KR20090013696A - 가교결합성 히알루론산 유도체 제조방법 및 그 히알루론산유도체의 가교결합물 - Google Patents

가교결합성 히알루론산 유도체 제조방법 및 그 히알루론산유도체의 가교결합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 가교결합성 히알루론산(hyaluronic acid, HA) 유도체 제조방법 및그 히알루론산 유도체의 가교결합물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 물-알코올 혼합용매 중에서 히알루론산 또는 그의 염 또는 유도체를 카르복실기 활성화제의 존재하에 지방족 디카르복실산의 디하이드라자이드 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 히알루론산 유도체 제조방법 및 이에 따라 제조된 히알루론산 유도체의 가교결합물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 히알루론산 유도체의 가교결합물은 겔, 주름살 치료용 삽입물, 성형보조물, 관절염 치료용 삽입물, 약물 전달체 등의 다양한 생체적합성(biocompatibility) 소재로 사용될 수 있다.
가교결합성, 히알루론산, 유도체, 가교결합물, 제조방법

Description

가교결합성 히알루론산 유도체 제조방법 및 그 히알루론산 유도체의 가교결합물{METHOD FOR PREPARING CROSSLINKABLE HYALURONIC ACID DERIVATIVE AND CROSSLINKED PRODUCT OF THE HYALURONIC ACID DERIVATIVE}
본 발명은 가교결합성 히알루론산(hyaluronic acid, 이하, "HA"로 약칭하기도 한다) 유도체 제조방법 및 그 히알루론산 유도체의 가교결합물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 물-알코올 혼합용매 중에서 히알루론산 또는 그의 염 또는 유도체를 카르복실기 활성화제의 존재하에 지방족 디카르복실산의 디하이드라자이드 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 히알루론산 유도체 제조방법 및 이에 따라 제조된 히알루론산 유도체의 가교결합물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 히알루론산 유도체의 가교결합물은 겔, 주름살 치료용 삽입물, 성형보조물, 관절염 치료용 삽입물, 약물 전달체 등의 다양한 생체적합성(biocompatibility) 소재로 사용될 수 있다.
히알루론산 유도체는 주름살 치료용 삽입물, 성형 보조물, 관절염 치료용 삽입물, 약물 전달체 등 여러 가지 용도로 개발되고 있다. 히알루론산은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위(repeating unit)가 선형으로 연결되어 있는 생체 고분자 물질로, 안구의 유리액, 관절의 활액, 닭벼슬 등에 많이 존재한다. 여기서 용어 "히알루론산(HA)"은 히알루론산과 그의 양이온 염을 모두 지칭하는 말이다. 히알루론산 유도체 겔은 그 독특한 유변 물성으로 인하여 여러 응용 분야에서 관심이 집중되고 있다.
디비닐술폰, 비스에폭사이드, 비스할라이드, 포름알데히드 등과 같이 작용기가 두 개인 화합물을 사용하여 가교결합된 불용성 HA 유도체를 합성한 예가 여러 문헌에 보고되었다. 미국특허 제4,582,865호는 HA의 가교를 위해서 디비닐술폰을 사용한 예를 개시하고 있으며, 미국특허 제4,713,448호에는 포름알데히드를 이용하여 가교반응을 수행한 것이 보고되어 있다. 또한, 미국특허 제5,356,883호는 다양한 카르보디이미드를 사용하여 O-아실우레아 또는 N-아실우레아로 카르복실기가 변형된 히알루론산 유도체 겔의 합성 예를 개시하고 있다.
그러나, 이들 특허에서의 방법으로 제조된 히알루론산 가교물은 히알루론산 분해효소에 대한 안정성이 낮으며, 미반응 화학물질의 함량이 높기 때문에 고순도의 생체적합성 물질로 활용하기에는 한계가 있다.
한편, 미국 특허출원공개 제2003/0094719A1호에는 물리적 점탄성이 낮고, 첨가된 가교제의 농도가 높아 활성상태로 반응물에 남아있을 수 있는 히알루론산 가교물의 제조방법이 개시되어 있다. 이 방법은 알칼리 수용액에서 가교제와 히알루론산을 혼합하여 가교반응을 유도하고 있으나, 일반적으로 반응성이 매우 낮다는 단점이 있다.
또한, 미국 특허출원공개 제2006/0105022A1호에는 물성을 향상시키기 위해서 HA를 과량을 사용하고 가교제의 사용비율을 낮추면서 우수한 점탄성을 나타내는 히알루론산 가교물의 제조가 개시되어 있다. 이 방법에서는, 가교제를 많이 첨가하여 가교결합률을 높여서 점탄성의 증대 및 장시간 조직 보정의 증대에 초점을 맞추고 있다. 그러나, 이 경우 고농도로 제조하기가 용이하지 않으며 첨가된 가교제를 정제과정에서 완벽하게 제거하기 어렵다는 문제점을 가지고 있다.
본 발명은 상기한 바와 같은 종래 기술들의 문제점들을 해결하고자 한 것으로서, 히알루론산의 카르복실기에 대한 높은 변형률을 가지는 히알루론산 유도체의 제조방법, 및 이에 따라 얻어진 히알루론산 유도체를 가교시켜 제조되며, 우수한 생체적합성과 높은 점탄성을 갖고 히알루론산 분해효소에 대한 안정성이 우수한 가교결합물을 제공하는 것을 그 기술적 과제로 한다.
한편, 본 발명은, 본 발명에 따른 히알루론산 유도체 가교결합물의 히알루론산 분해효소에 대한 안정성 시험방법, 생체적합성 시험방법 및 주름개선 효과 시험방법을 제공하는 것을 또 다른 기술적 과제로 한다.
상기한 바와 같은 기술적 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 물-알코올 혼합용매 중에서, 히알루론산 또는 그의 염 또는 유도체를 카르복실기 활성화제의 존재하에 하기 화학식 2의 지방족 디카르복실산의 디하이드라자이드 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 하기 화학식 1의 히알루론산 유도체 제조방법을 제공한다:
[화학식 2]
H2N-NH-C(O)-R1-C(O)-NHNH2
[화학식 1]
[HA]-C(O)-NHNH-C(O)-R1-C(O)-NHNH2
상기에서,
[HA]는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염 또는 유도체를 나타내고,
R1은 치환 또는 비치환된 C3-C10 알킬렌기를 나타낸다.
또한, 본 발명은, 하기 화학식 3으로 표시되는, 본 발명에 따라 제조된 히알루론산 유도체의 가교결합물을 제공한다:
[화학식 3]
[HA]-C(O)-NHNH-C(O)-R11-C(O)-NHNH-C(O)-R2-C(O)-NHNH-C(O)-R12-C(O)-NHNH-C(O)-[HA]
상기에서,
[HA]는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염 또는 유도체를 나타내고,
R11 및 R12는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C10 알킬렌기를 나타내며,
R2는 치환 또는 비치환된 C4-C12 알킬렌기를 나타낸다.
또한, 본 발명은, 본 발명에 따라 제조된 히알루론산 유도체들을 하기 화학식 4의 지방족 디카르복실 화합물로 가교결합시키는 단계를 포함하는 하기 화학식 3의 히알루론산 유도체 가교결합물 제조방법을 제공한다:
[화학식 4]
R'O-C(O)-R2-C(O)-OR"
[화학식 3]
[HA]-C(O)-NHNH-C(O)-R11-C(O)-NHNH-C(O)-R2-C(O)-NHNH-C(O)-R12-C(O)-NHNH-C(O)-[HA]
상기에서,
[HA]는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염 또는 유도체를 나타내고,
R11 및 R12는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C10 알킬렌기를 나타내며,
R2는 치환 또는 비치환된 C4-C12 알킬렌기를 나타내고,
R' 및 R"는 각각 독립적으로 수소, 숙신이미딜 또는 설포숙신이미딜를 나타낸다.
