KR102052225B1 - 관능성 pla-peg 공중합체, 그의 나노입자, 그의 제조법, 및 표적화 약물 전달 및 영상화를 위한 용도 - Google Patents

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Abstract

관능성 PLA-PEG 공중합체, 그의 나노입자, 그의 제조법, 및 표적화 약물 전달 및 영상화를 위한 용도. 본 발명은 공중합체를 함유하는 신규 관능성 PEG-PLA, 그를 함유하는 나노입자, 그의 제조 방법, 및 부위 특이적 표적화 약물 전달 및 영상화를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
<화학식 A>

Description

관능성 PLA-PEG 공중합체, 그의 나노입자, 그의 제조법, 및 표적화 약물 전달 및 영상화를 위한 용도 {FUNCTIONAL PLA-PEG COPOLYMERS, THE NANOPARTICLES THEREOF, THEIR PREPARATION AND USE FOR TARGETED DRUG DELIVERY AND IMAGING}
본 발명은 표적화 약물 전달 및 영상화 분야, 특히 약물의 폴리(에틸렌 글리콜)-폴리(락트산) (PEG-PLA) 나노입자 내로의 비-공유 캡슐화 또는 접합에 의한 전달에 관한 것이다.
PLA-PEG 나노입자의 합성 및 약물 전달에서의 그의 적용은 문헌에 대부분 기재되어 있다. PLA-PEG 조성물에서, PLA (폴리(락트산))는 소수성이고, PEG는 친수성이다. PLA-PEG는 수성 매질 중에서 나노입자로 어셈블리되며, 여기서 PLA는 코어를 형성하고, PEG는 코로나를 형성한다. 정맥내 주사시, PLA-PEG 나노입자에서의 PEG 코로나는, 나노입자를 식세포작용으로부터 보호하고 ("스텔스(stealth) 효과"), 따라서 나노입자의 신속한 전신 클리어런스를 최소화하며, 이에 따라 그의 전신 반감기를 증가시키는 것으로 나타났다 (미국 특허 5,683,723은 폴리옥시에틸렌 및 폴리락트산 블록 공중합체를 기재로 하는 나노입자를 기재하고 있음). 더욱이, 이러한 나노입자는 이전에 기재된 "증진된 투과성 및 체류" (EPR) 효과에 의해 종양 내에 축적된다. 암 분야에서 특히, 화학요법의 강한 부작용으로 인해 종양 특이적 치료가 요망되고, 이와 관련하여, 중합체 나노입자가 유망한 약물 전달 시스템으로서 고려되어 왔다. PLA-PEG 나노입자에 혼입되는 경우에, 약물은 EPR 효과로 인해 종양 내에 장기간 체순환 및 잠재적으로 보다 높은 농도를 겪는다. 종양에 대해 증가된 특이성을 갖는 나노입자를 전달하기 위해, 귀소 디바이스를 사용하는 조직 표적화/축적 접근법이 사용될 수 있다 (문헌 [Pulkkinen et al. Eur J Pharm Biopharm 70 (2008) 66-74, Zhan et al. J Control Rel 143 (2010) 136-142, Farokhzad et al. Cancer Res 64 (2004) 7668-7672, Gao et al. Biomaterials 27 (2006) 3482-3490]).
따라서, 표적화 리간드로 추가로 관능화된 PLA-PEG 나노입자의 사용이 본 발명자들에 의해 연구되었다.
클릭 화학 (휘스겐(Huisgen) 커플링)의 사용은 다양한 중합체 나노입자 (문헌 [Lv et al. J Colloid Interface Sci. 356 (2011) 16-23, Jubeli et al. J Polym Sci Part A : Polym Chem. 48 (2010) 3178-3187, Lecomte et al. Macromol Rapid Commun. 29 (2008) 982-997]) 또는 금속성 나노입자 (문헌 [Hanson et al. US2010/0260676 A1, 2010])의 합성을 위해 문헌에 기재되어 있다.
클릭 화학은 이러한 접근법이 고수율을 생성하기 때문에 흥미로운 것이고, 반응 조건은 반응이 산소 및 물에 비감수성이기 때문에 취급하기 쉽고 확장가능하다. 이 반응의 배경기술은 널리 공지되어 있고, 소량의 촉매를 포함하고, 높은 커플링 수율을 생성한다.
최근에, 문헌 [Deshayes et al. (Pharm. Res. (2011), 28, 1631-1642)]은 클릭-화학에 의한 시클로펩티드 (표적화 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 특이적으로 결합하는 리간드로서 사용됨)의 폴리비닐리덴 플루오라이드-폴리(아크릴산) 나노입자에의 접합을 보고하였다. 클릭 화학은 PLA 및 PEG 중합체 둘 다를 함유하는 거대분자를 합성하기 위해 이미 고려된 바 있다. 문헌 [Tang et al. Macromolecules 2011, 44, 1491-1499]은 PEG-g-PLA-알키닐 중간체와 아지도 유도체 (폴리(아지도프로필-L-글루타메이트))의 커플링을 개시하고 있다. 추가로, 문헌 [Yu et al. Macromolecules, 2011, 44(12), 4793-4800]은 최근에 거대분자 PLA-g-파클리탁셀-PEG에 의해 제조된 나노입자를 기재하고 있으며, 여기서 파클리탁셀은 PLA 백본 및 PEG 측쇄를 가교시킨다. 그러나, 약물은 나노입자 내로 물리적으로 캡슐화되지 않고, 구조는 표적화 리간드를 포함하지 않는다. 문헌 [Lu et al. Bioconjugate Chem 2009, 20, 87-94]은 또한, 클릭 화학에 의해 제조되고 펩티드 (RGD = 아르기닌-글리신-아스파르테이트)가 세포 표적화를 위해 부착되어 있는, PLA 및 PEG를 함유하는 거대 분자를 기재하고 있다. 거대분자의 구조는 구조적으로 복잡한 중간체: 아지드 공중합체 (폴리(2-메틸-2-카르복시트리메틸렌-카르보네이트-코-D,L-락티드)-g-PEG-아지드) 및 알킨-개질된 KGRGDS 펩티드의 합성을 포함한다.
문헌 [Zhang et al. (Mol. Pharmaceutics 2012,9, 2228-2236)]은, 표면이 클릭 화학을 사용하여 리간드와 접합되고, 이에 따라 트리아졸 기에 직접 부착된 리간드를 생성하는, PLA 및 PEG를 함유하는 거대분자로 제조된 나노입자를 개시하고 있다. 문헌 [Xiao et al. (International Jounal of nanomedicine 5, 1, 2010, 1057-1065)]은 일반적으로 PEG-PLA 함유 나노입자에 관한 것이다. 문헌 [Arutselvan et al. (Chemical Communications 7, 2007, 695-697), WO 2011/046946, Steinmetz et al. (Journal of the American Chemical Society 131, 47, 2009, 17093-17095) 및 Adibekian et al. (Nature Chemical Biology 7, 2011, 469-479)]은 알킨-PEG 유도체를 개시하고 있다.
따라서, 부위 특이적 전달을 위해 목적하는 관능성 리간드가 클릭 화학을 사용하여 부착될 수 있는, 약물을 캡슐화할 수 있는 PEG-PLA 함유 나노입자의 간단한 제조 방법을 고안할 필요성이 있다.
따라서, 본 발명은, 클릭 화학에 의해 수득가능한, 링커를 통해 표적화 리간드에 공유 결합된 제조 용이한 PLA-PEG 쇄를 포함하는 PLA-PEG 나노입자의 제공에 관한 것이다.
본 발명에 따라서, 나노입자의 제조는, 임의의 관능성 알킨-리간드, 예를 들어 귀소 디바이스, 영상화제, 자극-반응성 작용제, 도킹제, 세포 침투 증진제, 해독제, 약물이 다목적 접근법에 의해 클릭 화학을 사용하여 커플링될 수 있는, 클릭가능한 공중합체 플랫폼로서 작용할 수 있는 PLA-PEG-아지드 화합물의 합성을 포함한다.
제1 목적에 따르면, 본 발명은 따라서 하기 화학식 A의 화합물에 관한 것이다.
<화학식 A>
Figure 112014090700241-pct00001
상기 식에서,
PLA는 폴리락트산 잔기를 나타내고;
PEG는 폴리에틸렌 글리콜 잔기를 나타내고;
링커 PEG'는 폴리에틸렌 글리콜 잔기이고;
리간드는 관능성 리간드 잔기이다.
본원에 사용된 용어 "잔기"는 그것이 유래한 분자에 따른 또는 그의 유도체의 2가 또는 1가 라디칼을 지칭한다.
상기 화학식 A에서, 하기 특정한 실시양태 또는 그의 조합 중 어느 하나가 고려될 수 있다:
- 한 실시양태에 따르면, PEG'는 하기 화학식을 갖는다.
Figure 112014090700241-pct00002
상기 식에서,
n'는 단위의 수이고 1 내지 10이고;
(1)은 -(CH2)-트리아졸 기에 대한 결합의 부착이고;
(2)는 리간드에 대한 결합의 부착이다.
- 한 실시양태에 따르면, PLA는 하기 화학식을 갖는다.
Figure 112014090700241-pct00003
상기 식에서,
(3)은 PEG 모이어티에 대한 결합의 부착이고;
m은 단위의 수이고 약 144 내지 72000의 분자량에 해당하는 1 내지 500이다. 추가 실시양태에서, m은 일반적으로 약 14400 내지 43200 g/mol의 몰 중량에 해당하는 100 내지 300이다.
- 한 실시양태에 따르면, PEG는 하기 화학식을 갖는다.
Figure 112014090700241-pct00004
상기 식에서,
(4)는 -PLA에 대한 결합의 부착이고;
(5)는
Figure 112014090700241-pct00005
의 질소 원자에 대한 결합의 부착이고;
n은 단위의 수이고 약 44 내지 13200 g/mol의 몰 중량에 해당하는 1 내지 300이다. 추가 실시양태에서, n은 약 880 내지 3080 g/mol의 몰 중량에 해당하는 20 내지 70이다.
PLA 및 PEG 사이의 결합 (PLA-PEG)은 PLA 모이어티의 말단 카르복실 기와 PEG 모이어티의 말단 히드록실 기 사이에서의 에스테르 결합으로 이루어진다.
PEG' 및 리간드 사이의 결합 (PEG'-리간드)은 나타내지는 않았지만, 그것은 리간드의 카르복실 기 및 PEG'의 말단 히드록시 기로부터 생성되는 아미노 기에 의해 형성된 아미드 결합으로 이루어진다.
한 실시양태에서, 리간드는 귀소 디바이스, 진단제, 영상화제, 자극감수성 작용제, 도킹제, 세포 침투제, 해독제, 약물의 잔기로부터 선택될 수 있다. 화학식 A의 화합물의 특정한 실시양태에서, 리간드는 아니스아미드, 폴산, 및 형광색소, 예컨대 FP-547로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 문맥에서:
- 할로겐 원자는 플루오린, 염소, 브로민 또는 아이오딘을 의미하는 것으로 이해되고;
- (C1-C6)알킬 기는, 1 내지 6개의 탄소 원자 (유리하게는 1 내지 4개의 탄소 원자)를 포함하고 선형 또는 분지형인 포화 지방족 기를 의미하는 것으로 이해된다. 예로서, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, tert-부틸, 펜틸, 헥실 등이 언급될 수 있다.
화학식 A의 화합물은 유리 염기 형태로 또는 산과의 부가염 형태로 제공될 수 있으며, 이는 또한 본 발명의 일부를 형성한다.
이들 염은 유리하게는 제약상 허용되는 산을 사용하여 제조되지만, 예를 들어 화학식 A의 화합물의 정제 또는 단리에 유용한 다른 산과의 염이 또한 본 발명의 일부를 형성한다.
화학식 A의 화합물은 나노입자를 형성할 수 있다. 따라서, 또 다른 목적에 따르면, 본 발명은 또한 화학식 A의 하나 이상의 동일하거나 상이한 화합물을 포함하는 나노입자에 관한 것이다.
본원에 사용된 표현 "동일하거나 상이한 화합물"은 상기 화합물이 그의 다양한 PEG, PLA, PEG', R, m, n 등의 정의에 따라 동일한 화학식을 갖거나 또는 별개의 화학식을 가질 수 있다는 것을 나타낸다.
상기 나노입자는 또한 하기 화학식 I'의 하나 이상의 동일하거나 상이한 화합물을 포함할 수 있다.
<화학식 I'>
Figure 112014090700241-pct00006
상기 식에서, PLA, PEG는 화학식 A에서와 같이 정의되고, R은 H 또는 C1-C6 알킬, 예컨대 메틸이다.
상기 나노입자는 임의로 약물을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "약물"은 그를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있는 치료 물질을 지칭한다. 관심 있는 임의의 적절한 약물 (특히 수불용성 약물)은 나노입자 내로 비-공유 캡슐화되고/거나 (임의로 링커를 통해) 나노입자에 공유 접합되어 신체 내로 전달될 수 있다.
약물은 특히 항생제, 항암제, 항바이러스제, 항염증제, 백신 항원 또는 식의약제일 수 있다.
특히, 약물은 세포독성제, 예컨대 탁소이드, 보다 특히 도세탁셀일 수 있다.
따라서 한 실시양태에서, 약물은 나노입자 내에 비-공유 캡슐화된다 (예컨대 물리적으로 캡슐화됨). 그의 또 다른 실시양태에서, 약물은, 특히 리간드가 약물인 경우에, 임의로 링커를 통해 나노입자에 공유 접합된다.
특정한 실시양태에서, 리간드가 약물이 아니면, 약물은 나노입자 내에 비-공유 캡슐화된다.
본원에 사용된 용어 "나노입자"는 10 nm 내지 900 nm의 평균 직경을 갖는 입자를 지칭한다. 추가 실시양태에서, 본 발명의 나노입자는 50 내지 300 nm의 평균 직경을 갖는다.
이들은 전형적으로 0.01 내지 0.4, 보다 구체적으로 0.1 내지 0.4의 다분산 지수 (PdI)를 나타내고, -30 내지 + 30 mV의 제타 전위를 갖는다.
양이온성 리간드의 경우에 제타 전위는 1 내지 30 mV일 수 있고, 음이온성 리간드의 경우에 -30 내지 -1 mV일 수 있다.
본 발명의 나노입자는 도 2-3에 예시된다.
본 발명에 따르면, 상기 나노입자는 임의로 상기 화학식 I'의 화합물의 존재 하에 화학식 A의 화합물의 나노침전 및/또는 임의로 이어지는 약물의 비-공유 캡슐화 또는 공유 접합에 의해 제조될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "나노침전"은 현탁액 중 나노입자 형태의 하나 이상의 화합물의 침전 또는 유화 및 크기 감소를 포함하는 방법을 지칭한다.
