DE60117502T2

DE60117502T2 - Photohärtbare Derivate von Hyaluronsäure, Verfahren zu deren Herstellung, vernetztes und photogehärtetes Derivat der Hyaluronsäure und diese enthaltendes medizinisches Material

Info

Publication number: DE60117502T2
Application number: DE60117502T
Authority: DE
Inventors: Kenji Yokohama-shi Miyamoto; Yasuhiro Mitaka-shi Kurahashi; Hiroki Takahagi-shi Kano
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 2000-12-19
Filing date: 2001-12-17
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2021-12-18
Also published as: EP1217008B1; EP1217008A1; US20020143121A1; DE60117502D1; US6602859B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein photohärtbares Hyaluronsäurederivat und ein photogehärtetes vernetztes Hyaluronsäurederivat und ein medizinisches Material, das das photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivat verwendet.
Konventionell gibt es bekannte Techniken für eine Erhöhung der in vivo-Retentionsfähigkeit von Hyaluronsäure, in denen das Hyaluronsäurederivat einer Vernetzungsreaktion unterzogen wird, um seine Bioabbaubarkeit zu kontrollieren (JP-W 3-503704 (1991): die Bezeichnung "JP-W", wie hier verwendet, bedeutet eine "ungeprüfte veröffentlichte japanische internationale Patentanmeldung"). Es wurde bereits ein Verfahren vorgeschlagen, das dazu in der Lage ist, einfach eine Vernetzungsreaktion von Hyaluronsäure durchzuführen und nicht umgesetzte Vernetzungsgruppen einfach zu entfernen, um eine hohe Sicherheit sicherzustellen, indem eine Vernetzungsgruppe (photoreaktive Vernetzungsgruppe) mit einem photoreaktiven Rest (JP-A 6-73102 (1994), JP-A 8-143604 (1996) und JP-A 9-87236 (1997): die Bezeichnung "JP-A", wie hier verwendet, bedeutet eine "ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung") verwendet wurde.
Die US 5,462,976 (korrespondierend zu JP-A 6-73102) beschreibt ein photohärtbares Glycosaminoglycanderivat, das ein Glycosaminoglycan und eine photoreaktive Verbindung umfasst, die kovalent an das Glycosaminoglycan gebunden ist.
Die EP-A-0713859 (korrespondierend zu JP-A 8-143604 und JP-A 9-87236) beschreibt ein Zimtsäurederivat mit einem Abstandshalter, der in die Zimtsäure eingeführt ist, die photodimerisierbar ist, ein Zimtsäurepolymerderivat, erhältlich durch Einführen des Zimtsäurederivats in ein Wirtspolymer wie z.B. Glycosaminoglycan und ein photovernetztes Zimtsäurepolymerderivat, erhältlich, indem das Zimtsäurepolymerderivat einer ultravioletten Strahlung ausgesetzt wird.
Wenn eine photoreaktive Vernetzungsgruppe an Hyaluronsäure gebunden wird, um die Hyaluronsäure in ein photohärtbares Hyaluronsäurederivat umzuwandeln, wird eine Hydroxyl- oder Carboxylgruppe der Hyaluronsäure durch die photoreaktive Vernetzungsgruppe substituiert, so dass eine inhärente hydrophile Eigenschaft der Hyaluronsäure zerstört wird. Die Zerstörung der hydrophilen Eigenschaft der Hyaluronsäure beeinflusst in nachteiliger Weise ihre molekulare Dispersionsfähigkeit in einem wässrigen Lösungsmittel bei Bildung einer wässrigen Lösung. Wenn das photohärtbare Hyaluronsäurederivat zur Verwendung als Arzneimittel oder medizinischer Ausrüstung fotovernetzt wird, wird es bevorzugt, dass eine wässrige Lösung des photohärtbaren Hyaluronsäurederivats vorher durch einen Mikrofilter usw. zur Sterilisierung, Entfernung von Fremdstoffen und ähnlichem gefiltert wird. Zu diesem Zweck ist es notwendig, eine solche wässrige Lösung herzustellen, worin das photohärtbare Hyaluronsäurederivat ausreichend gelöst ist. Daher ist die obige Zerstörung der hydrophilen Eigenschaft, ausgelöst durch Umwandlung in das photohärtbare Hyaluronsäurederivat, nachteilig.
Als Ergebnis der intensiven Studien der vorliegenden Erfinder zur Lösung der obigen Probleme wurde unerwartet festgestellt, dass wenn das photohärtbare Hyaluronsäurederivat mit einer daran gebundenen photoreaktiven Vernetzungsgruppe mit Alkali, wie z.B. Natriumhydrogencarbonat behandelt wird, seine hydrophile Eigenschaft deutlich gestärkt werden kann. Das so alkalibehandelte photohärtbare Hyaluronsäurederivat hat eine stark hydrophile Eigenschaft im Vergleich mit dem unbehandelten und kann daher unerwartete Eigenschaften, wie eine hohe molekulare Dispersionsfähigkeit in einem wässrigen Lösungsmittel bei Bildung einer wässrigen Lösung daraus zeigen. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Basis dieser Feststellung gemacht.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein photohärtbares Hyaluronsäurederivat bereitzustellen, das eine starke hydrophile Eigenschaft zeigen kann und eine verbesserte Filtrierbarkeit seiner wässrigen Lösung.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein photogehärtetes vernetztes Hyaluronsäurederivat bereitzustellen, erzeugt, indem das photohärtbare Hyaluronsäurederivat einer photoreaktiven Vernetzung unterzogen wird und ein medizinisches Material, umfassend das photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivat.
Um diese Ziele zu bewirken, wird in einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein photohärtbares Hyaluronsäurederivat bereitgestellt, umfassend Hyaluronsäure und eine photoreaktive Vernetzungsgruppe, die daran gebunden ist, erhältlich durch Behandlung einer wässrigen Lösung eines Hyaluronsäurederivats mit einer daran gebundenen photoreaktiven Vernetzungsgruppe mit Alkali, wobei eine 1,0 Gew.-%-ige wässrige Lösung des photohärtbaren Hyaluronsäurederivats, erhältlich durch Lösen des photohärtbaren Hyaluronsäurederivats in einem wässrigen Lösungsmittel, durch einen porösen Filter mit einer Porengröße von 0,45 μm und einem Durchmesser von 25 mm mit einer Rate von nicht weniger als 2 ml/min bei 24°C mit einem Druck von 5,0 kg/cm² passieren kann.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein photogehärtetes vernetztes Hyaluronsäurederivat bereitgestellt, erzeugt durch Bestrahlung des photohärtbaren Hyaluronsäurederivats mit ultravioletten Strahlen.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivatlösung bereitgestellt, erzeugt durch Bestrahlung einer wässrigen Lösung des photohärtbaren Hyaluronsäurederivats mit ultravioletter Strahlung, wobei die photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivatlösung eine Konzentration von 1,0 Gew.-% aufweist und dazu in der Lage ist, einen kontinuierlichen Faden mit einer Länge von nicht weniger als 3 cm zu bilden, der ohne Bruch von einem offenen Spitzenende einer Injektionsnadel mit einem Durchmesser von 0,65 mm (23-Gauge) gebildet wird, wenn er aus der Injektionsnadel mit einer Rate von 0,2 ml/Sekunde bei 24°C in einer Richtung 45° abwärts von einer Horizontalrichtung extrudiert wird.
Gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein medizinisches Material bereitgestellt, umfassend das photohärtbare Hyaluronsäurederivat und einen medizinisch akzeptablen Träger.
Gemäß einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein medizinisches Material bereitgestellt, umfassend das photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivat oder die photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivatlösung und einen medizinisch akzeptablen Träger.
Die vorliegende Erfindung wird unten im Detail beschrieben werden.
Zunächst wird das Verfahren zur Erzeugung des photohärtbaren Hyaluronsäurederivats der vorliegenden Erfindung beschrieben.
