KR101743220B1 - 클릭 화학을 이용한 주입형 히알루론산 유도체 하이드로겔, 이의 제조방법 및 이를 이용한 생체 내 겔 형성방법 - Google Patents

클릭 화학을 이용한 주입형 히알루론산 유도체 하이드로겔, 이의 제조방법 및 이를 이용한 생체 내 겔 형성방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 독성을 갖는 구리 촉매를 필요로 하지 않는 무동 클릭 화학 반응을 이용한 가교를 통해 제조되는 히알루론산 유도체 하이드로겔, 이의 제조방법, 이를 이용한 생체 내 겔 형성방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 세포 독성을 갖는 구리 촉매를 필요로 하지 않는 무동 클릭 화학 반응을 이용한 가교를 통해 생체 내 원하는 위치에서 하이드로겔 형성이 가능하며, 형성된 히알루론산 유도체 하이드로겔은 체내에서 장시간 안정성을 유지하고 우수한 생체적합성을 가져 주름살 개선을 위한 필러, 세포, 유전자, 단백질 전달을 위한 캐리어로 사용가능하다.

Description

클릭 화학을 이용한 주입형 히알루론산 유도체 하이드로겔, 이의 제조방법 및 이를 이용한 생체 내 겔 형성방법{Injectable Hyaluronic Acid Derivative Hydrogel Using Click Chemistry, Preparation Method Thereof and Method For In Vivo Gelation Using The Same}
본 발명은 세포 독성을 갖는 구리 촉매를 필요로 하지 않는 무동 클릭 화학 반응을 이용한 가교를 통해 제조되는 히알루론산 유도체 하이드로겔, 이의 제조방법, 이를 이용한 생체 내 겔 형성방법에 관한 것이다.
하이드로겔이란 충분한 양의 물에서 팽윤되어 녹지 않고 삼차원적인 형태를 유지하는 친수성 고분자 망상구조를 유지하는 것을 말한다. 이러한 하이드로겔의 친수성은 고분자 주사슬이나 곁가지의 수산기, 카르복시기, 아미드기, 아민기, 설폰기 등에 의해 친수성을 띄게 된다.
생체조직공학용 주입형 하이드로겔은 수술부위의 최소화와 친수성, 생체적합성, 고효율 담지 등으로 하이드로겔의 의료용 충진제, 약물전달시스템 및 조직공학분야에서 다양하게 연구가 진행되고 있다. 하이드로겔의 가교반응시 겔 화 시간을 빠르게 할 경우 반응 이전의 고분자 용액이 가교되며 체내 병변 부위에 주입되면서 결손부위를 수복할 수 있다. 이러한 생체 주입형 하이드로겔을 통상적으로 인 시튜(in situ) 형성 하이드로겔이라 한다. 주입형 하이드로겔은 기존 하이드로겔의 특징을 모두 가지면서 체외에서는 보통의 유체와 같이 유동성을 가지고 주입 후에는 화학적 또는 물리적 자극에 의해 겔 화되어 체내 주입형 하이드로겔로 이용된다.
인 시튜(in situ) 형성 하이드로겔을 제조하기 위해 다양한 가교 방법들이 이용되고 있다. 예를 들어, 광중합, Schiff-base 형성, Michael Type 첨가 반응 등을 이용한 화학적 가교방법을 통해 주입형 하이드로겔을 형성하는 방법이 제안된 바 있다.
화학적 가교방법 중 클릭 화학(Click Chemistry)은 어떤 특정한 관능기끼리 매우 높은 반응성을 가지고 선택적으로 반응하여 생성물이 빠르게 합성되는 방법으로, 클릭 화학을 이용하면 매우 높은 수득률로 원하는 물질을 합성할 수 있다. 또한 클릭 화학은 합성 조건도 간단하기 때문에 비교적 합성이 까다로운 고분자에도 응용이 가능한 장점이 있다. 대표적인 클릭 화학 반응에는 아지드-알킨 고리화 반응, 딜스-알더(Diels-Alder), 티올-엔(Thiol-Ene) 반응 등이 있다. 특히 무동 클릭 화학 반응은, 세포 독성을 갖는 구리 촉매를 필요로 하지 않는 반응으로서 매우 신속하고 효과적인 반응이다. 이러한 클릭 화학반응을 이용하여 하이드로겔을 형성하는 방법이 제안된 바 있다. 일 예로 대한민국 공개특허 제2009-0063235호는 클릭 화학 유형의 반응에 의해 히알루론산 또는 그 유도체 간의 고리화 첨가반응으로 가교되는 히알루론산 유도체 제조방법을 개시하고 있다.
