의 제조
1-1. siRNA 전달용 나노파티클과 2b 단백질의 디자인
본 발명자들은 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클, 2b 단백질로 구성된 siRNA 전달체를 도 1과 같이 디자인하였다. 우선 RNA 결합 2b 단백질을 구성하는 아미노산 서열 1을 결정하였다.
서열번호 1;
MASIEIPLHEIIRKLERMNQKKQAQRKRHKLNRKERGHKSPSEQRRSELWHARQVELSAINSDNSSDEGTTLCRFDTFGSKSDAICDRSDWCLDQ
서열번호 1은 토마토 아스퍼미 바이러스(tomato aspermy virus)에서 유래한 RNA 결합 2b 단백질과 같으며 도 1에 나타난 바와 같은 3차원 구조를 가지게 되었으며, 상기 RNA 결합 2b 단백질은 2개의 단백질이 호모다이머(homodimer)를 형성하여 하나의 siRNA duplex를 결합할 수 있다.
히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클은 양친매성 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트를 제조한 후 수용액상에서 자가조립현상에 의하여 형성되는 나노파티클을 이용하는 것으로 히알루론산을 콜레스테롤 분자로 화학개질함으로써 제조할 수 있다.
1-2. 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트의 제조
도 2에서 보여지는 것과 같이, 본 발명자들은 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클을 제조하기 위하여 우선, 250 mmol 에틸렌다이아민(ethylenediamine) 16.7mL을 150 mL toluene 용매에 녹인 후 5 mmol 콜레스테릴 클로로포르메이트 (cholesteryl chloroformate) 2.25 g이 녹아있는 50 mL toluene 용액을 한 방울씩 첨가하여 16시간동안 상온에서 반응시켰다. 증류수로 반응물을 세척한 후 진공상태에서 용매를 제거하고 생성된 파우더를 100 mL의 다이클로로메탄 (dichloromethane/emthanol, v/v=1/1)용매에 다시 녹이고 비스카바메이트(biscarbamate)를 제거하기 위하여 시린지필터(syringe filter, PTFE, MWCO: 1 μm, Whatman, Piscataway, NJ)를 사용하였다. 걸러진 용액은 진공 건조한 후 하얀색 분말인 콜레스테릴 아민 콘쥬게이트(cholesteryl amine conjugate)를 약 750 mg 얻어냈다. 1H-NMR (Unit Plus 600, Varian) 분석을 통해 에틸렌 그룹(ethylene group, (δ=2.82 ppm [2H, -CH2NH2], δ= 3.22 ppm [2H, -NHCH2-]))에서 유래된 피크로부터 콜레스테릴 아민 콘쥬게이트 (cholesteryl amine conjugate)의 형성을 확인하였다(도 2).
EDC cross linker (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 23.4 내지 93.5 mg과 sulfo-NHS(sulfo - N-Hydroxysuccinimide, C4H5NO3) 26.4 내지 106.0 mg을 녹인 증류수 10 mL에 244 μmol 소듐하이알루로네이트(sodium hyaluronate, Mw. 234 kDa) 100 mg을 녹인 후, 상기 제조한 콜레스테릴 아민 콘쥬게이트 (cholesteryl amine conjugate (5.35 mg - 21.4 mg, 12.2 μmol - 48.8 μmol))가 녹아있는 10 mL THF 용액을 천천히 첨가하였고 6시간동안 반응시켰다. 반응용액은 과량의 증류수/THF (V/V=1/1)용매에 대하여 2일 동안 투석하고 나서 1일동안 증류수에 대하여 투석하였다. 진공건조를 통한 후 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트가 하얀 분말로 얻어졌으며 1H-NMR 분석을 이용하여 히알루론산의 아세틸그룹(N-acetyl group (δ= 2.01 ppm, [3H, -COCH3]))과 콜레스테롤의 메탄그룹(methane group, (δ= 5.37 ppm [1H, -CH=C])) 사이의 특징적인 피크의 적분값으로부터 콜레스테롤의 함량을 확인하였다 (도 2).
본 발명자들은 히알루론산과 콜레스테릴 아민 콘쥬게이트(cholesteryl amine conjugate)의 반응시, 콜레스테릴 아민 콘쥬게이트(cholesteryl amine conjugate)의 혼합양을 조절함으로써 콜레스테롤의 함량을 조절하였다.
히알루론산의 100개 당 잔기마다 콜레스테롤이 각각 2.6개, 12.7개, 24개가 결합된 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트를 제조하였으며(도 3), 각각 HA-Chol3, HA-Chol13, HA-Chol24 라고 명명하였다.