In der vorliegenden Erfindung kann das photohärtbare Hyaluronsäurederivat durch Behandlung einer wässrigen Lösung eines Hyaluronsäurederivats mit einer daran gebundenen photoreaktiven Vernetzungsgruppe mit Alkali erzeugt werden.
Die hier verwendete Hyaluronsäure ist nicht besonders begrenzt und es können allgemein diejenigen verwendet werden, die von natürlichen Substanzen abstammen, vorzugsweise von Vertebraten oder Mikroorganismen. Die Hyaluronsäure hat ein gewichtsgemitteltes Molekulargewicht von in der Regel 400.000 bis 10.000.000, vorzugsweise 600.000 bis 6.000.000. Die Carboxylgruppe der Hyaluronsäure kann in jeder Form vorliegen, z.B. in Form eines Salzes wie z.B. eines Alkalimetallsalzes oder Erdalkalimetallsalzes. Unter diesen Salzen werden die Natrium- oder Kaliumsalze bevorzugt.
Die photoreaktive Vernetzungsgruppe (d.h. die Vernetzungsgruppe mit einem photoreaktiven Rest) kann an die Position einer Carboxylgruppe oder einer Hydroxylgruppe der Hyaluronsäure gebunden sein, vorzugsweise an die Position einer Carboxylgruppe, da die Einführungsreaktion der photoreaktiven Vernetzungsgruppe in die Carboxylgruppe einfacher durchführbar ist. Die photoreaktive Vernetzungsgruppe kann jeder Rest von Verbindungen sein, der durch Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen eine Photodimerisierungsreaktion oder eine Photopolymerisierungsreaktion durchlaufen kann. Spezifische Beispiele für die Verbindungen, die den oben erwähnten photoreaktiven Rest bilden können, können Zimtsäure beinhalten, substituierte Zimtsäuren, wie z.B. Aminozimtsäure (d.h. eine Zimtsäure, in der irgendwelche der Wasserstoffatome, gebunden an den Benzolring durch eine Aminogruppe substituiert sind), vorzugsweise p-Aminozimtsäure, Acrylsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Sorbinsäure, Coumarin, Thymin oder ähnliche. Unter diesen Verbindungen werden diejenigen Verbindungen mit einer Vinylengruppe bevorzugt, die einen Cyclobutanring durch Bestrahlung mit Licht bilden können und Zimtsäure oder substituierte Zimtsäuren (insbesondere Aminozimtsäure) werden im Hinblick auf Photoreaktivität und Sicherheit besonders bevorzugt. Um außerdem effektiv die Hyaluronsäure an einer nachteiligen Beeinflussung durch den photoreaktiven Rest zu hindern, wird es bevorzugt, dass der photoreaktive Rest an die Hyaluronsäure durch einen Abstandshalter gebunden ist. Daher werden Zimtsäurederivate oder substituierte Zimtsäurederivate mit einer daran gebundenen Abstandshaltergruppe besonders bevorzugt als photoreaktive Vernetzungsgruppe verwendet.
Spezifische Beispiele für die besonders bevorzugten photoreaktiven Vernetzungsgruppen können Aminoalkylcinnamatderivate beinhalten, erhalten durch Esterbindung eines Aminoalkohols, repräsentiert durch die Formel: H₂N-(CH₂)_n-OH oder H₂N-(CH₂-O)_m-CH₂-OH, worin n 1 bis 18 und m 1 bis 9 ist, an die Carboxylgruppe der Zimtsäure (Ph-CH=CH-CO-O-(CH₂)_n-NH₂, Ph-CH=CH-CO-O-(CH₂=O)_m-NH₂, worin n und m wie oben repräsentiert sind, -Ph repräsentiert eine Phenylgruppe); Zimtsäurederivate, an die ein Diamin, repräsentiert durch die Formel: H₂N-(CH₂)₁-NH₂, worin l 1 bis 10 ist oder ein Diol, repräsentiert durch die Formel: HO-(CH₂)_k-OH, worin k 1 bis 10, in die Carboxylgruppe der Zimtsäure eingeführt ist (Ph-CH=CH-CO-NH-(CH₂)_l-NH₂, Ph-CH=CH-CO-O-(CH₂)_k-OH, worin l, k und -Ph wie oben repräsentiert sind); substituierte Zimtsäurederivate, erhalten durch Einführung einer Aminosäure, repräsentiert durch die Formel: HOOC-(CHR)_j-NH₂, worin j 1 bis 10 ist und R eine Seitenkette eines Aminosäurepeptids ist usw. in substituierte Zimtsäuren, wie z.B. Aminozimtsäure (HOOC-CH=CH-Ph-NH-CO-(CH₂)_j-NH₂, HOOC-CH=CH-Ph-NH-(Peptid), worin R und j wie oben repräsentiert sind und -Ph- repräsentiert eine Phenylengruppe oder ähnliche. Unter diesen photoreaktiven Vernetzungsgruppen werden die Aminoalkylcinnamatderivate, erhalten durch Einführung eines Aminoalkohols in die Carboxylgruppe der Zimtsäure besonders bevorzugt. Die Zahl n der obigen Formel, die den Aminoalkohol repräsentiert, ist vorzugsweise 1 bis 18, noch bevorzugter 3 bis 6, besonders bevorzugt 3 bis 4. Insbesondere wenn das Aminoalkylcinnamat als photoreaktive Vernetzungsgruppe verwendet wird, bilden die Aminogruppe des Aminoalkylbestandteils und die Carboxylgruppe der Hyaluronsäure eine Amidbindung, durch die die photoreaktive Vernetzungsgruppe an die Hyaluronsäure gebunden ist.
Als Verfahren zur Erzeugung der Hyaluronsäure mit der daran gebundenen photoreaktiven Vernetzungsgruppe kann beispielhaft ein Verfahren genannt werden, wobei ein wasserlösliches Kondensationsmittel, wie z.B. ein wasserlösliches Carbodiimid, z.B. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid (EDCI·HCl), 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat, 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimid-hydrochlorid und ähnliche verwendet werden; ein Verfahren unter Verwendung eines Hilfskondensationsmittels wie z.B. N-Hydroxysuccinimid (HOSu) und N-Hydroxybenzotriazol (HOBt) zusätzlich zu dem obigen Kondensationsmittel; ein aktives Veresterungsverfahren; ein Säureanhydridverfahren oder ähnliche. Unter diesen Verfahren werden diejenigen bevorzugt, die in Gegenwart eines wässrigen Lösungsmittels durchgeführt werden, d.h. die Verfahren, die das wasserlösliche Kondensationsmittel oder die Kombination eines Reaktionsassistenten und des wasserlöslichen Kondensationsmittels verwenden. Als wässriges Lösungsmittel kann allein Wasser oder ein Mischlösungsmittel verwendet werden, bestehend aus Wasser und einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel wie z.B. Dioxan, Dimethylformamid (DMF), Aceton, Alkohol (z.B. Methanol, Ethanol usw.) und ähnliche.
Währenddessen kann in der vorliegenden Erfindung der Substitutionsgrad der photoreaktiven Vernetzungsgruppe, eingebaut in die Hyaluronsäure (DS), der gemäß dem in den Beispielen unten beschriebenen Verfahren gemessen werden kann, in der Regel 0,3 bis 30 %, vorzugsweise 1 bis 20 %, noch bevorzugter 2 bis 10 % annehmen. Der Substitutionsgrad der photoreaktiven Vernetzungsgruppe kann in geeigneter Weise durch Kontrolle der Molzahl der Hyaluronsäure und der photoreaktiven Vernetzungsgruppe, die miteinander umgesetzt werden, variiert oder eingestellt werden. Das Molekulargewicht des erhaltenen photohärtbaren Hyaluronsäurederivats variiert abhängig von der Einführungsprozentzahl der photoreaktiven Vernetzungsgruppe und liegt in der Regel bei 400.000 bis 10.000.000, vorzugsweise 600.000 bis 6.000.000.
