KR102430034B1 - 일산화질소 감응성 하이드로겔 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일산화질소 감응성 하이드로겔에 관한 것으로, 상기 하이드로겔은 클릭화학 반응에 의해 표적부위에서 제자리부합하여 형성되고, 일산화질소에 감응하는 가교제를 이용하여 제조되므로 표적부위에 과발현된 일산화질소를 효과적으로 포집하여 소거할 수 있으며, 나아가 하이드로겔에 담지된 약물은 치료가 필요한 표적부위에 국소적이며 선택적으로 방출될 수 있으므로 일산화질소의 과발현으로 인해 발생하는 염증성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

일산화질소 감응성 하이드로겔{NITRIC OXIDE SENSITIVE HYDROGEL}
본 발명은 일산화질소 감응성 하이드로겔에 관한 것으로, 상기 하이드로겔은 클릭화학 반응에 의해 표적부위에서 제자리부합하여 형성되고, 일산화질소에 감응하는 가교제를 이용하여 제조되므로 표적부위에 과발현된 일산화질소를 효과적으로 포집하여 소거할 수 있으며, 나아가 하이드로겔에 담지된 약물은 치료가 필요한 표적부위에 국소적이며 선택적으로 방출될 수 있으므로 일산화질소의 과발현으로 인해 발생하는 염증성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
일산화질소(nitric oxide)는 수초 이내의 짧은 반감기를 가지는 반응성이 높은 라디칼 분자이며, 인체의 여러 세포에서 발생하고, 인체 내부에서 농도에 따라 신경전달, 혈관확장, 항암효과 등 다양한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.
2010년대 후반부터 일산화질소의 과분비로 인한 염증성 질환을 완화 또는 치료하기 위해 질환 부위에 과생성되어 있는 일산화질소를 국소적으로, 그리고 선택적으로 포집하려는 시도가 활발히 진행되고 있다.
이러한 시도에 따라 주사 용이성을 위한 나노미터 사이즈 기반의 기술들이 개발되어 왔지만, 주사부위 외 다른 장기로의 빠른 확산 및 제거로 인한 문제점이 있었다. 예를들면, 일산화질소는 정상 범위에서 생체 내 중요한 역할을 하므로 일산화질소를 비특이적으로 제거하면 전신 독성과 같은 수많은 부작용을 유발할 수 있으며, 만성 염증성 질환 중 하나인 류마티스 관절염의 경우, 연골 주사를 일년에 최대 3-4회 접종하기 때문에, 질환 부위 외 다른 장기로의 빠른 확산 및 제거가 유발될 수 있는 기술은 바람직하지 않다.
한편, 류마티스 관절염은 다발성 관절염을 특징으로 하는 원인 불명의 만성 염증성 질환이다. 초기에는 관절을 싸고 있는 활막에 염증이 발생하지만 점차 주위의 연골과 뼈로 염증이 퍼져 관절의 파괴와 변형을 초래하게 된다. 관절뿐만 아니라 관절 외 증상으로 빈혈, 건조증후군, 피하 결절 폐섬유화증, 혈관염, 피부 궤양 등 전신을 침범할 수 있는 질환이다.
류마티스 관절염의 정확한 원인은 아직 밝혀지지 않았지만 자가면역현상이 주요 기전으로 알려져 있다. 자가면역이란 외부로부터 인체를 지키는 면역계의 이상으로 오히려 자신의 인체를 공격하는 현상이다. 일반적으로는 유전적 소인, 세균이나 바이러스 감염 등이 류마티스 관절염의 원인으로 생각되고 있다.
이러한 류마티스 관절염은 관절의 종창, 염증, 경직, 동통을 수반하며, 전신의 다발성 관절염의 병상을 보이는 난치성 자기면역 질환으로 해당 질환을 가진 환자에게 많은 고통을 발생시킨다.
따라서, 표적부위에서 국소적으로 장기간 일산화질소를 포집할 수 있고, 나아가 일산화질소에 감응하여 질환의 악화 정도에 따라 치료제를 함께 전달하여 일산화질소의 과발현과 관련된 질환을 완화 또는 치료할 수 있는 새로운 기술이 필요하다.
본 발명자들은 일산화질소 감응성 하이드로겔이 체내 과생산된 일산화질소를 국소적으로 포집하여 소거할 수 있으며, 나아가 상기 하이드로겔에 담지된 약물을 일산화질소에 감응하여, 일산화질소의 농도에 따라 질환 부위에 국소적이며 선택적으로 방출할 수 있어 염증성 질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다는 점을 입증하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물로부터 제조되는 제자리부합(in situ hybridization) 하이드로겔을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112021019873252-pat00001
[화학식 2]
Figure 112021019873252-pat00002
[화학식 3]
Figure 112021019873252-pat00003
여기서,
상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1-C10 알킬렌이고,
상기 n 및 m은 각각 1 내지 1000의 정수이다.
본 발명은 상기 화학식 1에서 R1 및 R2는 C2 알킬렌인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 하이드로겔은 일산화질소를 포집하여 소거하는 것인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 하이드로겔이 일산화질소와 반응하여 분해되는 것인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 화학식 2로 표시되는 화합물이 자가조립에 의해 마이셀 구조체를 형성하는 것인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 마이셀 구조체가 10 내지 1000 nm의 균일한 직경을 갖는 것인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 마이셀 구조체가 하이드로겔의 망상구조에 고정되어 있는 것인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 하이드로겔이 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 상기 화학식 2 및 3으로 표시되는 화합물 간의 클릭화학 반응에 의해 제조되는 것인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 하이드로겔이 소수성 약물을 더 포함하는 것인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 소수성 약물이 상기 화학식 2로 표시되는 화합물의 자가조립에 의해 형성된 마이셀 구조체에 담지된 것인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 소수성 약물이 항염증제인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 항염증제가 덱사메타손인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 소수성 약물이 상기 마이셀 구조체 전체 중량 대비 3 내지 7 중량%로 함유된 것인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 하이드로겔이 소수성 약물 및 친수성 약물을 더 포함하는 것인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 소수성 약물 및 친수성 약물이 표적부위에서 동시에 방출되는 것인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 소수성 약물의 방출은 침식-기반(erosion-based) 방출로 인한 것이며, 상기 친수성 약물의 방출은 피키언(Fickian) 확산으로 인한 것인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 화학식 1 내지 3의 화합물이 표적부위에 동시-주사(co-injection)되는 것인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 동시-주사가 이중 주사기 시스템(dual syringe system)에 의한 것인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 하이드로겔이 상기 화학식 1 내지 3의 화합물을 표적부위에 주사 후 0.5 내지 10분 이내 형성되는 것인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 하이드로겔이 염증성 질환 치료용인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 염증성 질환이 생체 내 일산화질소가 과생산되는 양상을 나타내는 질환인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 염증성 질환이 류마티스 관절염인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 하이드로겔이 TNF-α 및 IL-6 수준을 감소시키는 것인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 하이드로겔이 점성보충제용인 제자리부합 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물을 포함하는 제자리부합 하이드로겔 전구체 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 조성물이 소수성 약물을 더 포함하는 것인 제자리부합 하이드로겔 전구체 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 소수성 약물이 상기 화학식 2로 표시되는 화합물의 자가조립에 의해 형성된 마이셀 구조체에 담지된 것인 제자리부합 하이드로겔 전구체 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 조성물이 소수성 약물 및 친수성 약물을 더 포함하는 것인 제자리부합 하이드로겔 전구체 조성물을 제공한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 제자리부합(in situ hybridization) 하이드로겔 제조방법을 제공한다.
a) 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 포함하는 제1 전구체 조성물을 제조하는 단계;
b) 하기 화학식 2로 표시되는 화합물로부터 형성된 마이셀 구조체를 포함하는 제2 전구체 조성물을 제조하는 단계; 및
c) 상기 제1 전구체 조성물 및 제2 전구체 조성물을 동시-주사하는 단계.
[화학식 1]
Figure 112021019873252-pat00004
[화학식 2]
Figure 112021019873252-pat00005
[화학식 3]
Figure 112021019873252-pat00006
여기서,
상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1 내지 C10의 알킬렌이고,
상기 n 및 m은 각각 1 내지 1000의 정수이다.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 제1 전구체 조성물 전체 질량 대비 0.02 내지 0.06 wt%; 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 제2 전구체 조성물 전체 질량 대비 1.00 내지 3.00 wt%; 및 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은 제1 전구체 조성물 전체 질량 대비 1.00 내지 1.50 wt%;로 포함하는 제자리부합 하이드로겔 제조방법을 제공한다.
본 발명은 상기 제2 전구체 조성물이 소수성 약물을 더 포함하는 것인 제자리부합 하이드로겔 제조방법을 제공한다.
본 발명은 상기 제1 전구체 조성물이 친수성 약물을 더 포함하고, 제2 전구체 조성물은 소수성 약물을 더 포함하는 것인 제자리부합 하이드로겔 제조방법을 제공한다.
본 발명은 상기 소수성 약물이 마이셀 구조체에 담지된 것인 제자리부합 하이드로겔 제조방법을 제공한다.
본 발명은 상기 동시-주사가 이중 주사기 시스템(dual syringe system)에 의한 것인 제자리부합 하이드로겔 제조방법을 제공한다.
이하 이를 구체적으로 설명한다. 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합은 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기의 구체적인 서술에 의해 본 발명 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명은 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물로부터 제조되는 제자리부합(in situ hybridization) 하이드로겔을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112021019873252-pat00007
[화학식 2]
Figure 112021019873252-pat00008
[화학식 3]
Figure 112021019873252-pat00009
여기서,
상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1-C10 알킬렌이고,
상기 n 및 m은 각각 1 내지 1000의 정수이다.
본 발명에서 “Cx-Cy”(여기서 x, y는 1 이상의 정수)는 탄소 개수를 의미한다. 예를 들면, C1-C10 알킬렌은 1 이상 10 이하의 탄소수를 가지는 알킬렌을 의미하며, C1-C10 알킬은 1 이상 10 이하의 탄소수를 가지는 알킬을 의미한다.
본 발명에서 “알킬”은 직쇄 또는 분지쇄 포화탄화수소기를 의미하는 것으로, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-디케닐 등을 포함한다.
본 발명에서 “알킬렌”은 상기 정의된 알킬로부터 유도된 2가의 작용기를 의미한다.
본 발명에서 “인 시츄(in situ)”는 “제자리” 또는 “원위치에서”와 교환되어 사용될 수 있고, “투여부위에서” 또는 “표적부위에서”를 의미한다.
본 발명에서 "제자리부합(in situ hybridization)"은 하이드로겔을 형성할 수 있는 전구체 물질들이 환자의 체내에 주입된 뒤, 원하는 체내의 조직, 기관 또는 체강 내의 표적부위에서 전구체 물질들의 결합에 의해 겔화가 일어나는 것을 의미한다.
