DE60025328T2

DE60025328T2 - Verfahren zur herstellung von mehrfach vernetzten hyaluronsäurederivaten

Info

Publication number: DE60025328T2
Application number: DE60025328T
Authority: DE
Inventors: Fermentech Med. Ltd. Xiaobin ZHAO
Original assignee: Mentor Biopolymers Ltd
Current assignee: Mentor Biopolymers Ltd
Priority date: 1999-02-03
Filing date: 2000-02-03
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2020-02-04
Also published as: DE60025328T3; EP1149116B1; CN1342171A; JP2002536466A; US20090247741A1; CA2361981A1; GB9902412D0; US8080641B2; EP1149116B9; CA2361981C; EP1149116A1; US7514541B2; DK1149116T4; WO2000046253A1; ES2181608T5; DE60025328D1; US20050250939A1; DE1149116T1; US20020091251A1; AU2307500A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure-(HA)Derivaten, insbesondere multiplen, z.B. doppelt-quervernetzten Hyaluronsäure-Derivaten, auf so erhaltene neuartige quervernetzte Derivate, auf Produkte, in welchen sie enthalten sind, sowie ihre Verwendung in kosmetischen, medizinischen und pharmazeutischen Anwendungen.
HA ist ein Mitglied einer Klasse von Polymeren, die als Glykosaminoglykane bekannt sind. HA ist ein langkettiges lineares Polysaccharid und liegt üblicherweise als das Natriumsalz mit der Molekularformel (C₁₄H₂₀NNaO₁₁)_n vor, wobei n abhängig von der Quelle, dem Isolationsverfahren und dem Bestimmungsverfahren variieren kann. Es wurde jedoch von Molekulargewichten von bis zu 14 × 10⁶ berichtet.
HA und ihre Salze können aus vielen Quellen, einschließlich humaner Nabelschnur, Hahnenkämmen und nahezu allen Bindematritzen von Wirbeltierorganismen, isoliert werden. HA ist außerdem eine Kapselkomponente von Bakterien wie Streptokokken, wie von Kendall et al., (1937), Biochem. Biophys. Acta, 279, 401–405 gezeigt wurde; es kann daher auch durch Fermentationsverfahren erhalten werden. Zum Beispiel beschreibt US-Patentschrift Nr. 5,411,874 des vorliegenden Anmelders ein Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure durch kontinuierliche Fermentation von Streptococcus equi.
HA ist nicht immunogen und besitzt daher großes Potential in der Medizin. Aufgrund seiner viskoelastischen Eigenschaften ist HA mit einem hohen Molekulargewicht (über 1 Million) nachweislich in einer Reihe von klinischen Anwendungsgebieten, einschließlich der Wundbehandlung, Ophthalmochirurgie und orthopädischen Chirurgie besonders geeignet. HA ist außerdem in einer Vielzahl von nichtmedizinischen Anwendungsgebieten wie kosmetischen Anwendungen potentiell von Nutzen.
Jedoch ist die Verwendung von HA in einigen dieser Anwendungen durch die Tatsache eingeschränkt, dass HA nach der Verabreichung an den Menschen schnell durch Enzyme wie Hyaluronidasen und durch freie Radikale abgebaut wird. Des Weiteren ist HA bei Raumtemperatur in Wasser löslich, wodurch sie auch für einige Anwendungen weniger geeignet sein kann. Es wurden daher verschiedene Versuche unternommen, stabilere Formen von HA herzustellen, insbesondere durch Quervernetzung der HA-Moleküle.
So beschreibt US-Patentschrift Nr. 4,582,865 (Biomatrix Inc.) die Herstellung von quervernetzten Gelen aus Hyaluronsäure, welche durch Quervernetzung der HA entweder mit sich selbst oder gemischt mit anderen hydrophilen Polymeren mittels Divinylsulfon als Quervernetzungsmittel gebildet werden. Es scheint, dass in diesem Fall die Quervernetzung über die Hydroxylgruppen der HA stattfindet.
US-Patentschrift Nr. 5,550,187 (Collagen Corporation) beschreibt ein Verfahren zur Herstellung quervernetzter Biomaterialzusammensetzungen, welches das Mischen eines biokompatiblem Polymers, bei dem es sich bevorzugt um Kollagen handelt, welcher jedoch auch aus anderen Polymeren, einschließlich Hyaluronsäure, ausgewählt sein kann, mit einem sterilen trockenen Quervernetzungsmittel wie einem synthetischen hydrophilen Polymer, beinhaltet.
US-Patentschrift Nr. 5,578,661 (Nepera Inc.) beschreibt ein Gelbildungssystem zur Verwendung als Wundverband, welcher aus drei Hauptkomponenten gebildet wird, wobei die erste ein wasserlösliches Polymer ist, die zweite ist ein säurehaltiges Polymer und die dritte ist ein Polysaccharid- oder Amino-haltiges Polymer wie Hyaluronsäure. In diesem Fall scheint die Quervernetzung über die Ionenbindung stattzufinden.
US-Patentschrift Nr. 5,644,049 (Italienisches Ministerium für Universitäten, und Wissenschafts- und Technologieforschung) beschreibt ein Biomaterial, welches ein interpenetrierendes Polymernetzwerk (IPN) aufweist, wobei eine der Polymerkomponenten ein saures Polysaccharid wie Hyaluronsäure ist, und die zweite Polymerkomponente kann ein synthetisches chemisches Polymer sein. Die beiden Komponenten können (müssen jedoch nicht notwendigerweise) quervernetzt sein.
Tomihata und Ikada berichten von der Quervernetzung von HA mit Hilfe eines wasserlöslichen Carbodiimids als Quervernetzungsmittel. Es wurde postuliert, dass die Quervernetzung über Estergruppen stattfindet. Die Quervernetzungsreaktion wurde auch in Gegenwart von L-Lysin-Methylester durchgeführt, was zu einer zusätzlichen Quervernetzung über Amidbindungen zu dem Lysin-Ester zu führen schien (J. Biomed. Mater. Res., 37, 243–251, 1997).
US-Patentschrift Nr. 5,800,541 beschreibt Kollagen-synthetische Polymer-Matrizen hergestellt mittels einer Mehrschrittreaktion. Der erste Schritt beinhaltet das Reagieren des Kollagens mit einem synthetischen hydrophilen Polymer; die so entstehende Matrix kann dann in einem zweiten Reaktionsschritt, welcher das Quervernetzen oder Konjugieren der Matrix mit einem synthetischen Polymer, das Koppeln biologisch aktiver Moleküle oder Glykosaminoglykane an die Matrix, das Quervernetzen der Matrix mittels konventioneller chemischer Quervernetzungsmittel oder das Modifizieren des Kollagens in der Matrix mit Hilfe einer chemischen Reaktion beinhalten kann, modifiziert werden. Bei diesem Prozess scheint die ursprüngliche Kollagen-synthetische Polymermatrix über nur eine Bindungsart quervernetzt zu werden, und die zusätzlichen Verfahrensschritte dienen der Einführung weiterer chemischer Substanzen, welche unterschiedliche Bindungsarten bilden können. Es scheint jedoch nicht so, das zwei beliebige der das Produkt bildenden Substanzen durch mehr als eine Bindungsart miteinander verknüpft werden.
