CN111686075B - 一种以纳米胶束为交联剂的原位水凝胶组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

一种以纳米胶束为交联剂的原位水凝胶组合物及其应用。本发明公开了一种适用于大分子药物和/或小分子药物局部共递送的原位水凝胶组合物和应用。以功能化胶束作为难溶性小分子增溶载体并交联亲水性高分子水凝胶骨架材料构建网状三维水凝胶结构，实现小分子药物和生物大分子药物的局部可控递释。本发明的原位水凝胶组合物通过端基功能化的胶束作为难溶性药物的增溶载体实现小分子药物的局部可控递释，功能化端基作为水凝胶的交联剂，与侧链功能化修饰的链状亲水性高分子材料交联构建亲水网状三维凝胶结构。局部给予光热治疗的小分子，可以有效提高光热剂的光热效率以及反复光照后的光热稳定性，可运用于肿瘤术后的辅助治疗。

Description

一种以纳米胶束为交联剂的原位水凝胶组合物及其应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，主要涉及一种以纳米级胶束为交联剂，适用于大分子药物和小分子药物局部共递送的原位水凝胶组合物及其在抗肾纤维化，抗肿瘤治疗方面的应用。

背景技术

慢性肾病（Chronic kidney disease, CKD）在全球范围内的发病率呈逐年上升趋势。其中，肾间质纤维化（interstitial renal fibrosis）是导致慢性肾病终末期肾衰竭（End-stage renal failure, ESRF）的常见病理学通路，还会引起进行性肾功能衰竭、肾功能损害并发症以及诱发心血管疾病，严重危害人类的健康和生存质量。肾间质纤维化是细胞外基质（extracellular matrix, ECM）过度累积的必然结果，是肾组织在慢性持续性损伤后肾组织的创伤愈合过程。肾间质纤维化破坏性强，对于中晚期CKD患者，透析和肾移植是维持和延续生命的主要治疗手段，给患者家庭和社会带来巨大经济负担。系膜细胞和成纤维细胞活化以及肾小管上皮细胞的上皮-间质转化，是病理状态下产生间质ECM的主要途径。

常用治疗肾纤维化的药物包括抗 TGF-β1抗体、生长因子和各种激酶抑制剂等。由于药物体内分布缺乏特异性，单纯提高给药剂量，常伴随严重的全身毒副反应。因此，有必要通过药剂学手段开发能靶向传递药物至病灶处的递药载体，从而提高靶部位的有效药物浓度以达到增效减毒的目的。

现有的肾靶向递药策略主要包括：i）采用肾靶向配体与药物偶联形成小分子或高分子耦合物，所使用的靶向配体包括溶菌酶、2-氨基葡萄糖、低分子量白蛋白（LMWP）、低分子量壳聚糖（LMWC）、乙烯基吡咯烷酮/二甲基马来酸共聚物（PVD）、聚马来酸（HPMA）、叶酸、抗体片段等；ii）纳米载体，如特定粒径的白蛋白粒或金纳米粒。虽然上述载体经全身给药后显示出一定的肾靶向特性，但在应用时存在以下问题：药物-载体缀合物结构不明确，要将它们开发成新药存在未知的难度；载体分子量较大，活性基团数量有限，载药量低；制备工艺复杂，重现性差，不适合工业化大生产；免疫原性，生物相容性差，毒性大。

癌症是除心血管疾病外死亡率最高的疾病之一。目前，临床上使用的癌症治疗手段包括手术、放疗以及化疗药物治疗。其中，化疗是综合治疗的主要措施之一。然而，常用化疗药物由于不能区分正常细胞和肿瘤细胞，难以实现选择性靶向肿瘤细胞。因此，临床应用时常会产生诸如骨髓抑制、心脏毒性、肾毒性等严重全身毒副作用。此外，大部分肿瘤术后复发率高达60%以上，症状包括原发病灶复发和远端转移，原因与手术难以彻底清除肿瘤细胞有关。因此，一些局部给药和治疗的策略将有益于肿瘤的术后辅助治疗。光热治疗（PTT）是一种利用光热材料将近红外光转化为热，利用热效应杀死肿瘤细胞的治疗方法。但是，已有的光热材料本身不具有肿瘤细胞选择性，而通过全身给药方式分布于全身各大脏器也容易产生毒性反应。

亲水性高分子材料是构成亲水凝胶三维网状结构的骨架材料。线性亲水性高分子材料如多糖、蛋白来源的天然高分子具有来源广泛、生物相容性好等特点。分散在水溶液介质中的线性聚合物高分子通过多种机理发生交联，形成三维网状结构的水凝胶。成胶机理包括温度引起的聚合物链缠绕和折叠、聚合物自组装、离子交换胶凝、化学键交联、静电相互作用等。常用的线形亲水性高分子材料有海藻酸钠、肝素、壳聚糖、硫酸软骨素、透明质酸、纤维素、瓜尔胶、胶原、明胶、糖基化蛋白等。

水凝胶是一种具有三维网状结构的聚合物材料，现广泛运用于作为细胞支架、药物递释系统、软组织替代品和伤口敷料等医药和组织工程领域。可利用水凝胶良好的生物相容性和可降解特性，通过局部注射在病变部位形成药物储库可实现药物的局部可控释放，从而提高药物在病变部位的有效蓄积，达到治疗目的。

