KR20110008013A - 재건된 각막 및 점막 - Google Patents

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니콜라 베쉐뜨왈
발르리 안드레
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바스프 뷰티 케어 솔루션즈 프랑스 에스에이에스
상뜨르 나쇼날 드 라 러쉐르쉬 샹띠피끄 (쎄엔알에스)
호스피스 시빌 드 리옹
위니베르시테 끌로드 베르나르 리옹 Ⅰ
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Abstract

본 발명은 특히 조직 공학에 사용될 수 있는 재건된 각막의 모델, 재건된 각막을 제조하기 위해 사용될 수 있는 생체물질, 및 또한 재건된 각막 모델의 더 나은 배양 재현성을 가능하게 하는 배양 장치에 관한 것이다.

Description

재건된 각막 및 점막 {RECONSTRUCTED CORNEA AND MUCOUS MEMBRANE}
본 발명은 조직 공학에서 재건된 각막의 모델, 재건된 각막의 제조를 위해 사용될 수 있는 생체물질, 및 또한 재건된 각막의 모델 뿐만 아니라 재건된 각막 간질의 더 나은 배양 재현성을 가능하게 하는 배양 장치에 관한 것이다.
본 발명은 또한 점막의 모델 및 상기 모델을 제조하기 위한 배양 장치에 관한 것이다.
조직 공학에 의한 각막의 재건은 약리독물학적 모델을 수득하고 그들의 치료적 용도에 대한 진보를 목적으로 한다 (Germain 등, 2000; Carlsson 등, 2003). 현재의 모델들은 지지체, 일반적으로, 간질을 재건하기 위해 그 안에 각막간질세포가 분산되어 있는 콜라겐 겔로 이루어져 있다. 상기 간질은 그 후 상피 세포 및 경우에 따라서는 내피 세포로 접종되어 인공 각막을 재건한다. 충분한 수의 잘 특성화된 세포를 갖는 것이 필수적이다. 그러한 배양물을 수득하기 위해 두 가지 방법이 존재한다: 감염된 세포주를 이용하는 것, 또는 1차적인 인체 세포를 가지고 배양을 시작하는 것. 후자의 방법이 생리학에 더 근접한 모델을 제공하는 것과 가능한 요법에 대하여 방법을 열어준다는 두 가지 장점을 갖는다.
가장자리에 위치한 각막 상피 줄기 세포만이 확인되고 특성화되었다 (Pellegrini 등, 1999; 2001). 내피 세포의 배양은 초기 단계에 있고, 낮은 증식 능력으로 인해 수득되는 양이 중간 정도에 머무른다. 슈발베 (Schwalbe) 세포주에 가까운 내피 원종의 존재가 추정되기는 해도, 내피 줄기 세포는 확인되지 않았다. 상기 모델에 사용된 내피 세포는 감염된 세포주로부터 유래된다 (Reichl 등; Griffith 등, 1999).
각막간질세포는 생리적 상태에서 무활동성이고, 본래의 장소에서 형태학적으로 잘 정의되어 있다. 이들은 환경 조건에 따라 상이한 표현형을 갖는다. 이들은 체내에서 적어도 3종의 각막간질세포 표현형을 갖는다: 무활동성 각막간질세포, 활성 각막간질세포 (섬유아세포) 및 근섬유아세포 (Musselmann 등, 2003). 이러한 3 가지 표현형에, 각막 두께에서 그들의 위치의 함수로서 형태학적으로 상이한 3 가지 유형의 각막간질세포가 첨가된다. 인체에서는, 전방 간질 (0-200 μm), 중간 간질 (200-400 μm) 및 후방 간질(400-600 μm)의 각막간질세포 사이에 형태계측적 차이가 존재한다. 본래의 장소에서, 그들이 납작하게 펴발라진 경우, 세포의 평균 크기는 약 300-400 μm(투과 전자 현미경으로 측정)이다. 이들 세포가 현탁액 중에 있을 경우, 이들은 구형이 되고, 그들의 크기는 훨씬 작지만 그 본래 위치에서의 크기에 비례를 유지한다 (약 5-20 μm). 이들 세 집단 사이의 가장 큰 차이는 세포 부피이다: 전방 및 중앙 각막간질세포는 약 5x103 μm3의 동일한 부피를 갖는 한편, 후방 간질의 각막간질세포는 약 14.4x103 μm3의 더 큰 부피를 갖는다 (Hahnel 등, 2000).
표현형은 특정 표지에 의해 구별될 수 있다: 특히, 항원 CD34가 각막에서 각막간질세포 표현형의 표지로 확인되었다. 매끈한 근육 α-액틴(α-SMA)은 근섬유아세포의 액틴 아이소형 특징이며, 이는 흉터형성 과정 도중 각막간질세포의 근섬유아세포로의 변형 도중 나타난다. 흉터형성 과정 중 통상적인, 근섬유아세포의 세포자멸사에 대한 경향, 및 그의 콜라겐 합성에 있어서의 정성적 차이는 상기 표현형으로부터 조직 공학에서 간질의 재건을 허용하지 않는다 (Jester 등, 2003; Gabbiani 2003).
다양한 세포 유형을 배양하기 위해 다른 세포 배양 지지체가 본 출원인에 의해 이미 기재되었다. 그러나 이들 지지체에 사용된 생체물질은 대략 150 내지 200 마이크로미터의 평균 세공 직경을 갖는 보다 높은 세공 크기를 갖는다. 이러한 지지체는 적절한 증식을 허용하지 않고 따라서 재건된 간질의 표면 위에 양호한 상피형성을 허용하지 않는다.
즉, 선행 기술은 각막 세포의 배양을 위해 실제로 적정화된 모델을 제시하지 않고 있다. 현재로서, 각막의 만족스런 모델, 특히 세포 회복 능력 또는 세포 재생 능력을 갖는 각막의 모델이 존재하지 않는다. 본 발명은 이러한 문제점을 극복하기 위해 제시된다.
본 발명의 주된 목적은 각막의 모델을 형성할 수 있는 세포를 배양하기 위한 신규의 지지체 또는 장치, 및/또는 조직 공학에서 재건된 각막 유형의 생체물질, 및/또는 재건된 각막 간질의 모델 및/또는 재건된 각막의 모델을 제공하는 데 있어서 새로운 기술적 문제를 극복하는 것이다.
본 발명의 목적은 재생 능력을 갖는 재건된 각막의 모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 특히 자동화되고 산업적인 방법에서 그러한 배양 장치를 제공하는 것이다. 즉, 본 발명의 목적은, 특히 고-처리량의 스크리닝(screening)이 수행될 수 있도록, 그러한 배양 장치를 재현성있게, 안전하게, 그리고 신뢰성있게, 산업 및 의학적 사용을 위한 대규모로 제조하기 위한 무균의 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한, 특히 화장품 및 약리학적 응용을 위해 동물에 대한 독성 시험에 대하여 대체물로 사용될, 각막의 모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한 점막, 특히 토끼 눈 위에 수득된 것과 같은, 조직 복구를 시뮬레이트하는 데 허용되는 각막의 모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한, 특히 각막 이식 또는 교정 외과술에 사용하기 위한 재건된 각막을 제공하는 것이다.
본 발명은 각막 세포 및/또는 점막 세포가 인체 각막이 아닌 조직 지지체 위에서 또는 그 안에서, 산업적이고 신뢰할 만하며 저비용인 자동화가능한 방식으로 배양되는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 맥락에서, 특별한 언급이 없을 경우, "각막"은 반-각막(hemicornea)과 같이 적어도 부분적으로 재건된 각막 및 각막의 완전히 재건된 구조로 이해되어야 한다.
본 발명의 맥락에서 "각막 간질"은, 적어도 각막 간질 세포, 바람직하게는 각막 간질세포 및 각막 세포를 배양하기 위한 세포 배양 지지체를 포함하는, 각막 간질, 특히 인체 각막 간질의 모델로 이해되어야 하며, 상기 지지체는 그 다공도가 10 내지 100 마이크로미터인 다공성 매트릭스의 형태로 적어도 1종의 생체고분자를 포함한다.