Die Internationale Patentanmeldung WO 98/02204 (Hercules Incorporated) betrifft medizinische Hilfsmittel, welche Polymerhydrogele mit verbesserten mechanische Eigenschaften aufweisen. Dies wird bewirkt, indem eine ionisch quervernetzbare Polymerzusammensetzung (bei welcher es sich um HA handeln kann) Quervernetzungsbedingungen ausgesetzt wird, so dass sowohl ionische als auch nicht-ionische Verknüpfungsbedingungen entstehen. Diepoxide oder Glutaraldehyd werden als geeignete Quervernetzungsmittel genannt, da es sich bei ihnen um polyfunktionelle Verbindungen mit zumindest zwei funktionellen Gruppen handelt, welche mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen im Polymer reaktiv sind.
EP 161887 (Seikagaku Kogyo Co. Ltd.) offenbart ein Verfahren zum Quervernetzen von HA durch seine Reaktion mit einer polyfunktionellen Epoxy-Verbindung in einer Alkali-Lösung. Diese quervernetzte HA war Hyaluronidase-resistent und hatte eine wundheilende Wirkung.
Die Internationale Patentanmeldung WO 97/04012 (Agerup) beschreibt Polysaccharid-(welches unter anderem Hyaluronsäure sein kann)Gelzusammensetzungen, welche durch die Bildung wässriger Lösungen des Polysaccharides, das Initiieren der Quervernetzung in Gegenwart eines polyfunktionellen Quervernetzungsmittels, die sterische Verhinderung, dass die Quervernetzungsreaktion beendet wird, bevor Gelierung stattfindet (z.B. durch Verdünnung der Lösung) und dann die Wiedereinführung der sterisch ungehinderten Bedingungen (z.B. durch Evaporieren der Lösung), damit die Quervernetzung zu einem viskoelastischen Gel fortgesetzt wird, hergestellt werden. Es gibt in dieser Anmeldung keinen Hinweis darauf, dass in den zwei Quervernetzungsstufen unterschiedliche Bindungsarten gebildet werden.
Keines der obengenannten Dokumente beschreibt Produkte, in denen Moleküle der HA mittels zweier unterschiedlicher Arten kovalenter Quervernetzungsbindungen miteinander verknüpft werden.
Wir haben nun herausgefunden, dass Hyaluronsäure durch zwei unterschiedliche Arten von Quervernetzungsbindungen quervernetzt werden kann, um eine ,doppelte Quervernetzung' zu bewirken. Die Bildung unterschiedlicher Arten von Bindungen wird durch das Bewirken der Quervernetzung über unterschiedliche funktionelle Gruppen erreicht. Die so gebildeten Bindungen können daher als funktionelle Bindungen beschrieben werden. So kann zum Beispiel eine Bindungsart durch die Quervernetzung über Hydroxylgruppen gebildet werden und eine andere funktionelle Bindung wird durch das Quervernetzen z.B. über Carboxylgruppen gebildet. Es wurde gefunden, dass eine solche multiple Quervernetzung in einem hohen Grad an Quervernetzung mit verbesserter Biostabilität der HA resultiert.
Gemäß einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung daher ein Verfahren zur Herstellung multipler quervernetzter Derivate der Hyaluronsäure bereit, wobei das Verfahren die kovalente Quervernetzung von HA über zwei oder mehr unterschiedliche funktionelle Gruppen aufweist, wobei die Quervernetzung durch das in Kontakt bringen von HA mit einem oder mehreren chemischen Quervernetzungsmitteln bewirkt wird, damit zwei oder mehr chemisch unterschiedliche Quervernetzungen zwischen den HA-Molekülen gebildet werden.
Die Quervernetzung jedes Typs einer funktionellen Gruppe kann durch das in Kontakt bringen der HA mit einem oder mehreren Quervernetzungsmitteln, gleichzeitig oder nacheinander, bewirkt werden, wie im Folgenden detaillierter beschrieben ist.
In dieser Spezifikation bezieht sich ,mehrfach-quervernetzte HA' auf ein Hyaluronsäurederivat, bei dem ein HA-Molekül mittels zwei oder mehr unterschiedlichen Arten der funktionellen Bindung mit einem anderen HA-Molekül quervernetzt ist. Ähnlich bezieht sich ,doppelt-quervernetzte HA' auf ein Hyaluronsäurederivat, bei dem ein HA-Molekül mittels zweier unterschiedlicher Arten der funktionellen Bindung mit einem anderen HA-Molekül quervernetzt ist, und ,einzeln-quervernetzte HA' bezieht sich auf ein Hyaluronsäurederivat, bei dem ein HA-Molekül mittels lediglich einer Art der funktionellen Bindung mit einem anderen HA-Molekül quervernetzt ist.
Die funktionellen Gruppen, welche hauptsächlich für die Quervernetzung von HA-Molekülen verantwortlich sind, sind die Hydroxyl- und Carboxylgruppen. Hydroxylgruppen können über eine Etherbindung und Carboxylgruppen über eine Esterbindung quervernetzt werden. Falls gewünscht kann die HA vor der Quervernetzung chemisch modifiziert werden, um weitere chemisch reaktive Gruppen zu bilden. So kann HA zum Beispiel mit Säure oder Base behandelt werden, so dass sie zumindest einer teilweisen Entacetylierung unterzogen wird, was zum Vorhandensein von freien Aminogruppen führt. Diese Aminogruppen können über eine Amid-(-C(O)-NH-)-; Imino-(-N=CH-)- oder Amin-(-NH-CH-)- Bindung quervernetzt werden. Eine Iminobindung ist ein Vorläufer einer Aminbindung und eine Iminobindung kann in Gegenwart eines Reduktionsmittels in eine Aminbindung umgewandelt werden.
Zu Quervernetzungsmitteln, welche im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, zählen die in der Technik gut bekannten, zum Beispiel Formaldehyd, Glutaraldehyd, Divinylsulfon, ein Polyanhydrid, ein Polyaldehyd, ein mehrwertiger Alkohol, Carbodiimid, Epichlorhydrin, Ethylenglykoldiglycidylether, Butandioldiglycidylether, Polyglycerinpolyglycidylether, Polyethylenglykol, Polypropylenglykoldiglycidylether oder ein Bis- oder Polyepoxy-Quervernetzungsmittel wie 1,2,3,4-Diepoxybutan oder 1,2,7,8-Diepoxyoktan.