본 발명에서 “환자”는 특정 상태 또는 질환의 치료를 필요로 하는 임의의 개체 또는 대상체를 의미하며, 포유류일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
본 발명의 제자리부합 하이드로겔은 이식을 위한 외과적인 시술을 필요로 하지 않고, 최소 침투 기술을 통하여 체내에서 단순히 전구체 물질들의 혼합을 통해 하이드로겔을 형성시키므로 치료를 받는 환자에게 편안함을 부여할 수 있으며, 체내 표적부위에 국소적이며 선택적으로 하이드로겔을 형성시킬 수 있어 특히 치료가 필요한 부위에 대한 치료 효과가 우수하다.
본 발명에서 화학식 1로 표시되는 화합물은 하이드로겔 형성에 있어서 가교제의 역할을 하는 것일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112021019873252-pat00010
(상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1-C10 알킬렌)
본 발명에서 "가교제"는 화합물을 서로 결합시켜 망상(network) 구조를 취하기 위한 물질을 의미하며, 본 발명의 실시예들에 의하면, 화학식 1로 표시되는 화합물은 상기 R1 및 R2가 C2 알킬렌인, 하기 DA-NOCCL로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
[DA-NOCCL]
Figure 112021019873252-pat00011
본 발명에서 화학식 1로 표시되는 화합물은 과생산된 일산화질소를 포집하여 소거하는 역할을 할 수 있으므로, 상기 화힉식 1로 표시되는 화합물을 사용하여 제조되는 본 발명의 하이드로겔은 체내 과생산된 일산화질소를 포집하여 소거하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 일산화질소에 감응하여 분해되는 것일 수 있으며, 상기 화힉식 1로 표시되는 화합물로부터 제조되는 본 발명의 하이드로겔은 일산화질소에 감응하여 분해되는 것일 수 있다.
본 발명에서 "감응(성)"은 어떠한 환경 조건에 민감하게 반응하는 것을 의미하며, 본 명세서에서 "감응(성)"과 "반응(성)"은 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
후술하는 실험예에서는 본 발명의 하이드로겔이 일산화질소를 흡수하여 팽창할 수 있음을 입증하여, 체내 과생산된 일산화질소를 포집하여 소거할 수 있고, 일산화질소의 과생산으로 인해 발생하는 질환을 효과적으로 치료할 수 있다는 점을 확인하였다. 또한, 본 발명의 하이드로겔이 일산화질소에 감응하여 분해될 수 있다는 점을 입증하여, 하이드로겔 망상구조 내에 결합되어 있는 마이셀 구조체를 질환이 발생한 부위에 선택적으로 방출할 수 있고, 상기 마이셀 구조체에 담지된 약물을 질환이 발생한 부위에 국소적이고, 선택적이며 집중적으로 전달할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 하이드로겔은 NO 농도 의존적으로 분해되는 정도가 달라질 수 있어, 질환의 중증도에 따라 약물방출의 조절이 가능함을 확인하였다.
본 발명에서 화학식 2로 표시되는 화합물은 PLA-b-PEG-N3 블록공중합체로도 지칭되며, 화학식 1로 표시되는 화합물의 알킨기와는 아자이드기를 통한 클릭화학 반응에 의해 결합할 수 있다.
[화학식 2]
Figure 112021019873252-pat00012
(상기 n 및 m은 각각 1 내지 1000의 정수)
상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 자가조립(self-assembly)에 의해 마이셀 구조체를 형성하는 것일 수 있다.
본 발명에서 “마이셀(micelle)”은 수용액 상에서 내부의 소수성 영역과 바깥쪽의 친수성 영역으로 구성되는 시스템을 의미하며, 본 발명에서는 화학식 2로 표시되는 화합물인 PLA-b-PEG-N3 블록공중합체를 사용하여 마이셀 구조체를 형성시켰다.
본 발명에서 마이셀 구조체는 소수성 약물을 담지하고 질환부위에 특이적으로 방출되어 과생산된 일산화질소로 인한 질환을 치료함에 있어서 복합적인 치료, 즉, 일산화질소 소거로 인한 치료 및 약물에 의한 치료를 가능하게 한다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 마이셀 구조체는 10 내지 1000 nm의 균일한 직경을 갖는 것일 수 있으며, 바람직하게는 70 내지 900 nm일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 70 내지 500 nm일 수 있다. 상기 범위 미만인 경우, 치료하고자 하는 질환 치료하기에 충분한 약물을 담지할 수 없을 수 있고, 상기 범위를 초과하는 경우, 주사 용이성 면에서 적합하지 않을 수 있다.
본 발명에서 상기 마이셀 구조체는 하이드로겔의 망상구조에 고정되어 있는 것일 수 있다. 상기 마이셀 구조체는 하이드로겔이 일산화질소에 감응하여 분해될 때 하이드로겔로부터 방출될 수 있고, 일산화질소가 과생산된 부위에 선택적으로 담지된 약물을 전달할 수 있다.
본 발명에서 화학식 3로 표시되는 화합물인 히알루론산 기반 고분자 체인은 HA-N3로도 지칭되며, 본 발명의 하이드로겔 백본(backbone)을 이루는 역할을 수행한다.
[화학식 3]
Figure 112021019873252-pat00013
(상기 n은 각각 1 내지 1000의 정수)
본 발명에서 상기 “히알루론산(hyaluronic acid)”은 글루크로닉산 및 아세틸글루코스아민으로 구성된 선형 폴리사카리드로서 세포외기질(extracellular matrix, ECM), 관절의 윤활액, 연골을 구성하는 지지체에 존재하는 글리코스아미노 글리칸 중의 하나이다. 가교된 히알루론산은 점탄성적인 성질로 인해 관절 윤활액으로서 사용할 수 있으며, 생체 내 적용 시 면역적인 측면에서도 문제가 없어 조직공학 및 약물전달시스템에 이용할 수 있는 우수한 생체적합성을 가진 재료이다.
본 발명에서 화학식 3으로 표시되는 화합물은 아자이드기를 통해 화학식 1로 표시되는 화합물의 알킨기와 클릭화학 반응에 의해 결합할 수 있다.
본 발명에서 하이드로겔은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 상기 화학식 2 및 3으로 표시되는 화합물 간의 클릭화학 반응에 의해 제조되는 것일 수 있다.
본 발명에서 "클릭화학(click chemistry)"은 생물의 복잡한 환경 중에 일어나는 맞춤형 반응으로, 특정한 조건 하에서 빠르고 효과적이고 동시에 예측 가능하게 결합시키는 유기합성에 대한 모듈적 접근을 의미한다. 예를 들어, 아자이드(azide)-알킨(alkyne) 고리첨가반응(cyclo addition)은 열역학적 추진력이 매우 높아 효율적이면서 높은 수율로 아자이드 화합물과 알킨 화합물의 결합을 형성할 수 있어 올리고머, 폴리머 등과 같은 고분자와의 반응에서도 높은 수율로 분자간 결합을 형성시킬 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 화학식 1로 표시되는 화합물의 알킨(alkyne)기와 화학식 2 로 표시되는 화합물의 아자이드기(azide, -N3)기; 및 화학식 1로 표시되는 화합물의 알킨(alkyne)기와 화학식 3으로 표시되는 화합물의 아자이드기(azide, -N3)기는 클릭화학 반응에 의해 각각 1,2,3-트리아졸(1,2,3-triazole)을 형성하며, 이로인해 본 발명의 마이셀 구조체를 포함하는 일산화질소 반응성 제자리부합 하이드로겔을 형성할 수 있다.
본 발명에서 하이드로겔은 생체활성물질을 포함함으로써, 과발현된 일산화질소에 의해 발생된 염증 또는 질환을 치료하는 효과를 더욱 높일 수 있다. 이러한 생체활성물질은 질병의 치료, 치유, 예방 또는 진단 등에 사용되는 물질 예를들어, 세포, 성장인자 및 호르몬과 같은 단백질 또는 펩타이드, 핵산, 세포외기질 물질 및 의약적으로 치료기능을 가지는 약물 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 특정 질병에 효과가 있는 것으로 알려진 생체활성물질이라면 제한없이 하이드로겔에 적용하여 치료효과를 높이는데 사용할 수 있다. 하이드로겔이 생체활성물질을 포함하도록 제조하기 위해, 생체활성물질을 어느 한 용액에 포함되도록 용액을 제조하고, 다른 용액과 표적부위에서 혼합하여 하이드로겔을 형성하도록 할 수 있다. 또한, 생체활성물질이 포함된 각각의 두가지 용액을 주사기를 사용하여 표적부위에서 혼합하여 하이드로겔을 형성하도록 할 수 있다.
본 발명에서 하이드로겔은 소수성 약물을 더 포함할 수 있으며, 상기 소수성 약물은 상기 화학식 2로 표시되는 화합물의 자가조립에 의해 형성된 마이셀 구조체에 담지된 것일 수 있다. 상기 마이셀 구조체는 수중에서 친수성 및 소수성 부분을 가지는 블록공중합체의 자가조립에 의해 형성되어 내부는 강한 소수성을 띠므로, 상기 마이셀 구조체 내부에는 소수성 약물이 담지되기 용이하고, 이는 약물 및 마이셀 구조체 내부가 모두 소수성을 나타내는 것에 기인한 물리적인 현상으로 화학적 결합으로 인한 약물 전달체 대비 약물 함유량을 늘릴 수 있다.
본 발명에서 “소수성”은 물과 혼화되지 않는 비극성 또는 저극성 물질을 포함하는 의미이나 이에 제한되지 않고, 본 발명의 마이셀 구조체의 소수성 내부에 안정하게 존재할 수 있는 물질이라면 모두 소수성 물질에 포함된다.
본 발명에서 소수성 약물은 진통제, 항염증제, 면역억제제 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 항염증제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 “항염증제”는 소염제로도 지칭되며, 염증을 없애는 성질을 가지고 있거나 염증 과정에 관여하여 이를 억제하는 약물을 의미한다.
상기 항염증제는 예를 들어, 21-아세톡시프레그네놀론, 알클로메타손, 알클로메타손 디프로피오네이트, 알게스톤, 암시노니드, 베클로메타손, 베타메타손, 베타메타손 디프로피오네이트, 베타메타손인산나트륨, 베타메타손 발레레이트, 부데소니드, 클로로프레드니손, 시클레소니드, 클로베타솔, 클로베타솔17-프로피오네이트, 클로베타손-17-부티레이트, 클로베타손, 클로코르톨론, 클로프레드놀, 코르티코스테론, 코르티손, 코르티손 아세테이트, 코르티바졸, 데플라자코르트, 데소니드, 데스옥시메타손, 덱사메타손, 덱사메타손 인산나트륨, 디플로라손, 디플루코르톨론, 디플루프레드네이트, 에녹솔론, 플루아자코르트, 플루클로로니드, 플루메타손, 플루오시노니드, 플루오시놀론, 플루오시놀론 아세토니드, 플루오시노니드, 플루오코르틴 부틸, 플루오코르톨론, 플루오코르톨론 카프로에이트, 플루오코르톨론 피발레이트, 플루오로메톨론, 플루니솔리드, 플루페롤론 아세테이트, 플루프레드니덴 아세테이트, 플루프레드니솔론, 플루란드레놀리드, 플루티카손 프로피오네이트, 포르모코르탈, 할시노니드, 할로베타솔 프로피오네이트, 할로메타손, 할로프레돈 아세테이트, 히드로코르타메이트, 히드로코르티손, 히드로코르티손 아세테이트, 히드로코르티손-17-아세포네이트, 히드로코르티손17-부테프레이트, 히드로코르티손-17-부티레이트, 히드로코르티손-17-발레레이트, 로테프레드놀, 마지프레돈, 메드리손, 메프레드니손, 메틸프레드니솔론, 모메타손, 모메타손 푸로에이트, 파라메타손, 파라메타손 아세테이트, 프레드니카르베이트, 프레드니솔론, 프레드니솔론 25-디에틸아미노-아세테이트, 프레드니솔론 인산나트륨, 프레드니손, 프레드니발, 프레드닐리덴, 리멕솔론, 틱소코르톨, 틱소코르톨 피발레이트, 트리암시놀론, 트리암시놀론 아세토니드, 트리암시놀론 알콜, 트리암시놀론 베네토니드, 트리암시놀론 헥사세토니드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 항염증제는 덱사메타손일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 실시예들에 따르면, 소수성 약물은 마이셀 구조체 전체 중량 대비 3 내지 7 중량%로 함유된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 하이드로겔은 소수성 약물 및 친수성 약물을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 소수성 약물 및 친수성 약물은 표적부위에서 동시에 방출될 수 있으며, 이때, 상기 소수성 약물의 방출은 침식-기반(erosion-based) 방출로 인한 것이며, 상기 친수성 약물의 방출은 피키언(Fickian) 확산으로 인한 것일 수 있다.
