KR101122163B1

KR101122163B1 - 아토피 피부염에 효과적인 히알루론산 유도체 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101122163B1
Application number: KR1020090117962A
Authority: KR
Inventors: 이동희; 송준식; 정하나; 차상도; 이다예; 김철민; 박종철
Original assignee: (주)셀인바이오
Priority date: 2009-12-01
Filing date: 2009-12-01
Publication date: 2012-03-16
Also published as: US20120283428A1; KR20110061345A; WO2011068303A3; WO2011068303A2

Abstract

아토피 피부염에 효과적인 히알루론산 유도체와 그 제조방법이 개시된다. 본 발명의 히알루론산 유도체와 그 제조방법은 아스코르브산(ascorbic acid)을 염소화(chlorination)하는 제1 단계, 히알루론산(hyaluronic acid)의 TBA(Tetrabutylammonium hydroxide) 염(salt)을 생성하는 제2 단계 및 제1 단계의 염소화된 아스코르브산과 제2 단계의 히알루론산의 TBA 염을 결합(conjugation)하는 제3 단계를 포함한다. 그 히알루론산 유도체는 피부의 병변을 일으키는 원인물질을 효과적으로 줄일 수 있고, 아토피 질환을 완화하는 데 도움을 줄 수 있으며, 피부재생에 효능이 있다.

히알루론산, 히알루론산 유도체, 아스코르브산, TBA

Description

아토피 피부염에 효과적인 히알루론산 유도체 및 그 제조방법{Hyaluronic acid derivative with atopic dermatitis treating effect and method of preparing the same}

본 발명은 히알루론산 유도체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 아토피 피부염 등에 효과적인 히알루론산의 염과 아스코르브산의 결합에 의한 히알루론산 유도체 및 그 제조방법에 관한 것이다.

히알루론산은 아미노산과 우론산으로 이루어지는 복합 다당류의 하나로서, N-아세틸글루코사민과 글루쿠론산이 교대로 사슬형태로 결합하여 이루어지는 분자량이 5000 내지 2000만의 범위에 있는 고분자 화합물이다. 아래에 화학식 1에 히알루론산의 화학구조를 나타내었다.

히알루론산은 눈의 초자체, 탯줄, 닭의 볏 등에 존재하는 물질이다. 히알루론산 염을 비롯한 히알루론산의 각종 유도체들은 수술 후 유착을 방지하는 필름이나 젤로 이용되거나, 주름 개선용 삽입물 등의 각종 성형 보조물 또는 관절염 치료용 삽입물로도 이용되고 있다. 또한, 이와 같은 히알루론산 유도체는 피부질환을 치유하고 피부재생 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 목적은, 피부병변을 일으키는 물질을 효과적으로 감소시켜 피부질환을 완화하고, 손상된 피부를 재생시키며, 특히 아토피 질환에 효능을 발휘할 수 있는 새로운 히알루론산 유도체와 그 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 히알루론산 유도체의 제조방법은 아스코르브산(ascorbic acid)을 염소화(chlorination)하는 제1 단계, 히알루론산(hyaluronic acid)의 TBA(Tetrabutylammonium hydroxide) 염(salt)을 생성하는 제2 단계 및 상기 제1 단계의 염소화된 아스코르브산과 상기 제2 단계의 히알루론산의 TBA 염을 결합(conjugation)하는 제3 단계를 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 제1 단계는 상기 아스코르브산을 아세트산에 용해시키고, 포화된 염화수소 기체와 반응시킴으로써 상기 아스코르브산의 하이드록시기(hydroxy group)가 염소로 치환 되도록 하는 과정 및 상기 아세트산을 일차적으로 제거하고, 물과 아세톤을 이용하여 1회 또는 복수 회 상기 아세트산을 일차적으로 제거한 물질을 용해시킨 후 증발시킴으로써 잔류하는 아세트산을 더 제거하는 과정을 포함할 수 있다.

