MXPA01005338A - Materiales de hidrogel para la produccion de oxido nitrico. - Google Patents

Abstract

Se describen hidrogeles para suministrar o producir NO, de mayor preferencia los hidrogeles biodegradables fotopolimerizables capaces de suministrar cantidades fisiológicas de NO durante periodos prolongados de tiempo, se aplican sobre los sitios o en un paciente que necesita de este tratamiento para los trastornos tales como reestenosis, trombosis, asma, cicatrización de heridas, artritis, disfunción eréctil penial, u otras condiciones en donde el NO desempeña una función importante. Los hidrogeles típicamente se forman de macrómeros que de preferencia incluyen regiones biodegradables y tienen grupos unidos a los mismos que se suministran in situ para elevar o de otra manera modular los niveles de NO en el sitio en donde se necesita el tratamiento. Los macrómeros pueden formar una homo o hetero-dispersión o solución, que se polimeriza para formar un material de hidrogel, que en elúltimo caso puede ser una red semi-compenetrante o una red compenetrante. Los compuestos que serán suministrados pueden estar atrapados físicamente, unidos al macrómero de manera covalente o iónica, o formar realmente una parte del material polimérico. El hidrogel se puede formar mediante reticulación iónica y/o covalente. Dentro del material polimérico también se pueden incluir otros agentes activos, que contienen agentes terapéuticos, profilácticos o para diagnósti

Description

MATERIALES DE HIDROGEL PARA LA PRODUCCIÓN DE ÓXIDO NÍTRICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con materiales de hidrogel fotopolimerizables que producen cantidades fisiológicamente relevantes de óxido nítrico (NO) durante periodos prolongados de t iempo . Esta solicitud reivindica la prioridad de la U.S.S.N. 60/152,054 presentada el 2 de septiembre de 1999.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las células endoteliales , normalmente presentes como una monocapa en la capa íntima de la pared arterial, se cree que desempeña una función importante en la regulación de la proliferación celular del músculo liso in vivo. Las células endoteliales se rompen seriamente mediante la mayoría de formas de lesión vascular entre las que se incluyen la provocada por angioplastia coronaria transluminar percutánea y procedimientos similares. Aproximadamente del 35 al 50% de los pacientes tratados con angioplastia coronaria transluminal percutánea experimentan re-estrechamiento clínicamente significativo de la arteria, o reestenosis, dentro de los seis meses del tratamiento inicial. La reestenosis es debida, al menos en parte, a la migración y proliferación de células de músculo liso en la pared arterial junto con aumentos en la secreción de proteínas matriz para formar una capa neoíntima obstructiva dentro de la pared arterial. Los tejidos similares limitan el desempeño de los injertos vasculares. Los procesos que regulan la curación de las heridas arteriales después de la lesión vascular, tales como la provocada por la angioplastia , todavía son muy poco comprendidos, pero se cree que implican una cascada compleja de factores derivados de la pared de los vasos sanguíneos . Se han identificado muchos factores que estimulan el engrosamiento y la reestenosis íntima a través de la administración de proteínas exógenas, la alteración genética de las células, o a través del bloqueo de ciertas señales que. utilizan los anticuerpos u otros inhibidores del factor de crecimiento específicos. Estos mitógenos celulares del músculo liso y quimioatrayentes se derivan tanto de la formación de sangre o trombo como de la pared del vaso misma. Las células endoteliales producen varias de las substancias conocidas para regular en forma descendente la proliferación celular del músculo liso, incluyendo sulfato de heparina, prostaciclina (PG12), y NO. El NO es una molécula blanco derivada de endotelio útil para la prevención de reestenosis debida a células de músculo liso y además para limitar la proliferación de las mismas (Garg et al., 1989) , el NO reduce la agregación de plaquetas (de Graaf et al., 1992; Radomski et al., 1987), aumenta la proliferación celular endotelial (Ziche et al., 1993) y atenúa la adhesión de leucocitos (Lefer et al., 1993), todas son bastante deseables para la reducción del espesamiento intimo y reestenosis (Revisado por Loscalzo, 1996) . Debido a la complejidad del proceso reestenót ico , los enfoques que actúan en los objetivos múltiples son los que probablemente sean más exitosos. Los mecanismos por los cuales el NO afecta estas respuestas múltiples no se entienden completamente aún, aunque se conoce que el NO activa la ciclasa ,'uanilato soluble al unirse a su entidad hem, elevando con esto los niveles de monofosfato de gunocina cíclica (cGMP), un segundo mensajero intracelular con múltiples efectos celulares (Moro et al., 1996) . Los efectos del NO con frecuencia se pueden imitar mediante la administración de cGMP o más derivados estables de cGMP (Garg et al., 1989) . Además, se ha encontrado que el NO inhibe la reductasa de ribonucleót idos , una enzima que convierte los ribonucleót idos en desoxirribonucléot idos , impactando de manera significativa con esto la síntesis del ADN (Lepoivre et al., 1991; Kwon et al., 1991), así como las diversas enzimas implicadas en la respiración celular (Stuehr et al. , 1989) . Varias de las moléculas que producen NO bajo condiciones fisiológicas (donadores de NO) se han identificado y evaluado tanto in vitro como in vivo. Las moléculas donadoras de NO ejercen efectos biológicos imitando aquellas de NO e incluyen S-nit rosot ioles (Diodati et al., 1993; Lefer et al., 1993; DeMeyer et al., 1995), nitratos orgánicos (Ignarro et al., 1981) y complejos de NO con nucleófilos (Diodati et al., 1993; Diodati et al., 1993; Maragos et al., 1993) . La mayoría de éstas han sido moléculas con bajo peso molecular que se administran sistémicamente y tienen vidas medias cortas bajo condiciones fisiológicas, ejerciendo con esto efectos en muchos tipos de tejido con un breve periodo de actividad. Además, con frecuencia se considera a la N-arginina como un donador de NO, a medida que L-arginina es un sustrato para la cintasa de NO y de esta forma la administración de L-arginina aumenta la producción de NO endógeno y provoca respuestas similares a aquellas provocadas por los donadores de NO en la mayoría de los casos (Cooke et al . , 1992 ) . El desarrollo de polímeros para liberación de NO que contienen complejos NO/nucleóf ilo se ha reportado por Smith et al., (1996) . Estos materiales fueron capaces de liberar el NO durante un periodo tan largo como 5 semanas in vitro y fueron capaces de limitar la proliferación de células de músculo liso en el cultivo y reducir la adherencia de plaquetas a los materiales de injerto vascular en un modelo de anastomosis arterio-venoso . Estos materiales muestran una esperanza de ser utilizados para muchas aplicaciones clínicas en donde se podría desear la producción de NO localizado, tales como materiales para recubrimiento anti-trombótico para catéteres, aunque probablemente no serán útiles para el tratamiento directo de tejidos in vivo a medida que estos materiales tienen varias desventajas. Estos polímeros se pueden producir como películas, polvos o microesferas , aunque no se pueden formar in situ en contacto directo con células y tejidos, haciendo con esto difícil localizar estrictamente el tratamiento con NO para un tejido y provocando potencialmente que los tejidos retengan el polímero en el sitio de aplicación. La formulación de los tejidos también hará difícil o imposible la administración durante los procedimientos laparoscópicos o basados en catéter. Adicionalmente, la biocompatibilidad del polímero base es un tejido serio para polímeros sin liberación de NO, implantables , especialmente aquellos destinados para utilizarse a largo plazo, a medida que se puedan desarrollar respuestas inflamatorias y trombóticas después de que termina la liberación de NO.