Eine wässrige Lösung des photohärtbaren Hyaluronsäurederivats kann erzeugt werden, indem eine wässrige Lösung des Hyaluronsäurederivats, das daran gebunden die photoreaktive Vernetzungsgruppe aufweist, vorzugsweise eine Reaktionslösung, erhalten nach Einführung der photoreaktiven Vernetzungsgruppe in die Hyaluronsäure mit einem Alkali behandelt wird. Das verwendete Alkali ist nicht besonders begrenzt und kann sich in Form entweder von organischen oder anorganischen Salzen befinden. Unter dem Gesichtspunkt der Behandlung in dem wässrigen Lösungsmittel wird die Verwendung anorganischer Alkalisalze bevorzugt. Unter diesen anorganischen Alkalisalzen sind schwache Alkalisalze wie z.B. Natriumhydrogencarbonat und Natriumcarbanat besser geeignet im Vergleich zu starken Alkalisalzen, wie z.B. Natriumhydroxid, das solche schwachen Alkalisalze einen geringeren Einfluss auf die Umwandlung des photoreaktiven Hyaluronsäurederivats in niedermolekulare Verbindungen oder den Zerfall der Vernetzungsgruppe aufweisen. Hier kann die Alkalibehandlung bei einem pH-Wert von in der Regel 7,2 bis 11, vorzugsweise 7,5 bis 10 durchgeführt werden.
Die Menge des verwendeten Alkalis und die Alkali-Behandlungszeit kann in geeigneter Weise eingestellt werden, abhängig von den beabsichtigten hydrophilen Eigenschaft (d.h. Filtrierbarkeit, wie unten beschrieben). Wenn z.B. Natriumhydrogencarbonat in einer Menge von 500 mg, basierend auf 1 g Hyaluronsäure verwendet wird (d.h. in einer molaren Menge von dem 10-fachen oder mehr der Mol der Hyaluronsäure) kann die Alkalibehandlung für 2 bis 3 Stunden unter Rühren durchgeführt werden, wodurch ein photohärtbares Hyaluronsäurederivat mit ausreichend verbesserter hydrophiler Eigenschaft erhalten werden kann.
Das so hergestellte photohärtbare Hyaluronsäurederivat kann, fall nötig, einer Neutralisierung unter Verwendung einer organischen Säure, wie z.B. Essigsäure oder einer anorganischen Säure unterzogen werden und dann verschiedenen Nachbehandlungen wie Ethanolpräzipitation, einem Waschen mit Ethanol und Trocknen, wodurch es ermöglicht wird, dass das photohärtbare Hyaluronsäurederivat isoliert wird.
Als nächstes wird das photohärtbare Hyaluronsäurederivat mit einer verbesserten hydrophilen Eigenschaft gemäß der vorliegenden Erfindung im Detail unten beschrieben.
Das photohärtbare Hyaluronsäurederivat mit einer verbesserten hydrophilen Eigenschaft gemäß der vorliegenden Erfindung weist dieselbe chemische Struktur auf wie das durch die oben beschriebenen konventionellen Verfahren unter Verwendung einer photoreaktiven Vernetzungsgruppe erhaltene photohärtbare Hyaluronsäurederivat, unterscheidet sich jedoch in der höhergeordneten Struktur (d.h. Stereostruktur) von den konventionellen photohärtbaren Hyaluronsäurederivaten. Dies führt zu unterschiedlichen Eigenschaften zwischen denselben.
Daher kann das photohärtbare Hyaluronsäurederivat der vorliegenden Erfindung von den konventionellen durch seine hohe molekulare Dispersionsfähigkeit in einem wässrigen Lösungsmittel bei Bildung einer wässrigen Lösung davon deutlich unterschieden werden. Genauer gesagt hat das photohärtbare Hyaluronsäurederivat der vorliegenden Erfindung das Merkmal, dass eine 1,0 Gew.-%-ige wässrige Lösung des photohärtbaren Hyaluronsäurederivats, erhalten durch Lösen des festen photohärtbaren Hyaluronsäurederivats in einem wässrigen Lösungsmittel dazu in der Lage ist, durch einen porösen Filter mit einem Porendurchmesser von 0,45 μm und einem Durchmesser von 25 mm mit einer Geschwindigkeit von nicht weniger als 2 ml/Minute bei 24°C unter einem Druck von 5,0 kg/cm² zu laufen. Die hohe Filtrationsfähigkeit der wässrigen Lösung des photohärtbaren Hyaluronsäurederivats zeigt, dass das photohärtbare Hyaluronsäurederivat eine hohe molekulare Dispersionsfähigkeit in einem wässrigen Lösungsmittel bei Bildung seiner wässrigen Lösung aufweist. Die Filtrationsfähigkeit kann bestimmt werden, indem die Konzentration des photohärtbaren Hyaluronsäurederivats in der wässrigen Lösung nach Passage durch den Filter mit der vor Passage durch den Filter verglichen wird. In dem Fall, in dem die wässrige photohärtbare Hyaluronsäurederivatlösung der vorliegenden Erfindung durch den Filter unter den obigen Bedingungen passiert, bleibt die Konzentration des photohärtbaren Hyaluronsäurederivats in der wässrigen Lösung vor und nach Passage durch den Filter unverändert. Das photohärtbare Hyaluronsäurederivat der vorliegenden Erfindung zeigt die folgenden essenziellen Eigenschaften.
Bei den konventionellen Verfahren unter Verwendung einer photoreaktiven Vernetzungsgruppe wird, nachdem die photoreaktive Vernetzungsgruppe in die Hyaluronsäure eingeführt wurde, um das photohärtbare Hyaluronsäurederivat zu erhalten, die resultierende wässrige Reaktionslösung, enthaltend das photohärtbare Hyaluronsäurederivat Nachbehandlungen unterzogen, wie z.B. einer Ethanolpräzipitation, einem Waschen mit Ethanol und einem Trocknen, um dadurch ein festes photohärtbares Hyaluronsäurederivat zu erhalten. Da das feste photohärtbare Hyaluronsäurederivat jedoch eine deutlich niedrigere Wasserlöslichkeit im Vergleich zu derjenigen von roher Hyaluronsäure aufweist, ist es manchmal schwierig, das photohärtbare Hyaluronsäurederivat wieder in dem wässrigen Lösungsmittel zu lösen. In einem solchen Fall kann obwohl der Test für eine Passage durch einen porösen Filter durchgeführt wird, um die molekulare Dispersionsfähigkeit zu bestimmen, das photohärtbare Hyaluronsäurederivat nicht durch den Filter passieren. Andererseits kann das photohärtbare Hyaluronsäurederivat der vorliegenden Erfindung im wesentlichen dieselbe Wasserlöslichkeit wie diejenige von roher Hyaluronsäure zeigen. Daher kann das feste photohärtbare Hyaluronsäurederivat der vorliegenden Erfindung ohne unlöslich zu werden oder Gelierung im dem wässrigen Lösungsmittel gelöst werden.
Das photohärtbare Hyaluronsäurederivat wird als biomedizinisches Material verwendet, z.B. als Antiadhäsionsmaterial (das Adhäsionen während oder nach einer chirurgischen Operation verhindert), raumbesetzendes Material, künstliches Bodyfluidmaterial (künstliche Synovialflüssigkeit, künstliche Tränen und Augentropfen).
Als nächstes wird das photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivat der vorliegenden Erfindung unten beschrieben.
Das photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivat der vorliegenden Erfindung (vernetztes Produkt) kann erzeugt werden, indem das obige photohärtbare Hyaluronsäurederivat der vorliegenden Erfindung mit ultravioletten Strahlen bestrahlt wird.