후술하는 실험예에서는 본 발명의 하이드로겔이 하이드로겔의 소수성 도메인인 마이셀 내부에는 소수성 약물을 담지하고, 하이드로겔의 친수성 도메인에 친수성 약물을 담지할 수 있으며, 상기 두가지 약물을 치료가 필요한 표적부위에서 약물을 동시에 방출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 하이드로겔은 일산화질소의 농도에 따라서 약물의 방출 정도가 달라질 수 있는데, 이는 병의 악화정도에 따라 약물방출이 조절될 수 있음을 의미하며, 이는 치료하고자 하는 질환의 상태에 따른 맞춤형 치료가 가능함을 나타낸다.
본 발명에서 하이드로겔을 제조하기 위한 화학식 1 내지 3의 화합물은 표적부위에 동시-주사(co-injection)되는 것일 수 있다.
본 발명에서 “동시-주사(co-injection)”는 화학식 1 내지 3의 화합물이 주사에 적합한 제형, 예를 들면, 액체 상태로 환자의 체내 표적부위에 함께 주사되는 것을 의미한다. 본 발명 실시예들에 따르면, 화학식 1 내지 3의 화합물을 포함하는 액체 형태의 조성물은 주사 바늘의 팁(tip)으로부터 빠져나가 환자 체내 표적부위에 들어가기 전 균질하게 혼합되고, 이어서 표적부위에 혼합물로서 주사되며, 주사 바늘을 빠져나가 체내에서 겔화된다. 본 발명의 화학식 1 내지 3의 화합물은 표적부위에 동시-주사된 후 클릭화학 반응에 의해 자발적으로 결합되어 하이드로겔을 형성할 수 있다.
본 발명에서 상기 동시-주사는 이중 주사기 시스템(dual syringe system) 또는 임의의 다른 적합한 주사기 시스템을 사용하여 달성될 수 있으며, 바람직하게는 이중 주사기 시스템에 의한 것일 수 있다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물은 동시-주사 전, 예를 들어 주사에 의한 동시 압출, 혼합 및 환자의 체내에서 바늘을 통한 주입의 일련의 과정이 발생하기 전에 물리적으로 분리되어 있을 수 있다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 화학식 1 및 화학식 3으로 표시되는 화합물을 포함하는 조성물은 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하는 조성물과 물리적으로 분리되어 있을 수 있다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하는 조성물은 화학식 3으로 표시되는 화합물과 물리적으로 분리되어 있을 수 있다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 조성물은 화학식 2 및 화학식 3으로 표시되는 화합물과 물리적으로 분리되어 있을 수 있다.
본 발명의 하이드로겔은 상기 화학식 1 내지 3의 화합물을 표적부위에 주사 후 0.5 내지 10분 이내, 바람직하게는 0.5 내지 1분 이내 형성되는 것일 수 있다. 하이드로겔 형성 시간(겔화 시간)이 상기 범위 미만인 경우, 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물이 혼합된 후 조기 가교결합에 의해 표적부위에의 주사가 원활하지 않을 수 있고, 상기 범위를 초과하는 경우, 주사된 물질이 주위 조직으로 확산되어 표적부위에 국소적인 하이드로겔의 형성에 적합하지 않을 수 있다. 종래 온도 또는 UV 조사 등을 통해 개발된 기존의 in situ 주입형 하이드로겔은 느린 상전이 시간과 같은 문제점들을 가지고 있다. 본 발명의 하이드로겔은 클릭화학 반응을 통해 짧은 시간에 겔화 될 수 있어 종래 기술이 가진 문제점을 해결하였다.
본 발명의 하이드로겔은 염증성 질환 예방, 완화 또는 치료용으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 "염증성 질환"은 염증을 주병변으로 하는 질환을 의미하며, 본 발명에서 상기 염증성 질환은 생체 내 일산화질소가 과생산되는 양상을 나타내는 염증성 질환일 수 있다.
본 발명의 하이드로겔은 과생산된 일산화질소를 포집하여 소거할 수 있다. 스트레스 등에 의해 면역체계가 무너져 생체 내 일산화질소가 과생산되는 경우 자가면역질환 또는 염증성 질환을 일으킬 수 있다. 따라서, 과생산된 일산화질소를 포집하여 소거할 수 있는 본 발명의 하이드로겔은 일산화질소 과생산에 의해 유발된 질환을 효과적으로 치료할 수 있다.
또한, 상기 염증성 질환은 관절의 염증으로 인한 질환일 수 있으며, 예를 들면, 미분화 척추관절증, 미분화 관절병증, 관절염, 바이러스 또는 박테리아 감염에 의한 만성 염증질환, 류마티스 관절염, 반응성 관절염, 골관절염, 골다공증 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 염증성 질환은 류마티스 관절염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 류마티스 관절염은 자가면역질환 중 하나로, 고농도의 일산화질소에 의하여 발병되는 질환이다. 따라서, 본 발명의 하이드로겔은 고농도의 일산화질소 환경에서 일산화질소를 포집하여 사이토카인으로 유도된 파골 세포의 골 흡수를 억제하고, 관절에서 세포 사멸을 막아 류마티스 관절염을 완화 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 “완화 또는 치료”는 질환 증상의 중증도 감소, 질환 증상이 없는 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질환의 고통으로 인한 손상 또는 장애의 방지를 의미한다.
본 발명의 하이드로겔은 전염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6 수준을 감소시키는 것일 수 있다.
본 발명에서 “전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)”은 주로 활성화된 대식세포에 의해 생산되어 전신 염증을 촉진하는 사이토카인을 의미한다. 전염증성 사이토카인에는 예를 들면, TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 등이 있으며, 이들은 염증 반응 시 함께 나타나며 염증반응의 지표가 될 수 있다.
후술하는 실험예에서 본 발명의 하이드로겔을 처리하는 경우, 전염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6 수준을 감소시킬 수 있음을 확인하여, 본 발명의 하이드로겔이 염증성 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 하이드로겔은 비스코 보충제(visco-supplement)용으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 "비스코보충제(visco-supplement)"는 겔 상태의 히알우론산을 관절 부위에 주사하여 점액성 윤활액을 보충해 주는 물질을 의미한다.
후술하는 실험예에서 본 발명의 하이드로겔은 파열 후에 스트레스로 유발된 흐름에 따라 거의 완전한 회복을 보여 비스코보충제로서 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다. 이는 특정이론에 얽매이지 않고, HA 사슬 간의 분자간 수소 결합과 마이셀 구조의 엔트로피 기반 재연결(entropy-driven reassociation)에 기인한 것으로 여겨진다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물을 포함하는 제자리부합 하이드로겔 전구체 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112021019873252-pat00014
[화학식 2]
Figure 112021019873252-pat00015
[화학식 3]
Figure 112021019873252-pat00016
여기서,
상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1-C10 알킬렌이고,
상기 n 및 m은 각각 1 내지 1000의 정수이다.
본 발명에서 "전구체(precursor)"는 다른 화합물을 생성하는 화학 반응에 참여하는 화합물을 의미한다.
본 발명의 전구체 조성물은 소수성 약물을 더 포함하는 것일 수 있으며, 상기 소수성 약물은 상기 화학식 2로 표시되는 화합물의 자가조립에 의해 형성된 마이셀 구조체에 담지된 것일 수 있다.
본 발명의 전구체 조성물은 소수성 약물 및 친수성 약물을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 하기 단계를 포함하는 제자리부합(in situ hybridization) 하이드로겔 제조방법을 제공한다.
a) 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 포함하는 제1 전구체 조성물을 제조하는 단계;
b) 하기 화학식 2로 표시되는 화합물로부터 형성된 마이셀 구조체를 포함하는 제2 전구체 조성물을 제조하는 단계; 및
c) 상기 제1 전구체 조성물 및 제2 전구체 조성물을 동시-주사하는 단계.
[화학식 1]
Figure 112021019873252-pat00017
[화학식 2]
Figure 112021019873252-pat00018
[화학식 3]
Figure 112021019873252-pat00019
여기서,
상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1 내지 C10의 알킬렌이고,
상기 n 및 m은 각각 1 내지 1000의 정수이다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 제1 전구체 조성물 전체 질량 대비 0.02 내지 0.06 wt%; 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 제2 전구체 조성물 전체 질량 대비 1.00 내지 3.00 wt%; 및 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은 제1 전구체 조성물 전체 질량 대비 1.00 내지 1.50 wt%;로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 제2 전구체 조성물에는 촉매가 더 포함될 수 있으며, 본 발명의 실시예들에 따르면 상기 촉매는 Cu(I)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 제2 전구체 조성물은 소수성 약물을 더 포함하는 것일 수 있으며, 상기 소수성 약물은 상기 화학식 2로 표시되는 화합물의 자가조립에 의해 형성된 마이셀 구조체에 담지된 것일 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 제1 및 제2 전구체 조성물은 소수성 약물 및 친수성 약물을 더 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 소수성 약물은 제2 전구체 조성물에 포함될 수 있으며, 친수성 약물은 제1 전구체 조성물에 포함될 수 있고, 소수성 약물 및 친수성 약물 모두 제1 전구체 조성물 또는 제2 전구체 조성물에 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 동시-주사는 이중 주사기 시스템(dual syringe system)에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 제1 및 제2 전구체 조성물은 비경구투여에 적절하도록 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태일 수 있고, 고체 또는 반고체의 형태로 제조될 수 있으며, 현탁제, 안정화제, 용해제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 제1 및 제2 전구체 조성물은 액체 상태일 수 있고, 멸균된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그리고 세균이나 곰팡이와 같은 미생물의 오염작용에 대해 보존될 수 있다. 또한, 제1 및 제2 전구체 조성물은 분말 형태일 수 있고 멸균된 것일 수 있다. 이 경우 사용 전 주사용수 등을 이용하여 액체 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명은 염증성 질환을 보유하고 있는 개체에 본 발명의 하이드로겔을 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환 예방, 완화 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 하이드로겔을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 하이드로겔의 투여 경로는 목적하는 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있으나, 바람직하게는 비경구투여일 수 있다. 상기 비경구투여는 예를 들어, 근육내, 피하, 관절내, 복강내 투여 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 투여는 관절내 투여일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 개체는 임의의 인간, 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 척추동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 및 설치류, 예컨대 마우스, 래트 및 기니 피그일 수 있다. 상기 개체는 바람직하게 인간일 수 있으며, 구체적으로 특정 질환을 보유하고 있는 인간일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "개체"는 "대상체" 또는 "환자"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 제자리부합 하이드로겔, 전구체 조성물, 제조방법 및 치료방법에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 이상 동일하게 적용되며, 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 반복기재를 생략하였다.