1-3. 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트의 물리화학적 물성 테스트
도 3에서 보여지는 것과 같이, 콜레스테롤 함량이 각각 2.6%, 12.7%, 24%와 같이 서로 다른 세 종류의 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트는 수용액상에서 나노파티클이 형성되는 것을 동적광산란법(dynamic light scattering, DLS)을 이용하여 확인하였으며 이 때 측정된 나노파티클의 직경은 HA-Chol3 나노파티클은 410 nm, HA-Chol13 나노파티클은 268 nm, HA-Chol24 나노파티클은 190 nm임을 확인하였다. 또한 증류수에서의 나노파티클의 표면전하는 HA-Chol3 나노파티클 = -64.3 mV, HA-Chol13 나노파티클 = -54.7 mV, HA-Chol24 나노파티클 = -45.1 mV이었다. HA-Chol24 나노파티클의 동적광산란법(dynamic light scattering, DLS) 측정시 나노파티클 사이즈 분포도와 전자현미경사진 (TEM)에서 나노파티클의 형태는 구형이었다(도 4).
나노파티클의 표면은 음전하를 띄고 있는 히알루론산으로 덮여있으며 이러한 음전하를 띄고 있는 표면은 수용액 상에서의 안정성을 제공할 수 있는지 알아보기 위하여 PBS 버퍼 조건에서 6일간 나노파티클의 사이즈를 측정하였으며, 그 결과 나노파티클의 사이즈는 거의 변화가 없었다 (도 5). 이러한 결과는 나노파티클이 수용액상에서 파티클간의 상호작용에 의해 침전이 되는 현상이 일어나지 않으며 매우 안정적인 구조체를 유지하고 있음을 나타내는 것이다.
또한, 피렌(pyrene)을 프로브로 사용하여 상기 실시예 1-2에서 제조한 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클의 임계회합농도(critical aggregation concentration, CAC)를 측정하였다. 1.0 x 10-3 mg/mL 내지 1.0 mg/mL 사이의 농도범위에서 12개의 서로 다른 농도의 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트 샘플에 피렌(pyrene)을 첨가하여 390 nm 파장에서 들뜨게하여 방출스펙트럼으로부터 형광 강도 비율 (I338/I333)를 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트 농도에 대하여 플롯(plot)하였다(도 6).
도 6은 형광강도 비율 (I338/I333)을 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트 농도에 대하여 플롯(plot)하였을 때, 농도가 증가할수록 형광 방출스펙트럼의 적색이동(red shift)이 발견되었으며, 이로부터 피렌(pyrene) 분자가 물 환경에서 수소성의 미쉘(micelle) 환경으로 전이되었다는 것을 알 수 있었다. 이 때 형광강도 비율 (I338/I333)에서의 급격한 변화점이 임계회합농도(critical aggregation concentration, CAC)값에 해당되며, CAC 값은 HA-Chol3 conjugate = 0.15 mg/mL, HA-Chol13 conjugate = 0.025 mg/mL, HA-Chol24 conjugate = 0.006 mg/mL임을 나타낸 것이다. 이는 CAC 값 이상의 농도에서 나노파티클을 형성한다는 것을 나타내며 콜레스테롤의 함량이 높을수록 낮은 농도에서 나노파티클 형성이 가능하다는 것을 나타낸다.
1-4. 대장균을 이용한 RNA 결합 2b 단백질의 대량 생산 및 정제
상기 실시예 1-1에서 디자인된 RNA 결합 2b 단백질을 제조하기 위하여, 먼저 2b 단백질을 코딩하는 유전자를 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다.
서열번호 2: 5' - CATATGGCAAGCATCGAGATCCCT - 3’
서열번호 3: 5’- CTCGAGGCATTGATCGAGACA -3’
상기 PCR 증폭은 각각 변성 단계 95℃/30초, 어닐링 단계 60℃/30초 및 신장 단계 72℃/ 2분의 조건으로 30 사이클 실시하였고, RNA 결합 2b 단백질 (서열번호 1)의 유전자 컨스트럭(construct)을 얻을 수 있었다.
이 때 증폭된 유전자는 NdeI, XhoI 제한 효소자리를 포함하고 있으므로 제한효소를 처리한 후 정제하였다. 마찬가지로 pET22a 벡터(NEB Inc.)도 동일한 제한효소로 처리한 후 정제하였으며 상기 재조합 유전자를 T4 DNA ligase를 이용하여 삽입한 후 수용세포(competent cell)에 Hanahan method(Hanahan, D. (1983) Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids J. Mol . Biol . 166, 557-77)를 사용하여 형질전환하고 콜로니 PCR 방법(Sheu DS, Wang YT, Lee CY. Rapid detection of polyhydroxyalkanoate-accumulating bacteria isolated from the environment by colony PCR. Microbiology . 2000, 146, 2019-25)으로 유전자삽입을 확인한 후 최종적으로 DNA 시퀀싱을 통하여 서열을 확인하였다.
