CN117643651A

CN117643651A - 一种血管内原位固化前体液及其制备方法

Info

Publication number: CN117643651A
Application number: CN202311640084.0A
Authority: CN
Inventors: 赵安莎; 邵将; 王静月
Original assignee: Southwest Jiaotong University
Current assignee: Southwest Jiaotong University
Priority date: 2023-11-30
Filing date: 2023-11-30
Publication date: 2024-03-05

Abstract

本发明公开了一种血管内原位固化前体液及其制备方法，其制备方法包括以下步骤：将磷脂、胆固醇、治疗药物和十八胺加入溶剂中溶解，然后旋转蒸发去除溶剂，然后向其中加水进行水合，然后超声处理并对脂质体进行挤压，制备得到药物脂质体；将巯基化合物、四臂聚乙二醇降冰片烯、光引发剂溶液、药物脂质体溶液和去离子水混合，制得光固化前体液。该光固化前体液具有快速成胶，且能够与湿润的组织快速粘合的优点，有效解决现有的凝胶无法应用于血管内壁修复和治疗的问题。

Description

一种血管内原位固化前体液及其制备方法

技术领域

本发明属于水凝胶前体液技术领域，具体涉及一种血管内原位固化前体液及其制备方法。

背景技术

血管连接着身体的各个器官，无时无刻为人体提供着氧气和营养，是生命的循环。但血管非常脆弱，不良的生活习惯、压力的增加、空气污染都可能引发心血管疾病。

动脉粥样硬化是冠心病、脑梗死、外周血管病等疾病的主要发病原因，对于动脉粥样硬化，临床上最广泛的治疗方式就是经皮动脉介入治疗(PCI)。PCI是通过药物支架或球囊进入患者血管，对血管病变狭窄部位进行扩张、疏通。然而植介入治疗器械在长期植入后，会引起血栓/栓塞、新生内膜增生/管腔丢失等并发症，并发症严重的情况下还需要进行二次手术，同时患者必须长期复用抗凝药物来降低上述风险发生的概率。因此，在动脉粥样硬化斑块处构建抗增生、抗凝、促修复的生物功能涂层是避免并发症和提高临床性能的有效手段。

由于外伤等原因，会导致血管内膜破裂，轻者会出现偏瘫、失语现象，严重的会出现昏迷甚至威胁到生命，目前治疗血管内膜破裂的主要手段是通过手术进行重新吻合或其他的移植来代偿此段血管的供血，以避免发生更严重的后果，但是存在手术复杂等问题。

水凝胶类生物材料具有良好的生物相容性、可降解性，并可通过改变凝胶成分、交联程度、药物装载等方式，以达到所需求的功能性及力学强度。而水凝胶的结构功能与细胞外基质类似，而常用作皮肤、骨等的修复。

水凝胶的黏附性能可以提高组织的修复效果，但大多黏附性促修复水凝胶常用在静态的环境中。而之前用于体内组织修复的研究，大多集中于防止术后组织的粘连或没有差异性的黏附，且大多为预制胶，预制胶则很难应用于血管内膜并递送。面对湿组织表面和连续动态的血液冲刷，凝胶涂层的持久黏附、成胶性能、抗血小板黏附性能、安全性能则是极大的挑战。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种血管内原位固化前体液及其制备方法，该前体液具有快速成胶，且能够与湿润的组织快速粘合的优点，有效解决现有的凝胶无法应用于体内组织修复的问题。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种血管内原位固化前体液的制备方法，包括以下步骤：

(1)将磷脂、胆固醇、治疗药物和十八胺加入溶剂中溶解，然后旋转蒸发去除溶剂，然后向其中加水进行水合，然后超声处理并对脂质体进行挤压，制备得到药物脂质体；

(2)将巯基化合物、四臂聚乙二醇降冰片烯、光引发剂溶液、药物脂质体溶液和去离子水混合，制得光固化前体液。

进一步地，步骤(1)中磷脂、胆固醇、治疗药物和十八胺的质量比为94-98:22-26:12-17:10-14。

进一步地，磷脂包括L-α-磷脂酰胆碱、二棕榈酰胆碱、二硬脂酰胆碱和二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱中的一种。