또한, 본 발명은, 본 발명에 따른 히알루론산 유도체 가교결합물을 히알루론 산 분해효소로 분해하는 단계; 및 상기 분해의 결과 얻어진 글루쿠룬산을 카르바졸 방법으로 정량분석하는 단계를 포함하는, 히알루론산 유도체 가교결합물의 히알루론산 분해효소에 대한 안정성 시험방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 본 발명에 따른 히알루론산 유도체 가교결합물을 생체 내에 주입하는 단계; 상기 주입된 히알루론산 유도체 가교결합물을 상기 생체로부터 회수하는 단계; 및 상기 회수된 히알루론산 유도체 가교결합물을 헤마토자일린-이오신(hematoxylin-eosin) 및 알시안 블루(alcian blue)를 사용하여 염색하는 단계를 포함하는, 히알루론산 유도체 가교결합물의 생체적합성 시험방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 생체 표피에 인위적으로 주름을 유발하는 단계; 본 발명에 따른 히알루론산 유도체 가교결합물을 생체 피하층에 주입하는 단계; 및 주름 개선 면적을 계산하는 단계를 포함하는 히알루론산 유도체 가교결합물의 주름개선 효과를 확인하는 시험방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 하기 화학식 5의 히알루론산 유도체를 제공한다:
[화학식 5]
[HA]-C(O)-NH-R3-NH2
상기에서,
[HA]는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염 또는 유도체를 나타내고,
R3은 치환 또는 비치환된 C3-C10 알킬렌기를 나타낸다.
또한, 본 발명은, 카르복실기 활성화제 및 반응 보조제의 존재하에 하기 화학식 5의 히알루론산 유도체를 가교시키는 것을 특징으로 하는, 가교된 히알루론산 유도체 제조방법을 제공한다:
[화학식 5]
[HA]-C(O)-NH-R3-NH2
상기에서,
[HA]는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염 또는 유도체를 나타내고,
R3은 치환 또는 비치환된 C3-C10 알킬렌기를 나타낸다.
또한, 본 발명은, 카르복실기 활성화제 및 반응 보조제의 존재하에 히알루론산 또는 그의 염 또는 유도체를 하기 화학식 6의 디아민 화합물로 가교시키는 것을 특징으로 하는, 가교된 히알루론산 유도체 제조방법을 제공한다:
[화학식 6]
H2N-R3-NH2
상기에서,
R3은 치환 또는 비치환된 C3-C10 알킬렌기를 나타낸다.
이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 명세서에서 용어 "히알루론산"은 히알루론산 자체는 물론 그의 염 및 유도체를 모두 포함하는 의미로 사용된다. 따라서, 이하에서 사용되는 용어 "히알루론산 수용액"은 히알루론산의 수용액, 히알루론산 염의 수용액, 히알루론산 유도체의 수용액, 및 이들의 혼합물 수용액을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명에 사용되는 히알루론산으로는 다양한 물성과 생체적합성을 구현하기 위해 20,000 달톤(Da) 내지 4,000,000 달톤(Da)의 분자량을 갖는 것이 바람직하나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따르면, 물-알코올 혼합용매 중에서, 히알루론산 또는 그의 염 또는 유도체를 카르복실기 활성화제의 존재하에 하기 화학식 2의 지방족 디카르복실산의 디하이드라자이드 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 하기 화학식 1의 히알루론산 유도체 제조방법이 제공된다:
[화학식 2]
H2N-NH-C(O)-R1-C(O)-NHNH2
[화학식 1]
[HA]-C(O)-NHNH-C(O)-R1-C(O)-NHNH2
상기에서, [HA]는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염 또는 유도체를 나타내고, R1은 히드록시, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬렌기, 바람직하게는 C3-C6 알킬렌기, 보다 바람직하게는 C4-C5 알킬렌기, 가장 바람직하게는 C4 알킬렌기를 나타낸다.
본 발명의 히알루론산 유도체 제조방법에서는, HA의 카르복실기가 상기 디하이드라자이드 화합물의 하이드라자이드기(hydrazide group)와 아미드(amide) 결합 반응하고, 그 결과 HA와 하이드라자이드 화합물이 공유결합된다.
본 발명의 히알루론산 유도체 제조방법에서 사용가능한 지방족 디카르복실산의 디하이드라자이드 화합물의 바람직한 예로는 아디프산 디하이드라자이드와 같은 C3-C10지방족 디카르복실산의 디하이드라자이드를 들 수 있으며, 보다 바람직하게는 아디프산 디하이드라자이드가 사용된다. 지방족 디카르복실산의 디하이드라자이드 화합물의 사용량에는 특별한 제한이 없으며, 히알루론산 1몰당 몰비로 30 내지 50배 과량으로 사용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 히알루론산 유도체 제조방법에서 사용가능한 카르복실기 활성화제로는 카르보디이미드(carbodiimide)가 바람직하게 사용된다. 상기 카르보디이미드의 예로는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)와 같은 1-알킬-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드들; 1-에틸-3-(3-(트리메틸암모니오)프로필) 카르보디이미드 (ETC, 1-ethyl-3-(3-(trimethylammonio)propyl) carbodiimide)와 같은 1-알킬-3-(3-(트리메틸암모니오)프로필) 카르보디이미드들; 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸) 카르보디이미드(CMC, 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl) carbodiimide)와 같은 1-사이클로알킬-3-(2-모르폴리노에틸) 카르보디이미드 등의 수용성 카르보디이미드를 들 수 있다. 보다 바람직하게는, EDC가 사용된다. 카르복실기 활성화제의 사용량에는 특별한 제한이 없으며, 히알루론산 1몰당 몰비로 2 내지 6배 과량으로 사용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 히알루론산 유도체 제조방법에서는 선택적으로 반응 보조제를 추가 사용할 수 있다. 상기 반응 보조제로는 물에 녹으며, 활성(active) 에스테르(ester)를 형성할 수 있는 물질들이 사용될 수 있으며, 예를 들면 N-히드록시숙신이미드(NHS, N-Hydroxysuccinimide), 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt, 1-hydroxybenzotriazole), 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아 진(HOOBt, 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAt, 1-hydroxy-7-azabenzotriazole), 설포-N-히드록시설포숙신이미드 (Sulfo-NHS, Sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide) 등을 들 수 있다. 반응 보조제의 사용량에는 특별한 제한이 없으며, 히알루론산 1 몰당 몰비로 2 내지 6배로 사용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 히알루론산 유도체 제조는 물-알코올 혼합용매, 바람직하게는 물-C1~C6 알코올 혼합용매, 보다 바람직하게는 물-에탄올 혼합용매 중에서 수행된다. 상기에서 물과 알코올의 혼합비에는 특별한 제한이 없으며, 바람직하게는 물:알코올이 부피비로 1:0.1 내지 1:10, 더욱 바람직하게는 1:0.5 내지 1:2, 더욱 더 바람직하게는 1:0.9 내지 1:1.1이다. 본 발명의 히알루론산 유도체 제조시 온도 및 압력 조건에는 특별한 제한이 없으며, 통상 20 내지 40℃ 및 대기압의 조건에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 pH 조건 및 반응시간에도 특별한 제한이 없으며, 바람직하게는 4 내지 6의 pH 조건 하에서 30분 내지 4시간 동안 반응을 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 히알루론산 유도체 제조방법에서는 물-알코올 혼합용매 중에서 카르복실기 활성화제의 존재하에 히알루론산(HA)과 지방족 디카르복실산의 디하이드라자이드 화합물을 반응시킴으로써, 디하이드라자이드에 의한 HA의 변형률을 높일 수 있다. 본 발명의 히알루론산 유도체 제조시 사용되는 히알루론산과 디하이드라자이드 화합물의 상대적인 양에는 특별한 제한이 없으며, 통상 히알루론산 대비 몰 비로 10~80배, 보다 바람직하게는 30~50배 과량의 디하이드라자이드 화합물이 사용된다.