两药联用或多药联用策略通常显示出更优的疗效，但是，生物大分子药物与难溶性小分子药物由于理化性质差距较大，通常采用不同的递药系统进行递送，给药困难且难以同时保证病变部位的药物浓度。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种以纳米胶束为交联剂的原位水凝胶组合物，可实现生物大分子药物与难溶性小分子药物的共递释。所述的一种以纳米胶束为交联剂的原位水凝胶组合物可应用于抗肾纤维化、抗肿瘤或肿瘤术后辅助治疗。

本发明通过以下技术方案予以实现：

一种以纳米胶束为交联剂的原位水凝胶组合物，采用侧链功能化修饰的线性亲水性高分子材料作为亲水凝胶骨架，采用端基功能化的胶束作为难溶性药物的增溶载体实现小分子药物的局部可控递释，而其功能化的端基亦作为水凝胶的交联剂，与侧链功能化修饰的线性亲水性高分子材料交联构建亲水性网状三维凝胶结构，通过水凝胶的网状孔隙结构实现生物大分子药物和/或难溶性小分子药物的局部可控递释。

所述水凝胶交联方式包括物理交联和化学交联，物理交联包括离子相互作用，氢键作用，疏水作用，化学交联法包括弱碱性条件催化的迈克尔加成反应，含炔基的点击化学反应，希弗碱反应，以及光催化的巯基烯烃点击化学反应。

所述端基功能化胶束和侧链功能化修饰的线性亲水性高分子材料，分别修饰以下官能团对：金刚烷-环糊精，巯基-巯基，双键-双键，巯基-烯/炔，巯基-马来酰亚胺，巯基-亲双烯体，醇铵-醛/铜，醛-醇/胺/肼的基团中的一种或几种。

所述功能化胶束为端基功能化的三嵌段两亲性共聚物单独形成的胶束和/或与其他两嵌段、三嵌段两亲性共聚物形成的混合胶束，其中三嵌段两亲性共聚物优选为聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物-聚乙二醇嵌段聚合物（PEG-PLGA-PEG）、聚乙二醇-聚赖氨酸-聚乙二醇（PEG-PLL-PEG）、嵌段聚合物普朗尼克PEO-PPO-PEO，更优选为普朗尼克F127、P84、普朗尼克F68中的一种或多种，两嵌段两亲性共聚物优选为D-α-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯（TPGS）。

其中所述普朗尼克F68的分子量优选为7680 – 9510 Da，所述P84的分子量优选为4200 Da，F127的分子量优选为12600 Da。

基于胶束的实际粒径需要，可通过选择不同分子量的载体材料制备不同粒径大小的混合胶束。

所述端基功能化胶束粒径范围在10 nm - 300 nm，优选为20 nm - 100 nm。

所述侧链功能化修饰的线性亲水性高分子材料为多糖类衍生物或蛋白类高分子材料中的一种或几种经过侧链功能化修饰，优选为肝素、右旋糖苷、透明质酸、壳聚糖、硫酸软骨素、瓜尔胶、明胶、胶原，更优选为透明质酸和/或明胶。

所述侧链功能化修饰的链状亲水性高分子材料的分子量为5 kDa ~ 1000 kDa，优选为6 kDa ~ 300 kDa。

所述胶束水凝胶可用于载难溶性小分子药物和/或大分子药物。

所述难溶性小分子药物选自有抗炎作用或抗纤维化作用或抗癌作用的难溶性小分子药物的一种或几种，优选为雷公藤红素，地塞米松，泼尼松龙，紫杉醇，吡非尼酮，可用于肿瘤光热治疗的近红外荧光染料IR780（2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-3,3-二甲基-1-丙基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-3,3-二甲基-1-丙基吲哚鎓碘化物）、IR775（2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)-亚乙基]-1-环己烯-1-基]-乙烯基]-1,3,3-三甲基-3H-吲哚氯化物）、IR825（3-[(4-羧基苯基)甲基]-2-[2-[3-[2-[3-[(4-羧基苯基)甲基]-1,3-二氢-1,1-二甲基-2H-苯并[e]吲哚-2-亚基]亚乙基]-2-氯-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,1-二甲基-1H-苯并吲哚鎓溴化物），Toll样受体激动剂包括TLR7/8激动剂咪喹莫特（R-837）和瑞奎莫德（R-848），TLR4拮抗剂如二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、白术内酯I。

所述生物大分子药物选自有抗炎作用或抗纤维化作用或抗癌作用的一种或几种，优选为白细胞介素10（IL-10），转化生长因子β抗体（anti-TGF-β）, 骨形态形成蛋白-7（BMF-7），PD-1抗体，PD-L1抗体。

本发明的胶束水凝胶的制备方法可采用本领域常用的水凝胶制备方法进行制备，优选以下制备方法制备：

一种碱催化的胶束凝胶组合物的制备方法，包括如下步骤：1）制备侧链功能化修饰的线性亲水性高分子材料、端基功能化的胶束载体材料、难溶性小分子药物溶液；2）所述端基功能化的胶束载体材料溶于有机溶剂，与上述难溶性小分子药物溶液混合，旋转蒸发除去有机溶剂，再分散于合适的溶剂中制备获得胶束；3）将上述侧链功能化修饰的线性亲水性高分子材料溶于水中，再与上述胶束混合，在碱催化条件下通过迈克尔加成反应交联形成胶束凝胶。