进一步地，步骤(1)药物脂质体的粒径为100-400nm。

进一步地，步骤(1)治疗药物包括抗增生药物、抗炎药物、抗凝药物和促内皮修复药物中的一种。

进一步地，步骤(1)治疗药物包括雷帕霉素、紫杉醇及其衍生物、他汀类药物、表没食子儿茶素没食子酸酯、硫酸软骨素、脂联素、外泌体和RvE1中的一种。

进一步地，步骤(2)巯基化合物采用以下方法制得：制备巯基化合物溶液，向其中添加EDC.HCL和NHS，搅拌活化，然后向其中添加半胱胺溶液并于室温避光条件下反应，然后对反应产物进行透析，然后取出混合物溶液并向其中中添加二硫苏糖醇继续反应，反应完成后调节溶液为酸性，然后向溶液中添加氯化钠和乙二胺四乙酸，继续调节pH为酸性后进行透析，冷冻干燥以后制得巯基化合物。

进一步地，EDC.HCL与羧基化合物中羧基的摩尔比为4-6:1，NHS与羧基化合物中羧基的摩尔比为3-4:1；半胱胺与羧基化合物中羧基的摩尔比为2-4:1；二硫苏糖醇与羧基化合物的质量比为1.5-3:1；氯化钠与羧基化合物的质量比为15-25:1；乙二胺四乙酸与羧基化合物的质量比为0.8-1.5:1；两次调节后的pH均为3.5-5。

进一步地，羧基化合物包括肝素钠、壳聚糖、透明质酸和明胶中的一种。

进一步地，步骤(2)中光固化前体液中巯基化合物的质量百分比浓度为2-8wt％，四臂聚乙二醇降冰片烯的质量百分比浓度为4-8wt％，光催化剂的质量百分比浓度为0.3-0.6wt％，药物脂质体的质量百分比浓度为10-40wt％，其余为磷酸盐缓冲液。

进一步地，步骤(2)中光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐或2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮。

一种血管内原位固化前体液，采用上述的方法制得。

本发明所产生的有益效果为：

1、本申请前体液中的四臂聚乙二醇降冰片烯可与巯基化合物之间发生硫醇-烯光点击化学反应快速生成水凝胶，同时还会与组织中的巯基键形成可逆的二硫键使得水凝胶在组织表面具有持久的黏附力，牢牢的黏附在湿润的血管组织表面，在血管组织表面形成水凝胶涂层，涂层中含有治疗药物，随着涂层的降解，不断释放药物抑制平滑肌细胞增殖，防止血管内膜的增生；而且四臂聚乙二醇降冰片烯属于PEG衍生物，是一种具有抗黏附性的防污聚合物，暴露在血管内的四臂聚乙二醇降冰片烯因具有较强的抗黏附性及致密性结构，能够防止血小板、蛋白等物质附着，避免血管内形成血栓，提高治疗的安全性(防御策略)；同时，巯基化肝素中高亲和力的五糖序列结合丝氨酸蛋白酶抑制剂抗凝血酶Ⅲ(antithrombinⅢ,ATⅢ)时，ATⅢ的构象发生改变而被激活，活化的ATⅢ可以直接灭活凝血因子Xa，抑制凝血酶原酶复合物的形成，从而发挥抗凝活性(进攻策略)，本申请中通过“防御”和“进攻”策略，避免血管内凝血、形成血栓，从而实现抗黏附的效果。