Da das photohärtbare Hyaluronsäurederivat mit einer verbesserten hydrophilen Eigenschaft der vorliegenden Erfindung im wesentlichen dieselbe Wasserlöslichkeit wie diejenige von roher Hyaluronsäure aufweist, kann das photohärtbare Hyaluronsäurederivat einfach in eine gewünschte Form gegossen oder einfach in einen Behälter wie z.B. eine Spritze gefüllt werden, bei Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen. Wie oben im Hinblick auf die molekulare Dispersionsfähigkeit erklärt, kann das photohärtbare Hyaluronsäurederivat der vorliegenden Erfindung einfach durch den porösen Filter passieren. Daher ist es, indem das photohärtbare Hyaluronsäurederivat einer solchen Filtration vor einer Vernetzungsreaktion durch die ultravioletten Strahlen unterzogen wird, möglich, Fremdstoffe daraus zu entfernen oder das photohärtbare Hyaluronsäurederivat einem Sterilisationsprozess zu unterziehen, wodurch die Produktion eines sauberen photogehärteten vernetzten Hyaluronsäurederivats erleichtert wird.
Die bestrahlten ultravioletten Strahlen können aus denjenigen gewählt werden, die eine Wellenlänge aufweisen, die die photoreaktive Vernetzungsgruppe einer Photoreaktion unterziehen kann, ohne dass die glycosidische Bindung der Hyaluronsäure gespalten wird, z.B. eine Wellenlänge von 200 bis 600 nm. Als bevorzugte Lichtquelle kann eine Hochdruck-Quecksilberlampe oder eine Metallhalogenidlampe verwendet werden. Diese Lichtquellen werden vorzugsweise mit einem Schnittfilter zur Entfernung unnötiger Wellenlängenstrahlen, die daraus emittiert werden, versehen. Als Schnittfilter wird vorzugsweise ein speziell verarbeiteter Filter verwendet, jedoch kann auch ein üblicher Hartglasfilter als Schnittfilter verwendet werden.
Das photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivat der vorliegenden Erfindung kann verschiedene Konfigurationen oder Formen annehmen, abhängig von der Konzentration, der Vernetzungsprozentzahl und ähnlichem. In dem Fall, in dem photoreaktive Reste, wie z.B. Zimtsäure oder substituierte Zimtsäure verwendet werden, die durch die Photoreaktion Dimere bilden können, kann der Vernetzungsprozentsatz des photogehärteten vernetzten Hyaluronsäurederivats durch ein Verhältnis (Prozentsatz) von zweimal den Molen der resultierenden Dimere zu den Molen der in die Hyaluronsäure eingeführten photoreaktiven Vernetzungsgruppe ausgedrückt werden.
Typische Konfigurationen oder Formen des photogehärteten vernetzten Hyaluronsäurederivats können amorphe Formen beinhalten wie z.B. eine Lösung und ein Gel und geformte Formen wie z.B. elastische Körper, z.B. Blätter, Filme, Pellets, Rohre oder ähnliches. Das obige photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivatgel kann einfacher erzeugt werden, indem eine wässrige photohärtbare Hyaluronsäurederivatlösung als Rohmaterial verwendet wird, deren Konzentration auf 1,0 bis 3,0 Gew.-% angehoben ist. Währenddessen können die obigen elastischen Körper durch Bestrahlung des photohärtbaren Hyaluronsäurederivats mit einer Konzentration von so hoch wie 3 bis 10 Gew.-% mit ultravioletten Strahlen erzeugt werden. Genauer gesagt können, wenn die wässrige photohärtbare Hyaluronsäurederivatlösung mit einer solch hohen Konzentration einer Vernetzungsreaktion unterzogen wird, fast feste Produkte, d.h. elastische Körper, enthaltend das wässrige Lösungsmittel, erzeugt werden. Währenddessen wird das Gel allgemein als Polymer und ein angeschwollenes Material davon definiert, die in irgendeinem Lösungsmittel unlöslich sind und eine dreidimensionale Netzwerkstruktur aufweisen und ein solches angeschwollenes Produkt eines solchen Polymers (unter Bezugnahme auf "New-Edition Polymer Dictionary", veröffentlicht von Asakura Shoten, 25. November 1988, Seite 129). In der vorliegenden Beschreibung ist die "Lösung" als solche definiert, die von einer Injektionsnadel mit einem 0,65 mm Durchmesser (23-Gauge) bei 24°C unter einem Druck von 5,0 kg/cm² extrudiert werden kann und das "Gel" ist als solches definiert, das unter den obigen Bedingungen nicht extrudiert werden kann.
Als nächstes wird die photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivatlösung mit einer hohen Fadenformfähigkeit gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben. Hier ist die hohe Fadenformfähigkeit eine Eigenschaft, die nur von der Lösung allein ausgeübt wird und insbesondere bedeutet dies eine Eigenschaft, die dazu führt, dass ein kontinuierlicher Faden mit einer Länge von in der Regel nicht weniger als 3 cm gebildet werden kann, der ohne Bruch von einem offenen Spitzenende einer Injektionsnadel mit einem Durchmesser von 0,65 mm Durchmesser (23-Gauge) gebildet wird, wenn die photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivat-haltige Lösung mit einer Konzentration von 1,0 Gew.-% aus der Injektionsnadel bei 24°C mit einer Geschwindigkeit von 0,2 ml/Sekunde in einer Richtung von 45° nach unten aus Horizontalrichtung extrudiert wird. Es ist bekannt, dass eine Fadenformbarkeit einer Hyaluronsäurelösung auf ihre polymeren Eigenschaften zurückzuführen ist. Die von der photogehärteten vernetzten Hyaluronsäurederivatlösung der vorliegenden Erfindung gezeigte hohe Fadenformbarkeit unterscheidet sich jedoch deutlich von derjenigen einer konventionellen Hyaluronsäurelösung. Die Länge des aus dem offenen Spitzenende der Injektionsnadel gebildeten Fasens ist vorzugsweise nicht weniger als 5 cm, noch bevorzugter nicht weniger als 7 cm. Demgegenüber ist die Länge des gebildeten Fadens im Fall der konventionellen 1,0 Gew.-%-igen Hyaluronsäurelösung weniger als 1 cm.
Die obige hohe Fadenbildungsfähigkeit der photogehärteten vernetzten Hyaluronsäurederivatlösung gemäß der vorliegenden Erfindung kann erhalten werden, indem die Konzentration des Rohmaterials (wässrige photohärtbare Hyaluronsäurederivatlösung) kontrolliert wird und außerdem die Vernetzungsprozentzahl des vernetzten Produkts (photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivatlösung), erhalten durch die ultraviolette Bestrahlung. Die Konzentration der wässrigen photohärtbaren Hyaluronsäurederivatlösung und der Vernetzungsprozentsatz der photogehärteten vernetzten Hyaluronsäurelösung werden auf in der Regel 0,1 bis 1,0 Gew.-% bzw. 3 bis 40 %, vorzugsweise 0,3 bis 1,0 Gew.-% bzw. 4 bis 35 %, besonders bevorzugt 0,3 bis 1,0 Gew.-% bzw. 5 bis 30 % eingestellt.
Das photohärtbare Hyaluronsäurederivat mit einer verbesserten hydrophilen Eigenschaft gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt eine hohe Photovernetzungseffizienz, d.h. es kann mit einem Prozentsatz einfach vernetzt werden, der so hoch liegt wie in der Regel nicht weniger als 10 %, vorzugsweise nicht weniger als 20 %. Wenn daher das photohärtbare Hyaluronsäurederivat in das photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivat in Form einer Lösung, eines Gels oder eines elastischen Körpers umgewandelt wird, können diese Produkte eine hohe Wärmefestigkeit im Vergleich mit üblicher Hyaluronsäure und dem konventionellen photogehärteten vernetzten Hyaluronsäurederivat zeigen. Insbesondere sind das photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivat und seine Lösung gemäß der vorliegenden Erfindung frei von einem Zerfall der Konfiguration oder einer hohen Fadenbildungsfähigkeit, selbst wenn sie einer feuchten Hitzesterilisation bei 121°C für 20 Minuten unterzogen werden, die eine der garantierten Sterilisierungsbedingungen ist, die für Arzneimittel oder medizinische Ausrüstung gefordert werden. Die Wärmefestigkeit neigt dazu höher zu werden, wenn der Vernetzungsprozentsatz des photogehärteten vernetzten Hyaluronsäurederivats ansteigt. Wenn das photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivat einen Vernetzungsprozentsatz von in der Regel 5 bis 70 %, vorzugsweise 10 bis 80 % aufweist, können die erhaltenen Produkte eine hohe Wärmefestigkeit ausüben.