대한민국 공개특허 제2009-0063235호: 클릭 화학 가교를 통해 수득된 히알루론산 유도체
본 발명의 과제는 독성이 없는 가교제를 이용하여 생체 내 원하는 위치에서 하이드로겔을 형성할 수 있으며 체내에서 장시간 안정성을 유지하고 우수한 생체적합성을 갖는 주입형 히알루론산 유도체 하이드로겔, 이의 제조방법 및 이를 이용한 생체 내 겔 형성방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 달성하기 위해 본 발명은
하기 화학식 1의 히알루론산 유도체 또는 이의 염을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112017004461951-pat00032
(상기 식에서, l은 1323 내지 6613의 정수이고, m은 1 내지 20의 정수이고, n은 10 내지 2500의 정수이다)
(1) 히알루론산과 하기 화학식 2의 화합물을 반응시켜 하기 화학식 3의 히알루론산 유도체를 제조하는 단계와,
(2) 하기 화학식 3의 히알루론산 유도체와 하기 화학식 4의 가교제를 반응시켜 하기 화학식 1의 히알루론산 유도체 또는 이의 염을 생성하는 단계
를 포함하는 히알루론산 유도체 또는 이의 염 제조방법을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112017004461951-pat00033
[화학식 2]
Figure 112015098298095-pat00003
[화학식 3]
Figure 112017004461951-pat00050
[화학식 4]
Figure 112015098298095-pat00005
(상기 식에서, l은 1323 내지 6613의 정수이고, m은 1 내지 20의 정수이고, n은 10 내지 2500의 정수이다)
하기 화학식 3의 히알루론산 유도체 및 하기 화학식 4의 가교제를 포함하는, 주사가능한 하이드로겔 형성용 조성물을 제공한다:
[화학식 3]
Figure 112017004461951-pat00045
[화학식 4]
Figure 112015098298095-pat00007
(상기 식에서, l은 1323 내지 6613의 정수이고, m은 1 내지 20의 정수이고, n은 10 내지 2500의 정수이다)
하기 화학식 3의 히알루론산 유도체와 하기 화학식 4의 가교제를 포함하는 하이드로겔 형성용 조성물을 생체 내로 주사투입하여, 하기 화학식 1의 히알루론산 유도체 또는 이의 염을 형성하는 생체 내 겔 형성방법을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112017004461951-pat00036
[화학식 3]
Figure 112017004461951-pat00046
[화학식 4]
Figure 112015098298095-pat00010
(상기 식에서, l은 1323 내지 6613의 정수이고, m은 1 내지 20의 정수이고, n은 10 내지 2500의 정수이다)
본 발명에 따르면, 세포 독성을 갖는 구리 촉매를 필요로 하지 않는 무동 클릭 화학 반응을 이용한 가교를 통해 생체 내 원하는 위치에서 하이드로겔 형성이 가능하며, 형성된 히알루론산 유도체 하이드로겔은 체내에서 장시간 안정성을 유지하고 우수한 생체적합성을 가져 주름살 개선을 위한 필러, 세포, 유전자, 단백질 전달을 위한 캐리어로 사용가능하다.
도 1은 실시예 1의 클릭 화학을 이용한 히알루론산 기반 주입형 하이드로겔 제조방법 공정도이다.
도 2의 A는 히알루론산(HA) 및 실시예 1에서 제조된 히알루론산 유도체(HA-DBCO)의 1H NMR 분광기 분석 결과를 나타낸 것이고, B는 히알루론산(HA) 및 실시예 1에서 제조된 히알루론산 유도체(HA-DBCO, HA-DBCO)의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3의 A는 실험예 2에서, 화학식 4의 가교제 농도에 따른 하이드로겔 겔화 시간을 측정한 그래프이고, B는 화학식 4의 가교제 농도에 따른 하이드로겔의 탄성계수를 측정한 그래프이고, C는 화학식 4의 가교제 농도에 따른 하이드로겔 평형 팽윤도를 측정한 그래프이고, D는 화학식 4의 가교제 농도에 따라 형성된 하이드로겔의 SEM 사진이다.
도 4의 A는 실험예 3에서, 화학식 4의 가교제 농도에 따른 세포 생존율을 나타낸 그래프이고, B는 실시예 1 내지 3에서 제조된 하이드로겔에 연골세포를 인캡슐레이션하고 2일간 배양시 하이드로겔의 모폴로지를 관찰한 사진이고, C는 실시예 1 내지 3에서 제조된 하이드로겔에 연골세포를 인캡슐레이션 한 후 세포 생존율을 live/dead 분석 키트로 분석하여 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 5의 A는 실험예 4에서, 마우스 피하에 화학식 3의 히알루론산 유도체와 화학식 4의 가교제를 혼합하여 주입 후 1, 7, 14, 21, 35일 경과 후 적출한 젤 사진이고, B는 1, 7, 14, 21, 35일 경과 후 적출한 젤의 부피 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6의 A는 실험예 5에서, 실시예 1 내지 3에서 제조된 하이드로겔에 연골세포를 인캡슐레이션하여 마우스에 주입하여 35일 경과 후 적출된 하이드로겔을 관찰한 사진이고, B는 적출한 하이드로겔의 H&E 염색 분석 사진이다.
도 7의 A는 실험예 6에서, 마우스 피하에 화학식 3의 히알루론산 유도체와 화학식 4의 가교제를 연골세포와 함께 혼합하여 주입 후 알시안 블루 염색 결과 사진이고, B는 사프라닌-O 면역 염색 결과 사진이다.
본 발명에서는 생체적합성 하이드로겔을 개발하기 위해 생체 내 고분자인 히알루론산을 사용하였으며, 생체 내 환경에서 하이드로겔이 만들어지도록 하기 위하여, 독성이 없는 가교제를 사용하여 무동 클릭 화학 반응을 이용한 가교를 통해 히알루론산을 변형하였다.