이때, 상기 아스코르브산의 하이드록시기(hydroxy group)가 염소로 치환 되도록 하는 과정은 10 내지 20시간 동안 지속 되도록 할 수 있고, 상기 아세트산을 더 제거하는 과정을 거친 후, 극성용매를 이용하여 순도가 97 내지 100% 범위에 있도록 1회 또는 복수 회 재결정하는 과정을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 극성용매는 나이트로메탄(nitromethane)으로 할 수 있고, 재결정하는 과정 후에는 아세톤을 이용하여 재결정하는 과정을 더 포함할 수도 있다.

본 발명의 바람직한 다른 실시예에 있어서, 상기 제2 단계는 양이온교환수지에 TBA(Tetrabutylammonium hydroxide) 수용액을 흘림으로써 상기 양이온교환수지의 양이온과 상기 TBA 수용액 속에 해리되어 있는 TBA 이온이 교환되도록 하는 과정 및 상기 TBA 이온으로 교환된 양이온교환수지에 히알루론산의 나트륨염 수용액을 흘림으로써 히알루론산의 나트륨 이온(Na⁺)과 TBA 이온을 교환하는 과정을 포함 할 수 있다. 이때, 상기 양이온교환수지는 약산성 양이온교환수지이고, 상기 이온교환수지에 부착된 양이온은 나트륨 이온(Na⁺)으로 할 수 있다. 또한, 상기 양이온교환수지에 흘리는 TBA 수용액은 30 내지 50%의 농도를 갖도록 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 있어서, 상기 제3 단계는 DMSO(Dimethyl Sulfoxide)에 상기 제1 단계에서 생성된 염소화된 아스코르브산과 상기 제2 단계에서 생성된 히알루론산의 TBA 염을 넣고 저어주면서 히알루론산 유도체를 생성하는 과정, 상기 과정에서의 출발물질인 상기 염소화된 아스코르브산과 상기 히알루론산 TBA 염이 사라지면, DMSO를 제거하는 과정 및 물과 아세톤을 이용하여 상기 히알루론산 유도체의 솔리드(solid)를 형성시켜 필터링(filtering) 하고, 물로 1회 내지 복수 회 씻어 건조하는 과정을 포함할 수 있다.

이때, 상기 DMSO에 염소화된 아스코르브산과 히알루론산 TBA 염을 넣어 히알루론산 유도체를 생성하는 과정은 온도를 서서히 올려 50 내지 90℃의 온도에서 30 내지 70시간 동안 저어주면서 반응하도록 할 수 있다. 또한, 상기 DMSO를 제거하는 과정은 감압하여 증류하는 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위한 히알루론산 유도체는 상기의 제조방법에 의하여 제조되는 물질이다.

본 발명의 히알루론산 유도체는 피부의 병변을 일으키는 원인물질을 효과적으로 줄일 수 있고, 아토피 질환을 완화하는 데 도움을 줄 수 있으며, 피부재생에 효능이 있다.

이하에 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 설명할 것이다. 다음에서 설명되는 실시예들은 여러 가지 다양한 형태로 변형할 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 완전한 설명을 하기 위하여 제공되는 것이다.

먼저, 본 발명의 실시예에 의한 아스코르브산과 결합된 히알루론산 유도체(CIB09001S)의 제조방법과 이에 따른 히알루론산 유도체에 관하여 설명하도록 하고, 히알루론산의 아토피 질환을 비롯한 피부질환에 대한 효능과 피부재생 효능에 관한 실험예들을 살펴보기로 한다.

도 1은 본 발명의 히알루론산 유도체의 제조방법을 나타낸 흐름도이다.

도 1에 의하면, 본 발명의 히알루론산 유도체의 제조방법은 크게 세 단계로 나누어 볼 수 있다. 이때, 제1 단계는 아스코르브산을 염소화(chlorination)하는 단계, 제 2단계는 히알루론산의 테트라부틸암모늄(이하, TBA라 함) 염(salt)을 만드는 단계, 제3 단계는 상기 제1 단계 및 제2 단계에서 제조된 염소화된 아스코르브산과 히알루론산을 결합(conjugation)하여 최종물질인 본 발명의 히알루론산 유도체(CIB09001S)를 얻어 정량하는 단계이다. 아래에서, 각 단계에서의 공정을 상세히 살펴보도록 한다.

