CN116867837A - 一氧化氮敏感性水凝胶 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种一氧化氮敏感性水凝胶，所述水凝胶借助于点击化学反应在靶标部位通过原位杂交形成，因为是利用一氧化氮敏感的交联剂制造，因此可以有效地对在靶标部位过表达的一氧化氮进行捕获和清除，进而，担载到水凝胶中的药物可以在需要治疗的靶标部位局部且选择性地释放，因此可以有效地适用于对因为一氧化氮的过表达而导致的炎症性疾病进行预防或治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种一氧化氮敏感性水凝胶，所述水凝胶借助于点击化学反应在靶标部位通过原位杂交形成，因为是利用一氧化氮敏感性的交联剂制造，因此可以有效地对在靶标部位过表达的一氧化氮进行捕获和清除，进而，担载到水凝胶中的药物可以在需要治疗的靶标部位局部且选择性地释放，因此可以有效地适用于对因为一氧化氮的过表达而导致的炎症性疾病进行预防或治疗。
背景技术
一氧化氮(nitric oxide)是一种半衰期只有短短几秒以内的高反应性的自由基分子，从人体的多种细胞生成，而且可以根据在人体内部的浓度起到如神经传递、血管扩张以及抗癌效果等多种作用。
从2010年代后期开始，为了对因为一氧化氮的过度分泌而导致的疾病进行缓解或治疗，正在积极尝试局部性且选择性地对一氧化氮进行捕获。
伴随着所述尝试，开发出了便于注射的基于纳米尺寸的技术，但是具有快速地向注射部位之外的其他脏器扩散并执行清除的问题。例如，因为一氧化氮在正常范围内可以起到生体内的重要作用，因此在非特异性地清除一氧化氮时可能会诱发如全身毒性等多种副作用，以慢性炎症性疾病之一的类风湿性关节炎为例，因为每年最多接种3～4次软骨素注射液，因此会快速地向疾病部位之外的其他脏器扩散并诱发清除的技术并不可取。
此外，类风湿性关节炎是一种以多发性关节炎为特征的不明原因的慢性炎症性疾病。初期会在围绕关节的滑膜上发生炎症，但是炎症会逐渐扩散到周围的软骨以及骨骼，从而导致关节的破坏以及变形。这是一种可能侵犯全身的疾病，不仅局限于关节症状，还可能诱发如贫血、干燥综合征、皮下结节性肺纤维化、血管炎以及皮肤溃疡等关节外症状。
虽然类风湿性关节炎的具体病因目前尚不明确，但是已经得知其主要机制为自身免疫现象。自身免疫是一种因为从外部保护人体的免疫系统出现异常而攻击人体自身的现象。通常来讲，类风湿性关节炎的病因被理解为是如遗传因素以及细菌或病毒感染等。
如上所述的类风湿性关节炎会伴随关节的肿胀、炎症、僵硬以及疼痛，是一种呈现出全身多发性关节炎症状的难治性自身免疫疾病，会为患上该疾病的患者带去巨大的痛苦。
因此，需要开发出一种可以在靶标部位局部性地长期捕获一氧化氮，进而可以借助于一氧化氮敏感性而根据疾病的恶化程度同时传递治疗剂，从而对与一氧化氮的过度表达相关的疾病进行患者或治疗的全新技术。
发明内容
提供一种可以局部性地对体内过度生成的一氧化氮进行捕获和去除，进而可以根据一氧化氮的浓度在疾病部位局部性且选择性地释放出担载到水凝胶中的药物，从而用于对炎症性疾病进行预防或治疗的一氧化氮敏感性水凝胶。
接下来，将对其进行详细的说明。本发明中所公开的各种要素的所有组合都属于本发明的范畴。此外，并不能认为本发明的范畴因为下述的具体说明而受到限定。
本发明提供一种利用以下述化学式1至化学式3表示的化合物制造出来的原位杂交(in situ hybridization)水凝胶。
【化学式1】
【化学式2】
【化学式3】
其中，
所述R1以及R2各自独立地为C1-C10的亚烷基，
所述n以及m分别为1至1000的整数。
在本发明中，“Cx-Cy”(其中，x、y为1以上的整数)是指碳数量。例如，C1-C10的亚烷基是指碳数量为1以上10以下的亚烷基，而C1-C10的烷基是指碳数量为1以上10以下的烷基。
在本发明中，“烷基”是指直链或支链的饱和烃基，包括如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基以及正癸基等。
在本发明中，“亚烷基”是指从如上所述定义的烷基衍生的2价的官能团。
在本发明中，“原位(in situ)”可以与“原地”或“原位置”互换使用，是指“给药部位”或“靶标部位”。
在本发明中，“原位杂交(in situ hybridization)”是指在将可以形成水凝胶的前驱体物质注入到患者的体内之后，在所需要的体内组织、器官或体腔内的靶标部位借助于前驱体物质的结合发生凝胶化的现象。
在本发明中，“患者”是指需要对特定状态或疾病进行治疗的任意的个体或对象，可以是哺乳类，较佳地可以是人类。
本发明的原位杂交水凝胶并不需要执行外科移植手术，而是可以通过微创技术在体内通过单纯的前驱体物质的混合形成水凝胶，因此可以为接受治疗的患者创造舒适感，而且可以在体内靶标部位局部性且选择性地形成水凝胶，因此尤其是可以在需要治疗的部位达成优秀的治疗效果。
在本发明中，以化学式1表示的化合物可以在形成水凝胶时起到交联剂的作用。
【化学式1】
(所述R1以及R2各自独立地为C1-C10的亚烷基)
在本发明中，“交联剂”是指通过使化合物彼此结合而形成网状(network)结构的物质，在本发明的实施例中，以化学式1表示的结构可以是所述R1以及R2为C2亚烷基的以下述DA-NOCCL表示的化合物，但是并不限定于此。
[DA-NOCCL]
在本发明中，以化学式1表示的化合物可以起到对过度生成的一氧化氮进行捕获和去除的作用，因此使用以所述化学式1表示的化合物制造出来的本发明的水凝胶可以对体内过度生成的一氧化氮进行捕获和去除。
此外，本发明的以化学式1表示的化合物可以借助于一氧化氮敏感性发生分解，因此从以所述化学式1表示的化合物制造出来的本发明的水凝胶可以借助于一氧化氮敏感性发生分解。
在本发明中“敏感(性)”是指以对某种环境条件敏感的方式发生反应，在本说明书中，“敏感(性)”可以与“反应(性)”互换使用。
在后续说明的试验例中，验证了本发明的水凝胶可以吸收一氧化氮并膨胀，从而确认了可以对体内过度生成的一氧化氮进行捕获和去除，并有效地对因为一氧化氮的过度生成而导致的疾病进行治疗。此外，还验证了本发明的水凝胶可以借助于一氧化氮敏感性发生分解，从而确认了可以将结合到水凝胶网状结构内的微胶粒结构体选择性地释放到发生疾病的部位，并将担载到所述微胶粒结构体中的药物局部性、选择性且集中性地传递到发生疾病的部位。此外，还确认了本发明的水凝胶的分解程度会依赖于NO浓度发生变化，从而可以根据疾病的严重程度对药物释放进行调节。
在本发明中，以化学式2表示的化合物也被称之为PLA-b-PEG-N3嵌段共聚物，可以借助于通过叠氮基的点击化学反应与以化学式1表示的化合物的炔基结合。
【化学式2】
(所述n以及m分别为1至1000的整数)
以所述化学式2表示的化合物可以借助于自组装(self-assembly)形成微胶粒结构体。
在本发明中，“微胶粒(micelle)”是指在水溶液中由内部的疏水性区域以及外侧的亲水性区域构成的系统，在本发明中，使用以化学式2表示的化合物即PLA-b-PEG-N3嵌段共聚物形成微胶粒结构体。
在本发明中，微胶粒结构体可以将疏水性药物担载到微胶粒结构体并特异性地在疾病部位释放，从而可以在对因为过度生成的一氧化氮而导致的疾病进行治疗时实现复合治疗，即通过去除一氧化氮的治疗以及通过药物的治疗。
在本发明的实施例中，所述微胶粒结构体可以具有10至100nm的均匀直径，较佳地可以是70至900nm，更较佳地可以是70至500nm。在不足所述范围的情况下，可能会导致无法担载对需要治疗的疾病进行治疗所需要的足够药物的问题，而在超出所述范围的情况下，可能会导致在注射的便利性方面不适合的问题。
在本发明中，所述微胶粒结构体可以被固定到水凝胶的网状结构。所述微胶粒结构体可以在水凝胶借助于一氧化氮敏感性发生分解时从水凝胶释放出来，从而选择性地将所担载的药物传递到过度生成一氧化氮的部位。
在本发明中，以化学式3表示的化合物即基于透明质酸的聚合物链也被称之为HA-N3，起到构成本发明的水凝胶主链(backbone)的作用。
【化学式3】
(所述n分别为1至1000的整数)
在本发明中，所述“透明质酸(hyaluronic acid)”是由葡萄糖醛酸以及乙酰氨基葡萄糖构成的线性多糖，是存在于构成细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)、关节润滑液以及软骨的载体中的葡糖氨基葡聚糖中的一种。交联透明质酸因为粘弹性的性质而可以作为关节润滑液使用，而且在适用于生体内时在免疫方面也没有问题，因此是一种可以适用于组织工学以及药物传递系统中的优秀的生物相容性材料。
在本发明中，以化学式3表示的化合物可以借助于通过叠氮基的点击化学反应与以化学式1表示的化合物的炔基结合。
在本发明中，水凝胶可以借助于以所述化学式1表示的化合物与以所述化学式2以及化学式3表示的化合物之间的点击化学反应制造。
在本发明中，“点击化学(click chemistry)”是一种在生物体的复杂的环境中发生的针对性反应，是指与可以在特定的条件下快速、有效且可预测地结合的有机合成相关的模块化方法。例如，叠氮(azide)-炔基(alkyne)环加成反应(cyclo addition)因为其热力学驱动力极高而可以非常有效地以高收率形成叠氮化合物以及炔基化合物的结合，因此在与如低聚物以及聚合物等聚合物的反应中也可以以高收率形成分子间结合。
在本发明的实施例中，以化学式1表示的化合物的炔基(alkyne)以及以化学式2表示的化合物的叠氮基(azide，-N3)；以及以化学式1表示的化合物的炔基(alkyne)以及以化学式3表示的化合物的叠氮基(azide，-N3)将借助于点击化学反应分别形成1,2,3-三唑(1,2,3-triazole)，借此可以形成本发明的包含微胶粒结构体的一氧化氮反应性原位杂交水凝胶。