Im allgemeinen hat Hyaluronsäure eine niedrige Wärmefestigkeit und leidet daher an dem Nachteil der Spaltung von glycosidischen Bindungen, wenn sie feuchter Wärmesterilisation bei 121°C unterworfen wird, was zu einer Verminderung ihres Molekulargewichts führt. Die gute Konfiguration und die guten Eigenschaften, die von der hochmolekularen Hyaluronsäure ausgeübt werden, verschlechtern sich oder werden eliminiert, begleitet von einer Verminderung des Molekulargewichts der Hyaluronsäure. Demgegenüber können die gute Konfiguration und die ausgezeichneten Eigenschaften, die von dem photogehärteten vernetzten Hyaluronsäurederivat der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, ohne Verschlechterung oder Eliminierung selbst dann aufrechterhalten bleiben, wenn eine Spaltung glycosidischer Bindungen durch die Wärmebehandlung ausgelöst wird. Insbesondere kann das photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivatgel in einem gelierten Zustand gehalten werden, und zwar selbst nach einer feuchten Wärmesterilisation und das aus dem photogehärteten vernetzten Hyaluronsäurederivat erzeugte Blatt kann selbst nach feuchter Wärmesterilisation in Form eines Blatts bleiben. Es wird angenommen, dass eine solch hohe Wärmefestigkeit des photogehärteten vernetzten Hyaluronsäurederivats im wesentlichen seiner dreidimensionalen Netzwerkstruktur zuzuschreiben ist, die aus intermolekularen Bindungen besteht, wobei es sich nicht um glycosidische Bindungen handelt, gebildet durch die Photovernetzungsreaktion. Das photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivat wird als biomedizinisches Material verwendet, z.B. als Antiadhäsionsmaterial (das Adhäsionen während oder nach chirurgischer Operationen verhindert), als raumfüllendes Material, als künstliches Körperfluidmaterial (künstliche Synovialflüssigkeit, künstliche Tränen und Augentropfen).
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein photohärtbares Hyaluronsäurederivat mit einer verbesserten hydrophilen Eigenschaft bereitgestellt. So kann die vorliegende Erfindung deutlich zu dem Gebiet der medizinischen Materialien unter Verwendung von Hyaluronsäure beitragen.
BEISPIELE
Die Beispiele der vorliegenden Erfindung werden unten als Illustration angeboten.
(1) Filtrierbarkeitstest:
Eine Testprobe wurde hergestellt, indem ihre Konzentration auf 1,0 Gew.-% unter Verwendung von 5 mM phosphatgepufferter physiologischer Salzlösung eingestellt wurde. Die so erhaltene Testprobe wurde dazu gezwungen, durch einen porösen Filter zu passieren, der eine Porengröße von 0,45 μm und einen Durchmesser von 25 mm aufwies und zwar bei 24°C mit einem Druck von 5,0 kg/cm², um eine Menge (ml) der pro Minute filtrierten Testprobe zu messen. Die Bewertung "A" wird Testproben zugeordnet, die eine Filtrationsfähigkeit von nicht weniger als 2 ml/min aufweisen; die Bewertung "B" wird denjenigen zugewiesen, die eine Filtrationsfähigkeit von weniger als 2 ml/min aufwiesen und die Bewertung "C" wird denjenigen zugewiesen, die keine Filtrationsfähigkeit aufweisen.
(2) Konfigurationstest:
Die Testprobe (24°C) wurden in eine 5 ml Spritze mit einer Injektionsnadel mit einem Durchmesser von 0,65 mm (23-Gauge) gefüllt und bei 24°C unter einem Druck von 5,0 kg/cm² durch die Injektionsnadel extrudiert. Extrudierbare Testproben wurden als "Lösungen" klassifiziert und nicht extrudierbare als "Gels".
(3) Schnurbildungstest (Fadenbildungsfähigkeitstest):
Eine Testprobe wurde hergestellt, indem ihre Konzentration auf 1,0 Gew.-% unter Verwendung einer 5 mM phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung eingestellt wurde. Die so hergestellte Testprobe (24°C) wurde in eine 5 ml-Spritze mit einer Injektionsnadel mit einem Durchmesser von 0,65 mm (23-Gauge) gefüllt und bei 24°C mit einer Geschwindigkeit von 0,2 ml/Sekunde in einer Richtung von 45° nach unten aus der Horizontale durch die Injektionsnadel extrudiert, um eine Länge eines gebildeten Fadens aus der Injektionsnadel ohne Bruch zu messen. Testproben, die einen bruchfreien Faden mit einer Länge von nicht weniger als 7 cm bilden konnten, wurden als "++" ausgedrückt; diejenigen, die einen bruchfreien Faden mit einer Länge von 3 cm bis weniger als 7 cm bilden konnten, wurden als "+" ausgedrückt und diejenigen, die einen bruchfreien Faden mit einer Länge von weniger als 3 cm bilden konnten, wurden als "–" ausgedrückt.
(4) Grad der Vernetzungsmittelsubstitution (DS):
Der Grad einer Substitution mit einem Vernetzungsmittel (DS) wird als Prozentsatz der Zahl der photoreaktiven Vernetzungsgruppen ausgedrückt die pro sich wiederholender Disaccharideinheit in eine Hyaluronsäure eingeführt sind. Die benötigte Menge der Hyaluronsäure für die Berechnung des Einführungsprozentsatzes wurde durch ein Carbazolmessverfahren unter Verwendung einer Kalibrierungskurve gemessen. In dem Fall, in dem Zimtsäure oder Aminozimtsäure als photoreaktiver Rest der photoreaktiven Vernetzungsgruppe verwendet wurden, wird die Menge an Zimtsäure oder Aminozimtsäure durch Absorptiometrie (Messwellenlänge: 269 nm) unter Verwendung einer Kalibrierungskurve gemessen.
(5) Vernetzungsprozentsatz:
Der Vernetzungsprozentsatz wurde wie folgt gemessen. Das heißt, 1 g einer Testprobe wurde mit 1 ml einer 1M-Natriumhydroxidlösung verseift. Die erhaltene Lösung wurde angesäuert und dann mit Ethylacetat extrahiert, um Substanzen (Monomere und Dimere) zu erhalten, die von der photoreaktiven Vernetzungsgruppe abgeleitet waren. Die so extrahierten Substanzen wurden durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) analysiert, um eine Menge der Dimere durch ein Kalibrierungskurvenverfahren zu messen. Dann wurde aus dem gemessenen Wert der Prozentsatz der Zahl der Mole der photoreaktiven Vernetzungsgruppe in den Dimeren, basierend auf denen der photoreaktiven Vernetzungsgruppe, eingeführt in die Hyaluronsäure, berechnet.
(6) Viskosität:
Die Viskosität wurde durch den Wert (Pa·s), gemessen bei 25°C unter Bedingungen von 3° × R14 und 1 Upm unter Verwendung eines E-Typ-Rotationsviskometers ausgedrückt.
Beispiel 1:
Amiaozimtsäurederivat-versetzte Hyaluronsäure
400 mg Natriumhyaluronat mit einem gewichtsgemittelten Molekulargewicht von ungefähr 900.000 wurden in 60 ml Wasser gelöst und dann mit 30 ml Dioxan vermischt. Zu der resultierenden Lösung wurden sequenziell 34 mg N-Hydroxysuccinimid; 1 ml Wasser; 29 mg EDCI·HCl; 1 ml Wasser; 51 mg 4-(6-Aminohexanamid)ethylcinnamathydrochlorid, respräsentiert durch die Formel: HCl·H₂N-(CH₂)₅CONH-Ph-CH=CH-COOCH₂CH₃, worin -Ph- eine Phenylengruppe repräsentiert und 1 ml Wasser bei Raumtemperatur vermischt. Die resultierende Mischung wurde 3 Stunden gerührt.