유전자가 삽입된 발현벡터를 BL21(DE3) 숙주세포(Novagen)에 형질전환을 시킨 후, LB 배지(Sigma-Aldrich)에서 37℃에서 키운 후 OD600 값이 0.5에 도달하면 IPTG(Isopropyl β-D thiogalactoside) 1mM을 이용하여 발현을 유도하였다. 이 후 37 ℃에서 6시간을 더 배양한 후 세포를 수거하고 용해 버퍼(50mM Tris-HCl, 8.0, 100mM NaCl, 1mM PMSF(phenylmethylsulfanylfluoride))를 이용하여 세포를 파괴한 후 용해된 부분만을 정제에 이용하였다.
발현 벡터의 특징상 2b 단백질의 C-말단에 히스티딘-태그가 위치하는 것을 이용하여 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용한 정제방법을 사용하였다. 친화성 크로마토그래피는 Ni-NTA 컬럼(GE healthcare)을 사용하였으며 A 버퍼(50mM Tris-HCl, 8.0, 100mM NaCl)로 컬럼 준비와 단백질 로딩 후 세척하였다. 이후 B 버퍼(50mM Tris-HCl, 8.0, 100mM NaCl, 500mM Immidazole)로 컬럼에 붙어있는 단백질을 용출시킨 후 전기영동을 하여 순도를 확인하였다. 정제 후 약 1mg/mL 단백질의 농도로 농축하였으며, 50 mM PBS(pH7.4)를 이용하여 보관하였다.
실시예 2. siRNA 전달용 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클의 siRNA 결합력 조사
상기 실시예 1-2에서 제조한 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클의 내부에 siRNA를 봉입하여 siRNA 결합력을 조사하였다. 본 실험에서는 RFP(Red Fluorescent Protein) 유전자를 타겟으로 하는 siRNA를 사용하였으며, 사용한 siRNA의 염기 서열은 다음과 같다:
센스 가닥: 5’-UGUAGAUGGACUUGAACUCdTdT-3’ (서열번호 4)
안티센스 가닥: 5’-GAGUUCAAGUCCAUCUACAdTdT-3’(서열번호 5)
먼저, 상기 RNA 결합 2b 단백질에 결합하는 siRNA의 몰비(mole ration)를 결정하기 위하여, free siRNA의 농도를 고정한 상태에서 상기 siRNA 전달용 재조합 단백질의 농도를 증가시키면서 siRNA 결합량을 전기영동으로 분석하였다(도 7).
도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 RNA 결합 2b 단백질의 농도가 높아질수록 결합에 참여하지 못하는 siRNA의 양이 감소하면서 상기 RNA 결합 2b 단백질에 결합되어 겔이동(gel shift)을 보여주는 밴드의 두께가 증가하였으며, 정량적 분석을 통해서 두 개의 2b 단백질 당 결합되는 siRNA의 개수는 하나임을 확인할 수 있었다.
다음으로 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클의 내부에 2b 단백질/siRNA 복합체를 봉입하여 siRNA 결합력을 조사하였다. 도 3에서 보여주는 것과 같이 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클은 음전하를 띠고 있으므로 siRNA를 봉입할 수 없으나, 2b 단백질이 siRNA에 결합할 경우 siRNA의 음전하를 중성화함으로써 도 1에서 디자인한 것처럼 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클이 2b 단백질/siRNA 복합체를 결합할 수 있다.
또한, 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클과 2b 단백질/FITC-siRNA 복합체를 표시된 시간동안 혼합반응시킨 후 원심분리 (13000 rmp, 30분)을 하여 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클/2b 단백질/FITC-siRNA 복합체는 침전으로 튜브 바닥에 모이고 나노파티클에 결합하지 못한 2b 단백질/siRNA 복합체는 상층액에 모이는 것을 관찰하였다. 바닥에 침전된 형광표지된 FITC-siRNA의 형광세기를 측정함으로써 나노파티클에 결합한 siRNA와 상층액에 존재하는 siRNA를 정량화하였으며(도 8), 아래와 같이 식으로 나타내었다.
siRNA의 봉입효율 (%) = (나노파티클에 존재하는 siRNA의 양)
Figure 112013081919994-pat00001
Figure 112013081919994-pat00002
(히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클의 양 + 2b 단백질의 양) * 100
혼합반응 1시간 후에는 HA-Chol3, HA-Chol13, HA-Chol24 모두에서 HA-Chol/2b/siRNA 복합체에 존재하는 siRNA의 봉입효율은 약 7%로 측정되었으며 혼합반응시간이 경과함에 따라 천천히 봉입효율이 증가함을 보여주었다. 24시간 혼합반응시간 경과 후에 세 종류의 HA-Chol 나노파티클에서는 약 11%의 siRNA 봉입효율을 관찰할 수 있었다.