Podría ser más eficiente en estos compuestos que se pudiera administrar únicamente al sitio que necesita del tratamiento, y en algunos casos, reducir o eliminar los efectos secundarios debidos a la administración sistémica de los agentes, en particular durante periodos prolongados de tiempo. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar reactivos para la liberación controlada de NO y/o compuestos que modulen los niveles de NO a un sitio particular, después de la aplicación local o tópica. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar los métodos para el tratamiento de las condiciones que implican respuestas inflamatorias al proporcionar un compuesto para la liberación de materiales de hidrogel que module los niveles de NO en el sitio de aplicación.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los materiales poliméricos biocompatibles para la liberación o producción de NO, de mayor preferencia son hidrogeles biodegradables fotopolimeri zables capaces de liberar cantidades fisiológicas de NO durante periodos prolongados de tiempo, se aplican a los sitios sobre un paciente que necesita de este tratamiento para trastornos tales como por ejemplo, reestenosis, trombosis, asma, cicatrización de heridas, artritis, disfunción eréctil penial u otras condiciones en donde el NO desempeña una función importante. Los materiales poliméricos también se pueden formar en películas, recubrimientos o micropartículas . Los polímeros típicamente se forman de macrómeros, que de preferencia incluyen regiones biodegradables y tienen enlaces además de grupos que se liberan in situ para elevar o de otra manera modular los niveles de NO en el sitio en donde se necesita el tratamiento. Los macrómeros pueden formar una homo o heterodispersión o solución, que se polimeriza para formar un material polimérico, que en el último caso puede ser una red semi-compenetrante o una red compenetrante. Los compuestos que serán liberados se pueden atrapar físicamente, de manera covalente o iónicamente unirse al macrómero, o formar realmente una parte del material polimérico. Los hidrogeles se pueden formar mediante reticulación iónica y/o covalente. Otros agentes activos, entre los que se incluyen agentes terapéuticos profilácticos o para diagnóstico, también se pueden incluir dentro del material polimérico .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La Figura 1 es una representación gráfica de la síntesis de los hidrogeles S-nit rosocisteina (Acriloil-PEG-CYSNO) . La Figura 2 es una representación gráfica de la síntesis de los hidrogeles de complejo de N0-nucleófilo acriloil-PEG-Lisynes . La Figura 3 es una representación gráfica de la síntesis de los hidrogeles de complejo de nucleófilo acriloil-PEG-DETA-NO . La Figura 4 es una gráfica que muestra la liberación temporal (% de NO liberado durante el tiempo en días) de NO proveniente de hidrogeles de acriloil-PEG-Lys5-NO a un pH de 7.4 (círculos) y pH 3 ( cuadrados ) . La Figura 5 es una gráfica que muestra la liberación temporal (% de NO liberado durante el tiempo en días) de NO proveniente de hidrogeles de acriloil-PEG-DETA-NO a un pH de 7.4 (círculos) y pH 2 ( cuadrados ) . La Figura 6 es una gráfica que muestra la liberación temporal (% de NO liberado durante el tiempo en horas) de NO proveniente de hidrogeles de PEG-CYSNO a un pH de 7.4 (círculos) y pH 2 ( cuadrados ) . La Figura 7 es una gráfica que muestra la liberación temporal (µp??? de NO liberado por gramo de polímero durante el tiempo en horas) de NO proveniente de hidrogeles de PVA-NO-bFGF a un pH de 7.4, 37 °C . Las Figuras 8A y 8B son gráficas que muestran que los hidrogeles de acriloil-PEG-Lisina-NO inhiben la proliferación de las células de músculo liso. La Figura 8A, % del número de células control, formulación de hídrogel. La Figura 8B, % del número de células control, polímero soluble. Las Figuras 9A y 9B son gráficas que muestran la inhibición de la proliferación SMC mediante el NO liberado proveniente de hidrogeles de acriloil-PEG-DETA-NO (Figura 9A) y polímero soluble (Figura 9B) , como un porcentaje del control. Las Figuras 10A y 10B son gráficas que muestran la inhibición de la proliferación de SMC mediante el NO liberado proveniente de hidrogeles de acriloil-PEG-CYSNO, (Figura 10A) y polímero soluble (Figura 10B) , como un porcentaje de los controles. La Figura 11 es una gráfica que compara el grado de inhibición del desarrollo de las células de músculo liso mediante el NO liberado proveniente de los hidrogeles: acriloil-PEG-Lys-NO, acriloil-PEG-DETA-NO, acriloil-PEG-CYSNO, comparado con el hidrogel control con NO. El % de inhibición del desarrollo de las células de músculo liso se determina al comparar el desarrollo celular para cada hidrogel que libera el NO con un hidrogel de ' PEG-diacrilato control. La Figura 12a es una gráfica que muestra la liberación temporal de NO, el NO micromolar liberado/gramo de gel durante el tiempo en horas proveniente de hidrogeles PVA-NO-bFGF a un pH 7.4, 37°C. La Figura 12b es una gráfica que muestra la liberación temporal (% de bFGF teórico liberado por gramo de gel durante el tiempo en horas) proveniente de hidrogeles PVA-Cys-NO-bFGF a un pH 7.4, 37°C.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I . Materiales poliméricos para la liberación de NO Los materiales poliméricos son biocompat ibles y liberan o producen NO. En varias modalidades preferidas, los polímeros también son biodegradables , forman hidrogeles, se polimerizan in situ y son adherentes de tejido. Estas propiedades son conferidas por la selección de los componentes de macrómero así como la adición de varios grupos a los componentes . El termino "polimerizable" significa que las regiones tienen la capacidad de formar enlaces covalentes adicionales dando por resultado en azamiento de macrómero, por ejemplo, dobles enlaces carbono-carbono del tipo acrilato. Esta polimerización se inicia de manera características mediante la formación de radicales libres que resultan de la absorción fotónica de ciertos tintes y compuestos químicos para producir por último radicales libres, aunque se pueden obtener utilizando otros métodos y reactivos conocidos por aquellos expertos en la técnica.

A. Materiales poliméricos Los materiales poliméricos deben ser biocompat ibles , es decir, no deben provocar una respuesta tóxica o inmunogénica significativa o inaceptable después de la administración en un individuo o la implantación en el misino. Se sabe que varios de los materiales poliméricos son biocompatibles , entre los que se incluyen polímeros tanto naturales como sintéticos. Los ejemplos incluyen proteínas (del mismo origen del receptor), polisacáridos tales como sulfato de condroitina y ácido hialurónico, poliuretanos , poliésteres, poliamidas y acrilatos. Los polímeros pueden ser degradables o no degradables. La mayoría de los materiales poliméricos se seleccionará con base en una combinación de propiedades conferidas por diversos componentes, que pueden incluir regiones solubles en agua tales como PEG o PVA, regiones biodegradables tales como regiones que se degradan hidrolíticamente y grupos que se pueden utilizar para polimerizar los macrómeros in situ.

Regiones de adhesivo soluble en agua y/o para tejido Existe una variedad de materiales solubles en agua que se pueden incorporar en los polímeros. El término "al menos prácticamente soluble en agua" es indicativo de que la solubilidad deberá ser de al menos aproximadamente 5 g/100ml de solución acuosa. En modalidades preferidas, la región de núcleo soluble en agua puede consistir de copolimeros de bloque de poli ( etilenglicol ) , poli (óxido de etileno), poli (acetato de vinilo) , poli(alcohol vinilico), poli ( inilpirrolidona) , poli (etiloxasolina) , poli (óxido de etileno) -co-poli (óxido de propileno), polisacáridos o carboxilatos tales como ácido hialurónico dextran, sulfato de heparan, sulfato de condroitina, heparina o alginato, o proteínas, tales como gelatina, colágeno, albúmina u ovalbúmina. Las regiones hidrofílicas (es decir, solubles en agua) en general serán adhesivos para tejidos. El polímero tanto hidrofóbico como hidrofílico que incluye un gran número de grupos carboxílicos expuestos será un tejido o bioadhesivo. Los ligandos tales como péptidos de RGD y lecitinas que se unen a las moléculas carbohidrato en las células también se pueden unir al polímero para aumentar la adhesividad del tejido.