제1 단계로는, 먼저 준비된 아스코르브산을 아세트산(acetic acid)에 녹인 후, 염화수소(HCl) 기체를 포화시켜 10시간 내지 20시간 동안, 바람직하게는 약 15 시간 동안 반응시킨다. 이에 따라 아스코르브산의 하이드록시기(-OH)는 염소(Cl)로 치환되어 염소화된다. 상기 아스코르브산의 염소화 반응은 아래의 화학식 2와 같다.

상기 아스코르브산의 염소화 반응 후에는 순도가 높은 염소화된 아스코르브산을 얻는 과정을 거친다. 이를 위하여 용매인 아세트산을 제거하는 과정을 거친다. 먼저, 아세트산을 대략 제거하고, 용매인 아세트산을 물과 아세톤(aceton)을 이용하여 녹이고 날리는 작업을 반복하면서 아세트산을 더 제거하였다. 또한, 나이트로메탄(nitromethane)에 용해시켜 순도가 97%이상이 될 때까지 재결정을 10회 가량 실시하였다. 최종적으로 다시 아세톤을 이용하여 재결정하여 순수한 염소화된 아스코르브산을 얻을 수 있었다. 상기 방법으로 얻은 염소화된 아스코르브산은 NMR(Nuclear Magnetic Resonance)을 이용하여 확인할 수 있다. (S1)

제2 단계는, 먼저 나트륨 이온(Na⁺)을 포함하는 약산성 양이온교환수지(상표명 Amberlite IRC86)를 컬럼(colomn)에 채운다. 다음으로, 30% 내지 50%, 바람직하게는 40% 농도의 TBA 수용액을 준비하여 양이온교환수지에 충분한 양을 흘려주고 물로 수지를 씻어낸다. 여기서, TBA 수용액에 해리되어 있는 TBA이온(TBA⁺)은 양이온교환수지의 나트륨 이온(Na⁺)과 교환될 수 있다. 이에 따라 스웰링(swelling) 현상을 관찰할 수 있다.

다음으로, 상기의 과정을 TBA이온으로 치환된 양이온 수지에 물에 용해된 히알루론산 나트륨염을 흘려준다. 이때, 양이온교환수지에 부착되어 있던 TBA이온은 탈락 되어 히알루론산 나트륨염의 나트륨 이온(Na+)과 교환된다. 따라서 히알루론산의 TBA염이 생성될 수 있다.

상기 히알루론산 TBA염의 생성과정은 아래의 화학식 3과 같다. 여기서, HA-COONa는 히알루론산의 아스코르브산에서 수소이온(H⁺)이 나트륨 이온(Na⁺)으로 치환된 히알루론산 나트륨염을 의미하고, HA-COO^-TBA⁺는 상기 나트륨 이온이 TBA이온으로 치환된 히알루론산의 TBA염을 뜻한다.

제3 단계는 상기 제1 단계에서 만들어진 염소화된 아스코르브산과 제2 단계에서 만들어진 히알루론산의 TBA염을 결합(conjugation)하는 단계로서, 상기 히알루론산의 TBA염과 염소화된 아스코르브산을 디메틸설폰산(DMSO; Dimethyl Sulfoxide)에 넣고 서서히 온도를 올려 50 내지 90℃에서 30 내지 70시간 동안, 바람직하게는 약 80℃에서 48시간 동안 저어주면서 본 발명의 히알루론산 유도체를 생성한다.

여기서, TLC(Thin Layer Chromatography)를 이용하여 출발물질인 상기 히알루론산 TBA염과 염소화된 아스코르브산이 사라진 것이 확인되면, 용매인 DMSO를 감압 증류하여 제거한다. 이후, 물과 아세톤을 이용하여 솔리드(solid)를 형성하고 필터링(filtering)한다.

상기 솔리드는 물로 여러 차례 씻고, 진공건조기(vacuum)에서 건조시킨다. 이로써, 본 발명의 히알루론산 유도체인 CIB09001S가 최종적으로 생성되고 이는 HPLC(고속액체크로마토그래피; High Speed Liquid Chromatogaraphy)를 이용하여 정량할 수 있다.