하지만 2b 단백질이 없는 경우에는, 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클이 siRNA과 결합하지 않았으며 (도 8), 이러한 결과는 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클에 siRNA를 봉입하는 주요한 상호작용 힘은 2b 단백질과 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클 간의 소수성 상호작용 (hydrophobic interaction)임을 나타내는 것이다.
또한, 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클/2b 단백질/siRNA 복합체에서 siRNA가 표면에 결합되어 있는지, 아니면 나노파티클의 내부에 결합되어 있는지 조사하기 위하여 히알루론산을 분해하는 히알루로니다제 (hyaluronidase)를 처리하고 이 때 해리되는 siRNA의 양을 시간별로 정량하였다 (도 9). FITC-siRNA를 이용하여 형광세기를 측정함으로써 siRNA의 양을 정량하였다. 반응시간에 따라 해리되는 siRNA의 양은 점점 증가하였으며 24시간 반응 후에 해리되는 siRNA의 양은 약 45%로 관찰되었다. 이러한 결과는 봉입된 siRNA가 나노파티클의 표면에 단순히 결합된 것이 아니라 나노파티클의 내부에 깊숙이 위치하고 있다는 것을 나타내는 것이다.
실시예 3. siRNA 전달용 나노파티클에 봉입된 siRNA 의 생체안정성 조사
siRNA를 분해할 수 있는 각종 리보뉴클레아제들이 혼재해 있는 30% FBS (fatal bovine serum) 조건하에서 naked siRNA와 상기 실시예 1-1에서 제조된 siRNA 전달용 나노파티클에 봉입된 siRNA를 각각 실온에서 시간별로 방치한 후 전기영동을 통해 분해되는 정도를 비교하였으며, naked siRNA의 경우 30분 이내에서 완전히 분해되었으나 상기 siRNA 전달용 나노파티클에 봉입되어 보호를 받는 siRNA는 24시간까지 약 80%가 안정적이었으며 48시간까지 분해되지 않고 남아있는 siRNA는 약 50%임을 관찰할 수 있었다(도 10).
이러한 결과로부터 siRNA 전달용 나노파티클이 siRNA의 생체 안정성을 획기적으로 향상시키는 우수한 전달체임을 확인할 수 있으며, 이는 siRNA 전달용 나노파티클의 내부에 봉입된 siRNA는 물리적으로 외부환경으로부터 보호를 받음으로써, naked siRNA에 비해 각종 리보뉴클레아제(ribonuclease)에 의한 분해 저항성이 뛰어나다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 2b 단백질에 의한 siRNA 결합 또한 외부의 리보뉴클레아제 공격으로부터 siRNA를 보호하는 것을 알 수 있었다.
실시예 4. siRNA 전달용 나노파티클의 pH 에 따른 siRNA 결합력
siRNA 전달체는 엔도시토시스(endocytosis)에 의하여 세포 내 투과 후 세포질로의 방출을 위해서, 엔도솜(endosome)의 산성조건을 이용하여 엔도솜에서 세포질로의 방출 기전(endosomal escape)을 활용할 경우 매우 유리하므로, 이를 이용하여 상기 실시예 1-1에서 제조한 siRNA 전달용 나노파티클의 pH에 따른 siRNA 결합력을 측정하였다. pH 7.4 조건은 PBS 버퍼, pH 6.0 내지 5.0 조건은 50 mM 아세트산나트륨 버퍼를 사용하였고, 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클/2b 단백질/siRNA 복합체를 상온에서 10분간 각각의 해당되는 pH 조건에서 방치한 후 전기영동(200V, 100mA)을 이용하여 결합 정도를 분석하였다(도 11).
그 결과, 상기 siRNA 전달용 나노파티클은 중성 pH에서는 siRNA 결합력이 우수하였으나 점점 pH가 감소할수록 해리가 되었다. 보다 구체적으로는 pH 약 6.5에서부터 siRNA의 해리가 확인되었으며, pH 약 5.0에서는 대부분의 siRNA가 해리되었다. 또한, 2b 단백질의 pH에 따른 siRNA 결합력을 측정하였을 때, 2b 단백질은 중성 pH에서는 siRNA 결합력이 우수하였으나 점점 pH가 감소할수록 해리 되었다(도 12).