전형적으로, 상기 방법은 현탁액의 원심분리를 포함한다. 방법은 또한 하기로부터 선택된 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다:
- 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 아세톤, 에탄올, 테트라히드로푸란 등과 같은 적합한 용매 또는 용매의 혼합물 중에서 화학식 A 및 임의로 I'의 화합물의 유기 상을 제조하는 단계;
- 하나 이상의 안정화제, 예컨대 콜산나트륨, 폴리비닐 알콜 (PVA), 폴록사머, 인지질 등으로 임의로 안정화된 수성 상을 제조하는 단계;
- 유기 및 수성 상을 혼합하는 단계;
- (예를 들어, 초음파처리에 의한) 현탁액의 크기 감소 단계;
- 진공 하에 또는 공기 유동 하에, 예를 들어 증발에 의한 유기 상의 제거 단계;
- 수성 상의 원심분리, 특히 최대 50000 g의 초원심분리 단계;
- 나노입자를 수집하는 단계; 및/또는
- 수득된 나노입자를 수성 매질 중에 재현탁시키는 단계.
전형적으로, 본 발명의 나노입자는, 임의로 안정화제와 함께 사용함으로써 수성 상 내에 침전되는 유기 상으로서의 수혼화성 유기 용매 (예컨대 아세톤)를 사용함으로써, 또는 PVA 또는 폴록사머 또는 콜산나트륨을 안정화제로서 함유하는 수성 상과 혼합되는 유기 상으로서의 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트를 사용함으로써 수득된다. 나노입자를 제조하는데 사용하기 위한 적합한 폴록사머는 TM 플루로닉(Pluronic) 하에 입수가능하다. 적합한 폴록사머는 폴록사머 188 (플루로닉® F68 또는 루트롤(Lutrol)® F68 (바스프(BASF))로서 입수가능함)이다.
본 발명에 따르면, PLA-PEG-관능성 리간드로부터 제조된 나노입자는 인체 내로의 치료 물질 (약물)의 전달을 비롯한 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 나노입자는 약물을 추가로 포함한다. 이 경우에, 치료 물질은 나노입자 매트릭스 내로 비-공유 캡슐화되고 (물리적 캡슐화), 의도된 조직에 보다 잘 전달된다.
또 다른 실시양태에서, 약물은, 임의로 링커를 통해 화학식 A의 화합물에, 예를 들어 리간드 대신에 공유 접합될 수 있다. 공유 접합은 약물 전달 및 영상화 용도를 위해 생체내 담체에 대한 약물의 회합을 유지하는데 관심이 있을 수 있다.
다양한 화학식 A의 화합물을 다양한 리간드와 혼합함으로써, 다관능성 나노입자가 수득될 수 있다. 이들 다관능성 나노입자는 조합 적용에 사용될 수 있다 (도 3 참조).
본 발명에 따르면, 나노입자는, 임의로 약물 또는 상이한 약물 (조합 요법을 위해)의 존재 하에 화학식 A 및 임의로 I'의 하나 이상의 화합물을 나노침전시킴으로써 제조될 수 있다.
화학식 A의 화합물에서 또는 이것으로 제조된 나노입자에서, 본원에 사용된 표현 "관능성 리간드"는 약물의 인체 내로의 전달을 표적화하거나 추적할 수 있는 임의의 종류의 화합물, 또는 특히 부위-특이적인 약물 그 자체, 예컨대 수용체에 특이적으로 결합하는 약물을 지칭한다. 관능성 리간드는 특히 하기로부터 선택될 수 있다:
- 예를 들어, 나노입자 분포의 영상을 제공할 수 있는 표지를 제공하는 것을 통해, 세포, 조직, 동물 또는 환자에서 나노입자의 섭취 및 분포가 이어질 수 있는 화합물;
- 세포 사멸을 촉발하거나 또는 수용체, 효소 또는 유전자를 활성화 또는 억제하는 것과 같은 나노입자의 목적하는 최종 효과를 수행하는 약물을 포함하는 화학적 또는 생물학적 작용제;
- 에스트로겐 수용체 길항제, 안드로겐 수용체 길항제, 폴산, 아니스아미드, RGD 펩티드, 항체, 펩티드 표적화 유전자 벡터, 압타머 및 종양 괴사 인자와 같은 수용체 리간드.
관능성 리간드는 구상된 적용에 따라 귀소 디바이스, 영상화제, 자극-감수성 작용제 (감열제, pH-감수성 작용제, 감광제 등), 도킹제, 세포 침투 증진제, 해독제, 약물 등을 포함할 수 있다.
예를 들어, 특정한 세포/조직-유형을 인식하고 이에 결합하는 귀소 디바이스는 약물 로딩된 나노입자를 관심 있는 특정한 기관/질환에 걸린 조직에 표적화하는데 사용될 수 있고, 이는 또한 '부위-특이적 약물 표적화'로서 지칭될 수 있다. PLA-PEG-귀소 디바이스 나노입자는, 의도된 질환 부위에의 캡슐화 약물의 전달을 개선하고, 표적화 조직에서 국부 약물 농도를 증가시키고, 동시에 지속 약물 방출을 용이하게 하는 것으로 여겨진다. 이는 질환에 걸린 조직/세포의 약물에의 증진 및 연장된 노출을 유발할 수 있고, 따라서 개선된 치료 이익 및 감소된 부작용이 달성될 수 있다. 이러한 귀소 작용제는 특히 막 인식 리간드, 예컨대 아니스아미드 (시그마 수용체에 대한 친화도를 가짐), 폴산 (일부 종양 세포주의 표면 상에 과다발현된 폴레이트 수용체에 대한 친화도를 가짐), 상응하는 표면 항원을 인식할 수 있는 항체 (예컨대 HER2, 트랜스페린, 항-EGFR 항체 등), 종양 혈관신생 내피 상에 과다발현된 αvβ3 인테그린에 결합하는 RGD 서열, CD44 수용체에 결합하는 히알루론산, 트랜스페린 수용체에 결합하는 트랜스페린 등으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 예에서, 리간드는 또한 치료 또는 해독 전략을 위해 생물학적 유체 중에 가용성이거나 순환성인 생물학적 화합물 (예를 들어, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF))을 인식하고 결합하는 것을 포함한다.
PLA-PEG 나노입자 상에 커플링된 관능성 리간드가 영상화제/진단제인 경우에, 나노입자는 신체에서 질환 또는 결함의 영상화/진단에 사용될 수 있다. 이러한 영상화제/진단제는 특히 산화철, 가돌리늄 착물, 인도시아닌 그린, 근적외선 형광 프로브, 양전자 방출체 (예를 들어, 18F, 68Ga, 64Cu)로부터 선택될 수 있다.
관능성 리간드, 예컨대 자극-반응성 물질은, 근적외선 광에 의한 조사시 열과 같은 국부 자극-반응성 변화를 창출하는, 예를 들어, 외부 자장을 사용하여, PLA-PEG 나노입자를 의도된 부위로 안내하는데 사용된다. 이러한 자극-반응성 물질은 특히, 예를 들어 산화철 나노입자, 금 나노입자, 또는 임의의 방사선-활성화가능한 물질로부터 선택될 수 있다.
관능성 리간드, 예컨대 도킹제는 약물을 (예를 들어, 이온 쌍형성 원리에 의해) 도킹하여, 이를 분해로부터 보호하고, 이를 신체 내 적절한 위치에 전달하는데 사용될 수 있다. 예로서, 올리고뉴클레오티드의 비경구 경로에 의한 전달은 이들을 올리고펩티드-커플링된 PEG-PLA에 도킹함으로써 보다 효율적으로 될 수 있으며, 여기서 올리고펩티드는 올리고뉴클레오티드의 것과 반대인 전기 전하를 보유한다. 이러한 도킹제는 특히 올리고펩티드 (예를 들어, 폴리-리신, 폴리(류신-리신), 폴리(류신-리신-리신-류신))로부터 선택될 수 있다.
관능성 리간드, 예컨대 세포 침투 증진제는 나노입자 및 이에 따른 그의 캡슐화 약물 (이는 약물의 증진된 효능을 유도할 수 있음)의 세포 흡수를 개선하는데 사용될 수 있다. 이러한 세포 침투제는 특히 전사의 트랜스활성인자 (Transactivator of transcription: TAT) 서열, 페네트라틴, 폴리아르기닌 서열, VP22 단백질 서열 등으로부터 선택될 수 있다.
관능성 리간드, 예컨대 해독제는 체순환으로부터의 독성 물질의 제거에 사용될 수 있다. 이러한 해독제는 특히 다양한 물질, 예를 들어 킬레이트화제 (금속 해독용), 코발아민, 코빈아미드, 로다네제 효소 (시아나이드 해독용), 유기인 가수분해 효소 (유기인 해독용), 날록손, 아트로핀 (오피오이드 해독용), 특정한 독소를 인식하는 항체/항체 단편으로부터 선택될 수 있다.
따라서, 상기 언급된 리간드는 따라서 하기로부터 선택될 수 있다:
에스트로겐 수용체 길항제, 안드로겐 수용체 길항제, 폴산, 아니스아미드, 상응하는 표면 항원을 인식할 수 있는 항체, 예컨대 HER2, 트랜스페린 또는 항-EGFR 항체, 종양 혈관신생 내피 상에 과다발현된 αvβ3 인테그린에 결합하는 RGD 서열, CD44 수용체에 결합하는 히알루론산, 트랜스페린 수용체에 결합하는 트랜스페린, 펩티드 표적화 유전자 벡터, 압타머 및 종양 괴사 인자로부터 선택된 막 인식 리간드,
산화철, 가돌리늄 착물, 인도시아닌 그린, 근적외선 형광 프로브 또는 양전자 방출체 (예를 들어, 18F, 68Ga, 64Cu)로부터 선택된 진단제/영상화제,
산화철 나노입자, 금 나노입자, 또는 임의의 방사선-활성화가능한 물질로부터 선택된 자극 반응성 물질,
올리고펩티드 (예를 들어, 폴리-리신, 폴리(류신-리신), 폴리(류신-리신-리신-류신)로부터 선택된 도킹제,
전사의 트랜스활성인자 (TAT) 서열, 페네트라틴, 폴리아르기닌 서열 또는 VP22 단백질 서열로부터 선택된 세포 침투제,
코발아민, 코빈아미드, 로다네제 효소, 유기인 가수분해 효소, 날록손, 아트로핀, 또는 특정한 독소를 인식하는 항체/항체 단편으로부터 선택된 해독제; 또는
항생제, 항암제, 항바이러스제, 항염증제, 백신 항원 또는 식의약제로부터 선택된 약물.
또 다른 목적에 따르면, 본 발명은 또한 상기 화학식 A의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
화학식 A의 화합물의 상기 제조 방법은
- 하기 화학식 I의 화합물을
<화학식 I>
Figure 112014090700241-pct00007
- 하기 화학식 XI의 화합물과
<화학식 XI>
Figure 112014090700241-pct00008
(식 중, PLA, PEG, PEG' 및 리간드는 상기 화학식 A에서와 같이 정의됨)
커플링시키는 것을 포함한다.
커플링은 소위 "클릭 화학"에 의해 실시될 수 있다. 이 용어는 아지드 (N3) 화합물이 알킨 기와 반응하여 1,2,3-트리아졸을 형성하는 임의의 방법을 지칭한다.
클릭 화학 커플링 반응은, 특히 문헌 [Chem. Rev. 2008, 108, 2952-3015]에 개시된 조건을 참조하여 당업자에 의해 일반적으로 공지된 임의의 휘스겐 실험 절차를 적용하거나 채택함으로써 휘스겐 반응에 따라 수행될 수 있다. 일반적으로, 상기 클릭 화학 커플링 반응은 유기 또는 수성 조건에서 휘스겐 반응에 따라 수행된다.
화학식 I의 화합물은, 하기 정의된 바와 같은 화학식 I'의 화합물을 임의로 함유하는, 유기 용매 중 용액의 형태로 또는 수성 매질 중 나노입자의 형태로 존재할 수 있다.
유기 조건에서, 상기 클릭 화학 커플링 반응은 전형적으로 브로민화구리(I) (CuBr) 및 N,N,N',N',N"-펜타메틸디에틸렌트리아민 (PMDETA)의 존재 하에 수행된다 (문헌 [Chem. Rev. 2008, 108, 2952-3015]). 이 반응은, 특히 유기 용매, 예컨대 디메틸 포름아미드 (DMF), 테트라히드로푸란 (THF), 톨루엔, 디메틸술폭시드 (DMSO) 중에서, 실온 및 반응 혼합물의 환류 온도 사이에 포함되는 온도에서, 유리하게는 수성 조건에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 과량의 화학식 XI의 화합물이 사용된다.
수성 조건에서, 상기 클릭 화학 커플링 반응은 전형적으로 문헌 [Chem. Rev. 2008, 108, 2952-3015]에 따라, 특히 물 및 구리 유도체, 예컨대 CuSO4-5H2O의 존재 하에 수행된다. 촉매를 위한 환원제, 예컨대 아스코르브산나트륨의 존재가 유리할 수 있다. 일반적으로, 수성 조건은 화학식 I의 화합물이 특히 수성 현탁액 중에서 나노입자의 형태로 존재하는 경우에 사용된다.
클릭 반응에서, 화학식 I의 화합물을 포함하는 나노입자는 또한 하기 화학식 I'의 화합물을 포함할 수 있다.
<화학식 I'>
Figure 112014090700241-pct00009
상기 식에서, PLA 및 PEG는 화학식 A에서와 같이 정의되고, R은 H 또는 C1-C6 알킬, 예컨대 메틸이다.
R이 메틸인 화학식 I'의 화합물은 예를 들어 US 5,683,723에 개시되어 있다.
필요하다면, 나노입자 현탁액은 또한 안정화제, 예컨대 폴리비닐 알콜 (PVA), 플루로닉® (예를 들어, 플루로닉® F68) 또는 콜산나트륨을 포함할 수 있다.
화학식 A의 화합물의 제조에 포함되는 화학식 I의 화합물은 본 발명의 또 다른 특유한 목적이다.
따라서, 본 발명은 또한 하기 화학식 I의 화합물에 관한 것이다.
<화학식 I>
Figure 112014090700241-pct00010
상기 식에서, PLA 및 PEG는 화학식 A의 화합물에서와 같이 정의된다.
화학식 I의 화합물은 본 발명의 또 다른 목적인 나노입자를 형성할 수 있다.
상기 나노입자는 또한 상기 정의된 바와 같은 화학식 I'의 하나 이상의 동일하거나 상이한 화합물을 포함할 수 있다.
<화학식 I'>
Figure 112014090700241-pct00011
상기 나노입자는 도 1에 예시된다.
상기 나노입자는 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 하나 이상의 동일하거나 상이한 화합물을 임의로 화학식 I'의 하나 이상의 동일하거나 상이한 화합물의 존재 하에 나노침전시킴으로써 수득될 수 있다.
나노침전은 화학식 A의 하나 이상의 화합물을 포함하는 나노입자와 관련하여 상기 개시된 방법에 따라 수행될 수 있다.