Die erhaltene Mischung wurde weiter mit 1 ml einer 1M wässrigen Natriumhydroxidlösung vermischt, 1 Stunde und 30 Minuten gerührt und dann mit 1,6 ml einer 25 Gew.-%-igen wässrigen Natriumchloridlösung vermischt. Die resultierende Reaktionslösung wurde in 300 ml Ethanol zur Präzipitation eines Feststoffs geladen. Der erhaltene Feststoff wurde sukzessiv zweimal mit 80 %igem (V/V) Ethanol und dann zweimal mit Ethanol gewaschen und über Nacht bei 40°C getrocknet, wodurch 360 mg eines weißen Feststoffs (4-(6-Aminohexanamid)ethylcinnamat-gebundene Hyaluronsäure erhalten wurde: "(4-(6-Aminohexanamid)ethylcinnamat-gebundene Hyaluronsäure" wird hiernach einfach als "Aminozimtsäurederivat-versetzte Hyaluronsäure") als Zielverbindung bezeichnet. Es wurde bestätigt, dass der Grad der Aminozimtsäurederivatsubstitution pro sich wiederholender Disaccharideinheit der Hyaluronsäure (DS) 4,5 % betrug. Die Ergebnisse des Filtrationsfähigkeitstests für die so erhaltene Verbindung sind in Tabelle 1 dargestellt. Währenddessen wurde dasselbe Verfahren wie oben definiert durchgeführt, außer dass die 1M wässrige Natriumhydroxidlösung nicht zugefügt wurde, wodurch eine Aminozimtsäurederivat-versetzte Hyaluronsäure mit einem Grad der Aminozimtsäurederivatsubstitution von 4,5 % erhalten wurde. Die so erhaltene Aminozimtsäurederivat-versetzte Hyaluronsäure wurde als Kontrolle 1 verwendet.
Dann wurde die Aminozimtsäurederivat-versetzte Hyaluronsäure in einer 5 mM phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung so gelöst, dass die Konzentration der erhaltenen Lösung 0,2 bis 2,5 Gew.-% annahm, berechnet als Hyaluronsäure. Weiterhin wurde die resultierende Lösung in ein Pyrex-Glas-Testrohr mit einem Innendurchmesser von 15 mm geladen und separat zwischen ein Paar von Pyrex-Glasplatten zwischengelagert, deren Clearance auf 2 mm eingestellt wurde und wurde dann mit ultravioletten Strahlen 20 Minuten unter Verwendung einer wassergekühlten Ultraviolettbestrahlungsvorrichtung (3kW Metallhalogenidlampe) bestrahlt, um die Konfiguration und die Fadenformbarkeit (für die Lösung) des erhaltenen vernetzten Produkts zu überprüfen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Währenddessen wird die Hyaluronsäure hiernach einfach als "HA" bezeichnet. Tabelle 1
Tabelle 2

Merke *: Gebildete Konfiguration, nachdem die Testprobe, zwischengelagert zwischen ein Paar von Pyrex-Glasplatten, mit ultravioletten Strahlen bestrahlt worden war.

Beispiel 2:
Zimtsäurederivat-versetzte Hyaluronsäure
500 g einer 1 Gew.-%-igen wässrigen Lösung Natriumhyaluronat mit einem gewichtsgemittelten Molekulargewicht von 900.000 wurden mit einer Mischlösung, enthaltend 250 ml Wasser und 375 ml Dioxan unter Rühren vermischt. Zu der resultierenden Lösung wurde sequenziell 860 mg N-Hydroxysuccinimid; 2 ml Wasser (0,6 Äquivalente/HA-Disaccharideinheit (mol/mol)); 717 mg EDCI·HCl; 2 ml Wasser (0,3 Äquivalente/HA-Disaccharideinheit (mol/mol)); 903 mg 3-Aminopropylcinnamathydrochlorid, dargestellt durch die Formel: HCl·H₂N-(CH₂)₃OCO-CH=CH-Ph, worin -Ph eine Phenylgruppe bedeutet und 2 ml Wasser (0,3 Äquivalente/HA-Disaccharideinheit (mol/mol)) bei Raumtemperatur vermischt. Die resultierende Mischung wurde 2 Stunden und 30 Minuten gerührt. Die erhaltene Mischung wurde weiter mit 2,5 g Natriumhydrogencarbonat und 50 ml Wasser vermischt, einen Tag gerührt und dann mit 30 g Natriumchlorid vermischt. 2 Liter Ethanol wurden in die resultierende Reaktionslösung zum Ausfällen des Feststoffs geladen. Der erhaltene Feststoff wurde sukzessive mit 80 % (V/V) Ethanol zweimal und dann mit Ethanol zweimal gewaschen und dann über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet, wodurch 5,24 g eines weißen Feststoffs (3-Aminopropylcinnamat-gebundene Hyaluronsäure: "3-Aminopropylcinnamat-gebundene Hyaluronsäure" wird hiernach einfach als "Zimtsäurederivat-versetzte Hyaluronsäure" bezeichnet) als Zielverbindung erhalten wurde. Es wurde bestätigt, dass der DS des Zimtsäurederivats 8,4 % betrug (siehe Nr. 5 von Tabelle 3). Weiterhin wurde dasselbe Verfahren wie oben definiert durchgeführt, außer dass die äquivalenten Mengen von N-Hydroxysuccinimid (HOSu), EDCI·HCl und Aminopropylcinnamathydrochlorid verändert wurden, wodurch verschiedene Zimtsäurederivat-versetzte Hyaluronsäuren (Nr. 1 bis 4) mit unterschiedlichen Einführungsprozentsätzen voneinander erhalten wurden.
Dann wurden die Zimtsäurederivat-versetzten Hyaluronsäuren Nr. 1 bis 5 jeweils in einer 5 mM phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung gelöst, so dass die Konzentration der erhaltenen jeweiligen Lösungen 1,0 Gew.-%, berechnet als Hyaluronsäure, annahm. Die so erhaltenen jeweiligen Zimtsäurederivat-versetzten Hyaluronsäurelösungen wurden getestet, um ihre Filtrationsfähigkeit zu überprüfen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Außerdem wurde dasselbe Verfahren für die Erzeugung der obigen Verbindungen Nr. 1 bis 5 wie oben definiert durchgeführt, außer dass das Natriumhyaluronat mit einem gewichtsgemittelten Molekulargewicht von ungefähr 900.000 als Rohmaterial und die Mischung aus 2,5 g Natriumhydrogencarbonat und 50 ml Wasser nicht zugefügt wurde, wodurch Zimtsäurederivat-versetzte Hyaluronsäure als Kontrolle erhalten wurde. Diese Kontrollen wurden getestet, um ihre Filtrationsfähigkeit zu überprüfen. Währenddessen zeigte die Hyaluronsäure als Rohmaterial eine Filtrationsfähigkeitsbewertung "A".
Tabelle 3
Tabelle 3 (Fortsetzung)
Wie in Tabelle 3 dargestellt wurde bestätigt, dass die Zimtsäurederivat-versetzte Hyaluronsäure, die nicht mit Alkali (Natriumhydrogencarbonat) behandelt wurde, keine Filtrationsfähigkeit zeigte, während die alkalibehandelte Zimtsäurederivat-versetzte Hyaluronsäure eine hohe Filtrationsfähigkeit und daher eine hohe hydrophile Eigenschaft zeigte.
Währenddessen stieg, wenn der DS des Zimtsäurederivats höher wurde (d.h. die hydrophobe Eigenschaft höher wurde) die Menge an unlöslichen Stoffen in dem wässrigen Lösungsmittel und die erhaltene Lösung wurde stärker opak. Demgegenüber zeigte die Zimtsäurederivat-versetzte Hyaluronsäure der vorliegenden Erfindung eine hohe Filtrationsfähigkeit und eine hohe hydrophile Eigenschaft und daher eine hohe Transparenz.