상기 결과들로부터, 약산성 환경에서 siRNA는 2b 단백질과의 결합력이 감소되어 해리가 가능하며 이 때 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클 내부의 음전하와 siRNA의 음전하가 정전기적 충돌을 일으켜서 최종적으로 siRNA가 나노파티클로부터 방출이 됨을 알 수 있었으며, 이로부터 siRNA 전달용 재조합 단백질이 세포 내 투과 후에 엔도솜(endosome)에서의 방출 기전(endosomal escape)에 의하여 세포질로 siRNA의 전달이 가능함을 확인하였다.
실시예 5. siRNA 전달용 재조합 단백질의 세포독성 실험
siRNA 전달용 나노파티클의 세포 내 생체적합성을 조사하기 MTT 분석을 수행하였다. 구체적으로, 기하급수적인 증가 단계(Exponential growth phase)에 있는 HeLa 세포를 96-웰 플레이트에서 웰당 20000개의 세포가 되도록 키운 후, 상기 실시예 1-1에서 제조한 siRNA 전달용 나노파티클/siRNA 복합체를 다양한 농도로 각 웰에 처리하고 24시간 동안 배양하였다. MTT 용액(0.5mg/mL)을 웰 당 200uL씩 첨가하여 4시간 동안 반응시킨 후 DMSO 200uL를 넣고 10분간 반응시키고 570nm 파장에서 ELISA를 이용하여 측정하였다(도 13).
상기 siRNA 전달용 나노파티클/siRNA 복합체은 100μg/mL까지 우수한 생체적합성을 보여주었으며, 바람직하게는 상기 siRNA 전달용 나노파티클/siRNA 복합체의 농도를 50 μg/mL 로 결정할 수 있었다. siRNA를 탑재하지 않은 나노파티클의 경우도 비슷한 생체적합성을 보여주었으나, 기존에 siRNA 전달체로 많이 활용되고 있는 양전하를 띠고 있는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI, 25 kDa, branched 형태)는 상대적으로 매우 낮은 농도인 5 μg/mL에서도 약 80%이상의 세포독성이 관찰되었다. 이러한 결과는 상기 siRNA 전달용 나노파티클이 기존의 siRNA 전달용 폴리머에 비해 매우 우수한 생체적합성을 가지고 있음을 나타내는 것이다.
siRNA는 선천성 면역반응(innate immune response)를 유도한다고 알려져 있다 (Judge AD., et al., Mol. Ther. 2006, 13, 494-505). 마우스 대식세포인 RAW264.7 세포에 대하여 상기 siRNA 전달용 나노파티클/siRNA 복합체를 처리한 후 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay)을 수행하여 유도된 TNF-α를 정량하였다. 대식세포를 96-웰 플레이트에 부착한 후 상기 siRNA 전달용 나노파티클/siRNA 복합체를 2시간 처리하고 분석키트를 사용하여 TNF-α를 정량하였으며, 기저수준(basal level background)이상의 TNF-α를 관찰할 수 없었다(도 14). 하지만 0.1 μg/mL의 지질다당(lipopolysaccharide, LPS)을 이용하여 대조군(control) 실험을 수행한 경우, 4시간과 24시간후의 TNF-α 양이 급속히 증가함을 관찰하였다. 마찬가지 방법으로 측정하였을 때 대조군의 PBS 버퍼, 히알루론산 및 콜레스테롤 콘쥬게이트를 포함하는 나노파티클, 2b 단백질/siRNA 복합체, 대표적 상업적 siRNA 전달체인 Lipofectamine/siRNA 복합체에서는 TNF-α의 증가를 관찰할 수 없었다. 이러한 결과는 상기 siRNA 전달용 나노파티클/siRNA 복합체가 선천성 면역반응(innate immune response)을 일으키지 않는다는 것을 나타내는 것이다.
실시예 6. siRNA 전달용 나노파티클의 세포투과 활성
마우스 골수종(myeloma) 세포주인 B16F10에 대한 세포투과 실험을 수행하였다. 구체적으로 형광현미경에서의 형광관찰을 용이하게 하기 위하여, 먼저 상기 실시예 1-1에서 제조된 siRNA 전달용 나노파티클 표면에 위치한 카르복실 잔기를 이용하여 Cy5.5 형광체를 결합시키고 FITC가 부착되어 있는 siRNA(Cy5.5-HA-Chol24/2b 단백질/FITC-siRNA 복합체)를 이용하였다. B16F10 세포에 상기 Cy5.5-HA-Chol24/2b 단백질/FITC-siRNA 복합체를 1시간 처리한 후 형광현미경을 이용하여 관찰하였다(도 15). 형광현미경으로는 Achroplan IR40 x/0.80W lens, Axiocam black and white CCD camera(Carl Zeiss)가 부착된 Axioskop2 FS plus imaging microscope (ZEISS)을 사용하였다. Cy5.5-HA-Chol24/2b 단백질/FITC-siRNA 복합체를 처리한 세포에서 세포질에서의 siRNA의 형광이미지와 나노파티클의 형광이미지가 중첩되었으며, 이러한 결과로부터 siRNA 전달용 나노파티클은 매우 효과적으로 siRNA를 세포질로 전달할 수 있음을 확인하였다(도 15).