아래의 화학식 4에서 상기 히알루론산 TBA염과 염소화된 아스코르브산의 결합을 나타내었다.

상기 화학식 4에서의 생성물질인 본 발명의 히알루론산 유도체(CIB09001S)의 화학구조는 아래의 화학식 5에서 상세하게 나타내었다. 여기서, n은 양의 정수이 다.

다음은 본 발명의 히알루론산 유도체(이하, CIB09001S라 칭함)의 효능에 관한 실험예들을 살펴보도록 한다.

<실험예 1>

실험예 1은 CIB09001S의 세포수준에서의 PGE2(프로스타글란딘; prostaglandine E2)생성 억제효과를 알아보는 것이다. 비교 실험군은 아스코르브산(AA) 및 히알루론산과 아스코르브산를 혼합한 물질(HA+AA)을 처리한 것으로 하였다. 여기서, PGE2는 염증, 부종, 통증, 발열 등을 일으키는 원인물질이다.

실험방법은, 먼저 세포를 배양하기 위하여, 배양액 DMEM(Dulbecco`s modified Eagle`s medium)/ FBS(Fetal Bovine Serum)에 대식세포주인 RAW264.7를 5%의 이산화탄소 농도와 37℃ 온도의 공기조건에서 배양하여 1×10⁵(cells/㎖)가 되도록 분주하고, 세포의 안정화를 위하여 16시간 더 배양하여 실험에 적용될 배지를 완성하였다.

상기의 방법으로 완성된 각 배지에 LPS의 양을 최종적으로 500ng/㎖가 되도록 하고, 본 발명의 CIB09001S을 10㎎/㎖의 농도로 처리하고, AA와 HA+AA는 각각 CIB09001S에 포함되는 AA 및 HA와 유사한 농도로 처리하였다. 여기서, LPS(Lipopolysaccharide)는 PGE2의 농도를 증가시키는 물질이다.

이후, 24시간을 배양하여 배양 상층액에서의 PGE2의 양을 조사하였다. 여기서, PGE2 양의 조사는 단백질 검출법인 ELISA(효소면역측정법; Enzyme Linked Immunosorbent Assay)로 하였다.

상기 ELISA를 구체적으로 살펴보면, R&D System사의 키트를 사용하였으며, 100㎕의 배양 상층액과 표준곡선으로 사용할 PEG2와 50㎕의 일차 항체를 제공된 마이크로플레이트에 첨가한 후 실온에서 2시간 방치하였다. 다음으로, 각 웰(well)을 세척하고, 여기에 기질 용액을 첨가하여 30분간 실온에서 방치한 후 발색반응을 ELISA 판독기(reader)로 450nm의 파장에서의 흡광도(OD; Optical Density)를 관찰하였다.

도 2는 상기 실험예 1의 실험결과를 나타낸 그래프이다. 여기서, 각 수치의 유의성 검증 방법은 Student`s t-test로 하였고, P값은 유의확률(P-value)을 의미 한다.

도 2를 참조하여 실험결과를 살펴보면, LPS는 PGE2의 생성을 증가시켰으며, CIB09001S을 처리한 실험군과 AA 및 HA+AA을 처리한 비교 실험군은 대조군과 비교하여 모두 PGE2의 농도를 유의성 있게 감소시켰다. 즉, 상기 실험을 통하여 CIB09001S는 피부 염증, 부종, 통증 등을 완화하는 효능이 있음을 확인할 수 있다.

<실험예 2>

실험예 2는 본 발명의 CIB09001S의 세포수준에서의 TNF-α(Tumor Necrosis Factor α) 생성억제효과를 알아보는 실험이다. 비교 실험군은 상기 실험예와 동일하므로 상세한 설명은 생략하기로 한다. 여기서, TNF-α는 염증성 사이토카인 즉, 제암효과를 가진 생물학적 응답조절물질로서 내재면역에 있어서 중요한 역할을 하며, 염증성 물질의 농도가 높아 지면 그 농도가 함께 증가하는 성질을 갖는다.