Zur Bildung einer Etherbindung wird das Quervernetzungsmittel bevorzugt aus Formaldehyd, Glutaraldehyd, Divinylsulfon und, unter alkalischen Bedingungen, Bis- und Polyepoxiden ausgewählt. Bevorzugt enthält das Quervernetzungsmittel ein hydrophobes Kohlenwasserstoffsegment, z.B. 1,2,3,4-Diepoxybutan, oder am bevorzugtesten 1,2,7,8-Diepoxyoktan.
Zur Bildung einer Esterbindung wird das Quervernetzungsmittel bevorzugt aus mehrwertigen Alkoholen, Carbodiimiden, Polyanhydriden, Carbonsäurechloriden und, unter sauren Bedingungen, Bis- und Polyepoxiden ausgewählt. Bevorzugt enthält das Quervernetzungsmittel ein hydrophobes Kohlenwasserstoffsegment, z.B. 1,2,3,4-Diepoxybutan, oder am bevorzugtesten 1,2,7,8-Diepoxyoktan.
Eine Amidbindung wird bevorzugt mittel eines Quervernetzungsmittels ausgewählt aus Carbodiimiden in der Gegenwart von Aminen, Carbonsäureanhydriden und -chloriden (mit entacetylisierter HA) und Diisocyanaten gebildet.
Eine Aminbindung wird bevorzugt mittel eines Quervernetzungsmittels ausgewählt aus einem Epoxid oder Glutaraldehyd mit einem Reduktionsmittel in der Gegenwart von Aminogruppen in entacetylisierter HA gebildet.
Eine Iminobindung (Schiffsche Base-Bindung) kann mittels Glutaraldehyd in der Gegenwart von Aminogruppen in entacetylisierter HA gebildet werden.
Eine Sulfonbindung wird bevorzugt mittels eines Sulfonylchlorids gebildet.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die unterschiedlichen funktionellen Bindungen nacheinander, in einem Mehrschrittverfahren, gebildet werden, welche entweder mittels eines unterschiedlichen Quervernetzungsmittels für jede Stufe oder durch Verwendung des gleichen Quervernetzungsmittels bei jeder Stufe und das Anpassen der Reaktionsbedingungen zur Steuerung der erforderlichen spezifischen Quervernetzungsreaktion erreicht werden.
Um also eine multiple, z.B. doppelte Quervernetzung in einem schrittweisen Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zu erreichen, wird eine erste Quervernetzungsreaktion durchgeführt, zum Beispiel mit Hilfe eines der unten beschriebenen Verfahren. Ist diese abgeschlossen, oder ist sie soweit wie erforderlich vorangeschritten, wird der Reaktionsmischung ein weiteres Quervernetzungsmittel hinzugefügt, um eine zweite Quervernetzung zu bewir ken. Das weitere Quervernetzungsmittel kann das gleiche oder verschieden wie das erste sein. Wird ein anderes Quervernetzungsmittel eingesetzt, wird es im Allgemeinen so ausgewählt, dass es ohne Veränderung der Reaktionsbedingungen eine andere Art der funktionellen Bindung bildet. Wird jedoch das gleiche Quervernetzungsmittel eingesetzt, um beide Quervernetzungen zu bilden, sollten die Reaktionsbedingungen entsprechend angepasst werden, um eine andere Art der Bindung zu bilden. Der Fachmann wird leicht in der Lage sein, ein geeignetes Quervernetzungsmittel und die angemessenen Reaktionsbedingungen auszuwählen, um die gewünschte Bindung zu bilden.
Um Zweifel zu vermeiden wird vermerkt, dass, wenn das gleiche Quervernetzungsmittel unter den gleichen Reaktionsbedingungen in jedem Schritt verwendet wird, dies nur zu einer Bindungsart führt, d.h. es entsteht nur ein einziges Quervernetzungsprodukt, obwohl es in zwei oder mehr Stufen hergestellt wurde.
Es wird bekannt sein, dass, wenn die zwei oder mehr funktionellen Bindungen gemäß der Erfindung nacheinander gebildet werden, d.h. in einer mehrstufigen Reaktion, die im ersten Schritt der Reaktion gebildete Quervernetzung ausreichend stark sein sollte, um die Reaktionsbedingungen zu überstehen, welche zur Bildung der zweiten oder anschließenden Quervernetzung(en) erforderlich sind. Also sollte die stärkere der beiden (oder mehreren) Bindungen zuerst gebildet werden. Dies wird ohne weiters für den Fachmann offensichtlich sein, und wenn nötig kann es mit Hilfe von Routineexperimenten leicht bestimmt werden.
Wenn also Quervernetzungen über Hydroxyl- und Carboxyl-Gruppen gebildet werden, wird man erkennen, dass die Quervernetzung der ersten Stufe über die Hydroxyl-Gruppen bewirkt werden sollte, um eine Etherbindung zu erzeugen, und die Quervernetzung der zweiten Stufe wird dann über die Carboxyl-Gruppen bewirkt, um eine Esterbindung zu erzeugen.
Eine Etherbindung kann mittels eines Epoxid-Quervernetzungsmittels unter alkalischen Bedingungen, bevorzugt bei einem pH von 10 oder mehr, gebildet werden, oder, vorausgesetzt die HA enthält keine freien Aminogruppen, mittels Glutaraldehyd als Quervernetzungsmittel unter sauren Bedingungen, z.B. pH 4 oder weniger. Eine Esterbindung kann mit einem Epoxid-Quervernetzungsmittel unter sauren Bedingungen, z.B. pH 4 oder weniger, gebildet werden.
So kann zum Beispiel eine erste Quervernetzungsreaktion zur Bildung einer Etherbindung mittels eines Epoxids wie 1,2,7,8-Diepoxyoktan unter alkalischen Bedingungen, bevorzugt bei einem pH von 10 oder mehr, zum Beispiel im Bereich von pH 10 bis pH 12, durchgeführt werden. Eine zweite Quervernetzungsreaktion zur Bildung einer Esterbindung kann anschließend durch den Einsatz des gleichen Quervernetzungsmittels und das Anpassen des pH- Wertes des Reaktionsmediums auf pH 4 oder weniger, zum Beispiel im Bereich von pH 4 bis pH 2, bewirkt werden. Alternativ dazu können unterschiedliche Quervernetzungsmittel in jedem Schritt verwendet werden, wobei es in diesem Fall nicht notwendig sein muss, die Reaktionsbedingungen anzupassen. So kann zum Beispiel eine erste Quervernetzungsreaktion mittels Glutaraldehyd unter sauren Bedingungen zur Bildung einer Etherbindung durchgeführt werden, gefolgt von einer Reaktion mit einem Epoxid-Quervernetzungsmittel auch unter sauren Bedingungen zur Bildung einer Esterbindung.