첫번째 국면에 따르면, 본 발명은 각막 또는 점막 세포를 배양하기 위한 세포 배양 지지체(또는 세포 배양 기질 또는 생체물질)에 관한 것이며, 상기 지지체는 각막 또는 점막 간질 세포를 배양하는 데 적합한 적어도 1종의 생체고분자로 된, 임의로 탈수된 수성 겔을 포함한다.
바람직한 실시양태에 따르면, 상기 수성 겔은 탈수된 것이고, 10 내지 100 마이크로미터, 바람직하게는 30 내지 70 마이크로미터, 더욱 바람직하게는 40 내지 50 마이크로미터의 다공도를 갖는다.
임의로 탈수된 수성 겔은 또한 또 다른 세포 유형, 예를 들면 각막 또는 점막 상피 세포 및/또는 내피 세포를 배양하는 데도 적합하다.
유리하게는, 상기 세포는 인체 세포, 예를 들면 1차 인체 세포 또는 세포주로부터 유래된 세포이다.
유리하게는, 본 발명에 따르는 지지체는 적어도 1종의 생체고분자의 수용액을 기재로 하는 수성 겔을 포함한다.
"~을 기재로 하는 물질"이라는 표현은 고려되는 물질을 포함하거나 그것으로 주로 이루어지거나 그것만으로 이루어진 물질을 의미한다. 즉, 예를 들면 적어도 1종의 생체고분자를 기재로 하는 물질은 바람직하게는 적어도 2종의 생체고분자를 혼합물로 포함한다.
"생체고분자"라는 용어는 대사 과정에서 및 살아있는 생물의 유지에서 구조 및 기능적 조직화에 관여하는 고분자를 의미하며, 이는 어쩌면 살아있는 생물에 의해 합성된다. 생체고분자는 일반적으로 아미노산, 및/또는 뉴클레오티드, 및/또는 탄수화물 사이에 공유 결합을 포함한다. "생체고분자"라는 용어는 또한 자연에서 발견되는 것들과 동일하지만, 예를 들면 합성 등의 다른 방법에 의해 수득되는 생체고분자를 의미한다. 살아있는 생물의 고분자 구조의 형성에서, 그리고 바람직하게는 세포외 매트릭스(ECM)에서 기능하는 고분자가 바람직하다. 즉, 바람직한 생체고분자는 콜라겐, 피브로넥틴 또는 라미닌과 같은 당단백질, 또는 엘라스틴과 같은 순수한 단백질, 또는 임의로 치환된 다당류, 예를 들면 키틴 또는 키토산에서 선택된다. 이들 생체고분자는 물론 재조합 또는 단리된 생체고분자(인공적 또는 천연 근원)일 수 있다.
바람직하게는, 수성 겔은 ECM의 고분자, 바람직하게는 적어도 1종의 당단백질의 수용액을 기재로 하며, 더욱 바람직하게는 콜라겐의 수용액을 기재로 한다. 유리하게는, 상기 당단백질, 및 바람직하게는 콜라겐은, 임의로 치환된 적어도 1종의 다당류와 조합된다. 콜라겐은 특히, 소, 돼지, 말 또는 바다 생물의 것이고, 바람직하게는 V 형 콜라겐과 임의로 조합된 I/III 형 콜라겐이며, 이는 콜라겐 IV 및/또는 VI 및/또는 VII로 보충되거나 보충되지 않을 수 있다.
생체고분자, 바람직하게는 당단백질, 더욱 바람직하게는 콜라겐은 임의로 치환된, 1종 이상의 다당류, 예를 들면 글리코사미노글리칸, 예컨대 콘드로이틴 4-설페이트, 콘드로이틴 6-설페이트 또는 히알루론산, 또는 이들의 혼합물, 및/또는 키틴 및/또는 키토산; 및/또는 1종 이상의 프로테오글리칸과 바람직하게 조합된다.
바람직하게는, 임의로 개질된, 적어도 1종의 다당류와 키토산이 조합된다.
생체고분자들 사이에 최종 건조 물질에 대한 중량 백분율 분포는: 콜라겐 (60-90), 키토산 (10-30), 글리코사미노글리칸 (0-15); 유리하게는, 콜라겐 (62-72), 키토산 (20-25), 글리코사미노글리칸 (8-12); 특히 콜라겐 (72), 키토산 (20), 글리코사미노글리칸 (8)이다.
세포 배양 지지체는, 특히 매트릭스나 스펀지를 형성하는, 겔 또는 탈수된 겔일 수 있다. 탈수는 열에 의한 탈수 또는 동결-건조에 의해 수득될 수 있다.
본 발명에 사용되는 "다공도"라는 용어는 평균 세공 직경으로 이해되어야 한다. 평균 세공 직경은 선행 기술에서 알려진 방법으로 측정될 수 있다. 예를 들면, 이는 50x 내지 7000x 범위의 배율로 주사 전자 현미경 분석으로 측정될 수 있다. 니콘(Nikon, France)에 의해 시판되는 루시아(Lucia™) 5.02 버전과 같은 소프트웨어가, 특히 자동 장치 하에, 영상 분석을 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 사용되는 "균질 재분배"라는 용어는 생체물질 내의 거의 동일한 세공 재분배로 이해되어야 한다. 제조 방법은 생체물질 내에 세공 구배를 만들거나 만들지 않도록 조절될 수 있다. 그러한 균질 재분배는 신속한 동결-건조 단계에 의해 특히 수득될 수 있다.
이미 언급한 것과 같이, 10 내지 100 마이크로미터, 바람직하게는 30 내지 70 마이크로미터, 더욱 바람직하게는 40 내지 50 마이크로미터의 다공도를 갖는 적어도 1종의 생체고분자를 포함하는 겔의 탈수에 의해 제조된 세포 배양 지지체가 각막 간질 세포의 매우 양호한 배양을 가능하게 하고, 상피 형성을 가능하게 하며, 양호한 품질의 재건된 각막 및/또는 재건된 점막을 제조할 수 있게 한다는 것이 완전히 놀랍게도 발견되었다. 이러한 맥락에서 ECM의 고분자, 바람직하게는 콜라겐을 생체고분자로 사용하는 것이 바람직하다.
유리하게 사용될 수 있는 임의로 치환된 다당류 중에, 키틴 또는 키토산과 임의로 조합된 글리코사미노글리칸(GAG)이 있다.
유리하게는, 배양 지지체는, 임의로 개질되어, 특히 탈수되는 경우에, 각막 및/또는 점막 간질 세포의 매우 양호한 배양을 가능하게 하는, 콜라겐, 적어도 1종의 다당류 및 키토산의 혼합물을 기재로 하는 수성 겔이다.
개질된 키토산의 언급될 수 있는 예는, 의도되는 용도의 함수로 조절된 일정 정도의 아실화, 바람직하게는 아세틸화를 갖는 키토산이며, 아세틸화의 다양한 정도는 당업자에게 공지되어 있고, 특히 본원에 그 전체로서 참고문헌으로 도입되는 상기 언급된 유럽 특허 EP 0 296 078에 기재되어 있다.
즉 본 발명은 또한 상기 배양 지지체에 의해 형성되고, 각막 또는 점막 간질 세포의 배양을 가능하게 하는 다공성 매트릭스에 관한 것이다. 이는 다공성 구조로 인해 스펀지라 불린다. 표현형 및 각막간질세포의 형태의 다양성은, 근섬유아세포를 제외하고는, 현재 모델의 간질 부분의 재건에 있어 현재까지 본 발명자들의 지식에 고려되지 않았다. 이를 고려하는 것이 더 나은 세포 배양을 위해 중요한 것으로 나타난다. 시중에서 현재 제안되는 배양 모델은 각막 세포를 배양하는 데 적합하지 않다. 본 발명은 각막 세포를 배양하는 데 적합한 배양 모델을 제안한다.
본 발명에서, "세포를 배양하는 데 적합"이라는 표현은 세포 배양 지지체 또는 모델을 제조할 필요에 대하여 만족할만한 증식을 가능하게 하는 모델을 의미한다.
