WO2012053776A2

WO2012053776A2 - 히알루론산계 화합물, 그 제조방법 및 용도

Info

Publication number: WO2012053776A2
Application number: PCT/KR2011/007650
Authority: WO
Inventors: 이병찬; 나건; 이지은
Original assignee: (주)소우영
Priority date: 2010-10-19
Filing date: 2011-10-14
Publication date: 2012-04-26
Also published as: WO2012053776A3; WO2012053776A9; KR101003687B1

Abstract

본 발명은 히알루로산계 화합물, 그 제조방법 및 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 히알루론산계 화합물을 함유하는 연조직 충전재는 기존의 가교결합된 히알루론산 겔을 이용한 연조직 충전재에 비해 생분해속도가 길고 레티노익산 성분이 콜라겐 생성능을 제공하여 충전재가 생분해되더라도 생성된 콜라겐이 피부를 유지해주어 적용된 연조직에 다시 충전재를 주입할 필요를 대폭 감소시키고, 치료 효과가 우수하고 자연스러우며 이를 오랫동안 유지할 수 있는 등의 장점이 있다.

Description

히알루론산계 화합물, 그 제조방법 및 용도

본 발명은 새로운 히알루론산계 화합물에 관한 것으로서, 특히 주름과 흉터의 처치를 위한 연조직 충전제로 유용한 히알루론산계 화합물, 그 제조방법 및 용도에 관한 것이다.

일반적으로 인체 연조직 충전 방법은 진피 충전 혹은 피하 충전으로 분류되는데, 이에 사용되는 일반적인 충전제는 모두 자체 조직의 활성 인자가 아니라 생물합성재료 혹은 이질 단백질을 포함하고 있다. 19세기에 최초로 파라핀(Paraffin)을 충전 재료로 활용하였으나, 많은 합병증이 나타나고 효과 또한 우수하지 않았다. 1960년대에는 실록산 충전이 이용되기도 하였으나 부작용이 심하여 현재는 더 이상 이용되지 않고 있다.

그 후 외원성 단백질을 충전 재료로 활용하는 방법이 개발되었고, 특히 소의 콜라겐 단백질을 이용한 충전제는 신속한 효과를 나타내었지만 3 내지 6개월 후 조직 기관에 소화 흡수된다는 문제점이 있었다. 소의 콜라겐 단백질의 제작과 응용은 미국 특허 제3,949,073호, 제4,424,208호 및 제4,488,911호에 기술되어 있다. 소의 콜라겐 단백질은 35 mg/ml 및 65 mg/ml의 용량으로 자이덤(Zyderm I, II 및 III)이라는 상품명으로 시판되었으나, 자이덤 사용 후 90%의 치료자에 면역체가 생성되었고 1~3%의 치료자는 뚜렷한 알레르기 반응을 보여 만족을 얻지 못했다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 활용하여 여과 후 자이플라스트(Zyplast) 라는 가교 콜라겐 단백질을 개발함으로써 알레르기 반응은 해소하였으나(미국특허 제4,582,640호 및 공개특허 10-2007-0122316, 제4,642,117호), 글루타르알데히드로 얻은 재료의 점착성이 너무 커서 치료효과는 우수하지 않았다. 소 콜라겐 단백질의 면역 반응을 제거하기 위하여, 사람의 태반에서 콜라겐을 취하여 사용하는 방법이 미국 특허 제4,969,912호 및 제5,332,802호에 개시되어 오토로겐(AUTOLOGEN)이라는 상품명으로 시판되었으나, 이의 효과는 단지 수개월만 유지되었다. 돼지에서 추출한 콜라겐 제품인 피브렐(Fibrel)은 젤라틴 및 아미노카프로산(aminocaproic acid)과 치료자 혈장의 혼합물로서, 일부 환자에게서는 효과가 있지만 주사 부위에 덩어리가 생기거나 치료 효과를 유지하지 못하는 현상이 쉽게 출현하였다.