Regiones degradables Los poliésteres (Holland et al., 1986 Controlled Reléase, 4:155-180) de a-hidroxiácidos (es decir, ácido láctico, ácido glicólico) son los materiales biodegradables más ampliamente utilizados para aplicaciones que varían de dispositivos para cierre (suturas y grapas) a sistemas para suministro de fármacos (Patente de los Estados Unidos No. 4,741,337 a Smith et al.; Spilizewski et al., 1985 J. Control. Reí. 2:197-203). Además de los poli (hidroxi ácidos), se conocen varios polímeros distintos que son biodegradables , entre los que se incluyen polianhídridos y poliortoésteres , que aprovechan los enlaces de estructura lábil, según se reporta por Domb et al., 1989 Macromolecules , 22:3200; Heller et al., 1990 Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems, Chasin, M. and Langer R., Eds . , Dekker, New York, 121-161. También se han sintetizado los poliaminoácidos ya que es deseable tener polímeros que se degraden en materiales que se presentan en la naturaleza, según se reporta por Miyake et al., 1974, para uso in vivo. El tiempo que requiere un polímero para degradarse se puede ajustar mediante la selección de monómeros adecuados. Las diferencias en cristalinidad también alteran los índices de degradación. Debido a la naturaleza relativamente hidrofóbica de estos polímeros, la perdida de masa real únicamente inicia cuando los fragmentos oligoméricos son demasiado pequeños para ser solubles en agua. Por lo tanto, el peso molecular del polímero inicial influye en el índice de degradación. La región biodegradable de preferencia se puede hidrolizar bajo condiciones in vivo. Los grupos hidrolizables pueden ser polímeros y oligómeros de glicólido, láctido, e-caprolactona, otros a-hidroxiácidos y otros polímeros biológicamente degradables que proporcionan materiales que no son tóxicos o se presentan como metabolitos normales en el grupo. Los poli (a-hidroxiácidos ) son poli(ácido glicólico) , poli(DL-ácido láctico) y poli(L-ácido láctico) . Otros materiales útiles incluyen poli ( aminoácidos ) , pol i ( anhídridos ) , pol i ( ortoestéres ) y poli ( fosfoésteres) . También son útiles, por ejemplo, las polilactonas tales como por ejemplo ??1?(e-caprolactona ) , poli (e-caprolactona ) , ???(d-valerolactona) y poli (gamma-butirolactona ) . Las regiones biodegradables también se pueden construir a partir de polímeros o monómeros que utilizan enlaces susceptibles a la biodegradación mediante enzimas, tales como éster, péptido, anhídrido, ortoéster y enlaces fosfoéster. Los materiales degradables de origen biológico son bien conocidos, por ejemplo, gelatina reticulada. El ácido hialurónico se ha reticulado y se ha utilizado como un polímero degradable para aumentar de volumen para aplicaciones biomédicas (Patente de los Estados Unidos No. 4,987,744 a Della Valle et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,957,744 a Della Valle et al. (1991) Polym. Matar. Sci. Eng . , 62:731-735] ) .

Hidrogeles biodegradables Se han descrito varios polímeros que incluyen tanto regiones solubles en agua como regiones biodegradables. Sawhney et al., (1990) J. Biomed. Mater. Res. 24:1397-1411, láctido copolimerizado, glicólido y e-caprolactona con PEG para aumentar su hidrof ilicidad e índice de degradación. La Patente de los Estados Unidos No. 4,716,203 de Casey et al. (1987) sintetizó un copolímero de bloque PGA-PEG-PGA, con un contenido de PEG que varía de 5-25% en masa. La Patente de los Estados Unidos No. 4,716,203 de Casey et al. (1987) también reporta la síntesis de copolímeros dibloque de PGA-PEG, nuevamente con una variación PEG de 5-25%. La Patente de los Estados Unidos No. 4 , 526, 938 de Churchill et al. (1985) describe materiales no reticulados con PM en exceso de 5,000, con base en composiciones similares con PEG; aunque estos materiales no son solubles en agua. Cohn et al. (1988) J. Biomed. Mater. Res. 22:993-1009, describe copolímeros PLA-PEG que pueden aumentar de volumen en agua hasta 60%; estos polímeros tampoco son solubles en agua y no son reticulados. Las características que son comunes para estos materiales, es que utilizan tanto polímeros solubles en agua como polímeros degradables y que son insolubles en agua, que aumentan de volumen colectivamente hasta aproximadamente 60%.

La Patente de los Estados Unidos No. 5,410,016 otorgada el 25 de abril de 1995 a Hubbell, et al., describe materiales que se basan en polietilenglicol (PEG) , debido a su alta biocompatibilidad y naturaleza tromboresistente, con extensiones de polilactida cortas para impartir biodegradación y acrilato terminal para permitir una rápida fotopol imeri zación sin producción de calor observable. Estos materiales se modifican fácilmente para producir hidrogeles que liberan o producen NO. Las regiones polimerizables se separan en al menos una región degradable para facilitar la degradación uniforme in vivo. Existen diversas variaciones de estos polímeros. Por ejemplo, las regiones polimerizables se pueden unir directamente a extensiones degradables o indirectamente mediante secciones no degradables solubles en agua mientras que las regiones polimerizables se separan mediante una sección degradable. Por ejemplo, si la composición de macrómero contiene una región soluble en agua simple acoplada a una región degradable, una región polimerizable puede estar unida a la región soluble en agua y la otra está unida a la extensión o región degradable. En otra modalidad, la región soluble en agua forma el núcleo central de la composición de macrómero y tiene al menos dos regiones degradables unidas al núcleo. Al menos dos regiones polimerizables se unen a las regiones degradables de tal forma que, en el momento de la degradación, las regiones polimerizables, en particular en la forma de gel polimeri zado , se separan. Por el contrario, si el núcleo central de la composición de macrómeros se forma mediante una región degradable, al menos dos regiones solubles en agua se pueden unir al núcleo y las regiones polimerizables unidas a cada región soluble en agua. El resultado neto será el mismo después de la formación de gel y la exposición a las condiciones de degradación in vivo. En otra modalidad, la composición de macrómero tiene una región de estructura soluble en agua y una región degradable fija a la estructura de macrómero. Al menos dos regiones polimerizables están unidas a las regiones degradables, de tal forma que se separen en el momento de la degradación, dando por resultado en la disolución del producto de gel. En una modalidad adicional, la estructura de macrómeros se forma de una estructura no degradable que tiene regiones solubles en agua como ramas o injertos unidos a la estructura degradable. Dos o más regiones polimerizables están unidas a las ramas o injertos solubles en agua. En otra variación, la estructura puede tener la forma de estrella, lo que incluye una región soluble en agua, una región biodegradable o una región soluble en agua que también es biodegradable. En esta modalidad general, la región de estrella que contiene ya sea ramas o injertos solubles en agua o biodegradables con regiones polimerizables unidas a los mismos. Nuevamente, las regiones polimerizables se deben separar en algún punto mediante una región degradable .

Grupos polimerizables Las regiones polimerizables de preferencia son polimerizables mediante fotoiniciación por generación de radicales libres, de mayor preferencia en la radiación ultravioleta de longitud de onda visible o larga. Las regiones polimerizables preferidas son acrilatos, diacrilatos, oligoacrilatos , dimetacrilatos , oligometoacrilatos u otros grupos fotopolimerizables biológicamente aceptables. Una amina terciaria preferida es tr ietanolamina . Los fotoiniciadores útiles son aquellos que se pueden utilizar para iniciarse mediante la polimerización de generación por radicales libres de los macrómeros sin citotoxicidad y dentro de un marco de tiempo corto, minutos a lo sumo y de mayor preferencia segundos. Los tientes preferidos como iniciadores de elección para la iniciación LWUV son etil eosina, 2 , 2 -dimetoxi -2 - feni lacetofenona , otros derivados de acetofenona y alcanfor quinona. En todos los casos, la reticulación y la polimerización se inician entre copolirtieros mediante un iniciador de polimerización por radicales libres activado por luz tal como por ejemplo, 2 , 2-dimetoxi-2-fenilacetofenona o una combinación de etil eosina (10~4-10~2 miliM) y triet anolamina (0.001 a 0.1M), por ejemplo. La elección del fotoiniciador , depende de manera importante de las regiones fotopolimerizables. Por ejemplo, cuando el macrómero incluye al menos un doble enlace carbono-carbono, la absorción de luz mediante el tinte provoca que el tinte asuma un estado de triplete, el estado de triplete posteriormente reacciona con la amina para formar un radical libre que inicia la polimerización. Los tintes preferidos para utilizarse con estos materiales incluyen tinte de eosina e iniciadores tales como 2 , 2-dimetil-2-fenilacetofenona, 2-metoxi-2-fenilacetofenon y a lcanforquinona . Al utilizar estos iniciadores, los copolimeros se pueden polimerizar in situ mediante luz ultravioleta de longitud de onda larga o mediante luz láser de aproximadamente 514 nm, por ejemplo. La iniciación de la polimerización se lleva a cabo mediante la irradiación con luz a una longitud de onda de entre aproximadamente 200-700 nm, de mayor preferencia en el intervalo de luz ultravioleta de longitud de onda larga o el intervalo visible, 320 nm o superior, de mayor preferencia de aproximadamente 514 nm o 365 nm.