특히, 본 발명은 각막 세포를 배양하기 위한 세포 배양 지지체를 포함하며, 상기 지지체는, 그 세공 크기가 각막 간질 세포가 확산되어 지지체 내에 부착될 수 있도록, 그리고 각막 간질 세포, 특히 각막 간질세포의 증식을 가능하게 하도록 정의되는, 다공성 매트릭스 형태인 적어도 1종의 생체고분자를 포함한다. 다른 다양한 종류의 세포의 증식, 바람직하게는 상피형성을 위해 적합한 재건된 간질이 수득되며, 세포 회복 능력, 특히 상피 재생 능력을 갖는 각막이 제공된다. 즉 다공도는 10 내지 100 마이크로미터, 바람직하게는 30 내지 70 마이크로미터, 더욱 바람직하게는 40 내지 50 마이크로미터로 이루어진다.
각막 간질세포의 증식은 실시예 4에서 특히 설명되고 보여진다. 상기 재생 능력 또는 세포 회복은 SDS 처리 후 실시예 8 및 9에서 특히 설명되고 보여진다.
본 발명의 세공 크기는, 세포가 표면 위에 부착된 후 상기 매트릭스를 자연스럽게 침투하고, 이어서 지지체의 섬유에 부착되는 한, 구배를 필요로 하지 않는다. 즉, 세포가 커다란-크기의 세공에 의해 침투된 다음 물질의 깊이의 함수로서 세공 크기를 줄임으로써 부착되게 할 필요가 없다. 세공의 크기는 세포, 특히 간질 세포를 허용하기에, 상기 매트릭스 내에 확산 또는 침투되기에 충분하게 크지만, 상기 세포가 벽에 부착되고, 매트릭스에 부착되지 않고 그를 통과하지는 않도록 충분히 작다. 유리하게는, 상기 세공의 크기 분포는 균일하다. 본 발명에 기재된 생체물질 제조 방법은 그러한 균질의 세공 크기 분포를 가능하게 한다.
바람직한 실시양태에 따르면, 세공 크기 분포는 적어도 50％의 세공 직경이 목표한 다공도를 갖도록 한다.
유리하게는, 세공은 본 발명의 생체고분자(들)를 포함하는 용액으로부터 용매를 제거함으로써 (수용액의 경우 탈수) 형성된다. 생체고분자는 본 발명에서 설명된 바와 같이 단독으로 또는 혼합물로 존재할 수 있다.
유리하게는, 상기 다공성 매트릭스는 임의로 개질된, 콜라겐, 적어도 1종의 다당류 및 키토산의 혼합물을 기재로 하며, 바람직하게는 상기 혼합물의 총 건조 중량에 대한 건조 중량 백분율로 60％ 내지 90％의 콜라겐 비율, 0 내지 15％의 GAG, 및 10％ 내지 30％의 키토산 비율을 갖는다.
상기 다공성 매트릭스를 제조하는 방법은 본 발명에 기재된 변법을 포함한다.
상기 탈수 공정의 변수는 수득되는 다공도에 의존하며, 이는 배양될 각막 세포 또는 점막 세포의 크기에 적응된다. 즉 본 발명은 각막 또는 점막 세포를 배양하기 위한 세포 배양 지지체에 관한 것이며, 상기 지지체는 각막 또는 점막 간질 세포를 배양하는 데 적합한 적어도 1종의 생체고분자의, 임의로 탈수된, 수성 겔을 포함하고, 임의로 탈수된 상기 수성 겔은 간질 세포, 특히 각막 간질 세포 또는 점막 간질 세포를 배양하는 데 적합한 다공도를 갖는다. 상기 배양 지지체는 일반적으로 10 내지 100 마이크로미터의 다공도(평균 직경)를 갖는다. 30 내지 70 마이크로미터, 더욱 특별하게는 40 내지 50 마이크로미터, 예를 들면 42 내지 49 마이크로미터의 다공도가 바람직하게 지향된다. 다공도의 계산은 50x 내지 7000x 범위의 배율에서 주사 전자 현미경 연구에 의해 수행된다.
사용될 수 있는 콜라겐 겔 중에, 콜라겐 IV 및/또는 VI 및/또는 VII로 보완되거나 보완되지 않은, 콜라겐 V 형과 임의로 조합된 I/III 형의 콜라겐이 있다. 유리하게는, 상기 배양 지지체는, 임의로 개질된, 콜라겐, 글리코사미노글리칸 및 키토산의 혼합물을 기재로 하는, 임의로 탈수된 수성 겔이며, 간질 세포를 배양하는 데, 특히 탈수 후 스펀지를 수득하는 데 적합한 농도를 갖는다. 상기 농도는 일반적으로, 수성 매질(일반적으로 물, 바람직하게는 실험실용 물 또는 증류수)에 대하여, 임의로 개질된 콜라겐, 글리코사미노글리칸 및 키토산의 혼합물의 1.25％ 내지 1.6％이다. 상기 농도는 탈수 후 수득되는 스펀지의 다공도에 영향을 준다. 즉, 다공도는 겔의 점도에 의존한다.
유리하게는, 다공성 물질의 층의 제조는 상기 수성 겔을 동결-건조함으로써, 특히 -30℃ 내지 -196℃의 온도에서, 바람직하게는 산업적 이유로 -40℃ 내지 -80℃의 온도에서 동결시킴으로써 수행된다. 상기 온도는 지지체의 다공도에 영향을 주며, 원하는 다공도에 적응되어야 한다.
본 발명은 또한, 오목부 및 앞에서 정의된 적어도 1종의 지지체를 포함하여, 배양될 세포를 배양하기 위한 층을 형성하고, 상기 층은 상기 장치의 오목부 내에 직접 부어진 적어도 1종의 생체고분자의 수성 용액의 겔화에 의해 수득되는, 각막 또는 점막 세포를 배양하기 위한 세포 배양 장치에 관한 것이다.
하나의 특별한 실시양태에 따르면, 각막 또는 점막 세포를 배양하기 위한 상기 세포 배양 장치는 오목부 및 앞에서 정의된 적어도 1종의 지지체를 포함하여, 배양될 세포를 배양하기 위한 층을 형성하고, 상기 층은 상기 장치의 오목부 내에 직접 부어진 적어도 1종의 생체고분자의 수성 겔의 탈수에 의해 수득된다.
특허 FR 2 881 434에 기재된 장치가 본 발명에 특히 적합한데, 무엇보다도 이는 세포 배양 지지체의 자동화된 제조에 적합하기 때문이다. 상기 세포 배양 지지체 장치는 산업적 용도에, 특히 고-처리량 스크리닝에 적합하다.
하나의 실시양태에 따르면, 상기 장치는 "간질 영역"이라 언급되는 간질 세포를 배양하기 위한 제1 영역, 및 "상피 영역"이라 언급되는 상피 세포, 또는 "내피 영역"이라 언급되는 내피 세포를 배양하기 위한 제2 영역을 포함한다. 또 하나의 실시양태에 따르면, 상기 장치는 "간질 영역"이라 언급되는 간질 세포를 배양하기 위한 제1 영역, 및 "상피 영역"이라 언급되는 상피 세포를 배양하기 위한 제2 영역, 및 "내피 영역"이라 언급되는 내피 세포를 배양하기 위한 제3 영역을 포함한다.
"간질 영역", "상피 영역" 및 "내피 영역"이라는 용어는 간질 세포, 상피 세포 및 내피 세포, 및 또한 그들이 분비하거나 합성하는 분자를 포함하는 그들의 세포 환경을 각각 주로 포함하는 구획을 의미한다.
하나의 특별한 실시양태에 따르면, 전술한 세포 배양 기질 또는 지지체의 몸체가 전술한 간질 영역을 형성하고, 상기 배양 기질 또는 지지체의 표면이 상피 또는 내피 영역의 기초를 형성한다. 상기 실시양태에서, 예를 들면 간질 세포를 세포 배양 지지체의 표면 위에 접종하는 것이 가능하다. 상기 간질 세포는 지지체의 몸체를 침투하고, 이동하여 세포외 매트릭스를 합성함으로써, 지지체의 세공의 점차적인 충전을 가능하게 한다. 간질 세포를 생체고분자의 수용액에 접종한 다음, 상기 수용액을 겔화시켜 접종된 세포를 포함하는 생체고분자 수성 겔을 수득하는 것도 가능하다. 다음, 상피 또는 내피 세포를 상기 배양 지지체 또는 기질의 표면 위에 접종한다.
유리하게는, 상피 영역은 간질 영역으로부터 구별되며, 각막간질세포를 배양하기 위한 다공성 물질의 층을 포함한다.