보톡스(BOTOX)는 최근에 폭넓게 활용되는 단기 주름 제거 주사액으로 2004년 4월에 FDA의 비준을 받고 임상 활용에 들어갔다. 이 주사액은 안면 운동 근육을 마취시켜 치료 효과를 달성하는데, 조작이 간단하고 효과가 즉시 나타난다는 장점이 있다. 그러나, 치료 후 얼굴 표정이 경직되고 치료 효과의 지속 시간이 짧으며 얼굴 신경 마비 등이 유발된다는 문제점을 안고 있다.

아르테콜(Artecoll)은 인공 합성 입자와 소 콜라겐 단백질의 복합물로서 캐나다, 멕시코, 유럽에서 몇 년간 사용되고 있는데, 국부 진피를 자극하여 자체 교원을 생산함으로써 지속적인 효과를 나타낸다. 그러나, 치료자가 촉감으로 입자를 느낄 수 있고 치료 부위에 붓기 현상이 출현하는 등의 문제점이 있다.

한편, 상품명이 레스틸랜드(Restyland , Q-Med Scandivavia사, USA)인 생분해성, 비-동물성 안정화 히알루론산(Non-Animal Stabilized Hyaluronic Acid) 겔은 주로 주름을 제거하고 입술을 풍만하게 하는 주름 제거 주사제로서 2003년 12월 12일자로 미국 FDA의 승인을 받았다. 히알루론산은 글루콘산 알데하이드산으로서 태반에서 취한 것으로, 조직과 세포에 자양분을 제공하는 역할을 하는 동시에 조직의 대사에 액체 환경을 제공하며, 피부를 탄력있고 매끄럽게 하는 기능을 한다.

미국 미용성형수술학회(ASAPS)에 따르면 히알루론산 연조직 충전제를 사용한 미용수술이 연평균 35% 를 넘나드는 가파른 성장세를 지속하고 있다. 최근에 승인 받은 프리벨 실크는 리토카인을 함유한 무색 히알루론산(HA) 겔제제로 임상실험에서 프리벨 실크를 주사받은 환자들은 리도카인이 없는 히알루론산 제품 사용자와 비교해 통증이 적은 것으로 나타났다.

메디시스 파마슈티컬의 주사용 젤 타입 충전제 레스틸랜 역시 히알루론산제제로서 보톡스가 이마 부위의 주름개선에 주안점을 두고 있는 반면 레스틸랜은 입과 코 주위의 주름개선에 초점을 맞추고 있다.

하일라폼도 닭 등 조류 수컷의 볏에서 추출된 히알루론산이 주성분으로 지난 1996년 유럽시장에 선을 보인 이래 오늘날 30여개국 이상에서 발매되고 있다.

엘러간에서 나온 주베덤 역시 히알루론산을 얼굴에 주사해 주름을 제거하는 제품이다.

이밖에 매사추세츠주에 소재 애니카 테라퓨틱스사가 주름개선 및 상처치유용 피부 충전제 ‘엘레베스Elevess'를 FDA로부터 발매허가 받은 적이 있다. 엘레베스는 주사제 제형의 연조직 충전제로 애나카 테라퓨틱스측이 특허를 보유하고 있는 화학적 변형 히알루론산에 국소마취제 리도카인을 결합시킨 형태의 제품이다.

연조직 충전에 히알루론산을 사용할 때의 장점은 천연 성분이어서 안전하고 부작용이 없다는 것인 반면, 지속 시간이 6개월 정도로 짧다는 문제점이 있다. 또한, 히알루론산을 사용하여 주름을 제거하거나 입술을 풍만하게 하는 시술을 수행하는 경우에는 즉각적인 효과가 나타나지만, 그 치료 효과가 6개월 정도만 유지된다는 문제가 있다.

