KR100293043B1 - 광경화성글리코사미노글리칸유도체,가교결합된글리코사미노글리칸및이의제조방법 - Google Patents

광경화성글리코사미노글리칸유도체,가교결합된글리코사미노글리칸및이의제조방법 Download PDF

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Abstract

고도로 안정하고 생혼화성인 광경화성 글리코사미노글리칸(GAG) 유도체 및 가교결합된 글리코사미노글리칸, 경우에 따라 용매를 사용하여 주형시킴으로써 용이하게 성형가능한 광경화성 GAG 유도체를 제조하는 방법(이 방법으로 역영향을 일으키는 비반응성 물질이 용이하게 제거될 수 있다) 및 가교결합된 GAG 및 광경화성 GAG 유도체 또는 가교결합된 GAG를 기본으로 하는 의학 물질을 제조하는 방법이 제공된다. 광경화성 GAG 유도체는 글리코사미노글리칸 및 이에 결합된 광반응성 화합물을 포함하고, 예를 들어 글리코사미노글리칸의 하이드록실 또는 카복실 그룹을 광반응성 화합물과 각각 에스테르화 반응 또는 아미드화 반응시켜 제조할 수 있다. 가교결합된 GAG는 이에 결합된 광반응성 화합물의 분자간 가교결합에 의해 광경화성 GAG 유전자로부터 유도된다.

Description

광경화성 글리코사미노글리칸 유도체, 가교결합된 글리코사미노글리칸 및 이의 제조방법
제1도는 실시예 1에서 결합된 신남산의 양을 측정하기 위해 사용한1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
제2도는 실시예 1에서 가교결합된 히알루론산 필름 제조에 있어서 광에 대한 노출에 의해 초래되는 279nm에서의 감쇠된 흡광도를 나타내는 UV/VIS 스펙트럼을 나타낸다.
제3도는 가교결합된 각종 히알루론산 필름에 있어서, 신남산 잔기에 의한 치환도(DS)에 대한 접촉각의 의존성을 나타내는 그래프이다.
제4도는 가교결합된 각종 히알루론산 필름에 있어서 신남산 잔기에 의한 DS에 대한 팽윤능의 의존성을 나타내는 그래프이다.
제5도는 가교결합된 히알루론산 필름에 있어서 신남산 잔기에 의한 DS의 격차에 의해 발생하는 내피세포층 세포 접착력의 차이를 설명하는, 세포 형태학을 나타내는 사진이다.
제6도는 콘드로이틴 설페이트-신남산 에스테르(분획 CS-Cin-2)의 PBS 용액속에서의 이의 농도에 대한 콘드로이틴 설페이트-신남산 에스테르의 광경화시의 겔화도(%)의 의존성을 나타내는 그래프이다.
제7도는 PBS 중의 콘드로이틴 설페이트-신남산 에스테르(분획 CS-Cin-3)의 광노출 시간에 대한, 가교결합된 콘드로이틴 설페이트 겔 형성시의 겔화도(%)의 의존성 및 팽윤능의 의존성을 나타내는 그래프이다.
제8도는 신 잔기에 의한 DS에 대한, 가교결합된 콘드로이틴 설페이트 겔 형성시의 겔화도(%)의 의존성 및 팽윤능의 의존성을 나타내는 그래프이다.
제9도는 가교결합된 콘드로이틴 설페이트 필름의 DS에 대한 팽윤능의 의존성을 나타내는 그래프이다.
제10도는 실시예 8에서 제조된 가교결합된 콘드로이틴 설페이트 필름의 신남산 잔기에 의한 DS에 대한 접촉각의 의존성을 나타내는 그래프이다.
제11도는 실시예 14에서의 HA-Thym-1의 UV선에 대한 노출에 의한 가교결합된 히알루론산 필름 형성 공정에서 UV(자외선) 조사 시간에 대한 티민 이량체 형성율(%)의 의존성을 나타내는 그래프이다.
제12도는 실시예 16에서 HA-Thym 합성시에 1-(2-카복시에틸)티민/HA 몰 비와 DS와의 관계를 나타내는 그래프이다.
제13도는 실시예 17에서 CS-Thym 합성시에 1-(2-카복시에틸)티민/CS 몰 비와 DS와의 관계를 나타내는 그래프이다.
제14도는 실시예 18에서의 얇은 CS-Thym 필름의 광노출시의 조사 시간과 티민의 흡광도(270nm에서의) 변화와의 관계를 나타내는 그래프이다.
제15도는 실시예 18에서의 얇은 CS-Thym 필름의 광노출시의 조사 시간과 겔화도(%)와의 관계를 나타내는 그래프이다.
제16도는 실시예 18에서의 다른 얇은 CS-Thym 필름의 광노출시의 조사 시간과 겔화도(%)와의 관계를 나타내는 그래프이다.
제17도는 실시예 18에서의 얇은 HA-Thym 필름의 광노출시의 조사 시간과 팽윤능과의 관계를 나타내는 그래프이다.
제18도는 실시예 18에서의 광노출 전과 후의 얇은 HA-Thym 필름에 대한 팽윤능과 DS와의 관계를 나타내는 그래프이다.
제19도는 실시예 20에서 제조된 콘드로이틴 설페이트-(7-쿠마릴옥시)아세트산 에스테르의1H NMR 스펙트럼을 나타낸다.
제20도는 산 클로라이드 형태의 쿠마린/콘드로이틴 설페이트 하이드록실 그룹(CS-OH)의 몰 비와 형성된 에스테르의 DS와의 관계를 나타내는 그래프이다.
제21도는 실시예 21에서의 얇은 콘드로이틴 설페이트-(7-쿠마릴옥시)아세트산 에스테르 필름의 광노출시의 조사 시간과 쿠마린 흡광도(320nm에서의) 변화와의 관계를 나타내는 그래프이다.
제22도는 실시예 21에서의 얇은 콘드로이틴 설페이트-(7-쿠마릴옥시)아세트산 에스테르 필름의 광노출시의 조사 시간과 팽윤능과의 관계를 나타내는 그래프이다.
제23도는 실시예 21에서의 얇은 콘드로이틴 설페이트-(7-쿠마릴옥시)아세트산 에스테르 필름의 광노출시의 DS와 팽윤능과의 관계를 나타내는 그래프이다.
제24도는 실시예 21에서의 얇은 콘드로이틴 설페이트-(7-쿠마릴옥시)아세트산 에스테르 필름의 광노출시의 조사 시간과 겔화도(%)와의 관계를 나타내는 그래프이다.
제25도는 실시예 21에서의 콘드로이틴 설페이트-(7-쿠마릴옥시)아세트산 에스테르를 포함하는 얇은 필름의 광노출시의 설페이트-(7-쿠마릴옥시)아세트산 에스테르의 농도와 겔화도(%)와의 관계를 나타내는 그래프이다.
제26도는 실시예 28에서 측정된 약제 함량이 10% 또는 50%인 광가교결합된 HA-Thym 필름(DS=0.7)으로부터 약제 방출 속도[흡광도(269nm에서의) 변화로 표현함]를 시간의 함수로서 나타낸 그래프이다.
제27도는 실시예 28에서 측정된, 약제 함량이 10% 또는 50%인 광가교결합된 HA-Thym 필름(DS=2.2)으로부터 약제 방출 속도[흡광도(269nm에서의)의 변화로 표현함]를 시간의 함수로서 나타낸 그래프이다.
제28도는 실시예 28에서 측정된, 약제 함량이 10% 또는 50%인 광가교결합된 CS-Thym 필름(DS=0.8)으로부터 약제 방출 속도[흡광도(269nm에서의)의 변화로 표현함]를 시간의 함수로서 나타낸 그래프이다.
제29도는 실시예 28에서 측정된, 약제 함량이 10% 또는 50%인 광가교결합된 CS-Thym 필름(DS=1.3)으로부터 약제 방출 속도[흡광도(269nm에서의)의 변화로 표현함]를 시간의 함수로서 나타낸 그래프이다.
제30도는 실시예 28에서 측정된, 약제 함량이 10% 또는 50%인 광가교결합된 CS-Thym 필름(DS=1.8)으로부터 약제 방출 속도[흡광도(269nm에서의)의 변화로 표현함]를 시간의 함수로서 나타낸 그래프이다.
본 발명은 광반응성 화합물을 글리코사미노글리칸(이후, 가끔 "GAG"로 약칭함)에 화학적으로 결합시켜 제조한 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체, 이 유도체를 광반응성 화합물의 이량체화를 위해 광반응시켜 수득한 3차원 망상 구조를 갖는 가교결합된 글리코사미노글리칸, 이의 제조방법 및 이를 포함하는, 의학적 용도를 위해 만족스러운 정도로 생체 적합성인 물질에 관한 것이다.
가교결합을 위해 광이량체화될 수 있는 소수성 중합체를 포함하는 광경화성 수지는 지금까지 석판인쇄, 페인트 및 프링팅에 사용되어 왔다. 반대로, 친수성 중합체가 광가교결합되는 예는 거의 알려져 있지 않다.
한편, 생체내 GAG의 작용을 연장시키거나 의학적 용도를 위한 필름 또는 분말 형태의 물질을 제조하기 위해, 예를 들면, 조직 유착을 방지하기 위해 전형적인 친수성 중합체인 GAG를 알데하이드, 에폭시 화합물 및 디비닐 설폰 화합물 등을 사용하여 가교결합시키려고 시도되어 왔다. 그러나, GAG는 거대분자이기 때문에, 형성된 가교결합된 GAG 유도체는 여전히 분자량이 크며, 이로 인해 가교결합된 GAG 유도체로부터 반응하지 않은 물질 및/또는 촉매를 완전히 제거하기가 어렵게 된다. 따라서, 생체내에 투여되거나 이식될 때, 당해 유도체는 흔히 부작용을 발생시키며, 따라서 실제적으로 사용하기에 적합하지 않다. 또한, 가교결합된 GAG 유도체는 겔 또는 고체로서 생성되며, 따라서 가교결합 후에 성형시키기가 어려우므로 실제적으로 사용하기에 적합하지 않다. 또한, 이들의 서방출 또는 조절 방출 약제 제제에서의 담체로서의 용도[참조: JP-A 제(소)62-129226호(미합중국 특허 제5,128,326호에 상응함)(여기서, 용어 "JP-A"는 일본국 공개특허공보를 의미한다)]에 대해 말하자면, 활성 성분의 서방출은 단지 가교결합된 GAG 유도체의 점성의 잇점을 취함으로써 성취될 수 있으며 이러한 단점은 이들을 실제적으로 사용하기에 부적합하게 한다. 따라서, 이러한 방법 및 가교결합된 GAG 유도체는 약체의 방출속도를 거의 조절할 수가 없다.
또한, 예를 들면, 광이량체성 작용성 그룹인 신나모일 그룹을 갖는 풀루란, 아밀로오즈 및 만난과 같은 미생물 또는 식물 유도된 폴리사카라이드의 하이드록실 그룹을 에스테르화시켜 제조한 감광성 물질은 흡착제, 효소 담체 또는 크로마토그라피용 담체로서 사용할 수 있거나 PS 플레이트 또는 감광성 내식막을 제조하는데 사용할 수 있거나 기타의 적용[참조: JP-B 제(소)56-14969호(미합중국 특허 제 3,960,685호에 상응함)(여기서, 용어 "JP-B"는 일본국 특허공보를 의미한다) 및 JP-A 제(소)60-219202호]에 사용될 수 있다.
그러나, 위에서 언급한 감광성 물질은 보관 안전성에 있어서 문제점이 있으며 세포 유착을 거의 조절할 수가 없고 사람에 대한 생체적합성도 열등하며, 따라서 이들을 생체에 직접 적용하기 위한 의학용 물질, 특히 인공 장기, 상처를 도포하기 위해 사용하거나 외과용으로 사용하기 위한 의학용 제품, 약제학적 제제에서의 담체 또는 특정 또는 기타의 의학적 처치를 위해 사용되는 기타 재료로서 사용하기에 적합하지 않다.
따라서, 본 발명의 목적은 매우 안전하고 생체 적합한, 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체 및 이로부터 유도된 가교결합된 글리코사미노글리칸 유도체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 경우에 따라, 예를 들면, 용매를 사용하는 주형에 의해 쉽게 성형시킬 수 있는 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체의 제조방법(이 방법에 의해 부작용의 원인이 되는 비반응 물질을 쉽게 제거할 수 있다) 및 이로부터 가교결합된 GAG를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 세번째 목적은 위의 광경화성 GAG 유도체 또는 가교결합된 GAG를 기본으로 하며 다양한 목적에 널리 적용할 수 있는 의학용 물질을 제공하는 것이다.
본 발명의 네번째 목적은 조직에는 유착되지 않으나 상처 치유 속도에 따라 생분해될 수 있는 가교결합된 글리코사미노글리칸을 포함하고 적용 부위에서의 기계적 응력에 따라 기계적 강도를 쉽게 조절할 수 있는 비유착성 물질 및 생체내 광조사시 가교결합된 글리코사미노글리칸으로 쉽게 전환될 수 있는 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체를 포함하는 비유착성 물질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다섯번째 목적은 가교결합된 글리코사미노글리칸을 포함하고, 물질 또는 제제내에 포함되거나 엔트래핑되거나 봉입된 약제에 적합한 속도 및 약제적용 목적에 적합한 속도로 약제를 방출시키는 약제 방출 조절용 물질 또는 제제, 및 광경화성 글리코사미노글리칸을 포함하고 물질 또는 제제의 담체로서 또는 이를 위한 출발물질로서 유용한 약제 방출 조절용 물질을 제공하는 것이다.
본 발명은 글리코사미노글리칸 및 이와 결합하는 광반응성 화합물을 포함하는 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체(이후 가끔 "광경화성 GAG"로 약칭함) 및 광반응성 화합물을 가교결합시켜 광경화성 GAG를 제조한 가교결합된 글리코사미노글리칸(이후, 가끔 "가교결합된 GAG"로 약칭함)을 제공하는 것이다. 광경화 GAG는 바람직하게는 글리코사미노글리칸의 하이드록실 또는 카복실 그룹을 광반응성 화합물과 에스테르화 반응시키거나, 글리코사미노글리칸의 카복실 그룹을 활성화시키고 활성화된 카복실 그룹을 광반응성 화합물과 아미드화 반응시키거나, 글리코사미노글리칸의 카복실 그룹을 축합제 존재하에 광반응성 화합물과 아미드화 반응시켜 제조할 수 있다. 가교결합된 글리코사미노글리칸은 광경화성 GAG에 광을 조사하여 광반응성 화합물 잔기를 서로 가교결합 반응시켜 제조할 수 있다. 가교결합된 GAG를 기본으로 하는 물질은 의학용으로 적합하다. 가교결합된 GAG를 제공하는 광경화성 GAG도 의학용 물질로서 사용될 수 있다.
본원에서 용어 "의학용 물질"은 치료 목적을 위한 진단에 사용하는 의료기기 또는 인공 장기(인공 혈관, 인공 심장, 인공 피부 등) 구성 물질, 상처 도포물, 보철, 비유착성 물질 또는 약제 방출 조절용 기기를 구성하는 물질 및 인공 세포외 세포간질 또는 하이브리드 인공 장기 제조에 있어서 복강 세포, 상피 세포 및 평활근 세포의 유착 및 중식에 유용한 인공 기초막을 포함한다.