유리하게는, 상기 장치는 장치의 오목한 부피 내에 삽입하기 적합한 크기의 삽입물(또는 나셀 (nacelle))을 포함한다. 세포 배양 지지체 기질이 상기 삽입물 또는 나셀 내에 위치할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 적어도 1종의 생체고분자의 수성 겔을 상기 삽입물의 바닥 내에 붓는다. 수용액의 경우, 이 용액은 삽입물의 바닥에서 겔화된다. 상기 수성 겔은 바람직하게는 탈수된다. 상기 겔은 상기 정의된 것과 같은 기질 또는 지지체를 포함한다.
삽입물이 사용되는 경우, 배양 배지는 바람직하게는 상기 오목부의 바닥 내로 도입되고, 세포는 삽입물 내에 위치한 기질 위에서 배양된다. 그러나, 상기 기질은 세포를 배양하기 위한 배양 배지에 침지된 오목부의 바닥에 위치할 수도 있다. 수성 겔을 오목부 및/또는 상기 나셀 내에 직접 붓는 것이 유리하다. 나셀의 다공성 물질을 제조하기 위해 사용되는 수성 겔은 상기 오목부의 다공성 물질을 제조하는 데 사용되는 것과 상이할 수 있다. 유리하게는, 나셀의 다공성 물질은, 임의로 개질된 다당류 및/또는 키토산과 바람직하게 혼합된, 콜라겐을 포함한다.
특히, 상기 삽입물은 그 어깨부를 상기 오목부의 가장자리의 적어도 일부 위에 위치시킴으로써 상기 오목부 내에서 삽입물을 제자리에 유지시킬 수 있는 어깨부를 포함한다.
본 발명의 또 하나의 유리한 양상에 따르면, 상기 장치는, 기질 위에 수축-방지 효과를 줌으로써, 그리고 또한 바람직하게는 상기 기질과 그를 마주보는 바닥의 내벽의 주변 계면에서 누출-밀폐성을 보장함으로써, 임의로 다공성 기질로 된 층의 적어도 주변 가장자리를 제자리에 유지시키기 위한 요소를 바람직하게 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 맥락에서, 상기 주변부 누출-밀폐성은 주변부에서 물질의 교환을 방지하기 위해, 즉 기질의 상부 표면 위에 부착된 물질과, 기질에 존재할 수 있는 배양 배지 또는 세포 사이에, 기질의 측부 가장자리를 통한 소통을 방지하도록 유리하게 구비된다.
본 발명의 하나의 특별한 실시양태에 따르면, 상기 언급된 위치-유지 요소는 기질의 주변 가장자리 위에 견디기 충분한 크기의 환형 고리를 포함한다.
본 발명의 또 하나의 유리한 양상에 따르면, 상기 장치는 상기 나셀의 바닥이 제거가능하고 나셀에 조여질 수 있으며, 나셀은 그 자체가 상기 오목부에 조여질 수 있음을 특징으로 한다.
본 발명의 또 하나의 유리한 양상에 따르면, 상기 장치는 상기 나셀의 제거가능한 바닥이 오목부 내에 온화한 힘-조절 또는 클립고정에 의해 조여질 수 있고, 따라서 누출-밀폐성을 안전하고도 신뢰할 만하게 보장하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 유리한 양상에 따르면, 상기 장치는 상기 나셀의 제거가능한 바닥이 오목부 또는 나셀의 외부에 조여지고, 따라서 상기 오목부 또는 나셀의 측벽의 하부 가장자리가 상기 기질의 주변 가장자리를 제자리에 유지하기 위한 요소를 구성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 유리한 실시양태에 따르면, 상기 장치는 배양 웰 하나 당 복수의 나셀 또는 삽입물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 실시양태의 또 하나의 유리한 실행 변법에 따르면, 상기 장치는 또한 나셀 또는 삽입물이 존재하는 수 만큼의 오리피스가 구비된 뚜껑을 포함하고, 각각의 오리피스는 나셀 또는 삽입물을 수납하고 제 위치에 유지하는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 하나의 유리한 양상에 따르면, 상기 장치는 다공성 기질을 함유하는 오목부 또는 나셀 또는 삽입물의 적어도 바닥이 상기 탈수 후에 멸균되고, 바람직하게는 누출-밀폐 포장된 것을 특징으로 한다.
유리하게는, 상기 장치는 멸균된다. 바람직하게는, 전체 배양 장치가 멸균되고, 유리하게는 누출-밀폐 포장 안에서 컨디셔닝된다.
본 발명의 또 하나의 유리한 양상에 따르면, 상기 언급된 멸균은, 바람직하게는 베타 선 또는 감마 선을 이용하는 광조사에 의한 멸균 또는 에틸렌 옥시드와 같은 멸균 기체를 이용한 처리로 이루어지는 군에서 선택된다.
유리하게는, 상기 바닥 또는 나셀의 내벽의 적어도 일부는, 세포 배양을 촉진하기 위해, 예를 들면 세포의 부착 및/또는 증식을 촉진하는 피복을 이용하여, 물리적으로, 화학적으로 또는 생물학적으로, 또는 이들의 조합으로 처리된다.
본 발명의 맥락에서, 상기 벽의 재료, 유리하게는 플라스틱 재료의 총 이온 전하를 조절하는 임의의 물리적 또는 화학적 공정이 사용되고/되거나, 세포의 부착 및/또는 증식을 촉진하는, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 등과 같은 임의의 생물학적 분자를 갖는 벽의 피복이 사용될 수 있다.
하나의 변법에 따르면, 바닥 또는 나셀의 내벽의 적어도 일부는, 특히 천연 조직, 예를 들면 상피의 줄무늬 또는 공동을 모방하도록, 표면 이완을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 유리한 실시양태에 따르면, 상기 장치는 오목부 또는 나셀의 적어도 바닥이, 예를 들면 합성 물질, 니트로셀룰로오스-기재 물질, 나일론과 같은 폴리아미드-기재 물질, 폴리테트라플루오로에틸렌- 또는 테플론(Teflon®)-기재 물질, 폴리카르보네이트-기재 물질, 반-투과성 폴리에틸렌- 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET)-기재 물질, 폴리에스테르-기재 물질, 예를 들면, 셀룰로오스 폴리에스테르, 특히, 아세테이트, 반-투과성 비오포어-씨엠 (Biopore-CM®) 막을 기재로 하는 물질, 또는 폴리비닐피롤리돈으로 이루어진 군에서 선택된 비활성 지지체 물질로 제조되는 것을 특징으로 한다.
두 번째 국면에 따르면, 본 발명은 위에 정의된 장치를 제조하기 위한 자동화된 방법에 관한 것이다.
유리하게는, 예를 들면 그 자체가 컴퓨터에 의해 제어되는 로봇 또는 자동화 장치에 의해 제어되는 배양 배지의 주입 또는 흡입을 위한 장치와 같은 세포 배양 장치의 배치를 바람직하게 가능하게 하기 위해, 로봇화 또는 자동화 플랫폼이 사용될 수 있다.
유리하게는, 상피 또는 내피 영역이 간질 영역 위에 자동으로 부착된다.
유리하게는, 자동화 장치에 의해 수성 겔을 붓고/거나 자동화 장치에 의해 세포를 접종한다.
세 번째 국면에 따르면, 본 발명은 위에 정의된 장치를 포함하는 누출-밀폐 포장에 관한 것이다.
네 번째 국면에 따르면, 본 발명은 적어도 각막 또는 점막 간질 세포 (각각) 및 상기 각막 또는 점막 간질 세포를 배양하기 위한 적어도 1종의 지지체를 각각 포함하고, 상기 지지체는 위에 정의된 바와 같은, 각막 또는 점막, 특히 인체 각막 또는 점막의 모델에 관한 것이다.
유리하게는, 상기 모델은 또한 각막 또는 점막 상피 세포 및/또는 내피 세포, 바람직하게는 각막 또는 점막 상피 세포 및/또는 내피 세포를 포함한다.
접종된 세포의 종류는 세포외 매트릭스의 신규합성(neosynthesis)에, 또는 상피 및 내피와의 상호작용에 주된 영향을 줄 수 있다. 각막 간질과 유사한 인공 간질을 재건하기 위해, 각막간질 줄기 세포를 사용하거나, 아니면, 높은 증식 능력이 부여되고 그 생체 내 해당부분과 가능한 한 가까운 표현형 특성을 여전히 나타내는 각막간질세포를 사용하는 것이 유리하다.