본 발명의 하이드로겔은 체내외의 과생산된 일산화질소를 국소적이며 선택적으로 포집하여 소거할 수 있으므로 일산화질소의 과생산으로 인한 염증성 질환에 있어서 우수한 예방, 완화 또는 치료 효과를 가진다.
또한, 본 발명의 하이드로겔은 소수성 및/또는 친수성 약물을 담지할 수 있어 표적부위로의 약물의 전달체로서 역할을 할 수 있고, 일산화질소 포집 및 약물 전달에 따른 복합적인 치료효과를 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 하이드로겔은 일산화질소에 감응하여 분해될 수 있으므로 일산화질소가 존재하는 환경에서 가교점이 일산화질소에 감응하여 해리됨에 따라 하이드로겔에 담지된 약물은 표적부위에 국소적이며 선택적으로 전달될 수 있다.
또한, 본 발명의 하이드로겔은 외과적 수술이 필요하지 않고 최소 침습으로 표적부위에 국소적으로 하이드로겔을 형성할 수 있어 환자 편의성이 우수하다.
또한, 본 발명의 하이드로겔은 표적부위에서의 빠른 제거 및 다른 장기로의 확산을 방지할 수 있어, 전신독성 등 종래 기술이 가지던 문제점을 나타내지 않는다.
또한, 본 발명의 하이드로겔은 자기치유(self-healing) 능력으로 인해 기계적 특성의 회복이 뛰어나 비스코 보충제(visco-supplement)로 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 하이드로겔 형성 과정 및 상기 형성된 하이드로겔이 일산화질소에 반응하여 가교점이 해리되는 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 화학식 1로 표시되는 화합물의 합성 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 화학식 1로 표시되는 화합물의 합성의 각 단계에서 수득된 화합물의 1H NMR 데이터이다.
도 4는 화학식 1로 표시되는 화합물이 일산화질소와 반응하여 분해될 수 있는지 여부를 나타낸 것이다.
구체적으로 도 4a는 화학식 1로 표시되는 화합물이 일산화질소와 반응하여 분해되는 메커니즘을 나타낸 것이다.
도 4b 내지 도 4d는 화학식 1로 표시되는 화합물이 일산화질소와 반응하여 분해되는지 여부를 확인한 것으로, 4b는 1H NMR, 4c는 FT-IR, 4d는 UV-Vis 흡광 데이터를 나타낸 것이다.
도 5는 화학식 2로 표시되는 화합물의 합성과정을 나타낸 것이다.
도 6은 화학식 2로 표시되는 화합물 합성의 각 단계에서 수득된 화합물의 1H NMR 스펙트럼 데이터를 나타낸 것이다.
도 7은 화학식 2로 표시되는 화합물의 FT-IR, GPC, TEM, DLS 데이터이다.
구체적으로 도 7a는 PLA-b-PEG-N3의 FT-IR 스펙트럼 데이터를 나타낸 것이다.
도 7b는 PLA-b-PEG-N3의 GPC(Gel Permeation Chromatography) 데이터를 나타낸 것이다.
도 7c는 PLA-b-PEG-N3의 TEM(transmission electron microscope) 이미지를 나타낸 것이다.
도 7d는 PLA-b-PEG-N3의 동적광산란광도계(DLS)에 의해 결정된 평균 유체 역학적 크기를 나타낸 것이다.
도 8은 화학식 3으로 표시되는 화합물의 합성과정을 나타낸 것이다.
도 9는 화학식 3으로 표시되는 화합물의 합성과정에서 수득된 화합물의 1H NMR 데이터를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 M-NO 겔의 특성을 분석한 것이다.
구체적으로 도 10a는 M-NO 겔을 극저온 스캐닝 전자 현미경(Cryogenic scanning electron microscopy)을 통해 이미지화한 것이다.
도 10b는 동적 과도 테스트(dynamic transient test)를 통한 M-NO 겔의 자가치유의 진동 유변학적 특성을 나타낸 것이다.
도 10c는 M-NO 젤의 자가치유 개략도를 나타낸 것이다.
도 10d는 M-NO 겔의 주파수 의존적 진동 유변학적 특성을 나타낸 것이다.
도 10e는 M-NO 겔 및 대조군 겔(NO 비반응성)의 NO 농도 의존적 진동 유변학적 특성을 나타낸 것이다.
도 10f는 M-NO 겔의 NO 소거 능력을 확인한 것이다. 데이터는 평균±SD(n = 4)로 표시하였다.
도 10g는 다양한 농도에서 시간에 따른 M-NO 겔의 상대적 팽창비를 나타낸 것이다. 데이터는 평균±SD(n = 4)로 표시하였다.
도 10h는 다양한 농도에서 시간에 따른 대조군 겔(NO 비반응성)의 상대적 팽창비를 나타낸 것이다. 데이터는 평균±SD(n = 3)로 표시하였다.
도 10i는 다양한 농도의 NO 용액에서 2시간 배양한 후 M-NO 겔 및 대조군 겔(NO 비반응성)의 이미지를 나타낸 것이다. 스케일 바는 1 cm이다.
도 10j는 M-NO 겔에서의 동시적 이중 약물 방출에 대한 개략도를 나타낸 것이다.
도 10k는 M-NO 겔의 BSA-FITC(hydrophilic cargo model) 방출 프로파일을 나타낸 것이다.
도 10l은 대조군 겔의 BSA-FITC 방출 프로파일을 나타낸 것이다.
도 10m은 M-NO 겔의 마이셀 구조체에 담지된 Nile Red(hydrophobic cargo model)의 방출 프로파일을 나타낸 것이다.
도 10n은 대조군 겔의 Nile Red 방출 프로파일을 나타낸 것이다.
도 10o는 하이드로겔 형성 전의 PLA-b-PEG-N3 마이셀 구조체의 평균 유체역학적 크기 및 M-NO 겔을 NO 용액(250 μM)과 함께 24 시간 배양한 후 상청액에서 확인된 PLA-b-PEG-N3 마이셀 구조체의 평균 유체역학적 크기를 나타낸 것이다.
도 10p, M-NO 겔의 침식 후 상청액의 TEM 이미지를 나타낸 것이다. 이미지 내의 흰색 박스는 겔 형성 전의 마이셀 구조체의 형태를 나타낸다.
도 11은 LPS 처리된 RAW 264.7 세포에 LPS 처리 후 M-NO 겔의 반응성 및 NO 소거능을 나타낸 것이다.
구체적으로, 도 11a는 RAW 264.7 및 NIH/3T3 세포주에 5 μg/ml LPS를 24시간 처리 전후의 NO 농도를 나타낸 것이다.
도 11b는 다양한 농도의 M-NO 겔 및 대조군 겔로 처리된 RAW 264.7 세포주의 세포생존율을 나타낸 것이다. 데이터는 평균±SD(n = 5)로 표시하였다.
도 11c는 M-NO 겔의 NO 소거능을 나타낸 것으로, 다양한 농도의 M-NO 겔을 RAW 264.7 세포주에 처리하고 24시간 배양 후 세포 배지 상청액의 NO의 수준을 Griess assay를 통해 확인한 것이다.
도 11d는 M-NO 겔 및 대조군 겔 처리 후 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포주의 공초점 현미경 이미지를 나타낸 것이다. 세포 내 NO 및 핵은 각각 DAF-2 DA(녹색) 및 DAPI(파란색)으로 염색되었으며, 스케일 바는 100 μm이다.
도 11e는 M-NO 겔 및 대조군 겔로 처리 후 TNF-α 수준을 정량화한 것을 나타낸 것이다.
도 11f는 M-NO 겔 및 대조군 겔로 처리 후 IL-6 수준을 정량화한 것을 나타낸 것이다.
도 11g는 배양된 RAW 264.7 또는 NIH/3T3 세포주(LPS로 자극되거나 자극되지 않은)에 M-NO 겔 및 대조군 겔을 처리하고 밤새 배양한 후의 M-NO 겔 및 대조군 겔의 이미지를 나타낸 것이다.
도 11h는 배양된 RAW 264.7 또는 NIH/3T3 세포주(LPS로 자극되거나 자극되지 않은)에 M-NO 겔 및 대조군 겔을 처리하고 밤새 배양한 후 상대적인 팽창 비율을 나타낸 것이다.
도 11i는 전염증성 사이토카인 수준을 감소시키기 위한 M-NO 겔의 in vitro NO-반응성 및 소거능을 나타낸 개략도이다.
도 12는 류마티스 관절염 동물모델인 콜라겐 유도 관절염(CIA) 마우스에서 본 발명의 M-NO 겔의 류마티스 관절염 치료효과를 확인한 것을 나타낸 것이다.
구체적으로, 도 12a는 전체 실험 타임 라인을 나타낸 것이다.
도 12b는 샘플 처리 후 RA 마우스 모델에서의 상대적인 발 부피 변화를 나타낸 것이다. 상대적인 발 부피는 RA 모델 마우스를 식염수로 처리된 군(B)을 다른 실험군과 비교하였으며, 일원 ANOVA을 사용하여 통계적으로 분석하였다(** p<0.01, *** p<0.001).
도 12c는 4주, 6주 및 8주에서의 대표적인 마우스 뒷발 이미지를 나타낸 것이다.
도 12d는 샘플 처리 후 RA 마우스의 시간-의존적 평균 임상 점수를 나타낸 것이다. 데이터는 평균±SD (n=8)로 표시하였다.
도 12e는 샘플 처리 후 RA 마우스의 8주차의 평균 임상점수를 나타낸 것이다. RA 모델 마우스를 식염수로 처리된 군(B)을 다른 실험군과 비교하였으며, 일원 ANOVA을 사용하여 통계적으로 분석하였다(** p<0.01, *** p<0.001).
도 12f는 로타로드 분석을 통해 샘플 처리 후 RA 마우스의 시간에 따른 낙하 지연 시간을 나타낸 것이다. 데이터는 평균±SEM(n=8)으로 표시하였다.
도 12g는 샘플 처리 후 RA 마우스의 8주차의 낙하 지연 시간을 나타낸 것이다. RA 모델 마우스를 식염수로 처리된 군(B)을 다른 실험군과 비교하였으며, 일원 ANOVA을 사용하여 통계적으로 분석하였다(** p<0.01, *** p<0.001).