其中，步骤2）所述有机溶剂选自乙腈、甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿中的一种或几种；所述合适的溶剂选自水、生理盐水、葡萄糖溶液、缓冲溶液中的一种或多种。

一种主客分子交联的胶束凝胶制备方法，包括如下步骤：1）制备侧链功能化修饰的线性亲水性高分子材料、端基功能化的胶束载体材料、难溶性小分子药物溶液；2）所述端基功能化的胶束载体材料溶于有机溶剂，与上述难溶性小分子药物溶液混合，旋转蒸发除去有机溶剂，再分散于合适的溶剂中制备获得胶束；3）将上述侧链功能化修饰的线性亲水性高分子材料溶于水中，再与上述胶束混合，搅拌或超声或均质条件下即可形成胶束凝胶。

其中，用于修饰所述端基功能化的胶束载体材料的原料选自环糊精或其衍生物，优选α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、葡萄糖基-β-环糊精、麦芽糖基-β-环糊精中的一种或几种；用于修饰侧链功能化线性亲水性高分子材料的原料选自金刚烷乙酸、金刚烷乙胺、前列腺素E2、双环戊二烯合铁（二茂络铁）、苯并咪唑，优选金刚烷乙酸和金刚烷乙胺。

步骤2）所述有机溶剂选自乙腈、甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿中的一种或几种；所述合适的溶剂选自水、生理盐水、葡萄糖溶液、缓冲溶液中的一种或多种。

一种光催化的胶束凝胶制备方法，包括如下步骤：1）制备侧链功能化修饰的线性亲水性高分子材料、端基功能化的胶束载体材料、难溶性小分子药物溶液；2）所述端基功能化的胶束载体材料溶于有机溶剂，与上述难溶性小分子药物溶液混合，旋转蒸发除去有机溶剂，再分散于含光引发剂的合适溶剂中制备获得胶束；3）将上述侧链功能化修饰的线性亲水性高分子材料溶于含光引发剂水中，再与上述胶束混合，紫外或可见光照射下即可形成胶束凝胶。

其中，用于修饰所述线性亲水性高分子材料的原料选自D型半胱氨酸、L型半胱氨酸、巯基乙胺、半胱胺中的一种或几种，优选巯基乙胺和半胱胺。

步骤2）所述有机溶剂选自乙腈、甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿中的一种或几种；所述合适的溶剂选自含有光引发剂的溶液。

本发明还提供了一种以纳米胶束为交联剂的原位水凝胶组合物在抗肾纤维化、抗肿瘤或肿瘤术后的辅助治疗的应用。

有益效果

本发明的原位水凝胶组合物通过采用端基功能化的胶束作为难溶性药物的增溶载体实现小分子药物的局部可控递释，而其功能化的端基亦作为水凝胶的交联剂，与侧链功能化修饰的链状亲水性高分子材料交联构建亲水性网状三维凝胶结构，实现生物大分子药物的局部可控递释，能够同时实现难溶性小分子药物和生物大分子药物的局部可控递释，确保两种药物在病变部位达到有效浓度，达到良好的共递送控释效果，降低药物毒副作用并且减少给药频次，增加患者顺应性。此外，局部给予光热治疗的小分子，可以有效提高光热剂的光热效率以及反复光照后的光热稳定性，可运用于肿瘤术后的辅助治疗。

附图说明

图1：胶束水凝胶结构示意图；

图2：F127甲基丙烯酸酯（bis-F127-MA）的结构和核磁氢谱；

图3：巯基修饰透明质酸（HASH）的结构和核磁氢谱；

图4：碱催化成胶的F127-HA胶束水凝胶成胶前后对比图；

图5：F127胶束及其衍生物F127-MA和F127-CD胶束透射电镜图和粒径图；

图6: 成胶过程示意图；

图7：F127-MA 胶束和碱催化成胶的F127-HA胶束水凝胶透射电镜图；

图8：不同粒径的PEO-PPO-PEO/TPGS混合胶束透射电镜图和粒径图；

图9：β-环糊精修饰的F127（F127-CD）的合成路线和核磁氢谱；

图10：金刚烷乙酸修饰的HA（HA-AD）的合成路线和核磁氢谱；

图11：F127-CD胶束和HA-AD成胶和流变学性质；

图12：碱催化成胶的F127-HA胶束水凝胶与疏水性药物的物理混合和增溶载药对比图；

图13：载地塞米松、泼尼松龙和牛血清白蛋白的F127-HA胶束水凝胶体外释放曲线；

图14：肾囊局部注射载DiD和Cy5.5-BSA的F127-HA胶束水凝胶后的活体成像及体内释放曲线；

图15：肾囊局部注射F127-HA胶束水凝胶的肾脏组织切片HE染色；

图16：UUO模型肾的组织切片HE染色和Masson染色结果；

图17：载雷公藤红素和TGFβ1抗体F127-HA胶束水凝胶用于UUO引起的肾纤维化模型的药效考察--组织形态学变化和间质纤维化程度；

图18：载雷公藤红素和TGFβ1抗体F127-HA胶束水凝胶用于UUO引起的肾纤维化模型的药效考察--UUO侧肾组织炎性因子TNF-α，IL-6和IL-1β的免疫组化表征和半定量统计；