본 발명은 또한, 조직, 바람직하게는 인체 조직 상에서 소정의 샘플링 영역을 선택하고, 샘플링된 각막 간질세포 또는 간질 세포를 표현형 분류하여 높은 증식 능력을 갖는 세포를 선택하는 것을 포함하는, 각막 간질세포 또는 간질 세포를 그들의 증식 능력의 함수로 선택하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 위에 정의된 바와 같은 각막 또는 점막의 모델의, 특히 화장품 및 약리학에서 동물에 대한 독성 시험의 대체 시험 모델로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 위에 정의된 각막 모델의, 특히 각막 이식 또는 교정 외과술에 사용하기 위한, 재건된 각막의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
유리하게는, 상기 모델은 위에 정의된 것과 같은 장치에서 또는 위에 정의된 방법에 의해 제조된다.
본 발명에 의해, 위에 언급된 다양한 기술적 문제가 산업적 및 의학적 규모에서, 특히 약제학 및 화장품 규모에서 만족스럽고도, 간단하게, 안전하고도 신뢰할 만하게, 그리고 재현성있게 해결되는 것으로 이해된다.
본 발명에 기재되고, 재건된 각막을 배양하기 위한 생체물질의 사용에 유리하게 적응된 배양 장치를 도 1 및 2에 나타낸다.
도 1은 본 발명에 따르는 생체물질이 제조되는 다양한 배양 포맷의 예를 보여준다. 왼쪽부터 오른쪽으로 96-웰 플레이트, 24-웰 플레이트, 12-웰 플레이트 및 6-웰 플레이트를 나타낸다.
도 2a는 본 발명에 따르는 생체물질이 제조될 수 있는 배양 삽입물의 원근법에 의한 사진이고, 도 2b는 위에서 본 사진이다. a는 트랜스웰 (Transwell®) 삽입물(Corning, 직경 24 mm)을 나타내고, b는 스냅웰 (Snapwell®) 삽입물(Corning, 직경 12 mm)을 나타내며, c는 네트웰 (Netwell®) 삽입물(Corning, 직경 24 mm)을 나타내고, d는 배양 삽입물(Nunc, 직경 25 mm)을 나타내며, e는 틴서트 (Thincert®) 삽입물(Greiner bio-one, 직경 24 mm)를 나타내고, f는 셀크라운 (CellCrown) 삽입물(Scaffdex, 직경 24 mm)을 나타낸다. 도 2b에서, 삽입물은 6-웰 배양 플레이트에 위치하고 있다. 도 2c는 아래에는 밀리셀 (Millicell®) 플레이트(Millipore, 직경 9 mm), 왼쪽에는 집합적인 지지체 플레이트, 그리고 오른쪽 위에는 24-웰 플레이트를 갖는 여타 배양 플레이트를 보여준다.
도 3은 정상인 인체 각막의 상피 세포 및 각막간질세포의 배양 사진을 보여준다. 사진 3a는 광조사된 섬유아세포의 자양 층 위에서 인체 각막 상피 세포의 생체 외 배양을 나타낸다. 사진 3b는 인체 각막 간질세포의 생체 외 배양을 보여준다.
도 4는 72％ 콜라겐, 8％ 글리코사미노글리칸 및 20％ 키토산으로 이루어진, 본 발명에 따르는 생체물질의 주사 전자 현미경에 의한 시각화 연구를 보여준다. 이러한 시각화는 상이한 백분율의 건조 물질 및 상이한 동결-건조 온도에서 수행된다.
도 5는 본 발명의 생체물질을 이용하여 재건된 인체 각막 간질의 생체 외 제조의 조직학적 연구를 나타낸다. 도 5a는 1.6％의 건조 물질을 포함하고, -80℃의 온도에서 동결 단계를 거쳐 제조된 생체물질을 나타낸다. 도 5b는 1.4％의 건조 물질을 포함하고, -40℃의 온도에서 동결 단계를 거쳐 제조된 생체물질을 나타낸다. 도 5c는 1.25％의 건조 물질을 포함하고, -40℃의 온도에서 동결 단계를 거쳐 제조된 생체물질을 나타낸다.
도 6은, 상이한 배양 일수(D7, D14, D28)에, 550 nm에서의 OD(광학 밀도) 값으로 환산된, 본 발명에 따르는 생체물질로 재건된 인체 각막 간질의 생체 외 제조 후 각막간질세포의 세포 증식 연구를 나타낸다.
도 7은 재건된 인체 반-각막을 자극물 SDS(소듐 도데실 설페이트)로 처리한 것의 조직학적 연구를 나타낸다.
도 8은 재건된 인체 반-각막을 SDS로 처리한 후 세포 생존가능성의 연구를 보여준다.
도 9는 SDS로 처리된 재건된 인체 반-각막에 의한 용해성 인자(이 경우, IL-6 또는 인터류킨-6)의 분비에 대한 연구를 보여준다.
도 10은 SDS로 처리된 재건된 인체 반-각막의 회복에 대한 연구를 보여주는 조직학적 분석을 나타낸다.
도 11은 SDS로 처리된 재건된 인체 반-각막의 회복에 대한 연구를 보여주는 세포 생존가능성의 분석을 나타낸다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 실시예를 참고하는 설명적 기재를 읽으면 당업자에게 분명하게 나타날 것이며, 실시예는 단순히 예시적 목적으로 주어진 것이지 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 아니된다.
실시예는 본 발명의 총체적인 부분을 형성하며, 실시예를 포함하여 전체 기재로 볼 때 임의의 선행 기술에 비하여 신규한 것으로 나타나는 임의의 특징은 그 기능 및 그 일반성에 있어서 본 발명의 총체적 부분을 형성한다.
즉, 각 실시예는 일반적인 범위를 갖는다.
또한, 실시예에서 모든 백분율은 달리 명시되지 않는 한 중량 기준이고, 온도는 달리 명시되지 않는 한 섭씨 도로 나타내며, 압력은 달리 명시되지 않는 한 대기압이다.
실시예
실시예 1: 정상의 인체 각막 상피 세포 및 각막간질세포의 배양 (도 3)
인체 각막을 윤리적 규칙에 따라 수거하는데, 과도하게 낮은 내피 밀도로 인하여 치료적으로 사용할 수 없다. 각막을 상피 세포 및 각막간질세포의 추출 시간까지 31℃에서 유기 배양물로 보관한다.
· 인체 각막 상피 세포의 추출 및 배양
각막을 트립신/EDTA(0.05％/0.01％)의 존재 하에 37℃에서 80 분 동안 항온처리하여 생체검사로부터 상피 구획을 회수하였다. 상피를 그 후 트립신/EDTA(0.05％/0.01％)의 존재 하에 용리시키고, 수득된 상피 세포를 주로 1.5x104 세포/cm2의 밀도로, 광조사된 섬유아세포의 자양 층과 같은 배양 지지체 상에, 그리고 DMEM/HAM F12 (2/1), 10％ 송아지 태아 혈청 (FCS), 인슐린 (5 μg/ml), 아데닌 (0.18 mM), 히드로코르티손 (0.4 μg/ml), 콜레라 독소 (0.1 nM), 트리요오도티로닌 (2 nM), 글루타민 (4 mM), 페니실린 G (100 IU/ml), 겐타마이신 (20 μg/ml) 및 암포테리신 B(1 μg/ml)로 유리하게 이루어진 배양 배지에서 접종하였다. EGF(10 ng/ml)는 배양 3일 후에 주로 첨가되었다. 배양을 37℃ 및 5％ CO2 하에, 습한 대기 하에 수행하였다.
생체 외 배양된 상피 세포(도 3a)는 동결되고/되거나 배양물, 예를 들면 광조사된 섬유아세포의 자양 층 위에 재접종되고/되거나 재건된 인체 반-각막/각막의 생체 외 생성을 위해 사용될 수 있다.