히알루론산은 피부 내에 광범위하게 분포되어 있는 D-글루큐로닉산과 N-아세틸 글루코사민의 반복되는 이중체로 이루어진 선형의 천연 뮤코다당류이다. 생체적합성이 뛰어나고 생체내 분해성을 가지고 있는 물질이며, 필러의 대세를 이루고 있는 콜라겐에 비해 장점이 많은 물질로, 생체 내에서 공간을 채우고, 구조를 지탱하며, 세포를 보호하는 작용을 하고 있다.

이러한 작용을 갖는 히알루론산을 가진 피부가 자외선으로 인해 자극을 받게 되면 피부 노화를 유발하고, 탄력이 감소되어 피부의 구성물질인 히알루론산, 콜라겐을 잃게 되어 주름을 유발하게 된다.

자외선으로 생긴 주름을 채우기 위해서 히알루론 산을 이용하게 되었는데, 히알루론산 자체는 반감기가 1일 정도로 매우 짧은 단점이 있기 때문에 기존의 히알루론산에 BDDE(1,4 부탄디올 디글라이시딜 에터)와 같은 가교제로 가교를 시켜 히알루론산을 가교결합시켜 젤을 형성하게 되어 분해가 빨리 되는 단점을 보완하고자 하는 시도도 있었다. 하지만 가교된 히알루론산이 히알루로니다아제인 효소, 라디칼, 수화작용에 의해 분해가 되어 서서히 없어지기 때문에 아무리 6-12개월 이하로 지속성을 가진 가교된 히알루론산 겔이라도 어느정도 기간이 지나면 다시 주입해야하는 번거로움을 가지는 단점이 있다.

따라서 본 발명의 목적은 기존의 히알루론산계 연조직 충전제에 비해 증대된 지속성을 갖는 히알루론산계 연조직 충전제를 제공하는 데에 있다.

본 발명자들은 기존의 히알루론산계 연조직 충전제는 지속성이 낮아 다시 주입해야하는 번거로움이 있어 이를 해결하는 것을 과제로 연구하였으며, 본 연구에서 콜라겐 생성능이 있는 레티노익산을 풀루란과 접합하면 레티노익산을 히알루론산에 결합시킬 수 있고 가교할 수 있다는 사실의 발견, 이 가교 생성물을 함유하는 연조직 충전재는 기존의 가교결합된 히알루론산 겔을 이용한 연조직 충전재에 비해 생분해속도가 길고 레티노익산 성분이 콜라겐 생성능을 제공하여 충전재가 생분해되더라도 생성된 콜라겐이 피부를 유지해주어 적용된 연조직에 다시 충전재를 주입할 필요가 크게 줄어든다는 놀라운 사실의 발견에 기초하여 본 발명을 완성하게 된 것이다.

그러므로 본 발명에 의하면 치환된 또는 치환되지 않은 화학식 1의 구조를 갖는 히알루로산계 화합물이 제공된다.

화학식 1

위 식에서, n은 반복단위로서 정수이고, X는 가교제의 잔기임.

바람직하게 본 발명에 의하면 상기 X는 다작용기 에폭시 화합물 또는 디비닐설폰 화합물의 잔기인 것을 특징으로 하는 치환된 또는 치환되지 않은 화학식 1의 구조를 갖는 히알루로산계 화합물이 제공된다.

또한 본 발명에 의하면 치환된 또는 치환되지 않은 화학식 1의 구조를 갖는 히알루로산계 화합물을 제조하기 위한 바람직한 방법의 하나로서,

치환된 또는 치환되지 않은 화학식 2의 구조를 갖는 풀루란과 화학식 3의 구조를 갖는 레티노익산 간의 에스테르결합에 의해 화학식 4의 풀루란-레티노익산 접합체를 제조하는 단계; 및

화학식 4의 풀루란-레티노익산 접합체, 치환된 또는 치환되지 않은 화학식 5의 히알루론산 및 가교제를 반응시켜 상기 접합체의 메탄올기와 상기 히알루론산의 메탄올기를 상기 가교제에 의한 에테르 결합으로 가교하는 단계;를 포함하는 치환된 또는 치환되지 않은 화학식 1의 구조를 갖는 히알루로산계 화합물의 제조방법이 제공된다.