2、本发明中的巯基化合物中巯基接枝率高达75％，经过光照时可快速与四臂聚乙二醇降冰片烯之间发生反应固化成膜，并牢牢的黏附在血管组织表面。

3、本申请中制备的阳离子脂质体的zeta电位为40.5±5.97mV，其可以靶向带负电荷的细胞，提高包封药物的活性及递送效果。

附图说明

图1为实施例1中制备的巯基化肝素的傅里叶变换红外光谱图；

图2为实施例1中制备的巯基化肝素的核磁共振氢谱图；

图3为实施例中不同工艺制备的巯基化肝素在412nm处巯基的吸光度；

图4为实施例1中制备的凝胶涂层的傅里叶变换红外光谱图；

图5为实施例1中制备的凝胶涂层的示意图；

图6为实施例1中制备的凝胶涂层与组织的黏附、黏附扭曲、冲刷图；

图7为实施例1中制备的脂质体的粒径分布图；

图8为实施例1中制备的脂质体的透射电子显微图；

图9为实施例1中制备的脂质体的zeta电位分布图；

图10为实施例1中制备的脂质体的药物包封率统计图；

图11为实施例1中制备的凝胶涂层的血小板黏附及激活的扫描电镜图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

下面结合实施例和附图对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

一种血管内原位固化前体液，其制备方法包括以下步骤：

(1)将L-α-磷脂酰胆碱、胆固醇、雷帕霉素和十八胺加入10ml氯仿中充分溶解，L-α-磷脂酰胆碱、胆固醇、雷帕霉素和十八胺的质量比为96:24:15:12，将混合溶液倒入150ml茄形瓶，然后于50℃条件下旋转蒸发去除氯仿，在茄形瓶侧壁形成脂质膜，然后向其中加4ml去离子水进行充分水合，然后置于超声波细胞破碎机中进行超声处理并利用脂质体挤出机对脂质体进行挤压，制备得到药物脂质体颗粒；

(2)将1g肝素钠(分子量16kDa)溶于100ml去离子水中，磁力搅拌15min至完全溶解；将EDC.HCL和NHS溶解于肝素钠水溶液中，EDC.HCL与肝素钠的羧基的摩尔比为5，NHS与肝素钠的羧基的摩尔比为4，搅拌活化20min；按照半胱胺与肝素的羧基摩尔比3:1缓慢加入半胱胺溶液，室温、避光条件下反应6h；将混合溶液透析12h，透析完成后，向透析液中加入1.5g的二硫苏糖醇反应3h；反应完成后将溶液pH调至3.5，并向反应液加入15g的氯化钠和1g的乙二胺四乙酸，将反应液pH调至3.5，继续透析48h，冷冻干燥以制备得到巯基化肝素；

(3)将巯基肝素、四臂聚乙二醇降冰片烯、苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐溶液、雷帕霉素脂质体溶液和去离子水混合，制得光固化前体液，光固化前体液中巯基化合物的质量百分比浓度为8wt％，四臂聚乙二醇降冰片烯的质量百分比浓度为4wt％，光催化剂的质量百分比浓度为0.5wt％，药物脂质体的质量百分比浓度为30wt％，其余为去离子水。

实施例2

一种血管内原位固化前体液，其制备方法包括以下步骤：

(1)将L-α-磷脂酰胆碱、胆固醇、雷帕霉素和十八胺加入10ml氯仿中充分溶解，L-α-磷脂酰胆碱、胆固醇、雷帕霉素和十八胺的质量比为94:22:15:10，将混合溶液倒入150ml茄形瓶，然后于50℃条件下旋转蒸发去除氯仿，在茄形瓶侧壁形成脂质膜，然后向其中加4ml去离子水进行充分水合，然后置于超声波细胞破碎机中进行超声处理并利用脂质体挤出机对脂质体进行挤压，制备得到药物脂质体颗粒；

(2)将1g肝素钠(分子量16kDa)溶于100ml去离子水中，磁力搅拌15min至完全溶解；将EDC.HCL和NHS溶解于肝素钠水溶液中，EDC.HCL与肝素钠的羧基的摩尔比为4，NHS与肝素钠的羧基的摩尔比为4，搅拌活化20min；按照半胱胺与肝素的羧基摩尔比3:1缓慢加入半胱胺溶液，室温、避光条件下反应6h；将混合溶液透析12h，透析完成后，向透析液中加入2g的二硫苏糖醇反应3h；反应完成后将溶液pH调至4，并向反应液加入20g的氯化钠和0.8g的乙二胺四乙酸，将反应液pH调至4，继续透析48h，冷冻干燥以制备得到巯基化肝素；