在本发明中，因为水凝胶包含生体活性物质，因此可以进一步提升对因为过度表达的一氧化氮而导致的炎症或疾病进行治疗的效果。所述生体活性物质是用于对疾病进行治疗、治愈、预防或诊断等的物质，如细胞、生长因子以及激素等蛋白或肽、核酸、细胞外基质物质以及具有医药治疗功能的药物等，但是并不限定于此，只要是已知对特定疾病具有效果的生体活性物质，就可以不受限制地适用于水凝胶并借此提升治疗效果。为了使得所制造出来的水凝胶包含生体活性物质，可以制造出包含生体活性物质的某一种溶液，然后在靶标部位与其他溶液进行混合而形成水凝胶。此外，也可以通过使用注射器在靶标部位对包含生体活性物质的各两种溶液进行混合而形成水凝胶。
在本发明中，水凝胶还可以包含疏水性药物，所述疏水性药物可以被担载到通过以所述化学式2表示的化合物的自组装而形成的微胶粒结构体中。所述微胶粒结构体是在水中通过具有亲水性以及疏水性部分的嵌段共聚物的自组装而形成，内部具有强疏水性，因此可以轻易地将疏水性药物担载到所述微胶粒结构体的内部，这是因为药物以及微胶粒结构体内部都呈现出疏水性而引起的物理现象，与利用化学结合的药物传递体相比可以提升药物含量。
在本发明中，“疏水性”是包含不与水混合的非极性或低极性物质的含义，但是并不限定于此，只要是可以稳定地存在于本发明的微胶粒结构体的疏水性内部的物质，都包含于疏水性物质中。
在本发明中，疏水性药物可以从镇痛剂、抗炎剂、免疫抑制剂或所述之组合中选择，较佳地可以是抗炎剂，但是并不限定于此。
在本发明中，“抗炎剂”也被称之为消炎剂，是指具有可以消除炎症的性质或通过参与炎症过程而对其进行抑制的药物。
所述抗炎剂可以是从如21-乙酰氧基孕烯醇酮、阿氯米松、二丙酸阿氯米松、阿尔孕酮、安西奈德、倍氯米松、倍他米松、二丙酸倍他米松、倍他米松磷酸钠、戊酸倍他米松、布地奈德、氯泼尼松、环索奈德、氯倍他索、氯倍他索17-丙酸酯、氯倍他松-17-丁酸酯、氯倍他松、氯可托龙、氯泼尼醇、皮质酮、可的松、醋酸可的松、可的伐唑、地夫可特、地索奈德、脱氧米松、地塞米松、地塞米松磷酸钠、双氟拉松、双氟可龙、双氟泼尼酯、甘草次酸、氟扎可特、氟氯奈德、氟米松、氟华奈、氟轻松、氟轻松醋酸酯、氟轻松、氟可丁丁酯、氟可龙、氟可龙己酸酯、氟可龙新戊酸酯、氟米龙、氟尼缩松、氟培龙醋酸酯、氟泼尼定醋酸酯、氟泼尼龙、氟氢缩松、氟替卡松丙酸酯、福莫可他、哈西奈德、卤倍他索丙酸酯、卤米松、卤泼尼松醋酸酯、氢可他酯、氢化可的松、氢化可的松醋酸酯、氢化可的松-17-丙酮酸酯、氢化可的松17-丁丙酸酯、氢化可的松-17-丁酸酯、氢化可的松-17-戊酸酯、氯替泼诺、马泼尼酮、甲羟松、甲泼尼松、甲泼尼龙、莫米松、莫米松糠酸酯、帕拉米松、帕拉米松醋酸酯、泼尼卡酯、泼尼松龙、泼尼松龙25-二乙氨基-醋酸酯、泼尼松龙磷酸钠、泼尼松、泼尼松龙戊酸酯、泼尼立定、利美索龙、替可的松、替可的松新戊酸酯、曲安奈德、缩丙酮曲安奈德、醇曲安奈德、苯曲安奈德以及己曲安奈德构成的组中选择的一种以上，在本发明的实施例中，所述抗炎剂可以是地塞米松，但是并不限定于此。
此外，在本发明的实施例中，与微胶粒结构体的整体重量相比可以含有3至7重量％的疏水性药物，但是并不限定于此。
本发明的水凝胶还可以包含疏水性药物以及亲水性药物。
在本发明中，所述疏水性药物以及亲水性药物可以在靶标部位同时释放，此时，所述疏水性药物的释放可以是基于侵蚀(erosion-based)的释放，而所述亲水性药物的释放可以是费克(Fickian)扩散。
在后续说明的试验例中，确认了本发明的水凝胶可以将疏水性药物担载到水凝胶的疏水性区域即微胶粒内部，并将亲水性药物担载到水凝胶的水凝胶的亲水性区域，而且可以将所述两种药物同时释放到需要治疗的靶标部位。此外，本发明的水凝胶的药物释放程度可以根据一氧化氮的浓度发生变化，这是指可以根据疾病的恶化程度对药物释放进行调节，同时表明可以根据需要治疗的疾病的状态进行个性化治疗。
在本发明中，用于制造水凝胶的化学式1至化学式3的化合物可以同时注射(co-injection)到靶标部位。
在本发明中，“同时注射(co-injection)”是指化学式1至化学式3的化合物以适合于注射的剂型，例如液体状态一起注射到患者的体内靶标部位。在本发明的实施例中，包含化学物1至化合物3的化合物的液体形态的组合物可以在从针头(tip)排出之后进入到患者体内的靶标部位之前均匀混合，进而以混合物的形态注射到靶标部位，并在脱离注射器之后在体内发生凝胶化。本发明的化学式1至化学式3的化合物可以在同时注射到靶标部位之后借助于点击化学反应自发性地结合并形成水凝胶。
在本发明中，所述同时注射可以通过双注射器系统(dual syringe system)或任意的其他适当的注射器系统达成，较佳地可以利用双注射器系统执行。在本发明的实施例中，以化学式1至化学式3表示的化合物可以在同时注射之前，例如在通过注射的同时挤出、混合并在患者的体内通过注射针的注入等一系列过程发生之前物理性分离。在本发明的实施例中，包含以化学式1以及化学式3表示的化合物的组合物可以与包含以化学式2表示的化合物的组合物物理性分离。在本发明的实施例中，包含以化学式1以及化学式2表示的化合物的组合物可以与以化学式3表示的化合物物理性分离。在本发明的实施例中，包含以化学式1表示的化合物的组合物可以与以化学式2以及化学式3表示的化合物物理性分离。
本发明的水凝胶可以在将所述化学式1至化学式3的化合物注射到靶标部位之后的0.5至10分钟以内，较佳地在0.5至1分钟以内形成。在水凝胶形成时间(凝胶化时间)不足所述范围的情况下，可能会因为以化学式1至化学式3表示的化合物混合之后的初期交联结合而导致向靶标部位的注射不顺利的问题，而在超出所述范围的情况下，可能会因为所注射的物质向周围组织扩散而导致不适合于在靶标部位局部性地形成水凝胶的问题。传统的通过温度或紫外线(UV)照射等方式开发出来的现有的原位(in situ)注射型水凝胶具有如相变时间较慢等问题。本发明的水凝胶可以借助于点击化学反应在极短的时间内发生凝胶化，从而解决了现有技术中存在的问题。
本发明的水凝胶可以作为炎症性疾病的预防、缓解或治疗用途使用。
在本发明中，“炎症性疾病”是指以炎症为主要病变的疾病，在本发明中，所述炎症性疾病可以是呈现出生体内生成过度的一氧化氮的症状的炎症性疾病。
本发明的水凝胶可以对过度生成的一氧化氮进行捕获和去除。在因为应激等原因造成免疫系统的瘫痪并导致生体内生成过度的一氧化氮的情况下，可能会导致自身免疫疾病或炎症性疾病。因此，可以对过度生成的一氧化氮进行捕获和去除的本发明的水凝胶可以有效地对因为一氧化氮的过度生成而诱发的疾病进行治疗。
此外，所述炎症性疾病可以是因为关节炎症而导致的疾病，例如可以是如未分化脊柱关节病、未分化关节病、关节炎、因为病毒或细菌感染而造成的慢性炎症疾病、类风湿性关节炎、反应性关节炎、骨关节炎以及骨质疏松症等，但是并不限定于此。在本发明的实施中，所述炎症性疾病可以是类风湿性关节炎，但是并不限定于此。
所述类风湿性关节炎是自身免疫疾病中的一种，是因为高浓度一氧化氮而发病的疾病。因此，本发明的水凝胶可以通过在高浓度的一氧化氮环境下对一氧化氮进行捕获而对细胞因子诱导的破骨细胞的骨吸收进行抑制，而且可以通过在关节中防止细胞死亡而对类风湿性关节炎进行缓解或治疗。
在本发明中，“缓解或治疗”是指降低疾病症状的严重程度、延长没有疾病症状的期间的频率以及持续时间或防止因为疾病痛苦而导致的损伤或残疾。
本发明的水凝胶可以降低促炎性细胞因子即肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及白细胞介素-6(IL-6)水准。
在本发明中，“促炎性细胞因子(pro-inflammatory cytokine)”主要是指因为活化的巨噬细胞而生成并促进全身炎症的细胞因子。促炎性细胞因子包括如肿瘤坏死因子-α(TNF-α，tumor necrosis factor-α)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)以及白细胞介素-8(IL-8)等，会在发生炎症反应时同时出现并作为炎症反应时的指标。
在后续说明的试验例中，确认了在利用本发明的水凝胶进行处理的情况下，可以降低促炎性细胞因子即肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及白细胞介素-6(IL-6)水准，从而确认了本发明的水凝胶可以有效地适用于对炎症性疾病进行治疗。
本发明的水凝胶可以作为粘性补充剂(visco-supplement)用途使用。
在本发明中，“粘性补充剂(visco-supplement)”是指通过将凝胶状态的透明质酸注射到关节部位而补充粘液性润滑液的物质。
在后续说明的试验例中，确认了本发明的水凝胶可以在破裂之后伴随着因为应激而诱发的流动呈现出几乎完全恢复的效果，从而可以有效地作为粘性补充剂使用。这并不局限于特定的理论，而是被认为是因为透明质酸(HA)链之间的分子间氢键以及微胶粒结构的熵驱动的再连接(entropy-driven reassociation)而引起的。
在本发明的另一形态中，提供一种包含以下述化学式1至化学式3表示的化合物的原位杂交水凝胶前驱体组合物。
【化学式1】
【化学式2】
【化学式3】
其中，
所述R1以及R2各自独立地为C1-C10的亚烷基，
所述n以及m分别为1至1000的整数。
在本发明中，“前驱体(precursor)”是指参与生成其他化合物的化学反应的化合物。
本发明的前驱体组合物还可以包含疏水性药物，所述疏水性药物可以被担载到通过以所述化学式2表示的化合物的自组装而形成的微胶粒结构体中。
本发明的前驱体组合物还可以包含疏水性药物以及亲水性药物。
在本发明的另一形态中，提供一种包含下述步骤的原位杂交(insituhybridization)水凝胶的制造方法。
a)制造出包含以下述化学式1表示的化合物以及以下述化学式3表示的化合物的第一前驱体组合物的步骤；
b)制造出包含从以下述化学式2表示的化合物形成的微胶粒结构体的第二前驱体组合物的步骤；以及，
c)对所述第一前驱体组合物以及第二前驱体组合物进行同时注射的步骤。
【化学式1】
【化学式2】