실험방법을 살펴보면, 실험에 이용할 세포의 배양방법 및 시료처리방법은 상기 실험예 1과 동일하므로 상세한 설명은 생략하도록 한다. 따라서, CIB09001S, AA, HA+AA의 시료 또한 실험예 1과 동일한 농도로 처리하여, 배양 상층액에서 TNF-α의 양을 ELISA의 방법으로 조사하였다.

상기 ELISA법을 상세히 살펴보면, 먼저 TNF-α에 대한 단일 클론 항체인 항인간 TNF-α 1㎍/㎖를 pH 7.4인 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 희석하여 96-웰 플레이트에 100㎕씩 각각 코팅한 다음, 실온에서 16시간 방치하였다. 다음으로, 상기 플레이트를 0.05%의 트윈(tween)이 포함된 PBS로 세척하고, 1%의 BSA(Bovine Serum Albumin)를 함유한 PBS로 차단하였다. 여러 차례 세척한 후, 배양 상층액과 표준곡선으로 사용할 재조합 TNF-α를 첨가하고 다시 실온에서 2시간 방치하였다.

다시, 각 웰을 세척한 후 2차 항체 바이오틴(biotin)이 결합된 TNF-α를 첨가하고 실온에서 2시간 방치하였다. 이어서, 각 웰을 다시 세척하고, 아비딘(avidine)이 부착된 과산화효소를 첨가하여 실온에서 30분간 방치하였다. 마지막으로, 웰을 세척한 다음, ABTS[2,2‘-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6- sulfonic acid)] 기질을 첨가하고 발색반응을 ELISA 판독기로 405nm의 파장에서의 흡광도(OD)를 측정하였다.

도 3은 상기 실험예 2의 실험결과를 나타낸 그래프이다. 여기서, 각 수치의 검증 방법과 P값의 의미는 도 2에서 설명한 바와 같다.

도 3에 의하여 실험예 2의 실험결과를 살펴보면, CIB09001S를 처리한 실험군은 비교 실험군들과 마찬가지로 대조군과 비교하여 LSP로 유도된 TNF-α의 농도를 감소시켰다. 이 실험을 통하여 CIB09001S는 염증성 물질의 농도를 감소시키는 효능이 있음을 확인할 수 있었다.

<실험예 3>

실험예 3은 본 발명의 CIB09001S의 농도에 따른 세포독성(cytotoxicity)에 관한 실험이다.

실험방법은, 세포독성 및 세포 생존율을 알아보기 위하여 WST-1 분석법을 이용하였다. WST-1분석법이란 살아있는 세포의 미토콘드리아 내에 존재하는 숙신산탈 수소효소(succinate dehydrogenase) 또는 미토콘드리아 탈수소효소(mitochondrial dehydrogenase)에 의해 노란색의 수용성 물질인 테트라졸리움염(tetrazolium salt) WST-1이 포르마잔(formazan) 색소로 변환, 환원되는 원리를 이용하는 것이다.

실험에 이용하는 세포는 세 종류로서, 마우스 대식 세포주 RAW 264.7, 마우스 섬유 아세포 세포주 BALB 3/T3, 마우스 조골 세포주 MC3T3-E1로 하였다. 먼저, 각 세포주를 1×10⁴cells/㎖의 농도로 하여 96-웰 플레이트에 접종하고, 배양액 DMEM/FBS에서 배양하였다.

배양 16시간 후, 상기 배양된 각 세포에 CIB09001S를 0.1, 1, 10, 20㎎/㎖의 농도로 첨가하고, 5%의 이산화탄소 농도와 37℃ 온도의 공기조건에서 24시간 방치하였다. 다음으로, 상등액을 제거하고 다시 PBS를 200㎕씩 가하여 세척하고, 각 웰마다 DMEM 100㎕와 WST-1 용액 10㎕를 첨가하여 4시간 후에 450nm 파장에서의 흡광도(DO)를 측정하였다.