화학식 A의 화합물을 포함하는 나노입자는 또한, 본 발명에 따르고 하기 기재된 화학식 I의 하나 이상의 화합물을 포함하는 나노입자를 상기 정의된 바와 같은 화학식 XI의 하나 이상의 화합물과 반응시키고, 임의로 이어서 약물을 비-공유 캡슐화시키거나 또는 공유 접합시키는 것에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 방법은 이것이 화학식 A의 화합물에 의해 형성된 나노입자의 관능성의 용이한 변경을 허용한다는 점에서 매우 다목적용이다.
본 발명의 방법은, 화학식 I의 화합물을 PLA-PEG 공중합체와 다양한 비로 혼합하여 아지드 기에 의해 관능화되지 않은 PLA-PEG 공중합체와 함께 화학식 I 또는 A의 화합물을 포함하는 나노입자를 제조하고 (도 1 참조), 이어서 상기 나노입자를 화학식 XI의 화합물과 반응시킴으로써 나노입자의 표면 상에 있는 리간드의 밀도를 목적하는 바와 같이 변경하거나 조절하는 가능성을 포함한다.
본 발명의 방법은 다양한 적용을 위해 다양한 PEG 및 PLA 쇄 길이를 사용하는 화학식 I 또는 A의 화합물의 사용을 허용한다 (도 2 참조). 예를 들어, 신체 구획에서 분해에 감수성인 치료 물질 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)을 단쇄 길이의 PEG를 함유하는 PLA-PEG에 도킹제 리간드를 통해 커플링시키고, 이어서 장쇄 PEG로 이루어진 PLA-PEG 공중합체와 혼합하여, 장쇄 PEG가 브러쉬형 표면을 형성하도록 할 수 있으며, 여기서 치료 물질은 차폐되어 이에 따라 체순환에서의 빠른 분해로부터 보호된다.
이외에도, 본 발명의 방법은 조합 적용을 위한 다관능성 나노입자의 형성을 위해 다양한 PLA-PEG-관능성 리간드 유형 (예를 들어, PLA-PEG-귀소 디바이스 + PLA-PEG-영상화제 + PLA-PEG-자극 반응성 물질)의 조합을 허용한다 (도 3 참조).
화학식 I의 화합물은, 이것이 임의의 알킨-관능성 리간드가 관능성 리간드의 유형에 따른 다양한 적용, 예컨대 약물 전달, 영상화, 해독 등을 위해 클릭 화학 (화학식 XI의 화합물에 의한)을 사용하여 커플링될 수 있는 클릭가능한 생분해성 공중합체 플랫폼으로서 작용하기 때문에 본 발명에 중추적이다. 따라서, 본 발명의 이점은 특히 비경구 경로에 의해 투여될 수 있는 다양한 관능성 리간드-커플링된 공중합체 나노입자를 합성하는 융통성을 포함한다. 또한, 나노입자 표면 상의 관능성 리간드 밀도는 화학식 I의 화합물 및 화학식 I'의 화합물을 적절한 비로 혼합함으로써 조정될 수 있다. 이외에도, 나노입자는 다양한 쇄 길이의 PEG 모이어티를 보유하도록 구축되어, 체순환에서 화학적으로 감수성인 치료 물질의 정맥내 전달을 용이하게 할 수 있다. 또한, 관능성 리간드의 커플링을 위한 클릭 반응은 리간드의 화학적 특성에 따라 나노입자 형성 이전에 또는 사전형성된 나노입자 상에서 수행될 수 있다.
추가 목적에 따르면, 본 발명은 또한,
하기 화학식 II의 화합물을
<화학식 II>
Figure 112014090700241-pct00012
(식 중, PEG는 화학식 A에서와 같이 정의되고, X는 아지드 (N3) 관능기 또는 할로겐, 예컨대 Br 원자를 나타냄)
하기 화학식의 락티드 화합물과
Figure 112014090700241-pct00013
반응시키고, 이어서 X가 할로겐 원자인 경우에, 수득된 하기 화학식 III의 화합물을
<화학식 III>
Figure 112014090700241-pct00014
(식 중, PLA 및 PEG는 화학식 A에서와 같이 정의되고, Hal은 할로겐 원자, 예컨대 Br을 나타냄)
NaN3과 반응시키는 단계
를 포함하는, 화학식 I의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
락티드와의 이러한 반응은 일반적으로 개환 중합 (ROP)에 의해 수행된다. 전형적으로, 이 반응은 Sn(Oct)2의 존재 하에 수행된다. 이것은 일반적으로 가열 하에 또는 고비점을 갖는 적합한 유기 용매, 예컨대 톨루엔 또는 크실렌 중에서 벌크로 수행될 수 있다.
일반적으로, 반응이 항상 완결 전에 중단될 수 있는 것으로 알려져 있기 때문에 락티드 화합물의 양은 화학식 I의 화합물에서 바람직한 n에 의존적이다. 전형적으로, PEG 거대개시제 및 촉매 Sn(Oct)2 사이의 몰비는 1 및 10 사이에 포함된다.
반응은 바람직하게는 무수 조건 하에 및/또는 실온 및 반응 혼합물의 환류 온도 사이에 포함된 온도에서 수행된다.
NaN3과의 반응은 일반적으로 비양성자성 유기 용매, 예컨대 DMF, 디메틸 아세트아미드 (DMA), 아세톤 등 중에서 과량의 NaN3을 사용하여 수행된다.
하기 화학식 II의 화합물은
<화학식 II>
Figure 112014090700241-pct00015
하기 화학식 IV의 화합물로부터
<화학식 IV>
Figure 112014090700241-pct00016
(식 중, Pg는 히드록실 보호기, 예컨대 벤질 (페닐-CH2-)을 나타내고, PEG는 화학식 A에서와 같이 정의됨)
치환 반응, 이어서 탈보호 반응에 의해 제조될 수 있다.
하기 언급된 바와 같은 보호기 Pg는, 한편으로는 합성 단계 동안 반응성 관능기, 예컨대 히드록시 또는 아민의 보호를 가능하게 하며, 다른 한편으로는 합성 단계의 말미에 무손상 반응성 관능기의 회수를 가능하게 하는 기에 해당한다. 보호기의 예, 뿐만 아니라 다양한 관능기의 보호 및 탈보호 방법은 문헌 [P. G. M. Wuts and T. W. Greene, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, 4. ed. (2007), John Wiley & Sons, 및 J. F. W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, 1973]에 제공된다.
치환 반응은 적절한 시약, 예컨대 각각 N-할로게노숙신이미드 (예를 들어, N-브로모숙신이미드 (NBS)) 또는 아지드화나트륨에 의해 OH 기를 할로겐 원자 또는 아지드 기로 치환하는 것을 포함한다.
할로겐 기가 치환되어야 하는 경우에, 이 반응은 일반적으로 적합한 유기 용매, 예컨대 디클로로메탄 중에서 적절한 N-할로게노숙신이미드 시약을 PPh3과 함께 사용하여 수행된다.
아지드 기가 치환되어야 하는 경우에, 이탈기로의 초기 치환은 하기와 같이 수행될 수 있다:
1) 화학식 IV의 화합물의 OH 기를 이탈기로 치환하고,
2) 단계 1)에서 수득된 화합물의 이탈기를 아지드 (N3) 기로 치환함.
본원에 사용된 "이탈기"는 전자 쌍의 이탈과 함께 불균일 결합 ((즉) 그의 분열이 양이온 및 음이온을 생성하는 결합)를 파괴함으로써 분자로부터 용이하게 절단될 수 있는 기에 해당된다. 이어서, 이러한 기는, 예를 들어 치환 반응 동안 또 다른 관능기에 의해 용이하게 대체될 수 있다. 이러한 이탈기는 할로겐 원자 또는 활성화된 히드록시 기, 예컨대 메실레이트, 토실레이트, 트리플레이트 또는 아세틸 기 등으로 이루어질 수 있다. 이탈기의 예, 뿐만 아니라 그의 제조법과 관련된 언급은 문헌 [≪Advances in Organic Chemistry≫ J. March, 3rd Edition, Wiley Interscience, p. 310-316]에 제시된다.
예를 들어, 단계 1)에서, 이탈기는 메실레이트이고, 따라서 치환은 메실클로라이드 (MsCl)의 존재 하에 수행된다. 이 반응은 전형적으로 DMAP의 존재 하에 유기 용매, 예컨대 디클로로메탄 중에서 수행된다.
단계 2)에서 이탈기의 아지드 기로의 치환은 아지드화나트륨의 존재 하에 적합한 유기 용매, 예컨대 DMF 중에서 수행될 수 있다.
탈보호 단계는 수득된 치환된 할로게노 또는 아지도 화합물의 보호기 Pg를 가수분해하여 화학식 II의 화합물을 수득하는 것을 포함한다.
가수분해는 전형적으로, Pg-가 페닐-CH2-인 경우에, 특히 진한 HCl을 사용하여 널리 공지된 절차에 따라 산성 조건에서 수행될 수 있다.
추가 목적에 따르면, 본 발명은 또한 하기 화학식 XI의 화합물에 관한 것이다.
<화학식 XI>
Figure 112014090700241-pct00017
상기 식에서, PEG' 및 리간드는 화학식 A에서와 같이 정의된다.
특히, 본 발명은
Figure 112014090700241-pct00018
를 제외한 화학식 XI의 화합물에 관한 것이다.
추가 목적에 따르면, 본 발명은 또한,
- 하기 화학식 XII의 화합물을
<화학식 XII>
Figure 112014090700241-pct00019
- 리간드 전구체와
커플링시키는 것을 포함하는, 하기 화학식 XI의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
<화학식 XI>
Figure 112014090700241-pct00020
(식 중, PEG' 및 리간드는 상기 화학식 A에서와 같이 정의됨)
"리간드 전구체"는, 화학식 XII의 화합물의 -NH2 기와 반응시, 기 -리간드 (여기서, 리간드는 화학식 A에 정의된 바와 같은 관능성 리간드의 잔기임)를 생성하는 화합물이다.
상기 커플링은 펩티드 커플링 시약의 존재 하에 염기의 존재 하에 수행될 수 있다.
상기 펩티드 커플링제는 공지된 펩티드 커플링제, 보다 특히 PyBOP (벤조티아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트) 또는 EDC/NHS (1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드 / N-히드록시 술포숙신이미드)로부터 선택될 수 있다.
염기는 임의의 유기 또는 무기 염기, 보다 특히 무기 염기, 예컨대 트리에틸아민 (TEA) 또는 N,N-디이소프로필에틸렌디아민 (DIPEA)일 수 있다.
특정한 조합에 대해서와 같이, 한 실시양태에서, PyBOP (벤조티아졸-1-일-옥시트리피롤리디노-포스포늄헥사플루오로-포스페이트)는 N,N-디이소프로필에틸렌디아민 (DIPEA)과 함께 사용되고, 또 다른 실시양태에서, EDC/NHS (1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드 / N-히드록시 술포숙신이미드)가 트리에틸아민과 함께 사용된다.
반응은 적합한 유기 용매, 예컨대 디클로로메탄, DMF 또는 디메틸 술폭시드 (DMSO) 중에서 수행될 수 있다.
대표적인 리간드 전구체는 다음을 포함한다:
아니스아미드 잔기인 리간드- =
Figure 112014090700241-pct00021
를 생성하는 아니스아미드 전구체인
Figure 112014090700241-pct00022
;
폴산;
FP547 잔기인 리간드- = -NH-C(=O)-(CH2)2-FP547를 생성하는 FP-547-NHS.
한 실시양태에 따르면, 화학식 XII의 화합물은
- 하기 화학식 XIII의 화합물을
<화학식 XIII>
Figure 112014090700241-pct00023
- 하기 화학식 XIV의 화합물
<화학식 XIV>
Figure 112014090700241-pct00024
및 염기와
반응시켜 하기 화학식 XV의 화합물을 형성하고;
<화학식 XV>
Figure 112014090700241-pct00025
(식 중, PEG'는 화학식 A에서와 같이 정의되고, Hal'는 할로겐 원자 예컨대 Br을 나타냄)
이어서,
화학식 XV의 화합물을 화학식 XII의 화합물로 변형시킴으로써 제조될 수 있다.
화학식 XIII의 화합물의 화학식 XIV의 화합물과의 반응은 일반적으로 적합한 유기 용매, 예컨대 DMF 중에서 강염기, 예컨대 NaH의 존재 하에 수행된다.
화학식 XV의 화합물의 화학식 XII의 화합물로의 변형은 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다.
특히, 이는
- 화학식 XV의 화합물을 프탈이미드 및 PPh3과 반응시켜 하기 화학식 XVI의 화합물을 형성하고;
<화학식 XVI>
Figure 112014090700241-pct00026
이어서,
- 화학식 XVI의 화합물을 히드라진 수화물과 반응시켜 화학식 XII의 화합물을 형성하는 것
을 포함할 수 있다.
화학식 XV의 화합물과 프탈이미드 및 PPh3과의 반응은 일반적으로 적합한 유기 용매, 예컨대 THF 중에서 디이소프로필 아조디카르복실레이트 (DIPAD)의 존재 하에 전형적으로 실온에서 수행된다.
수득된 화학식 XVI의 화합물의 히드라진 수화물 (N2H4.H2O)과의 반응은 용매로서의 에탄올 중에서 수행될 수 있다.
대안적으로, 화학식 XV의 화합물의 화학식 XII의 화합물로의 변형은
- 화학식 XV의 화합물을 하기 화학식 XVII의 화합물과 반응시켜
<화학식 XVII>
Figure 112014090700241-pct00027
(식 중, Lg는 이탈기이고, Hal"은 할로겐 원자임)
하기 화학식 XVIII의 화합물을 형성하고;
<화학식 XVIII>
Figure 112014090700241-pct00028
이어서,
- 수득된 화학식 XVIII의 화합물을 히드라진 수화물 (N2H4.H2O) 및 프탈산칼륨과 반응시켜
화학식 XII의 화합물을 형성하는 것
을 포함한다.
화학식 XVII에서, Lg는 유리하게는 메탄술포닐 기 (Ms)이고, Hal"는 Cl 원자일 수 있다.
이 반응은 일반적으로 염기, 예컨대 유기 염기, 예를 들어 트리에틸아민 (Et3N), 및 임의로 촉매, 예컨대 디메틸아미노피리딘 (DMAP)의 존재 하에 및/또는 적합한 유기 용매, 예컨대 디클로로메탄 중에서 수행된다.
수득된 화학식 XVIII의 화합물의 반응은 일반적으로 먼저 용매, 예컨대 DMF 중 프탈산칼륨 및 촉매량의 아이오딘화나트륨 (NaI)을 첨가하고, 이어서 용매를 제거하고, 용매, 예컨대 에탄올 중 히드라진 수화물 (N2H4.H2O)을 첨가함으로써 수행된다.
추가 실시양태에 따르면, 화학식 XII의 화합물은 또한,
- 하기 화학식 XIX의 화합물을
<화학식 XIX>
Figure 112014090700241-pct00029
하기 화학식 XIV의 화합물과 반응시켜
<화학식 XIV >
Figure 112014090700241-pct00030