본 발명의 하이드로겔은 하기 화학식 1의 히알루론산 유도체 또는 이의 염이다:
[화학식 1]
Figure 112017004461951-pat00038
(상기 식에서, l은 1323 내지 6613의 정수이고, m은 1 내지 20의 정수이고, n은 10 내지 2500의 정수이다)
바람직하기로 상기 식에서 m은 1 내지 5의 정수이고, n은 20 내지 1000의 정수이다.
본 발명에서 히알루론산은, 특별히 제한되지는 않으나, 일반적으로 천연 물질, 바람직하게는 척추동물 또는 미생물로부터 유래되는 것을 사용할 수 있다.　히알루론산의 분자량은 바람직하게는 0.5 MDa 내지 2.5 MDa이다.　히알루론산의 카르복시 그룹의 형태는 염의 형태를 취할 수 있으며, 이러한 경우 알칼리금속염, 또는 알칼리 토금속염의 형태일 수 있다.　이러한 염은 나트륨염 또는 칼륨염이 바람직하다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1의 히알루론산 유도체 또는 이의 염은
(1) 히알루론산과 하기 화학식 2의 화합물을 반응시켜 하기 화학식 3의 히알루론산 유도체를 제조하는 단계와,
(2) 하기 화학식 3의 히알루론산 유도체와 하기 화학식 4의 가교제를 반응시켜 상기 화학식 1의 히알루론산 유도체 또는 이의 염을 생성하는 단계를 거쳐 제조된다.
[화학식 2]
Figure 112015098298095-pat00012
[화학식 3]
Figure 112017004461951-pat00047
[화학식 4]
Figure 112015098298095-pat00014
(상기 식에서, l은 1323 내지 6613의 정수이고, m은 1 내지 20의 정수이고, n은 10 내지 2500의 정수이다)
바람직하기로 상기 식에서 m은 1 내지 5의 정수이고, n은 20 내지 1000의 정수이다.
이하 각 단계별로 상세히 설명한다.
먼저, 히알루론산과 상기 화학식 2의 화합물을 반응시켜 상기 화학식 3의 히알루론산 유도체를 제조한다.
본 단계는 히알루론산에 화학식 2의 화합물을 반응시켜 후속으로 진행되는 무동 클릭 화학 반응을 위한 작용기로서 사이클로옥테인 그룹을 히알루론산에 도입하기 위한 단계이다.
이때 히알루론산을 수용성 용매에 용해시킨 후, 히알루론산의 카르복시기를 활성화하기 위한 촉매제를 첨가할 수 있다. 상기 촉매제로서 1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필)카보디이미드[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; EDC] 및 N-하이드록시숙신이미드[N-hydrosuccinimide, NHS]를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 이때 EDC 및 NHS는 히알루론산의 카르복시기를 NHS 에스테르로 전환함으로써 화학식 2 화합물의 아민기와 아미드 결합을 유도하는 역할을 한다.
다음으로, 상기 화학식 3의 히알루론산 유도체와 상기 화학식 4의 가교제를 반응시켜 상기 화학식 1의 히알루론산 유도체 또는 이의 염을 생성한다.
상기 화학식 4의 가교제는 아지드 그룹을 가지고 있어, 무동 클릭 화학에 의해 화학식 3의 히알루론산 유도체의 사이클로옥테인 그룹과 빠르게 반응하여 고리화되며, 히알루론산이 서로 가교되도록 하여 상기 화학식 1의 히알루론산 유도체 또는 이의 염을 생성한다.
본 단계에서 사용되는 화학식 4의 가교제는 세포 독성이 없으며, 생체 내 환경에서 사용이 가능하다.
이때 상기 화학식 4의 가교제는 상기 화학식 3의 히알루론산 유도체에 대해 0.01 내지 2.5 mM, 바람직하게는 0.25 내지 1 mM의 농도로 사용하여 37 ℃에서 실시한다. 더욱 바람직하게는 0.25 내지 0.5 mM의 농도로 사용한다. 만약 가교제의 농도가 상기 범위 미만이면 하이드로겔 형성이 어렵고, 이와 반대로 상기 범위를 초과하면 물성이 약하여 생체 내 장기간 안정성을 유지하지 못하는 문제점이 있다.
본 발명의 히알루론산 유도체 또는 이의 염은 생체 내에 주사를 통해 하이드로겔을 생성할 수 있어 뼈, 연골, 신경 등 결손된 조직에 최소의 손상을 주고 이들 결손된 조직을 재생하는데 사용할 수 있다.　뿐만 아니라 생체 내 주입시 약물, 세포, 유전자 등의 다양한 바이오분자를 첨가할 수 있어, 이들 물질들의 활성이 유지된 채로 생체 내 전달이 가능하다.
본 발명의 주사가능한 하이드로겔 형성용 조성물은 상기 화학식 3의 히알루론산 유도체 및 상기 화학식 4의 가교제를 포함한다.