엔도시토시스(endocytosis)에 의한 세포 투과를 확인하기 위하여 대표적 엔도시토시스 저해제인 chlorpromazine(Sigma, Ger), amiloride(Sigma, Ger), filipin III(Sigma, Ger) 및 cytochalasin D(Sigma, Ger)를 상기 siRNA 전달용 나노파티클/siRNA 복합체에 각각 처리하였으며, 유동세포계수법(flow cytometry) 분석을 통하여 감소된 세포투과력을 정량하였다(도 16). 이로부터 상기 siRNA 전달용 나노파티클/siRNA 복합체의 세포투과력이 현저히 감소됨을 통해, siRNA 전달용 재조합 단백질이 엔도시토시스에 의하여 세포투과됨을 확인할 수 있었다.
실시예 7. siRNA 전달용 나노파티클에 의한 세포 내 siRNA 전달 및 유전자 사일런싱( gene silencing ) 조사
siRNA 전달용 나노파티클을 전달체로 이용한 siRNA가 세포 내 유전자에 대하여 유전자 사일런싱(gene silencing)을 일으키는 효과를 기존의 siRNA 전달체인 리포펙타민(Invitrogen, USA)과 비교하였다. RFP 형광 단백질을 발현할 수 있는 B16F10 미엘로마 세포주에 동일한 양의 siRNA를 각각 리포펙타민과 상기 실시예 1-2에서 제조한 siRNA 전달용 나노파티클에 섞어 준 후 세포 처리하고 24 시간 후 형광현미경으로 관찰하였다(도 17).
siRNA를 처리하지 않은 대조군 세포는 RFP 형광단백질이 발현되어 강한 형광강도를 보였으나 상기 리포펙타민 및 siRNA 전달용 나노파티클로 처리한 siRNA는 세포에서 RFP 형광단백질의 발현을 억제함을 확인하였다. 또한, RFP 단백질-코딩 유전자와 매칭(matching)되지 않는 scramble siRNA를 상기 siRNA 전달용 재조합 단백질과 처리하였을 때는 유전자 사일런싱이 거의 관찰되지 않았다. 이러한 RFP 형광단백질의 유전자 사일런싱을 정량적으로 분석하였을 때 상기 리포펙타민을 처리한 siRNA는 약 70%, 상기 siRNA 전달용 재조합 단백질을 처리한 siRNA는 약 70%의 유전자 발현억제를 보여줌을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 RT-PCR을 이용하여 세포 내의 RFP mRNA의 양 분석을 통해 상기 siRNA 전달용 재조합 단백질의 siRNA 전달 효과를 확인하였다. 보다 구체적으로 RFP mRNA에 매칭될 수 있는 프라이머(정방향 프라이머 5’-GGCTGCTTCATCTACAAGGT-3’(서열번호 6) 및 역방향 프라이머 5’-GCGTCCACGTAGTAGTAGCC-3’(서열번호 7)) 및 대조군 실험을 위한 β-actin과 매칭되는 프라이머(정방향 프라이머 5’-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’ (서열번호 8) 및 역방향 프라이머 5’-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3’ (서열번호 9)를 이용하여 세포 내의 RFP 유전자의 mRNA의 양을 정량하기 위한 RT-PCR을 수행하였으며 (변성 단계 95℃/30초, 어닐링 단계 51℃/30초, 신장 단계 72℃/30초, 20 사이클), DNR’s GelQuant (image analysis) 프로그램을 이용하여 전기영동 후 각각의 밴드에 대해 정량하였다(도 18).
대조군과 비교시, 상기 리포펙타민과 함께 처리한 siRNA는 약 70%, 상기 siRNA 전달용 나노파티클과 함께 처리한 siRNA는 약 70%의 감소를 나타내었다.
또한, RFP 항체를 이용하여 유전자 발현 억제를 확인한 경우, RFP 형광단백질이 발현되는 대조군 세포와는 달리, 리포펙타민 또는 상기 siRNA 전달용 재조합 단백질를 이용하여 siRNA를 처리한 세포에서는 RFP 단백질의 검출이 현저히 감소하였다. RFP 단백질-코딩 유전자와 매칭(matching)되지 않는 scramble siRNA를 상기 siRNA 전달용 재조합 단백질과 처리하였을 때는 유전자 사일런싱이 거의 확인되지 않았다. 이를 통해 siRNA 전달용 재조합 단백질에 의한 세포 내로 전달된 siRNA 가 사일런싱(gene silencing)을 일으킴을 확인할 수 있었다(도 19 및 도 20).