Existen diversos tintes foto-oxidables y fotoreducibles que se pueden utilizar para iniciar la polimerización. Éstos incluyen tintes de acridina, por ejemplo, acriblarina, tintes de tiacina, por ejemplo, tionina, tintes de xantina, por ejemplo, bengala rosa; y tintes de fenacina por ejemplo, azul de metileno. Éstos se utilizan con co-catali zadores tales como aminas, por ejemplo, trietanolamina; compuestos de azufre, por ejemplo, RSO2 1; heterociclos , por ejemplo, imidazol; enolatos; organometálicos; y otros compuestos tales como N-fenil glicina. Otros iniciadores incluyen alcanforquinonas y derivados acetofenona. También se pueden utilizar sistemas iniciadores de polimerización térmica. Estos sistemas que son inestables a 37°C y podrían iniciar una polimerización de radicales libres a temperaturas fisiológicas incluyen, por ejemplo, persulfato de potasio con o sin tetrametil etilendiamina ; benzoilperóxido, con o sin trietanolamina; y persulfato de amonio con bisulfito de sodio. Otros productos químicos de iniciación se pueden utilizar junto con la fotoiniciación . Estos incluyen, por ejemplo, esquemas de iniciación con agua y amina con isocianato o isotiocianato que contiene los macrómeros usados como las regiones polimerizables .

Modalidades preferidas En la modalidad preferida, los materiales poliméricos son una composición de macrómero biodegradable , polimeri zable y al menos prácticamente soluble en agua. El primer macrómero incluye al menos una región soluble en agua, al menos una región que porta el NO y al menos una región polimeri zable por radicales libres. El segundo macrómero incluye al menos una región soluble en agua y al menos dos regiones polimerizables por radicales libres. Las regiones pueden, en algunas modalidades, ser tanto solubles en agua como biodegradables . La composición de macrómero se polimeriza mediante la exposición de las regiones polimerizables a radicales libres generados, por ejemplo, mediante químicos y tintes fotosensibles. Ejemplos de estos macrómeros son PVA o PEG-oligoglicolil-acrilatos . La elección de capacetes adecuados permite la rápida polimerización y gelificación . Se prefieren los acrilatos debido a que se pueden polimerizar utilizando diversos sistemas de iniciación, por ejemplo, un tinte de eosina, mediante una breve exposición a luz ultravioleta o visible. Se prefiere un poli ( etilengl icol ) o unidad estructural central (núcleo) PEG sobre la base de su alta hidrofilicidad y solubilidad en agua, acompañada por una excelente biocompat ibilidad . Un oligo corto o poli (a-hidroxi ácido) , tal como ácido poliglicólico, se selecciona como una extensión de cadena preferida debido a que se degrada rápidamente mediante la hidrólisis del enlace éster en ácido glicólico, un metabolito inocuo. Aunque el ácido poliglicólico altamente cristalino es insoluble en agua y la mayoría de los solventes orgánicos comunes, la composición de macrómero total es soluble en agua y se puede gelificar rápidamente en una red biodegradable mientras que está en contacto con los fluidos de tejido acuoso. Estas redes se pueden utilizar para atrapar y dispersar los fármacos y enzimas solubles en agua y para suministrarlos a un índice controlado. Además, se pueden utilizar para atrapar suspensiones particuladas de fármacos insolubles en agua. Otras extensiones de cadena preferidas son ácido poliláctico, policaprolactona, poliortoésteres y polianhídridos . También se pueden utilizar polipéptidos . Estos bloques "poliméricos" se debe entender que incluyen bloques timéricos, triméricos y ol igoméricos . El PVA contiene muchos grupos hidroxilo colgantes. Estos grupos hidroxilo se hacen reaccionar fácilmente para formar cadenas laterales tales como diversos agentes reticulantes y donadores de óxido nítrico. El PVA es soluble en agua y tiene una excelente biocompatibilidad. La modificación del PVA para añadirse a grupos metacrilato mediante un enlace diacetal con los grupos hidroxilo colgantes y la adición de un fotoiniciador adecuado permite que el PVA se fotopolimerice para formar hidrogeles bajo luz UV de longitud de onda larga. En otra modalidad preferida, el hidrogel se forma a partir de macrómeros de alcohol polivinilico modificado (PVA), tales como los descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,508,317, 5,665,840, 5,849,841, 5,932,674, 6,011,077, 5,939,489 y 5,807,927. Los macrómeros expuestos en la Patente de los Estados Unidos No. 5,508,317, por ejemplo, son prepolimeros de PVA modificados con grupos reticulables colgantes, tales como grupos acrilamida que contienen grupos olefinicamente insaturados reticulables. Estos macrómeros se pueden polimerizar mediante la fotopolimerización o polimerización por radicales libres redox, por ejemplo. Los polímeros de partida son, en particular, derivados de alcohol polivinilico o copolímeros de alcohol vinílico que contienen, por ejemplo, una estructura 1,3-diol. El grupo reticulable o el modificador adicional se pueden unir a la estructura del polímero de partida en varias formas, por ejemplo a través de un cierto porcentaje de unidades 1,3-diol que serán modificadas para proporcionar un 1,3-dioxano, que contiene un radical reticulable o un modificador adicional en la posición 2. Otro posiblemente es para una cierto porcentaje de grupos hidroxilo en el polímero de partida que será esterificado por medio de un ácido orgánico insaturado, estos radicales unidos por éster contienen un grupo reticulable. La hidrofobicidad de estos macrómeros se puede aumentar al sustituir algunos de los grupos hidroxilo colgantes con más sustituyentes hidrofóbicos . Las propiedades de los macrómeros, tales como hidrofobicidad, también se pueden modificar mediante la incorporación de un comonómero en la estructura de macrómero. Los macrómeros también pueden estar formados teniendo grupos colgantes reticulables por otros medios.

B. Grupos NO o compuestos para modulación Se han identificado y evaluado varias de las moléculas que producen NO bajo condiciones fisiológicas (donadoras de NO) tanto in vitro como in vivo, incluyendo S-nitrosotioles , nitratos orgánicos y complejos de NO con nucleófilos. La L-arginina es un donador de NO, ya que la L-arginina es un sustrato para la cintasa de NO y de esta forma la administración de L-arginina aumenta la producción de NO endógena y produce respuestas similares a las provocadas por los donadores de NO en la mayoría de los casos. Otros donadores de NO incluyen molsidomina, CAS754, SP -5185 y SIN-1. Otros compuestos capaces de producir y/o donar NO también se pueden utilizar. Éstos incluyen compuestos nitrosilantes de nitratos orgánicos, nitroésteres y L-arginina.

Las moléculas que producen NO, o liberan o generan NO, de preferencia se unen a las regiones que contienen nucleófilos y/o tioles tales como por ejemplo S-nitrosotioles capaces de formar un complejo con NO.