Das für jede Stufe dieses Verfahrens verwendete Verhältnis von Quervernetzungsmittel zu HA liegt im Allgemeinen im Bereich von 1:10 bis 10:1 nach Gewicht.
Die einzelnen Quervernetzungsreaktionen können gemäß in der Technik allgemein bekannter Verfahren durchgeführt werden.
So kann die als Ausgangsmaterial verwendete HA in Form eines Films oder in Lösung vorliegen.
Wird ein HA-Film eingesetzt, kann dieser zusammen mit einem Quervernetzungsmittel in einem geeigneten Lösemittel suspendiert werden. Das Reaktionsmedium weist vorzugsweise ein organisches Lösemittel wie Aceton, Chloroform oder einen Alkohol, z.B. Ethanol oder Isopropanol, vermischt mit einer wässrigen sauren oder alkalischen Lösung, auf. Eine saure Lösung hat vorzugsweise einen pH-Wert von 4 oder weniger und eine alkalische Lösung hat vorzugsweise einen pH-Wert von 10 oder darüber. Die Quervernetzungsreaktion findet geeigneterweise bei einer Temperatur im Bereich von 15 bis 30°C, z.B. Umgebungstemperatur, statt.
Bevorzugt wird bei Verwendung eines HA-Films als Ausgangsmaterial zuerst eine Etherquervernetzung entweder mit einem Epoxid unter alkalischen Bedingungen, oder, vorausgesetzt es liegen keine freien Aminogruppen vor, mit Glutaraldehyd unter sauren Bedingungen gebildet, gefolgt von der Bildung einer Esterquervernetzung mittels Epoxid unter sauren Bedingungen. Wurde die HA entacetyliert, um freie Aminogruppen bereitzustellen, kann durch Reaktion mit Glutaraldehyd unter sauren Bedingungen eine Schiff-Base mit einer Iminobindung gebildet werden. Eine Iminobindung kann mittels eines Reduktionsmittels in eine Aminbindung umgewandelt werden.
HA kann auch als eine wässrige saure oder alkalische Lösung eingesetzt werden, zu der das Quervernetzungsmittel hinzugefügt wird. Unter sauren Bedingungen liegt der pH-Wert der Ausgangslösung vorzugsweise bei 4 oder darunter, und für eine alkalische Lösung ist der pH-Wert vorzugsweise 10 oder darüber. Die Konzentration der HA liegt geeigneterweise im Bereich zwischen 1 und 10 Gew. %. Die Reaktion kann bei einer Temperatur im Bereich von 15 bis 50°C bewirkt werden. Der Zeitraum zum Abschluss der Quervernetzungsreaktion kann im Allgemeinen von etwa einer Stunde bis hin zu einigen Tagen variieren.
Wird eine HA-Lösung eingesetzt, wird vorzugsweise zuerst eine Etherquervernetzung mit einem Epoxid unter alkalischen Bedingungen gebildet, gefolgt von der Bildung einer Esterquervernetzung mittels eines Epoxids (vorzugsweise das gleiche Epoxid wie im ersten Schritt) unter sauren Bedingungen.
Alternativ dazu kann eine HA-Lösung einer ersten Quervernetzungsreaktion unterzogen werden, das Zwischenprodukt wird zur Bildung eines Films getrocknet, und der Film wird einer weiteren Quervernetzungsreaktion wie oben beschrieben unterzogen, damit ein doppelt-quervernetztes Produkt in Form eines Films entsteht. Um eine doppelt-quervernetzte HA gemäß dieses Verfahrens zu erhalten wird vorzugsweise zuerst eine Etherquervernetzung mit einem Epoxid unter alkalischen Bedingungen gebildet, gefolgt von der Bildung einer Esterquervernetzung mittels eines Epoxids (vorzugsweise das gleiche Epoxid wie im ersten Schritt) unter sauren Bedingungen.
In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung kann die multiple Quervernetzung von HA, insbesondere die doppelte Quervernetzung, in einer Einzelschrittreaktion durch das gleichzeitige in Kontakt bringen der HA mit zwei unterschiedlichen Quervernetzungsmitteln bewirkt werden, welche für das Quervernetzen zweier unterschiedlicher funktioneller Gruppen unter den gleichen Bedingungen geeignet sind. So kann zum Beispiel zur Bildung von sowohl Ether- als auch Estergruppen in einem einzigen Schritt HA mit einer Mischung aus Glutaraldehyd und 1,2,7,8-Diepoxyoktan in Kontakt gebracht werden.
Das für jede Stufe dieses Verfahrens verwendete Verhältnis von Quervernetzungsmittel zu HA liegt im Allgemeinen im Bereich von 1:10 bis 10:1 nach Gewicht.
Die genaue Beschaffenheit des Produktes kann durch die angemessene Auswahl der Reaktionsbedingungen zur Kontrolle des Grades der Quervernetzung variiert werden und somit auch die Eigenschaften des Produktes. Zu Faktoren, welche den Grad der Quervernetzung und somit die Beschaffenheit des Endproduktes beeinflussen, gehören die Form des eingesetzten HA-Ausgangsmaterials, das Zugabeverhältnis des Quervernetzungsmittels zur HA, die Reaktionszeit, die Temperatur und der pH-Wert. Das Produkt kann in Form eines Gels oder Films erzeugt werden; es kann klar oder opak sein. Die Wasserabsorptionskapazität und Biostabilität variieren in Abhängigkeit von der genauen Beschaffenheit des Produktes.
Ein Produkt gemäß der Erfindung kann in Form eines Films oder Blattes durch den Einsatz des HA-Ausgangsmaterials in Form einer Lösung, eines Films oder Blattes und ausführen des Verfahrens ohne Rühren erzeugt werden. Es ist offensichtlich, dass, wenn HA in Form eines Films oder Blattes eingesetzt wird, diese Wasser absorbiert, wenn sie in wässrige Lösung wie PBS-Puffer gegeben wird und sie zur Bildung eines Gels aufquillt. Falls erwünscht kann gegebenenfalls ein Zwischenprodukt in Form eines Films nach dem ersten Quervernetzungsschritt, wie oben beschrieben, gebildet werden. Das Produkt kann in Abhängigkeit vom Grad der stattfindenden Quervernetzung klar oder opak sein.
Hoch-quervernetzte HA-Produkte sind im Allgemeinen opak und können selbst eine weiße Farbe aufweisen.