화학식 2

위식에서 n은 반복단위로서 정수임.

화학식 3

화학식 4

화학식 5

위 식에서 m은 반복단위로서 정수임.

바람직하게 본 발명에 의하면 상기 풀루란과 레티노익산은 유기용매 중에 용해하고 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법이 제공된다.

바람직하게 본 발명에 의하면 상기 풀루란-레티노익산 접합체의 용액을 히알루론산 용액과 혼합하고 가교제를 첨가하여 37℃에서 반응시켜 겔을 형성하는 것을 특징으로 하는 방법이 제공된다.

바람직하게 본 발명에 의하면 상기 겔을 중성으로 적정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법이 제공된다.

바람직하게 본 발명에 의하면 상기 풀루란-레티노익산 접합체는 플루란의 609개 글루코오스링 당 레티노익산 2개가 에스테르결합된 것임을 특징으로 하는 치환된 또는 치환되지 않은 화학식 1의 구조를 갖는 히알루로산계 화합물의 제조방법이 제공된다.

바람직하게 본 발명에 의하면, 상기 가교제가 다작용기 에폭시 화합물 또는 디비닐설폰 화합물인 것을 특징으로 하는 치환된 또는 치환되지 않은 화학식 1의 구조를 갖는 히알루로산계 화합물의 제조방법이 제공된다.

또한 본 발명에 의하면 치환된 또는 치환되지 않은 화학식 1의 구조를 갖는 히알루로산계 화합물을 함유하는 인체 연조직 충전재가 제공된다.

본 발명에 따르는 화학식 1의 히알루론산계 화합물을 함유하는 연조직 충전재는 기존의 가교결합된 히알루론산 겔을 이용한 연조직 충전재에 비해 생분해속도가 길고 레티노익산 성분이 콜라겐 생성능을 제공하여 충전재가 생분해되더라도 생성된 콜라겐이 피부를 유지해주어 적용된 연조직에 다시 충전재를 주입할 필요를 대폭 감소시키고, 치료 효과가 우수하고 자연스러우며 이를 오랫동안 유지할 수 있는 등의 장점이 있다,

도 1은 본 발명에 따르는 실시예 3에서 제조한 화학식 1의 화합물 겔의 점도를 가교 전과 가교 후에 측정한 결과를 나타낸 그래프,

도 2는 기존의 가교된 히알루론산 겔과 본 발명에 따르는 가교된 히알루론산/풀루란유도체-레티노익산 겔의 분해능 측정결과를 나타낸 그래프.

본 명세서에서, '히알루론산'이라는 용어는 히알루론산뿐만 아니라, 예를 들어 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 마그네슘 및 히알루론산 칼슘을 포함하는 임의의 히알루론산 염, 화학적으로 변형 혹은 유도체화된 형태의 히알루로산을 포함하는 의미로 사용된다.

'풀루란'이라는 용어는 풀루란뿐만 아니라, 예를 들어 풀루란 나트륨, 풀루란 칼륨, 풀루란 마그네슘 및 풀루란 칼슘을 포함하는 임의의 풀루란 염, 화학적으로 변형 혹은 유도체화된 형태의 풀루란을 포함하는 의미로 사용된다.

'레티노익산'이라는 용어는 레티노익산뿐만 아니라, 예를 들어 레티노익산 나트륨, 레티노익산 칼륨, 레티노익산 마그네슘 및 레티노익산 칼슘을 포함하는 임의의 레티노익산 염, 화학적으로 변형 혹은 유도체화된 형태의 레티노익산을 포함하는 의미로 사용된다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기로 한다.

본 발명에 따르는 히알루로산계 화합물은 치환된 또는 치환되지 않은 화학식 1의 구조를 갖는 화합물이다.