图19：IR780溶液、IR780胶束和载IR780的F127-HA胶束水凝胶的光热效应曲线；

图20：反复光照对IR780溶液、IR780胶束和载IR780的F127-HA胶束水凝胶的光热效率影响；

图21：不同交联度的光催化F127-HA胶束水凝胶的光热效率比较；

图22：载IR780的F127-HA胶束水凝胶用于抑制术后乳腺癌复发的药效验证--瘤体积大小随时间变化和小鼠体重随时间变化曲线。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明不限于这些实施例及其使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。

实施例1：碱催化F127-HA胶束水凝胶组合物制备和理化性质表征

胶束水凝胶结构示意图如图1所示。

首先，合成F127甲基丙烯酸酯（bis-F127-MA），结构式和核磁谱图如图2所示。称取5 g（0.4 mmol）的普朗尼克F127（F127）, 将其溶解在100 mL 无水二氯甲烷中，冰浴条件下依次滴加2 mL 三乙胺和4 mL 甲基丙烯酸酐（0.026 mol），室温反应24小时，反应结束后将反应液减压浓缩至20 mL，用5倍体积量反应液的冰乙醚沉淀析晶，抽滤，真空干燥得双键修饰的F127（bis-F127-MA，4.2 g，产率80%）。¹HNMR (400 MHz, CDCl3, δ): 6.13 (s, 2H),5.58 (s, 2H), 3.57 (bs, PEG), 1.13 (bs, 6H) （图2）。

其次，合成巯基修饰透明质酸（HASH），结构式和核磁谱图如图3所示。称取1 g（2.5mmol 的二糖重复单元）的透明质酸钠（HA, 77 k Da）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，575 mg，5mmol）溶解在80 mL去离子水中，室温下搅拌至其完全溶解。随后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCL 958 mg，5 mmol）搅拌2 h 以活化HA 的羧基。根据文献方法，巯基乙胺（855 mg，7.5 mmol）和二硫苏糖醇（578 mg，3.75 mmol）溶于10 mL 的稀盐酸（10 w/v%，pH 3.0），上述溶液在搅拌下滴加入HA 溶液，反复抽真空3次，氮气保护，搅拌反应过夜。反应结束后将反应液转移至截留分子量为8000 - 12000 Da的透析袋中，在含100 mM 氯化钠的盐酸（pH 3.5）中透析3 天，平均每8 h换一次透析液，透析结束后，收集样品液冻干。冻干后产物置于-20 ºC干燥保存。¹HNMR (400 MHz, D2O, δ): 4.38 (bs, 2H),3.0 - 3.8 (bs, 5H), 2.54 (m, 2H), 2.30 (m, 2H), 1.87 (bs, 3H) （图3）。

称取bis-F127-MA 50 mg，溶于5 mL乙腈，旋转蒸发形成聚合物膜，再分散于2 mLHEPES（pH8.0，0.1M）缓冲液获空白的F127-MA胶束。巯基修饰的透明质酸（HASH）溶于纯水制备成1%-10%的溶液；接下来，将一定量的F127-MA胶束溶液与HASH溶液搅拌混和，pH8.00.1M HEPES碱催化条件下通过迈克尔加成反应交联形成胶束水凝胶。总质量分数在1%至10%的F127-HA胶束水凝胶均能在37 °C条件下迅速成胶，完成由液态至半固体凝胶态的转变。对总质量分数1%，5%，10%的F127-HA胶束水凝胶进行流变性质考察，结果显示各组凝胶均在5分钟之内完成液态至固态的转化，且凝胶固化后的储能模量G’远高于损耗模量G”，表明所形成的凝胶以固态性质为主。凝胶粘度随聚合物总质量分数的增加而增加，5%的凝胶组最大溶胀率为200%左右，体外21天后凝胶逐渐开始降解（图4）。

实施例2：载雷公藤红素的碱催化F127-HA胶束水凝胶组合物制备

称取雷公藤红素（CLT) 10 mg，溶于10 mL乙腈制备1 mg/mL储备液。称取bis-F127-MA 50 mg，溶于5 mL乙腈，加入3 mL CLT储备液，混合均匀后旋转蒸发形成含药聚合物膜，再分散于2 mL HEPES（pH8.0，0.1M）缓冲液获载CLT的F127-MA胶束。上述方法所制备胶束呈类球型，大小均一，平均粒径为35.6 ± 0.6 nm，PDI为0.168 ± 0.02，ζ电位为-0.13 ± 0.011 mV，包封率为(95.4 ± 2.0)%，载药量为(1.62 ± 0.1)%。F127-MA胶束透射电镜图和粒径图如图5所示。

以1M、pH8.0 HEPES为溶剂制备载药胶束（5% - 10%），巯基修饰的透明质酸（HASH）溶于纯水制备成1%-10%的溶液；接下来，将一定量的载CLT的F127-MA胶束溶液与HASH溶液搅拌混和，pH8.0 0.1M HEPES碱催化条件下通过迈克尔加成反应交联形成胶束水凝胶。总质量分数在1%至10%的F127-HA胶束水凝胶均能在37 °C条件下迅速成胶，完成由液态至半固体凝胶态的转变（成胶时间<5分钟）（图6）。通过透射电镜观察F127-MA胶束和F127-HA胶束水凝胶，F127-HA胶束水凝胶内部的20-30 nm胶束颗粒清晰可见，且颗粒大小与F127-MA胶束类似（图7）。