본 발명의 광경화성 GAG는 바람직하게는 다음 일반식[1] 내지 [5] 중의 하나인 부분 구조를 가지며, 광반응시 가교결합된 GAG를 제공한다. 각 일반식 아래에 상응하는 반응 방식을 기술하며, 여기서 gag는 글리코사미노글리칸의 부분 구조를 의미하고, R1은 광반응성 그룹(즉, 적어도 비닐렌 그룹을 함유하는 그룹)이며, R1-COOH, R1-NH2및 R1-OH는 각각 광반응성 화합물이다.
[A] gag-O-(CO-R1) [1]
gag-OH + R1-COOH →에스테르 결합 →[1]
[B] gag-CO-(NH-R1) [2]
gag-COOH + R1-NH2→아미드 결합 →[2]
[C] gag-CO-(O-R1) [3]
gag-COOH + R1-OH →에스테르 결합 →[3]
[D] gag-O-R2a-R1[4]
R2a는 gag-OH와 반응할 수 있는 스페이서로부터 유도된 그룹(예 : HOOC-R3-COOH, HOOC-R3-NH2) 및 광반응성 화합물의 작용성 그룹과 반응할 수 있는 스페이서로부터 유도된 그룹이다.
R2b는 gag-COOH와 반응할 수 있는 스페이서로부터 유도된 그룹(예: HO-R3-COOH, HO-R3-OH, HO-R3-NH2, H2N-R3-NH2, H2N-R3-COOH) 및 광반응성 화합물의 작용성 그룹과 반응할 수 있는 스페이서로부터 유도된 그룹이다.
R3은 바람직하게는 다음 중의 하나이다:
R3a: -(CH2)n-(여기서, n은 1 내지 10이다);
R3b: -(CH2)pCHY-(여기서, Y는 COOH 또는 NH2이고, p는 1 내지 10이다);
R3c: -(CH2)m-C6H4-(CH2)ℓ-(여기서, m은 1 내지 10이고, ℓ은 1 내지 10이다).
상기예에서는 단지 하나의 스페이서만 사용되었지만, 다수의 스페이서를 사용할 수도 있다.
위에서 언급한 광반응성 화합물[F-1] 또는 [F-2]는 일반식[4b], [5b] 또는 [5h]의 생성물 제조시 R1-NH2대신에 사용될 수 있다.
원칙적으로, 광반응성 그룹인 R1은 사이클로부탄 환 형성하에 광노출시 적어도 분자간 및/또는 분자내 이량체화될 수 있으면 어떠한 그룹도 가능하다.
위의 각 일반식에서, -COOH는 하이드록실 또는 아미노 그룹과 반응할 수 있는 반응성 유도체(예: 할로겐화물, 산 무수물, 활성 에스테르)의 형태를 취할 수 있다.
일반식[1], [4c], [5c] 내지 [5f]에서 발견되는 R1-CO-의 특히 바람직한 예로서 다음 일반식[6], [7] 및 [8]의 그룹을 들 수 있다.
상기 식에서,
R4및 R5는 동일하거나 상이하며 각각 수소원자, 저급 알킬, 저급 알콕시, 니트로 또는 아미노 그룹이고,
R6는 수소, 할로겐 원자, 저급 알킬 또는 할로-저급 알킬 그룹이고,
R7은 수소, 할로겐 원자, 시아노, 카복실, 저급 알콕시카보닐, 저급 알킬 또는 할로-저급 알킬 그룹이고,
R8은 저급 알킬렌 그룹이고,
R9, R10및 R11은 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 수소원자 또는 저급 알킬 그룹이고,
R12는 저급 알킬렌 그룹이다.
위의 일반식[6] 내지 [8] 그룹이 일반식[2]에 따르는 R1a-CO-NH-R3-NH(여기서, R1a는 광반응성 그룹이다)에서 R1a-CO-로서 특히 바람직하고 일반식[5-1]에서 R1-CO-로서 바람직하고, R3a또는 R3b가 R3으로서 바람직하다. R3이 R3b인 경우, Y로는 COOH가 바람직하다.
일반식[3], [4a], [5a] 및 [5g]에서 R1-O-의 바람직한 예로서 다음 일반식 [9] 및 [10]의 잔기를 언급할 수 있다:
상기 식에서,
R13은 수소, 할로겐 원자, 저급 알킬 또는 할로-저급 알킬 그룹이고,
R11는 수소, 할로겐 원자, 시아노, 카복실, 저급 알콕시카보닐, 저급 알킬 또는 할로-저급 알킬 그룹이고,
R15는 저급 알킬렌 그룹이고,
R16및 R17은 동일하거나 상이하며, 각각 수소원자, 저급 알킬, 저급 알콕시, 니트로 또는 아미노 그룹이다.
또한, 예를 들면, 다음 구조식의 그룹이 R1의 구성원으로서 사용될 수 있다:
본 발명에 따르는 광경화성 GAG는 광노출시 분자간 이량체화될 수 있으며, 이때 광반응성 화합물의 분자에 함유된 광반응성 그룹(즉, 적어도 비닐 그룹을 함유하는 그룹)은 다음 반응성에 따라 짝을 이루어 사이클로부탄 환을 형성하여 바람직한 가교결합도의 2차원 또는 3차원 망상 구조를 갖는 상응하는 가교결합된 GAG를 제공한다. 또한, 광경화시 분자내 이량체화도 관련될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따라, 광반응성 화합물 및 GAG(예: 화학적 구조, 분자량 등) 및 광반응성 화합물의 함량(광반응성 화합물에 의한 치환도(DS))을 선택하거나 조절하여 의도하는 용도에 적합한 바람직한 가교결합도, 이에 따른 바람직한 물리적 특성(예: 기계적 구조 지지 특성, 수분 보유성, 친수성, 윤활성, 약제 방출 속도) 및 바람직한 생물학적 특성(예: 세포 유착성, 생분해성-흡수성, 생리학적 활성)을 갖는 생체적합한 광가교결합된 GAG를 제조할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치환도(DS)"는 GAG의 각각의 반복 디사카라이드 단위(각각의 단위는 우론산 및 헥소사민을 포함한다)에 결합한 광반응성 화합물 또는 그룹의 몰 수로 정의된다. 따라서, 예를 들어, 디사카라이드 단위 1개당 4개의 하이드록실 그룹(치환 가능한 하이드록실 그룹)을 갖는 히알루론산은, 모든 하이드록실 그룹이 광반응성 화합물 또는 그룹으로 개질되는 경우, DS가 4인 반면, 디사카라이드 단위 1개당 3개의 하이드록실 그룹을 갖는 콘드로이틴 설페이트는 광반응성 화합물 또는 그룹에 의해 개질되는 경우, DS가 3이다.
본원에서 사용되는 용어 "글리코사미노글리칸" 또는 "GAG"는 콜로민산, 히알루론산(HA), 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트(CS), 테이쿠론산, 더마탄 설페이트, 헤파린, 헤파란 설페이트, 케라토 설페이트(케라탄 설페이트), 케라토폴리설페이트 및 이들의 유도체(아실 유도체, 폴리설페이트, 탈황화 생성물, 탈아실화 생성물 등)를 포함한다. 용어 "저급"은 직쇄이거나 측쇄일 수 있는 탄소쇄가 1 내지 6개의 탄소로 구성됨을 의미한다. 용어 "할로겐 원자"는 염소, 브롬 및 요오드 원자를 포함하고 용어 "할로"는 하나 이상의 수소원자가 이들 할로겐에 의해 치환되었음을 나타내기 위해 사용된다.
일반식[1], [4c], [5-1], [5c] 내지 [5f]와 일반식[6]의 조합에서, R1CO-는, 예를 들어, 치환되거나 치환되지 않은 신남산 또는 이의 반응성 유도체로부터 유도된 잔기이다. 치환된 신남산 잔기로서는 벤젠환의 임의의 위치에 하나 또는 두 개의 저급 알킬, 저급 알콕시, 니트로 또는 아미노 그룹을 갖는 잔기들이 언급될 수 있다. 그러나, 신남산으로부터 유도된 R1CO-가 특히 바람직하다.
일반식[1], [4c], [5-1], [5c] 내지 [5f]와 일반식[7]의 조합에서, R1CO-는, 예를 들어, 위치 1에 치환체로서 카복시알킬 그룹을 갖는 우라실 유도체 또는 이의 반응성 유도체(이때, 피리미딘 환의 위치 5에는 R6으로 나타낸 수소 또는 할로겐 원자, 저급 알킬 또는 할로-저급 알킬 그룹을 갖고, 위치 6에는 R7로 나타낸 수소 또는 할로겐 원자, 시아노, 카복실, 저급 알콕시카보닐, 저급 알킬 또는 할로-저급 알킬 그룹을 갖고, 위치 1에는 gag의 하이드록실 그룹과 함께 에스테르 결합을 형성하고 카복시알킬 그룹으로부터 유도된 저급 알킬렌 그룹인 R8을 갖는다)로부터 유도된 잔기이다. 특히, 1-(2-카복시에틸)티민 유도된 R1CO-가 바람직하다.
일반식[1], [4c], [5-1], [5c] 내지 [5f]와 일반식[8]의 조합에서, R1CO-는, 예를 들어, 7-카복시알콕시 치환된 쿠마린 유도체 또는 이의 반응성 유도체(이때, 쿠마린 환의 위치 5, 6 및 8에는 각각 독립적으로, R9, R10및 R11로 나타낸 수소원자 또는 저급 알킬 그룹을 가지며, 위치 7에는 gag의 하이드록실 그룹과 함께 에스테르 결합을 형성하고 카복시알콕시 그룹으로부터 유도된 저급 알킬렌 그룹인 R12를 갖는다)로부터 유도된 잔기이다. 특히 바람직한 R1CO- 그룹은 7-쿠마릴옥시아세트산 유도된 그룹이다.
일반식[3], [4a], [5a], [5g]와 일반식[10]의 조합에서, R1O-는 1-하이드록시알킬 치환된 우라실 유도체 또는 이의 반응성 유도체(이때, 피리미딘 환의 위치 5에는 R13으로 나타낸 수소, 할로겐 원자, 또는 저급 알킬 또는 할로-저급 알킬 그룹을 갖고, 위치 6에는 R14로 나타낸 수소, 할로겐 원자, 또는 시아노, 카복실, 저급 알콕시카보닐, 저급 알킬 또는 할로-저급 알킬 그룹을 갖고, 위치 1에는 gag의 카복실 그룹과 함께 에스테르 결합을 형성하고 하이드록시알킬 그룹으로부터 유도된 저급 알킬렌 그룹인 R15를 갖는다)로부터 유도된 잔기이다.
일반식[3], [4a], [5a], [5g]와 일반식[11]의 조합에서, R1O-는, 예를 들면, 치환되거나 치환되지 않은 신나밀 알콜 또는 이의 반응성 유도체로부터 유도된 잔기이다. 치환된 신나밀 알콜 잔기는, 예를 들면, 벤젠 환의 임의의 위치에 한 개 또는 두 개의 저급 알킬, 저급 알콕시, 니트로 또는 아미노 그룹을 갖는 잔기이다.
[출발 화합물]
GAG
GAG는 기원 또는 분자량으로 제한되지 않는다. 의도되는 목적에 따라 선택된 GAG는 단독으로 또는 이들 두 개 이상의 혼합물의 형태로 사용된다. 천연 GAG(동물 기관의 추출물, 발효 생성물 등)가 일반적으로 사용되지만, 필요한 경우, 화학적으로 또는 효소적으로 합성된 GAG 또는 반합성 방법으로 합성된 GAG가 사용될 수도 있다. 작용성 그룹의 변형에 의해 이들로부터 유래된 생성물도 사용될 수 있다.
GAG는 광반응성 화합물과 그 자체로서 반응할 수 있으나, 일반적으로 알칼리금속(예: 나트륨, 칼륨 등), 알칼리 토금속(예: 마그네슘, 칼슘 등), 3급 아민(예: 트리-n-부틸아민, 트리에틸아민, 피리딘 등)과의 염의 형태로 사용된다.
GAG에 결합될 광반응성 화합물이 불수용성일때, 당해 광반응성 화합물을 GAG를 함유하는 유기 용매에 가해 반응을 수행시킨다.
GAG를 함유하는 유기 용매는, 예를 들어, GAG의 나트륨염의 수용액을 양이온 교환제로 처리하여 카복실 라디칼 또는 설페이트 라디칼을 형성시키고, 여기에 수혼화성 유기 용매[예를 들어, 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 헥사메틸-포스포르아미드(HMPA), 피리딘 등] 및 3급 아민(예를 들어, 트리-n-부틸아민)을 가하여 GAG의 아민염을 형성시킨 후, 증류시켜 물을 제거하여 제조할 수 있다.
광반응성 화합물이 수용성일때, 당해 광반응성 화합물을 GAG(예: 나트륨 염)의 수용액에 가하여 반응을 수행시킬 수 있다.
광반응성 화합물
위에서 언급한 바와 같이, GAG의 또는 GAG에 결합되거나 결합될 수 있는 스페이서의 -OH, -COOH 또는 -NH2와 같은 그룹과 함께 결합을 형성하는 광반응성 화합물은 -OH, -COOH 또는 -NH2와 같은 그룹을 갖는다.
(1) -COOH가 작용성 그룹인 경우:
광반응성 화합물은 일반식[1], [4c], [5-1], [5c], [5d], [5e] 및 [5f]에서와 같이 GAG 또는 에스테르 형성하의 스페이서 그룹에 결합되며, 예를 들어, OH 또는 할로겐이 일반식 [6] 내지 [8]의 그룹에 결합된 구조를 갖는 화합물, 즉 치환되거나 치환되지 않은 신남산, 1-카복시알킬 치환된 우라실 및 7-카복시알콕시 치환된 쿠마린(7-쿠마릴옥시 카복실산), 및 이의 반응성 유도체를 포함한다. 반응성 유도체로서는, 산 할라이드(예: 산 클로라이드 등) 및 산 무수물이 언급될 수 있다.
위에서 언급한 7-쿠마릴옥시 카복실산의 산 할라이드는 알칼리 존재하에 상응하는 임의로 치환된 7-하이드록시쿠마린을 할로-카복실산 에스테르와 축합시키고 생성된 7-쿠마릴옥시 카복실산 에스테르를 가수분해시켜 7-쿠마릴옥시 카복실산을 수득하거나, 상응하는 임의로 치환된 7-하이드록시쿠마린을 할로-카복실산과 축합시켜 7-쿠마릴옥시 카복실산을 수득하고 이렇게 수득된 일반식[8]에 상응하는 7-쿠마릴옥시 카복실산(이는 치환체 또는 치환체들을 임의로 가질 수 있다)을 티오닐 할라이드와 반응시킴으로써 합성될 수 있다(참조: JP-A-3-48674).
(2) -NH2가 작용성 그룹인 경우:
하기에 기재한 일반식[F]의 광반응성 화합물은 위에서 언급한 치환되거나 치환되지 않은 신남산, 1-카복시알킬 치환된 우라실 또는 7-카복시알콕시 치환된 쿠마린(7-쿠마릴옥시 카복실산) 또는 이의 반응성 유도체를 일반식[X-1]의 화합물 또는 3급-부톡시 카보닐 또는 벤질옥시카보닐과 같은 아미노 보호 그룹을 사용하여 아미노 그룹들 중의 하나를 보호하고 이어서, 필요한 경우, 탈보호하여 유도된 화합물[X-2]과 반응시킴으로써 수득될 수 있다.