바람직하게 본 발명에 따르는 히알루로산계 화합물(1)은 히알루론산, 레티노익산, 풀루란(pullulan) 및 가교제가 결합된 화합물이다.

히알루론산은 피부 내에 광범위하게 분포되어 있는 천연 뮤코다당류이며, 생체적합성이 뛰어나고 생체내 분해성을 가지고 있는 물질로, 가교에 의해 3차원 망상구조인 하이드로겔을 형성하여 요즘 피부 볼륨을 유지시키기 위한 성형 보형물로써 많이 이용되고 있는 FDA 승인을 받은 물질로 화학식 5로 나타낼 수 있다.

풀루란은 흑효모라고 불리우는 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) 균주가 세포외로 생산하는 수용성 다당류이다. 풀루란은 주로 3개의 글루코스가 α-1,4 결합된 말토트리오스가 α-1, 6결합으로 반복 결합된 직쇄상의 글루칸이며, 풀루란은 무미무취하고 부정형의 백색분말로 각종 독성, 변이원성 시험결과에 아무 문제가 없으며, 화학적으로 합성된 일반 고분자 재료와는 달리 장내세균의 풀루라네이즈나 아이소풀루라네이즈 등에 의해 쉽게 생분해되어 포도당으로 바뀌는 무독성 고분자이다.

레티노익산은 비타민 A 유도체로서 레티노이드(Retinoids)의 일종으로 콜라겐을 분해하는 효소인 MMPs를 감소시키고, 섬유모세포(Fibroblast)의 성장을 증진시켜 새로운 콜라겐을 합성하여 자외선으로 인한 피부손상을 치료하는 물질로 사용되며, 화학식 3으로 표시될 수 있다.

풀루란은 수용성 천연 고분자로서 다수의 히드록시기를 포함하고 있어 반응성이 좋으므로 촉매제에 의해 활성화되어 레티노익산의 카르복실기와 에스테르 결합에 의해 화학식 4의 풀루란-레티노익산 접합체를 형성할 수 있다.

본 발명에 따라 히알루론산, 레티노익산, 풀루란(pullulan) 및 가교제가 결합된 히알루로산계 화합물(1)은 풀루란과 레티노익산이 에스테르 결합으로 접합된 풀루란-레티노익산 접합체의 메탄올기와 히알루론산의 메탄올기가 가교제에 의한 에테르 결합에 의해 가교된 화합물이다.

레티노익산은 많은 양이 접합하게 되면 독성을 가질 수 있기 때문에 소량을 접합시키는 것이 바람직하다. 바람직한 접합 정도는 약 609개 글루코오스링당 레티노익산 2개를 접합하는 것이다.

본 발명에서 사용하기에 바람직한 가교제는 다작용기 에폭시 화합물 또는 디비닐설폰 화합물이며, 이러한 가교제는 당 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어 다작용기 에폭시 화합물로는 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether; BDDE), 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르(ethylene glycol diglycidyl ether)EGDGE), 1,6-헥산디올 디글리시딜 에테르, 폴리에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르, 폴리프로필렌 글리콜 디글리시딜 에테르, 폴리테트라메틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르, 네오펜틸 글리콜 디글리시딜 에테르, 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르, 디글리세롤 폴리글리시딜 에테르, 글리세롤 폴리글리시딜 에테르, 트리-메틸올프로판 폴리글리시딜 에테르, 펜타에리트리톨 폴리글리시딜 에테르, 소르비톨 폴리글리시딜 에테르 등이 있다. 이러한 다작용기 에폭시 화합물중 특히 바람직한 것은 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르이다.

본 발명에 따르는 히알루로산계 화합물(1)을 함유하는 연조직 충전재는 기존의 가교결합된 히알루론산 겔을 이용한 연조직 충전재에 비해 생분해속도가 길고 레티노익산 성분이 콜라겐 생성능을 제공하여 충전재가 생분해되더라도 생성된 콜라겐이 피부를 유지해주어 적용된 연조직에 다시 충전재를 주입할 필요가 크게 줄어든다.