· 인체 각막 간질세포의 추출 및 배양
각막을 트립신/EDTA(0.05％/0.01％)의 존재 하에 37℃에서 80 분 동안 항온처리하여 생체검사로부터 간질 구획을 회수하였다. 상기 간질을 그 후, 콜라게나아제 A(3 mg/ml)의 존재 하에 교반하면서 31℃에서 3 시간 동안 항온처리하였다. 수득된 세포 추출물을 그 후, 예를 들면 70 μm 체 위에서 정제한 다음, 주로 1.0x104 세포/cm2의 밀도로, DMEM/HAM F12, 10％ 송아지 신생아 혈청, b-FGF (5 ng/ml), 페니실린 G (100 IU/ml), 겐타마이신 (20 μg/ml) 및 암포테리신 B(1 μg/ml)로 유리하게 이루어진 배양 배지에서 배양하였다.
생체 외 배양된 각막간질세포(도 3b)는 동결되고/되거나 배양물에 재접종되고/되거나 재건된 인체 각막 간질 및 반-각막/각막의 생체 외 생성을 위해 사용될 수 있다.
실시예 2: 콜라겐, 글리코사미노글리칸 및 키토산을 기재로 하는 본 발명에 따르는 생체물질의 다공성의 재건된 인체 각막 간질 및 반-각막/각막의 생체 외 제조에 대한 연구 (도 4)
생체물질의 세공 크기가 재건된 인체 각막 간질 및 반-각막/각막의 생체 외 제조에 근본적인 변수임을 보여주기 위해, 본 발명자들은 그 다공도를 30 μm로부터 100 μm까지 변화시켰다. 이를 위해, 본 발명자들은 생체물질의 세공 직경에 직접적인 영향을 갖는 2 개의 제작 변수를 주로 조정하였다: (1) 콜라겐 (72％), 글리코사미노글리칸 (GAG) (8％) 및 키토산(20％)의 수성 조성물 중 건조 물질의 백분율, (2) 동결-건조에 의해 탈수되기 전 수성 겔의 동결 온도의 동력학.
콜라겐/GAG/키토산의 비가 변하지 않는 (각각 72％/8％/20％) 수성 겔의 3 가지 조성물을 다음 방식으로 제조하였다:
- 2％의 건조 물질, 즉 5.6 g의 콜라겐 + 1.56 g의 키토산 + 0.62 g의 GAG를 함유하는 수성 겔을 제조하였다;
- 2％ 겔의 물로 희석함으로써 제조된, 1.6％ 건조 물질을 함유하는 수성 겔;
- 2％ 겔의 물로 희석함으로써 제조된, 1.4％ 건조 물질을 함유하는 수성 겔;
- 2％ 겔의 물로 희석함으로써 제조된, 1.25％ 건조 물질을 함유하는 수성 겔.
다음, 수성 겔을 450 mg/삽입물의 양으로 스냅웰® 형의 배양 삽입물 내에 부었다.
이어서, 수성 겔(스냅웰® 삽입물 중)의 동결-건조를 -40℃에서 수행하였다. 상기 동결-건조 단계는 앞선 동결 단계를 필요로 하며, 이는 4 가지 변법에 따라 다음과 같은 방식으로 수행되었다:
- 수성 겔을 -40℃에서 직접 동결,
- 수성 겔을 -80℃에서 직접 동결,
- 수성 겔을 -196℃에서 직접 동결,
- 수성 겔을 +20℃로부터 -40℃까지 점차적으로 동결 (동결 시간은 바람직하게는 최소 30 내지 45 분).
생체물질의 다공도의 평가는 50x 내지 7000x 범위의 배율에서 주사 전자 현미경 연구에 의해, 그리고 자동 영상 분석 연구에 의해 수행되었다. 결과를 도 4에 나타낸다. 40 내지 50 μm의 다공도를 갖는 생체물질을 제조하기 위해 선택된 제조 조건은 다음과 같다:
- 1.6％ 건조 물질을 함유하는 수성 겔에 -80℃에서의 동결 단계가 뒤따르면 42.3 μm의 다공도를 가졌고,
- 1.4％ 건조 물질을 함유하는 수성 겔에 -40℃에서의 동결 단계가 뒤따르면 48.5 μm의 다공도를 가졌고,
- 1.25％ 건조 물질을 함유하는 수성 겔에 -40℃에서의 동결 단계가 뒤따르면 47.3 μm의 다공도를 가졌다.
실시예 3: 본 발명자의 다공성 생체물질을 이용하여 재건된 인체 각막 간질의 생체 외 제조: 조직학적 연구 (도 5)
40 내지 50 μm의 다공도를 갖는 생체물질이 인체 각막간질세포를 배양하는 데 적합함을 보이기 위해, 본 발명자들은, 재건된 인체 각막 간질의 생체 외 배양의 과정에서, 각막간질세포가 생체물질에서 통합되고 조직화되는 능력을 연구하였다.
다공성 생체물질에서 재건된 인체 각막 간질의 조직학적 연구는 다음과 같은 방식으로 수행되었다:
· 각막간질세포의 제조: 실시예 1에 기재된 것과 같음.
· 다공성 생체물질의 제조: 실시예 2에 기재된 것과 같음.
· 재건된 인체 각막 간질 의 제조:
배양 배지 500 μl 당 2x105 개 각막간질세포를 주로 함유하는 세포 현탁액을 본 발명자의 다공성 생체물질의 표면 위에 접종하였다. 사용된 배양 배지는 DMEM/HAM F12, 10％ 송아지 신생아 혈청, b-FGF (5 ng/ml), 아스코르브산 (1 mM), 페니실린 G (100 IU/ml), 겐타마이신 (20 μg/ml) 및 암포테리신 B(1 μg/ml)로 주로 이루어진 것이었다. 다음, 상기 각막간질세포를 전술한 배양 배지에서 예를 들면 14일 동안 배양하였다.
· 조직학적 연구:
14일 동안 배양 후, 재건된 인체 각막 간질을 배양 배지, 예를 들면 DMEM으로 헹군 다음, 예를 들면 포름알데히드로 고정시키고, 이어서 파라핀에 포함시켰다. 그 후, 파라핀 슬라이스를 마이크로톰에 의해, 주로 5 μm의 두께로 제조한 다음, 예를 들면 헤마톡실린, 플록신 및 사프론을 이용하여 염색하였다. 결과를 도 5에 나타낸다: a/ 1.6％ 고형분을 함유하는 수성 겔에 뒤따르는 -80℃에서의 동결 단계 (42.3 μm의 다공도), b/ 1.4％ 고형분을 함유하는 수성 겔에 뒤따르는 -40℃에서의 동결 단계 (48.5 μm의 다공도), c/ 1.25％ 고형분을 함유하는 수성 겔에 뒤따르는 -40℃에서의 동결 단계 (47.3 μm의 다공도). 다공성 생체물질에 배양된 각막간질세포(40 내지 50 μm의 다공도)는 여러 개의 세포 층의 형성 및 그들 자체의 세포외 매트릭스의 합성과 함께 조직으로 구성될 수 있다.
실시예 4: 다공성 생체물질을 이용하여 재건된 인체 각막 간질 의 생체 외 제조: 각막간질세포의 세포 증식 연구 (도 6)
실시예 3에 이어, 본 발명자들은 이제 재건된 인체 각막 간질의 생체 외 배양의 과정에서, 각막간질세포의 증식 능력을 연구하였다.
다공성 생체물질에서 각막간질세포의 세포 증식 연구를 다음과 같은 방식으로 수행하였다.
· 각막간질세포의 제조: 실시예 1에 기재된 것과 같음.
· 다공성 생체물질의 제조: 실시예 2에 기재된 것과 같음.
· 재건된 인체 각막 간질 의 제조: 실시예 3에 기재된 것과 같음.
· 재건된 인체 각막 간질 에서 각막간질세포의 세포 증식 연구:
7, 14 또는 28일 동안 배양 후, 재건된 인체 각막 간질을 다음과 같은 방식으로 분석하였다:
- 배양물을 2 ml의 MTT (메틸 티아졸릴 테트라졸륨) 1 mg/ml 농도 중 37℃에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 음성 대조는 각막간질세포를 함유하지 않는 생체물질에 해당하였다;
- 이어서, 상기 배양물을 회수한 다음, 4 ml의 DMSO(디메틸 술폭시드)에서 교반하면서 4 시간 동안 항온처리하였다;
- 각 시료 중 배양 상청액(200 μl)의 일부를 회수한 다음 분광광도측정(550 nm)에 의해 분석하였다. 광학 밀도 눈금은 살아있는 세포의 수에 정비례한다. 결과를 도 6에 나타낸다. 40 내지 50 μm의 다공도를 갖는 생체물질이 각막간질세포의 증식을 위해 적합하다. 실제로, 각막간질세포의 세포 증식 동력학은 재건된 인체 각막 간질의 배양 시간에 비례한다. 또한, 실시예 2에 기재된 것과 같은 본 발명자의 생체물질의 제조 조건[1.6％, 1.4％ 및 1.25％ 건조 물질]과 무관하게, 각막간질세포는 유사한 정도의 증식을 갖는다.
