JP2024506399A - 一酸化窒素感応性ヒドロゲル - Google Patents

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Abstract

本発明は一酸化窒素感応性ヒドロゲルに関するものであり、前記ヒドロゲルは、クリックケミストリー反応によって、標的部位でインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行って形成され、一酸化窒素に感応する架橋剤を用いて製造されるため、標的部位に過剰発現された一酸化窒素を効果的に捕集して消去することができ、さらにヒドロゲルに担持された薬物は、治療が必要な標的部位に局所的かつ選択的に放出できるため、一酸化窒素の過剰発現によって引き起こされる炎症性疾患の予防または治療に有用に使用することができる。

Description

本発明は一酸化窒素感応性ヒドロゲルに関するものであり、前記ヒドロゲルは、クリックケミストリー反応によって、標的部位でインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行って形成され、一酸化窒素に感応する架橋剤を用いて製造されるため、標的部位に過剰発現された一酸化窒素を効果的に捕集して消去することができ、さらにヒドロゲルに担持された薬物は、治療が必要な標的部位に局所的かつ選択的に放出できるため、一酸化窒素の過剰発現によって引き起こされる炎症性疾患の予防または治療に有用に使用することができる。
一酸化窒素（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ）は、数秒以内の短い半減期を有する、反応性の高いラジカル分子であり、人体の様々な細胞で発生し、人体の内部で濃度によって神経伝達、血管拡張、抗がん効果など様々な役割を果たすものとして知られている。
２０１０年代後半から、一酸化窒素の過分泌による炎症性疾患を緩和または治療するために、疾患部位に過剰産生されている一酸化窒素を局所的に、そして選択的に捕集しようとする試みが盛んに行われている。
このような試みによって、注射を容易にするためのナノメートルサイズを基盤とする技術が開発されてきたが、注射部位以外の他の臓器への急速な拡散及び除去による問題があった。例えば、一酸化窒素は正常範囲では生体内で重要な役割を果たすため、一酸化窒素を非特異的に除去すると、全身毒性などの数多くの副作用を引き起こす可能性があり、慢性炎症性疾患の一つである関節リウマチの場合、軟骨注射を年に最大で３～４回接種するので、疾患部位以外の他の臓器への急速な拡散及び除去を引き起こす可能性のある技術は望ましくない。
一方、関節リウマチは、多発性関節炎を特徴とする原因不明の慢性炎症性疾患である。初期には関節を取り巻く滑膜に炎症が生じるが、徐々に周りの軟骨と骨に炎症が広がって関節の破壊と変形をもたらすことになる。関節だけでなく、関節外症状として貧血、乾燥症候群、皮下結節、肺線維症、血管炎、皮膚潰瘍など全身を侵しかねない疾患である。
関節リウマチの正確な原因はいまだ解明されていないが、自己免疫現象が主な機序として知られている。自己免疫とは、外部から人体を守る免疫系の異常によって、むしろ自分の体を攻撃する現象のことである。一般的には、遺伝的素因、細菌やウイルスの感染などが関節リウマチの原因とされている。
このような関節リウマチは、関節の腫脹、炎症、こわばり、疼痛を伴い、全身の多発性関節炎の病像を呈する難治性自己免疫疾患であって、その疾患を持つ患者に大きな痛みを与える。
したがって、標的部位で局所的に長期間一酸化窒素を捕集することができ、さらに一酸化窒素に感応して疾患の悪化程度に応じて治療剤を共に送達することで、一酸化窒素の過剰発現に関わる疾患を緩和または治療できる新しい技術が求められる。
体内で過剰産生された一酸化窒素を局所的に捕集して消去することができ、さらにヒドロゲルに担持された薬物を一酸化窒素の濃度に応じて疾患部位に局所的かつ選択的に放出することにより、炎症性疾患の予防または治療に使用できる一酸化窒素感応性ヒドロゲルを提供する。
以下でこれを具体的に説明する。本発明で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせは、本発明の範疇に属する。また、下記の具体的な説明によって本発明の範疇が限定されるとは限らない。
本発明は、下記の化学式１～３で表される化合物から製造されるインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲルを提供する。
［化学式１］
［化学式２］
［化学式３］
ここで、
前記Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立にＣ１－Ｃ１０のアルキレンであり、
前記ｎ及びｍは、それぞれ１～１０００の整数である。
本発明における「Ｃｘ－Ｃｙ」（ここでｘ、ｙは１以上の整数）は炭素数を意味する。例えば、Ｃ１－Ｃ１０のアルキレンは、１以上１０以下の炭素数を有するアルキレンを意味し、Ｃ１－Ｃ１０のアルキルは、１以上１０以下の炭素数を有するアルキルを意味する。
本発明における「アルキル」は、直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素基を意味するものであり、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デカニルなどを含む。
本発明における「アルキレン」は、前記で定義されたアルキルに由来する二価の官能基を意味する。
本発明における「インサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）」は、「本来の場所で」または「原位置で」と同じ意味で使用することができ、「投与部位で」または「標的部位で」を意味する。
本発明における「インサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」は、ヒドロゲルを形成できる前駆体物質が患者の体内に注入された後、所望の体内の組織、器官または体腔内の標的部位で前駆体物質の結合によってゲル化が起こることを意味する。
本発明における「患者」は、特定の状態または疾患の治療を必要とする任意の個体または対象体を意味し、哺乳類であり得、好ましくはヒトであり得る。
本発明のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲルは、移植のための外科的手術を必要とせず、最小侵襲技術によって体内で単なる前駆体物質の混合によってヒドロゲルを形成させるため、治療を受ける患者に心地良さを与えることができ、体内の標的部位に局所的かつ選択的にヒドロゲルを形成させることができるので、特に治療が必要な部位に対する治療効果に優れる。
本発明で化学式１で表される化合物は、ヒドロゲルの形成において架橋剤の役割を果たすものであり得る。
［化学式１］
（前記Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立にＣ１－Ｃ１０のアルキレン）
本発明における「架橋剤」は、化合物を互いに結合させて網状（ｎｅｔｗｏｒｋ）構造をとるための物質のことを意味し、本発明の実施例によれば、化学式１で表される化合物は、前記Ｒ1及びＲ2がＣ２アルキレンである、下記のＤＡ－ＮＯＣＣＬで表される化合物であり得るが、これに限定されない。
［ＤＡ－ＮＯＣＣＬ］
本発明で化学式１で表される化合物は、過剰産生された一酸化窒素を捕集して消去する役割を果たすことができるため、前記化学式１で表される化合物を使用して製造される本発明のヒドロゲルは、体内で過剰産生された一酸化窒素を捕集して消去するものであり得る。
また、本発明の化学式１で表される化合物は、一酸化窒素に感応して分解されるものであり得、前記化学式１で表される化合物から製造される本発明のヒドロゲルは、一酸化窒素に感応して分解されるものであリ得る。
本発明における「感応（性）」は、ある環境条件に敏感に反応することを意味し、本明細書において「感応（性）」と「反応（性）」は互いに同じ意味で使用することができる。
後述する実験例では、本発明のヒドロゲルが一酸化窒素を吸収して膨張できることを裏付けて、体内に過剰産生された一酸化窒素を捕集して消去することができ、一酸化窒素の過剰産生によって発生する疾患を効果的に治療できることを確認した。また、本発明のヒドロゲルが一酸化窒素に感応して分解され得ることを裏付けて、ヒドロゲルの網状構造内に結合しているミセル構造体を、疾患が発生した部位に選択的に放出することができ、前記ミセル構造体に担持された薬物を、疾患が発生した部位に局所的で、選択的かつ集中的に送達できることを確認した。また、本発明のヒドロゲルは一酸化窒素（ＮＯ）濃度依存的に分解される程度が異なってくる可能性があるので、疾患の重症度に応じて薬物放出の調節が可能であることを確認した。
本発明で化学式２で表される化合物は、ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ－Ｎ3ブロック共重合体とも呼ばれ、化学式１で表される化合物のアルキン基とはアジド基を介したクリックケミストリー反応によって結合することができる。
［化学式２］
（前記ｎ及びｍは、それぞれ１～１０００の整数）
前記化学式２で表される化合物は、自己組織化（ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ）によってミセル構造体を形成するものであり得る。
本発明における「ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）」は、水溶液上で内部の疎水性領域と外部の親水性領域とからなるシステムのことを意味し、本発明では化学式２で表される化合物であるＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ－Ｎ3ブロック共重合体を使用してミセル構造体を形成させた。
本発明においてミセル構造体は、疎水性薬物を担持し、疾患部位に特異的に放出されて過剰産生された一酸化窒素による疾患を治療する上での複合的な治療、すなわち、一酸化窒素の消去による治療及び薬物による治療を可能にする。
本発明の実施例によれば、前記ミセル構造体は、１０～１０００ｎｍの均一な直径を有するものであり得、好ましくは７０～９００ｎｍであり得、より好ましくは７０～５００ｎｍであり得る。前記範囲の未満であると、治療しようとする疾患を治療するのに十分な薬物を担持することができない可能性があり、前記範囲を超えると、注射の容易さという点で適さない可能性がある。
本発明において前記ミセル構造体は、ヒドロゲルの網状構造に固定されているものであり得る。前記ミセル構造体は、ヒドロゲルが一酸化窒素に感応して分解される際、ヒドロゲルから放出され得、一酸化窒素が過剰産生された部位に選択的に担持された薬物を送達することができる。
本発明で化学式３で表される化合物であるヒアルロン酸基盤の高分子鎖はＨＡ－Ｎ3とも呼ばれ、本発明のヒドロゲル骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を成す役割を果たす。
［化学式３］
（前記ｎは、それぞれ１～１０００の整数）
本発明における前記「ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）」は、グルクロン酸及びアセチルグルコサミンからなる線状の多糖類（ポリサッカライド）であって、細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）、関節の潤滑液、軟骨を構成する支持体に存在するグリコサミノグリカンの一つである。架橋されたヒアルロン酸は粘弾性的な性質によって関節の潤滑液として使用することができ、生体内で適用する際、免疫的な側面でも問題がないので、組織工学及び薬物送達システムに利用できる、優れた生体適合性を有する材料である。
本発明で化学式３で表される化合物は、アジド基を介して化学式１で表される化合物のアルキン基とクリックケミストリー反応によって結合することができる。
本発明においてヒドロゲルは、前記化学式１で表される化合物と前記化学式２及び３で表される化合物との間のクリックケミストリー反応によって製造されるものであり得る。