(식 중, Hal'는 할로겐 원자, 예컨대 Br이고, PEG'는 화학식 A에서와 같이 정의됨)
하기 화학식 XX의 화합물을 형성하고;
<화학식 XX>
Figure 112014090700241-pct00031
이어서,
- 화학식 XX의 화합물을 트리페닐포스핀 (PPh3)과 반응시켜 화학식 XII의 화합물을 생성하는 것
에 의해 제조될 수 있다.
화학식 XIX의 화합물의 화학식 XIV의 화합물과의 반응은 일반적으로 염기, 예컨대 NaH의 존재 하에 유기 용매, 예컨대 DMF 중에서 수행된다.
화학식 XX의 화합물의 트리페닐포스핀 (PPh3)과의 반응은 일반적으로 용매, 예컨대 테트라히드로푸란 (THF) 중에서 임의로 물의 존재 하에 수행된다.
화학식 XIX의 화합물은 하기 화학식 XXI의 화합물로부터 치환 반응, 이어서 탈보호 반응에 의해 제조될 수 있다.
<화학식 XXI>
Figure 112014090700241-pct00032
상기 식에서, Pg는 화학식 IV에서와 같이 정의된다.
치환 및 탈보호 반응은 상기 논의된 바와 같이 화합물 (II)에 대해서와 같이 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한, 원하거나 필요한 경우에, 각 단계 이후에 수득된 화합물을 단리 또는 정제하는 단계 및/또는 원하는 단계를 순서대로 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
이와 같이 제조된 화합물은 반응 혼합물로부터 통상의 수단에 의해 회수될 수 있다. 예를 들어, 화합물은 반응 혼합물로부터 용매를 증류 제거하거나, 또는 필요한 경우에, 반응 혼합물로부터 용매를 증류 제거한 후에 잔류물을 물에 붓고, 이어서 수불혼화성 유기 용매로 추출하고, 추출물로부터 용매를 증류 제거함으로써 회수될 수 있다. 또한, 생성물은, 원하는 경우에, 널리 공지된 다양한 기술, 예컨대 재결정화, 재침전화 또는 다양한 크로마토그래피 기술, 특히 칼럼 크로마토그래피 또는 정제용 박층 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다.
상기 방법에서, 출발 화합물 및 반응물은, 달리 나타내지 않는 한, 상업적으로 입수가능하거나 또는 문헌에 기재되어 있거나, 또는 문헌에 기재된 방법에 따라, 하기 실시예에 개시된 바와 같이 또는 당업자에게 공지된 바와 같이 제조될 수 있다.
상기 기재된 방법에 대한 변화는 필요에 따라 당업자에 의해 인지될 것이고, 또한 본 발명의 일부이다. 적절한 변형 및 치환은 당업자에게 용이하게 분명하고 널리 공지되어 있거나 또는 과학 문헌으로부터 용이하게 수득가능하다. 특히, 이러한 방법은 문헌 [R.C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH publishers, 1989]에서 발견될 수 있다.
화학식 A의 화합물, 또는 적어도 본 발명의 화학식 A의 화합물을 포함하는 나노입자는 의약의 제조에 유용할 수 있다.
따라서, 또 다른 본 발명의 목적은 임의로 본 발명의 나노입자 형태인 화학식 A의 하나 이상의 화합물을 포함하는 의약이다.
또 다른 본 발명의 목적은 또한 활성 성분으로서 임의로 본 발명의 나노입자 형태인 화학식 A의 화합물을 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물이다.
이들 제약 조성물은 유효 용량의 본 발명에 따른 하나 이상의 화합물 (A) 및 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함한다.
상기 부형제는 제약 형태 및 바람직한 투여 경로에 따라 당업자에 의해 공지된 통상의 부형제 중에서 선택된다.
경구, 설하, 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 국소, 국부, 기관내, 비강내, 경피 또는 직장 투여를 위한 본 발명에 따른 제약 조성물에서, 활성 성분은 통상의 제약 부형제와의 블렌드 중의 단위 투여 형태로서 동물 및 인간에게 투여될 수 있다.
적절한 단위 투여 형태는 경구 형태, 예컨대 정제, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 분말, 과립 및 경구 용액 또는 현탁액, 설하, 협측, 기관내, 안내, 비강내 형태, 흡입에 의한 형태, 국소, 경피, 피하, 근육내, 정맥내 또는 동맥내 형태, 직장 형태 및 임플란트를 포함한다. 국소 적용의 경우에, 본 발명의 화합물은 크림, 겔, 연고 또는 로션으로서 사용될 수 있다.
예로서, 정제 형태의 본 발명에 따른 화합물에 대한 단위 투여 형태는 하기 성분을 포함할 수 있다:
본 발명에 따른 화합물 50.0 mg
만니톨 223.75 mg
크로스카르멜로스 소듐 6.0 mg
옥수수 전분 15.0 mg
히드록시프로필 메틸셀룰로스 2.25 mg
스테아르산마그네슘 3.0 mg
특정한 경우에, 보다 높거나 보다 낮은 투여량이 적절할 수 있으며, 이들 투여량은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 통상적인 실시에 따라, 각 환자에 적합한 투여량은 투여 경로, 환자의 체중 및 반응에 따라 의사에 의해 결정된다.
<도면의 간단한 설명>
도 1은 상이한 밀도의 N3으로 노출된 PLA-PEG-N3 클릭가능한 나노입자 표면을 예시한다. 나노입자 표면 상의 N3 밀도는 적절한 비의 PLA-PEG-N3과 PLA-PEG 공중합체를 혼합함으로써 목적하는 바에 따라 변경될 수 있다.
도 2는 화학적 감수성 물질 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)의 로딩 및 정맥내 전달을 용이하게 하기 위해 다양한 PEG 쇄 길이 (보다 짧은 길이 및 보다 긴 길이)를 사용하여 합성된 PLA-PEG 클릭가능한 나노입자를 예시한다.
도 3은 조합 적용 (예를 들어, 귀소 디바이스, 영상화제, 자극-반응성 작용제를 함유하는 나노입자)을 위해 적절한 비의 다양한 PLA-PEG-관능성 리간드 공중합체를 혼합함으로써 제조된 다관능성 나노입자를 예시한다.
도 4는 표면 플라즈몬 공명 실험을 사용하는 PLA-PEG-폴산 나노입자의 수용체 결합 능력 평가를 나타낸다. 그래프는 PLA-PEG-폴산 나노입자 중 폴산의 농도에 대한 특정한 신호 (공명 단위, RU로 언급됨)의 평가를 나타낸다.
도 5a는 폴레이트 수용체를 과다-발현하는 KB-3-1 세포 상에서 PLA-PEG-폴산 나노입자 (■ = S1)의 시험관내 세포독성을 PLA-PEG-OMe 나노입자 (◆ = S2)와 비교하여 예시한다.
도 5b는 시그마 수용체를 발현하는 PC-3 세포 상에서 형광 PLA-PEG-아니스아미드 나노입자 (■ = S3)의 시험관내 세포독성을 형광 PLA-PEG-OMe 나노입자 (◆ = S4)와 비교하여 예시한다.
도 6a는 폴레이트 수용체를 과다-발현하는 KB-3-1 세포 상에서 형광 PLA-PEG-폴산 나노입자 (■ = S3') 및 형광 PLA-PEG-OMe 나노입자 (◆ = S4')의 세포 침투 능력을 예시한다.
도 6b는 폴레이트 수용체를 과다-발현하는 KB-3-1 세포 상에서 형광 PLA-PEG-폴산 나노입자 (■ = S1', S3' 및 S5'의 평균) 및 형광 PLA-PEG-OMe 나노입자 (◆ = S2', S4' 및 S6'의 평균)의 세포 침투 능력을 예시한다. 형광 신호는 실험 이전의 각 샘플의 형광에 대해 정규화되었다.
실시예
하기 실시예는 본 발명에 따른 일부 화합물의 합성을 기재하고 있다. 이들 실시예는 제한하는 것으로 의도되지는 않으며, 단지 본 발명을 예시한다. 예시된 화합물의 번호는, 본 발명에 따른 수많은 화합물의 화학 구조 및 물리적 특성을 설명하는, 이후 주어진 표에서의 번호를 지칭한다.
약어:
MTS 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸륨
ACN 아세토니트릴
N3 아지드
Bz 벤질
PyBOP (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트
CuBr 브롬화구리 (I)
CuSO4 황산구리 (II)
cHex 시클로-헥산
Da 달톤
DCM 디클로로메탄
Et2O 디에틸 에테르
DIAD 디이소프로필 아조디카르복실레이트
DMSO 디메틸 술폭시드
DMAP 디메틸아미노피리딘
DMF 디메틸포름아미드
DMEM 둘베코 변형 이글 배지
DLS 동적 광 산란
EPR 증진된 투과성 및 체류
equiv., Eq. 당량
EtOH 에탄올
AcOEt 에틸 아세테이트
EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산
FBS 태아 소 혈청
FC 유동 채널
FP-547 플루오프로브(Fluoprobe)-547
FBP 폴레이트 결합 단백질
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
N2H4.H2O 히드라진 수화물
HBr 브로민화수소산
HCl 염산
IgG 이뮤노글로불린 G
MgSO4 황산마그네슘
MsCl 메탄술포닐 클로라이드
MeOH 메탄올
Ome 메톡시
EDC N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드
PMDETA N,N,N',N",N"-펜타메틸디에틸렌트리아민
DIEA N,N-디이소프로필에틸아민
NP 나노입자
NBS N-브로모숙신이미드
NHS N-히드록시숙신이미드
NMR 핵 자기 공명
Mn 수평균 분자량
PBS 포스페이트 완충제 염수
PLA 폴리(D,L-락트산)
PLGA 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)
PEG 폴리(에틸렌 글리콜)
PdI 다분산 지수
PVA 폴리(비닐 알콜)
R.U. 공명 단위
ROP 개환 중합
RPMI 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute)
SEC 크기 배제 크로마토그래피
NaN3 아지드화나트륨
NaCl 염화나트륨
NaCh 콜산나트륨
NaH 수소화나트륨
NaOH 수산화나트륨
NaI 아이오딘화나트륨
Sn(Oct)2 옥토산주석
SPR 표면 플라즈몬 공명
THF 테트라히드로푸란
Et3N (TEA) 트리에틸아민
PPh3 트리페닐포스핀
Mw 중량 평균 분자량
실시예 1: 나노입자를 제조하기 위한 전구체의 제조
제조예 1: 화학식 XII의 화합물의 합성
1. 모노-알킨 폴리에틸렌 글리콜의 합성을 위한 절차 (제조예 1A)
Figure 112014090700241-pct00033
실험 절차:
트리에틸렌 글리콜 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 5620 mg, 37.4 mmol, 1 당량)을 무수 THF (50 mL) 중에 용해시키고, 생성된 용액을 건조 조건에서 0℃로 냉각시켰다. 수소화나트륨 (988 mg, 1.1 당량)을 천천히 첨가한 다음, 프로파르길 브로마이드 (톨루엔 중 80 wt.%, 4360 μL, 1.1 당량)를 적가하였다. 반응물을 실온에서 12시간 동안 불활성 분위기 하에 교반하였다.
처리 방법:
THF를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 메틸렌 클로라이드 (디클로로메탄, DCM)에 녹이고, 염수로 수회 세척하였다. 생성된 유기 층을 황산마그네슘 (MgSO4) 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시키고, 진공 하에 건조시켰다. 조 생성물을 실리카 상의 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하고 (용리액: 시클로헥산 (cHex)/에틸 아세테이트 (AcOEt) : 8/2), 황색 오일 3.31 g을 회수하였다 (47% 수율).
NMR 특성화:
Figure 112014090700241-pct00034
2. 프탈이미드-알킨 트리에틸렌 글리콜 화합물의 합성은 또한 1-단계에 의해 또는 메실레이트 중간체를 통한 2-단계에 의해 2가지 상이한 경로를 사용하여 수행되었다.
2a) 프탈이미드-알킨 트리에틸렌 글리콜의 합성을 위한 1-단계 절차 (제조예 1B)
Figure 112014090700241-pct00035
실험 절차:
제조예 1A (2000 mg, 10.6 mmol, 1 당량), 프탈이미드 (2345 mg, 1.5 당량) 및 트리페닐포스핀 (4179 mg, 1.5 당량)을 건조 조건 하에 무수 THF (50 mL) 중에 용해시켰다. 디이소프로필 아조디카르복실레이트 (DIAD) (3.14 mL, 1.5 당량)를 천천히 첨가하고, 반응물을 실온에서 48시간 동안 불활성 분위기 하에 교반하였다.
처리 방법:
THF를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 DCM에 녹이고, 염수로 수회 세척하였다. 생성된 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시키고, 진공 하에 건조시켰다. 조 생성물을 실리카 상의 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하고 (용리액: cHex/AcOEt : 8/2), 황색 오일 3.37 g을 회수하였다 (60% 수율).
NMR 특성화:
Figure 112014090700241-pct00036
2b) 프탈이미드-알킨 트리에틸렌 글리콜의 2-단계 합성을 위해, 메실레이트를 먼저 하기와 같이 합성하였다:
메실-알킨 트리에틸렌 글리콜의 합성을 위한 절차 (제조예 1C)
Figure 112014090700241-pct00037
실험 절차:
DCM 60 mL 중 알킨 트리에틸렌 글리콜 (제조예 1A, 4 g, 212 mmol, 1 당량)의 용액에 불활성 분위기 하에 촉매량의 DMAP, 메탄술포닐 클로라이드 (3.3 mL, 2 당량) 및 트리에틸아민 (5.9 mL, 2 당량)을 적가하였다. 반응물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