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY KYUNGPOOK NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Hyaluronic acid-cholesterol nanoparticles for siRNA delivery and composition comprising the same <130> DPP20133945KR <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 95 <212> PRT <213> tomato aspermy virus 2b protein <400> 1 Met Ala Ser Ile Glu Ile Pro Leu His Glu Ile Ile Arg Lys Leu Glu 1 5 10 15 Arg Met Asn Gln Lys Lys Gln Ala Gln Arg Lys Arg His Lys Leu Asn 20 25 30 Arg Lys Glu Arg Gly His Lys Ser Pro Ser Glu Gln Arg Arg Ser Glu 35 40 45 Leu Trp His Ala Arg Gln Val Glu Leu Ser Ala Ile Asn Ser Asp Asn 50 55 60 Ser Ser Asp Glu Gly Thr Thr Leu Cys Arg Phe Asp Thr Phe Gly Ser 65 70 75 80 Lys Ser Asp Ala Ile Cys Asp Arg Ser Asp Trp Cys Leu Asp Gln 85 90 95 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for 2b primer <400> 2 catatggcaa gcatcgagat ccct 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for 2b protein <400> 3 ctcgaggcat tgatcgagac a 21 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RFP(red fluorescent protein) siRNA (sense) <400> 4 uguagaugga cuugaacuc 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RFP siRNA(antisense) <400> 5 gaguucaagu ccaucuaca 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RFP forward primer <400> 6 ggctgcttca tctacaaggt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RFP reverse primer <400> 7 gcgtccacgt agtagtagcc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward primer <400> 8 agagggaaat cgtgcgtgac 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse primer <400> 9 caatagtgat gacctggccg t 21

Claims (11)

  1. 히알루론산 및 아민기가 도입된 콜레스테롤과의 가교결합으로 형성된 콘쥬게이트를 포함하며, 소수성 상호작용으로 siRNA 및 siRNA 결합 단백질의 복합체를 내부에 봉입하여 siRNA를 전달하며,
    상기 siRNA 결합 단백질은 토마토 아스퍼미 바이러스(tomato aspermy virus)에서 유래한 RNA 결합 2b 단백질인,
    나노파티클.
  2. 제1항에 있어서, 상기 나노파티클은 직경이 150nm 내지 450nm인, 나노파티클.
  3. 제1항에 있어서, 상기 콘쥬게이트는 콜레스테롤의 함량이 콘쥬게이트 전체의 2중량% 내지 30중량%인, 나노파티클.
  4. 콜레스테롤 말단에 아민기를 도입하는 단계;
    가교제의 존재 하에서, 히알루론산 및 아민기가 도입된 콜레스테롤을 가교반응시켜 콘쥬게이트를 제조하는 단계; 및
    상기 콘쥬게이트를 수용액 내에서 자가조립시키는 단계를 포함하는,
    제1항의 나노파티클을 제조하는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 나노파티클, 및
    소수성 상호작용으로 상기 나노파티클의 내부에 봉입되는, siRNA 및 siRNA 결합 단백질의 복합체를 포함하며,
    상기 siRNA 결합 단백질은 토마토 아스퍼미 바이러스(tomato aspermy virus)에서 유래한 RNA 결합 2b 단백질인,
    siRNA 전달용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 나노파티클은 직경이 150nm 내지 450nm인, siRNA 전달용 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 나노파티클에 포함된 콘쥬게이트는 콜레스테롤의 함량이 콘쥬게이트 전체의 2중량% 내지 30중량%인 것인, siRNA 전달용 조성물.
  8. 콜레스테롤 말단에 아민기를 도입하는 단계;
    가교제의 존재 하에서, 히알루론산 및 아민기가 도입된 콜레스테롤을 가교반응시켜 콘쥬게이트를 제조하는 단계;
    상기 콘쥬게이트를 수용액 내에서 자가조립하여 나노파티클을 제조하는 단계;
    siRNA 결합 단백질에 siRNA를 결합시켜 siRNA 결합 단백질 및 siRNA의 복합체를 제조하는 단계; 및
    상기 나노파티클 내부에 상기 siRNA 결합 단백질 및 siRNA의 복합체를 소수성 상호작용을 이용하여 봉입하는 단계를 포함하며,
    상기 siRNA 결합 단백질은 토마토 아스퍼미 바이러스(tomato aspermy virus)에서 유래한 RNA 결합 2b 단백질인,
    제5항의 siRNA 전달용 조성물을 제조하는 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제8항에 있어서, 상기 토마토 아스퍼미스 바이러스의 2b 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 제조방법.