Ein Produkt gemäß der Erfindung in Form eines Gels erhält man durch Hydrierung eines Films, welcher zum Beispiel wie oben beschrieben hergestellt werden kann. Falls nötig kann der Film in kleine Teile zerteilt werden, um die Absorption von Wasser zu erleichtern.
Um ein Produkt gemäß der Erfindung in Form eines opaken Gels zu erhalten, kann das HA-Ausgangsmaterial in Form einer Lösung, eines Films oder Blattes eingesetzt werden, und das gesamte Verfahren wird mit Rühren und ohne die Bildung eines Films in jedem Stadium durchgeführt.
Welches Quervernetzungsverfahren auch immer verwendet wird, der Abschluss der Reaktion kann routinemäßig mit in der Technik gut bekannten Verfahren geprüft werden, zum Beispiel kann die Reaktion durch Neutralisierung der Reaktionsmischung und Lösemittelpräzipitation beendet werden, um ein Produkt mit dem gewünschten Grad an Quervernetzung zu erhalten.
Das Endprodukt kann durch konventionelle Verfahren aus dem Reaktionsmedium isoliert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen doppelt-quervernetzter HA bereit, wobei das Verfahren das in Kontakt bringen der HA mit einem oder mehreren Quervernetzungsmittel/n unter Bedingungen, welche für die Bildung zweier unterschiedlicher Bindungen zwischen den HA-Molekülen geeignet sind, aufweist. Vorzugsweise werden die Quervernetzungsreaktionen nacheinander bewirkt. Somit weist das zweistufige Verfahren gemäß der Erfindung Folgendes auf:

(a) das Quervernetzen der HA über eine erste funktionelle Gruppe und anschließend
(b) eine weitere Quervernetzung des Produktes aus (a) über eine zweite funktionelle Gruppe, wobei die erste und zweite funktionelle Gruppe unterschiedliche chemische Einheiten darstellen.

Es versteht sich, dass, wenn ein Produkt, das mehr als zwei unterschiedliche Quervernetzungen enthält, erforderlich ist, dies durch eine entsprechende Kombination von sequen tiellen oder gleichzeitigen Quervernetzungsreaktionen wie oben beschrieben hergestellt werden kann.
Quervernetzte HA hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung enthält mindestens zwei unterschiedliche Arten von Quervernetzungsbindungen, zum Beispiel sowohl Ether- als auch Esterbindungen.
Man geht davon aus, dass mehrfach-(z.B. doppelt-)quervernetzte HA-Derivate hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung an sich neuartig sind. So bietet die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt mehrfach-quervernetzte HA (d.h. HA quervernetzt über zwei oder mehr unterschiedliche funktionelle Bindungen), welche durch das oben beschriebene Verfahren erzeugt werden können. Vorzugsweise bietet die Erfindung doppelt-quervernetzte HA, welche durch das oben beschriebene Verfahren erzeugt werden kann.
In einem weiteren Aspekt bietet die vorliegende Erfindung mit sich selbst quervernetzte HA (d.h. zu einem weiteren HA-Molekül), wobei die HA durch mindestens zwei unterschiedliche Arten der Bindung quervernetzt ist. Vorzugsweise ist die HA doppelt-quervernetzte HA.
Doppelt-quervernetzte HA gemäß der vorliegenden Erfindung kann einen Quervernetzungsgrad im Bereich von 10 bis 50 %, z.B. 15 bis 30, vorzugsweise 20 bis 25 % aufweisen (wobei 100 % die Quervernetzung aller OH-Gruppen an der C6-Position und aller COOH-Gruppen an der C5-Position wäre). Der Grad der Quervernetzung kann mit der Elementaranalyse oder Festkörper-NMR-Analyse gemessen werden.
Die Verhältnisse der unterschiedlichen funktionellen Bindungen im Produkt variieren in Abhängigkeit von den vorliegenden Arten der funktionellen Bindungen und den zu ihrer Bildung verwendeten Reaktionsbedingungen. Bei einem doppelt-quervernetzten Produkt, welches Ether- und Ester-Bindungen enthält, kann das Verhältnis dieser Bindungen von 50:50 zu 95:5, z.B. 60:40 zu 80:20 Ether:Esterbindungen variieren.
Im Allgemeinen besitzt ein Produkt gemäß der vorliegenden Erfindung einen höheren Quervernetzungsgrad, sozusagen ein dichteres Netzwerk an Quervernetzungen als dies bei einfach-quervernetzter HA der Fall ist. Es wurde gefunden, dass ein höherer Quervernetzungsgrad die Wasserabsorptionskapazität der quervernetzten HA reduziert, was zu einer höheren Stabilität in wässriger Lösung führt. Außerdem wurde gezeigt, dass doppelt-quervernetzte HA eine höhere Stabilität gegenüber Abbau durch Hyaluronidase sowie gegen Abbau aufgrund von freien Radikalen hat, was auf eine erhöhte Biostabilität hindeutet.
Ein opakes Produkt gemäß der vorliegenden Erfindung weist im Allgemeinen einen höheren Quervernetzungsgrad auf, und daher eine geringere Wasserabsorptionskapazität und höhere Stabilität als ein klares Produkt. Solche Produkte sind für die Langzeitimplantation geeignet.
Ein klares Produkt, z.B. ein durchsichtiger Film gemäß der vorliegenden Erfindung, besitzt eine höhere Wasserabsorptionskapazität als ein opakes Produkt, und solche Produkte sind besonders geeignet für Hautimplantate, Wundheilungs- (Absorption von Exsudat) und resorbierbare Kurzzeitimplantate.
Das oben beschriebene mehrstufige Verfahren wird bevorzugt, wenn ein hoch-quervernetztes Produkt mit geringer Wasserabsorptionskapazität gewünscht wird. Gleichzeitige Quervernetzung resultiert im Allgemeinen in einem wasserunlöslichen Produkt; jedoch mit einer höheren Wasserabsorptionskapazität als ein mittels eines mehrstufigen (z.B. zweistufigen) Verfahrens unter ähnlichen Bedingungen hergestelltes Produkt.
Des Weiteren fand man heraus, dass die Verwendung eines ersten quervernetzten HA-Filmes für den zweiten Quervernetzungsschritt ein Produkt (welches in Form eines Films vorliegt oder in ein Gel umgewandelt werden kann) mit einer geringeren Wasserabsorptionskapazität bereitstellt als unter ähnlichen Quervernetzungsbedingungen doppelt-quervernetzte HA hergestellt aus einer HA-Lösung (d.h. ohne Zwischenfilmbildung). Tatsächlich stellte man fest, dass die Wasserabsorptionskapazität der entstehenden Produkte von 400 % bis zu 1000 % für Film- bzw. Gel-Ausgangsmaterialien variieren kann.