本発明における「クリックケミストリー（ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」は、生物の複雑な環境の中で起こるカスタマイズされた反応であり、特定の条件下で迅速かつ効果的かつ同時に予測可能に結合させる有機合成に対するモジュール的アプローチのことを意味する。例えば、アジド（ａｚｉｄｅ）－アルキン（ａｌｋｙｎｅ）環化付加反応（ｃｙｃｌｏ ａｄｄｉｔｉｏｎ）は、熱力学的推進力が非常に高くて、効率的かつ高い収率でアジド化合物とアルキン化合物との結合を形成できるので、オリゴマー、ポリマーなどといった高分子との反応でも高い収率で分子間結合を形成させることができる。
本発明の実施例によれば、化学式１で表される化合物のアルキン（ａｌｋｙｎｅ）基と化学式２で表される化合物のアジド（ａｚｉｄｅ、－Ｎ3）基；及び化学式１で表される化合物のアルキン（ａｌｋｙｎｅ）基と化学式３で表される化合物のアジド（ａｚｉｄｅ、－Ｎ3）基は、クリックケミストリー反応によって、それぞれ１，２，３－トリアゾール（１，２，３－ｔｒｉａｚｏｌｅ）を形成し、これによって本発明のミセル構造体を含む一酸化窒素反応性インサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲルを形成することができる。
本発明においてヒドロゲルは、生体活性物質を含むことにより、過剰発現された一酸化窒素によって引き起こされた炎症または疾患を治療する効果をさらに高めることができる。このような生体活性物質は、病気の治療、治癒、予防または診断などに使用される物質、例えば、細胞、成長因子及びホルモンなどといったタンパク質またはペプチド、核酸、細胞外基質物質及び医薬的に治療機能を持つ薬物などであり得るが、これに限定されず、特定の病気に効果があると知られている生体活性物質であるならば、制限なくヒドロゲルに適用して治療効果を高めるために使用することができる。ヒドロゲルが生体活性物質を含むように製造するために、生体活性物質をいずれか一つの溶液に含まれるように溶液を製造し、他の溶液と標的部位で混合してヒドロゲルを形成させることができる。また、生体活性物質が含まれる二つの溶液それぞれを、注射器を使用して標的部位で混合してヒドロゲルを形成させることができる。
本発明においてヒドロゲルは、疎水性薬物をさらに含むことができ、前記疎水性薬物は、前記化学式２で表される化合物の自己組織化によって形成されたミセル構造体に担持されたものであり得る。前記ミセル構造体は、水中で親水性及び疎水性部分を有するブロック共重合体の自己組織化によって形成されて、内部は強い疎水性を示すため、前記ミセル構造体の内部には疎水性薬物が担持されやすく、これは薬物及びミセル構造体の内部がいずれも疎水性を示すことに起因する物理的な現象であって、化学的結合による薬物送達体に比べて、薬物の含有量を増やすことができる。
本発明における「疎水性」は、水と混和しない非極性または低極性物質を含む意味であるが、これに限定されず、本発明のミセル構造体の疎水性内部に安定して存在できる物質であるならば、いずれも疎水性物質に含まれる。
本発明において疎水性薬物は、鎮痛剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、またはこれらの組み合わせから選択することができ、好ましくは抗炎症剤であり得るが、これに限定されない。
本発明における「抗炎症剤」は、消炎剤とも呼ばれ、炎症を取り除く性質を有するか、または炎症過程に関与してそれを抑制する薬物のことを意味する。
前記抗炎症剤は、例えば、２１－アセトキシプレグネノロン、アルクロメタゾン、アルクロメタゾンジプロピオネート、アルゲストン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ベタメタゾンジプロピオネート、ベタメタゾンリン酸ナトリウム、ベタメタゾンバレレート、ブデソニド、クロロプレドニゾン、シクレソニド、クロベタゾール、クロベタゾール１７－プロピオネート、クロベタゾン－１７－ブチレート、クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチゾンアセテート、コルチバゾール、デフラザコート、デソニド、デスオキシメタゾン、デキサメタゾン、デキサメタゾンリン酸ナトリウム、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、エノキソロン、フルアザコート、フルクロロニド、フルメタゾン、フルオシノニド、フルオシノロン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオコルトロンカプロン酸、フルオコルトロンピバレート、フルオロメトロン、フルニソリド、フルペロロンアセテート、フルプレドニデンアセテート、フルプレドニゾロン、フルランドレノリド、フルチカゾンプロピオネート、ホルモコルタール、ハルシノニド、ハロベタゾールプロピオネート、ハロメタゾン、ハロプレドンアセテート、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンアセテート、ヒドロコルチゾン－１７－アセポネート、ヒドロコルチゾン１７－ブテプレート、ヒドロコルチゾン－１７－ブチレート、ヒドロコルチゾン－１７－バレレート、ロテプレドノール、マジプレドン、メドリゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、モメタゾン、モメタゾンフロエート、パラメタゾン、パラメタゾンアセテート、プレドニカルベート、プレドニゾロン、プレドニゾロン２５－ジエチルアミノ－アセテート、プレドニゾロンリン酸ナトリウム、プレドニゾン、プレドニバル、プレドニリデン、リメキソロン、チキソコルトール、チキソコルトールピバレート、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンアルコール、トリアムシノロンベネトニド、トリアムシノロンヘキサセトニドからなる群から選択される一つ以上であり得、本発明の実施例によれば、前記抗炎症剤はデキサメタゾンであり得るが、これに限定されない。
また、本発明の実施例によれば、疎水性薬物は、ミセル構造体の全重量に対して３～７重量％で含まれるものであり得るが、これに限定されない。
本発明のヒドロゲルは、疎水性薬物及び親水性薬物をさらに含むものであり得る。
本発明において、前記疎水性薬物及び親水性薬物は標的部位から同時に放出され得るが、このとき、前記疎水性薬物の放出は、侵食に基づく（ｅｒｏｓｉｏｎ－ｂａｓｅｄ）放出によるものであり、前記親水性薬物の放出は、フィック（Ｆｉｃｋｉａｎ）の拡散によるものであり得る。
後述する実験例においては、本発明のヒドロゲルがヒドロゲルの疎水性ドメインであるミセルの内部には疎水性薬物を担持し、ヒドロゲルの親水性ドメインには親水性薬物を担持することができ、前記二つの薬物を、治療が必要な標的部位から薬物を同時に放出できることを確認した。また、本発明のヒドロゲルは、一酸化窒素の濃度に応じて薬物の放出の度合いが異なり得るが、これは病気の悪化の度合いに応じて薬物の放出を調節することができるということを意味し、これは治療しようとする疾患の状態に合わせたカスタマイズ治療が可能であることを示す。
本発明において、ヒドロゲルを製造するための化学式１～３の化合物は、標的部位に同時－注射（ｃｏ－ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）されるものであり得る。
本発明における「同時－注射（ｃｏ－ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）」は、化学式１～３の化合物が注射に適した製剤、例えば、液体状態で患者の体内の標的部位に共に注射されることを意味する。本発明の実施例によれば、化学式１～３の化合物を含む液体形態の組成物は、注射針の先端（ｔｉｐ）から出て患者の体内の標的部位に入る前に均一に混合され、次いで標的部位に混合物として注射され、注射針から出て体内でゲル化する。本発明の化学式１～３の化合物は、標的部位に同時－注射された後、クリックケミストリー反応によって自発的に結合してヒドロゲルを形成することができる。
本発明において、前記同時－注射は、二重シリンジシステム（ｄｕａｌ ｓｙｒｉｎｇｅ ｓｙｓｔｅｍ）または他の任意の適切なシリンジシステムを使用して達成することができ、好ましくは二重シリンジシステムによるものであり得る。本発明の実施例によれば、化学式１～化学式３で表される化合物は、同時－注射の前、例えば注射による同時圧出、混合、及び患者の体内で針を介した注入の一連の過程が発生する前に、物理的に分離されている可能性がある。本発明の実施例によれば、化学式１及び化学式３で表される化合物を含む組成物は、化学式２で表される化合物を含む組成物と物理的に分離されている可能性がある。本発明の実施例によれば、化学式１及び化学式２で表される化合物を含む組成物は、化学式３で表される化合物と物理的に分離されている可能性がある。本発明の実施例によれば、化学式１で表される化合物を含む組成物は、化学式２及び化学式３で表される化合物と物理的に分離されている可能性がある。
本発明のヒドロゲルは、前記化学式１～３の化合物を標的部位に注射してから０．５～１０分以内、好ましくは０．５～１分以内に形成されるものであり得る。ヒドロゲルの形成時間（ゲル化時間）が前記範囲の未満であると、化学式１～３で表される化合物が混合された後、早期架橋結合によって標的部位への注射がスムーズに行われなくなる可能性があり、前記範囲を超えると、注射された物質が周囲の組織に拡散してしまい、標的部位に局所的なヒドロゲルの形成に適さない可能性がある。従来の温度またはＵＶ（赤外線）照射などによって開発された既存のｉｎ－ｓｉｔｕ（インサイチュ）注入型ヒドロゲルは、相転移速度が遅いといった問題を抱えている。本発明のヒドロゲルはクリックケミストリー反応によって短時間でゲル化することができるので、従来技術が抱えていた問題を解決した。
本発明のヒドロゲルは、炎症性疾患の予防、緩和または治療用に使用することができる。
本発明における「炎症性疾患」は、炎症を主病変とする疾患のことを意味し、本発明において前記炎症性疾患は、生体内での一酸化窒素が過剰産生される様子を示す炎症性疾患であり得る。
本発明のヒドロゲルは、過剰産生された一酸化窒素を捕集して消去することができる。ストレスなどによって免疫系が崩れて生体内での一酸化窒素が過剰産生されると、自己免疫疾患または炎症性疾患を引き起こす可能性がある。したがって、過剰産生された一酸化窒素を捕集して消去できる本発明のヒドロゲルは、一酸化窒素の過剰産生によって引き起こされた疾患を効果的に治療することができる。
また、前記炎症性疾患は、関節の炎症による疾患であり得、例えば、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、ウイルスまたはバクテリア感染による慢性炎症疾患、関節リウマチ、反応性関節炎、変形性関節症、骨粗鬆症などであり得るが、これに限定されない。本発明の実施例によれば、前記炎症性疾患は関節リウマチであり得るが、これに限定されない。
前記関節リウマチは自己免疫疾患の一つであり、高濃度の一酸化窒素によって発症する疾患である。したがって、本発明のヒドロゲルは、高濃度の一酸化窒素の環境下で一酸化窒素を捕集してサイトカインによって誘導された破骨細胞の骨吸収を抑制し、関節での細胞死を防いで関節リウマチを緩和または治療することができる。
本発明における「緩和または治療」は、疾患症状の重症度の減少、疾患症状のない期間の頻度及び持続期間の増加、または疾患の苦痛による損傷または障害の防止を意味する。
本発明のヒドロゲルは、炎症性サイトカインであるＴＮＦ－α及びＩＬ－６のレベルを低下させるものであり得る。
本発明における「炎症性サイトカイン（ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）」は、主に活性化されたマクロファージによって産生されて全身の炎症を促進するサイトカインのことを意味する。炎症性サイトカインには、例えば、ＴＮＦ－α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α）、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８などがあり、これらは炎症反応時に共に現れ、炎症反応の指標になり得る。