도 4a 내지 도 4c는 상기 실험예 3에 대한 실험 결과에 대한 그래프로서, 도 4a는 RAW 264.7 세포에 대한 실험결과, 도 4b는 BALB 3/T3 세포에 대한 실험결과, 도 4C는 MC3T3-E1 세포에 대한 실험결과를 각각 나타낸다. 여기서, 각 수치의 유의성 검증 방법과 P값의 의미는 도 2에서와 같고, ns(not-significant)는 유의성 없음을 뜻한다.

도 4a 내지 도 4c에 의하여 실험예 3의 결과를 살펴보면, 대조군과 비교하여 볼 때 CIB09001S는 모든 종류의 세포에서 세포독성을 나타내지 않는 것으로 나타났 다. 실험 결과에 따라, 본 발명의 CIB09001S는 의약이나 화장품에 적용 가능성이 있음을 확인할 수 있었다.

<실험예 4>

실험예 4는 본 발명의 CIB09001S의 아토피에 대한 효능을 밝히는 실험이다. 비교 실험군은 히알루론산(hyaluronic acid) 및 하이드로코르티손(hydrocortisone)을 처리한 것으로 하였다.

실험방법은 인 비보(in vivo) 실험으로서, 아토피 유발인자인 DNCB(2,4- dinitrochlorobenzene)로 피부 염증을 유발한 마우스 모델 실험으로 진행하였다. 이때, 마우스 모델은 아토피 병변에 있어서 사람과 유사한 병변을 갖는 것으로서, 5주령, 체중 22 내지 24g인 Nc/Nga 마우스로 하였다.

먼저, 아세톤과 오일을 3:1로 혼합한 물질에 DNCB를 1% 농도로 용해시킨 물질을 준비하고, 실험 40일 전부터 주 3회씩 상기 준비된 물질을 상기 마우스의 양쪽 귀에 각각 10㎕씩 도포하여 아토피 병변을 유발하였다.

이후, 상기 아토피가 유발된 마우스의 양쪽 귀에 CIB09001S를 10㎎/㎖의 농도로 하여 10㎕씩 매일 도포하였다. 비교 실험군으로는 10㎎/㎖ 농도의 히알루론산과 1㎎/㎖ 농도의 하이드로코르티손을 10㎕씩 매일 도포하였다. 이때, DNCB를 처리하는 기간에는 주 3회, CIB09001S를 처리하는 기간에는 매일 마우스의 오른쪽 귀 두께를 측정하였다.

도 5는 실험예 4의 실험결과를 나타낸 그래프이고, 도 6은 실험예 4에 의한 마우스 귀를 나타낸 실물 이미지이다. 이때, (a)는 아토피 병변이 없는 정상상태의 마우스 귀의 상태, (b)는 아토피를 유발시킨 채 아무런 처리를 하지 않은 대조군, (c)는 하이드로코티손을 처리한 비교 실험군, (d)는 히알루론산을 처리한 비교 실험군, (e)는 본 발명의 히알루론산 유도체인 CIB09001S를 처리한 실험군에 관한 것이다.

도 5 및 도 6에 따라 실험결과를 살펴보면, 본 발명의 CIB09001S로 처리한 실험군과 다른 시료로 처리한 비교 실험군은 모두 대조군과 비교하여 볼 때, 통계학적으로 유의하게 귀의 두께를 감소시키는 효과가 나타났다. 실험군과 비교 실험군 들 간에는 아토피에 의한 피부병변의 감소효과에 통계적으로 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다.

<실험예 5>

실험예 5는 본 발명의 CIB09001S의 피부재생효과에 관한 실험이다. 비교 실험군은 같은 농도의 히알루론산(HA)을 처리한 조직 절편으로 하였으며, 인산 버퍼용액인 PBS만을 처리한 조직 절편은 대조군으로 하였다.

실험방법은, 5주령 된 헤어리스(hairless) 마우스의 등 부위에 5㎜ 직경의 생체검사용 펀치를 이용하여 상처를 유발한 후, 10㎎/㎖ 농도의 CIB09001S와 히알루론산을 각각 환부에 10일 동안 처리하면서 피부의 상태를 관찰하였다.