H2N-R3-NH2[X-1]
RNH-R3-NH2[X-2]
H2N-R3-NH-CO-R1[F-1]
RNH-R3-NH-CO-R1[F-2]
(3) -OH가 작용성 그룹인 경우:
일반식[9]에 상응하는 반응성 유도체는 광반응성 화합물로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 피리미딘 환의 위치 1과 2 사이에 있는 사이클릭 에테르 화합물이 사용될 수 있다. 특정 예는 1,2-0-에타노우라실, 1,2-0-에타노티민, 1,2-0-에타노-5-클로로우라실, 1,2-0-에타노-5-트리클로로메틸우라실, 1,2-0-에타노-6-시아노우라실, 1,2-0-에타노-6-클로로메틸우라실 및 1,2-0-에타노-6-트리클로로메틸우라실이다.
또한, 일반식[10]에 상응하는 치환되거나 치환되지 않은 신나밀 알콜이 언급될 수 있다.
(4) 바람직한 광반응성 화합물
사용될 광반응성 화합물은 의도된 목적에 따라 위에서 언급한 화합물들 중에서 선택되어야 하지만, 가교결합된 GAG에서 미반응된 형태로 잔류하는 경우에 부작용을 최소화시킬 수 있는 화합물로부터 유도된 광반응성 화합물, 예를 들어, 신남산, 티민 및 쿠마린도 의학적 용도 측면에서 바람직하다.
본 발명의 실시에서, 광경화성 GAG는 동일한 GAG 분자에 결합되어 있거나 다수의 상이한 GAG 분자에 결합되어 있는 하나 이상의 광반응성 화합물을 포함한다. 이것은 또한 위의 일반식[1] 내지 [3]의 화합물에도 적용된다. 그러므로, 본 발명의 가교결합된 GAG는 이의 의미 내에서 이러한 광경화성 GAG의 광가교결합에 의해 수득된 생성물을 포함한다.
[반응(광반응성 그룹의 도입)]
(1) gag-OH를 사용한 에스테르화 반응
GAG의 적당한 3급 아민염(예: 트리-n-부틸아민염, 트리에틸아민염, 피리딘염 등)을 적당한 용매(예: DMF, 피리딘, DMSO, HMPA 등)에 용해시키고 GAG의 하이드록실 그룹을 염기성 촉매(예: 무수 피리딘 등)의 존재하에서 일반식[6]의 부분 구조를 갖는 치환되거나 치환되지 않은 신남산(GAG의 하이드록실 그룹 1mol당 0.5 내지 5mol의 양으로) 또는 이의 반응성 유도체, 예를 들면, 산 할라이드 또는 염기성 촉매(예: 2-클로로-1-메틸 피리디늄 요오다이드, 피리딘 등)의 존재하에서 일반식[7] 또는 [8]의 부분 구조를 갖는 R1COOH 또는 이의 반응성 유도체와 0 내지 100℃에서, 바람직하게는 70 내지 90℃에서 수십분 내지 수십 시간, 바람직하게는 1 내지 10시간 동안 에스테르화 반응시켜 본 발명의 광경화성 GAG를 수득한다.
각 광경화성 GAG에서의 치환도(DS)는 반응 조건을 조절함으로써 목적하는 바대로 조정할 수 있다. 예를 들면, DS는 출발 GAG에 대한 R1COOH 또는 이의 반응성 유도체의 몰비를 증가시키고/시키거나 반응시간을 연장시킴으로써 증가시킬 수 있다.
반응 후, 예를 들어, 나트륨 아세테이트 포화된 에탄올, 에탄올 또는 메탄올을 반응 혼합물에 가하고, 생성된 침전물을 여과로 수집하고, 에탄올 또는 메탄올로 세척한 다음, 감압하에서 건조시킴으로써 목적 생성물을 백색 분말의 형태로 수득할 수 있다.
일반식[5c] 또는 [5e]의 화합물을 제조하기 위한 반응은 앞에서 언급한 바와 거의 동일한 방법으로 수행할 수 있다.
이렇게 수득할 수 있는 광경화성 GAG(이때, 각 디사카라이드 단위는 한 분자의 광반응성 화합물로 치환되어 있다)의 특정 예는 하기 구조식의 단위로 알 수 있다. 구조적으로 상이한 빌딩(building) 단위, 예를 들면, 이에 결합되는 광반응성 그룹의 수 및/또는 이의 결합 위치가 상이한 단위가 같은 종류 및 동일한 분자에서 나타날 수 있다.
1) 신남산의 히알루론산으로의 도입으로부터 생성된 광경화성 GAG(HA-Cin)
2) 1-(2-카복시에틸)티민의 히알루론산으로의 도입으로부터 생성된 광경화성 GAG(HA-Thym)
3) 7-쿠마릴옥시아세트산의 콘드로이틴 설페이트로의 도입으로부터 생성된 광경화성 GAG
(2) gag-COOH를 사용한 아미드화[특히, 광반응성 화합물이 스페이서 그룹에 결합되는 경우];
비교: 일반식[5-1]의 화합물
(2-1): R3가 R3a인 경우
일반식[X-1] 또는 [X-2]의 화합물이 알킬렌디아민(예: 에틸렌디아민)인 경우, GAG의 적당한 3급 아민염(예: 트리-n-부틸아민염, 트리에틸아민염, 피리딘염 등)을 적당한 용매(예: DMF, 피리딘, DMSO, HMPA 등)에 앞의 방법(1)에서와 같이 용해시킨 후, GAG의 카복실 그룹의 수에 비해 약간 과몰수의 하이드록시 화합물(예: N-하이드록시석신이미드, N-하이드록시프탈이미드 등) 및 축합제(예: 디사이클로헥실카보디이미드, 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)카보디이미드 등)를 가하고 반응을 0 내지 50℃에서 1 내지 20시간 동안 수행시켜 카복실 그룹에서 활성화된 개질된 GAG를 수득한다. 그 다음, 이렇게 개질된 GAG 및 일반식[F-1] 또는 [F-2]의 화합물의 아미노 그룹을 0 내지 50℃에서 30분 내지 20시간 동안 아미드화 반응시켜 광경화성 GAG를 수득한다.
또한, 광경화성 GAG는 GAG의 수용액을 사용하고 일반식[F-1] 또는 [F-2]의 화합물의 아미노 그룹과 GAG의 카복실 그룹을 축합제(예: 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)카보디이미드와 같은 수용성 카보디이미드)의 존재하에 0 내지 50℃에서 아미드화 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
(2-2): R3이 R3b인 경우(Y=COOH):
일반식[F-1] 또는 [F-2]의 화합물이, 예를 들어, 염기성 아미노산(예: L-리신)인 경우, GAG는 수용액의 형태로 사용하며 일반식[F-1] 또는 [F-2]의 화합물의 아미노 그룹과 GAG의 카복실 그룹을 축합제[예: 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)-카보디이미드와 같은 수용성 카보디이미드]의 존재하에 0 내지 50℃에서 아미드화 반응시켜 광경화성 GAG를 수득한다.
또한, 광경화성 GAG는 방법 (2-1)에서와 같이 적당한 3급 아민염 형태의 GAG를 디사이클로헥실카보디이미드와 같은 축합제의 존재하에 DMF와 같은 적당한 용매속에서 하이드록시 화합물(예: N-하이드록시석신이미드)과 반응시키고 카복실 그룹에서 활성화된 생성된 GAG를 일반식[F-1] 또는 [F-2]의 화합물의 아미노 그룹과 아미드화 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
일반식[2], [4b], [5b] 또는 [5h]와 관련된 반응은 앞에서 언급한 바와 거의 동일한 방법으로 수행할 수 있다.
(3) gag-COOH를 사용한 에스테르화
앞에서 언급한 방법(1)에서와 같이, GAG의 적당한 3급 아민염(예: 트리-n-부틸아민염, 트리에틸아민염, 피리딘염 등)을 적당한 용매(예: DMF, 피리딘, DMSO, HMPA 등)에 용해시키고 일반식[9]의 우라실 유도체의 반응성 유도체, 예를 들어, 사이클릭 에테르 화합물 또는 일반식[10]의 치환되거나 치환되지 않은 신나밀 알콜 또는 이의 반응성 유도체 및 GAG의 카복실 그룹을 염기성 촉매(예: 무수 피리딘 등)의 존재하에 0 내지 100℃에서 에스테르화 반응시킨다.
일반식[4a], [5a] 또는 [5g]와 관련된 반응은 필수적으로 앞에서 언급한 바와 거의 동일한 방법으로 수행할 수 있다.
[광경화성 GAG의 분리 및 정제]
위의 반응 후, 형성된 광경화성 GAG는 특별한 제한없이, GAG의 분리 및 정제에 일반적으로 사용되는 방법에 의해 분리하고 정제할 수 있다.
따라서, 예를 들면, 광경화성 GAG, 즉 목적 생성물은 미반응된 GAG 또는 미반응된 광반응성 화합물로부터 분리할 수 있고 음이온 또는 양이온 교환제를 사용하는 크로마토그래피, 유기 용매 속에서의 용해도 차이를 이용하는 방법(예: 알콜 침전법), 염석 또는 투석과 같은 방법에 의해 정제할 수 있다.
당해 기술분야에 공지되어 있는 가교결합된 글리코사미노글리칸은 겔 또는 고체로서 존재하므로 미반응된 물질, 촉매, 오염성 미생물, 발열물질 및 기타 불순물을 이러한 글리코사미노글리칸으로부터 거의 제거할 수 없는 반면, 본 발명의 광경화성 GAG는 물 및/또는 유기 용매에 가용성이므로 용이하게 정제할 수 있다. 이렇게 정제된 광경화성 GAG는, 광 노출시, 광반응성 그룹의 분자내 또는 분자간 이량체 반응을 수행할 수 있으므로, 미반응된 물질, 촉매, 오염성 미생물, 발열물질 등으로 최소한도로 오염된, 가교결합된 GAG를 용이하게 제조할 수 있다.
[광경화성 GAG의 물리적 특성]
앞에서 언급한 방법으로 합성되고 정제된 광경화성 GAG의 물리적 특성은 출발물질로서 사용된 GAG, 이의 분자량, 사용된 광반응성 화합물, 이의 양 및 기타 인자에 따라 변할 수 있으며, 의도하는 목적에 적합할 수 있도록 목적하는대로 조정할 수 있다. 일반적으로, 이들은 분자량 범위가 4,000 내지 2,000,000, 바람직하게는 10,000 내지 1,000,000이고 광반응성 그룹에 의한 치환도(DS) 범위가 0.1 내지 4.0, 바람직하게는 0.1 내지 3.0이며 물 및/또는 유기 용매에 가용성이다. 용해도는 목적하는대로 조절될 수 있다. 일반적으로, DS의 증가는 물에서의 용해도는 감소시키지만 DMF와 같은 유기 용매에서의 용해도는 증가시킨다. 광반응성 그룹이 일반식[6]의 신남산 유도체, 일반식[8]의 7-쿠마릴옥시 카복실산 또는 일반식[11]의 신나밀 알콜 유도체인 경우, 수득된 광경화성 GAG는 비교적 소수성이다. 이와는 반대로, 광반응성 그룹이 일반식[7] 또는 [10]의 우라실 유도체(특히 티민 유도체)인 경우, 생성된 광경화성 GAG는 비교적 친수성이다.
바람직한 DS의 범위는 광경화성 GAG와 가교결합된 GAG의 의도된 용도 및 사용된 GAG 및 광반응성 화합물에 따라 변할 수 있다. 세포에 비유착성인 가교결합된 GAG를 생성하고 이를 조직 비유착성 물질로서 이용하기 위해, 예를 들면, DS는 바람직하게는 히알루론산-신남산 에스테르(HA-Cin)의 경우 약 0.1 내지 0.5, 콘드로이틴 설페이트-신남산 에스테르(CS-Cin)의 경우 약 0.1 내지 3.0, 히알루론산-티민 유도체 에스테르(HA-Thym)의 경우 약 0.2 내지 1.0, 콘드로이틴 설페이트-티민 유도체 에스테르(CS- Thym)의 경우 약 0.2 내지 1.0이어야 한다. 생물학적 물질, 즉 약제 등을 가교결합된 GAG의 3차원 망상 구조에 봉입하여 이의 서방형을 수득하기 위해서는, 1.0 내지 2.5의 DS가 앞에서 언급된 가교결합된 GAG 각각에 대해 바람직하다.
더욱 특히, 광경화성 GAG가 일반식[1]의 광경화성 히알루론산 유도체인 경우, 분자량 범위는 바람직하게는 100,000 내지 1,000,000이고 광반응성 화합물에 의한 치환도(DS) 범위는 바람직하게는 0.1 내지 3.0이다. 광경화성 GAG가 일반식[1]의 광경화성 콘드로이틴 설페이트 유도체인 경우, 분자량 범위는 바람직하게는 10,000 내지 60,000이며 DS 범위는 0.1 내지 3.0이다.
의학용 물질로서 사용되는 경우, 광경화성 GAG 및 가교결합된 GAG는 어떤 형태라도 될 수 있다. 따라서, 이들은 다양한 형태, 예를 들면, 용액, 겔, 고체 등으로 사용할 수 있다. 이러한 광경화성 GAG 또는 가교결합된 GAG를 기본으로 하는 본 발명의 의학용 물질은, 경우에 따라, 다양한 용매(예: 물, 완충액, PBS, DMF, DMSO 등), 담체(예: 거어즈, 니트, 직물, 부직포, 속 또는 면 유사 물질, 필라멘트 또는 얀(yarn), 필름, 다공성 스폰지, 고무, 플라스틱, 금속, 인공 기관, 생체 조직 표면, 결각 또는 생체의 상처 부위), 생물학적 물질(예: 콜라겐, 젤라틴, 헤파린, 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산, 더마탄 설페이트 등), 약제 물질 등을 함유할 수 있다.
[광경화성 GAG의 성형(용매를 이용한 주형) 등]
의학용 물질로서 사용하기 위해, 광경화성 GAG를 특정 형태(필름형, 관상형, 입자형)로 성형하거나 담체로 위에서 기술한 기타 물질 또는 재료에 적용하거나 피복하거나 부착시키거나 봉입할 수 있다. 이러한 경우, 광경화성 GAG는 물(바람직하게는 정제수), 완충액(예: 인삼염 완충액, 탄산염 완충액) 또는 의학적으로 허용되는 등급의 유기 용매(예: DMF, DMSO)에 용해시키고, 당해 용액을 평판 플레이트 위에 분무하거나, 유리, 석영, 폴리비닐클로라이드, 폴리스티렌, 폴리우레탄 등으로 제조된 용기 등에 넣거나 그 표면에 분무하고, 통기 또는 특정 기타 방법으로 건조시켜 두께가 1㎛ 내지 1mm로 되도록 함으로써, 광반응에 선행하여 성형시킬 수 있다.
[가교결합된 GAG의 생성(광반응)]
광가교결합된 GAG는 위의 방법으로 성형되거나 용액 형태인 광경화성 GAG를 광가교결합용 광선(ray) 또는 방사선에 노출시킴으로써 광이량체화 반응을 유도하여 생성시킬 수 있다. 사용된 파장 또는 파장 범위는 광반응성 그룹의 성질에 따라 변할 수 있지만, 일반적으로 약 260 내지 400nm이다. 더욱 특히, 고압 수은 램프(450W)로부터의 광선은, 예를 들면, 260 내지 270nm로 차단되는 보다 짧은 파장의 광선과 함께 노출(조사)에 사용할 수 있다. 요구되는 노출(반응)기간은 파장범위, 온도 및 광원으로부터의 거리와 같은 인자에 좌우되지만, 반응이 30분내에 완결될 수 있도록 하는 조건이 바람직하다. 겔화(경화)는 광반응시 광경화성 GAG의 농도를 조정함으로써 조절할 수 있다. 일반적으로, 이러한 농도는 1 내지 30%, 바람직하게는 약 2 내지 20%이다.