KR1020130107541A 2013-09-06 2013-09-06 ｓｉＲＮＡ 전달을 위한 히알루론산-콜레스테롤 나노파티클 및 이를 포함하는 조성물 KR101579879B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130107541A KR101579879B1 (ko) 2013-09-06 2013-09-06 ｓｉＲＮＡ 전달을 위한 히알루론산-콜레스테롤 나노파티클 및 이를 포함하는 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130107541A KR101579879B1 (ko) 2013-09-06 2013-09-06 ｓｉＲＮＡ 전달을 위한 히알루론산-콜레스테롤 나노파티클 및 이를 포함하는 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150028644A KR20150028644A (ko) 2015-03-16
KR101579879B1 true KR101579879B1 (ko) 2015-12-23

Family

ID=53023471

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020130107541A KR101579879B1 (ko) 2013-09-06 2013-09-06 ｓｉＲＮＡ 전달을 위한 히알루론산-콜레스테롤 나노파티클 및 이를 포함하는 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101579879B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11529388B2 (en) 2019-05-10 2022-12-20 University Of South Florida Peptide-polynucleotide-hyaluronic acid nanoparticles and methods for polynucleotide transfection

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230008627A (ko) * 2021-07-07 2023-01-16 주식회사 제넥신 히알루론산-지질 유도체, 이를 포함하는 지질나노입자 및 그 용도
CN116284759A (zh) * 2022-11-29 2023-06-23 深圳先进技术研究院 一种聚多肽基因载体及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
[논문1] THER DELIV. (2012)*

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11529388B2 (en) 2019-05-10 2022-12-20 University Of South Florida Peptide-polynucleotide-hyaluronic acid nanoparticles and methods for polynucleotide transfection

Also Published As

Publication number Publication date
KR20150028644A (ko) 2015-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102052225B1 (ko) 관능성 pla-peg 공중합체, 그의 나노입자, 그의 제조법, 및 표적화 약물 전달 및 영상화를 위한 용도
Zhou et al. The role of cell‐penetrating peptides in potential anti‐cancer therapy
Ye et al. High-yield synthesis of monomeric LMWP (CPP)-siRNA covalent conjugate for effective cytosolic delivery of siRNA
JP2011523353A5 (ko)
JP2011523353A (ja) 細胞透過のための過剰に荷電されたタンパク質
US11904057B2 (en) Nanoparticle-hydrogel composite for nucleic acid molecule delivery
US20220177494A1 (en) pH-RESPONSIVE SILICA METAL ORGANIC FRAMEWORK NANOPARTICLES FOR DELIVERY OF BIOACTIVE MOLECULES
KR101734308B1 (ko) siRNA 표적-특이적 전달을 위한 RNA/DNA 나노입자 및 이를 포함하는 전달체
Barattin et al. pH-controlled liposomes for enhanced cell penetration in tumor environment
JP2007145761A (ja) 細胞膜透過性ペプチド修飾多糖−コレステロールまたは多糖−脂質非ウイルス性ベクターおよびその製造方法
WO2012137036A1 (en) Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
WO2021134023A2 (en) Compositions and methods for nucleic acid delivery
KR101579879B1 (ko) ｓｉＲＮＡ 전달을 위한 히알루론산-콜레스테롤 나노파티클 및 이를 포함하는 조성물
EP3821016A1 (en) Protein-based micelles for the delivery of hydrophobic active compounds
KR101559974B1 (ko) ｓｉＲＮＡ 전달을 위한 재조합 단백질 및 이를 포함하는 조성물
EP3302531B1 (en) Immune tolerant and non-immune tolerant elastin-like recombinant peptides and methods of use
EP3755379A1 (en) Polyplex delivery system for proteins, nucleic acids and protein/nucleic acid complexes
CN111714468A (zh) 一种siNRA递送系统复合物及其制备方法和用途
KR101430232B1 (ko) ｓｉＲＮＡ 전달을 위한 ｐ19-ＹＳＡ 재조합 단백질 및 이를 포함하는 조성물
KR102274876B1 (ko) 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도
KR101448800B1 (ko) 핵산 전달 복합체
KR102013908B1 (ko) 변형 지방산 인지질 및 양이온성 폴리펩티드 컨쥬게이트를 포함하는 핵산 전달용 조성물
Tuttolomondo Design of Novel DMBT1-derived CPP-siRNA Nanocomplexes and Two-step purification of the Human Recombinant Protein DMBT1
Fan et al. In Situ Assembly of Melittin-PHA Microspheres for Enhancing Therapeutic Efficacy in Cancer Treatment
KR20230006405A (ko) 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181203

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191203

Year of fee payment: 5