Quervernetzte HA-Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung können in einer Vielzahl pharmazeutischer, medizinischer (einschließlich chirurgischer) und kosmetischer Anwendungen verwendet werden.
So können sie zum Beispiel bei der Unterstützung der Wundheilung, z.B. als ein Hautwundenverband von Nutzen sein.
Sie können auch bei der Verhinderung der Adhäsion von Nutzen sein, z.B. um nach einem chirurgischen Eingriff das Gewebewachstum zwischen Organen zu verhindern.
Quervernetzte HA-Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung können auch im ophthalmischen Bereich zum Einsatz kommen, z.B. als Glaskörperflüssigkeitsersatz, als Hornhautschirm zur Abgabe von Arzneimitteln für das Auge oder als Linsen.
Quervernetzte HA-Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung können auch in der Chirurgie von Nutzen sein, zum Beispiel als solide Implantate für die Vermehrung von hartem Gewebe, z.B. für die Reparatur oder Ersetzung von Knorpeln oder Knochen, oder für die Vermehrung von weichem Gewebe, als Brustimplantate, oder als Beschichtung von Implantaten, welche für den Langzeiteinsatz im Körper gedacht sind, wie Brustimplantate, Katheter, Kanülen, Knochenprothesen, Knorpelersetzungen, Minipumpen oder andere Arzneimittelab gabevorrichtungen, künstliche Organe und Blutgefäße, Netze zur Gewebsverstärkung, usw. Sie können auch als Gelenkschmiermittel zur Behandlung von Arthritis verwendet werden.
Eine weitere Verwendung für die Derivate der vorliegenden Erfindung ist die Abgabe therapeutisch aktiver Wirkstoffe, einschließlich in jeder der obengenannten Anwendungen. Therapeutisch aktive Wirkstoffe können chemotherapeutische Wirkstoffe oder biologisch aktive Faktoren (z.B. Cytokine) sein, und zu ihnen zählen entzündungshemmende Wirkstoffe, Antibiotika, Analgetika, Anästhetika, Wundheilungspromotoren, Zytostatika, Immunstimulanzien, Immunsuppressiva und antivirale Wirkstoffe.
Die therapeutisch aktiven Faktoren können durch in der Technik gut bekannte Verfahren an das quervernetzte HA-Derivat gebunden sein.
Die quervernetzten HA-Derivate können in einer Vielzahl von Formen eingesetzt werden, einschließlich Membranen, Kügelchen, Schwämme, Röhrchen, Blätter und geformte Implantate.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden nichteinschränkenden Beispiele weiter veranschaulicht.
Die folgenden Verfahren wurden zur Messung der Stabilität der Produkte eingesetzt.
Methodik
Bewertung der Wasserabsorptionskapazität
20 mg (Wd) jeder getrockneten quervernetzten Probe wurden für 24 Stunden in PBS-Formulierungspufferlösung getaucht, um vollständig aufgequollenes Gel zu erhalten. Das nasse Gel wurde abfiltriert, und das restliche Wasser an der Oberfläche wurde mit Hilfe von Vliespapier entfernt. Das nasse Gel wurde gewogen, um Ws zu erhalten. Damit kann die Wasserabsorptionskapazität (water absorption capacity – WAC) (%) gemäß der folgenden Formel berechnet werden: WAC(%) = (Ws – Wd)/Wd × 100
Resistenz gegen Hyaluronidaseverdau
20 mg quervernetzte HA wurde in 6 ml PBS-Pufferlösung (pH = 7,2) die 1000 U Hyaluronidase enthält, aufgelöst und für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Danach wurde der Film entfernt und mit PBS-Puffer gespült, und die gesamte Spüllösung wurde gesammelt, um insgesamt 10 ml Lösung zu erhalten. Diese Lösung wurde für 30 Minuten gekocht, um Hyaluronidasepräzipitation zu erzeugen. Die Lösung wurde dann für 10 Minuten bei 4000 U/min. zentrifugiert. Die Überstandslösung wurde in einem Messkolben mittels PBS-Lösung auf 25 ml aufgefüllt. Die HA-Konzentration wurde mittels des Carbazol-Assays gemessen.
Der HA-Gewichtsverlust aufgrund des Hyaluronidaseverdaus kann mittels der folgenden Formel berechnet werden: HA-Gewichtsverlust (%) = [HA] × 25/[HA]o × 100wobei [HA] die Konzentration der HA und [HA]o der ursprüngliche HA-Gehalt (mg) ist.
Resistenz gegen freie Radikale
Ferton-Wirkstoffe werden eingesetzt, um freie Radikale zu erzeugen, welche durch 25 Mikroliter 0,1 Ascorbinsäure und 0,25 Mikroliter 0,1 M H₂O₂ in 5 ml PBS-Lösung gebildet werden. 20 mg getrockneter Probe wurden dieser Lösung zum Verdau hinzugefügt. Die Verdauungszeit ist 24 Stunden bei 37°C. Danach wurde der Film entfernt und mit PBS-Puffer gespült, und die gesamte Spüllösung wurde gesammelt und in einem Messkolben mit PBS-Puffer auf 25 ml aufgefüllt. Die HA-Konzentration wurde mittels des Carbazol-Assays gemessen. Der HA-Gewichtsverlust kann mit der gleichen Formel berechnet werden wie bei dem Hyaluronidaseverdau.
Beispiel 1
Bildung eines doppelt-quervernetzten HA-Films, ausgehend von einem HA-Film
5 ml HA (1 %) wurden für 4 Tage bei Raumtemperatur ausgegossen, um einen HA-Film zu erhalten. Der entstehende Film wurde in einer Mischung aus CHCl₃-Lösemittel/sauerer oder alkalischer Lösung/1,2,7,8-Diepoxyoktan- oder Glutaraldehyd-Quervernetzungsmittel suspendiert. Die Quervernetzungsreaktion wurde für eine feste Zeit (24 h) bei Raumtemperatur bewirkt. Eine weitere Menge Quervernetzungsmittel wurde hinzugefügt, und falls nötig, wurde der pH-Wert angepasst, und die Mischung wurde für weitere 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen lassen, um die zweite Quervernetzungsreaktion zu bewirken. Die detaillierten Quervernetzungsbedingungen sind in Tabelle 1 dargestellt. Nach der Quervernetzung wurden die Proben dreimal mit IPA und Aceton gewaschen, über Nacht in IPA/deionisiertes Wasser (60/40) getaucht und dann mit Aceton gewaschen und in einem 37°C warmen Ofen getrocknet, um ein konstantes Gewicht zu erhalten.