【化学式3】
其中，
所述R1以及R2各自独立地为C1至C10的亚烷基，
所述n以及m分别为1至1000的整数。
在本发明的实施例中，与第一前驱体组合物的整体质量相比可以包含0.02至0.06wt％的以所述化学式1表示的化合物；与第二前驱体组合物的整体质量相比可以包含1.00至3.00wt％的以所述化学式2表示的化合物；以及，与第一前驱体组合物的整体重量相比可以包含1.00至1.50wt％的以所述化学式3表示的化合物；但是并不限定于此。
在本发明的制造方法中，在所述第二前驱体组合物中还可以包含催化剂，在本发明的实施例中的所述催化剂可以是Cu(I)，但是并不限定于此。
在本发明的制造方法中，所述第二前驱体组合物还可以包含疏水性药物，所述疏水性药物可以被担载到通过以所述化学式2表示的化合物的自组装而形成的微胶粒结构体中。
在本发明的制造方法中，所述第一以及第二前驱体组合物还可以包含疏水性药物以及亲水性药物。在本发明的实施例中，疏水性药物可以包含于第二前驱体组合物，亲水性药物可以包含于第一前驱体组合物，或疏水性药物以及亲水性药物可以都包含于第一前驱体组合物或第二前驱体组合物，但是并不限定于此。
在本发明的制造方法中，所述同时注射可以利用双注射器系统(dual syringesystem)执行。
在本发明的制造方法中，所述第一以及第二前驱体组合物可以是适合于非口服给药的悬浮液、溶液或乳液的形态，可以制造成固体或半固体的形态，而且可以包含如悬浮剂、稳定剂、溶解剂和/或分散剂等制剂化剂。
在本发明的实施例中，第一以及第二前驱体组合物可以是液体状态，也可以经过灭菌，但是并不限定于此。此外，可以保存成可防止如细菌或霉菌等微生物的污染作用的形态。此外，第一以及第二前驱体组合物可以是粉末形态，也可以经过灭菌。在如上所述的情况下，可以在使用之前利用如注射用水等制剂化成液体形态。
本发明提供一种包括利用本发明的水凝胶向患有炎症性疾病的个体进行给药的步骤的炎症性疾病的预防、缓解或治疗方法。
在本发明中，“给药”是指通过某种适当的方法将本发明的水凝胶导入到患者体内，作为本发明的水凝胶的给药路径，只要是可以达到目标组织，就可以通过任意的一般的路径进行给药，较佳地可以是非口服给药。所述非口服给药可以是如肌内、皮下、关节内以及腹腔内给药等，但是并不限定于此。在本发明的实施中，所述给药可以是关节内给药，但是并不限定于此。
在本发明中，个体包括任意的人类以及非人类动物。术语“非人类动物”可以是如非人灵长类等脊柱动物、羊、狗以及如小鼠、大鼠以及豚鼠等啮齿类。所述个体较佳地可以是人类，具体来讲可以是患有特定疾病的人类。在本说明书中，术语“个体”可以与“对象”或“患者”互换使用。
在本发明的原位杂交水凝胶、前驱体组合物、制造方法以及治疗方法中所提及的事项在不彼此矛盾的情况下可以同等适用，而且为了避免说明书变得过于复杂而对重复记载进行了省略。
本发明的水凝胶可以局部性且选择性地对在体内外过度生成的一氧化氮进行捕获和去除，因此对因为一氧化氮的过度生成而导致的炎症性疾病具有优秀的预防、缓解或治疗效果。
此外，本发明的水凝胶可以担载疏水性和/或亲水性药物，因此可以起到向靶标部位传递药物的传递体的作用，从而通过一氧化氮的捕获以及药物的传递而达成复合治疗效果。
此外，本发明的水凝胶可以借助于一氧化氮敏感性发生分解，因此可以在有一氧化氮存在的环境下使得交联点借助于一氧化氮敏感性发生解离，从而将担载到水凝胶中的药物局部性且选择性地传递到靶标部位。
此外，本发明的水凝胶不需要执行外壳手术，而是可以通过微创方式在靶标部位局部性地形成水凝胶，因此患者的便利性优秀。
此外，本发明的水凝胶可以防止在靶标部位上的快速去除以及向其他脏器的扩散，因此不会出现如全身毒性等现有技术中存在的问题。
此外，本发明的水凝胶可以借助于自愈(self-healing)能力有效地恢复机械特性，因此可以有效地作为粘性补充剂(visco-supplement)使用。
附图说明
图1对本发明的水凝胶的形成过程以及所述所形成的水凝胶借助于一氧化氮反应性使得交联点解离的过程进行了图示化。
图2对以化学式1表示的化合物的合成过程进行了图示。
图3是在以化学式1表示的化合物的合成的各个步骤中获取到的化合物的核磁共振氢谱(1H NMR)数据。
图4对以化学式1表示的化合物是否可以与一氧化氮发生反应并分解进行了图示。
具体来讲，图4a对以化学式1表示的化合物与一氧化氮发生反应并分解的机制进行了图示。
图4b对用于确认以化学式1表示的化合物是否与一氧化氮发生反应并分解的核磁共振氢谱(1H NMR)数据进行了图示。
图5对用于确认以化学式1表示的化合物是否与一氧化氮发生反应并分解的傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)(a)以及紫外-可见光吸收光谱仪(UV-Vis)吸光数据(b)进行了图示。
图6对以化学式2表示的化合物的合成过程进行了图示。
图7对在以化学式2表示的化合物合成的各个步骤中获取到的化合物的核磁共振氢谱(1H NMR)光谱数据进行了图示。
图8是以化学式2表示的化合物的傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)、凝胶渗透色谱仪(GPC)、透射电子显微镜(TEM)以及动态光散射光度计(DLS)数据。
具体来讲，图8a对PLA-b-PEG-N3的傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)光谱数据进行了图示。
图8b对PLA-b-PEG-N3的凝胶渗透色谱仪(GPC，Gel Permeation Chromatography)数据进行了图示。
图8c对PLA-b-PEG-N3的透射电子显微镜(TEM，transmission electronmicroscope)图像进行了图示。
图8d对PLA-b-PEG-N3的通过动态光散射光度计(DLS)决定的平均流体力学大小进行了图示。
图9对以化学式3表示的化合物的合成过程进行了图示。
图10对在以化学式3表示的化合物的合成过程中获取到的化合物的核磁共振氢谱(1H NMR)数据进行了图示。
图11至图15对本发明的一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)的特性进行了分析。
具体来讲，图11a通过超低温扫描电子显微镜(Cryogenic scanning electronmicroscopy)对一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)进行了图像化。
图11b对通过动态瞬态测试(dynamic transient test)的一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)的自愈的振动流变学特性进行了图示。
图12a对一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)的自愈概要图进行了图示。
图12b对一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)的频率依赖性振动流变学特性进行了图示。
图12c对一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)以及对照组凝胶(NO非反应性)的NO浓度依赖性振动流变学特性进行了图示。
图13a对一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)的NO去除能力进行了确认。数据表示为平均值±标准偏差(SD)(n＝4)。
图13b对在不同的浓度下伴随时间经过的一氧化氮敏感性水凝胶(M-O凝胶)的相对膨胀比进行了图示。数据表示为平均值±标准偏差(SD)(n＝4)。
图13c对在不同的浓度下伴随时间经过的对照组凝胶(NO非反应性)的相对膨胀比进行了图示。数据表示为平均值±标准偏差(SD)(n＝3)。
图13d对在不同浓度的NO溶液中进行2小时的培养之后的一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)以及对照组凝胶(NO非反应性)的图像进行了图示。比例尺为1cm。
图14a对在一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)中的与同时双重药物释放相关的概要图进行了图示。
图14b对一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)的异硫氰酸荧光素-标记牛血清白蛋白(BSA-FITC)(亲水性物质模型，hydrophilic cargo model)释放曲线图进行了图示。
图14c对对照组凝胶的异硫氰酸荧光素-标记牛血清白蛋白(BSA-FITC)释放曲线图进行了图示。
图14d对一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)的担载到微胶粒结构体的尼罗红(Nile Red)(疏水性物质模型，hydrophobic cargo model)的释放曲线图进行了图示。
图14e对对照组凝胶的尼罗红(Nile Red)释放曲线图进行了图示。
图15a对形成水凝胶之前的PLA-b-PEG-N3微胶粒结构体的平均流体力学大小以及在将一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)与NO溶液(250μM)一起进行24小时的培养之后在上清液中确认到的PLA-b-PEG-N3微胶粒结构体的平均流体力学大小进行了图示。
图15b对一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)的侵蚀后上清液的透射电子显微镜(TEM)图像进行了图示。图像内的白色框代表形成凝胶之前的微胶粒结构体的形态。