(3)将巯基肝素、四臂聚乙二醇降冰片烯、苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐溶液、雷帕霉素脂质体溶液和去离子水混合，制得光固化前体液，光固化前体液中巯基化合物的质量百分比浓度为4wt％，四臂聚乙二醇降冰片烯的质量百分比浓度为4wt％，光催化剂的质量百分比浓度为0.4wt％，药物脂质体的质量百分比浓度为40wt％，其余为去离子水。

实施例3

一种血管内原位固化前体液，其制备方法包括以下步骤：

(1)将二棕榈酰胆碱、胆固醇、雷帕霉素和十八胺加入10ml氯仿中充分溶解，L-α-磷脂酰胆碱、胆固醇、雷帕霉素和十八胺的质量比为98:26:16:14，将混合溶液倒入150ml茄形瓶，然后于50℃条件下旋转蒸发去除氯仿，在茄形瓶侧壁形成脂质膜，然后向其中加4ml去离子水进行充分水合，然后置于超声波细胞破碎机中进行超声处理并利用脂质体挤出机对脂质体进行挤压，制备得到药物脂质体颗粒；

(2)将1g肝素钠(分子量16kDa)溶于100ml去离子水中，磁力搅拌15min至完全溶解；将EDC.HCL和NHS溶解于肝素钠水溶液中，EDC.HCL与肝素钠的羧基的摩尔比为4，NHS与肝素钠的羧基的摩尔比为4，搅拌活化20min；按照半胱胺与肝素的羧基摩尔比2:1缓慢加入半胱胺溶液，室温、避光条件下反应6h；将混合溶液透析12h，透析完成后，向透析液中加入2.5g的二硫苏糖醇反应3h；反应完成后将溶液pH调至5，并向反应液加入25g的氯化钠和1.2g的乙二胺四乙酸，将反应液pH调至5，继续透析48h，冷冻干燥以制备得到巯基化肝素；

(3)将巯基肝素、四臂聚乙二醇降冰片烯、苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐溶液、雷帕霉素脂质体溶液和去离子水混合，制得光固化前体液，光固化前体液中巯基化合物的质量百分比浓度为5wt％，四臂聚乙二醇降冰片烯的质量百分比浓度为5wt％，光催化剂的质量百分比浓度为0.6wt％，药物脂质体的质量百分比浓度为20wt％，其余为去离子水。

实施例4

一种血管内原位固化前体液，其制备方法包括以下步骤：

(1)将L-α-磷脂酰胆碱、胆固醇、雷帕霉素和十八胺加入10ml氯仿中充分溶解，L-α-磷脂酰胆碱、胆固醇、雷帕霉素和十八胺的质量比为97:25:15:12，将混合溶液倒入150ml茄形瓶，然后于50℃条件下旋转蒸发去除氯仿，在茄形瓶侧壁形成脂质膜，然后向其中加4ml去离子水进行充分水合，然后置于超声波细胞破碎机中进行超声处理并利用脂质体挤出机对脂质体进行挤压，制备得到药物脂质体颗粒；

(2)将1g肝素钠(分子量16kDa)溶于100ml去离子水中，磁力搅拌15min至完全溶解；将EDC.HCL和NHS溶解于肝素钠水溶液中，EDC.HCL与肝素钠的羧基的摩尔比为6，NHS与肝素钠的羧基的摩尔比为4，搅拌活化20min；按照半胱胺与肝素的羧基摩尔比3:1缓慢加入半胱胺溶液，室温、避光条件下反应6h；将混合溶液透析12h，透析完成后，向透析液中加入1.5g的二硫苏糖醇反应3h；反应完成后将溶液pH调至3.5，并向反应液加入15g的氯化钠和1g的乙二胺四乙酸，将反应液pH调至3.5，继续透析48h，冷冻干燥以制备得到巯基化肝素；