본 발명의 히알루론산 유도체 제조방법은, 반응 결과물을 투석막을 이용하여 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 사용한 투석막의 분자량 컷-오프(cut-off)에는 특별한 제한이 없으며, 본 발명의 일 구체예에서는 분자량 7 kD의 컷-오프를 사용한다. 이 구체예에서는, 반응하지 않고 남은 화학 반응물의 제거를 위해 과량의 100 mM NaCl 수용액에 60시간 투석시킨다. 이후 25% 에탄올과 증류수에서 각각 투석을 반복한다. 이 때, 25%의 에탄올에 투석하여 투석 튜브 내 수용액의 부피를 줄이면서 잉여 화학 반응물의 제거가 이루어지고, 이후, 순수한 물에 다시 투석하여 부피를 늘려주어 순수한 히알루론산 유도체를 얻을 수 있다.
본 발명에 따라 제조되는 히알루론산 유도체는 하기 화학식 1의 구조를 갖는다:
[화학식 1]
[HA]-C(O)-NHNH-C(O)-R1-C(O)-NHNH2
상기에서, [HA] 및 R1은 앞서 정의한 바와 같다.
본 발명에 따라 제조되는 히알루론산 유도체는 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬 디카르복실산의 디하이드라자이드 화합물이 공유결합에 의해 히알루론산 또는 그것의 염에 결합되어 있는 구조를 갖는다. 본 발명에 따라 제조되는 히알루론산 유도체의 바람직한 예로서 히알루론산-아디프산 디하이드라자이드(HA-ADH) 유도체를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 HA-ADH 유도체에서는, HA의 카르복시산기(-COOH)와 아디프산 디하이드라자이드의 하이드라자이드기 하나와의 반응을 통해 공유결합을 형성하고 있다. 히알루론산의 카르복시산기는 히알루론산 분해효소인 히알루로니다제(hyaluronidase)가 히알루론산을 인식하는 데에 관여하는 중요한 기로서, 본 발명에서는 히알루론산의 카르복시산기를 변형시킴으로써 생체 내에 투입시 분해효소에 의한 히알루론산 분해를 최소화할 수 있다.
한편, 본 발명에 따르면, 하기 화학식 3의 히알루론산 유도체 가교결합물이 제공된다:
[화학식 3]
[HA]-C(O)-NHNH-C(O)-R11-C(O)-NHNH-C(O)-R2-C(O)-NHNH-C(O)-R12-C(O)-NHNH-C(O)-[HA]
상기에서, [HA]는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염 또는 유도체를 나타내고, R11 및 R12는 각각 독립적으로 히드록시, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬렌기, 바람직하게는 C3-C6 알킬렌기, 보다 바람직하게는 C4-C5 알킬렌기, 가장 바람직하게는 C4 알킬렌기를 나타내며, R2 는 히드록시, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C4-C12 알킬렌기, 바람직하게는 C4-C10 알킬렌기, 보다 바람직하게는 C5-C7 알킬렌기, 가장 바람직하게는 C6 알킬렌기를 나타낸다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 히알루론산 유도체 가교결합물은, 본 발명에 따라 제조된 히알루론산 유도체들을 하기 화학식 4의 지방족 디카르복실 화합물로 가교결합시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다:
[화학식 4]
R'O-C(O)-R2-C(O)-OR"
상기에서, R2는 앞서 정의한 바와 같고,
R' 및 R"는 각각 독립적으로 수소, 숙신이미딜 또는 설포숙신이미딜을 나타낸다.
본 발명에 따른 히알루론산 유도체에 가교결합기를 제공하는 상기 화학식 4의 지방족 디카르복실 화합물로는 비스[설포숙신이미딜]수베레이트(bis[sulfosuccinimidyl]suberate, BS3)와 같은 아민-반응성 N-히드록시설포숙신이미드(amine-reactive N-hydroxysulfosuccinimide, NHS)의 지방족 디카르복실산 에스테르가 바람직하게 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 비스[설포숙신이미딜]수베레이트가 사용된다.
본 발명에 따라 제조되는 히알루론산 유도체의 바람직한 예인 히알루론산-아디프산 디하이드라자이드(HA-ADH) 유도체와 가교결합기를 제공하는 화합물의 바람직한 예인 BS3와의 반응에 따른 히알루론산 유도체 가교결합물의 생성을 도 1에 나타내었다. 도 1에 따르면, BS3의 카르복실기와 ADH의 하이드라자이드기와의 아미드 결합을 통하여 가교가 일어남을 알 수 있다. 가교결합은 분자 간에 일어날 수도 있고, 분자 내에서 일어날 수도 있다.
본 발명의 히알루론산 유도체 가교결합물의 제조시 온도 및 압력 조건에는 특별한 제한이 없으며, 통상 20 내지 40℃ 및 대기압의 조건에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 pH 조건 및 반응시간에도 특별한 제한이 없으며, 통상 6 내지 8의 pH 조건 하에서 30분 내지 2시간 동안 반응을 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 히알루론산 유도체 가교결합물의 제조에 사용되는 지방족 디카르복실 화합물의 양에는 특별한 제한이 없으나, 바람직하게는 히알루론산 유도체 내의 HA 반복 단위(repeating unit)의 10 내지 30 몰%, 더욱 바람직하게는 15 내지 25 몰%에 해당하는 양의 지방족 디카르복실 화합물이 사용된다. 이와 같이 제조된 가교된 히알루론산 유도체 가교결합물은 추가의 정제과정 없이 바로 생체적합성 실 험을 위해 사용될 수도 있다.
도 1에 나타낸 바와 같은 본 발명의 일 구체예에 따르면, 카르복실기 활성화제인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)의 존재하에 히알루론산(HA)과 아디프산 디하이드라자이드(ADH)를 물-에탄올 혼합용매 중에서 반응시켜 HA-ADH 유도체를 합성하고, 정제과정을 거친 후, 얻어진 HA-ADH 유도체를 비스[설포숙신이미딜]수베레이트(BS3)와 반응시켜 가교결합물을 제조한다. 이 때, BS3 양 말단이 설포숙신이미딜기를 방출하면서 HA-ADH 유도체의 하이드라자이드기와 아미드 결합을 형성하여 가교가 일어난다.
상기와 같이 하여 제조된 히알루론산 유도체 가교결합물은 생리학적으로 적합한 수용액으로 수화시키는 것에 의해 안정화될 수 있다. 생리학적으로 적합한 수용액으로는 생리식염수가 바람직하며, 히알루론산 유도체 가교결합물과 생리학적으로 적합한 수용액의 혼합비에는 특별한 제한이 없으나, 부피비로 1:0.5 내지 1:2의 비율로 혼합하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 히알루론산 유도체 가교결합물은, 이를 히알루론산 분해효소로 분해하고, 분해의 결과 얻어진 글루쿠룬산을 카르바졸 방법으로 정량분석하는 단계를 거쳐 히알루론산 분해효소에 대한 안정성을 확인할 수 있다.