본 발명에 따르는 화학식 1의 히알루론산계 화합물은 바람직하게 치환된 또는 치환되지 않은 화학식 2의 구조를 갖는 풀루란과 화학식 3의 구조를 갖는 레티노익산 간의 에스테르결합에 의해 화학식 4의 풀루란-레티노익산 접합체를 제조하는 단계; 및 화학식 4의 풀루란-레티노익산 접합체, 치환된 또는 치환되지 않은 화학식 5의 히알루론산 및 가교제를 반응시켜 상기 접합체의 메탄올기와 상기 히알루론산의 메탄올기를 상기 가교제에 의한 에테르 결합으로 가교하는 단계를 거쳐 제조할 수 있다.

상기 풀루란과 레티노익산은 유기용매 중에 용해하여 반응시키는 것이 바람직하다. 상기 유기용매로는 풀루란 및 레티노익산의 에스테르 결합 형성에 의한 풀루란-레티노익산 접합체의 형성을 방해하지 않는다면, 풀루란 및 레티노익 산을 모두 용해할 수 있는 임의의 유기용매를 사용할 수 있다. 특별히 제한하기 위한 것은 아니지만, 이러한 유기용매의 바람직한 예로는 디메틸설폭사이드(DMSO)가 있다.

예를 들어 풀루란-레티노익산 접합체, 히알루론산 및 가교제를 반응시킬 때에는 상기 풀루란-레티노익산 접합체의 용액을 히알루론산 용액과 혼합하고 가교제를 첨가하여 약 37℃에서 4~15시간 반응시켜 겔을 형성하는 것이 바람직하다.

상기한 가교단계는 풀루란-레티노익산 접합체를 알칼리성 수용액에 용해시키고, 히알루론산 역시 알칼리성 수용액에 용해시켜 메탄올의 히드록시기가 활성화 되도록 하는 것이 바람직하다. 이때 사용되는 알칼리성 수용액의 pH는 8~13가 적당하며, 상기 가교제는 각각의 히드록시기를 에테르결합으로 가교결합시켜 히알루론산을 더욱 견고한 겔로 제조할 수 있다. 또한 가교제의 활성은 25℃~60℃에서 가질 수 있다. 이와 같은 조건으로 제조되는 겔은 알칼리성을 띠기 때문에 pH 적정을 해주는 것이 바람직하다. pH 적정에 사용되는 용매는 pH가 낮은 유기산, 예를 들어 아세틱산(Acetic acid)이 바람직하며, 적정은 pH 7.2 정도가 바람직하다.

본 발명에 따라 히알루로산계 화합물(1)을 함유하는 연조직 충전재는 히알루로산계 화합물(1)을 겔 상태로 함유하는 것이다. 상기 겔은 호모게나이저로 분쇄하여 입자를 작게 만들어 주사제로 제형화하는 것이 바람직하다. 이러한 제형화를 위해서 본 발명의 연조직 충전재는 불활성의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제, 증점제, 유화제, 방부제 및 이들의 혼합물과 같은 첨가제를 포함할 수 있다. 이러한 첨가제의 적절한 예로는 통상적으로 약제학적 및 피부 보호용 제제에 일반적으로 사용되는 제제가 포함된다. 더욱 바람직하게는, 불활성의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제의 예로는 염수 및 정제수가 포함된다. 적절한 증점제에는 아크릴 아마이드 공중합체, 카보머, 하이드록시에틸셀룰로오스, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산 및 폴리비닐알콜이 포함된다. 적절한 유화제에는 카프릴/카프르산 트라이글라이세라이드, 스테아레이트-7, 세틸알콜, 세틸포스페이트, 아이소스테아레이트-11 및 나트륨 아이소스테아레이트가 포함된다. 방부제는 미생물의 공격 및 독성에 대한 내성을 부여한다. 적절한 예로는, 알콜, 임의의 파라벤, 디아졸리디닐 우레아, DMDM 히단토인, 펜옥시에탄올 및 요오도프로비닐 뷰틸카바메이트가 포함된다. 상기에 제시된 것 이외의 첨가제도 당 분야의 숙련자에게 통상적으로 알려진 바와 같이 본 발명에서도 사용될 수 있다.