(3)将巯基肝素、四臂聚乙二醇降冰片烯、苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐溶液、雷帕霉素脂质体溶液和去离子水混合，制得光固化前体液，光固化前体液中巯基化合物的质量百分比浓度为7wt％，四臂聚乙二醇降冰片烯的质量百分比浓度为6wt％，光催化剂的质量百分比浓度为0.5wt％，药物脂质体的质量百分比浓度为40wt％，其余为去离子水。

实施例5

一种血管内原位固化前体液，其制备方法包括以下步骤：

(2)将1g肝素钠(分子量16kDa)溶于100ml去离子水中，磁力搅拌15min至完全溶解；将EDC.HCL和NHS溶解于肝素钠水溶液中，EDC.HCL与肝素钠的羧基的摩尔比为5，NHS与肝素钠的羧基的摩尔比为3，搅拌活化20min；按照半胱胺与肝素的羧基摩尔比4:1缓慢加入半胱胺溶液，室温、避光条件下反应6h；将混合溶液透析12h，透析完成后，向透析液中加入3g的二硫苏糖醇反应3h；反应完成后将溶液pH调至4.5，并向反应液加入15g的氯化钠和1.5g的乙二胺四乙酸，将反应液pH调至4.5，继续透析48h，冷冻干燥以制备得到巯基化肝素；

(3)将巯基肝素、四臂聚乙二醇降冰片烯、苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐溶液、雷帕霉素脂质体溶液和去离子水混合，制得光固化前体液，光固化前体液中巯基化合物的质量百分比浓度为6wt％，四臂聚乙二醇降冰片烯的质量百分比浓度为8wt％，光催化剂的质量百分比浓度为0.4wt％，药物脂质体的质量百分比浓度为30wt％，其余为去离子水。

实施例6

一种血管内原位固化前体液，其制备方法包括以下步骤：

(1)将L-α-磷脂酰胆碱、胆固醇、雷帕霉素和十八胺加入10ml氯仿中充分溶解，L-α-磷脂酰胆碱、胆固醇、雷帕霉素和十八胺的质量比为98:23:15:12，将混合溶液倒入150ml茄形瓶，然后于50℃条件下旋转蒸发去除氯仿，在茄形瓶侧壁形成脂质膜，然后向其中加4ml去离子水进行充分水合，然后置于超声波细胞破碎机中进行超声处理并利用脂质体挤出机对脂质体进行挤压，制备得到药物脂质体颗粒；

(2)将1g壳聚糖(分子量16kDa)溶于100ml去离子水中，磁力搅拌15min至完全溶解；将EDC.HCL和NHS溶解于壳聚糖水溶液中，EDC.HCL与壳聚糖的羧基的摩尔比为6，NHS与壳聚糖的羧基的摩尔比为3，搅拌活化20min；按照半胱胺与壳聚糖的羧基摩尔比3:1缓慢加入半胱胺溶液，室温、避光条件下反应6h；将混合溶液透析12h，透析完成后，向透析液中加入2g的二硫苏糖醇反应3h；反应完成后将溶液pH调至3.5，并向反应液加入15g的氯化钠和1g的乙二胺四乙酸，将反应液pH调至3.5，继续透析48h，冷冻干燥以制备得到巯基化壳聚糖；

(3)将巯基壳聚糖、四臂聚乙二醇降冰片烯、苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐溶液、雷帕霉素脂质体溶液和去离子水混合，制得光固化前体液，光固化前体液中巯基壳聚糖的质量百分比浓度为4.5wt％，四臂聚乙二醇降冰片烯的质量百分比浓度为4wt％，光催化剂的质量百分比浓度为0.5wt％，药物脂质体的质量百分比浓度为40wt％，其余为去离子水。

实验例

以实施例1中的制备方法为例，对制得产物进行测试，具体如下：

(1)傅里叶变换红外光谱分析

将原料肝素钠与本发明实施例1制备得到的巯基化肝素分别于溴化钾(KBr)中研磨、压片。通过FT-IR在4000-500cm^-1波数处获得肝素钠、巯基化肝素的红外吸收峰。如图1所示，与肝素钠相比，可以在2565cm^-1处观察到HepSH的-SH伸缩振动，说明巯基成功的接枝到了肝素的分子链上。