광경화성 GAG의 광반응으로부터 생성된 이량체 구조의 특정 예는 다음과 같다.
1) 광반응성 화합물이 신남산인 경우:
2) 광반응성 화합물이 1-(2-카복시에틸)티미인 경우:
3) 광반응성 화합물이 7-쿠마릴옥시아세트산인 경우:
[가교결합된 GAG의 물리적 특성]
이렇게 제조된 본 발명의 가교결합된 GAG의 물리적 특성은 GAG의 성질, 광반응성 그룹(화합물)의 성질, 광경화성 GAG의 농도, 광반응성 화합물에 의한 치환도(DS), 가교결합도 및 광반응 시간과 같은 인자들에 의해 조절될 수 있다. 그러나, 일반적으로 이러한 물리적 특성은 특정 범위(0.1 내지 200) 내에서의 팽윤능[=(팽윤 상태의 중량-건조 상태의 중량)/건조 상태의 중량]을 나타내므로 특정 범위내의 양의 물을 포함하고 보유할 수 있다.
광반응성 그룹(화합물)에 의한 DS 및 가교결합도가 증가함에 따라 팽윤능은 감소한다.
이들은 또한 특정 범위(10 내지 100°)내의 물과의 접촉각을 나타낸다. 접촉각은 가교결합된 GAG 표면의 소수성/친수성을 반영한다. 광반응성 그룹의 가교결합(이량체화) 속도가 증가되면 접촉각이 증가한다. 즉, 소수성이 증가한다.
위에서 언급한 광반응성 그룹이 이량체화되는 비율인 가교결합도(%)는 DS를 증가시킴으로써 증가시킬 수 있다. 이것은 광반응을 조절함으로써 추가로 조절할 수 있다.
따라서, 가교결합된 GAG의 생물학적 작용은 가교결합도를 변화시킴으로써 조절될 수 있다. 예를 들면, 내피 세포와 같은 세포는 높은 가교결합도를 나타내는 가교결합된 GAG에 부착되는 경향이 있지만, 이러한 경향은 GAG 및 광반응성 화합물의 특성에 따라 상이할 수 있다. 이러한 경향은 설페이트 그룹(참조: 실시예 부분에서 언급된 광 그룹들)을 함유하지 않는 히알루론산을 사용하는 경우는 현저하지만, 설페이트를 함유하는 GAG(예를 들면, 콘드로이틴 설페이트)를 사용하는 경우는 경미하다. 이러한 관점에서, 2개 이상의 GAG를 조합하여 사용함으로써 세포 유착을 촉진하거나 억제할 수 있다. 또한, 이러한 특성은 GAG 및 광반응성 그룹을 선택하고 DS 및/또는 가교결합도를 조절함으로써 제조된 세포 유착 경향이 상이한, 상이하게 가교결합된 GAG로 내막과 외막을 피복함으로써 인공 혈관의 내막(최내부 피복)과 외막을 기능상 상이하게 하기 위해 이용할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 내막을 세포에 대해 비유착성으로 만듦으로써 혈전증을 예방하는 한편, 외막을 세포에 대해 유착성으로 만듦으로써 섬유아세포가 이에 부착되도록 할 수 있고 혈액에 대해 불침투성으로 만들 수 있다.
[의학용 물질로서 적용]
본 발명의 광경화성 GAG 및 가교결합된 GAG는 전술된 바와 같이 인공 혈관의 내막 및 외막을 구성하는 물질 뿐만 아니라 인공 피부, 조직 비유착성 필름 또는 물질, 상처 치료 촉진 물질, 하이브리드 인공 장기, 인공 세포외 세포간질 및 인공기초막 등을 구성하는 물질을 포함하는 의학용 물질로서 사용할 수 있다. 또한, 광경화성 GAG를 생리적으로 활성인 물질(예: 헤파린, 더마탄 설페이트, 헤파란 설페이트, 항암제, 항염증제, 시토킨, 호르몬, 성장 인자, 또는 조직 플라스미노겐 활성화제, 과산화물 디스무타제 또는 우로키나제 등의 효소)과 혼합하고 용액 자체 또는 이로부터 수득한 성형물을 가교 결합을 위해 광반응시킴으로써 약제 봉입이 가능하다. 따라서, 광경화성 GAG 및 가교결합된 GAG를 또한 여기에 봉입된 약제의 방출을 조절하기 위한 담체로서 사용할 수 있다.
전형적인 특정 적용이 다음에 더욱 구체적으로 언급된다.
[비유착성 물질]
외과적 상처의 목적하지 않은 유착을 방지하고 회복을 촉진하기 위한 비유착성 물질로서 본 발명의 가교결합된 GAG를 사용할 수 있다. 예를 들면, 가교결합된 GAG 필름을 사용하여 복부벽 및 복강내 기관 또는 기관들(예를 들면, 간 등)을 당해 필름으로 피복하여 복막 병변(결손)을 보호함으로써 유착을 방지하고 상처 치료를 촉진할 수 있다. 이러한 필름은 상처 치료 속도에 따라 분해되고 흡수될 수 있다.
용액형의 광경화성 GAG는 용액을 상처 부위에 주입시키거나 용액을 상처 부위 표면에 도포한 다음, 광을 조사하여 생체내에서 가교결합된 필름 또는 막을 형성시킴으로써 전술한 바와 동일한 목적으로 사용할 수 있다. 특히, 위의 방법을 사용함으로써 내시경 수술에서 유착을 방지하고/하거나 결손을 채울 수 있다.
비츄착성 물질로서 이를 사용하기 위해서, 가교결합된 GAG(생체내 가교결합된 GAG를 포함)는 바람직하게는 필름 균열을 피하고 조직(세포) 유착에 내성인 강도 수준이어야 하고 상처 치유 속도와 비례하여 생분해성이어야 하며, 생분해성 생성물은 생체에 의해 흡수되는 경우 실질적으로 비독성이어야 한다. 상기 작용은 광경화성 GAG(GAG 종 및 광반응성 화합물, 및 DS의 선택) 및 조사 조건(예를 들면, 광원으로부터의 거리, 광원의 종류, 강도, 필름 두께 등)을 선택함으로써 조절할 수 있다.
[약제 방출 조절]
본 발명의 가교결합된 GAG를 3차원 망상 구조로서 약제의 방출을 조절하기 위해 약제 봉입용 물질(캐리어 또는 담체)로서 사용할 수 있다. 따라서, 봉입되거나 포함된 약제를 약제가 방출되는 환경에서 필요한 특정 범위내에서 약제 농도를 유지시키면서 약제의 특성 및 적용 방식에 부합하는 기간 동안 방출시킬 수 있다.
광경화성 GAG(GAG 종 및 광 경화성 그룹, 및 DS의 선택) 및 조사 조건(예를 들면, 노출 시간, 광원으로부터의 거리, 광원의 와트수)을 선택함으로써 약제 방출 속도를 제어할 수 있다. 이러한 경우, 방출 속도는 일반적으로 약제의 분자량 및 약제와 가교결합된 GAG 사이의 정전기 인력이 증가함에 따라 감소하지만, 상기 속도는 [분자량, 전기적으로 하전된 상태(친수성 및 소수성 정도)로 볼때] 이의 각각의 화학 구조면에서 약제와의 배합물로 된 위에 언급한 광경화성 GAG를 선택함으로써 목적하는 수준으로 조절할 수 있다.
본 발명의 이러한 양태에 있어서, 약제는 온화한 조건하에서 부동화됨으로써, 특히 약제 분해 및 활성 손실이 선행 기술 분야와 비교하여 방지되는 상태로 안정화된다.
가교결합된 GAG 및 여기에 봉입된 약제를 각각 함유하는 약제 방출 조절용 물질 또는 제제는 약제의 특성 및 적용 방식에 따라 목적하는 임의의 형태로 가공할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 이들을 필름(필름제, 피복제), 젤리제, 겔제, 크림제, 현탁제, 미세 켑슐제, 정제, 입제, 산제 등으로 가공할 수 있다. 또한, 지지체(예를 들면, 거어즈, 드레싱 물질, 편물, 직물, 제지, 면, 부직포, 필름, 다공성 스폰지)를 광경화성 GAG와 약제를 함유하는 조성물과 함께 침지시키거나 당해 조성물을 이러한 지지체에 적용시킨 다음, 조사하여 가교결합된 GAG로 전환시킴으로써 적용할 준비가 된 광경화성 GAG를 제조할 수 있다. 또한, 광경화성 GAG와 약제를 함유하는 조성물을 인공 장기(예를 들면, 인공 혈관, 인공 심장)와 같은 구조물의 표면 또는 내부에 적용한 다음, 경화(가교결합)시킬 수 있다.
약제를 본 발명의 가교결합된 GAG에 봉입시키기 위해, 약 0.001 내지 80%의 약제 농도에 상응하는 광경화성 GAG를, 예를 들면, 약 1 내지 30중량% 함유하는 수용액 또는 유기 용매(예를 들면, DMF) 용액에 약제를 용해시키거나 현탁시키고, 필요에 따라, 다양한 첨가제를 첨가한 후, 수득한 조성물을 성형시키고, 건조시킨 다음, 광으로 조사시킨다. 가교결합시킨 후, 성형물을 그 자체로 사용하거나, 필요에 따라, 분쇄시켜 고체, 반고체 또는 현탁제 형태로 된 약제 방출 조절용 물질을 수득한다.
본 발명의 약제 방출 조절용 물질을 약제학적 제제로서 사용할 수 있다. 이러한 경우, 약제 함유 가교결합된 GAG를 그 자체로 가공하거나, 방부제, 안정화제, 국부 마취제, 분산제, 성형 개질제, 가용화제 등과 같은 통상의 약제학적으로 허용되는 첨가제와 함께 목적하는 투여형으로 가공할 수 있다. 예를 들면, 평균 입자 크기를 약 0.5 내지 40㎛로 조절한 후, 약제 함유 가교결합된 GAG를 사용하여 분산제{예를 들면, Tween 80, HC060[제조원: 니폰 케미칼스(Nippon Chemicals)], 카복시 메틸셀룰로오스, 나트륨 알기네이트, 등}, 방부제(예를 들면, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤질 알콜, 클로로부탄올 등), 등장화제(예를 들면, 염화나트륨, 글리세롤, 솔비톨, 글루코스 등) 및, 필요에 따라, 기타 첨가제와 함께 수성 현탁액을 제형시키거나 이들을 올리브유, 호마유, 낙화생유, 면실유 또는 옥수수 기름과 같은 식물성 오일 속에 또는 프로필렌 글리콜 등 속에 분산시킴으로써 유지성 현탁액을 제조하기 위해 사용할 수 있다. 압축 성형시켜 정제를 제조하거나 산제, 입제 등을 제조하기 위해 약제 함유 가교결합된 GAG를 또한 그 자체로 사용하거나 부형제(예를 들면, 전분, 탄산칼슘 등), 결합제(예를 들면, 전분, 아라비아 고무, 카복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필셀룰로오스 등), 윤활제(예를 들면, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜 6000 등) 등과 혼합하여 사용할 수 있다. 캡슐제, 산제 또는 입제 내로 충전할 경우, 약제 함유 캡슐제를 수득한다. 또한, 약제 함유 가교결합된 GAG를 그 자체로 성형하거나 필름으로 성형시키거나, 특정한 기타 지지체 위에서 부동화시킴으로써 경피 흡수, 안과용 제제(예를 들면, 각막 상처 치료 촉진제), 생체내 봉입용 제제, 또는 신체 강내 주입제(예를 들면, 좌제)를 제공한다. 이들은 특히 상처 드레싱, 약제 방출 패취(예를 들면, 부착 테이프) 및 피임 용구 등으로서 사용될 수 있다.
약제 함유 가교결합된 GAG를 포함하는 약제학적 제제의 제형에 사용하기 위한 약제는 특정한 종으로 제한되지는 않지만 유효한 혈액 농도 또는 유효한 국부 농도를 수득하기 위해 자주 투여되어야 할 필요가 있는 약제일 수 있고, 단 이들은 가교결합된 GAG의 망상 구조물 속에서 충분히 유지되고 조절된 방식으로 방출될 수 있다. 다음 약제를 구체적인 예로서 언급할 수 있다.
1. 인도메타신, 메페남산, 아세메타신, 알클로페낙, 이부프로펜, 티아르아미드 하이드로클로라이드, 펜부펜, 메피리졸, 살리실산 등과 같은 해열 진통 소염제;
2. 메토트렉세이트, 플루오로우라실, 빈크리스틴 설페이트, 미토마이신 C, 악티노마이신 C, 다우노루비신 하이드로클로라이드 등과 같은 항암제;
3. 아세글루타미드 알루미늄, L-글루타민, p-(트란스-4-아미노메틸사이클로헥산카보닐)페닐프로피온산 하이드로클로라이드, 세트락세이트 하이드로클로라이드, 설피리드, 게파르네이트, 시메티딘 등과 같은 항궤양제;
4. 키모트립신, 스트렙토키나제, 리소자임 클로라이드, 브로멜라인, 우로키나제, 조직 플라스미노겐 활성화제 등과 같은 효소 제제;
5. 클로니딘 하이드로클로라이드, 부니트롤올 하이드로클로라이드, 프라조신 하이드로클로라이드, 캅토프릴, 베타니딘 설페이트, 메토프롤올 타르트레이트, 메틸도파 등과 같은 혈압강하제;
6. 플라복세이트 하이드로클로라이드와 같은 비뇨기 치료제;
7. 헤파린, 헤파린 설페이트, 트롬보모듈린, 디쿠마롤, 와르파린 등과 같은 항응고제;
8. 클로피브레이트, 심피브레이트, 엘라스타제, 니코몰 등과 같은 항동맥경화제;
9. 니카르디핀 하이드로클로라이드, 니모디핀 하이드로클로라이드, 시토크롬 C. 토코페롤 니코티네이트 등과 같은 순환기 치료제;
10. 하이드로코르티손, 프레드니솔론, 덱사메타손, 베타메타손 등과 같은 스테로이드;
11. 성장인자, 콜라겐 등과 같은 상처 치료 촉진제[참조 JP-A 제(소)60-222425호].
또한, 생리학적으로 할성인 폴리펩티드, 호르몬, 항결핵제, 혈액 수렴 지혈제, 당뇨병 치료제, 혈관확장제, 항부정맥제, 심장제, 항알레르기제, 항우울제, 항간질제, 근육 이완제, 항기침성 거담제, 항생제 등을 언급할 수 있다.
본 발명의 약제 방출 조절용 물질을 또한 인공 장기(예를 들면, 인공 혈관, 인공 심장 등)와 같은 구조 성분(예를 들면, 표면)을 제조하기 위한 의학적 물질로서 사용할 수 있다. 이러한 경우, 이들은 특히 혈액과 접촉하는 표면을 구성하는 의학용 물질로서 유용하며, 이 경우에 항응고제(예를 들면, 헤파린, 헤파란 설페이트, 트롬보모듈린), 섬유소융해 활성화제(예를 들면, 조직 플라스미노겐 활성화제, 우로키나제) 및/또는 항혈소판 물질을, 상기 물질을 조절 방출시키고 표면을 항혈전성으로 만들기 위해 가교결합된 GAG내에 봉입시킬 수 있다.