C. Agentes profilácticos, terapéuticos y para diagnóstico Los materiales poliméricos también se pueden utilizar para la administración del fármaco, de preferencia la liberación localizada de los agentes profilácticos, .terapéuticos o para diagnóstico en el sitio en donde se necesitan los materiales, aunque los materiales poliméricos pueden estar cargados con un agente para ser liberados sistémicamente . Estos agentes incluyen proteínas o péptidos, polisacáridos , moléculas de ácido nucleico y moléculas orgánicas simples tanto naturales como sintéticas. Los materiales representativos incluyen antibióticos, antivirales y fármacos antihongos, productos antiinflamatorios ( esteroidales o no esteroidales ) , hormonas, factores de crecimiento, citosinas, · agentes neuroact i os , vasoconstrictores y otras moléculas implicadas en las respuestas cardiovasculares, enzimas, agentes antineoplásticos, anestésicos locales, agentes antiangiogénicos , anticuerpos, fármacos que afectan los órganos reproductores y oligonucleótidos tales como oligonucleótidos antisentido. Los materiales para diagnóstico pueden ser radioactivos, unidos para un substrato cromogénico y dividir el mismo, o se pueden detectar mediante ultrasonido, rayos X, mri u otros medios para formación de imagen normales. Estos agentes se pueden mezclar con macrómeros antes de la polimerización, aplicados en el interior o sobre el polímero, o unirse al macrómero antes del momento de la polimerización o en el momento de la misma, ya sea de manera covalente o iónica, de tal forma que el agente se libere mediante degradación (enzimática o hidrolítica) o mediante difusión en el sitio en donde se aplica el polímero.

II . Métodos de uso ?. Recubrimientos; películas; micropartículas Aunque se describen principalmente con respecto al tratamiento in vivo, es evidente que los materiales poliméricos descritos en la presente se pueden utilizar en cultivo celular, sobre sustratos de cultivo celular, o como recubrimientos sobre implantes médicos o dispositivos tales como sujetadores o catéteres, o se pueden formar utilizando técnicas estándar en micropartí culas u otros tipos de formulaciones que se pueden utilizar en un paciente o se pueden administrar al mismo.

B. Aplicaciones terapéuticas Los materiales poliméricos capaces de liberar cantidades fisiológicas de NO durante periodos prolongados de tiempo se pueden aplicar a los sitios sobre el paciente o en el mismo que necesita de este tratamiento. Los trastornos o condiciones representativas que se pueden tratar con NO incluyen reestenosis, trombosis, asma, cicatrización heridas, artritis y disfunción eréctil peniana o femenina. El material típicamente se aplica como una solución de macrómero y se polimeriza in situ, aunque la polimerización se puede iniciar antes de la aplicación.

Cicatrización de heridas Las formulaciones son particularmente útiles para el tratamiento de heridas tales como úlceras y quemaduras, todo tipo de heridas entre las que se incluyen quemaduras, heridas quirúrgicas y heridas abiertas de la pierna y el pie. En general existen tres tipos de heridas abiertas de la pierna, denominadas úlceras: úlceras estasis venosas, en general observadas en personas de edad avanzada sedentarias cuando el flujo sanguíneo a las piernas se vuelve lento; úlceras por decúbito, también denominadas llagas de presión o llagas de cama, que se presentan con mayor frecuencia en personas que deben guardar cama y que son incapaces de cambiar frecuentemente de posición; y úlceras diabéticas del pie, provocadas por una deficiente circulación sanguínea en los pies. Debido al envejecimiento de la población, probablemente habrá una mayor demanda por tratamientos para heridas eficaces y que no sean dañinos para el usuario en el futuro cercano. El término "herida" en el sentido en que se utiliza en la presente, se refiere a todos los tipos de lesiones de tejidos, entre las que se incluyen aquellas causadas por cirugía y trauma incluyendo quemaduras así como lesiones de condiciones médicas crónicas o graves tales como ateroesclerosis o diabetes .

Tratamiento de reestenosis Una aplicación preferida es un método para reducir los efectos de la reestenosis en pacientes después de la cirugía. El método incluye recubrir la superficie dentro de una arteria con una solución acuosa de un iniciador polimer i zable por radicales libres sensible a la luz y varios de los macrómeros. La arteria recubierta se somete a un láser por arco Xenón que induce la polimerización de los macrómeros. A medida que se forma la composición de macrómero polimerizada recientemente, las condiciones fisiológicas dentro de la arteria inducirán la liberación de NO. Esta liberación se localizará estrictamente durante periodos prolongados de tiempo.

Prevención de adhesiones quirúrgicas Una aplicación preferida es un método para reducir la formación de adhesiones después de un procedimiento quirúrgico en un paciente. En una modalidad, el método incluye recubrir las superficies del tejido dañado en un paciente con una solución acuosa de un iniciador de polimerización por radicales libres sensible a la luz y una solución de macrómeros según se describió ante iormente. Las superficies de tejido recubiertas se exponen a una luz suficiente para polimerizar el macrómero. El iniciador de polimerización por radicales libres sensible a la luz puede ser un compuesto simple (por ejemplo, 2 , 2-dimetoxi-2-fenil acetofenona) o una combinación de un tinte y un co-catali zador (por ejemplo, de etil eosina y trietanol amina) .

Adhesivos para tejido Otro uso de los polímeros es un método para adherir superficies de tejido en un paciente. En una modalidad, el macrómero se mezcla con un fotoiniciador o una mezcla de fotoiniciador/co-catalizador para formar una mezcla acuosa y la mezcla se aplica a la superficie del tejido para la cual se desea la adhesión del tejido. La superficie del tejido se pone en contacto con el tejido en donde se desea la adhesión formando una unión de tejido. La unión de tejido luego se irradia hasta que los macrómeros se polimerizan.

Recubrimientos de tejido En una aplicación particularmente preferida de estos macrómeros, un recubrimiento ultradelgado se aplica a la superficie de un tejido, de mayor preferencia al lumen de un tejido tal como un vaso sanguíneo. Un uso de este recubrimiento es en el tratamiento o prevención de la reestenosis, nuevo cierre abrupto, o vasospasmo después de la intervención vascular. El iniciador se aplica a la superficie del tejido, se deja reaccionar, adsorber o unirse al tejido, el iniciador sin unir se retira mediante dilución o enjuague y la solución de macrómero se aplica y se polimeriza. Este método es capaz de crear un recubrimiento polimérico uniforme de entre una y 500 mieras de espesor, de mayor preferencia aproximadamente veinte mieras, lo cual no evoca trombosis o inflamación localizada.

Soportes del tejido Los materiales poliméricos también se pueden utilizar para crear soportes de tejido al formar artículos configurados dentro del cuerpo para servir a una función mecánica. Estos soportes incluyen, por ejemplo, sellantes para órganos sangrantes, sellantes para defectos óseos y rellenador de espacios para aneurismas vasculares. Además, estos soportes pueden incluir estructuras para sostener órganos, recipientes o tubos, en una posición particular durante un periodo controlado de tiempo.

Suministro controlada del fármaco Como se observó anteriormente, los materiales poliméricos se pueden utilizar como portadores para materiales biológicamente activos tales como agentes terapéuticos, profilácticos o para diagnóstico, que incluyen hormonas, enzimas, antibióticos, agentes antineoplásticos y similares. El material polimérico se puede utilizar para preservar temporalmente las propiedades funcionales de un agente que será liberado, asi como para proporcionar la liberación prolongada y comprobada del agente en tejidos locales o circulación sistémica . En una variación del método para el suministro controlado del fármaco, en el cual el agente se mezcla con la solución de macrómero, luego se polimeriza in situ, los macrómeros se polimerizan con los materiales biológicamente activos para formar microesferas o nanoparticulas que contienen los materiales biológicamente activo. El macrómero, fotoiniciador y el agente que serán encapsulados se mezclan en una mezcla acuosa. Las partículas de la mezcla se forman utilizando técnicas estándar, por ejemplo, al mezclar en aceite para formar una emulsión, formando gotitas en aceite utilizando una boquilla, o formando gotitas en aire utilizando una boquilla. La suspensión o gotitas se irradian con una luz adecuada para la fotopolimerización del macrómero . Estos materiales son particularmente útiles para el suministro controlado del fármaco de los materiales hidrofil icos , ya que las regiones solubles en agua del polímero permiten el acceso del agua en los materiales atrapados dentro del polímero. Además, es posible polimerizar la composición de macrómero que contiene el material que será atrapado sin la exposición del material a solventes orgánicos. La liberación puede ocurrir mediante difusión del material a partir del polímero antes de la degradación y/o mediante la difusión del material a partir del polímero a medida que éste se degrada, dependiendo de los tamaños de poro característicos dentro del polímero, el cual se controla mediante el peso molecular entre los reticulantes y la densidad de reticulación. La desacti ación del material atrapado . se reduce debido a la inmovilización y al efecto protector del gel y se evitan los efectos de explosión catastróficos asociados con otros sistemas de liberación controlada. Cuando el material atrapado es una enzima, la enzima se puede exponer al substrato mientras que la enzima se atrapa, con la condición de que las proporciones de gel se seleccionen para permitir que el substrato permee al gel. La degradación del polímero facilita la liberación controlada eventual de las macromoléculas libres in vivo mediante hidrólisis gradual de los enlaces de éster terminal.