실시예 5: 약리독물학 모델로서 재건된 인체 반-각막의 생체 외 제조: 조직학적 연구 (도 7)
본 발명자들은 상기 생체물질로 재건된 인체 반-각막에 대한 자극제 SDS(소듐 도데실 설페이트)의 영향을 연구하였다.
SDS로 처리 후, 재건된 인체 반-각막의 조직학적 연구는 다음과 같은 방식으로 수행되었다:
· 세포의 제조: 실시예 1에 기재된 것과 같음.
· 다공성 생체물질의 제조: 실시예 2에 기재된 것과 같음. 이 연구를 위해, 본 발명자들은 1.6％의 건조 물질을 함유하는 수성 겔[콜라겐 (72％), GAG (8％) 및 키토산 (20％)]을 사용하였고, 이에 -80℃에서의 동결 단계를 수행하였다.
· 재건된 인체 각막 간질 의 제조: 실시예 3에 기재된 것과 같음.
· 재건된 인체 반-각막의 제조:
배양 배지 500 μl 당 2x105 개 각막 상피 세포를 주로 함유하는 세포 현탁액을 상기 재건된 인체 각막 간질의 표면 위에 접종하였다. 사용된 배양 배지는 DMEM/HAM F12 (2/1), 10％ 송아지 태아 혈청 (FCS), EGF (10 ng/ml), 인슐린 (5 μg/ml), 아데닌 (0.18 mM), 히드로코르티손 (0.4 μg/ml), 콜레라 독소 (0.1 nM), 트리요오도티로닌 (2 nM), 글루타민 (4 mM), 아스코르브산 (1 mM), 페니실린 G (100 IU/ml), 겐타마이신 (20 μg/ml) 및 암포테리신 B(1 μg/ml)로 주로 이루어진 것이었다. 상기 각막 상피 세포를 동등한 각막 간질 위에서, 그리고 전술한 배지를 이용하여 7 일 동안 침지에 의해 배양하였다.
다음, 배양물을 공기/액체 계면까지 상승시킨 다음, DMEM, 히드로코르티손 (0.4 μg/ml), 인슐린 (5 μg/ml), 아스코르브산 (1 mM), 페니실린 G (100 IU/ml), 겐타마이신 (20 μg/ml) 및 암포테리신 B(1 μg/ml)로 주로 이루어진 배양 배지를 이용하여 14일 동안 더 배양하였다.
· 재건된 인체 반-각막의 SDS 를 이용한 처리:
SDS의 용액을 증가시키면서 (0.5％, 1％, 2％ 및 3％), 상기 재건된 인체 반-각막을 완전히 침지시켜 10 분 동안 처리하였다. 처리 후, 상기 재건된 인체 반-각막을 배양 배지, 예를 들면 DMEM으로 헹군 다음, 예를 들면 포름알데히드로 고정시키고, 이어서 파라핀에 포함시켰다. 그 후, 파라핀 슬라이스를 마이크로톰에 의해, 주로 5 μm의 두께로 제조한 다음, 예를 들면 헤마톡실린, 플록신 및 사프론을 이용하여 염색하였다. 조직학적 결과를 도 7에 나타낸다. 본 발명자들은, 증가하는 SDS 농도 및 재건된 각막 상피의 표면 세포 층의 조직해체 사이에 직접적인 상관관계가 있음을 보여주었다. 0.5％ 이상의 SDS에서, 재건된 인체 반-각막에 대한 조직학적 영향이 관찰되었다.
실시예 6: 약리독물학 모델로서 재건된 인체 반-각막의 생체 외 제조: 세포 생존가능성의 연구 (도 8):
실시예 5에 이어, 본 발명자들은 자극제 SDS로 처리된 재건된 인체 반-각막의 세포 생존가능성을 다음과 같은 방식으로 연구하였다:
· 세포의 제조: 실시예 1에 기재된 것과 같음.
· 다공성 생체물질의 제조: 실시예 2에 기재된 것과 같음. 이 연구를 위해, 본 발명자들은 1.6％ 고형분을 함유하는 수성 겔[콜라겐 (72％), GAG (8％) 및 키토산 (20％)]을 사용하였고, 이어서, 이에 -80℃의 동결 단계를 수행하였다.
· 재건된 인체 각막 간질 의 제조: 실시예 3에 기재된 것과 같음.
· SDS 로 처리된 재건된 인체 반-각막의 제조: 실시예 5에 기재된 것과 같음.
· SDS 로 처리된 재건된 인체 반-각막의 세포 생존가능성 연구: 재건된 인체 각막 간질에 대하여 실시예 4에 기재된 것과 같음.
세포 생존가능성 결과를 도 8에 나타낸다. 본 발명자들은 증가하는 SDS 농도와 세포 생존가능성 백분율 사이에 직접적인 상관관계가 있음을 보여주었다. 0.5％ SDS를 초과하면, 재건된 인체 반-각막의 세포 생존가능성은 더 이상 만족스럽지 않으며, 75％ 미만이다. 따라서 상기 재건된 인체 반-각막에 대한 SDS의 생물학적 영향은 0.5％에 가까운 농도에서 평가되어야 한다.
실시예 7: 약리독물학 모델로서 재건된 인체 반-각막의 생체 외 제조: 용해성 인자의 분비 연구 (도 9):
실시예 5 및 6에 이어, 본 발명자들은 자극제 SDS로 처리된 재건된 인체 반-각막에 의해 생성된 용해성 인자, 예를 들면 전-염증성 시토킨의 분비를 연구하였다: 본 연구는 다음과 같은 방식으로 수행되었다:
· 세포의 제조: 실시예 1에 기재된 것과 같음.
· 다공성 생체물질의 제조: 실시예 2에 기재된 것과 같음. 이 연구를 위해, 본 발명자들은 1.6％ 고형분을 함유하는 수성 겔[콜라겐 (72％), GAG (8％) 및 키토산 (20％)]을 사용하였고, 이어서, 이에 -80℃의 동결 단계를 수행하였다.
· 재건된 인체 각막 간질 의 제조: 실시예 3에 기재된 것과 같음.
· SDS 로 처리된 재건된 인체 반-각막의 제조: 실시예 5에 기재된 것과 같음.
· SDS 로 처리된 재건된 인체 반-각막에 의한 전-염증성 시토킨의 분비 연구:
- SDS로 처리 후, 상기 재건된 인체 반-각막을 배양 배지, 예를 들면 DMEM으로 헹구고, 이어서, 상기 재건된 인체 반-각막의 제조에 대하여 (실시예 5) 기재된 배양 배지에서 적어도 추가 24 시간 동안 재배양하였다.
- 다음, 재건된 인체 반-각막의 배양 상청액을 회수하여, 분비된 전-염증성 시토킨을 분석하였다. 배양 상청액은 사용 전에 임의로 동결될 수 있다.
- 본 발명자들은 IL-6의 분비를, 예를 들면 실시예 6에서 이미 연구된 세포 생존가능성의 함수로서 "막 배열"에 의해 평가하였다. IL-6 분석의 결과를 도 9에 나타낸다. 본 발명자들은, IL-6의 강력한 분비와, 세포 사망율 없이 SDS의 자극 효과 사이에 직접적인 상관관계가 있음을 보여주었다.
실시예 8: 약리독물학 모델로서 재건된 인체 반-각막의 생체 외 제조: 조직학적 분석에 의한 세포 회복의 연구 (도 10):
실시예 5 내지 7에 이어, 본 발명자들은 SDS로 처리된 재건된 인체 반-각막의 세포 회복, 즉 처리의 효과에 따르는, 예를 들면 본 연구에서는 자극제의 효과에 따르는 그들의 재생 능력을 연구하였다. 상기 회복 연구는 다음과 같은 방식으로 수행되었다:
· 세포의 제조: 실시예 1에 기재된 것과 같음.