상기 처리 과정이 종료되면, 상기 환부를 중심으로 한 부분을 생체검사하여 10%의 포름알데하이드 용액에 고정한 후, 파라핀에 침지 시켜 자른 조직 절편을 슬 라이드에 붙인다. 다음으로, 상기 조직 절편을 염색하여 피부조직을 현미경으로 관찰하였다. 이때, 염색법은 HE염색법(Haematoxylin-Erosion staining)과 마슨스트리크롬 염색법(Masson`s trichrome staining)을 이용하였다.

또한, 재생된 피부의 콜라겐 합성능을 평가하기 위하여 하이드록시프롤린(hydroxyproline)의 함량을 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 마우스 조직 절편의 표준곡선으로 사용할 하이드록시프롤린을 가수분해하기 위하여 2N의 NaOH 용액에 넣고, 120℃의 온도에서 20분간 오토클레이브(autoclave) 하였다. 다음으로, 450㎕의 클로아민-T(chloamine-T)를 첨가하고, 실온에서 25분간 방치시킨 후, 500㎕의 에를리히의 알데하이드(Ehrlich`s aldehyde)를 첨가하여 65℃의 온도에서 20분간 반응시켜 발색을 유도하였다. 발색이 이루어진 후, 550nm의 파장에서의 흡광도를 측정하였다.

도 7a는 상기 실험예 5에서의 마우스 조직 절편의 현미경 상 이미지를 나타낸 것이고, 도 7b는 상기 실험예 5에서 콜라겐 합성능 평가를 위한 하이드록시프롤린의 함량을 나타낸 그래프이다.

도 7a에 따라 실험결과를 살펴보면, PBS만을 처리한 대조군에 비하여 히알루론산과 CIB09001S로 처리된 실험군에서 대조군에 비하여 피부재생효과가 있는 것으로 나타났으며, 특히 CIB09001S의 처리 실험군에서의 비교 실험군에 비하여 피부재생 효과가 더 좋은 것으로 나타났다.

또한, 도 7b에 의하여 실험결과를 보면, 히알루론산으로 처리한 비교 실험군과 CIB09001S로 처리한 실험군에서 대조군에 비하여 하이드록시프롤린 농도가 높은 것으로 나타났으며, 특히, CIB09001S를 처리한 실험군에서 하이드록시프롤린의 농도가 비교 실험군에 비하여 크게 증가한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본 발명의 히알루론산 유도체인 CIB09001S가 피부재생 즉, 콜라겐 합성에 탁월한 효과를 있음을 입증하는 것이다.

이상, 본 발명의 바람직한 실시예를 들어 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당 분야에 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 변형이 가능하다. 예를 들면, 아스코르브산을 염소화하는 과정에서 용매를 제거하는 방법이나, 히알루론산의 TBA 염의 생성과정에서 양이온교환수지에 부착되어 있는 양이온의 종류는 수소이온(H⁺)이나 암모늄이온(NH⁺)으로 적용하는 등 본 발명의 범주 내에서 다양하게 적용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 의한 히알루론산 유도체(CIB09001S)의 제조방법을 나타낸 흐름도이다.

도 2는 본 발명의 히알루론산 유도체의 세포수준의 PGE2의 감소효과에 대한 실험예 1의 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명의 히알루론산 유도체의 세포수준의 TNF-α의 감소효과 대한 실험예 2의 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4a 내지 도 4c는 본 발명의 히알루론산의 세포독성에 관한 실험예 3의 결과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명의 히알루론산의 아토피 치료효과에 대한 실험예 4의 결과를 나타낸 그래프이다.

도 6은 실험예 4의 결과를 나타내는 마우스 귀의 이미지이다.

도 7a는 본 발명의 히알루론산의 피부재생효과에 대한 실험예 5의 결과를 나타내는 피부조직의 현미경 상 이미지이다.

도 7b는 상기 실험예 5의 결과를 나타낸 그래프이다.