III . E emplos Como se demuestra por los ejemplos 1-3, se han sintetizado tres clases de polímeros con base PEG productores de NO y sus constantes de índice para liberación de NO determinadas in vitro bajo condiciones fisiológicas. La respuesta biológica a G los materiales adecuados se ha evaluado in vitro utilizando células de músculo liso cultivadas y células endoteliales in vivo utilizando un modelo de lesión en la arteria carótida de rata que se asemeja a la reestenosis en el hombre. Los materiales incluyen copolímeros de bloque BAB de polietilenglicol (A) con policisteína (B) que se hacen reaccionar posteriormente con NaN02 para formar S-nitrosotioles, copolímeros de bloque BAB de polietilenglicol ("PEG") (A) y diet ilent riamina ("DETA") (B) que se hacen reaccionar posteriormente con gas de NO para formar complejos de nucleóf ilo/NO y copolímeros de bloque BAB de polietilenglicol (A) y poliglicina (B) que se hacen reaccionar posteriormente con gas el NO para formar complejos de nucleófilo/NO . Todos los polímeros se terminan adicionalmente con grupos de acrilato reactivo para permitir la rápida fot opolimer i zación in situ. Se esperaría que estos materiales tengan buena biocompat ibilidad, con la condición de que un polímero biocompatible , soluble en agua tal como PEG comprenda el volumen del material y tenga un peso molecular suficientemente alto y que se biodegrade lentamente debido a la presencia de dos enlaces éster y dos enlaces amida en cada cadena polimérica. Estos tres materiales se seleccionaron a medida que se esperaba que tuvieran dinámicas de liberación muy diferentes: complejos de nucleófilo/NO que hayan mostrado liberar el NO durante hasta 5 semanas (Smith et al., 1996), mientras que la vida media de la S-nitrosocisteína es de 0.023 horas (Mathews et al., 1993) . La cantidad del NO producido mediante estos copolímeros se puede ajustar al alterar la proporción de polietilenglicol (PEG) a cisteína o lisina. Una ventaja de estas composiciones de macrómero es que se pueden polimeri zar rápidamente en un medio acuoso. Conformando de manera precisa, de esta forma se pueden formar películas o membranas semi-permeables , biodegradables, sobre el tejido in situ para servir como barreras biodegradables, como portadores para células vivas u otros materiales biológicamente activos y como adhesivos quirúrgicos. El polímero muestra excelente biocompat ibi 1 idad , según se observa mediante un sobredesarrollo fibroso mínimo en muestras implantadas. Los hidrogeles para los modelos se gelificaron in situ provenientes de precursores solubles en agua mediante una breve exposición a luz ultravioleta de longitud de onda larga (L UV) dando por resultado en la formación de una red compenetrante del hidrogel con la proteína y los componentes de glucosaminoglicano del tejido. Según se demuestra por los ejemplos 4 y 5, se producen tres tipos de hidrogeles PVA y demuestran liberación del NO y el fármaco incorporado (bFGF) : hidrogeles PVA-NH2-NO; hidrogeles PVA-Cys-NO; hidrogeles PVA-NO-bFGF. Los resultados son similares a aquellos para los hidrogeles con base PEG .

Ejemplo 1: Síntesis de macrómeros PEG-Cys Como se muestra en la Figura 1, se formó un polímero de acriloil-PEG-CYSNO al hacer reaccionar primero monoacrilato de polietilenglicol N-hidroxisuccinimida (ACRL- PEG-NHS , PM 3400, disponible comercialmente de Shearwater Polymers, Huntington, AL) con L-cisteína a una proporción molar de 1:2 en amortiguador de bicarbonato de sodio 50 mM (pH 8.5) durante 2 horas; el producto se dializó entonces en una membrana de éster de celulosa (peso molecular al corte 500, Spectrum Labs, Laguna Hills, CA) en diH20, y se liofilizó. El análisis del copolímero de acriloil-PEG-Cys se realizó utilizando cromatografía de perraeación en gel (GPC) con un detector por dispersión de luz, evaporativo y un detector de UV a 260 nm (Polymer Laboratories, Amherst, MA) . La síntesis exitosa del acriloil-PEG-Cys se determinó mediante un desplazamiento en la posición del pico del detector por dispersión de luz evaporativa. El copolímero se hizo reaccionar entonces con una cantidad equimolar de NaN02 a pH 2 y 37°C durante 20 minutos para formar la S-nitrosocisteína . La conversión de los grupos tiol a S-nitrosotioles se midió utilizando el ensayo Ellman (Hermanson, 1995) . Después de ajustar el pH de la solución a 7.4, el polímero de acriloil-PEG-CYSNO se incorporó en hidrogeles fotopolimerizables mezclando con diacrilato PEG ( PM 3400) a una proporción molar 1:10 en solución acuosa con 1500 ppm, 2 , 2 -dimetoxi -2 - feni 1 acetofenona como un iniciador ultravioleta de longitud de onda larga. Estuvo presente en esta mezcla N-vinilpirrolidona al 0.15% a medida que se utilizó como un solvente para el fotoiniciador . La exposición a luz ultravioleta (365 -nm, 10 nW/cm2) se utilizó para reticular el polímero, dando por resultado en la conversión a un hidrogel (Sawhney et al., 1993) . La producción de NO mediante los hidrogeles se cuantificó utilizando el ensayo Griess.

Ejemplo 2: Síntesis de los macrómeros PEG-Lys Como se muestra en la Figura 2, para los hidrogeles acriloil-PEG-Lyss-NO, un copolimero de ACRL-PEG-NHS ( PM 3400, Shearwater Polymers) y poly-L-lisina (DP=5) se sintetizó al hacer reaccionar en una proporción equimolar en bicarbonato de sodio 50 mM (pH 8.5) . El copolimero resultante se analizó mediante GPC, luego se disolvió en agua y se hizo reaccionar con gas de NO en un recipiente evacuado, formando asi complejos de nucleófilo con NO con los grupos amina en los grupos secundarios de lisina. El grado de conversión de los grupos amina a complejos de NO-nucleófilo se midió utilizando el ensayo de ninhidrina y se formaron hidrogeles reticulados según se describió anteriormente en el Ejemplo 1.

Ejemplo 3: Síntesis de hidrogeles de complejo DETA-NO- nucleófilo La diet ilentr iamina (DETA, Aldrich, Milwaukee, WI) se hizo reaccionar con ACRL-PEG-NHS ( PM 3400, Shearwater Polymers) en amortiguador de bicarbonato de sodio 50 mM (pH 8.5) a una proporción equimolar, se liofilizó y se analizó mediante GPC como se describió anteriormente. El copolimero se disolvió entonces en agua y se expuso a gas de NO para formar complejos de nucleófilo con NO según se describió para PEG-Lys5-NO y se ensayó para contenido de amina utilizando el ensayo ninhidrina. El PEG-DETA-NO se liofilizó y luego se fotopolimerizó según se describió anteriormente para formar hidrogeles, según se muestra en la Figura 3.