後述する実験例において、本発明のヒドロゲルを処理する場合、炎症性サイトカインであるＴＮＦ－α及びＩＬ－６のレベルを低下させることができることを確認することで、本発明のヒドロゲルが炎症性疾患の治療に有用に使用できることを確認した。
本発明のヒドロゲルは、ビスコ補充剤（ｖｉｓｃｏ－ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）用に使用することができる。
本発明における「ビスコ補充剤（ｖｉｓｃｏ－ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）」は、ゲル状態のヒアルロン酸を関節部位に注射して粘液性潤滑液を補充する物質のことを意味する。
後述する実験例において、本発明のヒドロゲルは、破裂後にストレスによって誘発される流れに応じてほぼ完全な回復を示すことから、ビスコ補充剤として有用に使用できることを確認した。これは特定の理論にとらわれず、ＨＡ（ヒアルロン酸）鎖間の分子間水素結合とミセル構造のエントロピー駆動による再結合（ｅｎｔｒｏｐｙ－ｄｒｉｖｅｎ ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）に起因するものとされる。
本発明の他の一態様によれば、下記の化学式１～３で表される化合物を含むインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル前駆体組成物を提供する。
［化学式１］
［化学式２］
［化学式３］
ここで、
前記Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立にＣ１－Ｃ１０のアルキレンであり、
前記ｎ及びｍは、それぞれ１～１０００の整数である。
本発明における「前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）」は、他の化合物を生成する化学反応に関与する化合物のことを意味する。
本発明の前駆体組成物は、疎水性薬物をさらに含むものであり得、前記疎水性薬物は、前記化学式２で表される化合物の自己組織化によって形成されたミセル構造体に担持されたものであり得る。
本発明の前駆体組成物は、疎水性薬物及び親水性薬物をさらに含むものであり得る。
本発明の他の一態様によれば、下記のステップを含むインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲルの製造方法を提供する。
ａ）下記の化学式１で表される化合物、及び下記の化学式３で表される化合物を含む、第１前駆体組成物を製造するステップ；
ｂ）下記の化学式２で表される化合物から形成されたミセル構造体を含む、第２前駆体組成物を製造するステップ；及び
ｃ）前記第１前駆体組成物及び第２前駆体組成物を同時－注射するステップ。
［化学式１］
［化学式２］
［化学式３］
ここで、
前記Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立にＣ１－Ｃ１０のアルキレンであり、
前記ｎ及びｍは、それぞれ１～１０００の整数である。
本発明の実施例によれば、前記化学式１で表される化合物は、第１前駆体組成物の全質量に対して０．０２～０．０６ｗｔ％；前記化学式２で表される化合物は、第２前駆体組成物の全質量に対して１．００～３．００ｗｔ％；及び前記化学式３で表される化合物は、第１前駆体組成物の全質量に対して１．００～１．５０ｗｔ％；で含まれ得るが、これに限定されない。
本発明の製造方法において、前記第２前駆体組成物は触媒をさらに含むことができ、本発明の実施例によれば、前記触媒はＣｕ（Ｉ）であり得るが、これに限定されない。
本発明の製造方法において、前記第２前駆体組成物は疎水性薬物をさらに含むものであり得、前記疎水性薬物は、前記化学式２で表される化合物の自己組織化によって形成されたミセル構造体に担持されたものであり得る。
本発明の製造方法において、前記第１及び第２前駆体組成物は、疎水性薬物及び親水性薬物をさらに含むものであり得る。本発明の実施例によれば、疎水性薬物は第２前駆体組成物に含まれ得、親水性薬物は第１前駆体組成物に含まれ得、疎水性薬物及び親水性薬物の両方が第１前駆体組成物または第２前駆体組成物に含まれ得るが、これに限定されない。
本発明の製造方法において、前記同時－注射は二重シリンジシステム（ｄｕａｌ ｓｙｒｉｎｇｅ ｓｙｓｔｅｍ）によるものであり得る。
本発明の製造方法において、前記第１及び第２前駆体組成物は、非経口投与に適するように懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態であり得、固体または半固体の形態で製造することができ、懸濁剤、安定化剤、溶解剤及び／または分散剤などといった製剤化剤を含むことができる。
本発明の実施例によれば、第１及び第２前駆体組成物は液体状態であり得、滅菌されたものであり得るが、これに限定されない。そして、細菌や真菌などの微生物の汚染作用に対して保存され得る。また、第１及び第２前駆体組成物は、粉末形態であり得、滅菌されたものであり得る。この場合、使用前に注射用水などを用いて液体形態に製剤化することができる。
本発明は、炎症性疾患を有する個体に本発明のヒドロゲルを投与する工程を含む、炎症性疾患の予防、緩和または治療方法を提供する。
本発明における「投与」は、任意の適切な方法で患者に本発明のヒドロゲルを導入することを意味し、本発明のヒドロゲルの投与経路は、所望の組織に到達することができる限り、いかなる一般的な経路を介して投与され得るが、好ましくは非経口投与であり得る。前記非経口投与は、例えば、筋肉内、皮下、関節内、腹腔内の投与などが挙げられるが、これに限定されない。本発明の実施例によれば、前記投与は関節内投与であり得るが、これに限定されない。
本発明における個体は、任意のヒト、非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、脊椎動物、例えば非ヒト霊長類、羊、犬、及びげっ歯類、例えば、マウス、ラット及びモルモットであり得る。前記個体は、好ましくはヒトであり得、具体的には特定の疾患を有するヒトであり得る。本明細書における「個体」という用語は、「対象体」または「患者」と同じ意味で使用することができる。
本発明のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル、前駆体組成物、製造方法及び治療方法で触れられた事項は、互いに矛盾しない限り同一に適用され、明細書の過度な複雑さを避けるために繰り返しの記載を省略した。
本発明のヒドロゲルは、体内外の過剰産生された一酸化窒素を局所的かつ選択的に捕集して消去することができるため、一酸化窒素の過剰産生による炎症性疾患において優れた予防、緩和または治療効果を有する。
また、本発明のヒドロゲルは、疎水性及び／または親水性の薬物を担持することができて、標的部位への薬物の送達体としての役割を果たすことができ、一酸化窒素の捕集及び薬物送達による複合的な治療効果を有することができる。
また、本発明のヒドロゲルは、一酸化窒素に感応して分解され得るため、一酸化窒素が存在する環境下で架橋点が一酸化窒素に感応して解離することにより、ヒドロゲルに担持された薬物は標的部位に局所的かつ選択的に送達することができる。
また、本発明のヒドロゲルは、外科的手術を必要とせず、最小侵襲で標的部位に局所的にヒドロゲルを形成することができて、患者の利便性に優れる。
また、本発明のヒドロゲルは、標的部位での迅速な除去及び他の臓器への拡散を防止することができて、全身毒性など従来技術が抱えていた問題点が見られない。
また、本発明のヒドロゲルは、自己治癒（ｓｅｌｆ－ｈｅａｌｉｎｇ）能力によって機械的特性の回復に優れて、ビスコ補充剤（ｖｉｓｃｏ－ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）として有用に活用することができる。
本発明のヒドロゲルの形成過程及び前記形成されたヒドロゲルが一酸化窒素に反応して架橋点が解離する過程を図式化したものである。 化学式１で表される化合物の合成過程を示すものである。 化学式１で表される化合物の合成の各工程で得られた化合物の1Ｈ ＮＭＲデータである。 化学式１で表される化合物が一酸化窒素と反応して分解できるかどうかを示すものである。図４ａは、化学式１で表される化合物が一酸化窒素と反応して分解されるメカニズムを示すものである。図４ｂは、化学式１で表される化合物が一酸化窒素と反応して分解されるかどうかを確認した1Ｈ ＮＭＲデータを示すものである。 化学式１で表される化合物が一酸化窒素と反応して分解されるかどうかを確認したＦＴ－ＩＲ（ａ）及びＵＶ－Ｖｉｓ（紫外可視）吸光データ（ｂ）を示すものである。 化学式２で表される化合物の合成過程を示すものである。 化学式２で表される化合物合成の各工程で得られた化合物の1Ｈ ＮＭＲスペクトルデータを示すものである。 化学式２で表される化合物のＦＴ－ＩＲ、ＧＰＣ、ＴＥＭ、ＤＬＳデータである。図８ａは、ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ－Ｎ3のＦＴ－ＩＲスペクトルデータを示すものである。図８ｂは、ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ－Ｎ3のゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ：Ｇｅｌ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）データを示すものである。図８ｃは、ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ－Ｎ3の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ：ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）画像を示すものである。図８ｄは、ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ－Ｎ3の動的光散乱光度計（ＤＬＳ）によって決定された平均流体力学的サイズを示すものである。 化学式３で表される化合物の合成過程を示すものである。 化学式３で表される化合物の合成過程で得られた化合物の1Ｈ ＮＭＲデータを示すものである。 本発明のＭ－ＮＯゲルの特性を分析したものである。図１１ａは、Ｍ－ＮＯゲルを極低温走査型電子顕微鏡（Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）によって画像化したものである。図１１ｂは、動的過渡試験（ｄｙｎａｍｉｃ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｅｓｔ）によるＭ－ＮＯゲルの自己治癒の振動レオロジー特性を示すものである。 本発明のＭ－ＮＯゲルの特性を分析したものである。図１２ａは、Ｍ－ＮＯゲルの自己治癒の概略図を示すものである。図１２ｂは、Ｍ－ＮＯゲルの周波数依存的振動レオロジー特性を示すものである。図１２ｃは、Ｍ－ＮＯゲル及び対照群ゲル（ＮＯ非反応性）のＮＯ濃度依存的振動レオロジー特性を示すものである。 本発明のＭ－ＮＯゲルの特性を分析したものである。図１３ａは、Ｍ－ＮＯゲルのＮＯ消去能力を確認したものである。データは平均±ＳＤ（ｎ＝４）で表した。図１３ｂは、様々な濃度における時間の経過に伴うＭ－ＮＯゲルの相対的な膨張比を示すものである。データは平均±ＳＤ（ｎ＝４）で表した。図１３ｃは、様々な濃度における時間の経過に伴う対照群ゲル（ＮＯ非反応性）の相対的な膨張比を示すものである。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）で表した。図１３ｄは、様々な濃度のＮＯ溶液中で２時間培養した後のＭ－ＮＯゲル及び対照群ゲル（ＮＯ非反応性）の画像を示すものである。スケールバーは１ｃｍである。 本発明のＭ－ＮＯゲルの特性を分析したものである。図１４ａは、Ｍ－ＮＯゲルにおける同時的二重薬物放出に関する概略図を示すものである。図１４ｂは、Ｍ－ＮＯゲルのＢＳＡ－ＦＩＴＣ（親水性薬物モデル（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｃａｒｇｏ ｍｏｄｅｌ））放出プロファイルを示すものである。