图16以及图17对在利用脂多糖(LPS)进行处理的RAW 264.7细胞中的利用脂多糖(LPS)进行处理之后的一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)的反应性以及NO去除能力进行了图示。
具体来讲，图16a对在RAW 264.7以及NIH/3T3细胞株中利用5μg/ml的LPS进行24小时的处理前后的NO浓度进行了图示。
图16b对利用不同浓度的一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)以及对照组凝胶进行处理的RAW 264.7细胞株的细胞生存率进行了图示。数据表示为平均值±标准偏差(SD)(n＝5)。
图16c对一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)的NO去除能力进行了图示，是在利用不同浓度的一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)对RAW 264.7细胞株进行处理并进行24小时的培养之后通过格里斯试剂(Griess assay)对细胞培养基上清液的NO水准进行确认的结果。
图16d对利用一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)以及对照组凝胶进行处理之后利用脂多糖(LPS)活化的RAW 264.7细胞株的共聚焦显微镜图像进行了图示。细胞内的NO以及核分别利用4,5-二氨基荧光素双乙酸酯(DAF-2DA，绿色)以及4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，蓝色)进行了染色，比例尺为100μm。
图17a对利用一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)以及对照组凝胶进行处理之后对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水准进行定量化的结果进行了图示。
图17b对利用一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)以及对照组凝胶进行处理之后的白细胞介素-6(I L-6)水准进行定量化的结果进行了图示。
图17c对利用一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)以及对照组凝胶对经过培养的RAW 264.7或NIH/3T3细胞株(利用脂多糖(LPS)刺激或未刺激)进行处理并进行一整夜的培养之后的一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)以及对照组凝胶的图像进行了图示。
图17d对利用一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)以及对照组凝胶对经过培养的RAW 264.7或NIH/3T3细胞株(利用脂多糖(LPS)刺激或未刺激)进行处理并进行一整夜的培养之后的相对膨胀比例进行了图示。
图17e是对用于降低促炎性细胞因子水准的一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)的体外(in vitro)NO-反应性以及去除能力进行图示的概要图。
图18至图22对在类风湿性关节炎动物模型即胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)小鼠中的本发明的一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)的类风湿性关节炎治疗效果的确认结果进行了图示。
具体来讲，图18a对整体试验时间线进行了图示。
图18b对样本处理之后在类风湿性关节炎(RA)小鼠模型中的相对足体积变化进行了图示。关于相对足体积，将利用食盐水对类风湿性关节炎(RA)模型小鼠进行处理的组(B)与其他试验组进行了比较，并使用单因素方差分析(ANOVA)进行了统计学分析(**p<0.01，***p<0.001)。
图19对第4周、第6周以及第8周的代表性的小鼠后足图像进行了图示。
图20a对样本处理之后的类风湿性关节炎(RA)小鼠的时间-依赖性平均临床评分进行了图示。数据表示为平均值±标准偏差(SD)(n＝8)。
图20b对样本处理之后的类风湿性关节炎(RA)小鼠的第8周的平均临床评分进行了图示。将利用食盐水对类风湿性关节炎(RA)模型小鼠进行处理的组(B)与其他试验组进行了比较，并使用单因素方差分析(ANOVA)进行了统计学分析(**p<0.01，***p<0.001)。
图20c对样本处理之后的类风湿性关节炎(RA)小鼠通过疲劳转棒仪分析的伴随时间经过的掉棒延迟时间进行了图示。数据表示为平均值±平均值标准误差(SEM)(n＝8)。
图20d对样本处理之后的类风湿性关节炎(RA)小鼠的第8周的掉棒延迟时间进行了图示。将利用食盐水对类风湿性关节炎(RA)模型小鼠进行处理的组(B)与其他试验组进行了比较，并使用单因素方差分析(ANOVA)进行了统计学分析(**p<0.01，***p<0.001)。
图21对在类风湿性关节炎动物模型即胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)小鼠中的本发明的一氧化氮敏感性水凝胶(M-NO凝胶)的类风湿性关节炎治疗效果的确认结果进行了图示。
具体来讲，图21a对类风湿性关节炎(RA)小鼠模型的前足微型计算机断层扫描(micro-CT)图像进行了图示。红色箭头代表骨骼的破坏以及损伤。
图21b对样本处理之后的关节组织的组织学分析结果进行了图示。比例尺为100μm。
图22a对利用苏木精-伊红(H&E)、马松三色(masson's trichrome)以及番红-O(Safranin-O)染色决定的关节组织的平均组织学评分进行了图示。将利用食盐水对类风湿性关节炎(RA)模型小鼠进行处理的组(B)与其他试验组进行了比较，并使用单因素方差分析(ANOVA)进行了统计学分析(*p<0.05，***p<0.001；n.s.无显著差异)。
图22b对经过样本处理的类风湿性关节炎(RA)小鼠血清标本中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水准的定量结果进行了图示。
图22c对经过样本处理的类风湿性关节炎(RA)小鼠血清标本中的白细胞介素-6(IL-6)进行了图示。数据表示为平均值±标准偏差(SD)(n＝4)，将#与其他组进行了比较，并利用单因素方差分析试验进行了统计学分析(*p<0.05，***p<0.001；n.s.无显著差异)。
图22d对经过样本处理的类风湿性关节炎(RA)小鼠足组织液中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水准的定量结果进行了图示。
图22e对经过样本处理的类风湿性关节炎(RA)小鼠足组织液中的白细胞介素-6(IL-6)水准的定量结果进行了图示。数据表示为平均值±标准偏差(SD)(n＝4)，将利用食盐水对类风湿性关节炎(RA)模型小鼠进行处理的组(B)与其他试验组进行了比较，并使用单因素方差分析(ANOVA)进行了统计学分析(*p<0.05，***p<0.001；n.s.无显著差异)。
图22f对第8周的经过样本处理的类风湿性关节炎(RA)小鼠足组织液中的NO水准的定量结果进行了图示。数据表示为平均值±标准偏差(SD)(n＝4)，将利用食盐水对类风湿性关节炎(RA)模型小鼠进行处理的组(B)与其他试验组进行了比较，并使用单因素方差分析(ANOVA)进行了统计学分析(*p<0.05，***p<0.001；n.s.无显著差异)。
具体实施方式
接下来，将参阅实施例对本发明进行更为详细的说明。但是，这些实施例只是用于对本发明进行示例性的说明，本发明的范围并不因为这些实施例而受到限定。此外，关于在本说明书中没有做出特殊定义的术语，应该理解为在本发明所属的技术领域中通常使用的含义。
制造例1.化学式1的化合物的合成
为了合成出与一氧化氮发生反应的点击式交联剂DA-NOCCL，首先将位于4-硝基-邻苯二胺(4-nitro-o-phenylenediamine)的C2位置的胺基利用盐酸胍(guanidine HCl)作为催化剂选择性地进行了叔丁氧羰基(Boc)-保护。接下来，将4-NO2还原成4-NH2，并将4-戊炔酸(4-pentynoic acid)与各个胺基通过酰胺键结合。接下来，通过在酸条件下进行叔丁氧羰基(Boc)-脱保护而完成合成。所述交联剂DA-NOCCL的合成过程如图2所示，通过核磁共振氢谱(1H NMR)对在合成过程中获取到的各个化合物以及交联剂DA-NOCCL的成功合成与否进行确认的结果如图3所示。
具体的各个合成步骤如下所述。
步骤1：在将4-硝基-邻苯二胺(1g，6.53mmol)以及盐酸胍(95mg，0.91mmol)溶解到20ml的乙醇中并滴加(dropwise)二碳酸二叔丁酯(2.85g，13.06mmol)之后，将所述反应混合物在25℃下进行24小时的剧烈搅拌。对反应完成之后的反应溶液内的有机溶剂进行减压蒸发，并悬浮到蒸馏水中。利用乙酸乙酯(EA)对所述水溶液进行3次提取，并通过将有机部分利用Na2SO4进行洗涤而获取到了橙黄色的粗(crude)固体，接下来通过利用硅胶柱色谱仪(洗脱液：乙酸乙酯(EA)-己烷混合物)进行纯化而获取到了化合物1(1.22g，收率：73.8％)。
【化合物1】
1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ＝8.56(brs,1H,D2O exchangeable),8.30(d,J＝1.6Hz,1H),7.78(dd,J＝9.0,2.7Hz,1H),6.72(d,J＝9.0Hz,1H),6.46(brs,2H,D2Oexchangeable),1.48(s,9H).