처리 방법:
용액을 염수 (50 mL로 3회)로 세척하고, 이어서 수성 상을 DCM (50 mL)으로 추출하고, 합한 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다.
최종 생성물을 하기 단계에서 (특성화 없이) 직접 사용하였다.
2c) 프탈이미드-알킨 트리에틸렌 글리콜의 합성을 위한 절차 (제조예 1D)
Figure 112014090700241-pct00038
실험 절차:
DMF (100 mL) 중 메실-알킨 트리에틸렌 글리콜 (제조예 1C, 5.1 g, 19.2 mmol, 1 당량)의 용액에 프탈산칼륨 (7.87 g, 2.2 당량) 및 촉매량의 아이오딘화나트륨 (1 당량 미만, 예를 들어 스패튤라 팁)을 첨가하였다. 용액을 밤새 80℃에서 교반하고, 용매를 감압 하에 제거하였다.
처리 방법:
생성된 잔류물을 실리카 상의 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다 (용리액: cHex/AcOEt : 2/8에서 4/6). 황색 오일 5.7 g을 회수하였다 (94% 수율).
NMR 특성화:
Figure 112014090700241-pct00039
3) 아미노-알킨 트리에틸렌 글리콜의 합성을 위한 절차 (제조예 1E)
Figure 112014090700241-pct00040
실험 절차:
제조예 1B (2034 mg, 6.4 mmol, 1 당량)를 에탄올 (EtOH) (200 mL) 중에 용해시키고, 히드라진 수화물 (3.1 mL, 10 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류 조건 하에 밤새 교반하였다.
처리 방법:
반응물을 실온 미만으로 냉각시키고, 진한 염산 8 mL를 반응물에 첨가하였다 (pH~2-3). 침전물을 여과에 의해 제거하고, pH를 NaOH (2 M)를 사용하여 10 초과로 상승시켰다. 수성 상을 DCM으로 3회 추출하였다. 생성된 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시키고, 진공 하에 건조시켰다. 황색 오일 911 mg을 회수하였다 (76% 수율).
NMR 특성화:
Figure 112014090700241-pct00041
제조예 2: 화학식 XI의 화합물의 합성
1) 아니스아미드-알킨 트리에틸렌 글리콜의 합성을 위한 절차 (제조예 2A)
Figure 112014090700241-pct00042
실험 절차:
DCM (20 mL) 중 제조예 1E (200 mg, 1.07 mmol, 1 당량)의 용액에 불활성 분위기 하에 PyBOP (780 mg, 1.4 당량), p-메톡시벤조산 (229 mg, 1.4 당량) 및 DIEA (260 μL, 1.4 당량)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다
처리 방법:
용액을 염수 (20 mL로 3회)로 세척하고, 이어서 수성 상을 DCM (20 mL)으로 추출하고, 합한 유기 층은 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 상의 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하고 (용리액 : cHex/AcOEt: 5/5에서 7/3), 황색 오일 300 mg을 회수하였다 (90% 수율).
NMR 특성화:
Figure 112014090700241-pct00043
2) 폴산-알킨 트리에틸렌 글리콜의 합성을 위한 절차 (제조예 2B)
Figure 112014090700241-pct00044
실험 절차:
DMF (70 mL) 중 제조예 1E (319 mg, 1.70 mmol, 1 당량)의 용액에 불활성 분위기 하에 EDC (393 mg, 1.2 당량), NHS (236 mg, 1.2 당량) 및 수 방울의 트리에틸아민 (Et3N)을 첨가하였다. 반응물을 50℃에서 가열하고, 폴산 (시그마-알드리치, 754 mg, 1 당량)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 이어서, 반응물을 50℃에서 밤새 교반하였다.
처리 방법:
용액을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 DCM 및 아세톤에 침전시키고, 여과하고, 진공 하에 건조시켰다.
수득된 생성물을, 예를 들어 아세트산암모늄 완충제 중 5에서 95% 아세토니트릴 구배 (pH 5로 조정됨) 20mM (20분 내), 이어서 95% 아세토니트릴 (5분 동안)을 사용하여 역상 칼럼 (C18, 크로마실(Kromasil) 10 μm, 4.6x250mm) 상에서 분석하였다.
생성물을 용리액 중 20% DMF 중에 가용화시켰다. 정제를 100 mm 칼럼 (상의 1.5 kg)에서 패킹된 크로마실 C18 10 μm 상에서 수행하고, 용리를 85% 아세트산암모늄 완충제 pH 5, 20mM 및 15% 아세토니트릴로 수행하였다
조 생성물 200mg은 DMF 주사 피크와 동시에 용리되었다.
정제 방법 (화합물 B):
최종 정제를 역상 칼럼 워터스 엑스브리지(Waters XBridge) C18 (30x100 mm), 5μm를 갖는 정제용 HPLC를 사용하여 조 생성물 200 mg을 가용화시킴으로써 수행하였다.
생성물을 먼저 DMSO (5 mL) 및 완충 용액 (28% 암모니아성 수용액으로 pH 9.3으로 조정된 탄산암모늄 10 mM) 5 mL 중에 용해시켰다.
1 ml의 10회 주사를 30 mL/분으로 95:5 (완충 용액 (탄산암모늄) / 아세토니트릴)에서 5:95로의 구배 (12분 내)를 사용하여 수행하였다.
NMR 특성화 (화합물 B):
Figure 112014090700241-pct00045
3) FP547-알킨 트리에틸렌 글리콜의 합성을 위한 절차 (제조예 2C)
Figure 112014090700241-pct00046
실험 절차:
DMSO (356 μL) 중 FP-547-NHS (인터킴(Interchim), 2.5 mg, 2.55 μmol, 1 당량)의 용액에 EDC (0.49 mg, 1 당량), NHS (0.29, 1 당량), TEA (0.35 μL, 1 당량) 및 제조예 1E (1.07 mg, 2.2 당량)를 함유하는 DMSO (92 μL)의 용액을 첨가하였다.
용액을 12시간 동안 실온에서 암실에서 교반하였다.
처리 방법:
반응물을 감압 하에 농축시키고, DCM 중에 용해시키고, 염수로 추출하였다. 핑크색 오일을 수득하였다.
자외선/가시선 (UV/Vis) 및 형광 분광분석법 특성화:
수득된 스펙트럼은 형광단 화합물의 상업적 공급원에 의해 주어진 것과 유사하였다.
제조예 3: 화학식 II의 화합물의 합성
1) 벤질옥시-아지드 PEG2500의 합성을 위한 절차 (제조예 3A)
Figure 112014090700241-pct00047
실험 절차:
0℃로 냉각된, DCM (65 mL) 중 PEG2500-벤질 (폴리머 소스(Polymer Source), Mn = 2572 g.mol-1, 2.43 g, 0.94 mmol, 1 당량), DMAP (58 mg, 0.5 당량) 및 TEA (747 μL, 5.6 당량)의 용액에 20분에 걸쳐 MsCl (326 μL, 4.4 당량)을 천천히 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 DMF (20 mL) 중에 용해시키고, 아지드화나트륨 (330 mg, 5.3 당량)을 용액에 첨가하였다. 반응물을 24시간 동안 50℃에서 교반하였다.
처리 방법:
반응물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 DCM (50 mL) 내로 용해시키고, 염수 (50 mL로 3회)로 세척하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 최소 부피의 DCM로 농축시켰다. 후자를 디에틸 에테르 내로 침전시켰다. 백색 분말 2.16 g을 수득하였다.
NMR 특성화:
Figure 112014090700241-pct00048
2) 아지드 PEG2500의 합성을 위한 절차 (제조예 3B)
Figure 112014090700241-pct00049
실험 절차:
제조예 3A (2.16 g, 0.83 mmol, 1 당량)를 진한 HCl (20 mL) 내로 가용화시키고, 2일 동안 실온에서 교반하였다.
처리 방법:
용액을 진한 NaOH 용액으로 pH 1까지 염기성화시켰다. 수성 상을 DCM (50 mL로 4회)으로 추출하고, 합한 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 최소 부피의 DCM로 농축시켰다. 후자를 디에틸 에테르 내로 침전시켰다. 백색 분말 1.89 g을 수득하였다.
NMR 특성화:
Figure 112014090700241-pct00050
3) 벤질옥시-브로모 PEG2100의 합성을 위한 절차 (제조예 3C)
Figure 112014090700241-pct00051
실험 절차:
문헌 [Nicolas et al. Macromol 2008, 41, 8418]에 따라 제조된 PEG2100-벤질 (Mn = 2176 g.mol-1, 500 mg, 0.23 mmol, 1 당량) 및 NBS (50 mg, 1.2 당량)의 혼합물에 DCM (50 mL) 중 트리페닐 포스핀 (PPh3) (75 mg, 1.2 당량)의 저온 용액을 첨가하였다. 이어서, 반응물을 밤새 실온에서 교반하였다.
처리 방법:
반응물을 감압 하에 25 mL 미만으로 농축시키고, 헥산 (100 mL)으로 희석하였다. 침전물 (트리페닐포스핀 옥시드)을 여과에 의해 제거하고, 중합체를 디에틸 에테르 (200 mL) 내로 2회 침전시켰다.
NMR 특성화:
Figure 112014090700241-pct00052
4) 브로모 PEG2100의 합성을 위한 절차 (제조예 3D)
Figure 112014090700241-pct00053
실험 절차:
제조예 3C (500 mg, 0.22 mmol, 1 당량)를 진한 HBr (20 mL) 내로 가용화시키고, 실온에서 2일 동안 교반하였다.
처리 방법:
용액을 진한 NaOH 용액으로 pH 1까지 염기성화시켰다. 수성 상을 DCM (50 mL로 4회)으로 추출하고, 합한 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 최소 부피의 DCM로 농축시켰다. 후자를 디에틸 에테르 내로 침전시켜 분말 형태로서 수득하였다.
NMR 특성화:
Figure 112014090700241-pct00054
제조예 4: 화학식 I의 화합물의 합성
화학식 I의 화합물을 2가지 상이한 경로를 사용하여 합성하였다. 첫 번째 것 (4A)은 1-단계에 의한 것이고, 두 번째 것 (4B)은 2-단계에 의한 것이다.
제조예 4A: 개환 중합 (ROP)에 의한 블록 공중합체 PLA-PEG-N3의 합성
Figure 112014090700241-pct00055
m은 PLA 단위의 수이다.
실험 절차:
아지도-폴리(에틸렌 글리콜) (3B, Mn = 2507 g.mol-1, 293 mg, 0.12 mmol) 및 D,L-락티드 (7,01 g, 48.62 mmol)의 혼합물에 건조 조건 하에 무수 톨루엔 (11.2 mL) 중 Sn(Oct)2 (18.7 mg, 46.1 μmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 20분 동안 아르곤을 버블링시킴으로써 탈기시키고, 이어서 90분 동안 120℃에서 불활성 분위기 하에 예열된 오일조 내 교반하였다. 반응은 대략 55%의 전환에서 중단시켰다.
처리 방법:
톨루엔을 감압 하에 제거하고, 수득된 생성물을 최소량의 DCM 내로 용해시키고, 추가로 디에틸 에테르 내로 침전시켰다. 이어서, 침전을 최소량의 THF 내로 용해시키고, 물 중에 추가로 침전시키고, 후속적으로 밤새 동결-건조시켜 백색 분말을 수득하였다.
NMR 특성화:
Figure 112014090700241-pct00056
<표 1>
Figure 112014090700241-pct00057
Mn = NMR에 의해 결정된 수 평균 분자량
이론치: 100%의 전환
NB: 상이한 배치의 제조예 4A 중합체를 합성하고 사용하였다. m 값은 각 배치에 따라 다양하다. m은 전형적으로 180 내지 250이었다.
제조예 4B(1): 개환 중합 (ROP)에 의한 블록 공중합체 PLA-PEG-Br의 합성
Figure 112014090700241-pct00058
m은 PLA 단위의 수이다.
실험 절차:
브로모-폴리(에틸렌 글리콜) (3D, Mn = 2149 g.mol-1, 49 mg, 22.8 μmol) 및 D,L-락티드 (0.72 g, 4.97 mmol)의 혼합물에 건조 조건 하에 Sn(Oct)2 (1 mg, 2.5 μmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 아르곤으로 20분 동안 탈기시키고, 이어서 벌크 조건 하에 예열된 오일조 내 120℃에서 20시간 동안 불활성 분위기 하에 교반하였다. 반응은 완전 전환시 중단되었다.
처리 방법:
수득된 생성물을 최소량의 DCM 내로 용해시키고, 추가로 디에틸 에테르 중에 침전시켰다. 이어서, 침전물을 최소량의 THF 내로 용해시키고, 추가로 물에 침전시키고, 후속적으로 밤새 동결-건조시켜 백색 분말을 수득하였다.
<표 2>
Figure 112014090700241-pct00059
Mn = NMR에 의해 결정된 수 평균 분자량
이론치: 100%의 전환
m= (NMR에 의해 결정된 실험 Mn - PEG-Br의 Mn)/락티드 단량체의 MW = (34120-2100)/144=222
NB: m 값은 각 배치에 따라 다양하다. m은 전형적으로 100 내지 300, 보다 특히 180 내지 250이었다.
제조예 4B(2): 아지드-PEG2100-PLA의 합성을 위한 절차
Figure 112014090700241-pct00060
m은 상기에 표에서와 같이 정의된다.
실험 절차:
DMF (10 mL) 중 제조예 4B(1) (200 mg, 5.9 μmol, 1 당량)의 용액에 불활성 조건 하에 아지드화나트륨 (20 mg, 54 당량)을 첨가하였다. 이어서, 반응물을 50℃에서 3일 동안 불활성 분위기 하에 교반하였다.
Figure 112014090700241-pct00061
처리 방법:
용액을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 최소량의 THF 내로 가용화시켰다. 이어서, 후자를 물 내로 침전시켰다.
제조예 5: 화학식 A의 화합물의 합성
유기 조건에서 휘스겐 반응을 위한 전형적 절차
Figure 112014090700241-pct00062
m은 PLA 단위의 수이고, 각 배치에 따라 다양하다.
최적화 실험 절차의 예:
무수 DMF (2.5 mL) 중 제조예 4A에 기재된 방법에 따라 제조된 화학식 I의 화합물 PLA-PEG-N3 (200 mg, 배치에 따른 몰량, 각 경우에: 6.7 μmol, 1 당량) 및 화학식 XI의 알킨 유도체 (0,12 mmol, 18 당량)의 사전 탈기된 용액에 무수 DMF (400 μL) 중 CuBr (5.8 mg, 6.1 당량) 및 PMDETA (16.8 μL, 17.8 당량)의 탈기된 용액에 시린지로 첨가하였다. 반응 혼합물을 15시간 동안 50℃에서 불활성 분위기 하에 교반하였다. 동일한 방법론이 모든 제조예에 사용되었다.
최적화 처리 방법의 예:
용액을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 최소량의 THF 내로 용해시키고, 추가로 물 중에 침전시켰다. 침전물을 동결-건조시키고, 최소량의 THF 내로 다시 용해시키고, 추가로 물 중에 침전시켰다. 침전물을 동결-건조시켜 백색 분말을 수득하였다.
알킨 유도체가 물 중에 불용성인 경우에, 중간 단계는, 동결-건조된 침전물을 먼저 최소량의 DCM 내로 용해시키고, 추가로 디에틸 에테르 중에 침전시킴으로써 추가될 수 있다.
최종 단계는 물 내로의 THF의 침전이어야 한다. 또한, 일부 출발 물질이 이후에 잔류하는 경우에, 정제 단계가 추가될 수 있다. 동일한 방법론이 화학식 A의 화합물을 제조하는 모든 제조예에 사용되었다 (하기 표 3 참조).
<표 3>
Figure 112014090700241-pct00063
(*) 제조예 2B의 화합물 A 및 B의 혼합물에 대해 수행된 반응
Mn*: NMR에 의해 결정된 수 평균 분자량
Copo: PLA-PEG-N3
Eq: 당량
PLA-PEG-트리아졸-PEG'-아니스아미드의 NMR 특성화
Figure 112014090700241-pct00064
제조예 6: 화학식 I'의 화합물의 합성
개환 중합 (ROP)에 의한 블록 공중합체 PLA-PEG-OMe의 합성을 위한 절차
Figure 112014090700241-pct00065
m은 PLA 단위의 수이다.
실험 절차:
메톡시폴리(에틸렌 글리콜) (시그마-알드리치, Mn= 2012 g.mol-1, 245 mg, 0.12 mmol) 및 D,L-락티드 (7,01 g, 48.62 mmol)의 혼합물에 건조 조건 하에 무수 톨루엔 (11.2 mL) 중 Sn(Oct)2 (18.7 mg, 46.1 μmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 20분 동안 아르곤을 버블링시킴으로써 탈기시키고, 이어서 예열된 오일조 내 120℃에서 30분 동안 불활성 분위기 하에 교반하였다. 반응은 대략 54.2%의 전환시 중단되었다.
처리 방법:
톨루엔을 감압 하에 제거하고, 수득된 생성물을 최소량의 DCM 내로 용해시키고, 추가로 디에틸 에테르 중에 침전시켰다. 이어서, 침전물을 최소량의 THF 내로 용해시키고, 추가로 물 중에 침전시키고, 후속적으로 동결-건조시켜 백색 분말을 수득하였다.
NMR 특성화:
Figure 112014090700241-pct00066
<표 4>
Figure 112014090700241-pct00067
Mn = NMR에 의해 결정된 수 평균 분자량
이론치: 100%의 전환
실시예 2: 나노입자 형성
나노입자는 하기 프로토콜에 따라서 및 하기 표에 명시된 바와 같은 성분 및 양을 사용하여 제조되었다.
일반적 프로토콜
1- 공중합체 또는 공중합체의 혼합물을 유기 용매 중에 용해시킨다 (최종 수성 중합체 농도는 1 내지 40 mg/mL로 다양함).
2- 유기 상을 안정화제 (농도가 0.1% 내지 1% w/v로 다양함)를 함유하는 수성 상 (수성/유기 부피 비는 2.5 내지 5로 다양함)과 혼합한다. 유화 및 크기 감소 기술을 사용하는 나노입자의 제조를 위해, 혼합물을 와류 진탕기를 사용하여 1분 동안 격렬하게 진탕시켜 에멀젼을 수득한다. 에멀젼을 초음파처리한다 (1 내지 10분으로 다양한 시간으로 프로브를 사용함).
3- 유기 상을 증발 (감압 또는 공기 유동 하에)에 의해 제거한다.
4- 나노입자를 30000g에서 30분 동안 초원심분리한다.
5- 나노입자를 수성 매질 중에 재현탁시킨다.
6- 나노입자를 1μm 유리 필터 디스크 (아크로디스크(Acrodisc)) 상에서 여과한다.
7- 나노입자를 사용시까지 4℃에서 저장한다.
예를 들어, 1.2 ml AcOEt가 유기 용매로서 사용되는 경우에 (하기 표 6에서 마지막 3가지 실시예 참조) 하기 프로토콜이 사용되었다.
1- 공중합체 또는 공중합체의 혼합물 (총 질량: 30 mg)을 AcOEt (1.2 mL) 중에 용해시킨다.
2- 유기 상을 1%의 플루로닉 F68을 함유하는 수성 상 3.3 mL에 첨가한다.
3- 혼합물을 와류 진탕기로 1분 동안 격렬하게 진탕시킨다.
4- 에멀젼을 3분 동안 초음파처리한다 (프로브 사용).
5- 유기 상을 감압 하에 회전 증발기를 사용하여 제거한다.
6- 나노입자를 30000g에서 30분 동안 초원심분리한다.
7- 나노입자를 pH 7.4 포스페이트 완충 염수 (PBS) 3mL 중에 재현탁시킨다.
8- 나노입자를 1μm 유리 필터 디스크 (아크로디스크) 상에서 여과한다.
9- 나노입자를 사용시까지 4℃에서 저장한다.
나노입자를 DLS (동적 광 산란) 및 맬번(Malvern)으로부터의 장치 (제타사이저 나노 ZS(Zetasizer Nano ZS))를 사용하여 특성화하였다. 하기 표에서 언급된 각 공중합체는 30000 Da 및 35000 Da 사이에 포함되는 평균 분자량을 갖는다.
<표 5> PLA-PEG-OMe 및 PLA-PEG-N3 공중합체로 제조된 나노입자
Figure 112014090700241-pct00068
상기 표에 표시된 계면활성제 농도의 농도는 %w/v 단위이다.
플루로닉® = 플루로닉 F68; Copo= 공중합체; PdI= 다분산 지수
PVA = 폴리(비닐 알콜) ~9500 Da
PLA = 30,000 Da (평균); PEG = PLA-PEG-N3에 대해 2500 Da 및 PLA-PEG-OMe에 대해 2000 Da
PLA-PEG-OMe는 제조예 6에 따라 제조됨
PLA-PEG-N3은 제조예 4A에 따라 제조됨
<표 6> PLA-PEG-OMe 공중합체와 블렌딩된 또는 블렌딩되지 않은 PLA-PEG-리간드 공중합체로 제조된 나노입자
Figure 112014090700241-pct00069
상기 표에 표시된 계면활성제 농도의 농도는 %w/v 단위이다.
플루로닉® = 플루로닉 F68; Copo= 공중합체; PdI= 다분산 지수
PVA = 폴리(비닐 알콜) ~9500 Da,
PLA = 30,000 Da (평균); PEG = PLA-PEG-N3에 대해 2500 Da 및 PEG = PLA-PEG-OMe에 대해 2000 Da
PLA-PEG-OMe - 제조예 6
PLA-PEG-아니스아미드 - 제조예 5
PLA-PEG-폴산 - 제조예 5
PLA-PEG-FP547 - 제조예 5
상기 표는 하기를 나타낸다:
- DCM/PVA는 230 nm 평균 직경 범위를 갖는 물리적으로 안정적 나노입자를 생성하였다.
- EtOAc/NaCh는 160 nm 평균 직경 범위를 갖는 물리적으로 안정적 나노입자를 생성하였다.
- EtOAc/플루로닉®는 110 nm 평균 직경 범위를 갖는 물리적으로 안정적 나노입자를 생성하였다.
- 아세톤의 사용은 30 nm 평균 직경 범위를 갖는 미셀을 생성하였다.
나노입자당 리간드의 수:
Figure 112014090700241-pct00070
Np = 나노입자의 수 (NP.L-1 (현탁액))
τ = 고체 함량 (g. L-1)
D = 평균 직경 (cm)
dp = 중합체 밀도 (g.cm-3)
PLA 중합체에 대해, 평균 밀도는 종종 1.24 또는 1.27 g.cm-3으로 언급된다.
평균 직경은 대략 110 nm (1.1x10-5 cm)이다.
고체 중합체 함량은 모액에 대해 대략 10 g.L-1이다.
따라서: Np ~ 1016 NP.L-1
공중합체가 대략 35000 g.mol-1의 분자량을 갖는 것을 고려한다.
나노입자의 표면 상의 폴산에 대한 최대 농도 (pH 7.4 PBS 용액 중 안정한 나노입자에 대해)가 약 30%임을 고려한다.
아보가드로 수(Avogadro number)는 NA = 6.022x1023 mol-1이다.
상기 주어진 데이터를 고려하여, 나노입자당
17000 공중합체 분자 및 5100 폴산 분자 (Mn( copo )=35000 g.mol-1인 경우에)
20000 공중합체 분자 및 6000 폴산 분자 (Mn( copo )=30000 g.mol-1인 경우에)
가 존재한다.
실시예 3: PLA-PEG-폴산 나노입자를 사용한 표면 플라즈몬 공명 (SPR)
시리즈 S 센서 칩 CM5 (지이 헬스케어(GE Healthcare)) 제조
이 센서 칩은 칩의 금 표면에 공유 부착된 카르복시메틸화 덱스트란의 매트릭스로 커버되고, 4개 채널로 구성되어 있다.
폴레이트 결합 단백질 ((FBP), 시그마-알드리치) 고정화:
단백질의 고정화를 위해 사용된 프로토콜은 존슨(Johnson)에 의해 기재된 것이다 (문헌 [Johnson et al. Anal. Biochem. 1991, 198, 268-277]). 간략하게, pH 7.4의 PBS로 기기를 평형화시킨 후에, 하기 샘플을 자동으로 및 연속적으로 비아코어(BIAcore) T100 내로 주입하였다: (i) 카르복실화 덱스트란을 활성화시키기 위한 혼합 용액 중 NHS/EDC (1:1, v/v) (420초 동안); (ii) 아세테이트 완충제 (pH 5.0) 중 125 μg/mL의 농도로 용해된 FBP (420초 동안), (iii) 센서 칩 상의 잔류 NHS-에스테르 기를 탈활성화시키기 위한 에탄올아민 (420초 동안). 각 단계의 사이에 PBS 세척을 수행하였다. 10 μL/분의 유량으로 수행된 고정화 프로토콜은 채널당 ~ 6.8 ng/mm2의 FBP의 결합을 허용하였다.
제1 유동 채널 (Fc1)을 단지 에탄올아민에 의해 차단하여 이를 참조 채널로서 사용하여, 덱스트란이 나노입자의 흡착에서 역할을 하고 있는지 아닌지 확인할 수 있었다.
고정된 FBP 입체형태 및 표면 재생의 검증:
고정된 FBP가 올바른 입체형태로 존재하는지 확인하기 위해, 폴리클로날 항체 항-FBP (IgG 항-FBP, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 사용하였다. 이뮤노글로불린G (IgG)를 30μL/분으로 120초 동안 50μg/mL로 주입하였다.
특이적 신호는 전체 신호의 대략 22%를 나타내는 비-특이적 신호 (참조 채널 Fc1 상의 IgG)보다 4.5배 더 크다.
글리신 및 에틸렌 글리콜의 사용은 표면을 재생하기 위해 고려되었다. 실제로, 이후에 IgG 항-FBP를 사용하여 유사한 특이적 신호를 얻는 것이 가능하였다.
새로 제조된 단백질-커버된 센서 칩 채널 상에서 나노입자 현탁액을 추가로 시험하였다.
PLA-PEG-폴산 나노입자 및 고정된 FBP 사이의 상호작용의 평가
고정된 FBP에 대한 PLA-PEG-폴산 나노입자의 흡착의 표면 플라즈몬 공명 분석은 비-접합된 PLA-PEG 나노입자를 대조군으로서 사용하여 수행하였다. 이들 실험은 500초의 접촉시간으로 5 μL/분의 유량으로 수행하였다.
사용된 나노입자:
나노입자의 표면에서 폴산의 농도를 다양하게 하는 것을 목적으로 하여, 나노입자의 다양한 현탁액을 이전에 기재된 프로토콜 (플루로닉®를 안정화제로서 사용함)을 사용하여 제조하였다. 이렇게 하기 위해, 나노입자를 PLA-PEG-OMe (Mn( NMR )=34820 g.mol-1) 및 PLA-PEG-폴산 (Mn(NMR)=32880 g.mol-1)의 혼합물로부터 제조하였다.
<표 7> SPR 실험에 사용된 나노입자의 특성화 데이터의 개요:
Figure 112014090700241-pct00071
PdI: 다분산 지수
폴산의 백분율은 각 제제에 사용된 PLA-PEG-폴산의 양, 및 알킨-폴산 및 PLA-PEG-N3 사이에 클릭 커플링의 수율로부터 계산되었다. 30% 초과의 폴산 공중합체 나노입자가 응집한다.
표면 플라즈몬 공명 실험:
새로 제조된 단백질-커버된 센서 칩 채널 상에서 모든 나노입자 현탁액을 시험하였다.
<표 8> 수행된 실험의 개요:
Figure 112014090700241-pct00072
FC = 유동 채널
RUFBP Immob = 고정된 FBP의 공명 단위
RUNanos = 고정된 나노입자의 공명 단위
Copo = 공중합체
PBS = 포스페이트 완충 염수
결과 분석:
각 샘플의 SPR 센소그램으로부터 수득된 신호의 최종 값을 나노입자 상의 폴산의 농도에 대하여 그래프 상에 플로팅하였다 (도 4).
따라서, 이 그래프는 나노입자의 표면 상의 폴산의 농도에 대한 특이적 신호의 진전을 나타낸다. 12%에서 최대에 도달하며, 여기서 특이적 신호는 전체 신호의 대략 70%를 나타낸다. 12% 이후에는, 특이적 신호가 감소하고 있다. 이것은 상이한 폴산 모이어티 사이의 일부 적층으로 인한 것이어서 더 우수한 상호작용을 방해할 수 있다. 비-특이적 신호는 그의 표면 상에 어떠한 폴산도 갖지 않는 나노입자에 대한 값으로 주어진다.