[인공 세포외 세포간질 및 인공 기초막]
본 발명의 광경화성 GAG는 콜라겐, 젤라틴 및 피브로넥틴과 같은 세포 유착성 단백질과 혼합하거나 이에 단백질을 화학적으로 결합시킨 후 세포(내피 세포, 상피 세포, 평활근 세포 등) 유착 및 성장을 허용하기 위한 인공 세포외 기초막 또는 인공 세포외 세포간질로서 이용될 수 있는 가교결합된 GAG로 전환시킬 수 있다[참조: JP-A 제(평)1-124465, 제(소)61-128974 및 제(소)62-270162]. 이들은 하이브리드형 인공 장기(인공 혈관, 인공 피부 등)로서 사용될 수 있다.
다음 실시예는 본 발명을 추가로 예시하는 것이며 본 발명이 이의 범주로 제한되는 것은 아니다.
실시예에서, 전술한 장치를 사용하여 하기에서 언급하는 방법에 의해 전형적인 물리적 특성 및 생물학적 작용을 측정하고 평가한다.
JOEL JNM-JX270 FTNMR 분광광도계를 사용하여1H NMR 스펙트럼을 측정하고, 자스코 우베스트(JASCO Ubest)-30UV/VIS 분광광도계를 사용하여 UV/VIS 스펙트럼을 측정한다.
각각의 광 반응성 화합물에 대한 치환도(DS)를1H NMR 또는 UV 데이타를 기본으로 하여 계산한다. 이것은 또한 저분자량 모델 화합물(GAG 분해 생성물)에 대한 UV 흡수 데이타와 이에 결합된 광반응성 화합물을 비교함으로써 결정된다.
각각의 가교결합된 GAG 유도체의 팽윤능을 다음과 같이 결정한다:
팽윤능 = [Wg(팽윤)-Wg(건조)]/Wg(건조)
상기 식에서,
Wg(건조)는 광 조사에 의해 제조된 건조 가교결합된 GAG 필름의 중량이고
Wg(팽윤)는 정제수 속에서 24시간 동안 침지시킨 후의 필름의 중량이다.
접촉각에 있어서, 접촉각 촉각계[정적 쿄와(Kyowa) 접촉각 측정기 CA-D, 교와가이멘가가쿠가부시키가이샤(Kyowa Kaimen Kagaku K.K.)[를 사용하여 액체 낙하 방법에 의해 전진 접촉각 및 후진 접촉각을 측정한다. 용어 "접촉각"을 그 자체로 사용할 경우, 이는 일반적으로 "전진 접촉각"을 의미한다.
내피 세포 유착 실험을 다음과 같이 수행한다. 각각의 광경화성 GAG를 용매로부터 주형시킴으로써 필름으로 제조하고, 당해 필름을 폴리스티렌(TCPS)으로 제조된 조직 배양 접시의 저부에서 부동화시킨다. 여기에 멸균 조건하에서 소의 대동맥 유도된 내피 세포를 접종시킨다. 사용된 배지는 10 내지 15% 태아 송아지 혈청(FCS)으로 보충된 둘베코(Dulbecco's) 개질된 이글(Eagle) 배지이다. 37℃에서 배양한지 24시간 후 상 대비 현미경하에 관측함으로써 세포 유착이 발생했는지의 여부를 판정한다. 세포 증식 판정을 위해, 1일 내지 2일 후의 증식 속도를 사용한다.
[실시예 1]
히알루론산-신남산 에스테르의 제조 및 이의 광반응에 의해 가교결합된 히알루론산의 제조
(1) 히알루론산-신남산 에스테르의 제조
무수 피리딘(30ml)을 디메틸포름아미드(DMF)(150mg/35ml) 중의 히알루론산(분자량 880,000) 트리-n-부틸아민염의 용액에 가한 다음, 실온에서 격렬하게 교반하면서 신나모일 클로라이드 26.64mg을 첨가한다. 75℃에서 2시간 동안 에스테르화시킨 다음, 나트륨 아세테이트로 포화된 에탄올을 반응 혼합물에 가하고, 생성된 침전물을 수집하고 미반응된 신나모일 클로라이드를 제거하기 위해 에탄올로 완전히 세척하여 히알루론산의 신남산 에스테르를 수득한다.
분획: HA-Cin-3
수율: 95.6mg
결합된 신남산: 11.0중량%(1H NMR 스펙트럼을 기본으로 함)
DS: 0.50
당해 생성물의1H NMR 스펙트럼을 제1도에 나타낸다. 전형적인 특징적인 흡수는 다음과 같다:
6 내지 8ppm: 신남산 벤젠 환과 신남산 이중 결합의 양성자에 기인함;
2ppm: 히알루론산 N-아세틸 그룹의 메틸 양성자에 기인함.
상기 양성자의 수의 비를 계산하고 위에 제공되어 있는 결합된 신남산의 양 및 DS를 결정하기 위해 이를 사용한다.
(2) 경화된(가교결합된) 히알루론산 필름의 제조
DMF 중의 분획 HA-Cin-3 30mg의 용액을 슬라이드 글라스(24mm × 24mm) 위에 배치하고 40℃로 가온시킨 멸균 공기를 사용하여 건조시킨다. 형성된 필름을 270nm 이하의 파장을 차단하기 위해 사용되는 파이렉스 피복된 물 여과기를 통해 450W 고압 수은 램프 조사에 노출시킨다. 이렇게 하여 경화된(즉, 가교결합된) 히알루론산 필름을 수득한다.
조사시 279nm에서 흡수 피이크는 감쇠된다(제2도).
감쇠율(%)이 일정할 경우 조사를 중지한다(조사 기간: 30분).
분획: HA-Cin-3-2
[실시예 2]
히알루론산과 신남산 간의 양의 비(히알루론산의 양은 항상 150mg이다)를 다음 표 1에서 제시한 바와 같이 변화시키는 점을 제외하고는 실시예 1에서 사용된 것과 동일한 물질 및 방법을 사용하여 히알루론산-신남산 에스테르를 제조한다. 또한, 경화된(가교결합된) 히알루론산 필름을 실시예 1의 방법으로 제조한다.
[표 1]
[실시예 3]
경화된 히알루론산 필름의 접촉각
실시예 1 및 2에서 수득한 각각의 경화된 히알루론산 필름을 전진 접촉각과 후진 접촉각에 대해 측정한다. 결과를 제3도에 나타낸다. 신남산 잔기에 의한 DS가 증가함에 따라 두 접촉각은 명백하게 증가한다.
접촉각의 증가는 필름 표면의 소수성의 증가를 반영한다.
[실시예 4]
경화된 히알루론산 필름의 팽윤능 평가
실시예 1 및 2에서 수득한 각각의 경화된 히알루론산 필름을 정제수 속에서 20시간 동안 팽윤시킴으로써 팽윤능을 측정한다. 결과를 제4도에 나타낸다.
표 4에 나타낸 바와 같이, 신남산 잔기에 의한 DS가 증가함에 따라 팽윤능은 감소한다.
팽윤능의 감소는 대체적으로 필름 소수성의 증가를 반영한다.
[실시예 5]
경화된 히알루론산 필름에 대한 내피 세포의 유착
배양한지 24시간 후 실시예 1 및 2에서 수득한 경화된 히알루론산 필름[분획: HA-Cin-3-2(DS=0.5), 4-2(DS=0.87), 5-2(DS=1.28) 및 6-2(DS=2.43)]에 대한 내피 세포의 유착 또는 접착을 평가한다. 결과를 제5도(사진)에 나타낸다.
제5도에 나타낸 바와 같이, 내피 세포의 유착은 신남산 잔기에 의한 DS가 증가함에 따라 증가하는 경향이 있다.
DS가 0.5인 필름 HA-Cin-3-2는 충분한 세포 비유착성 효과를 나타내므로 조직 비유착성 물질에서 필요한 기본적인 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
수득한 데이타는 본 발명의 가교결합된 GAG를 콜라겐, 젤라틴 및 피브로넥틴과 같은 세포 유착성 단백질과의 배합물로서 사용하여 인공 세포외 세포간질 또는 인공 기초막을 제조하고, 내피 세포, 상피 세포, 평활근 세포 등의 세포가 당해 세포간질 또는 막 위에서 유착 및 증식하여 하이브리드형 인공 장기(인공 혈관, 인공 피부 등)를 제공하도록 하는 데 참고되는 기본적인 데이타로서 또한 유용하다.
[실시예 6]
콘드로이틴 설페이트-신남산 에스테르의 제조 및 이의 광반응에 의한 가교결합된 콘드로이틴 설페이트의 제조
(1) 콘드로이틴 설페이트-신남산 에스테르의 제조
무수 피리딘(30ml)을 DMF(247mg/15ml) 중의 콘드로이틴 설페이트(몰 중량은 60,000)의 트리-n-부틸아민염 용액에 가한다. 실온에서 격렬하게 교반하면서 신나모일 클로라이드 19.78mg을 혼합물에 가한다. 75℃에서 2시간 동안 반응시킨다. 나트륨 아세테이트로 포화된 에탄올을 반응 혼합물에 가하고 생성된 침전물을 수집하고, 에탄올로 완전히 세척하고 감압하에서 건조시킨다.
분획: CS-Cin-1
수율: 152mg
결합된 신남산: 7.52중량%
DS: 0.33
(2) 가교결합된 콘드로이틴 설페이트 필름의 제조
위의 단계(1)에서 제조한 생성물 CS-Cin-1을 15%의 농도로 인산 완충액에 용해시킨 다음, 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 수은 램프를 조사하여 겔화시킨다.
분획: CS-Cin-1-2
[실시예 7]
콘드로이틴 설페이트와 신남산간의 양의 비(콘드로이틴 설페이트의 양은 항상 247mg이다)를 표 2에 나타낸 바와 같이 변화시키는 점을 제외하고는 실시예 6에서 사용한 동일한 물질 및 방법을 사용하여 콘드로이틴 설페이트-신남산 에스테르를 제조하고, 이로부터 실시예 1에 사용한 방법과 동일한 방법으로 가교결합된 콘드로이틴 설페이트 필름을 제조한다.
[표 2]
분획 CS-Cin-2(DS=0.51)를 각종 농도로 포스페이트 완충된 식염수(PBS)에 용해시키고 용액에 30분 동안 광을 조사한 다음, 겔화도를 조사한다. 이렇게 하여 수득된 결과를 제6도에 도시하는데, 농도가 증가함에 따라 겔화도는 증가된다.
겔화도(%)는 다음과 같이 계산한다:
겔화도(%)= 100 ×(A-X)/(A-B)
상기 식에서,
A는 조사하기 전의 흡광도(OD275nm)이고,
B는 흡광도가 일정한 수준에 도달하도록 충분히 조사한 후의 흡광도(OD275nm)이며,
X는 30분 동안 조사한 후의 흡광도(OD275nm)이다.
PBS 중의 분획 CS-Cin-3(DS=0.65)의 15% 용액에 광을 조사하고 겔화 상태는 시간의 함수로 주어진다. 각각의 노출시간 후, 형성된 겔을 탈이온수에 24시간 동안 침지시키고 겔 표면에서 수분을 제거한 후 측량한다. 겔을 건조시킨 다음, 팽윤능을 계산한다. 또한, 겔화도를 측정한다. 이와 같이 수득된 결과를 제7도에 나타낸다.
노출 시간이 연장됨에 따라 겔화도는 증가하고 팽윤능은 감소한다.
또한, 분획 CS-Cin-1 내지 5는 PBS 중에서의 겔화 거동에 대해 평가하고 생성된 겔은 팽윤능에 대해 평가한다. 이와 같이 측정한 겔화도 또는 팽윤능과 신남산 잔기의 DS와의 관계(콘드로이틴 설페이트 구성 디사카라이드 단위에 대한 몰비)를 제8도에 나타낸다.
신남산 잔기의 DS가 증가하면 겔화도는 증가하고 팽윤능은 급격히 감소한다.
[실시예 8]
경화된 콘드로이틴 설페이트 필름의 팽윤능 평가
실시예 6 및 7에서 합성한 콘드로이틴 설페이트-신남산 에스테르를 광경화성 필름으로 성형한 다음, 30분 동안 광을 조사하여 가교결합시켜 경화된 콘드로이틴 설페이트 필름을 수득한다.
이와 같이 경화된 콘드로이틴 설페이트 필름에 대해 팽윤능을 측정한다. 그 결과를 제9도에 나타낸다.
경화된 히알루론산 필름과는 달리, 경화된 콘드로이틴 설페이트 필름은 신남산 잔기의 DS가 증가하는 경우에도 경화된 히알루론산 필름이 나타내는 팽윤능의 급격한 감소는 나타내지 않는다. 이와 같은 결과는 경화된 콘드로이틴 설페이트 필름이 설페이트 그룹을 함유하고 경화된 히알루론산 필름보다 친수성이 높기 때문인 것으로 추정할 수 있다.
[실시예 9]
실시예 8에서 수득한 경화된 콘드로이틴 설페이트 필름의 접촉각을 측정하고 신남산 잔기의 DS에 대해 플로팅한다. 결과를 제10도에 나타낸다. 제10도의 그래프는 가교결합된 콘드로이틴 설페이트의 접촉각이 가교결합된 히알루론산에 비해 보다 작음을 나타낸다. 이 또한 친수성의 차이 때문인 것으로 추정된다.
[실시예 10]
경화된 콘드로이틴 설페이트 필름에 대한 내피 세포의 유착
실시예 8에서 수득한 경화된 콘드로이틴 설페이트 필름에 대한 내피 세포의 유착을 실시예 5와 동일한 방법으로 시험한다. 경화된 히알루론산 필름과는 달리 유착은 신남산 잔기의 DS에 상관없이 관찰되지 않는다.
[실시예 11]
히알루론산의 카복실 그룹에 대한 신남산 유도체의 결합 및 가교결합
(1) 신나모일 에틸렌디아민 아미드의 합성
신나모일 클로라이드(1.666g)를 클로로포름 100ml에 용해시키고, 클로로포름 중의 에틸렌디아민 6g을 0℃에서 용액에 적가한다. 40℃에서 20시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 포화된 탄산수소나트륨 용액으로 세척한 다음, 물로 완전히 세척한다. 유기 용매층을 감압하에 농축시키고 잔사를 에탄올로부터 재결정화하여 목적하는 생성물(1.58g: 이후, 화합물 A라고 한다)을 수득한다.
(2) Nα-신나모일-L-리신의 합성
Nε-t-부톡시카보닐-L-리신(2.58g)을 디메틸포름아미드 50ml에 용해시키고, 무수 피리딘 30ml를 용액에 가한다. 당해 혼합물에 클로로포름 중의 신나모일 클로라이드의 용액(1.665g/20ml)을 가하여 반응을 40℃에서 수행한다. 반응 혼합물을 감압하에 농축 건조시키고, 잔사는 3.6N의 HCl/디옥산(33ml)에 용해시킨 다음, 4시간 동안 정치시킨 후, 용액을 감압하에 농축시켜 목적 화합물(2.43g; 이후, 화합물 B라고 한다)을 수득한다.