实施例3：载泼尼松龙的碱催化F127-HA胶束水凝胶组合物的制备

称取泼尼松龙（PRE) 10 mg，溶于10 mL乙腈制备1 mg/mL储备液。称取bis-F127-MA 50 mg，溶于5 mL乙腈，加入3 mL PRE储备液，混合均匀后旋转蒸发形成含药聚合物膜，再分散于2 mL HEPES（pH8.0，0.1M）缓冲液获载PRE的F127-MA胶束。胶束呈类球形、粒径分布均一，包封率大于90%。同法，以纯水为溶剂制备10%的HASH溶液，取HASH溶液2 mL与载PRE胶束溶液2 mL等体积混合，该胶束水凝胶在37 °C条件下迅速成胶，且凝胶呈均一透明状态。

实施例4：载地塞米松的碱催化F127-HA胶束水凝胶组合物的制备

称取地塞米松（DEX) 10 mg，溶于10 mL乙腈制备1 mg/mL储备液。称取bis-F127-MA 50 mg，溶于5 mL乙腈，加入3 mL DEX储备液，混合均匀后旋转蒸发形成含药聚合物膜，再分散于2 mL HEPES（pH8.0，0.1M）缓冲液获载DEX的F127-MA胶束。胶束呈类球形、粒径分布均一，包封率大于90%。同法，以纯水为溶剂制备10%的HASH溶液，取HASH溶液2 mL与载DEX胶束溶液2 mL等体积混合，该胶束水凝胶在37 °C条件下迅速成胶，且凝胶呈均一透明状态。

实施例5：载TGF-β抗体的碱催化F127-HA胶束水凝胶组合物的制备

称取bis-F127-MA 50 mg，溶于5 mL乙腈，旋转蒸发形成含药聚合物膜，再分散于2mL HEPES（pH8.0，0.1M）缓冲液获F127-MA胶束。称取10 mg TGF-β抗体，溶解于1 mL纯水中，吸取100 μL抗体溶液加入5%的HASH溶液，取载TGF-β抗体的HASH溶液2 mL与F127-MA胶束溶液2 mL等体积混合，该胶束水凝胶在37 °C条件下迅速成胶，且凝胶呈均一透明状态。

实施例6: 载牛血清白蛋白的碱催化F127-HA胶束水凝胶组合物的制备

称取bis-F127-MA 50 mg，溶于5 mL乙腈，旋转蒸发形成含药聚合物膜，再分散于2mL HEPES（pH8.0，0.1M）缓冲液获F127-MA胶束。称取10 mg 牛血清白蛋白，溶解于10 mL 5%的HASH溶液中。然后取载牛血清白蛋白的HASH溶液2 mL与F127-MA胶束溶液2 mL等体积混合，该胶束水凝胶在37 °C条件下迅速成胶，且凝胶呈均一透明状态。

实施例7：共载TGF-β抗体和雷公藤红素的碱催化F127-HA胶束水凝胶组合物的制备

称取雷公藤红素（CLT) 10 mg，溶于10 mL乙腈制备1 mg/mL储备液。称取bis-F127-MA 50 mg，溶于5 mL乙腈，加入3 mL CLT储备液，混合均匀后旋转蒸发形成含药聚合物膜，再分散于2 mL HEPES（pH8.0，0.1M）缓冲液获载CLT的F127-MA胶束。称将10 mg TGF-β抗体，溶解于1 mL纯水中，吸取100 μL抗体溶液加入5%的HASH溶液1.9 ml，取载TGF-β抗体的HASH溶液2 mL与载CLT胶束溶液2 mL等体积混合，该胶束水凝胶在37 °C条件下迅速成胶可获得共载两药的胶束水凝胶，且凝胶外观呈均一透明状态。

实施例8：不同粒径大小的混合胶束制备

选择不同分子量的三嵌段聚合物与一定比例的两嵌段聚合物混合可制备不同粒径大小的混合胶束。称取F127 50 mg，称取TPGS 5 mg，共同溶于5 mL乙腈，混合均匀后旋转蒸发形成含药聚合物膜，再分散于2 mL HEPES（pH8.0，0.1M）缓冲液。如图8所示，F127/TPGS胶束呈类球形，平均粒径23.2 ± 0.2 nm （PDI = 0.136）。同法，采用P84 50 mg替代F127，所制备的P84/TPGS胶束呈类球形，平均粒径约13.4 nm（PDI = 0.148）。

实施例9：主客分子交联的F127-HA胶束水凝胶组合物制备

β-CD修饰F127（F127-CD）和金刚烷修饰透明质酸（HA-Ad），合成路线和结构式如图9和图10所示。称取适量F127-CD溶解于乙腈中，旋蒸除去有机溶剂，然后将其于45 °C同温水化分散得到5%的胶束储备液。如图5所示，F127-CD胶束的平均粒径为36.5 ± 1.1 nm,PDI为0.346 ± 0.03，-40 °C预冻，冻干。将胶束重新分散于适量1M pH7.4 PBS中，制备得20%、25%、30%的胶束储备液。

称取适量HA-Ad溶解于PBS中，制备得5%储备液。取不同浓度的F127-CD胶束储备液，分别与等体积的HA-Ad储备液搅拌混合均匀，于37 °C通过主客分子，F127相变作用交联形成了F127-HA胶束水凝胶。该凝胶的流变学性质显示出剪切变稀的性质，适合用于注射给药（图11）。