따라서 본 발명은, 본 발명에 따른 히알루론산 유도체 가교결합물을 히알루론산 분해효소로 분해하는 단계; 및 상기 분해의 결과 얻어진 글루쿠룬산을 카르바졸 방법으로 정량분석하는 단계를 포함하는, 히알루론산 유도체 가교결합물의 히알루론산 분해효소에 대한 안정성 시험방법을 제공한다.
본 발명에 따른 히알루론산 유도체 가교결합물의 안정성 시험방법에 있어서, 히알루론산 분해효소에 의한 분해시 온도는 30 내지 40℃ 인 것이 바람직하고, pH는 6 내지 8인 것이 바람직하며, 분해 시간은 12시간 내지 60시간인 것이 바람직하나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
미리 정해진 시간 동안의 분해가 완료되면 비등수조(boiling water bath (100℃))에 시료 용기를 담가 효소활성을 중지시키고, 상층액으로 분해되어 나온 글루쿠룬산의 양을 카르바졸(carbazole) 방법(Bitter T and Muir H, Anal. Biochem., 1962;4;330)으로 분석한다.
또한, 본 발명에 따른 히알루론산 유도체 가교결합물은, 이를 생체 내에 주입한 후, 주입된 히알루론산 유도체 가교결합물을 상기 생체로부터 회수하여 헤마토자일린-이오신(hematoxylin-eosin) 및 알시안 블루(alcian blue)를 사용하여 염색하는 과정을 통해 생체적합성을 확인할 수 있다.
따라서 본 발명은, 본 발명에 따른 히알루론산 유도체 가교결합물을 생체 내에 주입하는 단계; 상기 주입된 히알루론산 유도체 가교결합물을 상기 생체로부터 회수하는 단계; 및 상기 회수된 히알루론산 유도체 가교결합물을 헤마토자일린-이오신(hematoxylin-eosin) 및 알시안 블루(alcian blue)를 사용하여 염색하는 단계를 포함하는, 히알루론산 유도체 가교결합물의 생체적합성 시험방법을 제공한다.
본 발명의 히알루론산 유도체 가교결합물의 생체적합성 시험방법에서는 통상 마우스가 사용되며, 히알루론산 유도체 가교결합물을 생체 내에 주입하기 위하여 통상 생리식염수와 1:0.5 내지 1:2 부피 비율로 완전히 섞어서 점성이 낮은 상태로 만든 후 균질기 등을 사용하여 완전하게 균일화시킨다. 주입 완료 후 회수까지의 기간은 실험 대상 및 목적에 따라 수일 내지 수개월까지 다양할 수 있다. 회수된 가교결합물은 헤마토자일린-이오신(hematoxylin-eosin, H&E) 및 알시안 블루(alcian blue)를 사용하여 염색한다. H&E의 경우, 헤마토자일린은 염증 반응시 파란색으로 염색이 되며, 이오신은 헤마토자일린과는 대조염색으로서 붉게 염색이 된다. 알시안 블루 수용액(pH 2.5)은 구리 이온의 존재 하에 파란색을 나타내며, 황화된 무코다당류, 카르복실화된 무코다당류 및 카르복실화된 당단백질을 염색하여 파란색을 나타내게 된다. 염색이 완료된 시료는 동결시킨 후 절단하고, 광학현미경을 이용하여 관찰하여, 가교결합물의 생체적합성을 평가한다.
상기 생체적합성 시험에 있어서, 대조군으로는 대략 2,000,000 달톤의 고분자량인 순수 히알루론산을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 히알루론산 유도체 가교결합물의 주름개선 효과 시험방법에서는 바람직하게는 주름 유발 무모 마우스가 사용되며, 히알루론산 유도체 가교결합물은 상기 생체적합성 시험방법에서처럼 생리식염수에 균질화된 상태로 예컨대 주름 유발 무모 마우스의 등쪽 피하층에 주입된다. 주입 완료 후, 최종 관찰까지의 기간은 실험대상 및 목적에 따라 수개월까지 다양할 수 있다. 주름개선 효과는 동일한 거리와 조명 하에 사진촬영을 한 뒤, 이미지 분석기(image analyzer)로 주름개선의 면적을 계산하여 가교결합물의 주름개선 효과를 평가한다.
또한, 본 발명에 따르면, 하기 화학식 5의 히알루론산 유도체가 제공된다:
[화학식 5]
[HA]-C(O)-NH-R3-NH2
상기에서, [HA]는 앞서 정의한 바와 같고, R3은 치환 또는 비치환된 C3-C10 알킬렌기를 나타낸다.
상기 화학식 5의 히알루론산 유도체는 히알루론산과 디아민 화합물을 반응시켜 제조될 수 있고, 카르복실기 활성화제 및 반응 보조제의 존재하에 가교될 수 있다. 이 때 카르복실기 활성화제 및 반응 보조제로는 앞서 설명한 바와 같은 것이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 카르복실기 활성화제로는 EDC가, 반응 보조제로는 HOBt가 사용된다.
또한, 본 발명에 따르면, 카르복실기 활성화제 및 반응 보조제의 존재하에 히알루론산 또는 그의 염 또는 유도체를 하기 화학식 6의 디아민 화합물로 직접 가교시키는 것을 특징으로 하는, 가교된 히알루론산 유도체 제조방법이 제공된다:
[화학식 6]
H2N-R3-NH2
상기에서, R3은 히드록시, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬렌기, 바람직하게는 C3-C6 알킬렌기, 보다 바람직하게는 C4-C6 알킬렌기, 가장 바람직하게는 C6 알킬렌기를 나타낸다.
상기 화학식 6의 디아민 화합물의 구체적인 예로는 디아미노부탄, 헥사메틸렌디아민 등을 들 수 있고, 헥사메틸렌디아민이 바람직하다.
본 발명의 히알루론산 유도체 및 그 가교결합물의 제조를 위해 필요한 출발물질 및 시약은 직접 제조하여 사용할 수도 있고, 상업적으로 구입할 수도 있다.
본 발명에 따른 히알루론산 유도체 및 그 가교결합물의 제조 방법에는, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 범위 내에서 상기 공정들의 일부가 변형되거나 기타 제조 공정들이 포함될 수 있다.
본 발명에 따라 제공되는 히알루론산 유도체의 가교결합물은 기존의 가교결합물에 비하여 생체 내에서 오래 지속될 수 있고 우수한 생체적합성과 높은 점탄성을 가지므로, 주름살 치료용 삽입물, 성형보조물, 관절염 치료용 삽입물, 약물 전달체 등 다양한 생체적합성(biocompatibility) 소재 용도로 사용될 수 있으며, 특히 조직보정용 충전재로 사용시, 생체 내에서 오랜 기간 동안 유지될 수 있으므로, 그것의 교환횟수를 줄이는 등의 효과를 나타낼 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 히알루론산 유도체의 제조
Luo Y et al. (J. Control. Rel., 2000;69:169-184)의 방법에 따라 다음과 같이 히알루론산 유도체를 제조하였다.