(3) 히알루론산에 대한 신나모일 에틸렌디아민 아미드의 결합
몰 30ml에 히알루론산나트륨(몰 중량=1,200,000) 150mg을 용해시킨 후 화합물 A 42.75mg과 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드 71.9mg을 가한다. 실온에서 20시간 동안 반응시킨다. 반응 혼합물에 1M의 수성 탄산수소나트륨을 가하고, 실온에서 1시간 동안 정치시킨 후, 나트륨 아세테이트-포화 에탄올을 가한다. 생성된 백색 침전물을 수집하여 에탄올로 완전히 세척한다.
분획: HA-CinA-1
수율: 176.2mg
결합된 화합물 A: 16.58중량%
DS: 0.5
(4) 히알루론산에 대한 Nα-신나모일-L-리신의 결합
디메틸포름아미드 중의 히알루론산의 트리-n-부틸아민 염(몰 중량=880,000)의 용액(150mg/35ml)에 N-하이드록시석신이미드 1.224g과 디사이클로헥실카보디이미드 55mg을 가하고, 먼저 0℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 실온에서 10시간 동안 반응시켜 히알루론산의 카복실 그룹을 활성화시킨다. 반응 혼합물에 에테르를 가하여 생성된 침전물을 수집하고 에테르로 세척한 다음, 감압하에 건조시켜 상응하는 활성화된 히알루론산 에스테르를 수득한다.
활성화된 히알루론산을 디메틸포름아미드에 용해시킨다. 이 용액에 디메틸포름아미드 중의 화합물 B의 용액(44mg/50ml)을 가하여 실온에서 20시간 동안 반응시킨다. 나트륨 아세테이트 포화된 에탄올을 반응 혼합물에 가하고 생성된 침전물을 여과하고 에탄올로 세척하여 정제한다.
분획: HA-CinB-1
수율: 122.1mg
결합된 화합물 B: 25.92중량%
DS: 0.5
(5) 경화된 히알루론산 필름의 제조
실시예 1과 동일한 방법으로 분획 HA-CinA-1(30mg)과 HA-CinB-1(30mg)을 필름으로 성형한 다음, 광을 조사하여 가교결합시킨다.
이렇게 제조한 경화된 히알루론산 필름(분획: HA-CinA-1-2 및 HA-CinB-1-2)은 각각 1.2 및 1.4g H2O/g 겔의 팽윤능을 나타낸다.
[실시예 12]
히알루론산-[1-(2-카복시에틸)티민]에스테르(1)의 합성
2-클로로-1-메틸피리디늄 요오다이드 0.317g을 함유하는 디메틸포름아미드(DMF) 중의 히알루론산(몰 중량 1,000,000)(이하 HA100이라고 한다)의 용액(175mg/50ml)에 1-(2-카복시에틸)티민 0.245g과 트리에틸아민 0.461g을 가하여 90℃에서 4시간 동안 반응시킨다. DMF를 감압하에 제거하고, 과량의 에탄올을 가한다음, 생성된 침전물을 수집하고, 에탄올로 세척한 다음, 감압하에 건조시킨다. 수득한 백색 침전물은 히알루론산-[1-(2-카복시에틸)티민]에스테르이다.
분획: HA-Thym-1
수율: 160.0mg
결합된 티민: 9.1중량%
DS: 0.46
(DS는1H NMR에 의해 측정되는 티민의 메틸 양성자수와 히알루론산의 아세틸 양성자 수 사이의 비를 기초로 하여 결정된다)
[실시예 13]
히알루론산-[1-(2-카복시에틸)티민]에스테르(2)의 합성
표 3에 나타낸 조건을 사용하는 점을 제외하고는 실시예 12에서와 동일한 방법으로 수 분획의 히알루론산-[1-(2-카복시에틸)티민]에스테르를 제조한다.
[표 3]
[실시예 14]
히알루론산-[1-(2-카복시에틸)티민]에스테르(1)의 광반응에 의한 가교결합된 히알루론산의 제조
실시예 1과 동일한 방법으로 분획 HA-Thym-1(DS=0.46)로부터 필름을 제조하여 크세논 램프로부터 자외선을 조사한다. 티민 이량체의 형성 과정을 노출 시간의 함수로서 제11도에 나타낸다.
[실시예 15]
히알루론산-[1-(2-카복시에틸)티민]에스테르(2)의 광경화(광반응)에 의한 경화된 히알루론산 필름의 제조
실시예 13에서 제조한 분획 HA-Thym-3, 4, 6, 7, 8 및 9(DS는 각각 0.125, 0.14, 0.26, 0.35, 0.37 및 2.40)를 실시예 1과 동일한 방법으로 각각의 필름으로 성형시켜 크세논 램프를 사용하여 자외선을 필름에 조사한다. 이렇게 수득한 경화된 히알루론산 필름을 분획 HA-Thym-3-2, 4-2, 6-2, 7-2, 8-2 및 9-2로 각각 지정한다. 이들 필름에 대한 겔화도(%) 및 팽윤능의 데이터를 표 4에 나타낸다.
[표 4]
[실시예 16]
히알루론산-[1-(2-카복시에틸)티민]에스테르(3)의 합성
DMF(1.0mM) 중의 히알루론산의 용액을 분자체(molecular sieve)를 통해 예비 건조시킨 후, 추가로 4시간 동안 탈기시켜 완전히 탈수시킨다. 별도로, 1-(2-카복시에틸)티민(히알루론산의 각각의 하이드록실 그룹에 대한 다양한 몰 비로; 제12도 참조), 2-클로로-1-메틸피리디늄 요오다이드(1.2mM) 및 트리에틸아민(1.2mM)을 함유하는 DMF 용액을 실온에서 30분 동안 교반한다. 이 용액을 위에서 언급한 트리에틸아민(1.2mM)으로 보충된 히알루론산 용액에 적가한다. 생성된 혼합물을 90℃에서 3, 5 또는 8시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 감압하에 농축시키고 잔사에 메탄올을 가한다. 생성된 침전물을 여과하고, 메탄올로 세척한 다음, 건조시킨다. 이와 같은 방법으로 DS가 상이한 히알루론산-[1-(2-카복시에틸)티민]에스테르를 수득한다(HA-Thym; DS=0.2, 0.4, 0.6, 0.7, 0.9, 1.3, 1.8, 2.2).
사용된 1-(2-카복시에틸)티민의 몰 비와 DS 사이의 관계의 예를 제12도에 나타낸다.
[실시예 17]
콘드로이틴 설페이트-[1-(2-카복시에틸)티민]에스테르의 합성
콘드로이틴 설페이트(몰 중량=60,000)를 사용하는데, 단 콘드로이틴 설페이트의 각각의 하이드록실 그룹에 대해 1-(2-카복시에틸)티민의 몰 비는 변화되고 에스테르화 반응을 3, 5 또는 9시간 수행하는 점을 제외하고는 실시예 16의 방법을 따른다. 메탄올 또는 디에틸 에테르를 각각의 반응 혼합물에 가하여 생성물을 침전시킨다. 디에틸 에테르를 사용하는 경우, 침전물을 메탄올로 완전히 세척한다. 이와 같은 방법으로 DS가 상이한 콘드로이틴 설페이트-[1-(2-카복시에틸)티민]에스테르를 수득한다(CS-Thym; DS=0.09, 0.4, 0.8, 0.9, 1.3, 1.7, 1.8, 2.2).
사용되는 1-(2-카복시에틸)티민의 몰 비와 DS 사이의 관계에 대한 예를 제13도에 나타낸다.
DS-용해도(물 또는 DMF 중에서)의 관계를 표 5에 나타낸다.
[표 5]
[실시예 18]
티민 유도체를 사용한 경화된 히알루론산 필름 및 경화된 콘드로이틴 설페이트 필름의 제조
상기 필름은 실시예 16 또는 17에서 수득한 각각의 GAG의 1-(2-카복시에틸)티민을 사용하여 제조된다.
따라서, 각각의 히알루론산-[1-(2-카복시에틸)티민]에스테르(HA-Thym; DS=0.2, 0.4, 0.6, 0.7, 0.9, 1.3, 1.8, 2.2)와 콘드로이틴 설페이트-[1-(2-카복시에틸)티민]에스테르(CS-Thym; DS=0.09, 0.4, 0.8, 0.9, 1.3, 1.7, 1.8, 2.2)를 각각 DMF에 용해시켜 5% 용액을 수득하고, 용액 200μl를 슬라이드 글라스(직경 14mm)에 위치시킨 다음, 35℃에서 멸균 공기를 사용하여 건조시킨다. 생성된 필름을 파이렉스-물 필터를 통해 400W 고압 수은 램프로부터의 광선으로 조사하여 가교결합된 GAG 필름을 수득한다.
건조시킨 얇은 콘드로이틴 설페이트-[1-(2-카복시에틸)티민]에스테르(CS-Thym) 필름(DS=0.09, 두께=2 내지 3㎛)을 위의 방법으로 조사하는 경우, 측정된 흡광도(270nm)의 변화와 노출 시간 사이의 관계를 제14도에 나타낸다. 이러한 경우에 측정된 겔화도(%)와 노출 시간 사이의 관계를 제15도에 나타낸다. 실제 사용하기에 적합한 두께(10 내지 12㎛)의 CS-Thym(DS=0.09)의 필름을 동일한 방법으로 조사하고 겔화도(%)와 노출 시간 사이의 관계를 제16도에 나타낸다.
건조시킨 히알루론산-[1-(2-카복시에틸)티민]에스테르(HA-Thym) 필름(DS=0.9, 두꼐=10 내지 12㎛)을 동일한 방법으로 조사하여 팽윤능-노출 시간의 관계를 제17도에 나타낸다.
DS가 상이한 HA-Thym 필름에 대해 조사(3시간)하기 전 및 후의 팽윤능을 측정하고 데이타를 DS에 대해 플로팅하여 수득한 곡선을 제18도에 나타낸다.
당해 실시예에서 수득한 몇몇 HA-Thym- 또는 CS-Thym-유도된 광경화된 필름에 대해 수득한 접촉각 및 팽윤능 데이타와 DS의 차이를 표 6에 나타낸다.
[표 6]
[실시예 19]
가교결합된 히알루론산 필름에 대한 내피 세포의 유착
내피 세포를 실시예 18에서 디아민 유도체를 사용하여 제조한 DS가 다양한 가교결합된 히알루론산 필름(DS=0.4, 0.6, 1.3, 1.8)에서 생장시키고 배양을 시작한지 6시간 후에 세포의 유착을 평가한다.
따라서, 내피 세포의 유착, 신장(분산) 및 생장은 DS가 다양한 가교결합된 히알루론산 필름에서는 거의 관찰되지 않는다. 반면, 통상적인 유착, 신장(분산) 및 생장이 대조용 TCP의 벽에서 발견된다.
[실시예 20]
콘드로이틴 설페이트-(7-쿠마릴옥시아세트산)에스테르의 합성
DMF(10.25mg/ml) 중의 콘드로이틴 설페이트 트리-n-부틸아민 염의 용액을 분자체를 사용하여 미리 건조시키고, 이 용액 70ml를 실온에서 100ml 용량의 삼구 플라스크 속에서 교반하면서 진공중에서 건조시킨다. 대기를 질소 가스로 대체한 후, 증류시킨 피리딘 15ml를 가한다. 여기에 콘드로이틴 설페이트의 각 OH 그룹에 대해 DMF 5ml 중의 7-쿠마릴옥시아세틸 클로라이드[산 클로라이드 형태의 쿠마린](1.12g) 1몰 당량의 용액을 가한다. 반응은 질소 대기하에 80℃에서 3시간 동안 혼합물을 환류시켜 수행한다. 반응 혼합물을 농축시킨 다음, 디에틸 에테르를 적가한다. 생성된 침전물을 회수하고 탈이온수에 용해시킨 다음, 3일 동안 유수에 대해 투석시킨다. 투석물을 동결 건조시켜, 콘드로이틴 설페이트-(7-쿠마릴옥시아세트산) 에스테르를 백색 고체로서 수득한다.
수율: 965.1mg
DS: 0.021
팽윤능: 2.8g H2O/g 건조 겔
1H NMR 스펙트럼: 제19도 참조
콘드로이틴 설페이트의 하이드록실 그룹에 대한 산 클로라이드 형태의 쿠마린의 몰 비를 변화시키는 점을 제외하고는 상기 방법을 반복하고 DS를 몰 비에 대해 플로팅한다. 결과를 제20도에 나타낸다.
[실시예 21]
콘드로이틴 설페이트-(7-쿠마릴옥시아세트산)에스테르로부터 광경화된 콘드로이틴 설페이트 필름의 제조
실시예 20에서 합성한 콘드로이틴 설페이트-(7-쿠마릴옥시아세트산)에스테르를 실시예 1에서와 같이 건조 필름으로 가공시키고 당해 필름에 자외선(320nm)을 조사하여 광경화된 콘드로이틴 설페이트 필름을 수득한다.
쿠마린의 흡광 스펙트럼(320nm)에 있어서의 노출 시간과 변화 사이의 관계를 제21도에 나타낸다. 수득한 필름의 팽윤능(g H2O/g 건조 겔)을 측정하고 노출시간 및 DS에 대해 플로팅한다. 결과를 각각 제22도 및 제23도에 나타낸다. 또한, 겔화도(%)를 측정하고 노출 시간과 콘드로이틴 설페이트-(7-쿠마릴옥시아세트산)에스테르의 농도에 대해 플로팅한다. 결과를 각각 제24도 및 제25도에 나타낸다.
[실시예 22]
가교결합된 히알루론산/콘드로이틴 설페이트 필름
실시예 1에서 수득한 HA-Cin-3(DS=0.5)을 최종 농도 5중량%로 20%의 DMF 수용액에 용해시킨다. 실시예 7에서 수득한 CS-Cin-4(DS=1.37)를 최종 농도 5중량%로 상기 용액에 용해시켜 히알루론산-신남산 에스테르와 콘드로이틴 설페이트 신남산 에스테르의 혼합 용액을 수득한다. 이 용액을 사용하여, 시트화하고 실시예 1의 방법으로 조사하여 가교결합된 히알루론산/콘드로이틴 설페이트 필름을 수득한다.
유사하게 2:1 또는 1:2(중량비)의 비로 HA-Cin-3과 CS-Cin-4를 함유하는 혼합 용액을 제조하고 각 제제의 비유착 효과(이후에 설명함)를 측정한다.
[실시예 23]
헤파린-신남산 에스테르의 합성 및 가교결합된 헤파린 필름의 제조
(1) 헤파린-신남산 에스테르의 제조
디메틸포름아미드(DMF) 중의 헤파린 트리-n-부틸아민 염의 용액(500mg/125ml)에 피리딘 20ml를 가하고 혼합물을 감압하에 탈수시킨다. 실온에서 격렬하게 교반하면서, 신나모일 클로라이드를 69.35mg 가한다. 75℃에서 2시간 동안 반응시킨 다음, 반응 혼합물을 감압하에 40℃에서 30ml로 농축시킨다.
잔사에 에테르를 가하여 생성되는 침전물을 회수한 다음, 감압하에 건조시킨다. 침전물을 DMF 5ml에 용해시킨 다음, PBS 40ml를 가하고 용액을 잘 교반한다. 용액을 투석막을 통과시켜 투석시켜 저분자량 화합물을 완전히 제거한 다음, 동결 건조시켜 목적하는 에스테르 화합물을 440mg 수득한다.
분획: Hep-Cin-1
결합된 신남산의 양(1H-NMR로 측정), DS 및 가용성을 표 7에 나타낸다.