이때 화학식 3의 히알루론산 유도체 및 화학식 4의 가교제를 용해시키기 위한 용매로는, 상기 물질들이 용해될 수 있는 용매라면 제한 없이 사용가능하며, 예를 들어, 다양한 수용액 즉, 증류수, 완충용액 및 생리 식염수로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매를 사용할 수 있다.
본 발명의 하이드로겔 형성용 조성물은 이식할 세포와 혼합하여, 예를 들면 주사를 이용하여 원하는 위치에 주입하면, 주입된 조성물이 이식될 부위에서 신속하게 하이드로겔을 형성함으로서 체내 세포를 이식할 수 있다.수 있다. 상기 세포 이식의 대상이 되는 세포의 종류에는 특별한 한정이 없으며, 각종 줄기세포 이식에도 사용할 수 있다.
본 발명의 이식을 위한 세포는 구체적으로 연골세포(chondrocytes), 근아세포(myoblasts), 간세포(hepatocytes), 골아세포(osteoblasts), 배아줄기세포(embryonic stem cells), 배아생식세포(embryonic germ cells), 성체줄기세포(adult stem cells), 중간엽줄기세포, 신경줄기세포, 혈관내피줄기세포, 조혈모세포, 간줄기세포, 심장줄기세포, 췌장줄기세포, 내피전구세포(endothelial progenitors), 성장내피세포(outgrowth endothelial cells), 간엽줄기세포(mesenchymal stem cells), 조혈줄기세포(hematopoietic stem cells), 인간신경줄기세포(neural stem cells), 위성세포(satellite cells), 장 상피세포, 평활근세포 및 섬유아세포로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명은 상기한 하이드로겔 형성용 조성물 및 연골세포를 포함하는 연골재생용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 하이드로겔 형성용 조성물은 체내에서 원하는 위치에 신속하게 하이드로겔을 형성하여 연골세포의 지지체로 작용하여 연골재생이 필요한 체내 부위에 이식될 수 있다. 본 발명의 연골 재생용 약제학적 조성물은 주사로 이식용 세포와 함께 체내 이식 가능하며, 이식 후 쉽고 신속하게 겔화가 가능하다. 본 발명의 약제학적 조성물에 있어서, 이식을 위한 세포를 조성물 내에 1×105- 5×108세포/ml 포함할 수 있다.
본 발명의 치료제 조성물은 추가적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있고, 본 발명의 치료제 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 치료제 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 치료제 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 국소 주입(local injection)이 가장 바람직한 투여방법이다.
본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 조성물의 투여량은 바람직하게는 1회 1 x 105 내지 5 x 108 세포/ml이고 그 양은 필요에 의해 조정될 수 있다.
발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명은 상기한 주사가능한 하이드로겔 형성용 조성물을 이용하여 생체 내 환경에서 빠른 반응이 가능한 무동 클릭 화학으로 원하는 위치에 하이드로겔을 형성한다.
구체적으로, 본 발명의 생체 내 겔 형성방법은 상기 화학식 3의 히알루론산 유도체와 상기 화학식 4의 가교제를 포함하는 하이드로겔 형성용 조성물을 생체 내로 주사투입하여, 상기 화학식 1의 히알루론산 유도체 또는 이의 염을 형성하는 단계를 포함한다.
이와 같이 원하는 위치에 주사주입을 통해 생체 내 조건에서 짧은 시간 내에 형성된 본 발명의 하이드로겔은 생체적합성이 우수할 뿐만 아니라 장기간 겔 형상을 유지할 수 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예 및 실험예를 기재한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 명확히 표현하기 위한 목적으로 기재될 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 클릭 화학을 이용한 히알루론산 기반 주입형 하이드로겔 제조
1-1. 하이드로겔 제조
도 1은 실시예 1의 클릭 화학을 이용한 히알루론산 기반 주입형 하이드로겔 제조방법 공정도이다.
1. 히알루론산(Hyaluronic acid, HA: 2MDa) 1g (2.5mmol)을 1:1 비율의 디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide, DMSO)와 증류수에 넣고 교반하여 용해시켰다.
2. 이염화에틸렌(Ethylene dichloride, EDC) 23.4mg (117μmol)과 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS) 14.1mg (117μmol)를 반응 용액에 첨가하였다.
3. 디벤조시클로옥틸-폴리에틸렌글라이콜-아민 (Dibenzocyclooctyl-poly(ethylene glycol)4-amine, DBCO-PEG4-amine, m=4) 43mg을 DMSO 1mL에 용해시킨 뒤, HA 반응 용액에 한 방울씩 적하하여 상온에서 3일간 반응을 진행하였다.
4. 증류수로 3일간 투석(Dialysis membrane with MWCO Da)하여 DMSO 및 미 반응물을 제거해 준 뒤, 동결 건조하여 HA-DBCO 합성반응물을 수득하였다.
5. 수득한 HA-DBCO 100mg을 10mL의 증류수에 용해시켰다.
6. 가교제인 4-arm 폴리에틸렌 아자이드(4-arm polyethylene azide, 4-arm PEG azide: 분자량 2000, n=20) 0.25 mM를 HA-PEG4-DBCO 수용액에 첨가하고, 37℃에서 30분간 반응시켜 HA-DBCO 하이드로겔(HA-DBCO/0.25)을 제조하였다.