이것이 상기 표의 처음 7개 라인에서 나타낸 바와 같이, 어떠한 나노입자가 참조 채널 내에 주입되든지 상관없이, 어떠한 신호도 수득되지 않는다. 따라서, 원래의 코팅 표면 (덱스트란)은 나노입자의 어떠한 흡착도 유도하지 않는다.
비 특이성은 FBP를 갖는 나노입자의 PEG 코팅에 확실히 기인한다.
실시예 4: 세포독성
실시예 4a: PLA-PEG-폴산 나노입자의 세포독성
이들 나노입자를 시험하기 위해, KB-3-1 세포주 (인간 자궁경부 암종, DSMZ (저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘스 앤드 셀 컬쳐스(German collection of microorganisms and cell cultures), 카탈로그 코드: ACC 158)가 폴레이트 수용체를 발현하기 때문에 이를 사용하였다.
세포 배양:
이는 단층으로 성장하는 부착 세포주이고, 세포를 배양하여 폴레이트 수용체의 과다-발현을 유도하였다. 37℃에서 5% CO2 가습 분위기에서 폴레이트 수용체의 과다-발현을 위해 사용된 배지는, L-글루타민 (200 mM, 0.584 g/L, 바이오휘태거(BioWhittaker), 론자(Lonza)) 및 중탄산나트륨 (3.7 g/L, 시그마-알드리치)을 첨가하고 1% 페니실린/스트렙토마이신 (론자) 및 10% 태아 소 혈청 (FBS, 론자)으로 보충된 DMEM 2429 (폴산 없는 배지)였다.
사용된 나노입자:
폴산 나노입자 및 대조군 나노입자 (폴산 없음)를 갖는 것을 목적으로 하여, 나노입자의 2종의 상이한 현탁액을 이전에 기재된 프로토콜 (플루로닉®를 안정화제로서 사용함)을 사용하여 제조하였다.
이렇게 하기 위해, 나노입자를 PLA-PEG-OMe (Mn( NMR )=34820 g.mol-1; 중량 중 70% 또는 100%) 및 PLA-PEG-폴산 (Mn( NMR )=32880 g.mol-1; 각각 중량 중 30% 또는 0%)의 혼합물로부터 제조하였다.
<표 9> 세포독성 검정에 사용된 나노입자의 특성화 데이터의 개요:
Figure 112014090700241-pct00073
세포독성 검정 방법론:
96웰 플레이트에서, 배양 배지 (상기 기재된 바와 같음) 50 μL 중에 희석된 5x102개 세포를 웰당 침착시켰다. 세포 인큐베이터에서 24시간 후에, 다양한 공중합체 농도 (0.5, 0.1, 0.05, 0.01 mg/mL)의 나노입자를 함유하는 PBS 완충제 50 μL를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 48시간 동안 세포 인큐베이터 (5% CO2, 37℃)에서 정치되도록 하였다. 이어서, (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포-페닐)-2H-테트라졸륨) (MTS, 셀타이터(CellTiter) 96® AQueous 비-방사성 세포 증식 검정 (프로메가(Promega))에 포함된 테트라졸륨 화합물) 20 μL를 첨가하고, 플레이트를 세포 인큐베이터에서 3시간의 인큐베이션 후에 492 nm에서 마이크로플레이트 판독기 (랩시스템 멀티스캔 MS(Labsystem Multiscan MS), 유형 352)로 분석하였다.
데이터를 배양 배지 50 μL 및 PBS 완충제 50 μL 중 단 5x102개 세포를 함유하는 웰과 비교하였고, 이는 MTS 20 μL로 밝혀졌다. 모든 데이터로부터 배양 배지 50 μL 및 PBS 완충제 50 μL 중 적절한 농도의 나노입자로 이루어진 백그라운드를 제거하였고, 이는 MTS 20 μL로 밝혀졌다. 실험을 삼중으로 수행하였다.
플롯은 살아있는 세포의 백분율 함수로서 표현하였고, 100%는 단지 세포 및 MTS만을 함유한 웰이다.
결과:
셀타이터 96® AQueous 원 솔루션(CellTiter 96® AQueous One Soution) 세포 증식 검정 (프로메가)으로 수행되는 실험은 도 5a에 예시된다.
심지어 고농도에서도, 폴산의 존재 또는 부재에 상관없이, 나노입자는 폴레이트 수용체를 과다-발현하는 KB-3-1 세포에 대한 어떠한 세포독성도 유발하지 않았다.
실시예 4b: PLA-PEG-아니스아미드 나노입자의 세포독성
이들 나노입자를 시험하기 위해, PC-3 세포주 (인간 전립선 선암종, ATCC (번호: CRL-1435))가 아니스아미드 모이어티가 결합할 수 있는 시그마 수용체를 발현하기 때문에 이를 사용하였다.
세포 배양:
이 부착 세포주를 1% 페니실린/스트렙토마이신 (론자) 및 10% 태아 소 혈청 (FBS, 론자)으로 보충된 RPMI 1640 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)) 중에서 37℃에서 5% CO2 가습 분위기에서 배양하였다. 이 세포주는 시그마 수용체를 과다-발현한다. 85-90% 전면생장률의 배양물을 모든 실험에 대해 사용하였다. 세포를 트립신처리하고 (트립신-EDTA, 인비트로젠(Invitrogen), 깁코(Gibco)), 카운팅하고, 생존 연구를 위해 96-웰 플레이트에 계대-배양하였다. 세포를 실험에 사용하기 전 24시간 동안 부착되도록 하였다.
사용된 나노입자:
형광 아니스아미드 나노입자 및 대조군으로서의 형광 나노입자 (아니스아미드 없음)을 갖는 것을 목적으로 하여, 나노입자의 2종의 상이한 현탁액을 이전에 기재된 프로토콜 (플루로닉®를 안정화제로서 사용함)을 사용하여 제조하였다.
이렇게 하기 위해, 나노입자를 PLA-PEG-FP547 (Mn( NMR )=34820 g.mol-1; 제제 둘 다에서 중량 중 10%), PLA-PEG-OMe (Mn( NMR )=34820 g.mol-1; 중량 중 45% 또는 90%) 및 PLA-PEG-아니스아미드 (Mn( NMR )=37060 g.mol-1; 각각 중량 중 45% 또는 0%)의 혼합물로부터 제조하였다.
<표 10> 세포독성 검정에 사용된 나노입자의 특성화 데이터의 개요:
Figure 112014090700241-pct00074
세포독성 검정 방법론:
96웰 플레이트에서, 배양 배지 (상기 기재된 바와 같음) 50 μL 중에 희석된 5x103개 세포를 웰당 침착시켰다. 세포 인큐베이터에서 24시간 후에, 다양한 공중합체 농도 (5, 2.5, 0.5, 0.05 mg/mL)의 나노입자를 함유하는 PBS 완충제 50 μL를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 48시간 동안 세포 인큐베이터 (5% CO2, 37℃)에서 정치되도록 하였다. 이어서, (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포-페닐)-2H-테트라졸륨) (MTS, 셀타이터 96® AQueous 비-방사성 세포 증식 검정, 프로메가에 포함된 테트라졸륨 화합물) 20 μL를 첨가하고, 플레이트를 세포 인큐베이터에서 3시간의 인큐베이션 후에 492 nm에서 마이크로플레이트 판독기 (랩시스템 멀티스캔 MS, 유형 352)로 분석하였다.
데이터를 배양 배지 50 μL 및 PBS 완충제 50 μL 중 단 5x103개 세포를 함유하는 웰과 비교하였고, 이는 MTS 20 μL로 밝혀졌다. 모든 데이터로부터 배양 배지 50 μL 및 PBS 완충제 50 μL 중 적절한 농도의 나노입자로 이루어진 백그라운드를 제거하였고, 이는 MTS 20 μL로 밝혀졌다. 실험을 삼중으로 수행하였다.
플롯은 살아있는 세포의 백분율 함수로서 표현하였고, 100%는 단지 세포 및 MTS만을 함유한 웰이다.
결과:
셀타이터 96® AQueous 원 솔루션 세포 증식 검정 (프로메가)으로 수행되는 실험은 도 5b에 예시된다.
심지어 적어도 5 mg/mL까지의 고농도에서도, 아니스아미드의 존재 또는 부재에 상관없이, 형광 나노입자는 시그마 수용체를 발현하는 PC-3 세포 상에서 어떠한 세포독성도 유발하지 않았다.
실시예 5: PLA-PEG-폴산 나노입자의 세포 침투 검정
이들 나노입자를 시험하기 위해, KB-3-1 세포주 (인간 자궁경부 암종, DSMZ (저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘스 앤드 셀 컬쳐스, 카탈로그 코드: ACC 158)가 폴레이트 수용체를 발현하기 때문에 이를 사용하였다.
세포 배양:
이는 단층으로 성장하는 부착 세포주이고, 이를 배양하여 폴레이트 수용체의 과다-발현을 유도하였다. 37℃에서 5% CO2 가습 분위기에서 폴레이트 수용체의 과다-발현을 위해 사용된 배지는, L-글루타민 (200 mM, 0.584 g/L, 바이오휘태거, 론자) 및 중탄산나트륨 (3.7 g/L, 시그마-알드리치)을 첨가하고 1% 페니실린/스트렙토마이신 (론자) 및 10% 태아 소 혈청 (FBS, 론자)으로 보충된 DMEM 2429 (폴산 없는 배지)였다.
사용된 나노입자:
형광 폴산 나노입자 및 대조군으로서의 형광 나노입자 (폴산 없음)를 갖는 것을 목적으로 하여, 나노입자의 2종의 상이한 현탁액의 3개 배치를 이전에 기재된 프로토콜 (플루로닉®룰 안정화제로서 가짐)을 사용하여 제조하였다. 이렇게 하기 위해, 나노입자를 PLA-PEG-FP547 (Mn( NMR )=34820 g.mol-1), PLA-PEG-OMe (Mn( NMR )=34820 g.mol-1) 및 PLA-PEG-폴산 (Mn( NMR )=32880 g.mol-1)의 혼합물로부터 제조하였다.
제1 배치 (S1', S2')를 제2 배치 (S3', S4') 23일 전에 및 제3 배치 (S5', S6') 34일 전에 제조하였다.
<표 11> 세포독성 검정에 사용된 나노입자의 특성화 데이터의 개요:
Figure 112014090700241-pct00075
형광-활성화 세포 분류 (FACS) 방법론:
폴레이트 수용체 (상기 언급된 바와 같음)를 과다-발현하기 위해 배지 중에 배양된 KB-3-1 세포주를 24웰 플레이트에서 거의 전면생장 (~300000개 세포/웰)까지 성장하도록 하였다. 이어서, 배양 배지를 제거하고, 동일한 배양 배지에 ~60 μg/mL의 최종 농도로 희석된 나노입자 1mL를 다양한 양의 시간 (10분 내지 24시간) 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 이후에, 배양 배지를 제거하고, 각 웰을 PBS 완충제 (1mL)로 2회 세척하고, 세포를 트립신 (200μL, 3분)으로 탈착시켰다. 이어서, 트립신을 배양 배지 (800μL)로 중화시키고, 세포를 원심분리하였다 (5분, 1000g). 상청액을 제거하고, 세포를 PBS (1mL) 중에 재현탁시키고, 원심분리하고 (5분, 1000g), 최종적으로 파라포름알데히드 (200μL, PBS 중 1%)를 사용하여 회수하였다.
유동 세포측정법 연구는 561 nm의 여기 파장 및 575 내지 589nm에서 회수된 방출 신호를 갖는 BD LSRFortessa 세포 분석기를 사용하여 달성하였다.
결과:
FACS 실험으로부터 수득된 결과는 도 6a 및 6b에 예시된다.
폴산이 나노입자 (S3')의 표면에 존재하는 경우에, 이는 폴산이 없는 나노입자 (S4')보다 115배 더 내재화되는 것으로 관찰되었다. 또한, 정체기가 인큐베이션 6 내지 10시간에 도달하는 것으로 관찰되었다.
또한, 동일한 결과가 1개월 경과, 10일 경과 또는 1일 경과된 배치를 사용하여 수득될 수 있는 것으로 관찰되었다. 따라서, 폴산 나노입자가 시간 내에 안정하고, 폴산 모이어티가 나노입자의 표면에 남아있는 것으로 판단될 수 있다.
실시예 6: 도세탁셀 (DTX)의 PLA-PEG-아니스아미드 나노입자 내로의 캡슐화
도세탁셀을 캡슐화하기 위해, 나노입자의 제조를 위해 이전에 언급된 동일한 프로토콜을 사용하였다. 삼중수소화 도세탁셀을 약물 로딩 및 포착 효율을 평가하는 방법에 사용하였다.
에틸 아세테이트 1.2 mL 중에 희석된 공중합체 (PLA-PEG-OMe (Mn( NMR )=34820 g.mol-1; 중량 중 60%) 및 PLA-PEG-아니스아미드 (Mn( NMR )=37060 g.mol-1; 중량 중 40%)의 혼합물) 30 mg에 DTX 2.8 mg (3.24 μmol; 861.9 g.mol-1) 및 3H-DTX 4 nmol (5.38x105 Bq)을 첨가하였다. 이 유기 상을 플루로닉 F68의 수용액 (1 wt/v%) 3.3 mL와 혼합하였다. 2개 상을 1분 동안 와류로 격렬하게 진탕시키고, 이어서 3분 동안 프로브로 초음파처리하였다. 이후에, 유기 상을 감압 하에 제거하고, 생성된 수성 상을 1μm 유리 필터를 통해 여과한 후에, 초-원심분리하였다 (30분, 30000g). 상청액을 제거하고, 나노입자를 PBS 완충제 (10 mL) 내로 재현탁시키고, 1 μm 유리 필터를 통해 여과하였다.
결과:
상청액 및 NP 용액을 4.3%의 약물 로딩 및 46%의 포착 효율을 계산하는 것을 가능하게 하는 베크만 베타 카운터(Beckman beta counter)로 카운팅하였다.
실시예 7: 사전형성된 PLA-PEG-N3 나노입자 상에서 클릭 화학을 수행하기 위한 수성 조건에서의 휘스겐 반응을 위한 전형적 절차
<표 12>
Figure 112014090700241-pct00076
실험 절차:
이전에 기재된 프로토콜에 따라 제조되고 폴리(비닐 알콜) (PVA) (1% w/v)로 안정화된 나노입자 (PLA-PEG-N3 (20% w/w) 및 PLA-PEG-OMe (80% w/w)로 제조됨)의 현탁액에 PEG-알킨 (아지도 기와 비교하여 2 당량), CuSO4.5H2O 및 아스코르브산나트륨 (과량)을 첨가하였다.
반응 혼합물을 24시간 동안 교반하였다.
최종적으로, 현탁액을 20000 Da 컷오프를 갖는 셀룰로스 막 (스펙트럼랩스(SpectrumLabs))을 사용하여 물에 대해 투석하였다.
관찰:
NP 현탁액의 크기는 클릭 방법 동안 안정한 상태로 남아있다:
Z-평균= 198.5 nm 및 PdI=0.09
유사한 방식으로, 다른 리간드 (예를 들어, 형광 리간드...)는 상기 기재된 방법론에 따라 나노입자에 결합될 수 있다.