図１４ｃは、対照群ゲルのＢＳＡ－ＦＩＴＣの放出プロファイルを示すものである。図１４ｄは、Ｍ－ＮＯゲルのミセル構造体に担持されたナイルレッド（Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ）（疎水性薬物モデル（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｃａｒｇｏ ｍｏｄｅｌ））放出プロファイルを示すものである。図１４ｅは、対照群ゲルのナイルレッド（Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ）放出プロファイルを示すものである。 本発明のＭ－ＮＯゲルの特性を分析したものである。図１５ａは、ヒドロゲル形成前のＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ－Ｎ3ミセル構造体の平均流体力学的サイズ及びＭ－ＮＯゲルをＮＯ溶液（２５０μＭ）と共に２４時間培養した後、上清液で確認されたＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ－Ｎ3ミセル構造体の平均流体力学的サイズを示すものである。図１５ｂは、Ｍ－ＮＯゲルの侵食後の上清液のＴＥＭ画像を示すものである。画像中の白いボックスは、ゲル形成前のミセル構造体の形態を示す。 ＬＰＳ処理したＲＡＷ２６４．７細胞におけるＬＰＳを処理した後のＭ－ＮＯゲルの反応性及びＮＯ消去能を示すものである。図１６ａは、ＲＡＷ２６４．７及びＮＩＨ／３Ｔ３細胞株における５μｇ／ｍｌのＬＰＳを２４時間処理した前後のＮＯ濃度を示すものである。図１６ｂは、様々な濃度のＭ－ＮＯゲル及び対照群ゲルで処理したＲＡＷ２６４．７細胞株の細胞生存率を示すものである。データは平均±ＳＤ（ｎ＝５）で表した。図１６ｃは、Ｍ－ＮＯゲルのＮＯ消去能を示したもので、様々な濃度のＭ－ＮＯゲルをＲＡＷ２６４．７細胞株に処理し、２４時間培養した後の細胞培地上清液のＮＯのレベルをグリース・アッセイ（Ｇｒｉｅｓｓ ａｓｓａｙ）によって確認したものである。図１６ｄは、Ｍ－ＮＯゲル及び対照群ゲルで処理した後、ＬＰＳで活性化されたＲＡＷ２６４．７細胞株の共焦点顕微鏡画像を示すものである。細胞内のＮＯ及び核は、それぞれＤＡＦ－２ＤＡ（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）に染色され、スケールバーは１００μｍである。 ＬＰＳ処理したＲＡＷ２６４．７細胞におけるＬＰＳを処理した後のＭ－ＮＯゲルの反応性及びＮＯ消去能を示すものである。図１７ａは、Ｍ－ＮＯゲル及び対照群ゲルで処理した後のＴＮＦ－αレベルを定量化したものを示すものである。図１７ｂは、Ｍ－ＮＯゲル及び対照群ゲルで処理した後のＩＬ－６レベルを定量化したものを示すものである。図１７ｃは、培養されたＲＡＷ２６４．７またはＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（ＬＰＳで刺激されるか、または刺激されていない）にＭ－ＮＯゲル及び対照群ゲルを処理し、一晩培養した後のＭ－ＮＯゲル及び対照群ゲルの画像を示すものである。図１７ｄは、培養されたＲＡＷ２６４．７またはＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（ＬＰＳで刺激されるか、または刺激されていない）にＭ－ＮＯゲル及び対照群ゲルを処理し、一晩培養した後の相対的な膨張比を示すものである。図１７ｅは、炎症性サイトカインのレベルを低下させるためのＭ－ＮＯゲルのｉｎ ｖｉｔｒｏ（イン・ビトロ）でのＮＯ－反応性及び消去能を示す概略図である。 関節リウマチの動物モデルであるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）マウスにおいて、本発明のＭ－ＮＯゲルの関節リウマチの治療効果を確認したものを示すものである。図１８ａは、実験全体のタイムラインを示すものである。図１８ｂは、サンプル処理後のＲＡマウスモデルにおける相対的な足の体積変化を示すものである。相対的な足の体積は、ＲＡモデルマウスを生理食塩水で処理した群（Ｂ）を他の実験群と比較し、一元配置分散分析（ＯＮＥ－ＷＡＹ ＡＮＯＶＡ）を使用して統計的に分析した（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。 関節リウマチの動物モデルであるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）マウスにおいて、本発明のＭ－ＮＯゲルの関節リウマチの治療効果を確認したものを示すものである。４週目、６週目及び８週目における代表的なマウスの後足画像を示すものである。 関節リウマチの動物モデルであるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）マウスにおいて、本発明のＭ－ＮＯゲルの関節リウマチの治療効果を確認したものを示すものである。４週目、６週目及び８週目における代表的なマウスの後足画像を示すものである。図２０ａは、サンプル処理後のＲＡマウスの時間依存的平均臨床スコアを示すものである。データは平均±ＳＤ（ｎ＝８）で表した。図２０ｂは、サンプル処理後のＲＡマウスの８週目での平均臨床スコアを示すものである。ＲＡモデルマウスを生理食塩水で処理した群（Ｂ）を他の実験群と比較し、一元配置分散分析（ＯＮＥ－ＷＡＹ ＡＮＯＶＡ）を使用して統計的に分析した（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図２０ｃは、ロータロッド分析によるサンプル処理後のＲＡマウスの時間の経過に伴う落下遅延時間を示すものである。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝８）で表した。図２０ｄは、サンプル処理後のＲＡマウスの８週目での落下遅延時間を示すものである。ＲＡモデルマウスを生理食塩水で処理した群（Ｂ）を他の実験群と比較し、一元配置分散分析（ＯＮＥ－ＷＡＹ ＡＮＯＶＡ）を使用して統計的に分析した（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。 関節リウマチの動物モデルであるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）マウスにおいて、本発明のＭ－ＮＯゲルの関節リウマチの治療効果を確認したものを示すものである。図２１は、関節リウマチの動物モデルであるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）マウスにおいて、本発明のＭ－ＮＯゲルの関節リウマチの治療効果を確認したものを示すものである。図２１ａは、ＲＡマウスモデルの前足マイクロコンピュータ断層撮影（ｍｉｃｒｏ－ＣＴ）画像を示すものである。赤い矢印は骨の破壊及び損傷を示す。図２１ｂは、サンプル処理後の関節組織の組織学的分析結果を示すものである。スケールバーは１００μｍである。 関節リウマチの動物モデルであるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）マウスにおいて、本発明のＭ－ＮＯゲルの関節リウマチの治療効果を確認したものを示すものである。図２２ａは、Ｈ＆Ｅ染色、マッソン・トリクローム（ｍａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色、及びサフラニン－Ｏ（Ｓａｆｒａｎｉｎ－Ｏ）染色を使用して決定された関節組織の平均組織学的スコアを示すものである。ＲＡモデルマウスを生理食塩水で処理した群（Ｂ）を他の実験群と比較し、一元配置分散分析（ＯＮＥ－ＷＡＹ ＡＮＯＶＡ）を使用して統計的に分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎ．ｓ．大差なし）。図２２ｂは、サンプル処理したＲＡマウス血清標本におけるＴＮＦ－αのレベルを定量化したものを示すものである。図２２ｃは、サンプル処理したＲＡマウス血清標本におけるＩＬ－６を示すものである。データは平均±ＳＤ（ｎ＝４）で表され、＃を他の群と比較し、一元配置分散分析（ＯＮＥ－ＷＡＹ ＡＮＯＶＡ）を使用して統計的に分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎ．ｓ．大差なし）。図２２ｄは、サンプル処理したＲＡマウスの足組織液におけるＴＮＦ－αのレベルを定量化したものを示すものである。図２２ｅは、サンプル処理したＲＡマウスの足組織液におけるＩＬ－６のレベルを定量化したものを示すものである。データは平均±ＳＤ（ｎ＝４）で表され、ＲＡモデルマウスを生理食塩水で処理した群（Ｂ）を他の実験群と比較し、一元配置分散分析（ＯＮＥ－ＷＡＹ ＡＮＯＶＡ）を使用して統計的に分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎ．ｓ．大差なし）。図２２ｆは、８週目でのサンプル処理したＲＡマウスの足組織液におけるＮＯレベルを定量化したものを示すものである。データは平均±ＳＤ（ｎ＝４）で表され、ＲＡモデルマウスを生理食塩水で処理した群（Ｂ）を他の実験群と比較し、一元配置分散分析（ＯＮＥ－ＷＡＹ ＡＮＯＶＡ）を使用して統計的に分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎ．ｓ．大差なし）。
以下、本発明を実施例によってより詳しく説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。また、本明細書で特に定義されていない用語については、本発明が属する技術分野で通常使用される意味を有するものと理解すべきである。
製造例１．化学式１の化合物の合成
一酸化窒素に反応する、クリック可能な架橋剤ＤＡ－ＮＯＣＣＬの合成のために、まず、４－ニトロ－ｏ－フェニレンジアミン（４－ｎｉｔｒｏ－ｏ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）のＣ２位にあるアミン基を、グアニジンＨＣｌ（ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ＨＣｌ）を触媒として選択的にＢｏｃ－保護化した。その後、４－ＮＯ2を４－ＮＨ2に還元し、４－ペンチン酸（４－ｐｅｎｔｙｎｏｉｃ ａｃｉｄ）を各アミン基とアミド結合を介して結合させた。その後、酸条件下でＢｏｃ－脱保護化して合成を完了した。前記架橋剤ＤＡ－ＮＯＣＣＬの合成過程を図２に示し、合成過程で得られた各化合物及び架橋剤ＤＡ－ＮＯＣＣＬの成功した合成を1Ｈ ＮＭＲによって確認し、図３に示した。
具体的な合成の各ステップは下記の通りである。
ステップ１：４－ニトロ－ｏ－フェニレンジアミン（１ｇ、６．５３ｍｍｏｌ）及びグアニジンＨＣｌ（９５ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）をエタノール２０ｍｌに溶解させ、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカーボネート（２．８５ｇ、１３．０６ｍｍｏｌ）を滴下（ｄｒｏｐｗｉｓｅ）した後、前記反応混合物を２５℃で２４時間激しく撹拌した。反応が完了した後、反応溶液中の有機溶媒を減圧蒸発させ、蒸留水に懸濁した。前記水溶液を酢酸エチル（ＥＡ）で３回抽出し、有機部分をＮａ2ＳＯ4で洗浄して赤黄色の粗（ｃｒｕｄｅ）－固体を得、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＥＡ－ヘキサン混合物）によって精製して化合物１（１．２２ｇ、収率：７３．８％）を得た。
［化合物１］
1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ＝８．５６（ｂｒｓ、１Ｈ、Ｄ2Ｏ交換可能（ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｌｅ））、８．３０（ｄ、Ｊ＝１．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．７８（ｄｄ、Ｊ＝９．０、２．７Ｈｚ、１Ｈ）、６．７２（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．４６（ｂｒｓ、２Ｈ、Ｄ2Ｏ交換可能（ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｌｅ））、１．４８（ｓ、９Ｈ）