步骤2：在向氮环境下的10ml的无水四氢呋喃(THF)中的化合物1(400mg，1.58mmol)溶液添加担载有100mg的钯的活性炭(10％Pd/C)之后，泵入氢气直至压力达到最大40psi，然后将反应混合物在25℃下进行36小时的搅拌。在反应完成之后通过将反应混合物利用硅藻土545垫进行过滤而去除Pd/C，接下来通过在减压条件下进行蒸发而获取到了紫色的固体化合物2(322mg，收率：91.2％)。
【化合物2】
1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ＝8.08(brs,1H,D2Oexchangeable),6.64(d,J＝1.6Hz,1H),6.45(d,J＝8.3Hz,1H),6.16(dd,J＝8.3,2.5Hz,1H),4.29(brs,2H,D2Oexchangeable),4.01(brs,2H,D2O exchangeable),1.45(s,9H)
步骤3：将化合物2(200mg，0.90mmol)、4-戊炔酸(200mg，2.04mmol)、1-羟基苯并三唑(HOBt，280mg，2.07mmol)以及三乙胺(TEA，190mg，1.88mmol)完全溶解到10ml的无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中。在将N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，400mg，2.09mmol)添加到溶液之后，将反应混合物在25℃下进行24小时的剧烈搅拌。在反应完成之后对反应混合物进行减压蒸发并悬浮到CH2Cl2。利用蒸馏水对有机溶剂进行3次提取，并通过将有机部分利用Na2SO4进行洗涤而获取到了亮褐色的粗(crude)固体，接下来通过利用硅胶柱色谱仪(洗脱液：乙酸乙酯(EA)-己烷混合物)进行纯化而获取到了化合物3(285mg，0.74mmol，收率：82.7％)。
【化合物3】
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1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ＝9.99(brs,1H,D2Oexchangeable),9.41(brs,1H,D2Oexchangeable),8.26(brs,1H,D2O exchangeable),7.87(d,J＝2.2Hz,1H),7.39(dd,J＝8.7,2.2Hz,1H),7.27(d,J＝8.7Hz,1H),2.79(t,J＝2.5Hz,2H),2.55-2.41(m,8H),1.47(s,9H)
步骤4：将5ml的三氟乙酸(TFA)在0℃下滴加到悬浮到20ml的CH2Cl2中的化合物3(200mg，0.52mmol)中。接下来，将反应混合物在25℃下进行12小时的剧烈搅拌。在反应完成之后对反应混合物进行减压蒸发并利用饱和碳酸氢钠(NaHCO3)溶液进行中和。将中和的溶液利用CH2Cl2中的5％(v/v)的甲醇进行3次提取，并通过将有机部分利用Na2SO4进行洗涤而获取到了深褐色的固体交联剂DA-NOCCL(138mg，0.49mmol，93.5％)。
[DA-NOCCL]
1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ＝9.70(brs,1H,D2Oexchangeable),9.06(brs,1H,D2Oexchangeable),7.08(d,J＝2.2Hz,1H),7.01(d,J＝8.5Hz,1H),6.70(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),4.88(brs,2H,D2O exchangeable),2.78(dt,J＝14.7,2.4,2H),2.44(m,8H).
在图4以及图5中对所述所合成的交联剂DA-NOCCL与一氧化氮发生反应并分解的机制、对其进行确认的核磁共振氢谱(1H NMR)、傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)以及紫外-可见光吸收光谱仪(UV-Vis)吸光数据进行了图示。
通过图4以及图5可以确认，在饱和的NO溶液中进行培养之后，伯胺的特征峰值消失并形成苯并三唑(benzotriazole)基，表明交联剂DA-NOCCL可以与NO发生反应并分解。
制造例2.化学式2的化合物的合成
为了合成出可以与以化学式1表示的交联剂进行点击反应的化学式2的化合物，在将聚乙二醇(PEG，polyethylene glycol)作为起始物质并将聚乙二醇(PEG)的羟基(hydroxyl group)中的一个在氧化银(Ag2O)催化剂条件下选择性地进行甲苯磺酰化(tosylation)之后，利用溴化物取代甲基磺酰基。将所述所形成的PEG-Br通过与D,L-丙交酯的环化聚合形成PLA-b-PEG-Br的嵌段共聚物。最后，通过利用叠氮化物取代溴化物基而完成合成。在将所合成的10mg的PLA-b-PEG-N3溶解到1ml的四氢呋喃(THF)之后滴加(dropwise)到9ml的水中而形成微胶粒结构体，并通过透析(dialysis)去除了剩余的四氢呋喃(THF)。具体的各个合成步骤如下所述，且合成过程如图6所示。通过核磁共振氢谱(1HNMR)、傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)以及凝胶渗透色谱仪(GPC)对PLA-b-PEG-N3的成功合成进行了确认，分别如图7、8a以及8b所示。
具体的各个合成步骤如下所述。
步骤1：将氧化银(I)(1.74g，7.51mmol)以及碘化钾(KI，0.33g，1.99mmol)添加到溶解在160ml的无水二氯甲烷(CH2Cl2)中的真空-干燥2kDa聚乙二醇(PEG)(10g，5.00mmol)溶液中，接下来添加20ml的无水CH2Cl2中的对甲苯磺酰氯(TsCl，1g，5.25mmol)中并在0℃下进行整夜的剧烈搅拌。在反应完成之后将反应混合物通过硅藻土545垫(Celite 545bed)小心进行过滤并通过减压蒸发获取到了无色油性的生成物。将所述所获取到的生成物通过多重CH2Cl2/乙醚((C2H5)2O)再结晶进行追加提纯，从而获取到了白色固体沉淀物(monoTos-PEG，9.72g，收率：90.9％)。
步骤2：将monoTos-PEG(4.0g，1.86mmol)以及溴化钾(KBr，1.1g，9.24mmol)全部溶解到40ml的无水二甲基甲酰胺(DMF)中，并在搅拌的同时在65℃下进行18小时的反应。在反应完成之后对反应混合物进行减压蒸发并重新分散到CH2Cl2。使得所述生成物通过短硅胶，并通过多重CH2Cl2/(C2H5)2O再结晶进行追加提纯，从而获取到了白色固体沉淀物(monoBr-PEG，3.59g，收率：93.5％)。
步骤3：将monoBr-PEG(1.5g，0.72mmol)以及3,6-二甲基-1,4-二恶烷-2,5-二酮(D,L-丙交酯，2.1g，14.57mmol)溶解到5ml的无水甲苯中。对所述溶液执行多次冻结-解冻循环之后，通过添加锡(II)2-乙基己酯催化剂(Sn(Oct)2，0.01g，0.02mmol)而开始执行聚合。将反应混合物在120℃下进行36小时的剧烈搅拌。在反应完成之后对所述混合物进行减压蒸发并重新分散到CH2Cl2。接下来，将生成物通过多重CH2Cl2/(C2H5)2O再结晶化进行提纯，从而获取到了变色无定形固体沉淀物。将生成物利用蒸馏水进行2天的透析以及后续的冻结干燥，从而对生成物进行了追加提纯(PLA-b-PEG-Br)。在四氢呋喃(THF)(Mn＝5540，PDI＝1.50)下利用凝胶渗透色谱仪(GPC，gel permeation chromatography)对分子量进行了测定。
步骤4：将所述所制造出的PLA-b-PEG-Br(1.1g，0.19mmol)以及过量的叠氮化钠(NaN3，0.45g，6.92mmol)溶解到20ml的无水二甲基甲酰胺(DMF)中，并将反应混合物在50℃下进行3天的剧烈搅拌。在反应结束之后利用蒸馏水进行2天的透析以及后续的冻结干燥，从而对生成物进行了提纯(PLA-b-PEG-N3)。在四氢呋喃(THF)(Mn＝5864，PDI＝1.55)下利用凝胶渗透色谱仪(GPC)对分子量进行了测定。
此外，通过所述所制造出的PLA-b-PEG-N3的自组装而形成的微胶粒结构体的透射电子显微镜(TEM)以及动态光散射光度计(DLS)数据分别如图8c以及8d所示，通过图8c以及8d可以确认，PLA-b-PEG-N3可以在水性条件下通过自组装形成大约284.1±7.8nm大小的均匀的微胶粒结构。
制造例3.化学式3的化合物的合成
在将2-氯乙胺的氯化物基取代成叠氮基之后，将取代的2-叠氮基乙胺通过酰胺键与透明质酸结合，从而合成出了可以通过与以化学式1表示的化合物的点击反应而获得水凝胶主链(backbone)的以化学式3表示的化合物即基于透明质酸的聚合物链(HA-N3)。所述基于透明质酸的聚合物链的合成过程如图9所示，而在合成的各个步骤中获取到的化合物的核磁共振氢谱(1H NMR)光谱如图10所示。
具体的各个合成步骤如下所述。
步骤1：将2-氯乙胺盐酸盐(1.16g，10.00mmo l)以及NaN3(1.3g，20.00mmo l)全部溶解到30ml的蒸馏水中，并将反应混合物在80℃下进行12小时的剧烈搅拌。在反应完成之后添加1M的氢氧化钠(NaOH)溶解，从而将溶液的pH调整至10-11。将碱性溶液利用CH2C l2进行3次提取，并将有机部分利用无水硫酸钠(Na2SO4)进行洗涤，从而获取到了淡黄色油性生成物(2-叠氮基乙胺，0.62g，收率：72.0％)。
1H NMR(500MHz,D2O):δ＝3.41(t,J＝5.7Hz,1H),2.80(t,J＝5.7Hz,1H).