· 다공성 생체물질의 제조: 실시예 2에 기재된 것과 같음. 이 연구를 위해, 본 발명자들은 1.6％ 건조 물질을 함유하는 수성 겔[콜라겐 (72％), GAG (8％) 및 키토산 (20％)]을 사용하였고, 이어서, 이에 -80℃의 동결 단계를 수행하였다.
· 재건된 인체 각막 간질 의 제조: 실시예 3에 기재된 것과 같음.
· SDS 로 처리된 재건된 인체 반-각막의 제조: 실시예 5에 기재된 것과 같음.
· SDS 로 처리된 재건된 인체 반-각막의 세포 회복 연구:
SDS로 처리 후, 상기 재건된 인체 반-각막을 배양 배지, 예를 들면 DMEM으로 헹구고, 이어서, 상기 재건된 인체 반-각막의 제조에 대하여 (실시예 5) 기재된 배양 배지에서 적어도 추가 24 시간 동안 재배양하였다. 실시예 5에 기재된 것과 같이 조직학적 연구를 수행하였다. 조직학적 결과는 도 10에 나타낸다. 본 발명자들은 0.5％ 및 1％ SDS로 처리된 재건된 인체 반-각막은, 48 시간의 세포 회복 후, 처리되지 않은 반-각막의 것에 가까운 상피 조직화를 가짐을 보여주었다. 한편, 2％ 및 3％ SDS를 이용한 처리는 비가역적 상피 손상을 유도하였다.
실시예 9: 약리독물학 모델로서 재건된 인체 반-각막의 생체 외 제조: 세포 생존가능성의 분석에 의한 세포 회복의 연구 (도 11):
실시예 8에 이어, 본 발명자들은 이제 자극제 SDS로 처리한 후, 적어도 24 시간의 회복 후 재건된 인체 반-각막의 세포 생존가능성을 연구하였다. 상기 회복 연구는 다음과 같은 방식으로 수행되었다:
· 세포의 제조: 실시예 1에 기재된 것과 같음.
· 다공성 생체물질의 제조: 실시예 2에 기재된 것과 같음. 이 연구를 위해, 본 발명자들은 1.6％ 건조 물질을 함유하는 수성 겔[콜라겐 (72％), GAG (8％) 및 키토산 (20％)]을 사용하였고, 이어서, 이에 -80℃의 동결 단계를 수행하였다.
· 재건된 인체 각막 간질 의 제조: 실시예 3에 기재된 것과 같음.
· SDS 로 처리된 재건된 인체 반-각막의 제조: 실시예 5에 기재된 것과 같음.
· SDS 로 처리된 재건된 인체 반-각막의 세포 회복 연구: 실시예 8에 기재된 것과 같음.
세포 생존가능성 연구는 실시예 6에 기재된 것과 같이 수행되었다. 결과를 도 11에 나타낸다. 본 발명자들은 0.5％ SDS로, 회복 후 적어도 24 시간 (T = 48 h) 처리된 상기 재건된 인체 반-각막은 처리 후 (T = 0h) 재건된 인체 반-각막의 것과 실질적으로 동등한 세포 생존가능성을 가짐을 보여주었다. 한편, 1％, 2％ 및 3％ SDS로 처리된 재건된 인체 반-각막은 적어도 24 시간의 회복 (T = 48h) 후, 처리 후(T = 0h)보다 실질적으로 낮은 세포 생존가능성을 갖는다.

Claims (18)

  1. 적어도 1종의 생체고분자를 다공도가 10 내지 100 마이크로미터인 다공성 매트릭스의 형태로 포함하는, 각막 세포 배양을 위한 세포 배양 지지체.
  2. 제1항에 있어서, 다공도가 30 내지 70 마이크로미터, 더욱 바람직하게는 40 내지 50 마이크로미터인 것을 특징으로 하는 지지체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 다공성 매트릭스가 적어도 1종의 생체고분자, 바람직하게는 세포외 매트릭스(ECM)의 고분자, 바람직하게는 당단백질의 수용액, 더욱 바람직하게는 콜라겐 수용액을 기재로 하는 것을 특징으로 하는 지지체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다공성 매트릭스가 적어도 2종의 생체고분자를 혼합물로 포함하는 것을 특징으로 하는 지지체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다공성 매트릭스가, 1종 이상의 임의로 치환된 다당류, 예를 들면 글리코사미노글리칸, 예컨대 콘드로이틴 4-설페이트, 콘드로이틴 6-설페이트 또는 히알루론산, 또는 이들의 혼합물, 및/또는 키틴, 및/또는 키토산; 및/또는 1종 이상의 프로테오글리칸; 바람직하게는, 임의로 개질된, 적어도 1종의 다당류 및 키토산과 임의로 조합된 적어도 1종의 당단백질, 바람직하게는 콜라겐을 포함하는 것을 특징으로 하는 지지체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다공성 매트릭스가 탈수된 수성 겔로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 지지체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다공성 매트릭스가 임의로 개질된, 콜라겐, 적어도 1종의 다당류 및 키토산의 혼합물을 기재로 하며, 바람직하게는 상기 혼합물의 총 건조 중량에 대한 건조 중량 백분율로 60％ 내지 90％의 콜라겐, 0 내지 15％의 GAG, 및 10％ 내지 30％의 키토산 비율을 갖는 것을 특징으로 하는 지지체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 임의로 개질된, 콜라겐, 글리코사미노글리칸 및 키토산의 혼합물을 기재로 하는 수성 겔이, 임의로 개질된, 콜라겐, 글리코사미노글리칸 및 키토산의 혼합물의 수성 매질(w/w)에 대하여 1.25％ 내지 1.6％의 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 지지체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다공성 매트릭스가 수성 겔을 동결-건조시킴으로서, 특히 -30℃ 내지 -196℃의 온도에서, 바람직하게는 산업적 이유에서 -40℃ 내지 -80℃의 온도에서 동결시킴으로써 수득되는 것을 특징으로 하는 지지체.
  10. 오목부 및 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 적어도 1종의 지지체를 포함하여 배양될 세포를 배양하기 위한 층을 형성하고, 상기 층은 장치의 오목부 내에 직접 부어진 적어도 1종의 생체고분자의 수성 겔의 탈수에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는, 각막 세포용 세포 배양 장치.
  11. 제10항에 있어서, "간질 영역"으로 알려진 간질 세포를 배양하기 위한 제1 영역, 및 "상피 영역"으로 알려진 상피 세포, 또는 "내피 영역"으로 알려진 내피 세포를 배양하기 위한 제2 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, "간질 영역"으로 알려진 간질 세포를 배양하기 위한 제1 영역, 및 "상피 영역"으로 알려진 상피 세포를 배양하기 위한 제2 영역, 및 "내피 영역"으로 알려진 내피 세포를 배양하기 위한 제3 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간질 영역이 장치의 오목부의 부피 내에 삽입하기 적합한 치수의 삽입물(또는 나셀)에 놓인 배양 지지체를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상피 영역이 상기 간질 영역과 구별되고, 각막간질세포 (keratocyte)를 배양하기 위한 다공성 물질의 층을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  15. 적어도 각막 간질 세포 (corneal stromal cell), 바람직하게는 각막 간질세포 (corneal keratocyte), 및 각막 간질 세포를 배양하기 위한 적어도 1종의 지지체를 포함하고, 상기 지지체는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 것과 같은, 각막 간질, 특히 인체 각막 간질의 모델.
  16. 제15항에 따르는 각막 간질의 모델 및 각막 상피 세포 및/또는 내피 세포, 및 바람직하게는 각막 상피 세포 및 내피 세포를 포함하는, 각막, 특히 인체 각막의 모델.
  17. 제15항 또는 제16항에 정의된 모델의, 특히 화장품 및 약리학에 있어서의 동물에 대한 독성 시험의 대체 시험 모델로서의 용도.
  18. 제15항에 정의된 각막 간질의 모델 또는 제16항에 정의된 각막 모델의, 특히 각막 이식 또는 교정 외과술에서 사용하기 위한 재건된 각막의 제조를 위한 용도.
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