ステップ２：窒素下の１０ｍｌの無水ＴＨＦ中の化合物１（４００ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ）溶液に、パラジウム１００ｍｇが担持された活性炭（１０％Ｐｄ／Ｃ）を添加した後、圧力が最大４０ｐｓｉに達するまで水素ガスをポンピングし、反応混合物を２５℃で３６時間撹拌した。反応が完了した後、反応混合物を、セライト５４５ベッドを用いてろ過してＰｄ／Ｃを除去し、減圧下で蒸発させて紫色の固体化合物２（３２２ｍｇ、収率：９１．２％）を得た。
［化合物２］
1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ＝８．０８（ｂｒｓ、１Ｈ、Ｄ2Ｏ交換可能（ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｌｅ））、６．６４（ｄ、Ｊ＝１．６Ｈｚ、１Ｈ）、６．４５（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、１Ｈ）、６．１６（ｄｄ、Ｊ＝８．３、２．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．２９（ｂｒｓ、２Ｈ、Ｄ2Ｏ交換可能（ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｌｅ））、４．０１（ｂｒｓ、２Ｈ、Ｄ2Ｏ交換可能（ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｌｅ））、１．４５（ｓ、９Ｈ）
ステップ３：化合物２（２００ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）、４－ペンチン酸（２００ｍｇ、２．０４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２８０ｍｇ、２．０７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（ＴＥＡ、１９０ｍｇ、１．８８ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの無水ＤＭＦに完全に溶解させた。ＥＤＣ（４００ｍｇ、２．０９ｍｍｏｌ）を溶液に添加した後、反応混合物を２５℃で２４時間激しく撹拌した。反応が完了した後、反応混合物を減圧蒸発させ、ＣＨ2Ｃｌ2に懸濁した。有機溶媒を蒸留水で３回抽出し、有機部分をＮａ2ＳＯ4で洗浄して淡褐色の粗（ｃｒｕｄｅ）－固体を得、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＥＡ－ヘキサン混合物）によって精製して化合物３（２８５ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ、収率：８２．７％）を得た。
［化合物３］
1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ＝９．９９（ｂｒｓ、１Ｈ、Ｄ2Ｏ交換可能（ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｌｅ））、９．４１（ｂｒｓ、１Ｈ、Ｄ2Ｏ交換可能（ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｌｅ））、８．２６（ｂｒｓ、１Ｈ、Ｄ2Ｏ交換可能（ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｌｅ））、７．８７（ｄ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．３９（ｄｄ、Ｊ＝８．７、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．２７（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、２．７９（ｔ、Ｊ＝２．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．５５－２．４１（ｍ、８Ｈ）、１．４７（ｓ、９Ｈ）
ステップ４：５ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を０℃で２０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に懸濁した化合物３（２００ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）に滴下した。そして反応混合物を２５℃で１２時間激しく撹拌した。反応が完了した後、反応混合物を減圧蒸発させ、飽和重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ3）溶液で中和した。中和した溶液をＣＨ2Ｃｌ2中の５％（ｖ／ｖ）メタノールで３回抽出し、有機部分をＮａ2ＳＯ4で洗浄して、濃褐色の固体の架橋剤ＤＡ－ＮＯＣＣＬ（１３８ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ、収率：９３．５％）を得た。
［ＤＡ－ＮＯＣＣＬ］
1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ＝９．７０（ｂｒｓ、１Ｈ、Ｄ2Ｏ交換可能（ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｌｅ））、９．０６（ｂｒｓ、１Ｈ、Ｄ2Ｏ交換可能（ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｌｅ））、７．０８（ｄ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．０１（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、６．７０（ｄｄ、Ｊ＝８．５、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．８８（ｂｒｓ、２Ｈ、Ｄ2Ｏ交換可能（ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｌｅ））、２．７８（ｄｔ、Ｊ＝１４．７、２．４、２Ｈ）、２．４４（ｍ、８Ｈ）。
前記合成された架橋剤ＤＡ－ＮＯＣＣＬが一酸化窒素と反応して分解されるメカニズム、及びこれを確認した1Ｈ ＮＭＲ、ＦＴ－ＩＲ及びＵＶ－Ｖｉｓ（紫外可視）吸光データは図４及び図５に示した。
図４及び図５で確認できるように、飽和されたＮＯ溶液中で培養した後、一次アミンの特徴的なピークが消失し、ベンゾトリアゾール（ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）基が形成されて、架橋剤ＤＡ－ＮＯＣＣＬがＮＯに反応して分解できることを確認した。
製造例２．化学式２の化合物の合成
化学式１で表される架橋剤とクリック可能な化学式２の化合物との合成のために、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ））を開始物質としてＰＥＧのヒドロキシル基（ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）の一つを酸化銀（Ａｇ2Ｏ）触媒条件下で選択的にトシル化（ｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ）した後、トシル基をブロミド（ｂｒｏｍｉｄｅ）に置換した。前記形成されたＰＥＧ－Ｂｒは、Ｄ，Ｌ－ラクチドと環結合重合によってＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ－Ｂｒのブロック共重合体を形成する。最後に、ブロミド（ｂｒｏｍｉｄｅ）基をアジドに置換して合成を完了した。合成したＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ－Ｎ3１０ｍｇを１ｍｌのＴＨＦに溶かした後、９ｍｌの水を滴下（ｄｒｏｐｗｉｓｅ）してミセル構造体を形成させ、残りのＴＨＦを透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）によって除去した。具体的な合成の各ステップは下記の通りであり、合成過程は図６に示した。ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ－Ｎ3の成功した合成は、1Ｈ ＮＭＲ、ＦＴ－ＩＲ、及びＧＰＣによって確認し、それぞれ図７、８ａ及び８ｂに示した。
具体的な合成の各ステップは下記の通りである。
ステップ１：酸化銀（Ｉ）（１．７４ｇ、７．５１ｍｍｏｌ）及びヨウ化カリウム（ＫＩ、０．３３ｇ、１．９９ｍｍｏｌ）を１６０ｍｌの無水ジクロロメタン（ＣＨ2Ｃｌ2）に溶解した真空－乾燥２ｋＤａのＰＥＧ（１０ｇ、５．００ｍｍｏｌ）溶液に添加し、２０ｍｌの無水ＣＨ2Ｃｌ2中のｐ－トルエンスルホニルクロライド（ＴｓＣｌ、１ｇ、５．２５ｍｍｏｌ）を添加し、０℃で一晩激しく撹拌した。反応が完了した後、反応混合物を、セライト５４５ベッド（Ｃｅｌｉｔｅ ５４５ｂｅｄ）を用いて慎重にろ過し、減圧蒸発させて無色の油性生成物を得た。前記得られた生成物は、多重のＣＨ2Ｃｌ2／ジエチルエーテル（（Ｃ2Ｈ5）2Ｏ）の再結晶によってさらに精製して、白色の固体沈殿物（ｍｏｎｏＴｏｓ－ＰＥＧ、９．７２ｇ、収率：９０．９％）を得た。
ステップ２：ｍｏｎｏＴｏｓ－ＰＥＧ（４．０ｇ、１．８６ｍｍｏｌ）及び臭化カリウム（ＫＢｒ、１．１ｇ、９．２４ｍｍｏｌ）の両方を４０ｍｌの無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させ、撹拌下で６５℃で１８時間反応させた。反応が完了した後、反応混合物を減圧蒸発させてＣＨ2Ｃｌ2に再分散させた。前記生成物を短いシリカゲルに通過させ、多重のＣＨ2Ｃｌ2／（Ｃ2Ｈ5）2Ｏの再結晶によってさらに精製して、白色の固体沈殿物（ｍｏｎｏＢｒ－ＰＥＧ、３．５９ｇ、収率：９３．５％）を得た。
ステップ３：ｍｏｎｏＢｒ－ＰＥＧ（１．５ｇ、０．７２ｍｍｏｌ）及び３，６－ジメチル－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（Ｄ，Ｌ－ラクチド、２．１ｇ、１４．５７ｍｍｏｌ）を５ｍｌの無水トルエンに溶解させた。前記溶液に数回の凍結－解凍サイクルを行った後、スズ（ＩＩ）２－エチルヘキサノエート触媒（Ｓｎ（Ｏｃｔ）2、０．０１ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を添加して重合を開始した。反応混合物は、１２０℃で３６時間激しく撹拌した。反応が完了した後、前記混合物を減圧蒸発させてＣＨ2Ｃｌ2に再分散させた。そして、生成物を多重のＣＨ2Ｃｌ2／（Ｃ2Ｈ5）2Ｏの再結晶化によって精製して、白色の無定形固体沈殿物を得た。生成物は、蒸留水に対する２日間の透析、及び後続の凍結乾燥によってさらに生成物を精製（ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ－Ｂｒ）した。分子量は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（Ｍｎ＝５５４０、ＰＤＩ＝１．５０）下でゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ：Ｇｅｌ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によって測定した。
ステップ４：前記製造されたＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ－Ｂｒ（１．１ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）及び過量のアジ化ナトリウム（ＮａＮ3、０．４５ｇ、６．９２ｍｍｏｌ）を２０ｍｌの無水ＤＭＦに溶解させ、反応混合物を５０℃で３日間激しく撹拌した。反応が完了した後、蒸留水に対する２日間の透析、及び後続の凍結乾燥によって生成物を精製（ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ－Ｎ3）した。分子量は、ＴＨＦ（Ｍｎ＝５８６４、ＰＤＩ＝１．５５）下でＧＰＣによって測定した。