步骤2：将100kDa的透明质酸(HA，200mg，0.50mmo l(重复单元))完全溶解到40ml的蒸馏水中，并向所述溶液添加了N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，144mg，0.75mmo l)、1-羟基苯并三唑(HOBt，101mg，0.75mmo l)以及2-叠氮基乙胺(51.7mg，0.60mmo l)。在将pH调整至6.8之后，将反应混合物在黑暗(dark)条件下以25℃的温度进行了1天的剧烈搅拌。在反应完成之后将生成物通过利用0.1M的氯化钠(NaCl)以及蒸馏水的连续透析进行提纯，并通过冻结干燥获取到了HA-N3。
制造例4.水凝胶的制造
通过如下所述的方法制造出了本发明的一氧化氮敏感性水凝胶(以下简称为M-NO凝胶)。
具体来讲，将M-NO凝胶制备成双重注射器系统。在双重注射器系统的一个注射器中，包含以化学式1以及化学式3表示的化合物，而在另一个注射器中，包含以化学式2表示的化合物以及Cu(I)催化剂。包含化学式1以及化学式3的注射器是在1％(v/v)的二甲基亚砜(DMSO)中进行制备，其浓度分别为0.04wt％以及2.5wt％。包含以化学式2表示的化合物以及Cu(I)催化剂的注射器是在蒸馏水中进行制备，其浓度分别为2wt％以及0.02wt％。其中，Cu(I)催化剂是通过将15.5mg的CuSO4·5H2O以及22.0mg的抗坏血酸钠(sodiumascorbate)混合到0.2mL的蒸馏水中的方式进行制造。
此外，作为对照组使用的一氧化氮非反应性水凝胶是通过在所述M-NO凝胶的制造方法中将DA-NOCCL替代成DA-NONCL(二炔功能化的不可裂解交联剂，dialkyne-functionalized non-cleavable cross-linker)的方式进行制造。
试验例1.M-NO凝胶的形态学分析
为了对本发明的M-NO凝胶进行形态学分析，将制备成双重注射器系统(dualsyringe system)的M-NO凝胶通过超低温扫描电子显微镜(cryogenic scanning electronmicroscopy)进行了图像化，其结果如图11a所示。
通过所述图11a可以确认，微胶粒结构体在网状结构(network)的水凝胶内均匀分布固定。
试验例2.M-NO凝胶的机械特性分析
为了对本发明的M-NO凝胶作为关节的人工粘性补充剂(visco-supplements)的用途进行确认，通过动态瞬态测试(dynamic transienttest)对M-NO凝胶的破裂后自愈(self-healing)特性进行了分析。
具体来讲，对几个循环中的阶跃应变(step-strain)(ε＝0.5至200％，ωrad/s，25℃)进行测定，从而对粘性补充剂的重要的变量即高应变下的网状结构破裂后机械特性的自愈与否进行了确认，其结果如图11b以及12a所示。
通过所述结果可以确认，M-NO凝胶可以伴随着因为应激而诱发的流动呈现出几乎完全恢复的效果，因此本发明的M-NO凝胶可以有效地作为粘性补充剂使用。
试验例3.M-NO凝胶的NO浓度依赖性机械特性变化分析
为了对M-NO的不同的NO浓度下的机械特性变化进行确认，对频率-依赖性流变学变量(frequency-dependent rheological parameters)进行了分析。
具体来讲，对NO非反应性凝胶以及NO反应性的本发明的M-NO凝胶的频率依赖性振动流变学特性(ε％，25℃)以及浓度依赖性流变学特性(ωrad/s中的ωrad/s，ε％，25℃)的角频率(angular frequency)进行测定并在定量化之后进行了比较，其结果如图12b以及12c所示。
通过图12b以及12c可以确认，NO反应性的M-NO凝胶的储能模量(modulus)伴随着NO的浓度逐渐减小，从而在交联剂在NO介导下发生分解时呈现出机械强度减小的倾向，而与此相反，在作为对照组的NO非反应性凝胶中，即使是在高浓度的NO溶液中也没有呈现出储能模量的较大变化。即，可以确认本发明的M-NO凝胶呈现出了根据NO浓度增加的分解形态。
试验例4.M-NO凝胶的NO去除能力确认
关于本发明的M-NO凝胶的NO去除能力，在使用可以在水性条件下释放出NO的合成的NO供体即Py-NO(N-二醇二氮烯鎓混合的吡咯烷，N-diazeniumdiolates-incorporatedpyrrolidine)制造出25μM的Py-NO溶液之后，利用所述所制造出的25μM的Py-NO溶液对M-NO凝胶以及NO非反应性凝胶进行处理并进行1小时的培养，接下来通过格里斯分析对上清液的残留NO水准进行了定量化(通过将548nm下的吸光度与利用NaNO2绘制出的标准曲线进行比较而确定NO浓度)。此外，对水凝胶的膨胀水准进行测定和确认，并通过下述计算式计算出了相对膨胀比，其结果如图13a、13b、13c以及13d所示。
<计算式>
-膨胀比＝(Mf-Mi)/Mi
(Mf：在NO溶液中膨胀的水凝胶的重量，Mi：干燥的水凝胶的重量)
-相对膨胀比＝膨胀比/在0h的水中的膨胀比
通过图13a、13b、13c以及13d可以确认，本发明的M-NO凝胶可以伴随着NO的浓度大幅减少NO溶液的量，与作为对照组的NO非反应性凝胶相比大幅膨胀。
即，可以确认本发明的M-NO凝胶可以浓度依赖性地有效去除一氧化氮，而且具有因为在水凝胶的网状结构基于NO浓度发生断裂时的气孔大小增加而造成的膨胀特性，因此可以实现基于NO浓度的按需控制传递(on-demand controlled delivery)。
试验例5.M-NO凝胶的双重药物同时释放确认
通过下述试验对M-NO凝胶的NO反应性双重药物同时释放(simultaneous dual-stage release)进行了确认。
具体来讲，通过将亲水性药物模型即异硫氰酸荧光素-标记牛血清白蛋白(BSA-FITC，fluorescein isothiocyanate-labeled bovine serum albumin)以1wt％的最终浓度溶解到包含HA-N3的溶液中而封装到水凝胶的亲水性区域中，并将疏水性药物模型即尼罗红(Nile Red)封装到PLA-b-PEG-N3微胶粒的疏水性区域。所述亲水性以及疏水性药物模型在形成水凝胶时被共同-封装到M-NO凝胶中。
接下来，将200μL的M-NO凝胶在25℃下利用5mL的NO溶液(0、2.5、25以及250μM)进行了培养。按照预先规定的时间间隔将上清液更换成NO溶液，并在将所获取到的上清液通过冻结干燥进行浓缩之后，将荧光(激发/放射峰值为485/510nm)以及585nm下的吸光度与标准曲线进行比较，从而分别对异硫氰酸荧光素-标记牛血清白蛋白(BSA-FITC)以及尼罗红(Nile red)的时间依赖性NO反应性双重药物同时释放曲线进行了调查。
双重药物释放的模式图如图14a所示，其结果如图14b、14c、14d以及14e所示。
通过图14b、14c、14d以及14e可以确认，本发明的M-NO凝胶可以在较高的NO浓度下同时释放出具有因为费克(Fickian)扩散而导致的释放特性的亲水性分子以及具有基于侵蚀的释放(erosion-based mechanism)特性的疏水性分子(图14b以及14d)，但是作为对照组的NO非反应性凝胶即使是在NO浓度增加时也没有呈现出特殊的释放形态(图14c以及14e)。
此外，关于本发明的M-NO凝胶是否可以从微胶粒结构体实现疏水性药物的基于侵蚀的释放，通过对形成水凝胶之前的PLA-b-PEG-N3微胶粒结构体的平均流体力学(hydrodynamic)大小与在将M-NO凝胶与NO溶液(250μM)一起进行24小时的培养之后从上清液观察到的PLA-b-PEG-N3微胶粒结构体的平均流体力学大小进行比较的方式进行了确认，其结果如图15a以及15b所示。
通过所述图15a以及15b可以确认，在与NO溶液一起培养的M-NO凝胶的上清液中观察到了与形成水凝胶之前的PLA-b-PEG-N3微胶粒结构体相比在流体力学方面具有类似的大小以及形态的微胶粒结构体，这表明可以通过基于侵蚀的机制(erosion-basedmechanism)释放出疏水性药物。
试验例6.M-NO的细胞毒性确认
通过四唑兰比色法(MTT assay)对本发明的M-NO以及对照组的容量依赖性细胞毒性进行了确认。
具体来讲，将RAW 264.7细胞以1×104个细胞/孔的初始密度接种到96孔板中，并在37℃下利用包含10％的胎牛血清(FBS)、100U/mL的青霉素以及100μg/mL的链霉素的杜氏改良伊戈尔培养基(DMEM)进行了培养。