实施例10：光催化交联的F127-HA胶束水凝胶包载光热治疗剂的组合物制备

称取近红外荧光染料IR780 200 μg，400 mg bis-F127-MA溶于4 mL乙腈，通过薄膜分散法制备含药聚合物薄膜，再分散于2 mL 0.5% Irgacure 2959（I-2959）水溶液中获载IR780的F127-MA胶束。

巯基修饰的透明质酸（HASH）溶于0.5% I-2959 水溶液制备成20%（w/v）的储备溶液。接下来，如下表所示，将一定体积的上述载IR780的F127-MA胶束溶液与HASH溶液搅拌混和，在紫外光（365 nm，5 - 10 min）照射条件下共价交联形成胶束水凝胶。按表1所示处方制备，均可获得固化的胶束水凝胶。

表1. 光催化交联的F127-HA胶束水凝胶处方

实施例11：F127-HA胶束水凝胶对难溶性药物的增溶效应

称取地塞米松（DEX) 10 mg，溶于10 mL乙腈制备1 mg/mL储备液。称取bis-F127-MA 50 mg，溶于5 mL乙腈，加入3 mL DEX储备液，混合均匀后旋转蒸发形成含药聚合物膜，再分散于2 mL HEPES（pH8.0，0.1M）缓冲液获载DEX的F127-MA胶束。巯基修饰的透明质酸（HASH）溶于纯水制备成10%（m/v）的溶液。将载DEX F127-MA胶束溶液与HASH溶液等体积搅拌混和，于37 °C条件下形成胶束水凝胶，此载药胶束水凝胶外观澄清透明（图12）。若DEX在两种溶液混合后加入，则难溶性DEX以固体形式分散于凝胶基质中，凝胶外观呈浑浊状（图12）。

实施例12：载药碱催化F127-HA胶束水凝胶组合物体外释放曲线

采用1X pH7.4 PBS + 0.5% 吐温-80为释放介质，将实施例3、4、6中所制备载药水凝胶和相同处方构成简单混合制备的对应物理混合物各1 mL分别置于透析袋内（MWCO5000 – 8000 Da），按时取点测药物浓度，初步考察难溶性小分子药物和生物大分子的体外释放行为。如图13所示，物理混合组中，地塞米松和泼尼松龙在24小时的累积释放量均接近100%，表示药物快速从水凝胶中扩散释放；而胶束胶凝组的地塞米松和泼尼松龙在7天的累积释放百分数分别约为40%和50%。故推测，地塞米松和泼尼松龙的进一步释放将依赖于水凝胶材料体系的降解和溶蚀。牛血清白蛋白的释放经历了初期的突释阶段后，呈类似线性的零级释放特征（图13）。

实施例13：载药F127-HA胶束水凝胶组合物体内释放曲线

以近红外荧光探针DiD作为难溶性小分子药物模型，以近红外荧光分子Cy5.5标记的牛血清白蛋白（Cy5.5-BSA）作为生物大分子药物模型，按照实施例1的方法及用量配比，仅是将小分子药物换成DiD制备获得包载荧光素DiD F127-MA胶束水凝胶。按照实施例1的方法及用量配比，仅是药物换成Cy5.5-BSA制备获得包载荧光素Cy5.5-BSA F127-MA胶束水凝胶。同时，按照实施例1的方法及用量配比制备不载药的空白F127-MA胶束水凝胶备用。采用健康雄性Balb/c小鼠，自由饮食并禁食后随机分成3组。每组分别给等量的空白F127-MA胶束水凝胶、包载荧光素DiD F127-MA胶束水凝胶和包载荧光素Cy5.5-BSA F127-MA胶束水凝胶。给药后使用小动物活体成像仪在预设时间点进行拍照，观察凝胶的降解情况，实验结果见图14。

如图14所示，根据F127-HA胶束水凝胶分别包载DiD和Cy5.5-BSA活体成像荧光半定量得到的释放结果可以看出：DiD和Cy5.5-BSA能稳定存在于凝胶中长达21天，且21天内的体内累计释放量可达70%，说明DiD和Cy5.5-BSA能够通过F127-HA凝胶载体材料的溶蚀降解以及扩散作用而缓慢释放。这一结果一定程度上模拟了小分子难溶性药物和大分子蛋白药物从凝胶体系中释放出来的情况，再次证明该凝胶体系适合作为肾内局部注射的载药体系。

实施例14：F127-HA胶束水凝胶生物相容性表征

按实施例1所述方法制备10%（w/v）空白F127-HA胶束水凝胶溶液，给予Balb/C小鼠（18 - 22 g）肾囊内注射15 µL凝胶溶液，并使其原位成胶。分别在3天、7天和21天取出注射部位肾脏组织固定并进行切片和HE染色。于显微镜下观察各样品的组织形态特征。结果显示：注射点周围肾脏组织无明显炎性细胞浸润，肾组织细胞形态完好，无明显病变，表明该材料的生物相容性良好（图15）。

实施例15：HA-F127原位水凝胶组合物对肾间质纤维化的药效学研究

（1）UUO模型建立：选用雄性Balb/c小鼠（18-22 g），自由饮食并禁食后，对Balb/c小鼠行单侧输尿管结扎手术，于术后3天、7天、14天和21天处死小鼠，取肾脏组织固定、包埋制备石蜡切片，并进行HE和Masson染色。假手术组的小鼠于21天处死后，同法制备肾组织切片进行免疫组化分析。如图16所示，与假手术组及同时间点右侧肾比较，左肾UUO造模组随时间进展间质胶原沉积逐渐增多，肾小管管型结构逐渐缺失，提示造模成功。