[표 7]
○: 우수한 가용성
△: 가용성이 우수하지 않고 겔 형태
×: 불용성
(2) 가교결합된 헤파린 필름의 제조
DMF에 분획(Hep-Cin-1) 30mg을 용해시킨 다음, 용액을 유리 슬라이드(24mm×24mm)에 위치시키고 40℃에서 멸균된 따뜻한 공기로 건조시킨다. 생성된 필름은 파이렉스 도포된 물 필터를 통해 450W 고압 수은 램프로 조사하여 가교 결합된 헤파린 필름을 수득한다.
분획: Hep-Cin-1-2
접촉각(전진각 및 후진각) 및 수 팽윤능을 표 8에 나타낸다.
[표 8]
(3) 상기와 동일한 물질 및 방법을 사용하여, 신나밀 클로라이드에 대한 헤파린의 비가 변화하는 에스테르(Hep-Cin-2, Hep-Cin-3, Hep-Cin-4)를 제조한다(헤파린은 500mg으로 고정한다). 분석 결과를 표 7에 나타낸다. 또한, 가교결합된 헤파린 필름(Hep-Cin-2-2, Hep-Cin-3-2)을 동일한 방법으로 제조한다. 당해 필름의 물리적 특성을 표 8에 기재한다.
[실시예 24]
무수 DMF(200ml) 중의 히알루론산 트리-n-부틸암모늄 염의 용액(OH 그룹 10mmol에 상응하는 1.5g)을 Ar하에 유지시켜 0℃로 냉각시킨다. 4-디메틸아미노 피리딘(0.305g, 2.5mmol), 신남산 무수물(2.78g, 10mmol) 및 트리-n-부틸아민(4.76ml, 10mmol)을 연속적으로 가하고 반응을 24시간 동안 실온에서 진행시킨다. 0℃로 냉각시킨 후, 물(100ml) 중의 5% NaHCO3를 서서히 가하고 용액을 48시간 동안 실온에서 교반한다. 과량의 NaHCO3를 pH가 4로 될 때까지 1M HCl을 점차적으로 가하고 pH가 7로 될 때까지 1M NaOH를 점차적으로 가하여 제거한다. 차가운 에탄올을 교반하면서 가한다. 경사시킨 후, 침전물을 물에 용해시키고, 침전 과정을 에탄올로 반복한다. 침전물을 원심분리시키고 물에 용해시켜 4℃에서 Dowex 50(H+)양이온 교환 수지 컬럼에 통과시킨다. 산은 1M NaOH로 중화시키고 동결 건조시킨다.
[실시예 25]
광경화된 히알루론산 필름의 비유착 효과
실시예 1에서 제조한 분획 HA-Cin-3-2와 동일한 방법으로 제조한 광경화된 히알루론산-신남산 에스테르 필름(DS=0.5; 두께 30㎛; 20mm×20mm)을 비유착성 물질로서 사용하고, 다음 실험을 수행한다.
래트를 마취하에서 개복수술하고 체벽 복막을 기계적으로 상처를 입혀 근육층의 노출 부위를 생성시킨다. 이 부위를 위에서 제조한 비유착성 물질로 도포시킨다. 적용한지 1주 및 2주 후에 이식편을 제거하고 필름 표면 위의 조직 유착도를 광 경검법(헤마톡실린-에오신 염색 후) 및 전자 경검법으로 검사하여 평가한다. 상처 부위가 도포되지 않은 래트를 대조용으로서 사용한다.
본 발명의 비유착성 물질을 사용한 실험에서, 1주 및 2주 후 피브린 침전 및 세포 유착이 모든 샘플에서 거의 발견되지 않는다. 2주 후, 필름의 생분해가 이미 시작되었음을 알 수 있다.
한편, 대조 실험에서, 손상 부위는 잇따른 일련의 피브린 침전, 염증 세포의 침입, 섬유아세포증 및 콜라겐의 생성으로 이어지고, 장관이 1주 후에 손상된 부위에 잘 유착된다.
실시예 22에서 제조한 가교결합된 HA-Cin-3/CS-Cin-4 필름을 사용하는 점을 제외하고는 위의 실험을 반복한다. 위의 균질한 HA-Cin-3 필름(HA-Cin-3-2)과 비교하여, 생분해성이 증진되어 필름의 생분해는 이식 후 1주내에 시작되고, 이와 함께 세포가 필름으로 침입되고, 분해의 진전은 2주에서 명백하다.
[실시예 26]
광경화된 콘드로이틴 설페이트 필름의 비유착 효과(동일반응계내에서의 겔화)
실시예 7에서 제조한 콘드로이틴 설페이트-신남산 에스테르 분획 CS-Cin-3(DS=0.65)을 20중량%의 최종 농도로 인산염 완충액에 용해시켜 비유착성 물질을 용액 형태로 제공한다.
실시예 25에서 사용한 것과 유사한 기관이 손상된 동물 모델의 손상 부위를 위의 비유착성 물질로 도포한다. 이어서, 이 물질을 UV광으로 15분 동안 조사하여 동일반응계 내에서 겔화시킨다. 조직학적 시험은 겔층이 복막 표면과 잘 접촉되어 형성됨을 나타낸다.
실시예 25와 동일한 방법으로 손상된 부위를 연속적으로 관찰하면 실시예 25에서와 같이 유착이 없음을 알 수 있다.
[실시예 27]
광경화된(가교결합된) 히알루론산 필름과 광경화된(가교결합된) 콘드로이틴 설페이트 필름의 비유착 효과
실시예 1 및 2에서와 동일한 방법으로 제조한 광경화된 히알루론산-신남산 에스테르(HA-Cin) 필름(DS=0.1, 0.5), 광경화된 히알루론산-티민 유도체 에스테르(HA-Thym; DS=0.2, 0.6, 0.9, 1.8) 및 실시예 18과 동일한 방법으로 제조한 광경화된 콘드로이틴 설페이트-티민 유도체 에스테르(CS-Thym; DS=0.4, 0.9) 필름을 비유착성 물질로서 사용하고, 다음 실험을 수행한다. 각각의 광경화된 필름(직경 14mm; 두께 15 내지 20㎛)을 70% 에탄올에 30분 동안 침지시켜 멸균시킨 후, 멸균 수에서 1시간 동안 부동시킨다. DS가 낮은 샘플을 물에 침지시킨 후 건조시켜 에탄올을 제거하고 동물 실험 전에, 10분 동안 부동 침지시킨다. 수 흡수 필름은 팽윤되어 하이드로겔을 형성한다.
위스타(Wistar) 알비노 래트(수컷, 300g)를 에테르로 마취시키고, 수술시까지 에테르 및 산소로 유지시킨다. 한 마리의 래트를 각 샘플용으로 사용한다. 래트복부에서 연직으로 중앙선을 절개하여 간을 노출시킨다. 노출된 간의 표면을 기계적으로 손상시켜 1㎠의 손상된 복막 부위를 만들고, 상기한 팽윤된 광경화 필름을 적용한다. 상처 부위에 고착될 수 없는 필름에 대해서는, 폴리우레탄 접착제를 4개의 모퉁이에 떨어뜨려 필름을 고정시킨다. 이어서, 나일론 봉합으로 복벽 봉합을 행한다. 이식한지 1주 및 2주 후에, 래트를 폐사시키고 봉합 부위를 절개한다. 간을 덮은 필름을 검경법으로 검사하고, 덮혀진 부분을 주위 조직과 함께 절제하고 광검경법을 사용하여 조직 검사를 행한다. 결과를 표 9에 나타낸다.
[표 9]
-: 없음
+: 증가하거나 관찰됨
++: 뛰어남
예를 들어, 이식한지 1주 후에 광경화된 HA-Cin(DS=0.1) 필름을 조직 검사하면 필름 표면상의 세포 유착이 전혀 없고, 필름의 생분해가 시작되고 조직 침입이 관찰된다. 광경화된 HA-Thym(DS=0.2) 필름의 경우에, 복막 세포와 같은 편평한 세포가 최상부층에서 관찰되고, 생분해가 진전되며 단지 작은 중심부만 남는다.
대조용으로서 도포되지 않은 손상 부위를 사용하여 1주 후에 유사한 관찰을 한다. 그 결과, 약한 방법(예를 들어, 칼을 사용하여 절단하지 않고 조작 칼의 등 또는 손을 사용한 조작)으로는 분리할 수 없는 유착이 간과 복벽의 손상된 표면 사이에서 발견된다.
[실시예 28]
담체로서의 광경화된 콘드로이틴 설페이트 필름과 광경화된 히알루론산을 사용한 약제 방출 조절
1) 인도메타신의 방출 조절
실시예 16에서 수득한 DS가 다양한 HA-Thym을 5%의 최종 농도로 DMF에 용해시키고, 인도메타신 1㎍을 상기 용액 200μl에 용해시킨다. 생성된 용액을 직경이 15mm인 유리 슬라이드 위에 위치시키고, 35℃에서 멸균된 따뜻한 공기로 공기 건조시킨다. 이렇게 수득한 필름을 실시예 18에서와 동일한 방법으로 조사하여 인도메타신 함유 가교결합된 히알루론산 필름을 제공한다. 약제 함량은 10%로 조절한다. 동일한 방법으로, 약제 함량이 30%, 50% 및 73%인 가교결합된 히알루론산 필름을 제조한다. 또한, 실시예 17에서 수득한 DS가 다양한 CS-Thym을 사용하여, 약제 함량이 10%, 30% 및 50%인 가교결합된 콘드로이틴 설페이트를 동일한 방법으로 제조한다.
각각의 생성물 필름으로부터 약제의 방출에 대한 시험을 다음과 같이 수행한다. 이렇게 하여, 시험 필름을 물(20℃) 또는 인산염 완충된 염수(PBS)(37℃)에 현탁시키고 교반한다. 액상을 예정된 시간 간격으로 샘플링하고, 269nm에서의 이의 자외선 흡수 스펙트럼을 측정한다.
표 10은 약제 함량이 30%인 광경화된 히알루론산 필름(DS=0.7, 1.3, 1.8)에 대한 수 용해 시험 데이타와 DS 및 팽윤능의 관계를 나타낸다. 용해 시험 데이타로서 약제의 20%가 필름으로부터 방출되는 시간이 사용된다.
[표 10]
표 10으로부터 DS가 높고, 가교결합도가 높을수록, 필름은 보다 단단해지고, 따라서 팽윤능이 감소하고 약제의 방출 속도가 감소한다는 것이 명백하다. 이러한 발견은 필름의 수 흡수 능력이 약제 방출 속도에서 중요한 인자라는 것을 나타낸다. DS 값이 1.3 및 1.8인 필름에 있어서, 약제 방출 속도는 약제 함량이 증가함에 따라 감소하는 경향이 있다.
광경화된 히알루론산 필름(DS=0.7, 2.2)과 광경화된 콘드로이틴 설페이트 필름(DS=0.8, 1.3, 1.8)을 약제 함량이 10% 및 50%인 PBS에서의 약제 방출 속도에 대해 비교한다. 그 결과를 제26도 내지 제30도에 도시한다. 이들 그래프로부터 약제의 방출 조절이, DS 값이 특정 역치 이상인 필름(CS-Thym의 경우, DS=1.3)에 적당하다는 것이 명백할 것이다.
(2) 헤파린의 방출 조절
DMF의 20% 수용액에 20중량%의 최종 농도로 실시예 7에서 수득한 콘드로이틴 설페이트-신남산 에스테르[CS-Cin-4 (DS=1.37), CS-Cin-5(DS=2.43)] 뿐만 아니라, 10중량%의 최종 농도로 실시예 1 및 2에서 수득한 히알루론산-신남산 에스테르[HA-Cin-3(CS=0.50), HA-Cin-5(DS=1.28), HA-Cin-6(DS=2.43)]를 용해시킨다. 이 용액 10ml 각각에 헤파린 100mg을 가하고 당해 용액을 유리 시트(10cm×10cm) 위에 피복하고 실온에서 1시간 동안 건조시켜 필름을 제공한다. 당해 필름에 450W 고압 수은 램프로 30분 동안 조사한다. 각각의 필름의 두께는 약 100㎛이다.
유리 시트 위의 필름을 각각 물 100ml를 함유하는 용기에 완전히 침지시키고, 60rpm으로 교반한다. 시간에 따라 방출된 헤파린의 양을 카바졸-황산법으로 측정한다. 결과는 모든 필름이 헤파린의 방출을 조절한다는 것을 나타낸다.
또한, 위의 헤파린 방출 조절용 필름을 각각 시험관의 내부 벽에 형성시킨다. 이어서, JP-A 제(평)4-41432호에 따라, 시트레이트화된 혈액을 가하고, 응고시간을 측정한다. 모든 샘플은 항트롬빈 활성을 나타낸다.
(3) 성장 호르몬 방출 인자의 방출 조절
DMF의 20% 수용액에 10중량%의 최종 농도로 히알루론산-신남산 에스테르[HA-Cin-3(DS=0.50)]를 용해시키고, 성장 호르몬 방출 인자(GRF, 사람; 분자량 5039.8)를 당해 용액 1ml에 혼합한다. 이어서, 혼합물을 유리 시트(3cm×3cm)에 피복하고 실온에서 1시간 동안 건조시켜 필름을 제공한다. 이 필름에 450W 고압 수은 증기 램프로 30분 동안 조사한다. 당해 필름의 두께는 110㎛이다.
유리 시트 위의 필름을 몰 10ml를 함유하는 용기에 완전히 침지시키고 60rpm으로 교반한다. 시간에 따라 방출된 GRF를 고성능 액체 크로마토그래피로 분석하고 누적 방출량을 계산한다. GRF의 방출 조절이 성공적으로 이행된다.
[실시예 29]
혈관 보철
내강(내부 직경: 3mm)이 작은 인공 혈관의 내부 표면을 회전 피복 기술로 실시예 1에서 수득한 HA-Cin-3의 용액으로 피복하고, 건조시킨 후, 피복된 필름을 직경이 작은 광학 섬유를 사용하여 UV 조사제로 경화시킴으로써 경화된 히알루론산으로 내부 피복된 혈관 보철이 수득된다.
[발명의 효과]
본 발명은 고도로 안전하고 생혼화성인 출발 물질로서 본원에서 구체적으로 언급된 광반응성 화합물과 글리코사미노글리칸을 선택하고, 광반응성 화합물을 글리코사미노글리칸에 결합시킴으로써 용이하게 정제가능한 광경화성 GAG를 용이하게 제공할 수 있다. 본 발명은 또한 광경화성 GAG를 광으로 조사함으로써 의학용 물질을 추가로 제공할 수 있다. 당해 물질은 2차원 또는 3차원 망상 구조를 지니고, 고도로 안정한 생혼화성 및 생분해성/흡수성이다. 본 발명은 GAG의 분자량, 광반응성 화합물의 DS 및 기타 인자를 적절하게 선택함으로써 의학용 물질의 요구되는 바람직한 물리적 특성을 지닌 가교결합된 GAG계 물질을 추가로 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명은 다양한 의학 분야에서 매우 광범위하게 적용가능하다.

Claims (40)

  1. 글리코사미노글리칸, 및 글리코사미노글리칸에 공유결합되어 있고 글리코사미노글리칸에 직접 결합되거나 스페이서를 통해 결합될 수 있는 작용성 그룹을 함유하며 치환되거나 치환되지 않은 신남산 및 이의 반응성 유도체, 치환체로서 위치 1에 카복시알킬 그룹을 갖는 우라실 유도체 및 이의 반응성 유도체, 치환체로서 위치 7에 카복시알콕시 그룹을 갖는 쿠마린 유도체 및 이의 반응성 유도체, 및 다음 구조식의 그룹으로부터 선택된 그룹을 함유하는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 화합물인 광반응성 화합물을 포함하는 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체.