在培养24小时之后将培养基更换成包含样本的新鲜培养基，然后再进行40小时的培养。接下来，对细胞进行洗涤并在包含0.5mg/mL的四唑兰(MTT)溶液的培养基中进行4小时的培养。最后，将培养基更换成200μL的二甲基亚砜(DMSO)并通过对570nm下的吸光度进行测定而对细胞生存率进行了调查，其结果如图16b所示。
通过图16b可以确认，本发明的M-NO凝胶几乎不会对细胞生存率造成影响，借此可以确认本发明的M-NO的安全性。
试验例7.M-NO的NO去除能力确认
通过利用脂多糖(LPS)刺激的NO-释放RAW 264.7巨噬细胞细胞株，对本发明的组合物是否具有NO去除能力(NO-scavenging ability)以及与其相关的细胞因子水准进行了确认。
(1)不同浓度下的NO去除能力确认
将RAW 264.7细胞株以5×104个细胞/孔的密度接种到12孔板中，并在37℃下利用包含10％的胎牛血清(FBS)、100U/mL的青霉素以及100μg/mL的链霉素的杜氏改良伊戈尔培养基(DMEM)进行了培养。
在培养一整夜之后将培养基更换成包含样本且包含5μg/mL的脂多糖(LPS)的新鲜培养基，然后再进行24小时的培养。
最后，通过对培养基进行离心分离(3,000rpm，10分钟，4℃)而获取到上清液之后移动到96孔板，接下来通过格里斯分析对残留在上清液中的NO水准进行了确认，其结果如图16c所示。
通过图16c可以确认，本发明的M-NO凝胶可以将利用脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7细胞株的NO水准显著降低至25％，这与没有利用脂多糖(LPS)进行处理的RAW 264.7中的观察结果类似。
(2)通过共聚焦显微镜的NO去除能力确认
通过利用共聚焦显微镜(Confocal microscopy)对细胞内NO水准进行图像化而评估了NO去除能力。
具体来讲，将细胞以1×105个细胞/孔的密度接种到配置在6孔板上的盖玻片中，并在37℃下利用包含10％的胎牛血清(FBS)、100U/mL的青霉素以及100μg/mL的链霉素的杜氏改良伊戈尔培养基(DMEM)进行了培养。
在培养一整夜之后将培养基更换成包含样本(交联剂为25μg/mL，凝胶为250μg/mL)且包含5μg/mL的脂多糖(LPS)的新鲜的培养基，然后再进行24小时的培养。
接下来，在将样本培养基更换成包含5μm的4,5-二氨基荧光素双乙酸酯(DAF-2DA)的新鲜培养基并再进行40分钟的培养之后，利用杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)进行洗涤并与新鲜培养基一起进行20分钟的培养。
接下来，利用杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)进行洗涤并在室温的黑暗条件(darkcondition)下利用10％的中性福尔马林(NBF)进行处理，接下来在30分钟之后通过共聚焦显微镜进行观察，其结果如图16d所示。
通过图16d可以确认，在利用脂多糖(LPS)刺激的RAW 264.7细胞株中观察到了高荧光强度，但是在利用M-NO凝胶进行处理之后信号大幅减小，借此可以确认本发明的M-NO可以有效地去除NO。
(3)细胞因子水准的定量化
虽然NO是重要的促炎性介质(pro-inflammatory mediator)，但是过度生成时会在体外增加如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及白细胞介素-6(IL-6)等代表性的细胞因子水准。因此，对本发明的M-NO凝胶是否可以降低细胞因子即肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及白细胞介素-6(IL-6)水准进行了确认。
具体来讲，在利用M-NO凝胶以及对照组凝胶对利用脂多糖(LPS)刺激的RAW 264.7细胞株进行处理(250μg/mL)并进行24小时的培养之后，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)对细胞培养基的上清液的促炎性细胞因子即肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及白细胞介素-6(IL-6)进行定量化，其结果如图17a以及17b所示。
通过图17a以及17b可以确认，在利用M-NO凝胶进行处理之后，被NO诱导的促炎性细胞因子即肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及白细胞介素-6(IL-6)水准显著降低，借此可以确认本发明的M-NO凝胶可以有效地去除过度生成的NO，并借此减少炎症并对各种炎症性疾病进行治疗。
(4)捕获NO时的M-NO凝胶的膨胀确认
在利用M-NO凝胶以及对照组凝胶对利用脂多糖(LPS)刺激或未刺激的经过培养的RAW 264.7或NIH/3T3细胞株进行处理之后进行一整夜的培养，并对捕获NO时的M-NO凝胶的膨胀与否进行了确认，其结果如图17c以及17d所示。
通过所述图17c以及17d可以确认，M-NO凝胶可以在利用脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7细胞株中与NO发生反应并显著膨胀，借此可以确认本发明的M-NO凝胶具有有利于按需释放的条件。
试验例6.类风湿性关节炎治疗效果确认(1)
在类风湿性关节炎(RA)动物模型即胶原蛋白诱导的关节炎(collagen-inducedarthritis，CIA)小鼠中，对本发明的M-NO凝胶的类风湿性关节炎治疗效果进行了确认(图18a)。
(1)胶原蛋白诱导的关节炎小鼠模型的准备
将溶解到10mM的醋酸中的II型胶原蛋白(CII，collagen type II，2mg/mL)以及完全弗氏佐剂(CFA，complete Freund's adjuvant，1mg/mL)的混合物的乳化溶液(1:1，v/v)100μL皮下注射到6周龄的DBA/1j小鼠的尾部，从而进行了第一次免疫化。
在2周之后，将溶解到10mM的醋酸中的II型胶原蛋白(CII，2mg/mL)以及不完全弗氏佐剂(IFA，incomplete freud's adjuvant，1mg/mL)的混合物的乳化溶液(1:1，v/v)100μL皮下注射到小鼠的尾部。接下来，将第一次免疫化4周之后的类风湿性关节炎(RA)模型小鼠随机分配成8个组并将20μL的各个样本注射到胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)小鼠的关节内。原位杂交水凝胶是利用双重注射器系统(一个注射器中包含HA-N3(2.5wt％)以及交联剂(0.04wt％)，另一个注射器中包含微胶粒(2wt％)以及Cu(I)(0.02wt％))进行注射。对担载有地塞米松的M-NO凝胶稀释2倍以使其在1wt％下与水凝胶系统一致(担载量：5.02％，容量：0.5mg/kg)。
各个试验组分类如下。
(A)没有免疫化的健康小鼠
(B)利用食盐水对类风湿性关节炎(RA)模型小鼠进行处理的组
(C)利用担载有地塞米松的微胶粒结构体对类风湿性关节炎(RA)模型小鼠进行处理的组
(D)利用DA-NOCCL对类风湿性关节炎(RA)模型小鼠进行处理的组
(E)利用M-NO凝胶对类风湿性关节炎(RA)模型小鼠进行处理的组
(F)利用对照组凝胶(NO非反应性)对类风湿性关节炎(RA)模型小鼠进行处理的组
(G)利用担载有地塞米松的M-NO凝胶对类风湿性关节炎(RA)模型小鼠进行处理的组
(H)利用担载有地塞米松的对照组凝胶(NO非反应性)对类风湿性关节炎(RA)模型小鼠进行处理的组
(2)足体积变化确认以及与关节炎相关的临床评分评估
关于在类风湿性关节炎(RA)小鼠模型中伴随时间经过的足体积变化，通过将各个类风湿性关节炎(RA)小鼠模型试验组与利用食盐水进行处理的组(B)进行相对比较的方式进行了统计学分析，其结果如图18b所示。此外，在图19中对第4周、第6周以及第8周的代表性的小鼠后足图像进行了图示。
通过图18b以及图19可以确认，在利用本发明的M-NO凝胶以及担载有地塞米松的M-NO凝胶进行的组中呈现出了显著的足体积减小效果。
此外，关于伴随时间经过的关节炎临床评分，是在对第4周至第8周期间内的临床评分进行监测的同时按照标准评分方法(尺度为0-5)通过盲测方式进行了评估，其结果如图20a以及20b所示。关节炎评估中的临床评分以及评估标准如下所述。
0：没有临床症状
1：最小弥漫性红斑/水肿(对1个或2个脚趾造成影响)
2：轻微弥漫性红斑/水肿(对3个以上的脚趾造成影响)
3：中度弥漫性红斑/水肿(整个足部)
4：明显弥漫性红斑/水肿(整个足部以及脚腕)
5：严重弥漫性红斑/水肿(整个足部)，无法弯曲脚趾(关节粘连)