（2）药效研究：选用雄性Balb/c小鼠（18-22 g），自由饮食并禁食后将其随机分为以下实验组。Sham组：不结扎输尿管，其余操作同UUO组；UUO组：结扎单侧输尿管；UUO + CLT溶液组：结扎单侧输尿管后，尾静脉给予CLT（3 mg/kg）隔天给一次药，一共给药4次；UUO +空白凝胶组：结扎单侧输尿管后，肾囊内注射15 µL空白F127-HA凝胶；UUO + CLT凝胶组：结扎单侧输尿管后，肾囊内注射15 µL载CLT的F127-HA凝胶（3 mg/kg）；UUO + TGF β1抗体凝胶组：结扎单侧输尿管后，肾囊内注射15 µL载anti-TGFβ抗体的F127-HA凝胶（0.1 mg/只，6.7 µg/µL；UUO + anti-TGFβ/CLT凝胶组：结扎单侧输尿管后，肾囊内注射15 µL载TGFβ1抗体的F127-HA凝胶（CLT: 3 mg/kg ; anti-TGF β1: 0.1 mg/只，6.7 µg/µL）。各组于术后7天、14天、21天取血并处死小鼠，观察肾脏病变程度并取心、肝、脾、肺、肾等组织脏器备用。通过免疫组化手段表征造模肾的组织形态变化、评价间质纤维化程度以及相关炎症因子表达水平。结果显示局部给予CLT 具有良好的抗炎效果，并在肾间质纤维化初发过程中起到了积极的保护作用；与TGF-β1 抗体联合用药后，在肾间质纤维化进程的不同阶段显示出抗纤维化的积极作用（图17和图18）。

实施例16：载光热制剂F127-HA胶束水凝胶的光热效应

（1）光热性质考察

0.5% I2959水溶液制备：称取50 mg I-2959溶于100 ml纯水中得0.5% I-2959水溶液。

20 μg/mL IR780溶液制备：称取12 mg IR780溶于3 ml乙腈中，得4 mg/mL IR780储备液，再量取50 μL IR780储备液，用0.5% I-2959水溶液稀释至10 mL，得20 μg/mLIR780 水溶液。

载20 μg/mL IR780的F127_7.5%胶束制备：称取IR780 40 μg，150 mg F127-MA溶于4mL乙腈，通过薄膜分散法制备含IR780聚合物薄膜，再分散于2 mL 0.5% I-2959 水溶液中获载IR780的F127-MA胶束（7.5%）。

载20 μg/mL IR780的F127_7.5% - HA_5%胶束水凝胶制备：称取IR780 80 μg，300 mgF127-MA溶于8 mL乙腈，通过薄膜分散法制备含IR780聚合物薄膜，再分散于2 mL 0.5% I-2959 水溶液中获载IR780的F127-MA胶束（15%），称取200 mg HASH溶于2 mL 0.5% I-2959水溶液制备成溶液（10%）；接下来，将500 μL的胶束溶液与500 μL HASH溶液搅拌混和，在紫外光催化条件下通过迈克尔加成反应交联形成胶束水凝胶。

最后，将样品用808 nm近红外激光（1.18 W/cm²）照射10分钟，每分钟记录温度。如图19所示，与溶液组比较，F127-MA胶束组和F127_7.5% - HA_5%胶束水凝胶组均能显著提高IR780的光热效率。

（2）反复光照稳定性考察

将IR780溶液，载IR780的F127_7.5%胶束，载IR780的F127_7.5% - HA_5%胶束水凝胶用808nm近红外激光（1.18 W/cm²）照射10分钟，每两分钟记录温度，待样品冷却至室温后，近红外激光再次照射，每两分钟记录温度，重复6次。结果显示，仅F127_7.5% - HA_5%胶束水凝胶组再多次照射后仍然显示出较好的光热效率，而溶液组和胶束组经多次照射后逐渐丧失其光热性能（图20）。

（3）不同交联度凝胶的光热性质考察

载20 μg/mL IR780的F127-HA胶束水凝胶制备：称取IR780 80 μg，一定量的F127-MA溶于8 mL乙腈，通过薄膜分散法制备含IR780聚合物薄膜，再分散于2 mL 0.5% I-2959 水溶液中获载IR780的F127-MA胶束储备液，称取200 mg HASH溶于2 mL 0.5% I-2959水溶液制备成溶液（10%）；如表2所示，一定体积的载IR780的胶束储备液与一定体积的HASH溶液搅拌混和，在紫外光催化条件下通过迈克尔加成反应交联形成胶束水凝胶。将样品用808 nm近红外激光（1.18 W/cm²）照射10分钟，每两分钟记录温度。结果显示，不同交联度的胶束水凝胶对其光热效率的影响不大（图21）。