도 13은 류마티스 관절염 동물모델인 콜라겐 유도 관절염(CIA) 마우스에서 본 발명의 M-NO 겔의 류마티스 관절염 치료효과를 확인한 것을 나타낸 것이다.
구체적으로 도 13a는 RA 마우스 모델의 앞발 마이크로컴퓨터단층촬영(micro-CT) 이미지를 나타낸 것이다. 빨간색 화살표는 뼈의 파괴 및 손상을 나타낸다.
도 13b는 샘플 처리 후 관절 조직의 조직학적 분석 결과를 나타낸 것이다. 스케일 바는 100 μm이다.
도 13c는 H&E, masson's trichrome 및 Safranin-O 염색을 사용하여 결정된 관절 조직의 평균 조직학적 점수를 나타낸 것이다. RA 모델 마우스를 식염수로 처리된 군(B)을 다른 실험군과 비교하였으며, 일원 ANOVA을 사용하여 통계적으로 분석하였다(* p<0.05, *** p<0.001; n.s. 큰 차이 없음).
도 13d는 샘플 처리된 RA 마우스 혈청 표본에서 TNF-α의 수준을 정량화한 것을 나타낸 것이다.
도 13e는 샘플 처리된 RA 마우스 혈청 표본에서 IL-6를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD (n = 4)로 표시되며, #을 다른 군과 비교하여 일원 분산 분석 테스트를 사용하여 통계적으로 분석하였다(* p<0.05, *** p<0.001; n.s. 큰 차이 없음).
도 13f는 샘플 처리된 RA 마우스 발 조직액에서의 TNF-α의 수준을 정량화한 것을 나타낸 것이다.
도 13g는 샘플 처리된 RA 마우스 발 조직액에서의 IL-6의 수준을 정량화한 것을 나타낸 것이다. 데이터는 평균±SD (n=4)로 표시되며, RA 모델 마우스를 식염수로 처리된 군(B)을 다른 실험군과 비교하였으며, 일원 ANOVA을 사용하여 통계적으로 분석하였다(* p<0.05, *** p<0.001; n.s. 큰 차이 없음).
도 13h는 8 주차 샘플 처리된 RA 마우스 발 조직액에서 NO 수준의 정량화한 것을 나타낸 것이다. 데이터는 평균±SD (n=4)로 표시되며, RA 모델 마우스를 식염수로 처리된 군(B)을 다른 실험군과 비교하였으며, 일원 ANOVA을 사용하여 통계적으로 분석하였다(* p<0.05, *** p<0.001; n.s. 큰 차이 없음).
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에서 특별히 정의되지 않은 용어들에 대해서는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것으로 이해되어야 할 것이다.
제조예 1. 화학식 1의 화합물의 합성
일산화질소에 반응하는, 클릭 가능한 가교제 DA-NOCCL의 합성을 위해 먼저 4-니트로-o-페닐렌디아민(4-nitro-o-phenylenediamine) C2 위치에 있는 아민 그룹을 구아니딘 HCl(guanidine HCl)을 촉매로 하여 선택적으로 Boc-보호화하였다. 이후 4-NO2를 4-NH2로 환원시키고, 4-펜티노산(4-pentynoic acid)을 각 아민 그룹과 아미드 결합을 통해 결합시켰다. 이후 산 조건에서 Boc-탈보호화하여 합성을 완료하였다. 상기 가교제 DA-NOCCL의 합성과정은 도 2에 나타내었으며, 합성과정에서 수득된 각 화합물 및 가교제 DA-NOCCL의 성공적인 합성은 1H NMR을 통해 확인하고 도 3에 나타내었다.
구체적인 합성의 각 단계는 하기와 같다.
단계 1: 4-니트로-o-페닐렌디아민(1 g, 6.53 mmol) 및 구아니딘 HCl(95 mg, 0.91 mmol)을 에탄올 20 ml에 용해시키고, 디-tert-부틸디카보네이트(2.85 g, 13.06 mmol)를 적가(dropwise)한 후, 상기 반응 혼합물을 25℃에서 24시간 동안 격렬하게 교반하였다. 반응이 완료된 후 반응용액 내 유기용매를 감압 증발시키고 증류수에 현탁시켰다. 상기 수용액을 에틸 아세테이트(EA)로 3회 추출하고, 유기 부분을 Na2SO4로 세척하여 적황색 조(crude)-고체를 수득하였으며, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용리액: EA-헥세인 혼합물)를 통해 정제하여 화합물 1(1.22 g, 수율: 73.8 %)을 수득하였다.
[화합물 1]
Figure 112021019873252-pat00020
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ= 8.56 (brs, 1H, D2O exchangeable), 8.30 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.78 (dd, J = 9.0, 2.7 Hz, 1H), 6.72 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.46 (brs, 2H, D2O exchangeable), 1.48 (s, 9H).
단계 2: 질소 하의 10 ml 무수 THF 중의 화합물 1(400 mg, 1.58 mmol) 용액에 팔라듐 100 mg이 로딩된 활성탄(10 % Pd/C)을 첨가한 후, 압력이 최대 40 psi에 도달할 때까지 수소 가스를 펌핑하고, 반응 혼합물을 25℃에서 36시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후 반응 혼합물을 셀 라이트 545 베드를 통해 여과하여 Pd/C를 제거하고, 감압 하에 증발시켜 보라색 고체 화합물 2(322 mg, 수율: 91.2 %)를 수득하였다.
[화합물 2]
Figure 112021019873252-pat00021
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ= 8.08 (brs, 1H, D2O exchangeable), 6.64 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 6.45 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.16 (dd, J = 8.3, 2.5 Hz, 1H), 4.29 (brs, 2H, D2O exchangeable), 4.01 (brs, 2H, D2O exchangeable), 1.45 (s, 9H)
단계 3: 화합물 2(200 mg, 0.90 mmol), 4-펜티노산(200 mg, 2.04 mmol), HOBt(280 mg, 2.07 mmol) 및 트리에틸아민(TEA, 190 mg, 1.88 mmol)을 10 ml의 무수 DMF에 완전히 용해시켰다. EDC(400 mg, 2.09 mmol)를 용액에 첨가한 후, 반응 혼합물을 25℃에서 24시간 동안 격렬하게 교반하였다. 반응이 완료된 후 반응 혼합물을 감압 증발시키고 CH2Cl2에 현탁시켰다. 유기용매를 증류수로 3회 추출하고 유기 부분을 Na2SO4로 세척하여 밝은 갈색의 조(crude)-고체를 수득하였으며, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용리액: EA-헥세인 혼합물)를 통해 정제하여 화합물 3(285 mg, 0.74 mmol, 수율: 82.7 %)을 수득하였다.
[화합물 3]
Figure 112021019873252-pat00022
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ= 9.99 (brs, 1H, D2O exchangeable), 9.41 (brs, 1H, D2O exchangeable), 8.26 (brs, 1H, D2O exchangeable), 7.87 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.39 (dd, J = 8.7, 2.2 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 2.79 (t, J = 2.5 Hz, 2H), 2.55-2.41 (m, 8H), 1.47 (s, 9H)
단계 4: 5 ml 트리플루오로아세트산(TFA)을 0℃에서 20 ml CH2Cl2에 현탁된 화합물 3(200 mg, 0.52 mmol)에 적가하였다. 그리고 반응 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 격렬하게 교반하였다. 반응 완료 후 반응 혼합물을 감압 증발시키고 포화 중탄산나트륨(NaHCO3) 용액으로 중화시켰다. 중화된 용액을 CH2Cl2 중의 5 %(v/v) 메탄올로 3회 추출하고 유기 부분을 Na2SO4로 세척하여 짙은 갈색 고체의 가교제 DA-NOCCL(138 mg, 0.49 mmol, 수율: 93.5 %)을 수득하였다.
[DA-NOCCL]
Figure 112021019873252-pat00023
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ= 9.70 (brs, 1H, D2O exchangeable), 9.06 (brs, 1H, D2O exchangeable), 7.08 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.70 (dd, J = 8.5, 2.2 Hz, 1H), 4.88 (brs, 2H, D2O exchangeable), 2.78 (dt, J = 14.7, 2.4, 2H), 2.44 (m, 8H).
상기 합성된 가교제 DA-NOCCL이 일산화질소와 반응하여 분해되는 메커니즘, 및 이를 확인한 1H NMR, FT-IR 및 UV-Vis 흡광 데이터는 도 4에 나타내었다.
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 포화된 NO 용액에서 배양 후, 1차 아민의 특징적인 피크가 소실되고, 벤조트리아졸(benzotriazole)기가 형성되어 가교제 DA-NOCCL이 NO에 반응하여 분해될 수 있음을 확인하였다.
제조예 2. 화학식 2의 화합물의 합성
화학식 1로 표시되는 가교제와 클릭 가능한 화학식 2의 화합물의 합성을 위해 PEG(polyethylene glycol)를 시작 물질로 하여 PEG의 히드록실기(hydroxyl group) 중 하나를 산화은(Ag2O) 촉매 조건에서 선택적으로 토실화(tosylation)시킨 후, 토실기를 브로마이드로 치환하였다. 상기 형성된 PEG-Br는 D,L-락타이드와 고리연결 중합을 통해 PLA-b-PEG-Br의 블록공중합체를 형성한다. 마지막으로 브로마이드기를 아자이드로 치환하여 합성을 완료하였다. 합성된 PLA-b-PEG-N3 10 mg을 1 ml THF에 녹인 후, 9 ml의 물을 적가(dropwise)하여 마이셀 구조체를 형성시키고, 남은 THF를 투석(dialysis)을 통해 제거하였다. 구체적인 합성의 각 단계는 하기와 같으며, 합성과정은 도 5에 나타내었다. PLA-b-PEG-N3의 성공적인 합성은 1H NMR, FT-IR 및 GPC로 확인하였으며, 각각 도 6, 7a 및 7b에 나타내었다.
구체적인 합성의 각 단계는 다음과 같다.
단계 1: 산화은(I) (1.74 g, 7.51 mmol) 및 요오드화 칼륨(KI, 0.33 g, 1.99 mmol)을 160 ml 무수 디클로로메탄(CH2Cl2)에 용해된 진공-건조 2 kDa PEG(10 g, 5.00 mmol) 용액에 첨가하고, 20 ml 무수 CH2Cl2 중의 p-톨루엔 설포닐클로라이드 (TsCl, 1 g, 5.25 mmol)를 첨가하여 0℃에서 밤새도록 격렬히 교반하였다. 반응완료 후 반응 혼합물을 셀라이트 545 베드(Celite 545 bed)를 통해 조심스럽게 여과하고 감압 증발시켜 무색 유성인 생성물을 수득하였다. 상기 수득한 생성물은 다중 CH2Cl2/디에틸에테르((C2H5)2O) 재결정을 통해 추가로 정제하여 백색 고체 침전물(monoTos-PEG, 9.72 g, 수율: 90.9 %)을 수득하였다.