また、前記製造されたＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ－Ｎ3の自己組織化によって形成されたミセル構造体のＴＥＭ及びＤＬＳデータは、それぞれ図８ｃ及び８ｄに示し、図８ｃ及び８ｄで確認できるように、ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ－Ｎ3は、水性条件下で自己組織化して約２８４．１±７．８ｎｍサイズの均一なミセル構造を形成できることを確認した。
製造例３．化学式３の化合物の合成
化学式１で表される化合物とクリックしてヒドロゲル骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を成すことができる化学式３で表される化合物であるヒアルロン酸基盤の高分子鎖（ＨＡ－Ｎ3）は、２－クロロエチルアミンのクロライド基をアジド基に置換した後、置換された２－アジドエチルアミンをヒアルロン酸とアミド結合を通して結合させて合成した。前記ヒアルロン酸基盤の高分子鎖の合成過程は図９に示し、合成の各ステップで得られた化合物の1Ｈ ＮＭＲスペクトルは図１０に示した。
具体的な合成の各ステップは下記の通りである。
ステップ１：２－クロロエチルアミンハイドロクロライド（１．１６ｇ、１００．００ｍｍｏｌ）及びＮａＮ3（１．３ｇ、２０．００ｍｍｏｌ）の両方を３０ｍｌの蒸留水に溶解させ、反応混合物を８０℃で１２時間激しく撹拌した。反応が完了した後、１Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液を添加し、溶液のｐＨを１０～１１に調整した。アルカリ性溶液をＣＨ2Ｃｌ2で３回抽出し、有機部分を無水硫酸ナトリウム（Ｎａ2ＳＯ4）で洗浄して、淡黄色の油性生成物（２－アジドエチルアミン、０．６２ｇ、収率：７２．０％）を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）：δ＝３．４１（ｔ、Ｊ＝５．７Ｈｚ、１Ｈ）、２．８０（ｔ、Ｊ＝５．７Ｈｚ、１Ｈ）。
ステップ２：１００ｋＤａのヒアルロン酸（ＨＡ、２００ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ（繰り返し単位））を４０ｍｌの蒸留水に完全に溶解させ、前記溶液にＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、１４４ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、１０１ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）及び２－アジドエチルアミン（５１．７ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を添加した。ｐＨを６．８に調整した後、反応混合物を暗（ｄａｒｋ）条件下で、２５℃で１日間激しく撹拌した。反応が完了した後、生成物は０．１Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及び蒸留水に対する連続透析によって精製し、凍結乾燥してＨＡ－Ｎ3を得た。
製造例４．ヒドロゲルの製造
本発明の一酸化窒素感応性ヒドロゲル（以下、Ｍ－ＮＯゲル）は、下記の方法によって製造した。
具体的には、Ｍ－ＮＯゲルは二重シリンジシステムで用意した。二重シリンジシステムの片方のシリンジには化学式１及び化学式３で表される化合物を、他方のシリンジには化学式２で表される化合物とＣｕ（Ｉ）触媒とを含むようにした。化学式１と化学式３を含むシリンジは、１％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ中で用意され、各濃度は０．０４ｗｔ％、２．５ｗｔ％であった。化学式２で表される化合物とＣｕ（Ｉ）触媒とを含むシリンジは、蒸留水中で用意され、各濃度は２ｗｔ％、０．０２ｗｔ％であった。ここでＣｕ（Ｉ）触媒は、１５．５ｍｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ及び２２．０ｍｇのアスコルビン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｓｃｏｒｂａｔｅ）を０．２ｍＬの蒸留水で混合して製造した。
また、対照群として用いられた一酸化窒素非反応性ヒドロゲルは、前記Ｍ－ＮＯゲルの製造方法において、ＤＡ－ＮＯＣＣＬをＤＡ－ＮＯＮＣＬ（ジアルキン－官能化された非切断型架橋剤（ｄｉａｌｋｙｎｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｎｏｎ－ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｒ））に置き換えて製造した。
実験例１．Ｍ－ＮＯゲルの形態学的分析
本発明のＭ－ＮＯゲルの形態学的分析のために、二重シリンジシステム（ｄｕａｌ ｓｙｒｉｎｇｅ ｓｙｓｔｅｍ）で用意されたＭ－ＮＯゲルを極低温走査型電子顕微鏡（ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）によって画像化し、これは図１１ａに示した。
前記図１１ａで確認できるように、ミセル構造体が網状構造（ｎｅｔｗｏｒｋ）のヒドロゲル内に均一に分布して固定されていることを確認した。
実験例２．Ｍ－ＮＯゲルの機械的特性分析
本発明のＭ－ＮＯゲルの関節に対する人工粘性補充剤（ｖｉｓｃｏ－ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）としての用途を確認するために、動的過渡試験（ｄｙｎａｍｉｃ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｅｓｔ）によってＭ－ＮＯゲルの破裂後の自己治癒（ｓｅｌｆ－ｈｅａｌｉｎｇ）特性を分析した。
具体的には、複数のサイクルにわたるステップ－ひずみ（ｓｔｅｐ－ｓｔｒａｉｎ）（ε＝０．５～２００％、ωｒａｄ／ｓ、２５℃）を測定し、人工粘性補充剤の重要なパラメータである高いひずみでの網状構造の破裂後の機械的特性の自己治癒の有無を確認し、結果は図１１ｂ及び１２ａに示した。
前記の結果から確認できるように、Ｍ－ＮＯゲルはストレスによって誘発される流れに応じてほぼ完全な回復を示すことから、本発明のＭ－ＮＯゲルが粘性補充剤として有用に使用できることを確認した。
実験例３．Ｍ－ＮＯゲルのＮＯ濃度依存的な機械的特性変化の分析
Ｍ－ＮＯゲルのＮＯ濃度に応じる機械的特性の変化を確認するために、周波数依存的レオロジーパラメータ（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｈｅｏｌｏｇｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）を分析した。
具体的には、ＮＯ非反応性ゲルとＮＯ反応性である本発明のＭ－ＮＯゲルの周波数依存的振動レオロジー特性（ε％、２５℃）及び濃度依存性レオロジー特性（ωｒａｄ／ｓ～ωｒａｄ／ｓ、ε％、２５℃）を角周波数（ａｎｇｕｌａｒ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を測定し、定量化して比較し、結果は図１２ｂ及び１２ｃに示した。
図１２ｂ及び図１２ｃで確認できるように、ＮＯ反応性であるＭ－ＮＯゲルの貯蔵モジュラス（ｍｏｄｕｌｕｓ）は、ＮＯの濃度に応じて徐々に減少し、架橋剤のＮＯ媒介分解時の機械的強度の減少を示したのに対し、対照群であるＮＯ非反応性ゲルでは、高濃度のＮＯ溶液でも貯蔵モジュラスに大きな変化は見られなかった。すなわち、本発明のＭ－ＮＯゲルは、ＮＯ濃度の増加に伴う分解様相を示すことを確認した。
実験例４．Ｍ－ＮＯゲルのＮＯ消去能の確認
本発明のＭ－ＮＯゲルのＮＯ消去能は、水性条件下でＮＯを放出することができる合成ＮＯ供与体Ｐｙ－ＮＯ（Ｎ－ジアゼニウムジオレート配合ピロリジン（Ｎ－ｄｉａｚｅｎｉｕｍｄｉｏｌａｔｅｓ－ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ））を用いて２５μＭのＰｙ－ＮＯ溶液を製造した後、Ｍ－ＮＯゲル及びＮＯ非反応性ゲルを前記製造された２５μＭのＰｙ－ＮＯ溶液で処理し、１時間培養した後、グリース分析によって上清液の残留ＮＯのレベルを定量化した（５４８ｎｍでの吸光度をＮａＮＯ2でプロットされた標準曲線と比較してＮＯ濃度を決定する）。また、ヒドロゲルの膨張レベルを測定して確認し、下記の計算式によって相対的膨張比を計算し、結果は図１３ａ、１３ｂ、１３ｃ及び１３ｄに示した。
＜計算式＞
－膨張比＝（Ｍｆ－Ｍｉ）／Ｍｉ
（Ｍｆ：ＮＯ溶液中で膨張したヒドロゲルの重量、Ｍｉ：乾燥したヒドロゲルの重量）
－相対的膨張比＝膨張比／０ｈでの水による膨張比
図１３ａ、１３ｂ、１３ｃ及び１３ｄで確認できるように、本発明のＭ－ＮＯゲルは、ＮＯの濃度に応じてＮＯ溶液の量を大幅に減少させ、対照群であるＮＯ非反応性ゲルに比べて大幅に膨張したことを確認することができた。
すなわち、本発明のＭ－ＮＯゲルは濃度依存的に一酸化窒素を効果的に消去し、ＮＯ濃度に応じてヒドロゲルの網状構造の切断による気孔サイズの増加による膨張特性を有するため、ＮＯ濃度に応じたオンデマンド制御伝達（ｏｎ－ｄｅｍａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）が可能であることを確認した。
実験例５．Ｍ－ＮＯゲルの同時的二重薬物放出の確認
Ｍ－ＮＯゲルのＮＯ反応性同時的二重薬物放出（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｕａｌ－ｓｔａｇｅ ｒｅｌｅａｓｅ）については、下記の実験によって確認した。
具体的には、親水性薬物モデルであるＢＳＡ－ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート標識ウシ血清アルブミン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｌａｂｅｌｅｄ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ））を最終的に１ｗｔ％となるようにＨＡ－Ｎ3を含む溶液に溶解させて、ヒドロゲルの親水性ドメインにカプセル化し、疎水性薬物モデルであるナイルレッド（Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ）はＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ－Ｎ3ミセルの疎水性ドメインにカプセル化した。前記親水性及び疎水性薬物モデルは、ヒドロゲル形成時にＭ－ＮＯゲルに共同－カプセル化された。
その後、２００μＬのＭ－ＮＯゲルを２５℃で５ｍＬのＮＯ溶液（０、２．５、２５及び２５０μＭ）中で培養した。上清液は所定の時間間隔でＮＯ溶液に交換し、得られた上清液を凍結乾燥によって濃縮した後、蛍光（励起／放出ピークは４８５／５１０ｎｍ）及び５８５ｎｍでの吸光度を標準曲線と比較してＢＳＡ－ＦＩＴＣ及びナイルレッド（Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ）、それぞれの時間依存的なＮＯ反応性の同時的二重薬物放出プロファイルを調べた。
二重薬物放出の模式図は図１４ａに示し、結果は図１４ｂ、１４ｃ、１４ｄ及び１４ｅに示した。
図１４ｂ、１４ｃ、１４ｄ及び１４ｅで確認できるように、本発明のＭ－ＮＯゲルは、高いＮＯ濃度でフィック（Ｆｉｃｋｉａｎ）の拡散による放出特性を有する親水性分子、及び侵食に基づく放出（ｅｒｏｓｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）特性を有する全ての疎水性分子を迅速に放出することができたが（図１４ｂ及び１４ｄ）、対照群であるＮＯ非反応性ゲルは、ＮＯ濃度の増加にもかかわらず、特別な放出様相を示さなかった（図１４ｃ及び１４ｅ）。