실시예 2 내지 3 및 비교예 1 내지 2
하기 표 1에 기재된 바와 같이, 가교제인 4-arm PEG azide의 농도 조절에 따라 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 HA-DBCO 하이드로겔을 제조하였다.
구분 4-arm 폴리에틸렌 아자이드 (mM)
실시예 2(HA-DBCO/0.5) 0.5
실시예 3(HA-DBCO/1) 1
비교예 1(HA-DBCO/0) 0
비교예 2(HA-DBCO/2.5) 2.5
실험예 1: HA- DBCO 하이드로겔 구조 분석
실시예 1에서 제조된 HA-DBCO 하이드로겔의 화학적 구조는 1H NMR과 FT-IR을 통해서 분석하였다.
1-1. HA 및 HA- PEG4 - DBCO 의 1 H NMR 스펙트럼
HA 및 HA-PEG4-DBCO의 화학적 조성은 1H NMR 분광기(UnityPlus 300)를 통해 분석하였다. 그 결과는 도 2의 A에 나타내었다. NMR 시료는 D2O를 용매로 하여 제조하였고, D2O 피크는 δ = 4.75 ppm에서 확인하였다. HA의 N-아세틸 글루코사민 수소에 해당하는 피크는 δ = 2.0 ppm에서 관찰되었고, δ = 3.0 4.0 ppm 에서는 글루코피라노실기의 수소에 해당하는 피크가 관찰되었다. DBCO-PEG4-amine이 콘쥬게이션된 HA-PEG4-DBCO에서는 디벤조시클로옥탄의 수소에 해당하는 피크가 δ = 7.3 7.8 ppm에서 추가적으로 나타나는 것을 확인하였다.
1-2. HA, HA- PEG4 - DBCO 및 HA- DBCO 하이드로겔의 FT-IR 스펙트럼
HA, HA-PEG4-DBCO 및 HA-DBCO 하이드로겔의 구조적 특성은 FT-IR (Bruker Optic GmbH) 분광기를 통해 ATR 기법으로 분석하였고, 650 - 4000cm-1 범위 내에서 측정하였다. 그 결과는 도 2의 B에 나타내었다. 각각의 스펙트럼에서 O-H의 신축 진동을 나타내는 파장 (3290cm-1)과 C-H의 신축 진동에 해당하는 파장 (2890cm-1) 모두 확인하였고, 1032cm-1에서는 C-O-C의 신축 진동을 나타내는 파장이 나타났다. HA-PEG4-DBCO 스펙트럼에서는 방향족 고리의 탄소-탄소 이중결합에 의한 파장이 1750cm-1에서 확인되었다. HA-DBCO 하이드로겔의 스펙트럼에서는 4-arm PEG azide로 인한 가교로 C-N 신축진동에 해당하는 파장 (1250cm-1)이 확인되었다.
실험예 2: HA- DBCO 하이드로겔의 물리적 성질
2-1. 4-arm PEG azide 의 농도에 따른 HA- DBCO 하이드로겔의 겔화 시간 측정
HA-PEG4-DBCO와 4-arm PEG azide를 혼합한 후 겔이 형성되는 시간은 레오미터를 이용하여 측정하였고, 저장탄성률(G‘)과 손실탄성률(G“)의 교차 지점을 통해 겔화 시간을 확인하였다. 그 결과는 도 3의 A에 나타내었다. 도 3을 참조하면, 4-arm PEG azide를 첨가하지 않은 HA-DBCO/0은 겔화 지점이 나타나지 않았고, 4-arm PEG azide를 첨가한 HA-DBCO 하이드로겔은 HA-DBCO/2.5를 제외하고 15분 이내에 겔화가 일어나는 것을 관찰하였고 (HA-DBCO/0.25, HA-DBCO/0.5, HA-DBCO/1), 4-arm PEG azide의 농도가 높을수록 겔화 시간이 단축됨을 확인하였다. 예외적으로, HA-DBCO/2.5는 가교제의 양이 상대적으로 많아 겔화 지점이 확인되지 않았다. 따라서 적정한 농도의 4-arm PEG azide를 첨가하면 겔이 형성됨을 알 수 있었다.
2-2. HA- DBCO 하이드로겔의 탄성계수 측정
4-arm PEG azide의 농도에 따른 HA-DBCO 하이드로겔의 탄성계수(elastic modulus)는 동역학 측정 장치 (ELF3200, Endura TEC)를 통해 측정하였다. 그 결과는 도 3의 B에 나타내었다.
1. HA-PEG4-DBCO와 4-arm PEG azide를 혼합하고, 12-웰 세포 배양 플레이트(falcon)에 6mm 두께로 첨가하여 20분간 두었다.
2. 얻어진 하이드로겔은 상온에서 응력을 40 mM/min 으로 가하여 압축 탄성계수를 측정하였다.
도 3의 B를 보면, HA-DBCO/0.5의 탄성계수가 가장 높게 나타났고, HA-DBCO/0.25, HA-DBCO/1 순으로 탄성계수가 낮게 나타났다. HA-DBCO/2.5는 Figure 3A에서 언급했듯이 겔화가 일어나지 않아 HA-DBCO/0과 유사하게 0에 가까운 수치가 나타나는 것을 확인하였다.
