JP5937070B2 - 3d細胞培養に用いる改良された架橋ヒアルロナンヒドロゲル - Google Patents
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Description
本願は、2010年6月22日出願の欧州特許出願EP10305666および2011年3月24日出願の欧州特許出願EP11305333に基づく優先権を主張するものである。上記各欧州特許出願に記載されたすべての内容がここに援用される。
細胞培養研究の大部分は、マイクロウェル・プレート、組織培養フラスコ、ペトリ皿のような二次元(2D)表面で行われてきた。これは、2D培養が容易かつ便利で、細胞の生存可能性が高いためである。こうした従来の2D細胞培養システムは基礎的な細胞生物学に対する我々の理解を著しく広げてきたが、薬学的な検査や細胞生物学における新たな難問には不十分であり不適切であることが判明している。実際、2D細胞培養システムは、細胞形態学、成長率、接触形状、輸送量、その他多くの細胞機能に影響することが知られている、生体内状態の複雑で動的な諸環境を再現できない。
本発明は、おしなべて、三次元細胞培養を含むさまざまな用途に用いうる架橋ヒアルロナンヒドロゲルを作成する方法に関する。より具体的には、本発明は、架橋ヒアルロナンヒドロゲルを、細胞培養用のスキャフォールドとして用いる前に処理または加工する方法を提供する。特に、本発明に係る方法は、そうした処理をされていない類似のヒドロゲルに比べて改良された性質を有するヒアルロナンヒドロゲルを産出する。実際、本発明に係るヒドロゲルはより高い再水和性を示し、これはマトリックスへのより完全で均一な細胞の移動をもたらし、ひいてはより優れた3D細胞培養をもたらす。
図1は、培養後一日経った造血幹細胞を含む架橋ヒアルロナンヒドロゲルの画像である(×10)。小さな矢印は相互につながった多孔性ネットワークの隙間を示し、大きな矢印は細胞が移動したときのそのような隙間を示す。
本明細書を通して、以下の段落で定義するいくつかの用語が用いられる。
上記したように、本発明は、3D細胞培養を含むさまざまな用途に用いるのに適した架橋ヒアルロナンヒドロゲルを得る方法を提供する。本発明に係る方法は、3Dマトリックスにおいてよりよい細胞移動を可能にするヒアルロナンヒドロゲルを産出するという利点を持つ。
本発明に係る方法は、概して、架橋ヒアルロナンヒドロゲルを凍結乾燥する工程と、凍結乾燥したヒドロゲルを殺菌する工程とを含む。殺菌は二つの連続した工程で行われ、第一の工程は凍結乾燥したヒドロゲルを加熱する工程を含み、第二の工程は凍結乾燥したヒドロゲルをアルコールに浸す工程と、浸したヒドロゲルを物理的に圧縮する工程とを含む。
本発明に係る方法で処理することのできる架橋ヒアルロナンヒドロゲルには、3D細胞培養を含むさまざまな用途に用いるのに適したどのような架橋ヒアルロナンヒドロゲルも含まれる。
(a‐凍結乾燥)
本発明に係る方法の第一の工程は、架橋ヒアルロナンヒドロゲルを凍結乾燥する工程もしくは凍結乾燥した架橋ヒアルロナンヒドロゲルを提供する工程を含む。本明細書において「凍結乾燥する」「フリーズドライする」およびそれらに関連する用語は、交換可能に用いられる。これらの用語は、凍結乾燥すべき物質を凍結させ、その後、周辺圧力を減少させて、当該物質の凍結した水分が直接固体から気体へ昇華するだけの熱を加えることによって行われる脱水工程を指す。
本発明に係る方法では、殺菌処置は二つの連続した工程で行われる。第一の工程は凍結乾燥したヒドロゲルを加熱する工程を含み、第二の工程は凍結乾燥したヒドロゲルをアルコールに浸す工程と、浸したヒドロゲルを物理的に圧縮する工程とを含む。
本発明に従って処理された殺菌済みの架橋ヒアルロナンヒドロゲルは、3D細胞培養を含む用途で使用する前に再水和化される。再水和化は、適切な方法ならばどのような方法で行ってもよい。好ましくは、再水和化は、殺菌したヒドロゲルを室温の再水和化媒体に置くことで行われる。そのあと、ヒドロゲルは、37℃で5%CO2雰囲気の中、再水和化が完了するまでこの媒体に放置される。ある実施形態では、ヒドロゲルは数日間、例えば少なくとも三日間、再水和化される。再水和化媒体は、適切な水溶液ならばどのようなものでもよい。しかしながら、ある好ましい実施形態では、再水和化媒体は細胞培養媒体である。再水和化工程で用いられる再水和化媒体は、そのあと、ヒドロゲルが目的とする3D細胞培養の用途で用いられることが好ましい。