분자량 약 234 kD의 히알루론산(HA, 제조사:Lifecore Co.) 100 mg을 물 20 ml에 녹여 5 mg/ml의 HA 수용액을 제조했다. 상기 HA 수용액에 HA 대비 몰비로 40 배 과량의 아디프산 디하이드라자이드(ADH) 분말(1.736 g)을 혼합하고 10분간 완전히 녹였다. 얻어진 HA/ADH 혼합 수용액에 에탄올 20 ml를 첨가하고, 결과 혼합용액의 pH를 1 N HCl을 이용하여 4.8로 맞춘 후, 30분간 완전히 교반시켰다. 여기에 HA의 카르복실기를 활성화시키기 위해 교반을 잘 해주면서 몰비로 4배 과량의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC, 0.191 g) 분말을 첨가하였다. 상기의 수용액에 1 N HCl을 첨가하여 pH를 4.8로 유지하면서 두 시간 동안 반응시켰다. 두 시간 후에, 1 N NaOH를 첨가하여 pH를 7.0으로 끌어올려 반응을 정지시켰다 (수득량 86 mg, 수율: 86%).
수득된 생성물의 점성과 불순물(결합되지 않은 ADH)을 줄이기 위해 미리 씻어놓은 투석튜브 (7 kDa의 분자량 컷-오프)에 넣어 100 mM NaCl 수용액에 60시간 투석시켰다. 이 후 25% 에탄올과 증류수에 각각 투석을 반복하였다. 투석이 완료된 수용액을 3일 동안 동결건조하여 HA-ADH 유도체를 얻었다.
비교예 1: 히알루론산 유도체의 제조
HA/ADH 혼합 수용액에 에탄올 20 ml를 첨가하지 않은 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 HA-ADH 유도체를 얻었다.
실험예 1: 제조된 HA - ADH 유도체의 정제도 및 변형률 분석
상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 HA-ADH 유도체의 순도를 GPC(gel permeating chromatography) 방법(Kuo JS et al., Bioconj. Chem., 1991;2:232- 241)에 의해 결정하였다. 이 방법은 액상크로마토그래피(LC) 분석에 의해 불순물의 정도를 알아보는 방법으로 Ultrahydrogel 250과 1000 칼럼(7.8 mm i.d × 30 cm)이 사용되었다. 이동상으로 34 mM 인산 완충액(phosphate buffer, pH 6.6)/MeOH=80:20 (v/v)을 사용하여 0.5 ml/min으로 전개하였다. 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 HA-ADH 유도체 모두 HA-ADH 유도체와 ADH 피크(peak)를 확인한 결과 99% 이상의 정제도를 갖는 것으로 확인하였다. 실시예 1의 HA-ADH 유도체에 대한 크로마토그래피 분석결과를 도 2에 나타내었다(다른 용출전개 시간을 갖는 정제된 순수한 HA-ADH 피크와 ADH 피크만을 겹쳐서 표시하였다).
한편, 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 HA-ADH 유도체에 있어서, HA의 ADH에 의한 변형률 정도는 1H NMR (DPX300, Bruker, Germany) 분석을 통하여 확인하였다. 피크 분석을 통한 ADH에 의한 변형률 정도의 확인은 Luo Y et al. (J. Control. Rel., 2000;69:169-184)의 방법에 따라 분석하였으며, δ=1.7과 2.4 ppm에서 ADH의 메틸렌기 피크로 확인하였다. 아세트아미도(acetamido)기의 메틸 공명(δ=1.85-1.95 ppm)이 내부 기준으로 사용되었다. 실시예 1에서 제조된 HA-ADH 유도체의 NMR 스펙트럼을 도 3에 나타내었다. 도 3에서 히알루론산의 N-아세틸기(α)는 δ=1.9 ppm, ADH의 메틸렌기(β, γ)는 각각 δ=2.2 ppm, 2.3 ppm과 δ=1.5 ppm, 1.7 ppm의 피크에 해당한다.
비교예 1에서 제조된 HA-ADH 유도체의 변형률은 72.9mol%이었고, 실시예 1에서 제조된 HA-ADH 유도체의 변형률은 82.8mol%이었다.
실시예 2: 히알루론산 유도체 가교결합물의 제조
실시예 1의 HA-ADH 유도체(68 mg, ADH 변형률 82.8 mol%)을 0.01 M PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4) 1.615 ml에 완전히 녹였다.
상기 수용액 각각을 앞이 잘린 1 ml 주사기 15개에 각각 95 ㎍씩 담았다. 하이드라자이드기(hydrazide group)에 특이적인 가교제로서 비스[설포숙신이미딜]수베레이트(BS3)를 상기의 PBS 85 ㎕에 녹인 후, 이 가교제 수용액 5 ㎕씩을 주사기에 담긴 HA-ADH 수용액에 첨가하고 혼합하였다. 이때, 첨가해 준 BS3의 양은 HA 반복 단위(repeating unit)의 20 몰%에 해당하는 양이었다.
상기의 수용액 각각을 주사 바늘을 이용하여 완전히 섞어준 후 가교반응을 완전히 하기 위해 37℃에서 한 시간 동안 반응시켜, 실시예 2의 HA-ADH 유도체의 가교결합물을 제조하였다 (평균 수율: 88.24%).
비교예 2: 히알루론산 유도체 가교결합물의 제조
비교예 1의 HA-ADH 유도체(68 mg, ADH 변형률 72.9 mol%)을 이용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 제조하였다 (평균 수율: 88.24%).
비교예 3: 가교된 HA- DVS 의 제조
실시예 1 및 비교예 1에서 사용한 것과 같은 HA(68 mg)을 0.2 N NaOH 1.68 ml에 완전히 녹였다. 상기의 수용액에 HA의 히드록실기에 특이적인 가교제로서 20.02 ㎕의 디비닐설폰(divinyl sulfone, DVS)을 첨가하였다. 이때, 히드록실기에 대한 DVS의 몰분율은 1:1이었다. 상기의 수용액을 완전히 교반하여 섞어 주었고, 이 수용액의 각 100 ㎕씩을 15개의 앞이 잘린 1 ml 주사기에 담았다. HA와 DVS의 완전한 가교 반응을 위해 37℃에서 한 시간 동안 반응시킨 후, 상기의 주사기 각각을 미리 세척한 투석막(7 kDa의 분자량 컷-오프)으로 봉입해 과량의 순수한 물에 24시간 동안 투석하여 가교된 HA-DVS를 제조하였다 (수율: 97.90%).
실험예 2: 가교된 HA 유도체들의 생체외( In vitro ) 분해 실험
실시예 2, 및 비교예 2 및 3의 가교된 HA 유도체 각 100 ㎕씩을 각각 4 ml 바이얼(vial)에 넣었다. 0.2 M 소듐 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer, pH6.2) 1.45 ml을 각 바이얼에 첨가하였다. 각 바이얼에 히알루론산 분해효소(hyaluronate lyase, Sigma-Aldrich) 90 U을 포함한 0.2 M 소듐 포스페이트 완충액 (pH 6.2) 0.45 ml을 첨가하였다. 이를 37℃에서 48시간 동안 반응시켰다. 정해진 샘플 채취시간(0, 1, 4, 8, 24, 48 시간)이 되면 각 바이얼에서 상층액 200 ㎕를 뽑아내고, 0.2 M 소듐 포스페이트 완충액 (pH 6.2) 200 ㎕을 다시 넣어주었다. 각 샘플 채취시간마다 발생하는 상층액의 희석은 추후 보정하였다. 뽑아낸 각 상층액 200 ㎕은 비등수조(100℃)에 3분 동안 담가 효소활성을 중지시켰다. 상층액으로 분해되어 나온 글루쿠룬산의 양을 카르바졸(carbazole) 방법(Bitter T and Muir H, Anal. Biochem., 1962;4;330)으로 분석하여 가교된 HA 유도체의 분해효소에 대한 안정성을 확인하였다.