通过图20a以及19b可以确认，在利用本发明的M-NO凝胶以及担载有地塞米松的M-NO凝胶进行的组中呈现出了显著的临床评分减小效果。
通过所述结果可以确认，本发明的M-NO凝胶以及担载有地塞米松的M-NO凝胶不仅可以减缓疾病的发展，还可以缓解关节炎症状本身。尤其是，担载有地塞米松的M-NO凝胶呈现出了几乎完全的关节炎症状缓解效果。
(3)运动性评估
为了对在类风湿性关节炎(RA)小鼠模型中的运动活性进行评估而执行了疲劳转棒仪分析(rotarod assay)。
具体来讲，在进行第一次免疫化之前，为了使得小鼠到达稳定的掉棒延迟时间(latency to fall)而进行3天的疲劳转棒仪停留训练。接下来，对10rpm以及120s的固定速度下的掉棒延迟时间进行了记录，其结果如图20c以及20d所示。
通过所述图20c以及20d可以确认，在利用本发明的M-NO凝胶以及担载有地塞米松的M-NO凝胶进行处理的组中的掉棒延迟时间有所增加，尤其是在利用担载有地塞米松的M-NO凝胶进行处理的组中呈现出了显著的掉棒延迟时间的增加，借此可以确认小鼠的运动性得到了逐渐改善。
试验例7.类风湿性关节炎治疗效果确认(2)
为了对本发明的M-NO凝胶的类风湿性关节炎治疗效果进行集中调查，在第8周执行了一系列的追加试验。
(1)骨骼以及关节状态确认
通过对经过样本处理的各个试验组的代表性的前足微型计算机断层扫描(microcomputed tomography，micro-CT)图像对骨骼以及关节形态进行了确认，其结果如图21a所示。
通过图21a可以确认，与其他试验组相比，在利用本发明的M-NO凝胶以及担载有地塞米松的M-NO凝胶进行处理的组中，因为骨骼的侵蚀较小而可以观察到明显的骨骼边界。
这表明，本发明的水凝胶可以通过去除在类风湿性关节炎(RA)病变中过度生成的一氧化氮而防止氧化/硝化应激以及破骨细胞(osteoclasts)的上向调节。
(2)组织学分析
在第8周通过利用苏木精-伊红(H&E)、马松三色(masson's trichrome)以及番红-O(Safranin-O)对所处死的小鼠的关节组织进行染色而对经过样本处理的各个试验组的关节组织进行了组织学分析(Histological assays)，分析结果以及通过盲测按照标准评分方法(尺度为0-4)进行评估的软骨损伤程度如图21b以及22a所示(B：骨骼，C：软骨)。临床评分以及评估标准如下所述。
0：无损伤，可正常活动
1：仅限于单一位置的最小糜烂(erosion)
2：在有限范围内的轻微/中度糜烂
3：明显/大范围糜烂(erosion)
4：大部分损伤
通过所述图21b以及22a可以确认，本发明的M-NO凝胶以及担载有地塞米松的M-NO凝胶可以恢复受损的软骨以及关节腔。
(3)肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)水准以及NO浓度确认
在第8周按照制造企业的协议通过酶联免疫吸附测定(ELISA)对血清以及足组织液中的促炎性细胞因子即肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及白细胞介素-6(IL-6)的水准进行定量化和确认。通过格里斯分析对NO水准进行确定，其结果如图22b至22e所示。
通过图22b至22e可以确认，在利用本发明的M-NO凝胶以及担载有地塞米松的M-NO凝胶进行处理的组中，促炎性细胞因子的水准在血清以及足组织液中均呈现出了显著的减小效果。尤其是，在利用担载有地塞米松的M-NO凝胶进行的组中大幅减小至正常状态。
此外，在第8周对经过样本处理的类风湿性关节炎(RA)小鼠的足组织的NO水准进行定量化的数据如图22f所示。如所述图22f所示，可以确认在利用本发明的M-NO凝胶以及担载有地塞米松的M-NO凝胶进行处理的组的足组织液中，NO浓度显著降低。
Claims (32)
1.一种利用以下述化学式1至化学式3表示的化合物制造出来的原位杂交水凝胶：
【化学式1】
【化学式2】
【化学式3】
其中，
所述R1以及R2各自独立地为C1-C 10的亚烷基，
所述n以及m分别为1至1000的整数。
2.根据权利要求1所述的原位杂交水凝胶，
所述R1以及R2为C2亚烷基。
3.根据权利要求1所述的原位杂交水凝胶，
所述水凝胶对一氧化氮进行捕获和去除。
4.根据权利要求1所述的原位杂交水凝胶，
所述水凝胶与一氧化氮发生反应并分解。
5.根据权利要求1所述的原位杂交水凝胶，
以所述化学式2表示的化合物借助于自组装形成微胶粒结构体。
6.根据权利要求5所述的原位杂交水凝胶，
所述微胶粒结构体具有10至1000nm的均匀直径。
7.根据权利要求1所述的原位杂交水凝胶，
所述水凝胶借助于以所述化学式1表示的化合物与以所述化学式2以及化学式3表示的化合物之间的点击化学反应制造。
8.根据权利要求1所述的原位杂交水凝胶，
所述水凝胶还包含疏水性药物。
9.根据权利要求8所述的原位杂交水凝胶，
所述疏水性药物被担载到以所述化学式2表示的化合物借助于自组装形成的微胶粒结构体中。
10.根据权利要求8所述的原位杂交水凝胶，
所述疏水性药物为抗炎剂。
11.根据权利要求10所述的原位杂交水凝胶，
所述抗炎剂为地塞米松。
12.根据权利要求8所述的原位杂交水凝胶，
与所述微胶粒结构体的整体重量相比含有3至7重量％的所述疏水性药物。
13.根据权利要求1所述的原位杂交水凝胶，
所述水凝胶还包含疏水性药物以及亲水性药物。
14.根据权利要求13所述的原位杂交水凝胶，
所述疏水性药物以及亲水性药物在靶标部位同时释放。
15.根据权利要求1所述的原位杂交水凝胶，
所述化学式1至化学式3的化合物同时注射到靶标部位。
16.根据权利要求15所述的原位杂交水凝胶，
所述同时注射利用双注射器系统执行。
17.根据权利要求15所述的原位杂交水凝胶，
所述同时注射利用双注射器系统执行
18.根据权利要求1所述的原位杂交水凝胶，
所述水凝胶为炎症性疾病治疗用途。
19.根据权利要求18所述的原位杂交水凝胶，
所述炎症性疾病是呈现出生体内生成过度的一氧化氮的症状的疾病。
20.根据权利要求18所述的原位杂交水凝胶，
所述炎症性疾病为类风湿性关节炎。
21.根据权利要求1所述的原位杂交水凝胶，
所述水凝胶用于降低肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及白细胞介素-6(IL-6)水准。
22.根据权利要求1所述的原位杂交水凝胶，
所述水凝胶为粘性补充剂用途。
23.一种包含以下述化学式1至化学式3表示的化合物的原位杂交水凝胶前驱体组合物：
【化学式1】
【化学式2】
【化学式3】
其中，
所述R1以及R2各自独立地为C1-C 10的亚烷基，
所述n以及m分别为1至1000的整数。
24.根据权利要求23所述的原位杂交水凝胶前驱体组合物，
所述组合物还包含疏水性药物。
25.根据权利要求24所述的原位杂交水凝胶前驱体组合物，
所述疏水性药物被担载到以所述化学式2表示的化合物借助于自组装形成的微胶粒结构体中。
26.根据权利要求23所述的原位杂交水凝胶前驱体组合物，
所述组合物还包含疏水性药物以及亲水性药物。
27.一种原位杂交水凝胶的制造方法，包括：
a)制造出包含以下述化学式1表示的化合物以及以下述化学式3表示的化合物的第一前驱体组合物的步骤；
b)制造出包含从以下述化学式2表示的化合物形成的微胶粒结构体的第二前驱体组合物的步骤；以及，
c)对所述第一前驱体组合物以及第二前驱体组合物进行同时注射的步骤：
【化学式1】
【化学式2】
【化学式3】
其中，
所述R1以及R2各自独立地为C1至C10的亚烷基，
所述n以及m分别为1至1000的整数。
28.根据权利要求27所述的原位杂交水凝胶的制造方法，
与第一前驱体组合物的整体质量相比包含0.02至0.06wt％的以所述化学式1表示的化合物；
与第二前驱体组合物的整体质量相比包含1.00至3.00wt％的以所述化学式2表示的化合物；以及，
与第一前驱体组合物的整体质量相比包含1.00至1.50wt％的以所述化学式3表示的化合物。
29.根据权利要求27所述的原位杂交水凝胶的制造方法，
所述第二前驱体组合物还包含疏水性药物。
30.根据权利要求27所述的原位杂交水凝胶的制造方法，
所述第一前驱体组合物还包含亲水性药物，第二前驱体组合物还包含疏水性药物。
31.根据权利要求29或权利要求30所述的原位杂交水凝胶的制造方法，
所述疏水性药物被担载到微胶粒结构体中。
32.根据权利要求27所述的原位杂交水凝胶的制造方法，
所述同时注射利用双注射器系统执行。
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