表2. 不同交联度的胶束水凝胶处方

实施例17：载光热制剂F127-HA胶束水凝胶用于乳腺肿瘤术后辅助治疗的应用

将10⁶ 4T1-Luc细胞接种于6 ~ 8周大的雌性Balb/c小鼠左侧第二脂肪垫上，待肿瘤体积达 ~ 200 mm³切除部分肿瘤，残余部分肿瘤；其次，将载IR780胶束水凝胶混合溶液在紫外光（365 nm）照射下滴于肿瘤切除处形成凝胶；在肿瘤切除后第0，2，4，6天用808 nm近红外激光（1.18W/cm²）照射肿瘤切除处进行光热治疗；在肿瘤切除后，每三天测量肿瘤体积，并记录小鼠体重。与空白凝胶组比较，光热疗法能显著抑制术后肿瘤的生长速率，且对荷瘤小鼠体重无明显影响（图22）。

Claims (14)

1.一种原位胶束水凝胶组合物，其特征在于，包括端基功能化胶束，侧链功能化修饰的链状亲水性高分子材料，难溶性小分子药物和/或生物大分子药物，所述端基功能化胶束和所述侧链功能化修饰的线性亲水性高分子材料能够通过化学交联形成具三维网状结构的水凝胶，所述化学交联法选自碱性条件催化的迈克尔加成反应、含炔基的点击化学反应、希弗碱反应或光催化巯基烯烃点击化学反应的一种或几种；所述端基功能化胶束和侧链功能化修饰的线性亲水性高分子材料，分别修饰以下官能团对：金刚烷-环糊精，巯基-巯基，双键-双键，巯基-烯/炔，巯基-马来酰亚胺，巯基-亲双烯体，醇铵-醛/铜，醛-醇/胺/肼的基团中的一种或几种，所述侧链功能化修饰的线性亲水性高分子材料选自透明质酸；所述功能化胶束为端基功能化的三嵌段两亲性共聚物形成的胶束，所述三嵌段两亲性共聚物化学结构式为HO(CH₂CH₂)_a-(CHCH₃CH₂O)_b-(CH₂CH₂)_aOH的普朗尼克（PEO-PPO-PEO）。

2.根据权利要求1所述原位胶束水凝胶组合物，其特征在于，所述三嵌段两亲性共聚物选自普朗尼克F68，P84，F127。

3.根据权利要求1或2所述原位胶束水凝胶组合物，其特征在于所述功能化胶束粒径范围在10 nm - 300 nm。

4.根据权利要求1或2所述原位胶束水凝胶组合物，其特征在于所述功能化胶束粒径范围为20 nm - 100 nm。

5.根据权利要求1或2所述原位胶束水凝胶组合物，其特征在于，所述亲水性高分子材料的分子量为5 kDa ~ 1000 kDa。

6.根据权利要求1或2所述原位胶束水凝胶组合物，其特征在于，所述亲水性高分子材料的分子量为6 kDa ~ 300 kDa。

7.根据权利要求1或2所述原位胶束水凝胶组合物，其特征在于所述难溶性小分子药物选自有抗炎作用或抗纤维化作用或抗癌作用的难溶性小分子药物的一种或几种。

8.根据权利要求1或2所述原位胶束水凝胶组合物，其特征在于，所述难溶性小分子药物选自雷公藤红素，地塞米松，泼尼松龙，紫杉醇，吡非尼酮，二十二碳六烯酸，二十碳五烯酸，白术内酯I，咪喹莫特（R-837），瑞奎莫德（R-848），可用于肿瘤光热治疗的近红外荧光染料IR780（2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-3,3-二甲基-1-丙基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-3,3-二甲基-1-丙基吲哚鎓碘化物）、IR775（2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)-亚乙基]-1-环己烯-1-基]-乙烯基]-1,3,3-三甲基-3H-吲哚氯化物）、IR825（3-[(4-羧基苯基)甲基]-2-[2-[3-[2-[3-[(4-羧基苯基)甲基]-1,3-二氢-1,1-二甲基-2H-苯并[e]吲哚-2-亚基]亚乙基]-2-氯-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,1-二甲基-1H-苯并吲哚鎓溴化物）中的一种或几种。

9.根据权利要求1或2所述原位胶束水凝胶组合物，其特征在于，所述生物大分子药物选自有抗炎作用或抗纤维化作用或抗癌作用的生物大分子药物一种或几种。

10.根据权利要求1或2所述原位胶束水凝胶组合物，其特征在于，所述生物大分子药物选自白细胞介素10（IL-10），转化生长因子β抗体（anti-TGF-β）, 骨形态形成蛋白-7（BMF-7），PD-1抗体，PD-L1抗体中的一种或几种。

11.一种权利要求1-10任一项所述的原位胶束水凝胶组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1）制备侧链功能化修饰的线性亲水性高分子材料、端基功能化的胶束载体材料、难溶性小分子药物溶液；2）所述端基功能化的胶束载体材料溶于有机溶剂，与上述难溶性小分子药物溶液混合，旋转蒸发除去有机溶剂，再分散于合适的溶剂中制备获得胶束；3）将上述侧链功能化修饰的线性亲水性高分子材料溶于水中，再与上述胶束混合形成胶束水凝胶。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3）可以通过碱催化法、主客分子交联法或光催化法形成胶束水凝胶。

13.根据权利要求1~10中任一项所述的原位胶束水凝胶组合物在制备抗纤维化、抗肿瘤或肿瘤术后的辅助治疗药物中的应用。

14.根据权利要求1~10中任一项所述的原位胶束水凝胶组合物在制备抗肾纤维化治疗药物中的应用。

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