본 발명에 따르는 연조직 충전재는 자외선으로 인해 생긴 주름에 주입하면 콜라겐 생성에도 도움을 주며, 볼륨감을 줄 수 있게 주름을 채워주는 효과가 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 풀루란-레티노익산 접합체의 합성

풀루란(분자량 100,000 Da, Tokyo Chemical Industry) 1g을 10ml의 디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide)에 넣고 교반하여 용해시키고, 레티노익산 3mmole과 N,N'-디싸이클로헥실카르보닐이미드(DCC)와 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)을 각각6mmole의 농도로 디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide) 5ml에 6시간동안 용해시켜 반응을 시킨 뒤, 레티노익산이 용해된 5ml의 디메틸설폭사이드(Dimethyl Sulfoxide) 용액을 한방울씩 용해된 풀루란에 적하하여 24시간 동안 반응을 수행한 후 증류수로 3일간 투석(Dialylsis membrane with MWCO 10,000 Da)하여 미반응된 레티노익산을 제거한 후 동결건조 하여 풀루란-레티노익산의 합성반응물(풀루란-레티노익산 접합체)을 수득하였다.

실시예 2: 풀루란-레티노익산 접합체의 합성 검증

상기 실시예 1에서 제조된 풀루란-레티노익산 접합체가 제대로 합성되었는지 확인하기 위하여 자외-가시선 스펙트럼-흡수 분광법 (Uv-Vis spectroscopy)를 통해 확인하였다. 그 결과는 표 1에 제시된다. 표 1로부터 풀루란-레티노익산 접합체의 합성비율을 알 수 있다.

표 1

Code name	풀루란에 결합된 레티노익 산 양
Pullulan-Retinoic acid2(PR2)	2.13

실시예 3: 풀루란-레티노익산/히알루론 산 겔 형성

상기 실시예 1에서 제조한 풀루란-레티노익산 접합체를 히알루론산에 결합시키기 위하여 BDDE(1,4 Butanediol Diglycidyl Ether)를 가교제로 사용한다. 히알루론산과 풀루란-레티노익산 접합체의 비율은 100:0, 98:2, 90:10(w/v%)의 비율로 하였다. 10%의 히알루론산(HA,330kDa)을 0.2N의 수산화나트륨 용액에 용해시킨 후 10%의 풀루란유도체-레티노익산 접합체를 0.2N 수산화나트륨 용해시켰다. 풀루란-레티노익산 접합체를 히알루론산이 용해된 튜브에 적하하여 보르텍싱(voltexing)을 통해 충분히 섞이도록 한 뒤, 가교제인 BDDE를 히알루론산과 1:1(HA:BDDE)의 몰비로 첨가하여 충분히 보르텍싱(voltexing)을 시켰다. 이 물질을 37℃ 인큐베이터에서 4~15시간동안 반응을 시킨뒤, PBS로 투석 또는 아세틱산으로 중성화를 시켜주면서 충분히 부풀도록 한 뒤 호모게나이저로 겔을 깨뜨려 작은 입자를 형성하도록 하였다.

상기 실시예 1 및 3의 반응을 통합하여 반응식으로 나타내면 다음과 같다.