Beispiel 3:
Verschiedene vernetzte Hyaluronsäurederivate
Dasselbe Verfahren wie definiert in Beispiel 2 wurde durchgeführt, außer dass die 1,0 Gew.-%-ige Mischlösung, enthaltend die Zimtsäurederivat-versetzte Hyaluronsäure und die phosphatgepufferte physiologische Salzlösung mit ultravioletten Strahlen unter Verwendung einer wassergekühlten ultravioletten Bestrahlungsvorrichtung bestrahlt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4
Beispiel 4:
Einfluss von Alkali über den Zeitverlauf
Ein Liter einer 1 Gew.-%-igen wässrigen Lösung Natriumhyaluronat mit einem gewichtsgemittelten Molekulargewicht von 900.000 wurde mit einer Mischlösung vermischt, enthaltend 500 ml Wasser und 750 ml Dioxan unter Rühren. Zu der resultierenden Lösung wurde sukzessiv 1,721 g N-Hydroxysuccinimid; 4 ml Wasser (0,6 Äquivalente/HA-Disaccharideinheit (mol/mol)); 1,433 g EDCI·HCl; 4 ml Wasser (0,3 Äquivalente/HA-Disaccharideinheit (mol/mol)); 1,807 g Aminopropylcinnamathydrochlorid, dargestellt durch die Formel: HCl·H₂N-(CH₂)₃OCO-CH=CH-Ph, worin -Ph eine Phenylgruppe bedeutet und 4 ml Wasser (0,3 Äquivalente/HA-Disaccharideinheit (mol/mol)) bei Raumtemperatur zugemischt. Die resultierende Mischung wurde 2 Stunden und 30 Minuten gerührt.
Die erhaltene Mischung wurde weiter mit 2,0 g Natriumhydrogencarbonat und 40 ml Wasser (0,2 g pro 1 g HA) vermischt. Nach einem Verstreichen von 2, 3, 4, 6, 8 und 20 Stunden nach Zugabe des Natriumhydrogencarbonats wurden 225 ml der Reaktionslösung zu jedem Zeitpunkt genommen. Jede als Probe genommene Lösung wurde mit 6 g Natriumchlorid vermischt und 2 l Ethanol wurden zu der resultierenden Mischung zum Ausfällen einer Zimtsäurederivat-versetzten Hyaluronsäure zugeladen. Das erhaltene Präzipitat wurde sukzessiv mit 80 % (V/V) Ethanol zweimal und dann mit Ethanol zweimal gewaschen und daraufhin über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet, wodurch eine Zimtsäurederivat-versetzte Hyaluronsäure in Form eines weißen Feststoffs erhalten wurde. Weiterhin wurde dasselbe Verfahren wie oben definiert durchgeführt, außer dass kein Natriumhydrogencarbonat zugefügt wurde, wodurch eine Zimtsäurederivat-versetzte Hyaluronsäure als Kontrolle erhalten wurde. Diese Proben wurden zur Überprüfung ihrer Filtrationsfähigkeit getestet.
Dann wurden die obigen jeweiligen Proben in einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung gelöst, so dass die Konzentration der erhaltenen jeweiligen Lösungen 1,5 Gew.-%, berechnet als Hyaluronsäure, annahm. Außerdem wurde dasselbe Verfahren wie oben definiert durchgeführt, außer dass die Menge des Natriumhydrogencarbonats auf 1 g (0,1 g pro 1 g HA) und 5 g (0,5 g pro 1 g HA) verändert wurde, wodurch ähnliche Derivate erhalten wurden. Diese Derivate wurden durch dasselbe Verfahren wie oben definiert gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.
Tabelle 5
Wie in Tabelle 5 dargestellt wurde bestätigt, dass die Zimtsäurederivat-versetzten Hyaluronsäuren, die nicht mit Alkali (Natriumhydrogencarbonat) behandelt wurden, keine Filtrationsfähigkeit zeigten, während die alkalibehandelten Zimtsäurederivat-versetzten Hyaluronsäuren im Hinblick auf Filtrationsfähigkeit drastisch verbessert waren und daher eine hohe hydrophile Eigenschaft zeigten.
Beispiel 5:
Einfluss des Präzipitationsverfahrens auf die Filtrationsfähigkeit
Um zu bestätigen, dass die Filtrationsfähigkeit nicht durch ein Verfahren der Abtrennung des photohärtbaren Hyaluronsäurederivats aus seiner wässrigen Lösung beeinflusst wurde, wurden photohärtbare Hyaluronsäurederivate, erhalten durch unterschiedliche Präzipitationsverfahren, miteinander im Hinblick auf die Filtrationsfähigkeit verglichen.
Genauer gesagt wurde eine Verbindung (A) der vorliegenden Erfindung, abgetrennt durch ein Präzipitationsverfahren unter Verwendung von Ethanol nach Zugabe von Natriumchlorid; eine Verbindung (B) der vorliegenden Erfindung, abgetrennt durch ein Präzipitationsverfahren unter Verwendung einer gesättigten Lösung von Natriumacetat in Ethanol und eine Kontrollverbindung, abgetrennt durch ein Präzipitationsverfahren unter Verwendung einer gesättigten Lösung Natriumacetat in Ethanol, jedoch nicht alkalibehandelt im Hinblick auf ihre Filtrationsfähigkeit überprüft (siehe Tabelle 6). Im Ergebnis wurde bestätigt, dass die Kontrollverbindung, ausgefällt aus der gesättigten Lösung von Natriumacetat in Ethanol ohne die Alkalibehandlung, keine Filtrationsfähigkeit zeigte, d.h. die Filtrationsfähigkeit wurde durch die Art des Präzipitationsverfahrens nicht beeinflusst.
Tabelle 6
Währenddessen wurden die Verbindungen (A) und (B) und die Kontrollverbindung wie folgt hergestellt.
(1) Herstellung der Verbindung (A) der vorliegenden Erfindung:

(i) 2,0 g Natriumhyaluronat mit einem gewichtsgemittelten Molekulargewicht von 1.000.000 wurden in 300 ml destilliertem Wasser gelöst. Nach Zugabe von 150 ml Dioxan zu der resultierenden Lösung wurden 344 mg N-Hydroxysuccinimid (0,6 Äquivalente/HA-Disaccharideinheit (mol/mol)); 286 mg EDCI·HCl (0,3 Äquivalente/HA-Disaccharideinheit (mol/mol)) und 362 mg Aminopropylcinnamathydrochlorid, dargestellt durch die Formel: HCl·H₂N(CH₂)₃OCO-CH=CH-Ph, worin Ph eine Phenylgruppe bedeutet (0,3 Äquivalente/HA-Disaccharideinheit (mol/mol)) sequenziell zugefügt. Die resultierende Mischung wurde 2 Stunden und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
(ii) Dann wurde die erhaltene Mischung weiter mit 1,0 g Natriumhydrogencarbonat vermischt und 3 Stunden gerührt. Die erhaltene Reaktionslösung wurde durch Zugabe von 0,2 ml einer 2,25 M wässrigen Essigsäurelösung dazu neutralisiert.
(iii) Die neutralisierte Lösung wurde mit 12 g Natriumchlorid und dann mit einem Liter Ethanol zur Präzipitation eines photohärtbaren Hyaluronsäurederivats vermischt. Das erhaltene Präzipitat wurde sukzessiv zweimal mit 80 % (V/V) Ethanol und dann zweimal mit Ethanol gewaschen und daraufhin bei reduziertem Druck getrocknet, wodurch die Verbindung (A) der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.

(2) Präparation der Verbindung (B) der vorliegenden Erfindung
Nach Abschluss des Schritts (ii) zur Präparation der Verbindung (A) der vorliegenden Erfindung wurden 100 ml der Reaktionslösung als Probe genommen und in eine gesättigte Essigsäurelösung in Ethanol geladen, wodurch ein photohärtbares Hyaluronsäurederivat ausgefällt wurde. Das erhaltene Präzipitat wurde zweimal mit 80 5 Ethanol und dann zweimal mit Ethanol gewaschen und dann bei reduziertem Druck getrocknet, wodurch die Verbindung (B) der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.