단계 2: monoTos-PEG(4.0 g, 1.86 mmol) 및 브롬화 칼륨(KBr, 1.1 g, 9.24 mmol)을 모두 40 ml 무수 디메틸포름아미드(DMF)에 용해시키고, 교반 하에 65℃에서 18 시간 동안 반응시켰다. 반응완료 후 반응 혼합물을 감압 증발시켜 CH2Cl2에 재분산시켰다. 상기 생성물을 짧은 실리카겔에 통과시키고, 다중 CH2Cl2/(C2H5)2O 재결정을 통해 추가로 정제하여 백색 고체 침전물(monoBr-PEG, 3.59 g, 수율: 93.5 %)을 수득하였다.
단계 3: monoBr-PEG(1.5 g, 0.72 mmol) 및 3,6-디메틸-1,4-디옥세인-2,5-디온(D, L-락타이드, 2.1 g, 14.57 mmol)을 5 ml에 무수 톨루엔에 용해시켰다. 상기 용액에 여러번의 동결-해동 사이클 수행 후, 주석(II) 2-에틸헥사노에이트 촉매(Sn(Oct)2, 0.01 g, 0.02 mmol)를 첨가하여 중합을 시작하였다. 반응 혼합물은 120℃에서 36시간 동안 격렬하게 교반하였다. 반응완료 후 상기 혼합물을 감압 증발시키고 CH2Cl2에 재분산하였다. 그리고 생성물을 다중 CH2Cl2/(C2H5)2O 재결정화를 통해 정제하여 백색 무정형 고체 침전물을 수득하였다. 생성물은 증류수에 대한 2일 투석 및 후속적인 동결건조를 통해 추가로 생성물을 정제(PLA-b-PEG-Br)하였다. 분자량은 테트라하이드로퓨란(THF)(Mn=5540, PDI=1.50) 하에서 GPC(gel permeation chromatography)에 의해 측정하였다.
단계 4: 상기 제조된 PLA-b-PEG-Br(1.1 g, 0.19 mmol) 및 과량의 아지드화 나트륨(NaN3, 0.45 g, 6.92 mmol)을 20 ml 무수 DMF에 용해시키고, 반응 혼합물을 50℃에서 3일 동안 격렬히 교반하였다. 반응종료 후 증류수에 대해 2일 투석 및 후속적인 동결건조를 통해 생성물을 정제(PLA-b-PEG-N3)하였다. 분자량은 THF(Mn=5864, PDI=1.55) 하에 GPC에 의해 측정하였다.
또한, 상기 제조된 PLA-b-PEG-N3의 자가조립에 의해 형성된 마이셀 구조체의 TEM 및 DLS 데이터는 각각 도 7c 및 7d에 나타내었으며, 도 7c 및 7d에서 확인할 수 있는 바와 같이, PLA-b-PEG-N3는 수성 조건에서 자가조립되어 약 284.1±7.8 nm 크기의 균일한 마이셀 구조를 형성할 수 있다는 점을 확인하였다.
제조예 3. 화학식 3의 화합물의 합성
화학식 1로 표시되는 화합물과 클릭하여 하이드로겔 백본(backbone)을 이룰 수 있는 화학식 3으로 표시되는 화합물인 히알루론산 기반 고분자 체인(HA-N3)은 2-클로로에틸아민의 클로라이드 그룹을 아자이드 그룹으로 치환 후, 치환된 2-아지도에틸아민을 히알루론산과 아미드결합을 통해 결합시켜 합성하였다. 상기 히알루론산 기반 고분자 체인의 합성과정은 8a에 나타내었으며, 합성의 각 단계에서 수득된 화합물의 1H NMR 스펙트럼은 도 9에 나타내었다.
구체적인 합성의 각 단계는 하기와 같다.
단계 1: 2-클로로에틸아민 하이드로클로라이드(1.16 g, 10.00 mmol) 및 NaN3(1.3 g, 20.00 mmol)을 모두 30 ml 증류수에 용해시키고, 반응 혼합물을 80℃에서 12시간 동안 격렬하게 교반하였다. 반응완료 후 1M 수산화 나트륨(NaOH) 용액을 첨가하여 용액의 pH를 10-11까지 조절하였다. 알칼리성 용액을 CH2Cl2로 3회 추출하고 유기 부분을 무수 황산나트륨(Na2SO4)으로 세척하여 연황색 유성 생성물(2-아지도에틸아민, 0.62 g, 수율: 72.0 %)을 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, D2O): δ= 3.41 (t, J = 5.7Hz, 1H), 2.80 (t, J = 5.7Hz, 1H).
단계 2: 100 kDa 히알루론산(HA, 200 mg, 0.50 mmol (반복 단위))을 40 ml 증류수에 완전히 용해시키고, 상기 용액에 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염(EDC, 144 mg, 0.75 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt, 101 mg, 0.75 mmol) 및 2-아지도에틸아민(51.7 mg, 0.60 mmol)을 첨가하였다. pH를 6.8로 조정한 후, 반응 혼합물을 암(dark) 조건에서 1일 동안 25℃에서 격렬하게 교반하였다. 반응완료 후 생성물은 0.1 M 염화나트륨(NaCl) 및 증류수에 대한 연속 투석으로 정제하고, 동결건조하여 HA-N3를 수득하였다.
제조예 4. 하이드로겔의 제조
본 발명의 일산화질소 감응성 하이드로겔(이하, M-NO 겔)은 하기 방법을 통해 제조하였다.
구체적으로 M-NO 겔은 이중 주사기 시스템으로 준비하였다. 이중 주사기 시스템의 하나의 시린지에는 화학식 1 및 화학식 3으로 표시되는 화합물을, 다른 하나의 시린지에는 화학식 2로 표시되는 화합물과 Cu(I) 촉매를 포함하도록 하였다. 화학식 1과 화학식 3을 포함하는 시린지는 1 %(v/v) DMSO 상에서 준비되었으며, 각각의 농도는 0.04 wt%, 2.5 wt%이었다. 화학식 2로 표시되는 화합물과 Cu(I) 촉매를 포함하는 시린지는 증류수에서 준비되었으며, 각각의 농도는 2 wt%, 0.02 wt%이었다. 여기서 Cu(I) 촉매는 CuSO4 ·5H2O 15.5 mg 및 아스코르브산 나트륨(sodium ascorbate) 22.0 mg를 0.2 mL 증류수에서 혼합하여 제조하였다.
또한, 대조군으로 사용된 일산화질소 비반응성 하이드로겔은 상기 M-NO 겔의 제조방법에서 DA-NOCCL을 DA-NONCL(dialkyne-functionalized non-cleavable cross-linker)로 대체하여 제조하였다.
실험예 1. M-NO 겔의 형태학적 분석
본 발명의 M-NO 겔의 형태학적 분석을 위해 이중 주사기 시스템(dual syringe system)으로 준비된 M-NO 겔을 극저온 스캐닝 전자 현미경(cryogenic scanning electron microscopy)을 통해 이미지화 하였으며, 이는 도 10a에 나타내었다.
상기 도 10a에서 확인할 수 있는 바와 같이, 마이셀 구조체가 망상구조(network)의 하이드로겔 내에 균일하게 분포되어 고정되어 있음을 확인하였다.
실험예 2. M-NO 겔의 기계적 특성 분석
본 발명의 M-NO 겔의 관절에 대한 인공 점성보충제(visco-supplements) 용도를 확인하기 위하여 동적 과도 테스트(dynamic transient test)를 통해 M-NO 겔의 파열 후 자가치유(self-healing) 특성을 분석하였다.
구체적으로 여러 사이클에 걸친 스탭-스트레인(step-strain) (ε=0.5 내지 200 %, ωrad/s, 25℃)을 측정하여 인공 점성보충제의 중요한 매개 변수인 높은 스트레인에서 망상구조 파열 후 기계적 특성의 자가치유 여부를 확인하였으며, 결과는 도 10b 및 10c에 나타내었다.
상기 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, M-NO 겔은 스트레스로 유발된 흐름에 따라 거의 완전한 회복을 나타내어 본 발명의 M-NO 겔이 점성보충제로서 유용히 사용될 수 있음을 확인하였다.
실험예 3. M-NO 겔의 NO 농도 의존적 기계적 특성 변화 분석
M-NO 겔의 NO 농도에 따른 기계적 특성 변화를 확인하기 위해 주파수-의존적 유변학적 매개 변수(frequency-dependent rheological parameters)를 분석하였다.
구체적으로 NO 비반응성 겔과 NO 반응성인 본 발명의 M-NO 겔의 주파수 의존적 진동 유변학적 특성(ε%, 25℃) 및 농도 의존성 유변학적 특성(ωrad/s에서 ωrad/s, ε%, 25℃)을 각주파수(angular frequency)를 측정하고 정량화하여 비교하였으며, 결과는 도 10d 및 10e에 나타내었다.
도 10d 및 10e에서 확인할 수 있는 바와 같이, NO 반응성인 M-NO 겔의 저장 모듈러스(modulus)는 NO의 농도에 따라 점진적으로 감소하여 가교제의 NO 매개 분해 시 기계적 강도의 감소를 나타낸 반면, 대조군인 NO 비반응성 겔에서는 고농도의 NO 용액에서도 저장 모듈러스에는 큰 변화가 나타나지 않았다. 즉, 본 발명의 M-NO 겔은 NO 농도의 증가에 따른 분해양상을 나타냄을 확인하였다.
실험예 4. M-NO 겔의 NO 소거능 확인
본 발명의 M-NO 겔의 NO 소거능은 수성 조건에서 NO를 방출할 수 있는 합성된 NO 공여자 Py-NO(N-diazeniumdiolates-incorporated pyrrolidine)를 사용하여 25 μM Py-NO 용액을 제조한 후, M-NO 겔 및 NO 비반응성 겔을 상기 제조된 25 μM Py-NO 용액으로 처리하고, 1시간 동안 배양한 후, 그리스 분석을 통해 상청액의 잔류 NO 수준을 정량화 하였다(548 nm에서의 흡광도를 NaNO2로 플롯된 표준 곡선과 비교하여 NO 농도 결정). 또한, 하이드로겔의 팽창 수준을 측정하여 확인하고 하기 계산식을 통해 상대적 팽창비를 계산하였으며, 결과는 도 10f, 10g, 10h 및 10i에 나타내었다.
<계산식>
- 팽창비=(Mf-Mi)/Mi
(Mf: NO 용액에서 팽창된 하이드로겔 무게, Mi: 건조된 하이드로겔의 무게)
- 상대적 팽창비=팽창비/0 h에서의 물에 의한 팽창비
도 10f, 10g, 10h 및 10i에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 M-NO 겔은 NO의 농도에 따라 NO 용액의 양을 크게 감소시켰으며, 대조군인 NO 비반응성 겔 대비 크게 팽창한 것을 확인할 수 있었다.
즉, 본 발명의 M-NO 겔은 농도 의존적으로 일산화질소를 효과적으로 소거하며, NO 농도에 따라 하이드로겔의 망상구조 절단에 의한 기공 크기 증가로 인한 팽창 특성을 가지므로, NO 농도에 따른 주문형 제어 전달(on-demand controlled delivery)이 가능하다는 점을 확인하였다.
실험예 5. M-NO 겔의 동시적 이중 약물 방출 확인
M-NO 겔의 NO 반응성 동시적 이중 약물 방출(simultaneous dual-stage release)에 대해서는 하기 실험을 통해 확인하였다.