本明細書に記載した方法によって得られるヒドロゲルも本発明の範囲に含まれる。
本発明に係る方法に従って処理された架橋ヒアルロナンヒドロゲルには、同じ処理を施されていない類似のヒドロゲルにはないいくつかの特質がある。
本発明は、本発明に係る方法を用いて得られる、あるいは得ることができる、殺菌された架橋ヒアルロナンヒドロゲルを提供する。本発明に係る殺菌された架橋ヒアルロナンヒドロゲルは、無菌状態で−20℃で貯蔵されることが好ましい。貯蔵は非常に長い期間(例えば一年以上)行ってもよい。
上記したように、本明細書に記載した方法で処理されていない類似のヒドロゲルに比べて、本発明の架橋ヒアルロナンヒドロゲルは改善された性質を示す。こうした改善された性質のために、3D細胞培養に対応する能力と適性が増す。したがって、本発明に係るヒドロゲルは、3D細胞培養を含むさまざまな用途のいずれにも用いることができ、とりわけこれまでヒアルロナンヒドロゲルが用いられてきた用途のいずれにも用いることができる。本明細書において「3D細胞培養を含む用途」という用語は、三次元での細胞培養を含む(ヒドロゲルの)使用すべてを指す。そのような用途において、3D細胞培養は最終的な目的であってもよいし、最終的な目的を達成する工程に過ぎなくてもよい。
他の局面では、本発明に係る殺菌された架橋ヒアルロナンヒドロゲルと、当該ヒドロゲルを無菌状態で含有する容器とを備えたキットが提供される。本発明に係る再水和化された架橋ヒアルロナンヒドロゲルと、抗生物質を含む再水和化媒体に入った当該ヒドロゲルを含有する容器とを備えた他のキットが提供される。
以下の実施例では、本発明を作成し実施する好ましい様態のいくつかを記載する。しかしながら、これらの実施例はあくまでも例示のためであり、本発明の範囲を限定するものではない。また、実施例の記載が過去形でなされていない限り、その文章は、明細書の残りの箇所と同様、実験が実際に行われたまたはデータが実際に得られたことを示すものではない。
ここで用いるヒアルロナン(HA)ヒドロゲルは、架橋剤としてのアジピン酸ジヒドラジド(ADH、シグマ)と架橋したヒアルロナンの長鎖と、試薬としての1‐エチル‐3[3‐(ジメチルアミノ)‐プロピル]カルボジイミド(EDCI、シグマ)を用いて作成した。ヒドロゲルはすべて、Prestwich et al.(J. Control. Release, 1998, 53: 93-103)に記された手順に従い、高分子量のヒアルロナン(>1×106Da)から作成した。手短に言えば、ヒアルロナンに対するADHの比率と、EDCIに対するヒアルロナンの比率を、細胞粘着および細胞培養に最適なヒドロゲルが得られるように調整した。ADHとヒアルロナンとの比率が10:1、ヒアルロナンとEDCIとの比率が1:1のとき、もっともよい結果が得られた。ヒアルロナンとヒドラジドの架橋剤(ADH)をmilliQ水に溶かし、0.1N HClを加えてpHを4に調整した。カルボジイミド試薬(EDCI)をmilliQ水に溶かし、反応混合物に加え、2時間のあいだ優しくかき混ぜてゲル状にした。ヒアルロナンヒドロゲルは、0.1N NaClで2日間、次いで水とエタノールの混合液(3/1、v/v)で2日間、milliQ水で2日間平衡化させ、ADHを取り除いた。このようにして得られた架橋ヒアルロナンヒドロゲルを、本発明に従って処理した。
実施例1記載のようにして得られた架橋ヒアルロナンヒドロゲルを、まず凍結乾燥した。個々のヒドロゲルを透析し、プラスチックの容器に入れて凍結した。凍結に続いて、ヒドロゲルを凍結乾燥機(Alpha1‐2、性能:氷2kg/24時間、T=−55℃)に入れた。除去すべき水の量に応じて、凍結乾燥を4日から5日間行った。凍結乾燥されたヒドロゲルを、その後、−20℃で貯蔵した。