また、本発明のＭ－ＮＯゲルのミセル構造体から疎水性薬物の侵食に基づく放出が可能であるかどうかは、ヒドロゲル形成前のＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ－Ｎ3ミセル構造体の平均流体力学的（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ）サイズと、Ｍ－ＮＯゲルをＮＯ溶液（２５０μＭ）と共に２４時間培養した後、上清液で確認されたＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ－Ｎ3ミセル構造体の平均流体力学的サイズとを比較して確認し、結果は図１５ａ及び１５ｂに示した。
前記図１５ａ及び１５ｂで確認できるように、ヒドロゲル形成前のＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ－Ｎ3ミセル構造体と流体力学的に類似したサイズと形態を有するミセル構造体が、ＮＯ溶液と共に培養したＭ－ＮＯゲルの上清液で観察され、侵食に基づくメカニズム（ｅｒｏｓｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）によって疎水性薬物が放出され得ることを確認した。
実験例６．Ｍ－ＮＯの細胞毒性の確認
本発明のＭ－ＮＯ及び対照群の用量依存性細胞毒性については、ＭＴＴアッセイ（ａｓｓａｙ）によって確認した。
具体的には、ＲＡＷ２６４．７細胞を９６－ウェルプレートに１×１０4ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの初期密度で接種し、３７℃で１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地に培養した。
２４時間培養した後、培地をサンプルが含まれる新鮮な培地に交換し、再び４０時間培養した。その後、細胞を洗浄し、０．５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ溶液が含まれる培地に４時間培養した。最後に、培地を２００μＬのＤＭＳＯに交換し、５７０ｎｍで吸光度を測定して細胞生存率を調べ、結果は図１６ｂに示した。
図１６ｂで確認できるように、本発明のＭ－ＮＯゲルは細胞生存率にほとんど影響を与えず、本発明のＭ－ＮＯの安全性を確認した。
実験例７．Ｍ－ＮＯのＮＯ消去能の確認
本発明の組成物のＮＯ消去能（ＮＯ－ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ）を有するかどうか、及びそれに伴うサイトカインレベルは、ＬＰＳで刺激されたＮＯ－放出ＲＡＷ２６４．７のマクロファージ細胞株を使用して確認した。
（１）濃度に伴うＮＯ消去能の確認
ＲＡＷ２６４．７の細胞株を５×１０4ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの密度で１２－ウェルプレートに接種し、３７℃で１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地に培養した。
一晩培養した後、培地をサンプルが含まれる、５μｇ／ｍＬのＬＰＳを含む新鮮な培地に交換し、再び２４時間培養した。
最後に、培地を遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）して上清液を得た後、９６－ウェルプレートに移し、グリース分析によって上清液に残っているＮＯレベルを確認し、これは図１６ｃに示した。
図１６ｃで確認できるように、本発明のＭ－ＮＯゲルは、ＬＰＳで刺激されたＲＡＷ２６４．７細胞株のＮＯレベルを２５％まで著しく低下させることができることが確認でき、これはＬＰＳ未処理のＲＡＷ２６４．７において観察された値と類似していることが確認できた。
（２）共焦点顕微鏡によるＮＯ消去能の確認
細胞内のＮＯレベルを共焦点顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）によって画像化し、ＮＯ消去能力を評価した。
具体的には、細胞を１×１０5ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの密度で６－ウェルプレートに配置されたカバーガラスに接種し、３７℃で１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地に培養した。
一晩培養した後、培地をサンプル（架橋剤の場合は２５μｇ／ｍＬ、ゲルの場合は２５０μｇ／ｍＬ）が含まれる、５μｇ／ｍＬのＬＰＳを含む新鮮な培地に交換し、再び２４時間培養した。
その後、サンプル培地を５μｍのＤＡＦ－２ＤＡを含む新鮮な培地に交換し、再び４０分間培養した後、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、新鮮な培地と共にさらに２０分間培養した。
次いでＤＰＢＳで洗浄し、室温の暗条件（ｄａｒｋ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下で、１０％の中性ホルマリン（ＮＢＦ）で処理し、３０分後に共焦点顕微鏡によって観察し、結果は図１６ｄに示した。
図１６ｄで確認できるように、ＬＰＳで刺激されたＲＡＷ２６４．７細胞株で高い蛍光強度が観察されたが、Ｍ－ＮＯゲル処理後、そのシグナルが大幅に減少することを確認し、本発明のＭ－ＮＯがＮＯを効率的に消去できることを確認した。
（３）サイトカインレベルの定量化
ＮＯは重要な炎症誘発性メディエーター（ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ）だが、過剰産生は試験管内でのレベルでＴＮＦ－α及びＩＬ－６などの代表的なサイトカインレベルを増加させる。したがって、本発明のＭ－ＮＯゲルがサイトカインＴＮＦ－α及びＩＬ－６のレベルを低下させることができるかどうかを確認した。
具体的には、ＬＰＳで刺激されたＲＡＷ２６４．７細胞株にＭ－ＮＯゲル及び対照群ゲルで処理（２５０μｇ／ｍＬ）し、２４時間培養した後、細胞培地の上清液の炎症性サイトカインＴＮＦ－α及びＩＬ－６をＥＬＩＳＡ（エライザ）法によって定量化し、結果は図１７ａ及び１７ｂに示した。
図１７ａ及び１７ｂで確認できるように、Ｍ－ＮＯゲル処理後のＮＯによって誘発される炎症性サイトカインＴＮＦ－α及びＩＬ－６のレベルが大幅に低下し、本発明のＭ－ＮＯゲルが過剰産生されたＮＯを効果的に消去できることを確認し、それによって炎症を減少させて様々な炎症性疾患を治療できることを確認した。
（４）ＮＯ捕集によるＭ－ＮＯゲルの膨張の確認
ＬＰＳによって刺激されるか、または刺激されていない培養されたＲＡＷ２６４．７またはＮＩＨ／３Ｔ３細胞株に、Ｍ－ＮＯゲル及び対照群ゲルを処理した後一晩培養し、ＮＯ捕集によるＭ－ＮＯゲルが膨張したかどうかを確認した。結果は図１７ｃ及び１７ｄに示した。
前記図１７ｃ及び１７ｄで確認できるように、Ｍ－ＮＯゲルは、ＬＰＳで刺激されたＲＡＷ２６４．７細胞株でＮＯに応答して著しく膨張できることを確認し、本発明のＭ－ＮＯゲルがオンデマンド放出に有利な条件を有していることを確認した。
実験例６．関節リウマチの治療効果の確認（１）
関節リウマチ（ＲＡ）動物モデルであるコラーゲン誘導関節炎（ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、ＣＩＡ）マウスにおいて、本発明のＭ－ＮＯゲルの関節リウマチに対する治療効果を確認した（図１８ａ）。
（１）コラーゲン誘導関節炎マウスモデルの準備
１０ｍＭの酢酸に溶解させたＣＩＩ（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩＩ、２ｍｇ／ｍＬ）及びＣＦＡ（完全フロイントアジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）、１ｍｇ／ｍＬ）混合物の乳化溶液（１：１、ｖ／ｖ）１００μＬを６週齢のＤＢＡ／１ｊマウスの尾に皮下注射して一次免疫化した。
２週間後、１０ｍＭの酢酸に溶解させたＣＩＩ（２ｍｇ／ｍＬ）及びＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ｆｒｅｕｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）、１ｍｇ／ｍＬ）混合物の乳化溶液（１：１、ｖ／ｖ）１００μＬをマウスの尾に皮下注射した。そして、一次免疫化の４週間後、ＲＡモデルマウスを無作為に８つの群に分配し、各サンプル２０μＬをＣＩＡマウスの関節内に注射した。インサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲルは二重シリンジシステム（片方のシリンジにはＨＡ－Ｎ3（２．５ｗｔ％）及び架橋剤（０．０４ｗｔ％）を含み、他方のシリンジにはミセル（２ｗｔ％）及びＣｕ（Ｉ）（０．０２ｗｔ％）を含む）を用いて注射した。デキサメタゾンが担持されたＭ－ＮＯゲルは、１ｗｔ％でヒドロゲルシステムと一致するように２倍希釈された（担持量：５．０２％、用量：０．５ｍｇ／ｋｇ）。
各実験群は下記のように分類される。
（Ａ）免疫化されていない健康なマウス
（Ｂ）ＲＡモデルマウスを生理食塩水で処理した群
（Ｃ）ＲＡモデルマウスをデキサメタゾンが担持されたミセル構造体で処理した群
（Ｄ）ＲＡモデルマウスをＤＡ－ＮＯＣＣＬで処理した群
（Ｅ）ＲＡモデルマウスをＭ－ＮＯゲルで処理した群
（Ｆ）ＲＡモデルマウスを対照群ゲル（ＮＯ非反応性）で処理した群
（Ｇ）ＲＡモデルマウスをデキサメタゾンが担持されたＭ－ＮＯゲルで処理した群
（Ｈ）ＲＡモデルマウスをデキサメタゾンが担持された対照群ゲル（ＮＯ非反応性）で処理した群
（２）足の体積変化の確認及び関節炎に対する臨床スコアの評価
ＲＡマウスモデルにおける時間の経過に伴う足の体積変化は、各ＲＡマウスモデル実験群で生理食塩水を処理した群（Ｂ）と相対的に比較して統計的に分析し、結果は図１８ｂに示した。また、４週目、６週目及び８週目における代表的なマウスの後足の画像は図１９に示した。
図１８ｂ及び図１９で確認できるように、本発明のＭ－ＮＯゲル及びデキサメタゾンが担持されたＭ－ＮＯゲルで処理した群では、有意な足の体積減少を示した。
また、時間の経過に伴う関節炎の臨床スコアは、４～８週間の臨床スコアをモニターしながら、標準採点法（尺度０～５）に従ってブラインドテストによって評価し、結果は図２０ａ及び２０ｂに示した。関節炎評価による臨床スコア及び評価基準は下記の通りである。
０：臨床徴候なし
１：最小のびまん性紅斑／浮腫（１本または２本の足指に影響）
２：軽度のびまん性紅斑／浮腫（３本以上の足指に影響）
３：中度のびまん性紅斑／浮腫（全体の足）
４：著しいびまん性赤紅／浮腫（全体の足及び足首）
５：重度のびまん性紅斑／紅腫（全体の足）、足指を曲げることができない（関節癒着）
図２０ａ及び図２０ｂで確認できるように、本発明のＭ－ＮＯゲル及びデキサメタゾンが担持されたＭ－ＮＯゲルで処理した群では有意な臨床スコアの減少を示した。
前記の結果から確認したところによれば、本発明のＭ－ＮＯゲル及びデキサメタゾンが担持されたＭ－ＮＯゲルは、疾患の進行を遅らせることができるだけでなく、関節炎の症状自体を緩和できることを確認することができた。特にデキサメタゾンが担持されたＭ－ＮＯゲルは、ほぼ完全な関節炎の症状の緩和を示した。
（３）運動性評価
ＲＡマウスモデルでの運動活性を評価するために、ロータロッド分析（ｒｏｔａｒｏｄ ａｓｓａｙ）を行った。
具体的には、一次免疫化の前に、マウスが安定した落下遅延（ｌａｔｅｎｃｙ ｔｏ ｆａｌｌ）に到達するために、ロータロッド上に留まるように３日間訓練した。その後、１０ｒｐｍ、１２０ｓの固定速度で落下遅延時間を記録し、結果は図２０ｃ及び２０ｄに示した。
前記図２０ｃ及び２０ｄで確認できるように、本発明のＭ－ＮＯゲル及びデキサメタゾンが担持されたＭ－ＮＯゲルで処理した群では落下遅延時間が増加し、特にデキサメタゾンが担持されたＭ－ＮＯゲルで処理した群では有意な落下遅延時間の増加を示し、マウスの運動性の漸進的な改善を確認することができた。
実験例７．関節リウマチの治療効果の確認（２）
本発明のＭ－ＮＯゲルの関節リウマチの治療効果を集中的に調べるために、８週目に一連の追加実験を行った。
（１）骨及び関節形態の確認