(2)核磁共振氢谱分析

将原料肝素钠与本发明实施例1制备得到的巯基化肝素分别溶于氘代水中做核磁共振氢谱分析，获得表征结构的核磁氢谱图，如图2所示，MestReNova软件的分析结果表明化学位移δ＝2.6、2.8ppm处的核磁峰为半胱胺结构中两个亚甲基的特征峰，说明巯基成功的接枝到了肝素的分子链上。

(3)巯基接枝率测试

对不同工艺合成的HepSH进行Ellman测试。如图3所示，与原始HP溶液相比，HepSH水溶液在412nm处显示出更高的吸光度，表明在HepSH中有明显更多的-SH含量，利用巯基标准曲线y＝5.5989x-0.0452(R²＝0.999，x为巯基浓度，y为巯基在412nm的吸光度)公式，计算得出的HepSH₁(EDC.HCL:NHS的质量比5:4,半胱胺与肝素的羧基摩尔比3:1)的接枝率为75.83％、HepSH₂(EDC.HCL:NHS的质量比4:4，半胱胺与肝素的羧基摩尔比3:1)的接枝率为69.03％、HepSH₃(EDC.HCL:NHS的质量比4:4,半胱胺与肝素的羧基摩尔比2:1)的接枝率为58.43％。

(4)成胶基团验证

对本发明制备的得到的前体液利用波段为365nm-405nm、光强为150mw-300mw/cm²的光源照射1-5S进行快速光交联，将凝胶预冻、冷冻干燥。将PEGNB、HepSH₁、凝胶通过FT-IR测得在4000-500cm^-1波数处获得的红外吸收峰，如图4所示，在PEGNB的光谱中，在3060、716和1642cm^-1处分别观察到烯烃双键上C-H的伸缩振动、面外摇摆振动、以及C＝C的吸收峰。在PN-HS的FT-IR光谱中，上述烯烃相关的位置上，均出现明显差异，证明在成胶过程中，PEGNB的烯烃双键发生了变化。此外，在PN-HS的FT-IR光谱中观察到HepSH₁的特征峰，如1551cm^-1处的酰胺Ⅱ带N-H弯曲振动。以及HepSH₁的特征峰，2565cm^-1处-SH伸缩振动的消失，证明了巯基发生了变化。以上证明了HepSH₁与PEGNB成功交联成胶。

(5)成胶及组织黏附测试

将凝胶前提液喷涂在湿润的猪皮上，利用365nm-405nm，光强为150mw-300mw/cm²的光源对凝胶前提液紫外照射1S，凝胶成胶并牢固黏附在猪皮、兔心、兔肝、胸主动脉上。之后对凝胶涂层进行粘附扭曲、大水流冲刷、浸泡测试，凝胶涂层仍可牢固粘附于组织、未产生断裂及脱落，如图6所示。说明本发明的制备的凝胶前提液制备的涂层具有与湿组织的高、持久粘附力。

(6)雷帕霉素脂质体的表征

如图7所示，脂质体的平均粒径为156.5nm，多分散指数(PDI)为0.116，显示出良好的分散性，此外，脂质体的小尺寸(小于200nm)有利于穿透细胞。使用薄膜分散法制备的脂质体的透射电子显微镜(TEM)显微照片显示球形囊泡形态，粒径与检测指标相对应，见图8。

如图9所示，脂质体的zeta电位为40.5±5.97mV，而阳离子脂质体可以靶向带负电荷的细胞，提高RAPA的活性及递送。

本发明采用薄膜分散法制备脂质体，以包封率结果为优化指标。以磷脂和胆固醇的质量比、磷脂+胆固醇和RAPA的质量比为参考因素，对脂质体制备工艺进行优化，结果见图10，当磷脂与胆固醇质量比为8:2，磷脂+胆固醇和RAPA的质量比为8:1时包封率最高，包封率为94.2％，结果证明，脂质体中RAPA含量高、粒径合适、具有电位靶向性，可作为载体应用于原位抑制血管内膜增生的光固化凝胶前体液。