Claims

아스코르브산(ascorbic acid)을 염소화(chlorination)하는 제1 단계;

히알루론산(hyaluronic acid)의 TBA(Tetrabutylammonium hydroxide) 염(salt)을 생성하는 제2 단계; 및

상기 제1 단계의 염소화된 아스코르브산과 상기 제2 단계의 히알루론산의 TBA 염을 결합(conjugation)하는 제3 단계를 포함하는 히알루론산 유도체의 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 제1 단계는,

상기 아스코르브산을 아세트산에 용해시키고, 포화된 염화수소 기체와 반응시킴으로써 상기 아스코르브산의 하이드록시기(hydroxy group)가 염소로 치환 되도록 하는 과정; 및

상기 아세트산을 일차적으로 제거하고, 물과 아세톤을 이용하여 상기 아세트산을 일차적으로 제거한 물질을 용해시킨 후 증발시킴으로써 잔류하는 아세트산을 더 제거하는 과정을 포함하는 히알루론산 유도체의 제조방법.
제2항에 있어서,

상기 상기 아스코르브산의 하이드록시기(hydroxy group)가 염소로 치환 되도 록 하는 과정은,

10 내지 20시간 동안 지속 되도록 하는 히알루론산 유도체의 제조방법.
제2항에 있어서,

상기 제1 단계는,

상기 아세트산을 더 제거하는 과정을 거친 후, 극성용매를 이용하여 순도가 97 내지 100% 범위에 있도록 재결정하는 과정을 더 포함하는 히알루론산 유도체의 제조방법.
제4항에 있어서,

상기 극성용매는 나이트로메탄(nitromethane)으로 하는 히알루론산 유도체의 제조방법.
제4항에 있어서,

상기 제1 단계는,

상기 재결정하는 과정 후에, 아세톤을 이용하여 재결정하는 과정을 더 포함하는 히알루론산 유도체의 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 제2 단계는,

양이온교환수지에 TBA(Tetrabutylammonium hydroxide) 수용액을 흘림으로써 상기 양이온교환수지의 양이온과 상기 TBA 수용액 속에 해리되어 있는 TBA 이온이 교환되도록 하는 과정; 및

상기 TBA 이온으로 교환된 양이온교환수지에 히알루론산의 나트륨염 수용액을 흘림으로써 히알루론산의 나트륨 이온(Na⁺)과 TBA 이온을 교환하는 과정을 포함하는 히알루론산 유도체의 제조방법.
제7항에 있어서,

상기 양이온교환수지는 약산성 양이온교환수지이고, 상기 이온교환수지에 부착된 양이온은 나트륨 이온(Na⁺)으로 하는 히알루론산 유도체의 제조방법.
제7항에 있어서,

상기 양이온교환수지에 흘리는 TBA 수용액은 30 내지 50%의 농도를 갖도록 하는 히알루론산 유도체의 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 제3 단계는,

DMSO(Dimethyl Sulfoxide)에 상기 제1 단계에서 생성된 염소화된 아스코르브산과 상기 제2 단계에서 생성된 히알루론산의 TBA 염을 넣고 저어주면서 히알루론산 유도체를 생성하는 과정;

상기 과정에서의 출발물질인 상기 염소화된 아스코르브산과 상기 히알루론산 TBA 염이 사라지면, DMSO를 제거하는 과정; 및

물과 아세톤을 이용하여 상기 히알루론산 유도체의 솔리드(solid)를 형성시켜 필터링(filtering) 하고, 물로 씻어 건조하는 과정을 포함하는 히알루론산 유도체의 제조방법.
제10항에 있어서,

상기 DMSO에 염소화된 아스코르브산과 히알루론산 TBA 염을 넣어 히알루론산 유도체를 생성하는 과정은,

50 내지 90℃의 온도에서 30 내지 70시간 동안 저어주면서 반응하도록 하는 히알루론산 유도체의 제조방법.
제10항에 있어서,

상기 DMSO를 제거하는 과정은,

감압하여 증류하는 방법을 이용하는 히알루론산 유도체의 제조방법.
제1항 내지 제12항 중에 선택된 어느 한 항의 방법으로 제조되는 하기의 화학 구조를 갖는 히알루론산 유도체.

여기서, n은 1 내지 6020의 정수이다.