Ejemplo 4: Síntesis de hidrogeles PVA-NH2-NO El poli (alcohol vinilico) (Hoechst, Mowiol 4-88) se disolvió en diH20 y se calentó a 95°C en un matraz de fondo redondo bajo agitación continua. Durante una hora, la solución se enfrió a temperatura ambiente y se agregó un grupo acetal reticulable, dimetil acetal metacri lamidoacetaldehído (NAAADA) . También se agregó la aminacetal, gamma-aminobut iraldehido dietilacetal y la mezcla se acidificó utilizando ácido acético glacial y ácido clorhídrico al 37%. La mezcla se dejó agitar, a temperatura ambiente durante nueve horas, después de lo cual se ajusto el pH a pH 3.6 utilizando trietilamina . Con el fin de purificar el polímero, la solución se diafiltró entonces a través de una membrana de celulosa PM 3000 contra dif-hO a 6.5 veces el volumen de la solución de polímero. La concentración polimérica se ajustó a 22% p/v utilizando diafiltración y el pH se ajustó a 7.4 con NaOH 1N. La concentración de amina del polímero se determinó usando el ensayo ninhidrina. Con el fin de formar el enlace donador de NO para el PVA-NH2, el polímero modificado con amina neutralizada se colocó en un matraz de fondo redondo con grifo. El matraz se evacuó y se cargó con gas de óxido nítrico hasta que se logró la conversión deseada de aminas a complejos de nucleófilo con NO. Los hidrogeles fotoret iculados se formaron a partir de PVA-NH2-NO al agregar fotoiniciador Irgacure 2959 (Ciba-Geigy) al 0.1% (con base en el volumen de solución total) y luego exponiendo a luz UV (2 mW/cm2, 365 nm) durante 30 segundos. La adición del fotoiniciador condujo la concentración polimérica final a 20% p/v.

Ejemplo 5: Síntesis de idrogeles PVA-Cys-NO El PVA-NH2 se sintetizó según se describió anteriormente. La amina terminal de cisteína se acetiló utilizando anhídrido acético y el extremo carboxilo de la cisteína se acopló al PVA-NH2 utilizando un producto químico EDAC soluble en agua. El PVA-Cys resultante se purificó entonces utilizando diafiltración y condujo a una concentración del 22% ?/v. El PVA-Cys-NO se formó al agregar nitrito de sodio en una cantidad equimolar a residuos de cisteína, ajusfando el pH a 2 e incubando a 37°C durante 15 minutos. El grado de reacción de cisteína a Cys-NO se ensayó utilizando las reacciones tanto el Ellman y Griess. El fotoiniciador , 2,2-metil-2-fenilacetofenona se disolvió en N-vinilpirrolidona a una concentración de 600 mg/ml y se agregó a la solución de polímero (0.1% con base en el volumen de solución total) . El polímero se retículo entonces bajo luz UV durante 30 segundos y se colocó en HEPES amortiguado con solución salina, pH 7.4, 37°C.

Ejemplo 6: Liberación de bFGF a partir de hidrogeles PVA-NO-bFGF Para los hidrogeles PVA-NO-bFGF se utilizó el procedimiento anterior para producir el polímero PVA-NO. Inmediatamente antes de la exposición a luz UV, se adicionaron 2 ·' µg/ml bFGF a la solución de polímero y se mezclo i'ien. Los genes se reticularon según se describió anteriormente y se almacenaron en una emulsión salina amortiguada con HEPES pH 7.4, 30°C. La liberación de bFGF se cuantificó utilizando el ensayo BCA (Pierce Chemicals) y la liberación de i'iO se ensayó utilizando la reacción Griess.

Ejemplo 7: índices de liberación de NO a partir de hidrogeles de acriloil-PEG-Lys5-NO Después de la preparación y fotopol imeri zación de los materiales que liberan el NO según se describió anteriormente, los hidrogeles se pesaron y se almacenaron en solución salina amortiguada con HEPES, pH 7.4 a 37°C. Las alícuotas del amortiguador se retiraron en cada punto de tiempo y se reemplazaron con amortiguador fresco. Las muestras provenientes de cada punto de tiempo se analizaron para el contenido de nitrito utilizando un ensayo calorimétrico basado en la reacción Griess.

También se investigaron las dinámicas de liberación de NO de los hidrogeles almacenados en amortiguador a diversos niveles de pH con el fin de explorar posibles condiciones de almacenamiento para los hidrogeles. A niveles de pH ácido, la liberación de NO proveniente de los hidrogeles se inhibió significativamente . La liberación de NO proveniente de hidrogeles de acriloi 1-PEG-Lys5-N0 se muestra en la Figura 4. La liberación de NO proveniente de hidrogeles de acriloil-PEG-DETA-NO se muestra en la Figura 5. La liberación de NO proveniente de hidrogeles de acr i loil-PEG-CYSNO se muestra en la Figura 6.

Ejemplo 8: índices de liberación de NO a partir de hidrogeles de PVA-NO-bFGF La liberación de NO proveniente de hidrogeles PVA-NO-bFGF se determinó de la misma manera que en el Ejemplo 7 y se muestra en la Figura 7. Las Figuras 12a y 12b, respectivamente, muestran la liberación temporal de NO y un factor de crecimiento, bFGF, durante un tiempo proveniente de hidrogeles PVA-NO-bFGF. La liberación de NO continua por más de 12 horas, mientras que el factor de crecimiento se libera completamente dentro de las primeras 5 horas.

Ejemplo 9: Ejemplos de macrómeros que liberan NO en células de músculo liso cultivadas: proliferación y viabilidad Con el fin de valorar el potencial de un material para la reducción de la proliferación celular de músculo liso después de la lesión vascular, las célula; de músculo liso cultivadas se desarrollaron en piesencia de materiales para liberación de NO y se evaluaron los efectos de esos materiales sobre las células. Las células de músculo liso aisladas de ratas Wistar-Kyoto (pasaje 11-15, proporcionadas por T. Scott -Burden ) , se cultivaron en Medio Esencial Mínimo suplementado con FBS al 10%, L-glutamina 2 mM, 500 unidades de penicilina y 100 mg/L de estreptomicina a 37°C en un ambiente de C02 al 5%. Las células se sembraron en placas de cultivo para tejido de 24 cavidades (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) a una densidad de 10,000 células/cm2. Se agregaron donadores de NO en forma ya sea soluble o hidrogel al medio en las cavidades un día después del sembrado. A los 4 días del cultivo, los números celulares se determinaron al preparar suspensiones celulares individuales con tripsina y al contar tres muestras de cada grupo utilizando un contador Coulter (Multisizer #0646, Coulter Electronics, Hialeah, FL) .

Los efectos de los donadores de NO en solución en la proliferación de los SMC se investigaron primero al realizar una curva de respuesta de dosis a NO, en donde se cultivaron las células con una variación de concentraciones de donador de NO (1 µ? - 10 mM) con el fin de identificar las dosis adecuadas para los estudios de hidrogel. Los complejos de nucleófilo con NO (Lys-NO y DETA-NO) se formaro: al hacer reaccionar ya sea L-lisina o DETA con gas le NO en agua durante 24 horas. El Cys-NO soluble se sintetizó al hacer reaccionar una cantidad equimolar de L-cisteina con NaN02 a pH 2 y 37°C durante 20 minutos. Todas las soluciones donadoras de NO se ajustaron a pH 7.4 antes de la adición a los cultivos celulares. La proliferación de las células de músculo liso en presencia de hidrogeles productores de NO y control se investigó entonces utilizando la dosis de NO óptima determinada anteriormente. Los hidrogeles que contienen acriloil-PEG-Lys-NO, acriloil-PEG-DETA-NO y acriloil-PEG-CYSNO se formaron según se describió anteriormente, con la excepción de que las soluciones de gel se filtraron estériles a través de jeringa de 0.2 µ?? (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) antes de agregar 2 , 2-dimetoxi-2-fenil acetofenona. Los hidrogeles PEG-diacrilato que no contenían donadores de NO se utilizaron como un control. Los hidrogeles se fotopolimerizaron en los insertos de cultivo celular (tamaño de poro 8 µp?, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y se colocaron en un medio sobre las células cultivadas. Todos los tres donadores de NO en hidrogel inhibieron significativamente el crecimiento de SMC (p < 0.0001) . El número de células de músculo liso permaneció cerca de la densidad de sembrado, que varió de 10 a 15% del número de células control final para todos los experim ,-ntos . La inhibició:. de la proliferación de SMC mediante hidrogeles de acriloil-PEG-Lys5-NO se muestra en la Figura 8A, en comparación con el control de solución de macrómero mostrado en la Figura 8B. Ambos inhibieron significativamente la proliferación de SMC. La inhibición de la proliferación de SMC mediante niveles de complejo de acriloil-PEG-DETA-NO nucleófilo se muestra en la Figura 9A, en comparación con el control de solución de macrómero mostrado en la Figura 9B, ambos inhibieron significativamente la proliferación de SMC. La inhibición de la proliferación de SMC mediante hidrogeles de acriloil-PEG-CYSNO se muestra en la Figura 10A en comparación con el control de solución de macrómero mostrado en la Figura 10B, ambos inhibieron significativamente la proliferación de SMC. La inhibición de la proliferación de SMC mediante hidrogeles de acriloil-PEG-CYSNO, hidrogeles de acriloil-PEG-DETA-NO e hidrogeles de PEG-Lys-NO se comparó con el hidrogel control de la Figura 11. todos los hidrogeles de NO inhibieron significativamente el desarrollo SMC.