2-3. HA- DBCO 하이드로겔의 팽윤도 측정
하이드로겔 중 겔을 형성하는 실시예 1(HA-DBCO/0.25), 실시예 2(HA-DBCO/0.5) 및 실시예 3(HA-DBCO/1)의 팽윤도를 측정하였다. 그 결과는 도 3의 C에 나타내었다.
1. 동결 건조된 HA-DBCO 하이드로겔을 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)에 침지하고, 평형상태에 도달할 때까지 37도에서 보관하였다.
2. 팽윤된 하이드로겔을 꺼내고, 여과지로 하이드로겔 표면의 물을 제거한 후 무게를 측정하였다. 이때, 평형 팽윤도(equilibrium swelling ratio, ESR)는 아래와 같은 수학식 1에 의해 계산하였다.
[수학식 1]
평형 팽윤도 = (팽윤된 겔 무게 건조된 겔 무게)/건조된 겔 무게
결과를 보면, 초반에는 낮은 농도의 4-arm PEG azide를 사용한 하이드로겔이 비교적 형성된 가교점이 적기 때문에 빠르게 팽윤되는 것을 확인하였다. 하지만 평형상태에 도달한 HA-DBCO 하이드로겔의 평형 팽윤도는 큰 차이가 나지 않음을 확인할 수 있었다.
2-4. HA- DBCO 하이드로겔의 SEM 사진
실시예 1 내지 3의 하이드로겔을 동결 건조하고, 횡단면이 보이도록 절단하였다. 준비된 시료의 모폴로지는 가속전압(10kV)하에서 JSM-6330F SEM(JEOL,Peabody)을 이용하여 관찰하였다. SEM 사진을 통해 HA-DBCO/0.25가 상대적으로 큰 크기의 기공을 형성하고, HA-DBCO/1이 가장 작은 사이즈의 기공을 형성한 것을 확인하였다. 즉, 4-arm PEG azide의 농도가 높으면 가교점이 증가하여 비교적 작은 크기의 기공을 형성하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3: 4-arm PEG azide 및 HA- DBCO 하이드로겔의 세포 적합성 및 연골세포가 인캡슐레이션된 하이드로겔의 모폴로지
3-1. 4-arm PEG azide 의 농도에 따른 세포 독성 평가
HA-DBCO 하이드로겔을 형성하기 위한 가교제로 사용된 4-arm PEG azide의 세포 독성을 평가하기 위하여 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay를 실시하였다. 세포는 토끼 무릎의 연골로부터 분리한 패시지(passages)2의 연골세포를 사용하였고, 계대 배양하는 동안 10%의 우태아혈청과 1%의 페니실린=스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지를 사용하였다.
1. 배양한 연골세포는 0.05%의 트립신 효소를 처리하여 단일 세포로 부유시킨 뒤 앞서 언급한 DMEM 배지를 이용하여 수득한다.
2. 수득된 세포를 계수하여 96-웰 세포배양 플레이트에 5,000개 세포/웰(cells/well) 단위로 계대 배양하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
3. 24시간 뒤, 다양한 농도의 4-arm PEG azide(0.25, 0.5, 1, 2.5mM)가 첨가된 배지로 교체하였다.
4. 배지 교체 24시간 뒤, PBS에 5mg/ml로 용해된 MTT 용액을 20ul씩 처리하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 2시간 동안 배양하였다.
5. 형성된 포르마잔 결정은 상등액을 제거하고 DMSO로 녹인 후 540nm에서 microplate reader(SpectraMax M3)를 통해 흡광도를 측정하여 세포독성을 평가하였다. 이때, 4-arm PEG azide가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 배양한 대조군에 대한 흡광도를 100%로 하여 상대적인 세포 생존율을 구하였다. 그 결과는 도 4의 A에 나타내었다.
도 4의 A를 보면, 다양한 4-arm PEG azide를 처리한 실험군들이 대조군과 유사한 세포 생존율을 보이는 것을 확인할 수 있다. 즉 4-arm PEG azide가 세포독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.
3-2. 연골세포가 인캡슐레이션된 HA- DBCO 하이드로겔의 모폴로지
연골세포가 인캡슐레이션된 HA-DBCO 하이드로겔을 배지에 2일간 배양하였을 때 하이드로겔의 모폴로지를 관찰하였다. 도 4의 B를 참조하면, 실시예 1(HA-DBCO/0.25)와 실시예 2(HA-DBCO/0.5)는 하이드로겔의 형태를 유지하는 반면, 실시예 3(HA-DBCO/1)은 물성이 비교적 약하여 하이드로겔이 본래의 형태를 유지하지 못하고 풀어지는 것을 확인할 수 있었다.
3-3. HA- DBCO 하이드로겔이 연골세포의 생존율에 미치는 영향
HA-DBCO 하이드로겔이 연골세포에 직접적으로 미치는 영향을 확인하기 위해서 하이드로겔 내부에 세포를 인캡슐레이션하여 live/dead assay를 진행하였다.
1. HA-PEG4-DBCO에 연골세포를 1.0 x 107개 세포/ml(cells/ml)로 혼합하고, 4-arm PEG azide를 각각 0.25, 0.5, 1mM 농도로 첨가하였다.
2. 혼합액은 24-well 세포배양 플레이트에 주입하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 20분간 보관하였다.