시간 경과에 따른 분해율(degradation, %)을 도시한 그래프를 도 4에 나타내었다. 도 4에 따르면, 비교예 3의 가교된 HA-DVS(■)가 가장 빨리 분해되었고, 48시간 이후에는 완전히 분해되었다. 또한 비교예 2의 HA-ADH 유도체 가교결합물(○)은 48시간 이후에는 약 40% 미만의 양만이 분해되지 않은 채로 유지되었다. 이에 비하여 실시예 2의 HA-ADH 유도체 가교결합물(●)은 분해속도가 현저히 느렸을 뿐만 아니라 48시간 이후에도 약 60% 이상의 상당한 양이 분해되지 않은 채로 유지되었음을 알 수 있다.
상기 결과로부터, 가교된 HA 유도체의 분해효소에 대한 안정성을 향상시키기 위해서는, HA의 대표적인 기능기 중 히드록실기 보다는 카르복실기를 물-알코올 혼합용매 중에서 변형시키는 것이 효과적임을 알 수 있다.
실험예 3: 가교된 HA 유도체들의 생체내 ( in vivo ) 적합성 실험
2개월 된 수컷 Institute Cancer Research (ICR) 마우스 (Jung-Ang Lab Animal Inc., Korea)를 케타민 염화수소(ketamine hydrochloride, 몸무게에 따라 8 mg/kg, Yuhan Corporation, Korea)와 자일라진 염화수소(xylazine hydrochloride, 몸무게에 따라 1.15 mg/kg, Bayer, Korea)로 마취시켰다.
실시예 2 및 비교예 3의 가교된 HA 유도체 각각을 생리식염수와 1:1 부피 비율로 완전히 섞어서 주사가 가능하도록 점성이 낮은 상태로 만든 후 균질기(T-18 basic, IKA, Tokyo, Japan)로 8000 rpm에서 5분 동안 완전하게 균일화시켰다. 얻어 진 겔 0.2 ml를 24-게이지 주사바늘을 이용하여 마우스의 등쪽 피하층에 각각 주입하였다. 대조군으로서 분자량 약 2,000 킬로달톤(kDa)의 고분자량 HA(제조사: Chugai Pharmaceutical Co., Japan)의 10 mg/ml 수용액을 마우스에 주입하였다.
각각의 시료를 ICR 마우스에 주입 후 2, 6, 12 그리고 24주 뒤에 각각 관찰하였다. 주입된 각각의 시료들은 다음의 분석을 위해 마우스로부터 회수되었다. 회수된 상기 겔들의 모양을 디지털 카메라로 촬영하여 도 5에 나타내었다.
회수된 겔들을 생리식염수에 담가서 부피를 측정하였다. 이때, 생리식염수의 각각의 겔로의 흡수를 가능한 한 최소화하기 위해 부피는 최대한 신속히 측정하였다. 측정결과를 도 6에 나타내었다.
조직학적 검사를 위해 헤마토자일린-이오신(H&E) 염색시약과 알시안 블루 수용액을 사용하였다: 우선 각각의 회수된 시료들을 30분 동안 차가운 PBS에 담근 후, OCT(optimal cutting temperature) compound (Sakura Finetek, Japan)에 적셨다. 이것을 헥산과 함께 드라이아이스에 얼린 후 10 ㎛의 두께로 절단하였다. 절단된 시료를 H&E 염색시약과 알시안 블루로 염색하였다.
염색된 시료를 광학현미경을 이용하여 100배와 400배 줌으로 촬영하였다.
비교예 3, 대조군 및 실시예 2의 시료에 대한 광학현미경 촬영 결과를 각각 도 7 내지 9에 나타내었다.
실시예 2 및 비교예 3의 시료를 ICR 마우스에 주입한 후 1, 2주 후 각각 조직보정 상태를 확인한 결과, 주입한 3종류의 시료 모두 항생제의 치료를 하지 않은 상태에서 주입한 시료 주변에 용혈이나 염증 반응은 관찰되지 않았다. 또한 실시예 2 및 비교예 3의 시료는 2주 후에도 하이드로겔(hydrogel) 형태를 유지한 상태로 회수되었던 반면 대조군의 시료는 주입 후 1주 내에 사라졌다 (도 5).
실시예 2의 가교결합물은 그 제조 후에 추가적인 정제과정 없이 바로 생체 내에 주입되었지만, 생체적합성을 확인한 결과 어떠한 용혈이나 부작용이 관찰되지 않았는바, 우수한 안전성을 가짐을 확인하였다.
한편, 주입된 시료들의 주입 후 시간 경과에 따른 조직 부피의 유지 상태를 24주 동안 정량적으로 관찰한 결과, 실시예 2의 HA-ADH 유도체(●)는 24주 후에도 처음 부피의 65%를 유지하였음을 알 수 있었다. 반면, 비교예 3의 가교된 HA-DVS(○)는 주입 후 6주 동안 부피가 거의 일정하게 유지 내지 소폭 증가되었지만, 이후 감소하여 12주 후에는 처음 부피의 30%로 감소하였고, 24주 후에는 관찰되지 않았다. 처음 6주 동안 부피가 소폭 증가한 것은 HA가 빠르게 분해함에 따른 부종으로 보여졌다. 대조군으로 사용한 분자량 약 2,000,000 달톤의 순수 HA 시료(□)는 1주 이내에 완전히 분해되었다(도 6).
도 7 내지 도 9에 나타낸 H&E와 알시안 블루 시약을 사용한 조직학적 분석 결과에 따르면, 대조군, 실시예 2 및 비교예 3의 시료 모두에서 염증반응은 발견되지 않았다 (H&E의 경우, 헤마토자일린은 염증 반응시 파란색으로 염색이 되며, 이오신은 헤마토자일린과는 대조 염색으로서 붉게 염색이 된다). 알시안 블루 염색시 대조군 및 비교예 3의 시료는 파란색으로 염색이 된 반면, 실시예 2의 시료는 ADH에 의한 HA의 카르복실의 높은 변형률로 인하여 적은 부분만이 파란색으로 염색이 되었다 (알시안 블루 수용액(pH 2.5)은 구리이온의 존재 하에 파란색을 나타내며, 황화된 무코다당류, 카르복실화된 무코다당류 및 카르복실화된 당단백질을 염색하여 파란색을 나타내게 된다).
실험예 4: 가교된 HA 유도체들의 주름개선 효과 실험
Fujimura 등(Fujimura T et al., J. Dermatol. Sci., 2000;24;105-111)의 방법에 따라 6주령의 암컷 무모 마우스(hairless mouse type SKH; Jung-Ang Lab Animal Inc., Korea)를 동일 면적의 등판에 0.2 ㎍의 칼시트리올(calcitriol, 1α,25-dihydroxyvitamin D3 in ethanol)을 1일에 1회씩 주 6회로 4주 동안 도포하여, 인위적으로 주름을 유발시켰다. 주름 유발제 중단 3일 후 시험약물 및 대조군을 피하층에 투여하였다.