Ejemplo 5: Efectos de macrómeros para liberación de NO en adhesión de plaquetas in vitro El efecto da liberación de NO sobre la adhesión de plaquetas se investigó para valorar el potencial de estos materiales para la prevención de trombosis. La sangre se obtuvo de un voluntario sano mediante venipuntura y anticoagulada con 10 U/ml de heparina. Las plaquetas y los glóbulos blancos se etiquetaron de manera fluorescente con metaprina a una concentración de 10 µ? . Se preparó una solución de 2.5 mg/ml de colágeno I en ácido acético glacial al 3% en diH20 y se aplicó a portaobjetos de vidrio durante 45 minutos en un ambiente humidificado a temperatura ambiente. Los hidrogeles de acriloil-PEG-CYSNO y PEG-diacr ilato se prepararon según se describió anteriormente y se incubaron con la sangre entera etiquetada a 37°C durante 30 minutos. Los hidrogeles se retiraron y la sangre se incubó entonces con los portaobjetos de vidrio recubiertos con colágeno (dos por grupo) durante 20 minutos a 37°C y luego se enjuagaron con HBS . Los conteos de plaqueta por campo de vista a 40x se contaron bajo un microscopio fluorescente (Zeiss Axiovert 135, Thornwood, NY) en cuatro áreas seleccionadas aleatoriamente por portaobjeto. Las fotos de las plaquetas que se habían expuesto a los hidrogeles PEG-diacrilato o de acriloil-PEG-CYSNO control demostraron que la exposición a los hidrogeles para liberación de NO inhibió la adhesión de plaquetas a las superficies t rombogénicas . Les portaobjetos de vidrio recubiertos con colá reno se utilizaron como una superficie trombogénica cuyas plaquetas se podrían adherir normalmente. Cuando se incubó la sangre con los hidrogeles PEG-diacrilato control, se observaron por campo de vista plaquetas adherentes 69.25 ± 4.46 (media ± SD) . Este número se redujo a 7.65 ± 6.16 plaquetas por campo de vista cuando la sangre se expuso previamente a los hidrogeles de acriloil-PEG-CYSNO (p < 0.0001 ] .

Claims (23)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. Una composición de macrómero, polímerizable, biocompat ible , que comprende al menos una región portadora de NO o un compuesto modulador de NO, en donde el NO o compuesto modulador de NO se libera de la composic ón de macrómero después de la polimerización,' bajo condiciones fisiológicas, en donde los macrómeros comprenden regiones seleccionadas del grupo que consiste de regiones solubles en agua, regiones adhesivas de tejido y regiones de grupo extremo polímerizable.
2. 2. La composición de macrómero según la reivindicación 1, en donde la composición de macrómero comprende macrómeros adicionales que no liberan el NO después de la polimerización.
3. 3. La composición de macrómero según la reivindicación 1, en donde el macrómero comprende además grupos laterales ret iculables .
4. 4. La composición de macrómero según la reivindicación 1, en donde el macrómero comprende al menos una región degradable.
5. 5. La composición de macrómero según la reivindicación 1, en donde el macrómero es soluble en agua .
6. 6. La composición de macrómero según la reivindicación 1, en donde el macrómero se adhiere al tej ido .
7. 7. La composición de macrómero según la reivindicación 1, en donde el macrómero comprende una región soluble en agua unida a una región degradable, al menos una región polimerizable unida a la región soluble en agua y al menos una región polimerizable unida a la región degr?dable.
8. 8. La compo sición de macrómero según la reivindicación 4, en de de la región degradable es un núcleo central, al menos dos regiones solubles en agua se unen al núcleo y al menos una región polimerizable se une a cada región soluble en agua.
9. 9. La composición de macrómero según la reivindicación 1, en donde el macrómero comprende una región soluble en agua que forma un núcleo central, al menos dos regiones degradables unidas al núcleo central y al menos dos regiones polimeri zables unidas a las regiones degradables.
10. 10. La composición de macrómero según la reivindicación 1, en donde además comprende agentes terapéuticos, profilácticos o para diagnóstico seleccionados del grupo que consiste de proteínas carbohidratos, ácidos nucleicos, moléculas orgánicas, moléculas biológicamente activas inorgánicas, células, tejidos y agregados de tejido, y agentes para diagnóstico.
11. 11. La composición de macrómero según la reivindicación 1, en donde el macrómero comprende al menos una región soluble en agua, al menos una región portadora de NO y al menos una región polimeri zable por radicales libres.
12. 12. La composición de macrómero según la reivindicación 11, que comprende además al menos una región degradable.
13. 13. La composición de macrómero según la reivindicación 1, que r.iene incorporado a la misma o unido de manera liberable a la misma un compuesto que modula los niveles de NO bajo condiciones fisiológicas .
14. 14. La composición de macrómero según la reivindicación 1, que libera el NO bajo condiciones fisiológicas .
15. 15. Un método para modular niveles de NO en tejido que comprende administrar al tejido cualquiera de las composiciones de macrómero según las reivindicaciones 1 a 14.
16. 16. El método según la reivindicación 15, que comprende además aplicar primero un iniciador de polimerización en el sitio en donde la solución de composición de macrómero se polimeri zará .
17. 17. El método según la rei indicación 16, en donde iniciador se une al tejido, que comprende además retirar el iniciador sin unir antes de la aplicación de la solución de composición de macrómero.
18. 18. Un método para la liberación controlada de agentes terapéuticos profilácticos o para diagnóstico que comprende administrar al tejido en necesidad del mismo una composición de macrómero biocompatible, polimeri zable , que comprende al menos una región portadora de NO o un compuesto para modular NO, en donde el NO o el compuesto para modular el NO se libera de la composición de macrómero después de la polimerización, bajo condiciones fisiológi as, en donde los macrómeros comprenden regiones seleccionadas del grupo que consiste de regiones solubles en agua, regiones adhesivas de tejido y regiones de grupo extremo polimeri zables , que comprende agentes terapéuticos, profilácticos o para diagnóstico seleccionados del grupo que consiste de proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos, moléculas orgánicas, moléculas biológicamente activas inorgánicas, células, tejidos, y agregados de tejido, y agentes para diagnóstico.
19. 19. Un método para producir una composición polimérica capaz de liberar óxido nítrico a un pH fisiológico, el método comprende: polimerizar una solución de macrómeros biocompatibles sobre el tejido, en donde los macrómeros comprenden al menos un portador de NO o región de producción.
20. 20. Un método para tratar un trastorno o condición con NO que comprende administrar a un individuo en necesidad del mismo una composición de macrómero biocompatible, polimeri zable que comprende al menos una región portadora de NO o un compuesto para modulación de NO, en donde el NO o el compuesto para modulación de NO se libera de la composición de macrómero después de la polimerización, bajo condiciones fisiológicas, en donde los macrómeros comprenden regiones seleccionadas del grupo que consiste de regiones solubles en agua, regiones adhesivas de tejido / regiones de grupo extremo polimerizable .
21. 21. El método según la reivindicación 20, en donde el macrómero comprende además regiones degradables .
22. 22. El método según la rei indicación 20, para el tratamiento de un trastorno o condición seleccionados del grupo que consiste de cicatrización de heridas, reestenosis, trombosis, asma, artritis y disfunción eréctil.
23. 23. El método según la reivindicación 20, en donde el macrómero se adhiere al tejido para prevenir lesiones quirúrgicas, adherir tejido, porporcionar soporte para tejido o recubrir el tejido.