Claims (37)

  1. 하기 화학식 A의 화합물.
    <화학식 A>
    Figure 112019078017850-pct00077

    상기 식에서,
    PLA는 하기 화학식을 갖는 폴리락트산 잔기를 나타내고;
    Figure 112019078017850-pct00102

    (상기 식에서,
    (3)은 PEG 모이어티에 대한 결합의 부착이고;
    m은 단위의 수이고 1 내지 500임)
    PEG는 하기 화학식을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 잔기를 나타내고;
    Figure 112019078017850-pct00103

    (상기 식에서,
    (4)는 -PLA에 대한 결합의 부착이고;
    (5)는
    Figure 112019078017850-pct00104
    의 질소 원자에 대한 결합의 부착이고;
    n은 단위의 수이고 1 내지 300임)
    링커 PEG'는 하기 화학식을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 잔기이며;
    Figure 112019078017850-pct00105

    (상기 식에서,
    n'는 단위의 수이고 1 내지 10이고;
    (1)은 -(CH2)-트리아졸 기에 대한 결합의 부착이고;
    (2)는 리간드에 대한 결합의 부착임)
    리간드는
    에스트로겐 수용체 길항제, 안드로겐 수용체 길항제, 폴산, 아니스아미드, 상응하는 표면 항원을 인식할 수 있는 항체, 종양 혈관신생 내피 상에 과다발현된 αvβ3 인테그린에 결합하는 RGD 서열, 히알루론산, 트랜스페린, 펩티드 표적화 유전자 벡터, 압타머 또는 종양 괴사 인자로부터 선택된 막 인식 리간드,
    산화철, 가돌리늄 착물, 인도시아닌 그린, 근적외선 형광 프로브 또는 양전자 방출체로부터 선택된 진단제/영상화제,
    산화철 나노입자, 금 나노입자 또는 방사선-활성화가능한 물질로부터 선택된 자극 반응성 물질,
    올리고펩티드로부터 선택된 도킹제,
    전사의 트랜스활성인자 (Transactivator of transcription: TAT) 서열, 페네트라틴, 폴리아르기닌 서열 또는 VP22 단백질 서열로부터 선택된 세포 침투제,
    코발아민, 코빈아미드, 로다네제 효소, 유기인 가수분해 효소, 날록손, 아트로핀 또는 특정한 독소를 인식하는 항체/항체 단편으로부터 선택된 해독제; 또는
    항생제, 항암제, 항바이러스제, 항염증제, 백신 항원 또는 식의약제로부터 선택된 약물
    로부터 선택된 관능성 리간드 잔기이다.
  2. 제1항에 따른 화학식 A의 하나 이상의 동일하거나 상이한 화합물을 포함하는 나노입자.
  3. 제2항에 있어서, 하기 화학식 I'의 하나 이상의 화합물을 추가로 포함하는 나노입자.
    <화학식 I'>
    Figure 112019078017850-pct00106

    상기 식에서, PLA 및 PEG는 화학식 A에서와 같이 정의되고, R은 H 또는 C1-C6 알킬이다.
  4. 제2항에 있어서, 항생제, 항암제, 항바이러스제, 항염증제, 백신 항원 또는 식의약제로부터 선택된 약물을 포함하는 나노입자.
  5. 제4항에 있어서, 약물이 세포독성제인 나노입자.
  6. 제4항에 있어서, 약물이 탁소이드인 나노입자.
  7. 제4항에 있어서, 약물이 도세탁셀인 나노입자.
  8. 제4항에 있어서, 약물이 나노입자로 비-공유 캡슐화된 것인 나노입자.
  9. 제4항에 있어서, 약물이 나노입자에 공유 접합된 것인 나노입자.
  10. - 하기 화학식 I의 화합물을
    <화학식 I>
    Figure 112019078017850-pct00107

    - 하기 화학식 XI의 화합물과
    <화학식 XI>
    Figure 112019078017850-pct00108

    (식 중, PLA, PEG, PEG' 및 리간드는 제1항에서와 같이 정의됨)
    커플링시키는 것을 포함하는, 제1항에 따른 화학식 A의 화합물의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 커플링을 클릭 화학에 의해 실시하는 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 커플링 반응을 유기 또는 수성 조건에서 휘스겐(Huisgen) 반응에 따라 수행하는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 클릭 화학 커플링 반응을 CuBr 및 PMDETA (N,N,N',N',N"-펜타메틸디에틸렌트리아민)의 존재 하에 수행하는 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 클릭 화학 커플링 반응을 물, CuSO4-5H2O 및 아스코르브산나트륨의 존재 하에 수행하는 것인 방법.
  15. 하기 화학식 I의 화합물.
    <화학식 I>
    Figure 112019078017850-pct00109

    상기 식에서, PLA 및 PEG는 제1항에 따라 정의된다.
  16. 제15항에 따른 화학식 I의 하나 이상의 동일하거나 상이한 화합물을 포함하는 나노입자.
  17. 제16항에 있어서, 하기 화학식 I'의 하나 이상의 화합물을 추가로 포함하는 나노입자.
    <화학식 I'>
    Figure 112019078017850-pct00110

    상기 식에서, PLA 및 PEG는 제1항에서와 같이 정의되고, R은 H 또는 C1-C6 알킬이다.
  18. 하기 화학식 II의 화합물을
    <화학식 II>
    Figure 112019078017850-pct00111

    (식 중, PEG는 제1항에서와 같이 정의되고, X는 할로겐 원자 또는 아지드 (N3)임)
    하기 화학식의 화합물과
    Figure 112019078017850-pct00112

    개환 중합 (ROP)에 의해 반응시키고, 이어서 X가 할로겐 원자인 경우에, 수득된 하기 화학식 III의 화합물을
    <화학식 III>
    Figure 112019078017850-pct00113

    (식 중, PLA 및 PEG는 제1항에서와 같이 정의되고, Hal은 할로겐 원자를 나타냄)
    NaN3과 반응시키는 단계
    를 포함하는, 제15항에 따른 화학식 I의 화합물의 제조 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 반응을 Sn(Oct)2의 존재 하에 수행하는 것인 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 하기 화학식 II의 화합물을
    <화학식 II>
    Figure 112019078017850-pct00114

    하기 화학식 IV의 화합물로부터
    <화학식 IV>
    Figure 112019078017850-pct00115

    (식 중, Pg는 히드록실 보호기를 나타내고, X는 할로겐 원자 또는 아지드 (N3)이고, PEG는 제1항에서와 같이 정의됨)
    - OH의 X로의 치환 반응, 이어서
    - 탈보호 반응
    에 의해 제조하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, X가 아지드 기이고, 치환 반응이
    1) 화학식 IV의 화합물의 OH 기를 이탈기로 치환하고,
    2) 단계 1)에서 수득된 화합물의 이탈기를 아지드 (N3) 기로 치환하는 것
    을 포함하는 것인 방법.
  22. 제16항 또는 제17항에 따른 나노입자를 화학식 XI의 하나 이상의 화합물과 반응시키는 것을 포함하고, 반응 후에 약물을 비-공유 캡슐화시키거나 또는 공유 접합시키는 것을 포함할 수 있는, 제1항에 따른 화학식 A의 하나 이상의 동일하거나 상이한 화합물을 포함하는 나노입자의 제조 방법.
    <화학식 XI>
    Figure 112019078017850-pct00116

    상기 식에서, PEG' 및 리간드는 제1항에서와 같이 정의된다.
  23. 제1항에 따른 화학식 A의 하나 이상의 화합물을 화학식 I'의 화합물의 존재 하에 또는 부재 하에 나노침전시키는 것을 포함하고, 침전 후에 약물을 비-공유 캡슐화시키거나 또는 공유 접합시키는 것을 포함할 수 있는, 제1항에 따른 화학식 A의 하나 이상의 동일하거나 상이한 화합물을 포함하는 나노입자의 제조 방법.
    <화학식 I'>
    Figure 112019078017850-pct00117

    상기 식에서, PLA 및 PEG는 제1항에 따른 화학식 A에서와 같이 정의되고, R은 H 또는 C1-C6 알킬이다.
  24. 제15항에 따른 화학식 I의 하나 이상의 화합물을 화학식 I'의 화합물의 존재 하에 또는 부재 하에 나노침전시키는 것을 포함하는 제16항 또는 제17항에 따른 나노입자의 제조 방법.
    <화학식 I'>
    Figure 112019078017850-pct00118

    상기 식에서, PLA 및 PEG는 제1항에 따른 화학식 A에서와 같이 정의되고, R은 H 또는 C1-C6 알킬이다.
  25. 제1항에 따른 화학식 A의 하나 이상의 화합물을 포함하는 의약으로서, 화학식 A의 화합물이 제1항에 따른 화학식 A의 하나 이상의 동일하거나 상이한 화합물을 포함하는 나노입자 형태일 수 있는 의약.
  26. 활성 성분으로서의 제1항에 따른 화학식 A의 화합물 및 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물로서, 화학식 A의 화합물이 제1항에 따른 화학식 A의 하나 이상의 동일하거나 상이한 화합물을 포함하는 나노입자의 형태일 수 있는 제약 조성물.
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Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10056907B1 (en) 2011-07-29 2018-08-21 Crossbar, Inc. Field programmable gate array utilizing two-terminal non-volatile memory
EP2827913B1 (en) * 2012-03-19 2020-09-02 Neomend, Inc. Co-precipitation method
CN103627386B (zh) * 2013-12-04 2016-04-20 哈尔滨师范大学 一种荧光探针叶酸功能化的荧光金纳米簇的制备方法
US9228044B2 (en) 2014-04-02 2016-01-05 International Business Machines Corporation Versatile, facile and scalable route to polylactic acid-backbone graft and bottlebrush copolymers
US9458268B2 (en) 2014-04-02 2016-10-04 International Business Machines Corporation Lactide-functionalized polymer
CN105111265B (zh) * 2014-08-28 2018-04-06 成都先导药物开发有限公司 一种使用“一锅法”标记修饰生物大分子的方法
US9187597B1 (en) 2014-10-21 2015-11-17 International Business Machines Corporation Flame-retardant polylactic acid (PLA) by grafting through of phosphorus-containing polymers directly to PLA backbone
US9505858B2 (en) 2014-10-21 2016-11-29 International Business Machines Corporation Polylactic acid (PLA) with low moisture vapor transmission rates by grafting through of hydrophobic polymers directly to PLA backbone
US9193818B1 (en) 2014-10-29 2015-11-24 International Business Machines Corporation Toughened polylactic acid (PLA) by grafting through of impact-modifying polymers directly to PLA backbone
KR102368068B1 (ko) 2015-08-24 2022-02-25 삼성전자주식회사 반도체 소자 제조용 조성물 및 이를 이용하는 반도체 소자의 제조 방법
EP3377047A1 (en) * 2015-11-20 2018-09-26 Cristal Delivery B.V. Nanoparticles with active targeting
CN108472120B (zh) * 2015-11-30 2022-02-25 阿莱奥Bme公司 用于生物医学应用的聚合物材料
KR101630397B1 (ko) * 2015-12-31 2016-06-24 한국과학기술원 항암제-인도시아닌 그린-리포좀 복합체를 포함하는 암 치료용 조성물
US10822355B2 (en) * 2016-10-10 2020-11-03 University Of Massachusetts Ultralow-power near infrared lamp light operable targeted organic nanoparticle photodynamic therapy
CN108358995B (zh) * 2017-01-25 2021-07-06 四川大学 CP-iRGD多肽、iDPP纳米粒、载药复合物及其制备方法和应用
CN109010287A (zh) * 2018-02-05 2018-12-18 上海交通大学医学院附属第九人民医院 内耳疾病诊断、预防或治疗药物及其制备方法
CN109738387A (zh) * 2018-12-29 2019-05-10 佛山科学技术学院 一种基于吲哚箐绿的光学相干层析成像方法和装置
US11471412B1 (en) 2019-05-10 2022-10-18 University Of South Florida Nanoparticles and nanogel drug compositions for treatment of age-related macular degeneration
CN110128665B (zh) * 2019-05-13 2021-03-26 苏州大学 基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物近红外荧光探针及应用
GB2599573A (en) * 2019-05-31 2022-04-06 Rhogen Biotech Llc Compositions and methods for detoxifying bacterial endotoxins
US20220378696A1 (en) * 2019-10-16 2022-12-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Target delivery of non-biologics through nanotechnology for tissue repair
CN111253556B (zh) * 2020-03-20 2022-02-18 南京工业大学 一种功能化可回收高分子均聚物及其制备方法与应用
CN111888333A (zh) * 2020-08-11 2020-11-06 深圳大学 一种转铁蛋白受体靶向的纳米胶束及其制备方法与应用
WO2022063209A1 (zh) * 2020-09-25 2022-03-31 亭创生物科技(上海)有限公司 一种官能化双嵌段共聚物及其制备方法和用途
AU2021370647A1 (en) 2020-10-27 2023-06-08 Elucida Oncology, Inc. Folate receptor targeted nanoparticle drug conjugates and uses thereof
KR102430034B1 (ko) * 2021-02-18 2022-08-05 포항공과대학교 산학협력단 일산화질소 감응성 하이드로겔
CN112920396B (zh) * 2021-02-26 2023-02-24 商丘师范学院 一种端羟基高含氧量高柔顺性叠氮聚合物的合成方法
CN114813998B (zh) * 2022-03-24 2023-05-23 天津键凯科技有限公司 一种聚合物的检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004085712A2 (en) 2003-03-24 2004-10-07 Penn State Research Foundation Multi-functional polymeric materials and their uses
US20050118252A1 (en) 2003-09-22 2005-06-02 University Of Utah To University Of Utah Research Foundation: Tumor environment-induced ligand-expressing nanocarrier system
WO2011013616A1 (ja) 2009-07-27 2011-02-03 東京エレクトロン株式会社 選択酸化処理方法、選択酸化処理装置およびコンピュータ読み取り可能な記憶媒体
WO2011046946A2 (en) * 2009-10-13 2011-04-21 Yale University Bifunctional molecules with antibody-recruiting and entry inhibitory activity against the human immunodeficiency virus

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2678168B1 (fr) * 1991-06-28 1993-09-03 Rhone Poulenc Rorer Sa Nanoparticules ayant un temps de capture par le dysteme reticulo endothelial allonge.
US5612052A (en) * 1995-04-13 1997-03-18 Poly-Med, Inc. Hydrogel-forming, self-solvating absorbable polyester copolymers, and methods for use thereof
US6908963B2 (en) * 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
CN1290893C (zh) * 2002-05-03 2006-12-20 詹森药业有限公司 聚合物微乳状液
RU2326655C1 (ru) * 2006-11-09 2008-06-20 Федеральное государственное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации" Способ инкапсулирования белоксодержащих веществ в микросферы из сополимера полилактид-полигликолид
US9056129B2 (en) 2007-02-09 2015-06-16 Northeastern University Precision-guided nanoparticle systems for drug delivery
WO2010005740A2 (en) * 2008-06-16 2010-01-14 Bind Biosciences, Inc. Methods for the preparation of targeting agent functionalized diblock copolymers for use in fabrication of therapeutic targeted nanoparticles
US20110177619A1 (en) * 2008-07-14 2011-07-21 Andrew Metters In vitro diagnostic markers comprising carbon nanoparticles and kits
US20110171248A1 (en) * 2010-01-08 2011-07-14 Selecta Biosciences, Inc. Synthetic virus-like particles conjugated to human papillomavirus capsid peptides for use as vaccines
EA023397B1 (ru) * 2010-05-26 2016-05-31 Селекта Байосайенсиз, Инк. Комбинированные вакцины с синтетическими наноносителями
US20120064110A1 (en) * 2010-08-20 2012-03-15 Selecta Biosciences, Inc. Synthetic nanocarrier vaccines comprising peptides obtained or derived from human influenza a virus hemagglutinin

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004085712A2 (en) 2003-03-24 2004-10-07 Penn State Research Foundation Multi-functional polymeric materials and their uses
US20050118252A1 (en) 2003-09-22 2005-06-02 University Of Utah To University Of Utah Research Foundation: Tumor environment-induced ligand-expressing nanocarrier system
WO2011013616A1 (ja) 2009-07-27 2011-02-03 東京エレクトロン株式会社 選択酸化処理方法、選択酸化処理装置およびコンピュータ読み取り可能な記憶媒体
WO2011046946A2 (en) * 2009-10-13 2011-04-21 Yale University Bifunctional molecules with antibody-recruiting and entry inhibitory activity against the human immunodeficiency virus

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Appl. Polym. Sci. 129:480-486 (2013)

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