실험예 1: 가교된 풀루란-레티노익산/히알루론산 겔(화학식 1)의 점도 측정

상기 실시예 3에서 제조한 겔을 DV-Ⅱ+P점도계를 이용하여 0.025s¹의 전단율에 따라 점도를 측정하였다. 그 결과는 도1 에서와 같이 가교제를 넣기 전에는 점도가 150,000cp 이하로 점도가 낮았지만 가교제를 넣었을 때 점도가 7,000,000cp이하로 점도가 높아졌다. 가교된 히알루론산/풀루란-레티노익산 겔은 히알루론산만으로 겔을 제조한 것보다 점도가 높았고, 98:2의 비율의 겔이 90:10 비율의 겔 보다 점도가 높은 것을 확인하였다.

실험예 2: 가교된 풀루란-레티노익산/히알루론산 겔(화학식 1)의 분해능 측정

상기 실시예 3에서 제조한 겔 중 98:2가 콜라겐 형성에 도움을 주는 1㎍의 양이 있는 겔이므로 하나의 겔을 선택하여 히알루로니다아제를 40Unit/ml를 적용시켜 1,3,5,7일정도 분해능을 측정한 결과, 도 2에서와 같이 가교된 히알루론산 겔보다 가교화시킨 히알루론산/풀루란-레티노익산 겔이 더 천천히 분해됨을 확인하였다.

Claims

치환된 또는 치환되지 않은 화학식 1의 구조를 갖는 히알루로산계 화합물:

화학식 1

위 식에서, n은 반복단위로서 정수이고, X는 가교제의 잔기임.
제 1 항에 있어서, 상기 X는 다작용기 에폭시 화합물 또는 디비닐설폰 화합물의 잔기인 것을 특징으로 하는 치환된 또는 치환되지 않은 화학식 1의 구조를 갖는 히알루로산계 화합물.
치환된 또는 치환되지 않은 화학식 1의 구조를 갖는 히알루로산계 화합물을 제조함에 있어서,

치환된 또는 치환되지 않은 화학식 2의 구조를 갖는 풀루란과 화학식 3의 구조를 갖는 레티노익산 간의 에스테르결합에 의해 화학식 4의 풀루란-레티노익산 접합체를 제조하는 단계; 및

화학식 4의 풀루란-레티노익산 접합체, 치환된 또는 치환되지 않은 화학식 5의 히알루론산 및 가교제를 반응시켜 상기 접합체의 메탄올기와 상기 히알루론산의 메탄올기를 상기 가교제에 의한 에테르 결합으로 가교하는 단계;를 포함하는 치환된 또는 치환되지 않은 화학식 1의 구조를 갖는 히알루로산계 화합물의 제조방법:

화학식 2

화학식 3

화학식 4

화학식 5

위 식 2, 4 및 5에서 n, m은 반복단위로서 정수임.
제 3항에 있어서, 상기 풀루란과 레티노익산은 유기용매 중에 용해하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 치환된 또는 치환되지 않은 화학식 1의 구조를 갖는 히알루로산계 화합물의 제조방법.
제 3 항에 있어서, 상기 풀루란-레티노익산 접합체의 용액을 히알루론산 용액과 혼합하고 가교제를 첨가하여 37℃에서 반응시켜 겔을 형성하는 것을 특징으로 하는 치환된 또는 치환되지 않은 화학식 1의 구조를 갖는 히알루로산계 화합물의 제조방법.
제 5 항에 있어서, 상기 겔을 중성으로 적정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 치환된 또는 치환되지 않은 화학식 1의 구조를 갖는 히알루로산계 화합물의 제조방법.
제 3 항에 있어서, 상기 풀루란-레티노익산 접합체는 플루란의 609개 글루코오스링 당 레티노익산 2개가 에스테르결합된 것임을 특징으로 하는 치환된 또는 치환되지 않은 화학식 1의 구조를 갖는 히알루로산계 화합물의 제조방법.
제 3항에 있어서, 상기 가교제가 다작용기 에폭시 화합물 또는 디비닐설폰 화합물인 것을 특징으로 하는 치환된 또는 치환되지 않은 화학식 1의 구조를 갖는 히알루로산계 화합물의 제조방법.
청구항 1 기재의 히알루로산계 화합물을 함유하는 인체 연조직 충전재.