구체적으로, 친수성 약물 모델인 BSA-FITC(fluorescein isothiocyanate-labeled bovine serum albumin)을 최종적으로 1 wt%가 되도록 HA-N3를 포함한 용액에 용해시켜 하이드로겔의 친수성 도메인으로 캡슐화하였으며, 소수성 약물 모델인 Nile Red는 PLA-b-PEG-N3 마이셀의 소수성 도메인으로 캡슐화하였다. 상기 친수성 및 소수성 약물 모델은 하이드로겔 형성 시 M-NO 겔에 공동-캡슐화되었다.
이후 200 μL의 M-NO 겔을 25℃에서 5 mL의 NO 용액(0, 2.5, 25 및 250 μM)에 배양하였다. 상청액은 미리 정해진 시간 간격으로 NO 용액으로 교체하고, 수득된 상청액을 동결건조를 통해 농축한 후, 형광(여기/방출 피크는 485/510 nm) 및 585 nm에서의 흡광도를 표준 곡선과 비교하여 BSA-FITC 및 Nile red 각각의 시간-의존적 NO 반응성 동시적 이중 약물 방출 프로파일을 조사하였다.
이중 약물 방출의 모식도는 도 10j에 나타내었으며, 결과는 도 10k, 10l, 10m 및 10n에 나타내었다.
도 10k, 10l, 10m 및 10n에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 M-NO 겔은 높은 NO 농도에서 Fickian 확산으로 인한 방출 특성을 갖는 친수성 분자 및 침식-기반 방출(erosion-based mechanism) 특성을 갖는 소수성 분자를 모두 빠르게 방출할 수 있었으나(도 10k 및 10m), 대조군인 NO 비반응성 겔은 NO 농도의 증가에도 불구하고 특별한 방출 양상을 나타내지 않았다(도 10l 및 10n).
또한, 본 발명의 M-NO 겔의 마이셀 구조체로부터 소수성 약물의 침식-기반 방출이 가능한지 여부는 하이드로겔 형성 전의 PLA-b-PEG-N3 마이셀 구조체의 평균 유체역학적(hydrodynamic) 크기와 M-NO 겔을 NO 용액(250 μM)과 함께 24 시간 배양 후 상청액에서 확인된 PLA-b-PEG-N3 마이셀 구조체의 평균 유체역학적 크기를 대비하여 확인하였으며, 결과는 도 10o 및 10p에 나타내었다.
상기 도 10o 및 10p에서 확인할 수 있는 바와 같이, 하이드로겔 형성 전 PLA-b-PEG-N3 마이셀 구조체와 유체역학적으로 유사한 크기와 형태를 가진 마이셀 구조체가 NO 용액과 함께 배양한 M-NO 겔의 상청액에서 관찰되어, 침식 기반 메커니즘(erosion-based mechanism)에 의해 소수성 약물이 방출될 수 있음을 확인하였다.
실험예 6. M-NO의 세포독성 확인
본 발명의 M-NO 및 대조군의 용량-의존성 세포독성에 대해서는 MTT assay를 통해 확인하였다.
구체적으로, RAW 264.7 세포를 96-웰 플레이트에 1x104 cell/well의 초기 밀도로 접종하고, 37℃에서 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지에 배양하였다.
24시간 배양 후, 배지를 샘플이 포함된 신선한 배지로 교체하고, 다시 40시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 세척하고 0.5 mg/mL의 MTT 용액이 포함된 배지에 4시간 동안 배양하였다. 마지막으로 배지를 200 μL DMSO로 교체하고, 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 조사하였으며, 결과는 도 11b에 나타내었다.
도 11b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 M-NO 겔은 세포 생존율에 거의 영향을 주지 않아 본 발명의 M-NO의 안전성을 확인하였다.
실험예 7. M-NO의 NO 소거능 확인
본 발명의 조성물의 NO 소거능(NO-scavenging ability)을 가지는 여부 및 이에 따른 사이토카인 수준은 LPS로 자극된 NO-방출 RAW 264.7 대식세포 세포주를 사용하여 확인하였다.
(1) 농도에 따른 NO 소거능 확인
RAW 264.7 세포주를 5x104 cell/well의 밀도로 12-웰 플레이트에 접종하고 37℃에서 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지에 배양하였다.
밤새 배양 후, 배지를 샘플이 포함된, 5 μg/mL의 LPS를 포함하는 신선한 배지로 교체하고, 다시 24시간 동안 배양하였다.
마지막으로, 배지를 원심분리(3,000 rpm, 10분, 4℃)하여 상층액을 수득한 후 96-웰 플레이트로 옮기고 그리스 분석을 통해 상청액에 남아 있는 NO 수준을 확인하였으며, 이는 도 11c에 나타내었다.
도 11c에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 M-NO 겔은 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포주의 NO 수준을 25 %까지 현저하게 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있으며, 이는 LPS 처리되지 않은 RAW 264.7에서 관찰된 값과 유사한 것을 확인할 수 있었다.
(2) 공초점 현미경을 통한 NO 소거능 확인
세포 내 NO 수준을 공초점 현미경(Confocal microscopy)으로 이미지화하여 NO 소거 능력을 평가하였다.
구체적으로, 세포를 1x105 cell/well 밀도로 6-웰 플레이트에 배치된 커버 글라스에 접종하고, 37℃에서 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지에 배양하였다.
밤새 배양 후, 배지를 샘플(가교제의 경우 25 μg/mL, 겔의 경우 250 μg/mL)이 포함된, 5 μg/mL의 LPS를 포함하는 신선한 배지로 교체하고, 다시 24시간 동안 배양하였다.
이후 샘플 배지를 5 μm의 DAF-2 DA를 포함하는 신선한 배지로 교체하고 다시 40분 동안 배양한 후, 세포를 DPBS로 세척하고 신선한 배지와 함께 20분 동안 더 배양하였다.
이어 DPBS로 세척하고 실온의 암조건(dark condition)에서 10% 중성 포르말린(NBF)으로 처리하고, 30분 후 공초첨 현미경을 통해 관찰하였으며, 결과는 도 11d에 나타내었다.
도 11d에서 확인할 수 있는 바와 같이, LPS로 자극된 RAW 264.7 세포주에서 높은 형광 강도가 관찰되었지만 M-NO 겔 처리 후 신호가 크게 감소하는 것을 확인하여, 본 발명의 M-NO가 NO를 효율적으로 소거할 수 있음을 확인하였다.
(3) 사이토카인 수준의 정량화
NO는 중요한 전-염증 매개체(pro-inflammatory mediator)이지만 과잉 생산은 시험관 내 수준에서 TNF-α 및 IL-6과 같은 대표적인 사이토카인 수준을 증가시킨다. 따라서 본 발명의 M-NO 겔이 사이토카인 TNF-α 및 IL-6 수준을 감소시킬 수 있는지 여부를 확인하였다.
구체적으로 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포주에 M-NO 겔 및 대조군 겔로 처리(250 μg/mL)하고 24시간 배양한 후, 세포 배지의 상청액의 전-염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-6을 ELISA에 의해 정량화하였으며, 결과는 도 11e 및 11f에 나타내었다.
도 11e 및 11f에서 확인할 수 있는 바와 같이, M-NO 겔 처리 후 NO로 인해 유도된 전-염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 수준이 크게 감소하여 본 발명의 M-NO 겔이 과잉 생산된 NO를 효과적으로 소거할 수 있음을 확인하였으며, 이에 따라 염증을 감소시켜 다양한 염증성 질환을 치료할 수 있음을 확인하였다.
(4) NO 포집에 따른 M-NO 겔의 팽창 확인
LPS에 의해 자극되거나 자극되지 않은 배양된 RAW 264.7 또는 NIH/3T3 세포주에 M-NO 겔 및 대조군 겔을 처리 후 밤새 배양하고 NO 포집에 따른 M-NO 겔의 팽창 여부를 확인하였으며, 결과는 도 11g 및 11h에 나타내었다.
상기 도 11g 및 11h에서 확인할 수 있는 바와 같이, M-NO 겔은 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포주에서 NO에 반응하여 현저하게 팽창할 수 있음을 확인하여 본 발명의 M-NO 겔이 주문형 방출에 유리한 조건을 가지고 있음을 확인하였다.
실험예 6. 류마티스 관절염 치료효과 확인 (1)
류머티스 관절염(RA) 동물모델인 콜라겐 유도 관절염(collagen-induced arthritis, CIA) 마우스에서 본 발명의 M-NO 겔의 류머티스 관절염에 대한 치료 효과를 확인하였다(도 12a).
(1) 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델의 준비
10 mM 아세트산에 용해시킨 CII(collagen type II, 2 mg/mL) 및 CFA(complete Freund's adjuvant, 1 mg/mL) 혼합물의 유화 용액(1:1, v/v) 100 μL를 6주령 DBA/1j 마우스의 꼬리에 피하주사하여 1차 면역화하였다.
2주 후, 10 mM 아세트산에 용해시킨 CII(2 mg/mL) 및 IFA(incomplete freud''s adjuvant, 1 mg/mL) 혼합물의 유화 용액(1:1, v/v) 100 μL를 마우스의 꼬리에 피하주사하였다. 그리고 1차 면역화 4주 후 RA 모델 마우스를 무작위로 8개 군으로 분배하고 각 샘플 20 μL를 CIA 마우스의 관절 내에 주사하였다. 제자리부합 하이드로겔은 이중 주사기 시스템(하나의 시린지에는 HA-N3(2.5 wt%) 및 가교제(0.04 wt%)를 포함, 다른 시린지에는 마이셀(2 wt%) 및 Cu(I)(0.02 wt%) 포함)을 통해 주사하였다. 덱사메타손이 담지된 M-NO 겔은 1 wt%에서 하이드로겔 시스템과 일치하도록 2배 희석되었다(담지량: 5.02%, 용량: 0.5 mg/kg).
각각의 실험군은 하기와 같이 분류된다.
(A) 면역화되지 않은 건강한 마우스
(B) RA 모델 마우스를 식염수로 처리된 군
(C) RA 모델 마우스를 덱사메타손이 담지된 마이셀 구조체로 처리된 군
(D) RA 모델 마우스를 DA-NOCCL로 처리된 군
(E) RA 모델 마우스를 M-NO 겔로 처리된 군
(F) RA 모델 마우스를 대조군 겔(NO 비반응성)로 처리된 군
(G) RA 모델 마우스를 덱사메타손이 담지된 M-NO 겔로 처리된 군
(H) RA 모델 마우스를 덱사메타손이 담지된 대조군 겔(NO 비반응성)로 처리된 군
(2) 발의 부피 변화 확인 및 관절염에 대한 임상 점수 평가
RA 마우스 모델에서의 시간 경과에 따른 발 부피 변화는 각각의 RA 마우스 모델 실험군에서 식염수를 처리한 군(B)과 상대적으로 비교하여 통계적으로 분석하였으며, 결과는 도 12b에 나타내었다. 또한, 4주, 6주 및 8주에서의 대표적인 마우스 뒷발 이미지는 도 12c에 나타내었다.