3. DMEM 배지를 첨가한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
4. 하이드로겔 내부에서 배양된 세포는 배양 1일차, 5일차에 live/dead 분석 키트로 염색하여 공초점 현미경(Olympus IX 81)으로 관찰하였다. 그 결과는 도 4의 C에 나타내었다.
도 4의 C에 나타낸 바와 같이, 1일차에 HA-DBCO 하이드로겔에서 배양된 연골세포들이 대부분 녹색 형광을 띄는 것을 확인하였다. 5일차도 마찬가지로 대부분의 세포가 녹색 형광을 띄는 것으로 보아 HA-DBCO 하이드로겔이 세포의 생존율에 거의 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.
실험예 4: In vivo에서 HA- DBCO 하이드로겔의 생체적합성 및 생분해성
4-1. 피하 주입 후 젤을 적출한 사진
HA-DBCO 하이드로겔의 생체적합성을 확인하기 위하여 쥐의 피하에 주입 후 일정 시간 경과 후에 젤을 적출한 사진이다.
1. 제조된 HA-PEG4-DBCO와 0.25mM의 4-arm PEG azide를 혼합하여 balb/c 마우스의 피하에 주사기를 이용하여 200mm3을 주입하였다.
2. 주입 후 생체 내에서 젤이 형성됨을 확인하였고, 형성된 하이드로겔을 1, 7, 14, 21, 35일 경과 후 주사 부위를 절제하여 형성된 젤의 형태를 확인하였다.
도 5의 A에 나타낸 바와 같이, 주입된 하이드로겔은 염증 반응을 보이지 않았고, 주변의 조직과 함께 혈관을 형성하여 반투명한 겔의 형태를 나타내는 것을 확인하였다. 즉, 하이드로겔이 생체 내에서 독성을 나타내지 않고 생체 적합성을 가지는 것을 확인하였다.
4-2. In vivo에서의 HA- DBCO 하이드로겔 부피 변화
In vivo에서의 HA-DBCO 하이드로겔의 생분해성을 확인하기 위하여 적출한 하이드로겔의 시간의 경과에 따른 부피를 측정하여 비교하였다. 도 5의 B를 참조하면, 7일 경과 후 적출한 하이드로겔은 체내의 수분을 흡수하여 급격한 부피 증가를 보였다. 하지만 시간이 지남에 따라 천천히 분해되어 부피가 감소하였고, 35일이 경과한 후에도 처음의 부피를 유지하는 것을 확인하였다.
실험예 5: 연골세포가 인캡슐레이션된 HA- DBCO 하이드로겔의 연골 조직 형성
5-1. 35일 후 HA- DBCO 하이드로겔 적출 사진
HA-DBCO 하이드로겔의 연골 조직 형성을 확인하기 위하여 연골세포를 하이드로겔에 인캡슐레이션하여 마우스의 피하에 주입하였다.
1. 제조된 HA-PEG4-DBCO는 수득한 연골세포를 3x106개 세포/300μl의 비율로 혼합하였고, 0.25, 0.5, 1mM의 4-arm PEG azide를 첨가하여 섞은 뒤 24 게이지(gauge) 바늘을 사용하여 balb/c 마우스의 피하에 주입하였다.
2. 35일 경과 후, HA-DBCO 하이드로겔을 적출하여 각각을 비교하였다. 그 결과는 도 6의 A에 나타내었다.
도 6의 A를 참조하면, 실시예1(HA-DBCO/0.25)와 실시예 2(HA-DBCO/0.5)는 하얀 반투명의 연골 조직을 형성한 것을 확인할 수 있었다. 반면 실시예 3(HA-DBCO/1)은 비교적 작은 크기를 보이며 투명한 젤의 형태를 보였다.
5-2. HA- DBCO 하이드로겔의 H&E 염색 분석
각각의 HA-DBCO 하이드로겔에 따른 연골 조직 형성을 비교하기 위하여 H&E 염색을 실시하였다.
1. 상기 5-1와 같이 적출한 HA-DBCO 하이드로겔은 10%의 완충 포르말린 용액을 이용하여 고정시킨 후 파라핀 블록으로 제조하였다.
2. 제조된 블록은 5μm로 슬라이드에 절편한 후 조직학적 분석을 위해 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin) 염색법을 진행하였다. 그 결과는 도 6의 B에 나타내었다.
도 6의 B를 참조하면, 세 종류의 HA-DBCO 하이드로겔 모두 연골 조직이 형성되었고, 첨가된 4-arm PEG azide의 농도에 따라 연골 조직의 형성 경향이 다름을 확인할 수 있었다. 실시예 1(HA-DBCO/0.25)에서는 전반적으로 균일하게 형성된 연골 소강을 확인하였고, 실시예 2(HA-DBCO/0.5)에서는 실시예 1(HA-DBCO/0.25)와는 다르게 곳곳에 뭉쳐서 분포하는 것을 확인할 수 있었다. 실시예 3(HA-DBCO/1)에서는 비교적 연골이 형성되는 정도가 낮았고, 외부의 세포가 하이드로젤 내부로 이동(migration)한 것을 확인할 수 있었다. 본 실험을 통하여 HA-DBCO 하이드로겔의 물성을 조절함으로서 연골 조직의 형성 정도를 조절하여 응용할 수 있음을 확인하였다.