실시예 2의 가교된 HA 유도체를 실험예 3에서처럼 생리식염수와 1:1 부피 비율로 섞어서 균질기로 균일화시킨 하이드로겔을 얻었다. 얻어진 하이드로겔(20 mg/ml) 0.4 ml를 24-게이지 주사 바늘을 이용하여 케타민 염화수소(ketamine hydrochloride, Yuhan Corporation, Korea)로 마취된 주름 유발 마우스의 등쪽 피하층의 사각형에 균일하게 주입을 하였다. 대조군으로서 Restylane®(제조사: Q-Med AB; 20 mg/ml) 0.4 ml를 24-게이지 주사 바늘을 이용하여 케타민 염화수소로 마취된 주름 유발 마우스의 등쪽 피하층의 사각형에 균일하게 주입을 하였다.
주름의 개선 정도는 동일한 거리와 조명 아래서 사진촬영을 한 뒤 이미지 분석기(Image Analyzer, Artimage2 software)를 이용하여 주름개선의 면적을 계산하여 분석하였다. 각각의 대조군 및 시험군은 3마리씩을 사용하였으며, 각각의 주름개선 면적을 계산하여 평균하였다.
시간 경과에 따른 주름개선 효과를 도시한 그래프를 도 10에 나타내었다. 도 10에 따르면 90일까지 확인한 결과 대조군으로 사용한 Restylane®과 HA-ADH 하이드로겔 모두에서 주름 유발군 무모 마우스에 비해 주름개선 효과가 현저한 것으로 나타났다. 30일까지는 Restylane®과 HA-ADH 하이드로겔 모두 비슷한 효과를 보였으나, 30일 이후에는 시간이 경과 함에 따라 HA-ADH 하이드로겔이 대조군인 Restylane® 보다 더 높은 주름개선 효과를 보이는 것을 알 수 있었다.
90일 이후에 대조군인 주름 비유발 및 주름 유발군 무모 마우스와 주름 유발군 무모 마우스에 Restylane®처리와 HA-ADH 하이드로겔 처리를 한 무모 마우스의 등쪽 표피의 상태를 나타낸 사진을 도 11에 나타내었다. 도 11에 따르면 주름 유발군 무모마우스에 비하여 주름 유발 후 Restylane®처리와 HA-ADH 하이드로겔 처리를 한 무모 마우스의 등쪽 표피에서 주름개선 효과가 나타난 것을 직접 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, HA-ADH 하이드로겔이 종래에 널리 사용되던 주름개선제에 비하여 보다 효과적으로 주름개선에 사용될 수 있음을 알 수 있었고, 특히 HA-ADH 하이드로겔이 갖는 뛰어난 안정성을 고려할 때 장시간에 걸쳐 안정적인 효과를 보일 것으로 기대되었다.
실시예 3: 가교된 HA-디아민 유도체의 제조
(1) EDC와 Sulfo-NHS를 이용한 HA-디아민 유도체의 제조 및 정제
분자량 약 234 kD의 HA(제조사: Lifecore Co.)를 사용하여 반응시 농도가 5 mg/ml이 되도록 HA 수용액을 제조하였다. 여기에 디아민의 한 종류인 헥사메틸렌디아민(hexamethylenediamine)을 HA 당량의 40배로 첨가하고 교반하여 완전히 녹였다. 여기에 EDC를 HA 당량의 4배가 되게 첨가하고 교반하여 완전히 녹였다. 설포-N-히드록시설포숙신이미드(Sulfo-NHS)를 EDC와 같은 당량으로 첨가하고 교반하여 녹였다. 결과 혼합 수용액에 1 N HCl을 첨가하여 pH 6.0~6.4를 유지시키면서 두 시간 동안 반응시켰다. 두 시간 후에, 반응을 정지시키기 위해 1 N NaOH를 첨가하여 pH 7.0으로 끌어올렸다. 반응 결과물을 투석튜브 (7 kDa의 분자량 컷-오프)에 넣고 100 mM NaCl 수용액에 60시간 투석시켰다. 이 후 25% 에탄올과 증류수에 각각 투석을 반복하였다. 투석을 통해 불순물(미반응물)을 제거한 수용액을 3일 동안 동결건조하여 순수한 HA-디아민 유도체인 HA-헥사메틸렌디아민 유도체를 얻었다.
헥사메틸렌디아민의 HA 카르복실기에 대한 변형률 정도는 1H-NMR 분석을 통하여 확인하였다. 변형률 정도는 δ=1.3, 1.4, 1.55 ppm에서 헥사메틸렌디아민의 메틸렌기 피크로 확인하였다. 아세트아미도(acetamido)기의 메틸 공명(δ=1.85- 1.95 ppm)이 내부 기준으로 사용되었다. 본 실시예에서 제조된 HA-헥사메틸렌디아민 유도체의 NMR 스펙트럼을 도 12에 나타내었다. 도 12에서, 히알루론산의 N-아세틸기는 δ=1.9 ppm, 디아민의 메틸렌기는 δ=1.3 ppm, 1.4 ppm, δ=1.55 ppm의 피크에 해당한다.
제조된 HA-헥사메틸렌디아민 유도체의 변형률은 30mol%로 확인되었다.
( 2) HOBt 를 이용하여 가교된 HA- Diamine 유도체의 제조
상기 (1)에서 제조된 HA-헥사메틸렌디아민 유도체를 농도가 20 mg/ml이 되도록 순수한 물에 녹였다. 여기에 EDC와 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)를 각각 HA 당량의 4배가 되게 첨가하고 교반하여 완전히 녹였다. 37℃에서 두 시간 반응시켜 가교된 HA-헥사메틸렌디아민 유도체를 만들었다. 제조된 가교물을 과량의 PBS에 5일 정도 씻어주었다 (수율: 98.30%).
실시예 4: 디아민의 직접 가교에 의한 가교된 HA- 디아민 유도체 제조
분자량 약 234 kD의 HA(제조사: Lifecore Co.)를 사용하여 반응시 농도가 5 mg/ml이 되도록 HA 수용액을 제조하였다. 여기에 헥사메틸렌디아민을 HA 단분자와 비교하여 같은 당량만큼 넣고 교반하여 잘 섞었다. EDC와 HOBt를 각각 HA 당량의 4배로 첨가하고 교반하여 완전히 섞어주었다. 37℃에서 두 시간 반응시켜 직접 가교된 HA-디아민 유도체를 만들었다. 겔화된 HA-디아민 유도체가 만들어졌으며, 이를 과량의 PBS에 5일 정도 씻어주었다 (수율: 98.50%).
상기에서 본 발명은 기재된 구체예를 중심으로 상세히 설명되었지만, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정은 당연히 첨부된 특허청구범위에 속한다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 HA-ADH 유도체 합성과정 및 합성된 가교결합성 HA-ADH 유도체의 구조에 대한 개략도이다.
도 2는 실시예 1의 HA-ADH 유도체에 대한 크로마토그래피 분석결과이다 (HA-ADH 피크와 ADH 피크의 위치를 각각 표시하였다).
도 3은 실시예 1에서 제조된 HA-ADH 유도체의 1H NMR 분석결과이다.