Tabelle 1 Bildung quervernetzter HA (CHA) aus HA-Film

* Zufuhrverhältnis: das Gewichtsverhältnis der HA zum Quervernetzungsmittel
E: = 1,2,7,8-Diepoxyoktan; G: = Glutaraldehyd
H+ steht für einen pH-Wert von etwa 4; OH- steht für einen pH-Wert von etwa 10 CHA-1, CHA-4 und CHA-7 wurden jeweils mittels der gleichen Bedingungen für jeden Quervernetzungsschritt hergestellt, wodurch nur Etherbindungen erzeugt wurden (Einzelquervernetzung).

Beispiel 2
Bildung eines doppelt-quervernetzten HA-Gels aus HA-Lösung
0,1 g HA wurden zur Herstellung von HA-Lösungen mit 10 % oder 2,5 % Konzentration in 0,25 N NaOH-Lösung oder 0,25 N HCl-Lösung aufgelöst. Das Quervernetzungsmittel wurde hinzugefügt und die Mischung mechanischem Rühren unterzogen. Die erste Querver netzungsreaktion wurde für einen Zeitraum von etwa 2 Stunden bei 40°C bewirkt. Eine zweite Quervernetzungsreaktion wurde mittels einer weiteren Menge des gleichen Quervernetzungsmittels bewirkt, unter Anpassung der Reaktionsbedingungen. Die detaillierten Reaktionsbedingungen sind in Tabelle 2 aufgeführt. Nach der Quervernetzung wurde das gebildete Gel mit IPA, Aceton gewaschen und mit IPA/Wasser über Nacht extrahiert und dann dreimal mit IPA bzw. Aceton gewaschen.
Die Proben wurden in einem 37°C warmen Ofen getrocknet, um ein konstantes Gewicht zu erreichen. Man erhielt das Produkt als ein opakes Gel.
Tabelle 2 – Bildung quervernetzter HA (CHA) aus HA-Lösung

E: = 1,2,7,8-Diepoxyoktan
H+ steht für einen pH-Wert von etwa 4; OH- steht für einen pH-Wert von etwa 10

Beispiel 3
Bildung doppelt-quervernetzter HA (CHA) aus HA-Lösung über HA-Film
0,1 g HA wurden zur Herstellung von HA-Lösungen mit 10 % oder 2,5 % Konzentration in 0,25 N NaOH-Lösung oder 0,25 N HCl-Lösung aufgelöst. Das Quervernetzungsmittel wurde hinzugefügt. Die Reaktion wurde mit wenig oder ohne mechanisches/m Rühren in einer Petri-Schale durchgeführt. Die erste Quervernetzungsreaktion wurde für einen Zeitraum von etwa 48 oder etwa 72 Stunden bei Raumtemperatur bewirkt. Das Zwischenprodukt wurde zur Erzeugung eines Films oder Blattes (abhängig von der Dicke) getrocknet. Eine zweite Quervernetzungsreaktion wurde mittels der in Beispiel 1 beschriebenen Methodologie bewirkt. Die detaillierten Reaktionsbedingungen sind in Tabelle 3 unten aufgeführt. Nach der Quervernetzung wurde das Produkt mit IPA und Aceton gewaschen (×3) und mit IPA/Wasser über Nacht extrahiert und dann mit Aceton gewaschen. Die Proben wurden in einem 37°C warmen Ofen getrocknet, um ein konstantes Gewicht zu erreichen, und man erhielt das Produkt in Form eines Films oder Blattes.
Tabelle 3 Bildung quervernetzter HA (CHA) aus HA-Lösung über HA-Film

E: = 1,2,7,8-Diepoxyoktan; E-1: Epichlorhydrin
H+ steht für einen pH-Wert von etwa 4
OH- steht für einen pH-Wert von etwa 10

Tabelle 4 Biostabilität quervernetzter HA gegenüber Hyaluronidase und freien Radikalen
Beispiel 4
0,1 g HA wurden über Nacht in 2 ml 1 N NaOH-Lösung aufgelöst, um eine alkalische 5 % HA-Lösung zu erhalten. Dieser Lösung wurden 0,2 ml 1,2,7,8-Diepoxyoktan zugegeben. Dann wurden während des Rührens für 30 Minuten bei 40°C 0,2 ml Chloroform zugegeben. Nach der Bildung der Ether-Quervernetzung wurden 2,2 ml 1 N HCl zugegeben, um den pH-Wert der Lösung auf zwischen 3–4 zu ändern. Weitere 0,2 ml 1,2,7,8-Diepoxyoktan wurden zugegeben, und während des Rührens für 30 Minuten bei 40°C wurden dann 0,2 ml Chloroform zugegeben. Nach der Ester-Quervernetzung wurde das gebildete Gel mit 20 ml Aceton präzipitiert und gemäß dem gleichen Verfahren gereinigt wie in Beispiel 2 im Detail beschrieben ist.
Beispiel 5
Zu 5 ml HA/NaOH (1 N)-Lösung, wurden 0,5 ml Epichlorhydrin und 0,2 ml Chloroform zugegeben und bei Raumtemperatur für 10 Minuten gemischt. Die Lösung wurde in eine Petrischale gegossen und als ein Film quervernetzter HA (CHA-18) trocknen lassen. Nach der Neutralisierung mit 1 N HCl wurde die CHA-18-Probe in 20 ml Chloroform/wässriger saurer 0,1 N Lösung (3/1 v/v) aufgelöst, und 0,2 ml 1,2,7,8-Diepoxyoktan wurden zugegeben und für 24 Stunden bei Raumtemperatur reagieren lassen. Die entstehende Probe, CHA-19, wurde gemäß dem gleichen Verfahren gereinigt wie in Beispiel 1 im Detail beschrieben ist.
Beispiel 6
20 ml 2,5 % HA/NaOH (1,0 N)-Lösung wurden mit unterschiedlichen Volumen 1,2,7,8-Diepoxyoktan unter Rühren für 5 Minuten gemischt. Die gemischte Lösung wurde dann auf einer 7 cm kollagenfreiem Polystyrol-beschichteten Petrischale mit Deckel verteilt. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wurde der Deckel entfernt und das quervernetzte Gel für 48 Stunden getrocknet. Der getrocknete Film mit kontrollierbarer Stärke wurde mit Aceton/HCl-Lösung neutralisiert und mit Aceton/H₂O, Aceton und IPA gereinigt. Dann wurde das erste quervernetzte Blatt-ähnliche Material in eine Aceton/HCl-Lösung mit pH 5 und 0,4 ml 1,2,7,8-Diepoxyoktan gegeben, für weitere 24 Stunden Quervernetzung bei Raumtemperatur. Das erhaltene Blatt wurde mehrmals mit Aceton/Wasser, Aceton sowie IPA/Wasser, IPA gereinigt.