骨及び関節形態は、サンプルを処理した各実験群の代表的な前足のマイクロコンピュータ断層撮影（ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、ｍｉｃｒｏ－ＣＴ）画像によって確認し、結果は図２１ａに示した。
図２１ａで確認できるように、他の実験群に比べて、本発明のＭ－ＮＯゲル及びデキサメタゾンが担持されたＭ－ＮＯゲルで処理した群では骨の侵食が少なくて、骨の明確な境界を確認することができた。
これは、本発明のヒドロゲルがＲＡ病変で過剰産生された一酸化窒素の消去によって、酸化／硝化ストレス及び破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ）の上方調節を防止できることを示すものである。
（２）組織学的分析
サンプルを処理した各実験群の関節組織の組織学的分析（Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓａｙｓ）は、８週目に犠牲になったマウスの関節組織をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）、マッソン・トリクローム（ｍａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）及びサフラニン－Ｏ（Ｓａｆｒａｎｉｎ－Ｏ）で染色して観察し、分析結果及びブラインドテストによって標準採点法（尺度０－４）に従って評価した軟骨損傷の程度は、図２１ｂ及び２２ａに示した（Ｂ：骨、Ｃ：軟骨）。臨床スコア及び評価基準は下記の通りである。
０：損傷なし、正常な活動
１：単一部位に限られる最小のびらん（ｅｒｏｓｉｏｎ）
２：限られた範囲での軽度の／中度のびらん
３：著しい／広範囲なびらん（ｅｒｏｓｉｏｎ）
４：ほとんどが損傷
前記図２１ｂ及び図２２ａで確認できるように、本発明のＭ－ＮＯゲル及びデキサメタゾンが担持されたＭ－ＮＯゲルが、損傷した軟骨及び関節腔を回復させることができることを確認した。
（３）ＴＮＦ－α及びＩＬ－６のレベル及びＮＯ濃度の確認
血清及び足組織液中の炎症性サイトカインであるＴＮＦ－α及びＩＬ－６のレベルは、８週目に製造者のプロトコルに従ってＥＬＩＳＡ（エライザ）法によって定量化して確認した。ＮＯレベルはグリース分析によって決定し、結果は図２２ｂ～２２ｅに示した。
図２２ｂ～２２ｅで確認できるように、炎症性サイトカインのレベルは、血清及び足組織液の両方で本発明のＭ－ＮＯゲル及びデキサメタゾンが担持されたＭ－ＮＯゲルを処理した群は、有意な減少を示した。特に、デキサメタゾンが担持されたＭ－ＮＯゲルを処理した群は、正常状態まで大きく減少することを確認することができた。
また、８週目のサンプル処理されたＲＡマウスの足組織におけるＮＯレベルを定量化したデータは図２２ｆに示した。前記図２２ｆに示すように、本発明のＭ－ＮＯゲル及びデキサメタゾンが担持されたＭ－ＮＯゲルを処理した群は、足組織液中のＮＯ濃度が有意に減少することを確認した。

Claims (32)

  1. 下記の化学式１～３で表される化合物から製造されるインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル：
    ［化学式１］
    ［化学式２］
    ［化学式３］
    ここで、
    前記Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立にＣ１－Ｃ１０のアルキレンであり、
    前記ｎ及びｍは、それぞれ１～１０００の整数である。
  2. 前記Ｒ1及びＲ2はＣ２アルキレンである、請求項１に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル。
  3. 前記ヒドロゲルは一酸化窒素を捕集して消去するものである、請求項１に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル。
  4. 前記ヒドロゲルは、一酸化窒素と反応して分解されるものである、請求項１に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル。
  5. 前記化学式２で表される化合物は、自己組織化によってミセル構造体を形成するものである、請求項１に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル。
  6. 前記ミセル構造体は、１０～１０００ｎｍの均一な直径を有するものである、請求項５に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル。
  7. 前記ヒドロゲルは、前記化学式１で表される化合物と前記化学式２及び３で表される化合物との間のクリックケミストリー反応によって製造されるものである、請求項１に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル。
  8. 前記ヒドロゲルは、疎水性薬物をさらに含むものである、請求項１に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル。
  9. 前記疎水性薬物は、前記化学式２で表される化合物の自己組織化によって形成されたミセル構造体に担持されたものである、請求項８に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル。
  10. 前記疎水性薬物は抗炎症剤である、請求項８に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル。
  11. 前記抗炎症剤はデキサメタゾンである、請求項１０に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル。
  12. 前記疎水性薬物は、前記ミセル構造体の全重量に対して３～７重量％で含まれるものである、請求項８に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル。
  13. 前記ヒドロゲルは、疎水性薬物及び親水性薬物をさらに含むものである、請求項１に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル。
  14. 前記疎水性薬物及び親水性薬物は標的部位から同時に放出されるものである、請求項１３に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル。
  15. 前記化学式１～３の化合物は標的部位に同時－注射（ｃｏ－ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）されるものである、請求項１に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル。
  16. 前記同時－注射は二重シリンジシステム（ｄｕａｌ ｓｙｒｉｎｇｅ ｓｙｓｔｅｍ）によるものである、請求項１５に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル。
  17. 前記同時－注射は二重シリンジシステム（ｄｕａｌ ｓｙｒｉｎｇｅ ｓｙｓｔｅｍ）によるものである、請求項１５に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル。
  18. 前記ヒドロゲルは炎症性疾患の治療用である、請求項１に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル。
  19. 前記炎症性疾患は、生体内での一酸化窒素が過剰産生される様子を示す疾患である、請求項１８に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル。
  20. 前記炎症性疾患は関節リウマチである、請求項１８に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル。
  21. 前記ヒドロゲルは、ＴＮＦ－α及びＩＬ－６のレベルを低下させるものである、請求項１に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル。
  22. 前記ヒドロゲルは粘性補充剤用である、請求項１に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル。
  23. 下記の化学式１～３で表される化合物を含む、インサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル前駆体組成物。
    ［化学式１］
    ［化学式２］
    ［化学式３］
    ここで、
    前記Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立にＣ１－Ｃ１０のアルキレンであり、
    前記ｎ及びｍは、それぞれ１～１０００の整数である。
  24. 前記組成物は疎水性薬物をさらに含むものである、請求項２３に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル前駆体組成物。
  25. 前記疎水性薬物は、前記化学式２で表される化合物の自己組織化によって形成されたミセル構造体に担持されたものである、請求項２４に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル前駆体組成物。
  26. 前記組成物は、疎水性薬物及び親水性薬物をさらに含むものである、請求項２３に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲル前駆体組成物。
  27. ａ）下記の化学式１で表される化合物、及び下記の化学式３で表される化合物を含む、第１前駆体組成物を製造するステップ；
    ｂ）下記の化学式２で表される化合物から形成されたミセル構造体を含む、第２前駆体組成物を製造するステップ；及び
    ｃ）前記第１前駆体組成物及び第２前駆体組成物を同時－注射するステップ；を含むインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲルの製造方法。
    ［化学式１］
    ［化学式２］
    ［化学式３］
    ここで、
    前記Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立にＣ１－Ｃ１０のアルキレンであり、
    前記ｎ及びｍは、それぞれ１～１０００の整数である。
  28. 前記化学式１で表される化合物は、第１前駆体組成物の全質量に対して０．０２～０．０６ｗｔ％；
    前記化学式２で表される化合物は、第２前駆体組成物の全質量に対して１．００～３．００ｗｔ％；及び
    前記化学式３で表される化合物は、第１前駆体組成物の全質量に対して１．００～１．５０ｗｔ％；で含まれるものである、請求項２７に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲルの製造方法。
  29. 前記第２前駆体組成物は疎水性薬物をさらに含むものである、請求項２７に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲルの製造方法。
  30. 前記第１前駆体組成物は親水性薬物をさらに含み、第２前駆体組成物は疎水性薬物をさらに含むものである、請求項２７に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の製造方法。
  31. 前記疎水性薬物はミセル構造体に担持されたものである、請求項２９または請求項３０に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲルの製造方法。
  32. 前記同時－注射は二重シリンジシステム（ｄｕａｌ ｓｙｒｉｎｇｅ ｓｙｓｔｅｍ）によるものである、請求項２７に記載のインサイチュ－ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ヒドロゲルの製造方法。
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