도 12b 및 12c에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 M-NO 겔 및 덱사메타손이 담지된 M-NO 겔로 처리된 군에서는 유의미한 발의 부피 감소를 나타내었다.
또한, 시간 경과에 따른 관절염 임상점수는 4주 내지 8주 동안 임상점수를 모니터링하면서 표준 채점 방법(척도 0-5)에 따라 블라인드 테스트를 통해 평가하였으며, 결과는 도 12d 및 12e에 나타내었다. 관절염 평가에 따른 임상점수 및 평가 기준은 하기와 같다.
0: 임상 징후 없음
1: 최소 미만성 홍반/부종(1 또는 2개의 발가락에 영향)
2: 경미한 미만성 홍반/부종(3개 이상의 발가락에 영향)
3: 중증도 미만성 홍반/부종(전체 발)
4: 뚜렷한 미만성 홍반/부종(전제 발 및 발목)
5: 심한 미만성 홍반/부종(전체 발), 손가락을 구부릴 수 없음(관절유착증)
도 12d 및 12e에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 M-NO 겔 및 덱사메타손이 담지된 M-NO 겔로 처리된 군에서는 유의미한 임상점수의 감소를 나타내었다.
상기 결과에서 확인한 바에 의하면, 본 발명의 M-NO 겔 및 덱사메타손이 담지된 M-NO 겔은 질환의 진행을 늦출 수 있을 뿐만 아니라 관절염 증상 자체를 완화시킬 수 있다는 점을 확인할 수 있다. 특히 덱사메타손이 담지된 M-NO 겔은 거의 완전한 관절염의 증상의 완화를 나타내었다.
(3) 운동성 평가
RA 마우스 모델에서의 운동 활성을 평가하기 위해 로타로드 분석(rotarod assay)을 수행하였다.
구체적으로 1차 면역화 전, 마우스가 안정된 낙하지연(latency to fall)에 도달하기 위해 로타로드에 머무르도록 3일 동안 훈련하였다. 이후 10 rpm, 120s의 고정 속도에서 낙하지연 시간을 기록하였으며, 결과는 도 12f 및 12g에 나타내었다.
상기 도 12f 및 12g에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 M-NO 겔 및 덱사메타손이 담지된 M-NO 겔로 처리된 군에서는 낙하지연 시간이 증가하였으며, 특히 덱사메타손이 담지된 M-NO 겔로 처리된 군에서는 유의미한 낙하지연 시간의 증가를 나타내어 마우스의 운동성의 점진적인 개선을 확인할 수 있었다.
실험예 7. 류마티스 관절염 치료효과 확인 (2)
본 발명의 M-NO 겔의 류마티스 관절염 치료효과를 집중적으로 조사하기 위해 8주차에 일련의 추가 실험을 수행하였다.
(1) 뼈 및 관절 형태 확인
뼈 및 관절 형태는 샘플을 처리한 각 실험군의 대표적인 앞발 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(microcomputed tomography, micro-CT) 이미지를 통해 확인하였으며, 결과는 도 13a에 나타내었다.
도 13a에서 확인할 수 있는 바와 같이, 다른 실험군과 대비하여 본 발명의 M-NO 겔 및 덱사메타손이 담지된 M-NO 겔로 처리된 군에서는 뼈의 침식이 적어 뼈의 명확한 경계를 확인할 수 있었다.
이는 본 발명의 하이드로겔이 RA 병변에서 과생산된 일산화질소의 소거로 인해 산화적/질산화적 스트레스 및 파골 세포(osteoclasts)의 상향 조절을 방지할 수 있다는 점을 나타내는 것이다.
(2) 조직학적 분석
샘플을 처리한 각 실험군의 관절 조직의 조직학적 분석(Histological assays)은 8주차에 희생된 마우스의 관절 조직을 헤마톡실린 및 에오신(H&E), 마손 삼색(masson's trichrome) 및 사프라닌-O(safranin-O)으로 염색하여 관찰하였으며, 분석 결과 및 블라인드 테스트를 통해 표준 채점 방법(척도 0-4)에 따라 평가된 연골 손상 정도는 도 13b 및 13c에 나타내었다(B: 뼈, C: 연골). 임상점수 및 평가 기준은 하기와 같다.
0: 손상 없음, 정상적인 활동
1: 단일 지점으로 제한되는 최소 미란(erosion)
2: 제한된 범위에서의 경미한/중증도의 미란
3: 뚜렷한/광범위한 미란
4: 대부분 손상
상기 도 13b 및 13c에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 M-NO 겔 및 덱사메타손이 담지된 M-NO 겔이 손상된 연골 및 관절강을 회복할 수 있음을 확인하였다.
(3) TNF-α 및 IL-6 수준 및 NO 농도 확인
혈청 및 발 조직액에서의 전-염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 수준은 8주차에 제조자의 프로토콜에 따라 ELISA를 통해 정량화하여 확인하였다. NO 수준은 그리스 분석을 통해 결정하였으며, 결과는 도 13d 내지 13h에 나타내었다.
도 13d 내지 13h에서 확인할 수 있는 바와 같이, 전-염증성 사이토카인 수준은 혈청 및 발 조직액 모두에서 본 발명의 M-NO 겔 및 덱사메타손이 담지된 M-NO 겔을 처리한 군은 유의미한 감소를 나타내었다. 특히, 덱사메타손이 담지된 M-NO 겔을 처리한 군은 정상 상태까지 크게 감소함을 확인할 수 있었다.
또한, 8주차 샘플 처리된 RA 마우스의 발 조직에서 NO 수준을 정량화한 데이터는 도 13h에 나타내었다. 상기 도 13h에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 M-NO 겔 및 덱사메타손이 담지된 M-NO 겔을 처리한 군은 발 조직액에서 NO 농도가 유의하게 감소함을 확인하였다.

Claims (32)

  1. 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물로부터 제조되는 제자리부합(in situ hybridization) 하이드로겔:
    [화학식 1]
    Figure 112021019873252-pat00024

    [화학식 2]
    Figure 112021019873252-pat00025

    [화학식 3]
    Figure 112021019873252-pat00026

    여기서,
    상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1-C10 알킬렌이고,
    상기 n 및 m은 각각 1 내지 1000의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R1 및 R2는 C2 알킬렌인 제자리부합 하이드로겔.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 일산화질소를 포집하여 소거하는 것인 제자리부합 하이드로겔.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 일산화질소와 반응하여 분해되는 것인 제자리부합 하이드로겔.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 자가조립에 의해 마이셀 구조체를 형성하는 것인 제자리부합 하이드로겔.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 마이셀 구조체는 10 내지 1000 nm의 균일한 직경을 갖는 것인 제자리부합 하이드로겔.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 상기 화학식 2 및 3으로 표시되는 화합물 간의 클릭화학 반응에 의해 제조되는 것인 제자리부합 하이드로겔.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 소수성 약물을 더 포함하는 것인 제자리부합 하이드로겔.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 소수성 약물은 상기 화학식 2로 표시되는 화합물의 자가조립에 의해 형성된 마이셀 구조체에 담지된 것인 제자리부합 하이드로겔.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 소수성 약물은 항염증제인 제자리부합 하이드로겔.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 항염증제는 덱사메타손인 제자리부합 하이드로겔.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 소수성 약물은 상기 마이셀 구조체 전체 중량 대비 3 내지 7 중량%로 함유된 것인 제자리부합 하이드로겔.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 소수성 약물 및 친수성 약물을 더 포함하는 것인 제자리부합 하이드로겔.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 소수성 약물 및 친수성 약물은 표적부위에서 동시에 방출되는 것인 제자리부합 하이드로겔.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1 내지 3의 화합물은 표적부위에 동시-주사(co-injection)되는 것인 제자리부합 하이드로겔.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 동시-주사는 이중 주사기 시스템(dual syringe system)에 의한 것인 제자리부합 하이드로겔.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 상기 화학식 1 내지 3의 화합물을 표적부위에 주사 후 0.5 내지 10분 이내 형성되는 것인 제자리부합 하이드로겔.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 염증성 질환 치료용인 제자리부합 하이드로겔.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 생체 내 일산화질소가 과생산되는 양상을 나타내는 질환인 제자리부합 하이드로겔.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 류마티스 관절염인 제자리부합 하이드로겔.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 TNF-α 및 IL-6 수준을 감소시키는 것인 제자리부합 하이드로겔.
  22. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 점성보충제용인 제자리부합 하이드로겔.
  23. 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물을 포함하는 제자리부합(in situ hybridization) 하이드로겔 전구체 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112021019873252-pat00027

    [화학식 2]
    Figure 112021019873252-pat00028

    [화학식 3]
    Figure 112021019873252-pat00029

    여기서,
    상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1-C10 알킬렌이고,
    상기 n 및 m은 각각 1 내지 1000의 정수이다.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 조성물은 소수성 약물을 더 포함하는 것인 제자리부합 하이드로겔 전구체 조성물:
  25. 제24항에 있어서,
    상기 소수성 약물은 상기 화학식 2로 표시되는 화합물의 자가조립에 의해 형성된 마이셀 구조체에 담지된 것인 제자리부합 하이드로겔 전구체 조성물.
  26. 제23항에 있어서,
    상기 조성물은 소수성 약물 및 친수성 약물을 더 포함하는 것인 제자리부합 하이드로겔 전구체 조성물.
  27. a) 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 포함하는 제1 전구체 조성물을 제조하는 단계;
    b) 하기 화학식 2로 표시되는 화합물로부터 형성된 마이셀 구조체를 포함하는 제2 전구체 조성물을 제조하는 단계; 및
    c) 상기 제1 전구체 조성물 및 제2 전구체 조성물을 동시-주사하는 단계;를 포함하는 제자리부합(in situ hybridization) 하이드로겔 제조방법:
    [화학식 1]
    Figure 112021019873252-pat00030

    [화학식 2]
    Figure 112021019873252-pat00031

    [화학식 3]
    Figure 112021019873252-pat00032

    여기서,
    상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1 내지 C10의 알킬렌이고,
    상기 n 및 m은 각각 1 내지 1000의 정수이다.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 제1 전구체 조성물 전체 질량 대비 0.02 내지 0.06 wt%;
    상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 제2 전구체 조성물 전체 질량 대비 1.00 내지 3.00 wt%; 및
    상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은 제1 전구체 조성물 전체 질량 대비 1.00 내지 1.50 wt%;로 포함되는 것인 제자리부합 하이드로겔 제조방법.
  29. 제27항에 있어서,
    상기 제2 전구체 조성물은 소수성 약물을 더 포함하는 것인 제자리부합 하이드로겔 제조방법.
  30. 제27항에 있어서,
    상기 제1 전구체 조성물은 친수성 약물을 더 포함하고, 제2 전구체 조성물은 소수성 약물을 더 포함하는 것인 제자리부합 하이드로겔 제조방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서,
    상기 소수성 약물은 마이셀 구조체에 담지된 것인 제자리부합 하이드로겔 제조방법.
  32. 제27항에 있어서,
    상기 동시-주사는 이중 주사기 시스템(dual syringe system)에 의한 것인 제자리부합 하이드로겔 제조방법.
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