Das erhaltene doppelt-quervernetzte HA-Blatt ist in Wasser unlöslich, und es wurde festgestellt, dass es das 10-Fache an Wasser aufnimmt, um ein transparentes Gel zu bilden. Es zeigt außerdem eine gute mechanische Festigkeit, was ein wichtiges Merkmal für die Gewebeerzeugung ist.
Festkörper¹³C NMR-Analyse von HA-Proben
Die Festkörper¹³C NMR-Analyse des Hyalurons und der beiden doppelt-quervernetzten Proben wurde mittels eines Advance 200 Spektrometers mit 50 MHz durchgeführt. Die mittels einer Kontaktzeit von 1 ms in der Standardkreuzpolarisations-(CP)Impulssequenz erhaltenen Spektren sind in den 1–3 dargestellt. Ein Spektrum der Probe Nr. 3, welche den internen Standard, Tetrakis(trimethyl)silan (TKS, chemische Verschiebung von 3,2 ppm) enthielt, erhielt man ebenfalls mittels einer Kontaktzeit von 5 ms (4). Die auf TKS verweisenden Peakzuweisungen sind Folgende:

Probe 1 (1) ist reine Hyaluronsäure ohne Modifikation. Die tatsächlichen Formulierungen für Probe 2 und 3 sind in der folgenden Tabelle gezeigt:
Probe 2 (2): hergestellt gemäß des Verfahrens aus Beispiel 3, jedoch ohne die zweite Quervernetzung. Das Zufuhrverhältnis ist die Menge der HA zum 1,2,7,8-Diepoxyoktan. Der gebildete Film wurde für die NMR-Analyse in feine Netze geschnitten.
Probe 3 (3 und 4): hergestellt gemäß des Verfahren aus Beispiel 2 zur Bildung eines Gels, welches für die NMR-Analyse zu einem feinen Pulver zermahlen wurde.

Claims

Verfahren zur Herstellung mehrfach quervernetzter Derivate der Hyaluronsäure (HA), wobei das Verfahren die kovalente Quervernetzung von HA über zwei oder mehr unterschiedliche funktionelle Gruppen enthält, wobei die Quervernetzung durch das Kontaktieren von HA mit einem oder mehreren chemischen Quervernetzungsmitteln bewirkt wird, damit zwei oder mehr chemisch unterschiedliche Quervernetzungen zwischen den HA-Molekülen gebildet werden, und wobei die zwei oder mehr unterschiedlichen Typen von funktionellen Bindungen ausgewählt sind aus Ether-, Ester-, Sufon-, Amin-, Imin- und Amidbindungen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die funktionellen Gruppen aus Hydroxyl-, Carboxyl- und Aminogruppen ausgewählt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Quervernetzungsmittel aus Formaldehyd, Gluteraldehyd, Divinylsulfon, einem Polyanhydrid, einem Polyaldehyd, einem mehrwertigen Alkohol, Carbodiimid, Epichlorhydrin, Ethylenglykoldiglycidylether, Butandioldiglycidylether, Polyglycerinpolyglycidylether, Polyethylenglykol, Polypropylenglykoldiglycidylether oder einem Bis- oder Polyepoxy-Quervernetzungsmittel ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei eine Etherbindung unter Verwendung eines Quervernetzungsmittels ausgewählt aus Bis- und Polyepoxiden unter alkalischen Bedingungen gebildet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei eine Esterbindung unter Verwendung eines Quervernetzungsmittels ausgewählt aus Bis- und Polyepoxiden unter sauren Bedingungen gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei das Quervernetzungsmittel aus 1,2,3,4-Diepoxibutan und 1,2,7,8-Diepoxioktan ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei eine Etherbindung unter Verwendung eines Gluteraldehyd-Quervernetzungsmittels unter sauren Bedingungen gebildet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Quervernetzung jedes Typs einer funktionellen Gruppe nacheinander bewirkt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, welches die Quervernetzung von HA über eine erste funktionelle Gruppe und anschließend weiters die Quervernetzung des Produkts über eine zweite funktionelle Gruppe umfasst, wobei die erste und zweite funktionelle Gruppe unterschiedliche chemische Einheiten sind.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei HA zuerst über die Hydroxylgruppen durch Bildung von Etherbindungen und anschließend über die Carboxylgruppen durch Bildung von Esterbindungen quervernetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Quervernetzung jedes Typs einer funktionellen Gruppe gleichzeitig bewirkt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 wobei die mehrfach querfach-vernetzte HA mit einem oder mehreren chemischen Quervernetzungsmitteln quervernetzt wird, um zwei verschiedene Arten von funktionellen Bindungen zu schaffen.
Verfahren nach Anspruch 12, welches Folgendes aufweist: (a) Quervernetzung von HA über eine erste funktionelle Gruppe und (b) anschließend weitere Quervernetzung des Produkts aus (a) über eine zweite funktionelle Gruppe, wobei die erste und zweite funktionelle Gruppe unterschiedliche chemische Einheiten sind.
mehrfach quervernetzte HA, welche eine mit einem weiteren Molekül HA quervernetzte HA aufweist, wobei die HA-Moleküle durch mindestens zwei unterschiedliche Typen kovalenter Bindung quervernetzt sind, welche ausgewählt ist aus Ether-, Ester-, Sulfon-, Amin-, Imin- und Amidbindung.
Mehrfach quervernetzte HA nach Anspruch 14, in der Form einer Folie.
Mehrfach quervernetzte HA nach Anspruch 14 in der Form eines Gels.
Mehrfach quervernetzte HA nach einem der Ansprüche 14 bis 16, welche eine doppelt-quervernetzte HA ist.
Produkt, welches eine mehrfach quervernetzte HA nach einem der Ansprüche 14 bis 17 aufweist.
Verwendung einer HA nach einem der Ansprüche 14 bis 17 bei der Herstellung eines Produkts für die pharmazeutische, kosmetische oder medizinische Anwendung.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei das Produkt der Abgabe von entzündungshemmenden Mitteln, Antibiotika, Analgetika, Anästhetika, Wundheilungspromotoren, zytostatischen Wirkstoffen, Immunstimulanzien, Immunsuppressoren und antiviralen Mitteln dient.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Produkt der Abgabe von Anästhetika dient.
Verwendung des Produkts gemäß Anspruch 18 als festes Implantat.
Verwendung des Produkts gemäß Anspruch 18 als ein Implantat, das einen Überzug aufweist, der die mehrfach quervernetzte HA enthält.
Verwendung des Produkts gemäß Anspruch 18 als ein verbundenes Gleitmittel.