(7)血小板的黏附与激活

对本发明实施例1制备的凝胶涂层进行血小板粘附与激活测试，通过扫描电镜观察血小板的数量及形态。测试方法，将富板浆与各样品共孵育后，分别经2.5％戊二醛溶液固定12h，依次使用浓度为20-100％的乙醇水溶液进行梯度脱水，干燥后进行扫描电镜观察，如图11所示，图中PN-HS为PEGNB(四臂聚乙二醇降冰片烯)与巯基化肝素光交联制成的凝胶，PN-HSL为PEGNB与巯基化肝素光交联制成的凝胶，其中负载阳离子脂质体，PN-DT为PEGNB与二硫苏糖醇光交联制成的凝胶，SS为不锈钢；其中，PN-HS血小板粘附数量较少且无聚集、无激活情况，涂层表面上的血小板粘附数量与无添加肝素钠的PEGNB与二流苏糖醇交联剂的PN-DT对照组涂层无显著差异，证明了PEGNB具有优异的抗污能力，可抑制血小板的粘附。PN-HSL涂层相较于PD、PN-HS涂层，血小板粘附数量较多，推测阳离子脂质体与带负电的血小板发生静电作用，吸附一定数量的血小板，但也未发现血小板激活情况，相较与不锈钢组(SS)，此涂层的抗凝效果是非常优异的。

Claims

1.一种血管内原位固化前体液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的血管内原位固化前体液的制备方法，其特征在于，步骤(1)中磷脂、胆固醇、治疗药物和十八胺的质量比为94-98:22-26:12-17:10-14。

3.如权利要求1所述的原位抑制血管内膜增生的光固化前体液的制备方法，其特征在于，步骤(1)药物脂质体的粒径为100-400nm。

4.如权利要求1所述的血管内原位固化前体液的制备方法，其特征在于，步骤(1)治疗药物包括抗增生药物、抗炎药物、抗凝药物和促内皮修复药物中的一种。

5.如权利要求1所述的血管内原位固化前体液的制备方法，其特征在于，步骤(2)巯基化合物采用以下方法制得：制备羧基化合物溶液，向其中添加EDC.HCL和NHS，搅拌活化，然后向其中添加半胱胺溶液并于室温避光条件下反应，然后对反应产物进行透析，然后取出混合物溶液并向其中中添加二硫苏糖醇继续反应，反应完成后调节溶液为酸性，并向溶液中添加氯化钠和乙二胺四乙酸，继续调节pH为酸性后进行透析，冷冻干燥以后制得巯基化合物。

6.如权利要求5所述的血管内原位固化前体液的制备方法，其特征在于，EDC.HCL与羧基化合物中羧基的摩尔比为4-6:1，NHS与羧基化合物中羧基的摩尔比为3-4:1；半胱胺与羧基化合物中羧基的摩尔比为2-4:1；二硫苏糖醇与羧基化合物的质量比为1.5-3:1；氯化钠与羧基化合物的质量比为15-25:1；乙二胺四乙酸与羧基化合物的质量比为0.8-1.5:1；两次调节后的pH均为3.5-5。

7.如权利要求5所述的血管内原位固化前体液的制备方法，其特征在于，羧基化合物包括肝素钠、壳聚糖、透明质酸和明胶中的一种。

8.如权利要求1所述的血管内原位固化前体液的制备方法，其特征在于，步骤(2)中光固化前体液中巯基化合物的质量百分比浓度为2-8wt％，四臂聚乙二醇降冰片烯的质量百分比浓度为4-8wt％，光催化剂的质量百分比浓度为0.3-0.6wt％，药物脂质体的质量百分比浓度为10-40wt％，其余为磷酸盐缓冲液。

9.如权利要求1所述的血管内原位固化前体液的制备方法，其特征在于，步骤(2)中光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐或2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮。

10.一种血管内原位固化前体液，其特征在于，采用权利要求1-9中任一项所述的方法制得。