本発明に係る方法に従って処理し、造血幹細胞を播種した架橋ヒアルロナンヒドロゲルの倒立顕微鏡写真を、図1に示す。写真は播種後24時間経った時点で撮影した。この図には、隙間のいくつかに細胞が存在していること、およびヒドロゲルの多孔構造がはっきりと示されている。
フランスの倫理法に則り、児童の親に説明したうえで同意を得て、臍帯血標本を集めた。単核球(MNCs)を密度勾配分離(d=1.077、パーコール、シグマ、フランス)で分離した。得られた細胞をハンクス液(ユーロバイオ、フランス)で二度洗浄し、それからプラスチック接着によって単球を45分間(37℃、5%CO2)、10%のウシ胎仔血清(FCS)を含むRPMI1640中で減らした。
細胞播種の前に、ヒアルロナンヒドロゲルを100ng/mLのヒトSDF−1α(R&Dシステム、フランス)で補足したRPMI1640中で24時間培養し、それからPBSで洗浄して、細胞がヒドロゲルへ移動・移植するのを容易にした。
56日目にSEM画像撮影を行って、CD34+CBCsとヒアルロナンヒドロゲルの相互作用を調べた。造血細胞がマトリックスにしっかりと付着していた(図4)。
架橋ヒアルロナンヒドロゲルを作成するのに二つの異なる方法を用い、作成方法がヒドロゲルの性質に及ぼす影響を分析した。第一の方法は、実施例1と2に記載した方法と同じもの(すなわち、本発明に従った方法)であった。第二の方法は、100℃で殺菌したあと、ヒドロゲルを純粋アルコールに浸し、それから細胞培養触媒を用いて直接再水和化する点を除いては、第一の方法と同じものであった。言い換えれば、第二の方法では、ヒドロゲルを手で圧縮してヒドロゲル構造内部に閉じ込められている空気を取り除くことはしなかった。それから、細胞播種の前に、両組のヒドロゲル(すなわち、圧縮されたものとされていないもの)を100ng/mLのヒトSDF−1α(R&Dシステム、フランス)で補足したRPMI1640中で24時間培養し、それからPBSで洗浄して、細胞がヒドロゲルへ移動・移植するのを容易にした。それから、実施例3に記載したように、CD34+CBCsをヒドロゲルに播種した。
ここに開示された本発明の明細書または実施を考慮すれば、本発明の他の実施形態は当業者には明らかであろう。本明細書及び実施例はあくまでも例示であり、本発明の真の範囲は以下の請求項によって示される。
Claims (7)
- 3D細胞培養に適した架橋ヒアルロナンヒドロゲルを得る方法であって、
(a)架橋ヒアルロナンヒドロゲルを凍結乾燥して凍結乾燥ヒアルロナンヒドロゲルを得る工程または凍結乾燥ヒアルロナンヒドロゲルを提供する工程と、
(b)凍結乾燥されたヒアルロナンヒドロゲルを殺菌する工程とを含み、
凍結乾燥されたヒアルロナンヒドロゲルを殺菌する工程は、まずヒドロゲルを加熱する工程と、次いでヒドロゲルを純粋アルコールに室温で浸す工程と、浸されたヒドロゲルを物理的に圧縮する工程とを含み、
浸されたヒドロゲルを物理的に圧縮する工程では、ヒドロゲルに閉じ込められている空気を取り除く、方法。 - 加熱する工程は、100℃でオイルバスを用いて一時間行われる、請求項1に記載の方法。
- 殺菌前に、凍結乾燥されたヒアルロナンヒドロゲルを所望の形状及び寸法に切り分ける工程をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 殺菌の後に、殺菌されたヒアルロナンヒドロゲルを−20℃の無菌状態で貯蔵する工程をさらに含む、請求項1ないし3のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(b)の後に、殺菌されたヒドロゲルを、膨張平衡に達するまで再水和化する工程をさらに含む、請求項1ないし4のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養媒体において、殺菌されたヒドロゲルを再水和化する、請求項5に記載の方法。
- 再水和化の後に、再水和化されたヒアルロナンヒドロゲルを、37℃、5%CO2雰囲気中で、抗生物質を含む再水和化媒体で貯蔵する工程をさらに含む、請求項5または6に記載の方法。
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