(3) Präparation der Kontrollverbindung:
Nach Abschluss des Schritts (i) zur Präparation der Verbindung (A) der vorliegenden Erfindung wurden 100 ml der Reaktionslösung als Probe genommen und in eine gesättigte Essigsäurelösung in Ethanol gegeben, wodurch ein photohärtbares Hyaluronsäurederivat präzipitiert wurde. Das erhaltene Präzipitat wurde zweimal mit 80 % (V/V) Ethanol und dann zweimal mit Ethanol gewaschen und daraufhin bei reduziertem Druck getrocknet, wodurch die Kontrollverbindung erhalten wurde.
Beispiel 6:
Vernetztes Hyaluronsäuregel nach feuchter Wärmebehandlung
500 g einer 1 Gew.-%-igen wässrigen Lösung Natriumhyaluronat mit einem gewichtsgemittelten Molekulargewicht von 900.000 wurden unter Rühren in eine Mischlösung gemischt, enthaltend 250 ml Wasser und 375 ml Dioxan. Zu der resultierenden Lösung wurde sequenziell 860 mg N-Hydroxysuccinimid; 2 ml Wasser (0,6 Äquivalente/HA-Disaccharideinheit (mol/mol)); 717 mg EDCI·HCl; 2 ml Wasser (0,3 Äquivalente/HA-Disaccharideinheit (mol/mol)); 903 mg Aminopropylcinnamathydrochlorid, dargestellt durch die Formel: HCl·H₂N(CH₂)₃OCO-CH=CH-Ph, worin -Ph eine Phenylgruppe bedeutet und 2 ml Wasser (0,3 Äquivalente/HA-Disaccharideinheit (mol/mol)) bei Raumtemperatur zugemischt. Die resultierende Mischung wurde 2 Stunden und 30 Minuten gerührt.
Dann wurde die erhaltene Mischung weiter mit 2,5 g Natriumhydrogencarbonat und 50 ml Wasser vermischt, einen Tag gerührt und dann mit 0,676 g Essigsäure vermischt und daraufhin mit 30 g Natriumchlorid. 2 Liter Ethanol wurden in die resultierende Reaktionslösung zur Präzipitation eines Feststoffs geladen. Der erhaltene Feststoff wurde sukzessiv mit 80 % (V/V) Ethanol und zwar zweimal und dann zweimal mit Ethanol gewaschen und daraufhin über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet, wodurch 4,93 g eines weißen Feststoffs (Zimtsäurederivat-versetzte Hyaluronsäure) erhalten wurden. Es wurde bestätigt, dass der Prozentsatz des Zimtsäurederivats, eingeführt pro sich wiederholender Disaccharideinheit der Hyaluronsäure 8,8 % betrug.
Dann wurde die erhaltene Zimtsäurederivat-versetzte Hyaluronsäure in einer 5 mM phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung so gelöst, dass die Konzentration der erhaltenen Lösung 1,5 Gew.-% betrug, berechnet als Hyaluronsäure. Daraufhin wurde die resultierende Lösung in eine Glasspritze geladen und mit ultravioletten Strahlen für eine Stunde unter Verwendung einer wassergekühlten Ultraviolettbestrahlungsvorrichtung bestrahlt, wodurch ein Gel mit einem Vernetzungsprozentsatz von 22,2 % und einer Viskosität von 127 Pa·s erhalten wurde. Weiterhin wurde das erhaltene photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivatgel einer feuchten Hitzesterilisation bei 121°C für 20 Minuten unterzogen. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass das sterilisierte Produkt in einem gelierten Zustand verblieb und eine Viskosität von 136 Pa·s hatte. Diese Ergebnisse zeigten, dass das obige photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivatgel im wesentlichen frei von einem Abbau war.
Wie oben diskutiert, wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein photohärtbares Hyaluronsäurederivat mit einer verbesserten hydrophilen Eigenschaft bereitgestellt. So kann die vorliegende Erfindung deutlich zum Gebiet der medizinischen Materialien unter Verwendung von Hyaluronsäure beitragen.

Claims

Photohärtbares Hyaluronsäurederivat, umfassend Hyaluronsäure und eine photoreaktive Vernetzungsgruppe daran gebunden, erhältlich durch Behandlung einer wässrigen Lösung eines Hyaluronsäurederivats mit einer daran gebundenen photoreaktiven Vernetzungsgruppe mit Alkali, wobei eine 1,0 Gew.-%-ige wässrige Lösung des photohärtbaren Hyaluronsäurederivats, erhältlich durch Lösen des photohärtbaren Hyaluronsäurederivats in einem wässrigen Lösungsmittel, durch einen porösen Filter mit einer Porengröße von 0,45 μm und einem Durchmesser von 25 mm mit einer Rate von nicht weniger als 2 ml/min bei 24°C mit einem Druck von 5,0 kg/cm² passieren kann.
Photohärtbares Hyaluronsäurederivat gemäß Anspruch 1, wobei die photoreaktive Vernetzungsgruppe von Zimtsäure ableitbar ist, von substituierter Zimtsäure oder Derivaten davon.
Photohärtbares Hyaluronsäurederivat gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die photoreaktive Vernetzungsgruppe an eine Carboxylgruppe von Hyaluronsäure gebunden ist.
Photohärtbares Hyaluronsäurederivat gemäß Anspruch 3, worin die photoreaktive Vernetzungsgruppe ein Aminoalkylcinnamatrest ist.
Photohärtbares Hyaluronsäurederivat gemäß Anspruch 4, wobei der Aminoalkylcinnamatrest durch die Formel (I) dargestellt wird: Ph-CH=CH-CO-O(CH₂)_n-NH₂ (I)worin n 3 bis 4 bedeutet, -Ph bedeutet eine Phenylgruppe.
Photohärtbares Hyaluronsäurederivat gemäß Anspruch 5, wobei der Aminoalkylcinammatrest an eine Carboxylgruppe der Hyaluronsäure gebunden ist.
Photohärtbares Hyaluronsäurederivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 mit einem gewichtsbezogenen mittleren Molekulargewicht von 400.000 bis 10.000.000.
Photohärtbares Hyaluronsäurederivat gemäß Anspruch 1, wobei es einen Neutralisationsschritt der alkalibehandelten wässrigen Lösung gibt, folgend auf die Behandlung der wässrigen Lösung mit Alkali.
Photogehärtetes vernetztes Hyaluronsäurederivat, erzeugt durch Bestrahlung des photohärtbaren Hyaluronsäurederivats wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 8 mit ultravioletten Strahlen.
Photogehärtetes vernetztes Hyaluronsäurederivat, erzeugt durch Bestrahlung einer wässrigen Lösung, enthaltend das photohärtbare Hyaluronsäurederivat wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 8 in einer Menge von 0,1 bis 10 Gew.-%.
Photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivatlösung, erzeugt durch Bestrahlung einer wässrigen Lösung des photohärtbaren Hyaluronsäurederivats wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 8 mit Ultraviolettstrahlung, wobei die photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivatlösung mit einer Konzentration von 1,0 Gew.-% dazu in der Lage ist einen kontinuierlichen Faden mit einer Länge von nicht weniger als 3 cm zu bilden, der ohne Bruch von einer offenen Endspitze einer (23-Gauge) Injektionsnadel mit einem Durchmesser von 0,65 mm gebildet wird, wenn er von der Injektionsnadel bei 24°C mit einer Rate von 0,2 ml/s in einer Richtung von 45° nach unten aus horizontaler Richtung extrudiert wird.
Medizinisches Material, umfassend das photohärtbare Hyaluronsäurederivat wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 8 und einen medizinisch akzeptablen Träger.
Medizinisches Material, umfassend das photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivat wie definiert in Anspruch 9 oder 10 oder die photogehärtete vernetzte Hyaluronsäurederivatlösung wie definiert in Anspruch 11 und einen medizinisch akzeptablen Träger.