도 4는 실시예 2, 및 비교예 2 및 3에서 제조된 가교결합물들의 시간 경과에 따른 생체외(in vitro) 분해율(degradation, %)을 도시한 그래프이다. (■: 비교예 3, ○: 비교예 2, ●: 실시예 2)
도 5는 실시예 2 및 비교예 3에서 제조된 가교결합물 시료의 ICR 마우스 주입 후 2주가 지난 시점에서 조직보정 상태를 촬영한 해부학적 사진이다. (A: 대조군, B: 비교예 3, C: 실시예 2)
도 6은 ICR 마우스의 피하층에 주입한 대조군, 실시예 2 및 비교예 3 시료들의 부피변화를 나타낸 그래프이다. (○: 비교예 3, ●: 실시예 2, □: 대조군)
도 7은 시료 주입 후 2주, 6주, 12주 및 24주 경과시점에 ICR 마우스의 피하층으로부터 회수한 비교예 3의 시료들을 H&E와 알시안 블루(alcian blue)를 사용하여 염색한 뒤 광학현미경으로 촬영한 결과이다. 표시된 막대기는 50 ㎛를 나타낸다.
도 8은 시료 주입 후 1주 및 2주 경과시점에 ICR 마우스의 피하층으로부터 회수한 대조군의 시료들을 H&E와 알시안 블루(alcian blue)를 사용하여 염색한 뒤 광학현미경으로 촬영한 결과이다. 표시된 막대기는 50 ㎛를 나타낸다.
도 9는 시료 주입 후 2주, 6주, 12주 및 24주 경과시점에 ICR 마우스의 피하층으로부터 회수한 실시예 2의 시료들을 H&E와 알시안 블루(alcian blue)를 사용하여 염색한 뒤 광학현미경으로 촬영한 결과이다. 표시된 막대기는 50 ㎛를 나타낸다.
도 10은 시료 주입 후 10일, 20일, 30일, 40일,50일, 60일,70일, 80일 및 90일 경과시점에서 주름 유발 마우스의 주름개선 정도를 사진 및 이미지 분석기를 이용하여 주름개선의 면적(cm2)으로 계산하여 나타낸 그래프이다. (●: 주름 유발을 하지 않은 대조군, ○: 주름 유발을 한 대조군, ▼:Restylane®, ▽: 본 발명의 HA-ADH 하이드로겔)
도 11은 시료 주입 90일 후에 관찰한 주름 비유발군 무모 마우스, 주름 유발군 무모 마우스, Restylane® 투여한 주름 유발군 무모 마우스 및 본 발명의 HA-ADH 하이드로겔 투여한 주름 유발군 무모 마우스의 등쪽 표피 주름개선 정도를 촬영한 사진이다.
도 12는 실시예 3의 단계(1)에서 제조된 HA-헥사메틸렌디아민 유도체의 1H NMR 분석결과이다.

Claims (15)

  1. 물-알코올 혼합용매 중에서, 히알루론산 또는 그의 염 또는 유도체를 카르복실기 활성화제의 존재하에 하기 화학식 2의 지방족 디카르복실산의 디하이드라자이드 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 하기 화학식 1의 히알루론산 유도체 제조방법:
    [화학식 2]
    H2N-NH-C(O)-R1-C(O)-NHNH2
    [화학식 1]
    [HA]-C(O)-NHNH-C(O)-R1-C(O)-NHNH2
    상기에서, [HA]는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염 또는 유도체를 나타내고, R1은 치환 또는 비치환된 C3-C10 알킬렌기를 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, 히알루론산의 분자량이 20,000 달톤(Da) 내지 4,000,000 달톤(Da)인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 지방족 디카르복실산의 디하이드라자이드 화합물이 아디프산 디하이드라자이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 카르복실기 활성화제가 카르보디이미드 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 반응이 물과 C1-C6 알코올의 혼합용매 중에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 하기 화학식 3으로 표시되는, 제1항의 방법에 따라 제조된 히알루론산 유도체의 가교결합물:
    [화학식 3]
    [HA]-C(O)-NHNH-C(O)-R11-C(O)-NHNH-C(O)-R2-C(O)-NHNH-C(O)-R12-C(O)-NHNH-C(O)-[HA]
    상기에서, [HA]는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염 또는 유도체를 나타내고, R11 및 R12는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C10 알킬렌기를 나타내며, R2는 치환 또는 비치환된 C4-C12 알킬렌기를 나타낸다.
  7. 제1항의 방법에 따라 제조된 히알루론산 유도체들을 하기 화학식 4의 지방족 디카르복실 화합물로 가교결합시키는 단계를 포함하는 하기 화학식 3의 히알루론산 유도체 가교결합물 제조방법:
    [화학식 4]
    R'O-C(O)-R2-C(O)-OR"
    [화학식 3]
    [HA]-C(O)-NHNH-C(O)-R11-C(O)-NHNH-C(O)-R2-C(O)-NHNH-C(O)-R12-C(O)-NHNH-C(O)-[HA]
    상기에서, [HA]는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염 또는 유도체를 나타내고, R11 및 R12는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C10 알킬렌기를 나타내며, R2는 치환 또는 비치환된 C4-C12 알킬렌기를 나타내고, R' 및 R"는 각각 독립적으로 수소, 숙신이미딜 또는 설포숙신이미딜을 나타낸다.
  8. 제7항에 있어서, 지방족 디카르복실 화합물이 비스[설포숙신이미딜]수베레이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6항의 히알루론산 유도체 가교결합물을 히알루론산 분해효소로 분해하는 단계; 및 상기 분해의 결과 얻어진 글루쿠룬산을 카르바졸 방법으로 정량분석하는 단계를 포함하는, 히알루론산 유도체 가교결합물의 히알루론산 분해효소에 대한 안정성 시험방법.
  10. 제6항의 히알루론산 유도체 가교결합물을 생체 내에 주입하는 단계; 상기 주입된 히알루론산 유도체 가교결합물을 상기 생체로부터 회수하는 단계; 및 상기 회수된 히알루론산 유도체 가교결합물을 헤마토자일린-이오신 및 알시안 블루를 사용하여 염색하는 단계를 포함하는, 히알루론산 유도체 가교결합물의 생체적합성 시험방법.
  11. 생체 표피에 인위적으로 주름을 유발하는 단계; 제6항의 히알루론산 유도체 가교결합물을 생체 피하층에 주입하는 단계; 및 주름 개선 면적을 계산하는 단계를 포함하는, 히알루론산 유도체 가교결합물의 주름개선 효과를 확인하는 시험방법.
  12. 하기 화학식 5의 히알루론산 유도체:
    [화학식 5]
    [HA]-C(O)-NH-R3-NH2
    상기에서, [HA]는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염 또는 유도체를 나타내고, R3은 치환 또는 비치환된 C3-C10 알킬렌기를 나타낸다.
  13. 카르복실기 활성화제 및 반응 보조제의 존재하에 하기 화학식 5의 히알루론산 유도체를 가교시키는 것을 특징으로 하는, 가교된 히알루론산 유도체 제조방법:
    [화학식 5]
    [HA]-C(O)-NH-R3-NH2
    상기에서, [HA]는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염 또는 유도체를 나타내고, R3은 치환 또는 비치환된 C3-C10 알킬렌기를 나타낸다.
  14. 카르복실기 활성화제 및 반응 보조제의 존재하에 히알루론산 또는 그의 염 또는 유도체를 하기 화학식 6의 디아민 화합물로 직접 가교시키는 것을 특징으로 하는, 가교된 히알루론산 유도체 제조방법:
    [화학식 6]
    H2N-R3-NH2
    상기에서, R3은 치환 또는 비치환된 C3-C10 알킬렌기를 나타낸다.
  15. 제6항의 히알루론산 유도체 가교결합물을 포함하며, 겔, 주름살 치료용 삽입물, 성형보조물, 관절염 치료용 삽입물 및 약물 전달체로 이루어진 군으로부터 선택되는 생체적합성 소재.
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