실험예 6: 연골세포가 인캡슐레이션된 HA- DBCO 하이드로겔의 조직 면역 염색
연골세포가 인캡슐레이션된 HA-DBCO 하이드로겔의 연골화 정도를 확인하기 위하여 알시안 블루(alcian blue) 염색과 사프라닌-O(safranin-O) 면역 염색을 시행하였다.
1. 제조된 HA-PEG4-DBCO에 연골세포를 1x107개 세포/300μl의 비율로 혼합하였고, 0.25mM의 4-arm PEG azide를 첨가한 후 balb/c 마우스의 피하에 주입하였다.
2. 35일 후 형성된 젤을 적출하였고, 10%의 완충 포르말린 용액을 이용해 고정한 후 파라핀 블록으로 제조하였다.
3. 제조한 파라핀 블록은 5μm 두께로 슬라이스에 절편한 후 알시안 블루와 사프라닌-O 염색을 시행하였다. 그 결과는 각각 도 7의 A와 B에 나타냈다.
알시안 블루 면역 염색 결과인 도 7의 A를 참조하면, 연골 소강이 전반적으로 잘 형성된 것을 확인하였으며, 형성된 조직은 연골의 성분인 글리코사미노글리칸을 함유하고 있음을 알 수 있었다.
사프라닌-O 면역 염색 결과인 도 7의 B를 참조하면, 마찬가지로, 연골기질이 잘 형성되었음을 확인하였고, 연골 조직에 포함되어있는 프로테오글리칸을 많이 함유하고 있음을 알 수 있었다.

Claims (15)

  1. 하기 화학식 1의 히알루론산 유도체 또는 이의 염:
    [화학식 1]
    Figure 112017004461951-pat00040

    (상기 식에서, l은 1323 내지 6613의 정수이고, m은 1 내지 20의 정수이고, n은 10 내지 2500의 정수이다)
  2. 제1항에 있어서, 상기 m은 1 내지 5의 정수이고, n은 20 내지 1000의 정수인 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체 또는 이의 염.
  3. (1) 0.5 MDa 내지 2.5 MDa의 분자량을 갖는 히알루론산과 하기 화학식 2의 화합물을 반응시켜 하기 화학식 3의 히알루론산 유도체를 제조하는 단계와,
    (2) 하기 화학식 3의 히알루론산 유도체와 하기 화학식 4의 가교제를 반응시켜 하기 화학식 1의 히알루론산 유도체 또는 이의 염을 생성하는 단계
    를 포함하는 제1항의 히알루론산 유도체 또는 이의 염 제조방법:
    [화학식 1]
    Figure 112017004461951-pat00041

    [화학식 2]
    Figure 112017004461951-pat00017

    [화학식 3]
    Figure 112017004461951-pat00048

    [화학식 4]
    Figure 112017004461951-pat00019

    (상기 식에서, l은 1323 내지 6613의 정수이고, m은 1 내지 20의 정수이고, n은 10 내지 2500의 정수이다)
  4. 삭제
  5. 제3항에 있어서, 상기 m은 1 내지 5의 정수이고, n은 20 내지 1000의 정수인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 화학식 4의 가교제는 0.01 내지 2.5 mM의 농도로 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 하기 화학식 3의 히알루론산 유도체 및 하기 화학식 4의 가교제를 포함하는, 주사가능한 하이드로겔 형성용 조성물:
    [화학식 3]
    Figure 112017004461951-pat00049

    [화학식 4]
    Figure 112017004461951-pat00021

    (상기 식에서, l은 1323 내지 6613의 정수이고, m은 1 내지 20의 정수이고, n은 10 내지 2500의 정수이다)
  8. 제7항에 있어서, 상기 m은 1 내지 5의 정수이고, n은 20 내지 1000의 정수인 것을 특징으로 하는 주사가능한 하이드로겔 형성용 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 화학식 4의 가교제는 0.01 내지 2.5 mM의 농도로 사용하는 것을 특징으로 하는 주사가능한 하이드로겔 형성용 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 용매로서 증류수, 완충용액 및 생리 식염수로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매를 포함하는 것을 특징으로 하는 주사가능한 하이드로겔 형성용 조성물.
  11. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 연골세포, 근아세포, 간세포, 골아세포, 배아줄기세포, 배아생식세포, 성체줄기세포, 중간엽줄기세포, 신경줄기세포, 혈관내피줄기세포, 조혈모세포, 간줄기세포, 심장줄기세포, 췌장줄기세포, 내피전구세포, 성장내피세포, 간엽줄기세포, 조혈줄기세포, 인간신경줄기세포, 위성세포, 장 상피세포, 평활근세포 및 섬유아세포로 이루어진 군에서 선택된 1종의 세포를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 주사가능한 하이드로겔 형성용 조성물.
  12. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 주사가능한 하이드로겔 형성용 조성물 및 연골세포를 포함하는 연골재생용 약제학적 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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