  2. 제1항에 있어서, 글리코사미노글리칸과 광반응성 화합물과의 결합이 글리코사미노글리칸의 하이드록실 또는 카복실 그룹과 광반응성 화합물의 작용성 그룹 또는 광반응성 화합물에 공유결합된 스페이서와의 공유결합인 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체.
  3. 제2항에 있어서, 작용성 그룹이 하이드록실, 카복실 또는 아미노 그룹인 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 글리코사미노글리칸과 광반응성 화합물과의 결합이 스페이서를 통한 결합인 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체.
  5. 제4항에 있어서, 스페이서가 글리코사미노글리칸의 하이드록실 또는 카복실 그룹과 반응할 수 있는 작용성 그룹 및 광반응성 화합물과 반응할 수 있는 작용성 그룹을 갖는 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체.
  6. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 글리코사미노글리칸이 콜리민산, 히알루론산, 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, 테이쿠론산, 더미탄 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 케라토설페이트, 케라토폴리설페이트 및 이의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 화합물인 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체.
  7. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 글리코사미노글리칸이 히알루론산인 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체.
  8. 글리코사미노글리칸 및 글리코사미노글리칸에 공유결합된 광반응성 화합물을 포함하는, 일반식[1], [3], [4a], [4c], [5a], [5c], [5d], [5e], [5f] 또는 [5g]의 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체.
    상기식에서, gag-O- 및 gag-CO-는 각각 콜로민산, 히알루론산, 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, 테이쿠론산, 더마탄 설페이트, 헤파린, 헤파란 설페이트, 케라토설페이트, 케라토폴리설페이트 및 이의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 글리코사미노글리칸의 잔기이고,
    R3은 -(CH2)n-(여기서, n은 1 내지 10이다), -(CH2)pCHY-(여기서, Y는 COOH 또는 NH2이고 p는 1 내지 10이다) 또는 -(CH2)m-C6H4-(CH2)l-(여기서, m은 1 내지 10이고 l은 1 내지 10이다)이며,
    R1-CO-는 일반식
    [6](여기서, R4및 R5는 동일하거나 상이하며 각각 수소원자, 니트로 그룹 또는 아미노 그룹이다). 일반식
    [7](여기서, R6은 수소 또는 할로겐 원자 또는 저급 알킬 또는 할로-저급 알킬 그룹이고, R7은 수소 또는 할로겐 원자 또는 시아노, 카복실, 저급 알콕시카보닐, 저급 알킬 또는 할로-저급 알킬 그룹이며, R8은 저급 알킬렌 그룹이다) 또는 일반식
    [8](여기서, R9, R10및 R11은 동일하거나 상이하며 각각 수소원자 또는 저급 알킬 그룹이고, R12는 저급 알킬렌 그룹이다)이고,
    R1-0-는 일반식
    [9](여기서, R13은 수소 또는 할로겐 원자 또는 저급 알킬 또는 할로-저급 알킬 그룹이고, R14는 수소 또는 할로겐 원자 또는 시아노, 카복실, 저급 알콕시카보닐, 저급 알킬 또는 할로-저급 알킬 그룹이며, R15는 저급 알킬렌 그룹이다) 또는 일반식
    [10](여기서, R16및 R17은 동일하거나 상이하며 각각 수소원자, 니트로 그룹 또는 아미노 그룹이다)이다.
  9. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 글리코사미노글리칸에 대한 광반응성 화합물의 치환도가 0.1 내지 4.0인 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체.
  10. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 광반응성 글리코사미노글리칸이 물 또는 유기 용매에 가용성인 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체.
  11. 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체에 광을 조사하여, 글리코사미노글리칸, 및 글리코사미노글리칸에 직접 결합되거나 스페이서를 통해 공유결합되어 있고 글리코사미노글리칸에 결합될 수 있는 작용성 그룹을 함유하며 치환되거나 치환되지 않은 신남산 및 이의 반응성 유도체, 치환체로서 위치 1에 카복시알킬 그룹을 갖는 우라실 유도체 및 이의 반응성 유도체, 치환체로서 위치 7에 카복시알콕시 그룹을 갖는 쿠마린 유도체 및 이의 반응성 유도체 및 다음 구조식의 그룹으로부터 선택된 그룹을 함유하는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 화합물인 광반응성 화합물을 포함하는 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체의 광반응성 화합물을 가교결합시킴으로써 제조되는 가교결합된 글리코사미노글리칸.
  12. 제11항에 있어서, 글리코사미노글리칸과 광반응성 화합물과의 결합이 글리코사미노글리칸의 하이드록실 또는 카복실 그룹과 광반응성 화합물의 작용성 그룹 또는 광반응성 화합물에 공유결합된 스페이서와의 공유결합인 가교결합된 글리코사미노글리칸.
  13. 제12항에 있어서, 작용성 그룹이 하이드록실, 카복실 또는 아미노 그룹인 가교결합된 글리코사미노글리칸.
  14. 제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 글리코사미노글리칸과 광반응성 화합물과의 결합이 스페이서를 통한 결합인 가교결합된 글리코사미노글리칸.
  15. 제14항에 있어서, 스페이서가 글리코사미노글리칸의 하이드록실 또는 카복실 그룹과 반응할 수 있는 작용성 그룹 및 광반응성 화합물과 반응할 수 있는 작용성 그룹을 갖는 가교결합된 글리코사미노글리칸.
  16. 제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 글리코사미노글리칸이 콜로민산, 히알루론산, 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, 테이쿠론산, 더마탄 설페이트, 헤파린, 헤파란 설페이트, 케라토설페이트, 케라토폴리설페이트 및 이의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 화합물인 가교결합된 글리코사미노글리칸.
  17. 제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 글리코사미노글리칸이 히알루론산인 가교결합된 글리코사미노글리칸.
  18. 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체에 광을 조사하여 일반식[1], [3], [4a], [4c], [5a], [5c], [5d], [5e], [5f] 또는 [5g]의 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체의 광반응성 화합물을 가교결합시킴으로써 제조되는 가교결합된 글리코사미노글리칸.
    상기식에서, gag-O- 및 gag-CO-는 각각 콜로민산, 히알루론산, 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, 테이쿠론산, 더마탄 설페이트, 헤파린, 헤파란 설페이트, 케라토설페이트, 케라토폴리설페이트 및 이의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 글리코사미노글리칸의 잔기이고,
    R3은 -(CH2)n-(여기서, n은 1 내지 10이다), -(CH2)pCHY-(여기서, Y는 COOH 또는 NH2이고 p는 1 내지 10이다) 또는 -(CH2)m-C6H4-(CH2)l-(여기서, m은 1 내지 10이고 l은 1 내지 10이다)이며,
    R1-CO-는 일반식
    [6](여기서, R4및 R5는 동일하거나 상이하며 각각 수소원자, 니트로 그룹 또는 아미노 그룹이다). 일반식
    [7](여기서, R6은 수소 또는 할로겐 원자 또는 저급 알킬 또는 할로-저급 알킬 그룹이고, R7은 수소 또는 할로겐 원자 또는 시아노, 카복실, 저급 알콕시카보닐, 저급 알킬 또는 할로-저급 알킬 그룹이며, R8은 저급 알킬렌 그룹이다) 또는 일반식
    [8](여기서, R9, R10및 R11은 동일하거나 상이하며 각각 수소원자 또는 저급 알킬 그룹이고, R12는 저급 알킬렌 그룹이다)이고,
    R1-0-는 일반식
    [9](여기서, R13은 수소 또는 할로겐 원자 또는 저급 알킬 또는 할로-저급 알킬 그룹이고, R14는 수소 또는 할로겐 원자 또는 시아노, 카복실, 저급 알콕시카보닐, 저급 알킬 또는 할로-저급 알킬 그룹이며, R15는 저급 알킬렌 그룹이다) 또는 일반식
    [10](여기서, R16및 R17은 동일하거나 상이하며 각각 수소원자, 니트로 그룹 또는 아미노 그룹이다)이다.
  19. 제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 광경화성 글리코사미노글리칸의 글리코사미노글리칸에 대한 광반응성 화합물의 광반응성 그룹의 치환도가 0.1 내지 4.0인 가교결합된 글리코사미노글리칸.
  20. 제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체가 물 또는 유기 용매에 가용성인 가교결합된 글리코사미노글리칸.
  21. 제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 가교결합된 구조로서 사이클로부탄 환을 포함하는 가교결합된 글리코사미노글리칸.
  22. 제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 광반응성 화합물의 가교결합이 사이클로부탄 환 형성 반응인 가교결합된 글리코사미노글리칸.
  23. 가교결합된 구조가 다음 구조식에 상응하는, 글리코사미노글리칸의 작용성 그룹에 공유결합된 가교결합 구조부를 갖는 가교결합된 글리코사미노글리칸.
  24. 제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 접촉각을 필름으로서 측정했을 때 물과의 접촉각이 10 내지 100°인 가교결합된 글리코사미노글리칸.
  25. 글리코사미노글리칸의 하이드록실 그룹과 치환되거나 치환되지 않은 신남산 및 이의 반응성 유도체, 치환체로서 위치 1에 카복시알킬 그룹을 갖는 우라실 유도체 및 이의 반응성 유도체, 치환체로서 위치 7에 카복시알콕시 그룹을 갖는 쿠마린 유도체 및 이의 반응성 유도체 및 다음 구조식의 그루을 함유하고 글리코사미노글리칸의 하이드록실 그룹 또는 스페이서에 결합할 수 있는 작용성 그룹을 갖는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 화합물인 광반응성 화합물의 작용성 그룹 또는 광반응성 화합물에 공유결합된 스페이서를 반응시킴을 포함하는, 제1항에 따르는 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체의 제조방법.
  26. 제25항에 있어서, 당해 반응이 에스테르화 반응이고 염기성 촉매의 존재하에 0 내지 100℃에서 수행되는 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체의 제조방법.
  27. 글리코사미노글리칸의 카복실 그룹과 치환되거나 치환되지 않은 신남산 및 이의 반응성 유도체, 치환체로서 위치 1에 카복시알킬 그룹을 갖는 우라실 유도체 및 이의 반응성 유도체, 치환체로서 위치 7에 카복시알콕시 그룹을 갖는 쿠마린 유도체 및 이의 반응성 유도체 및 다음 구조식의 그룹을 함유하고 글리코사미노글리칸의 카복실 그룹 또는 스페이서에 결합할 수 있는 작용성 그룹을 갖는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 화합물인 광반응성 화합물의 작용성 그룹 또는 광반응성 화합물에 공유결합된 스페이서를 반응시킴을 포함하는, 제16항에 따르는 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체의 제조방법.
  28. 제27항에 있어서, 글리코사미노글리칸의 카복실 그룹을 활성화하여 활성화 카복실 그룹을 갖는 글리코사미노글리칸을 제조하고 활성화 카복실 그룹을 광반응성 화합물 또는 광반응성 화합물에 공유결합된 스페이서와 반응시키거나, 글리코사미노글리칸의 카복실 그룹을 축합제의 존재하에 광반응성 화합물 또는 광반응성 화합물에 공유결합된 스페이서와 반응시켜 형성되는 아미드 결합을 통해 글리코사미노글리칸의 카복실 그룹을 광반응성 화합물에 결합시킴을 포함하는, 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체의 제조방법.
  29. 글리코사미노글리칸, 및 글리코사미노글리칸에 직접 결합되거나 스페이서를 통해 공유결합되어 있고 글리코사미노글리칸 또는 스페이서에 결합할 수 있는 작용성 그룹을 함유하며 치환되거나 치환되지 않은 신남산 및 이의 반응성 유도체, 치환체로서 위치 1에 카복시알킬 그룹을 갖는 우라실 유도체 및 이의 반응성 유도체, 치환체로서 위치 7에 카복시알콕시 그룹을 갖는 쿠마린 유도체 및 이의 반응성 유도체, 및 다음 구조식의 그룹으로부터 선택된 그룹을 함유하는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 화합물인 광반응성 화합물을 포함하는 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체에 광을 조사하여, 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체의 광반응성 화합물을 가교결합시킴을 포함하는, 가교결합된 글리코사미노글리칸의 제조방법.
  30. 광반응성 화합물의 작용성 그룹을 글리코사미노글리칸의 하이드록실 또는 카복실 그룹에 결합시켜 글리코사미노글리칸, 및 글리코사미노글리칸에 직접 결합되거나 스페이서를 통해 공유결합되어 있고 글리코사미노글리칸 또는 스페이서에 결합될 수 있는 작용성 그룹을 함유하며 치환되거나 치환되지 않은 신남산 및 이의 반응성 유도체, 치환체로서 위치 1에 카복시알킬 그룹을 갖는 우라실 유도체 및 이의 반응성 유도체, 치환체로서 위치 7에 카복시알콕시 그룹을 갖는 쿠마린 유도체 및 이의 반응성 유도체, 및 다음 구조식의 그룹으로부터 선택된 그룹을 함유하는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 화합물인 광반응성 화합물을 포함하는 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체를 생성시키고 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체에 광을 조사하여, 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체를 가교결합시킴을 포함하는 가교결합된 글리코사미노글리칸의 제조방법.
  31. 제29항에 있어서, 용매를 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체 용액으로부터 제거하고 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체에 광을 조사하여 가교결합시킴을 포함하는 가교결합된 글리코사미노글리칸의 제조방법.
  32. 제29항에 있어서, 글리코사미노글리칸이 히알루론산인 가교결합된 글리코사미노글리칸의 제조방법.
  33. 제1항에 따르는 광경화성 글리코사미노글리칸 유도체를 포함하는, 세포, 조직, 또는 세포와 조직의 유착 방지용 조성물.
  34. 제11항에 따르는 가교결합된 글리코사미노글리칸과 이에 봉입된 약제를 포함하는, 약제 방출 조절용 조성물.
  35. 내막, 외막 또는 내막과 외막 둘 다가 제11항에 따르는 가교결합된 글리코사미노글리칸으로 피복된 인공 혈관.
  36. 제11항에 따르는 가교결합된 글리코사미노글리칸을 포함하는 인공 세포의 세포간질 또는 인공 기초막 제제.
  37. 제34항에 있어서, 약제가 해열 진통 소염제, 항암제, 항궤양제, 효소제제, 혈압강하제, 비뇨기 치료제, 항응고제, 항동맥경화제, 순환기 치료제, 스테로이드, 상처 치료 촉진제, 생리학적 활성 폴리펩티드, 호르몬, 항결핵제, 혈액 수렴 지혈제, 당뇨병 치료제, 혈관확장제, 항부정맥제, 심장제, 항알레르기제, 항우울제, 항간질제, 근육 이완제, 항기침성 거담제 및 항생제로부터 선택되는 약제 방출 조절용 조성물.
  38. 제34항에 있어서, 인공 장기, 인공 세포의 세포간질 또는 인공 기초막의 구성원으로서 사용될 수 있는 약제 방출 조절용 조성물.
  39. 제11항에 따르는 가교결합된 글리코사미노글리칸을 포함하는, 세포, 조직, 또는 세포와 조직 유착 방지용 조성물.
  40. 제11항에 따르는 가교결합된 글리코사미노글리칸을 포함하는, 인공 혈관 피복용 조성물.
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