KR100507545B1 - 히알루론산 유도체 및 그의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 글리콜 고분자가 아미드 결합에 의해 히알루론산에 결합되어 있는 히알루론산 유도체, 즉, 자유아민기가 한쪽 또는 양쪽 말단에 도입된 글리콜 고분자가 아미드 결합에 의해 히알루론산에 직접 연결되어 있거나, 또는 키토산을 경유하여 히알루론산에 결합되어 있는 히알루론산 유도체와 그것의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 히알루론산 유도체는 우수한 생체적합성과 매우 높은 점탄성을 가지며 아미드 결합의 구조를 가지므로, 젤, 필름, 실은 유착방지용 젤, 주름살 치료제, 성형보조물, 관절염 치료용 삽입물, 약물 전달체 등 다양한 용도로 사용될 수 있다.

Description

히알루론산 유도체 및 그의 제조방법 {HYALURONIC ACID DERIVATIVES AND PROCESSES FOR PREPARING THEM}

본 발명은 글리콜 고분자가 아미드 결합에 의해 히알루론산에 결합되어 있는 히알루론산 유도체 및 그것의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 자유아민기가 한쪽 또는 양쪽 말단에 도입된 글리콜 고분자가 아미드 결합에 의해 히알루론산에 직접 연결되어 있거나, 또는 키토산을 경유하여 히알루론산에 결합되어 있는 히알루론산 유도체와 그것의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 히알루론산 유도체는 젤, 주름살 치료용 삽입물, 성형보조물, 관절염 치료용 삽입물, 약물 전달체 등의 다양한 생체적합성 소재로 사용될 수 있다.

히알루론산(이하에서는, 때때로 "HA"로 약침함)은, 하기 화학식 1에서와 같이, N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 생체 고분자 물질로, 안구의 유리액, 관절의 활액, 닭벼슬 등에 많이 존재한다.

상기 식에서, n 은 1 또는 그 이상의 정수이다.

히알루론산 유도체는 수술후 유착방지용 필름 또는 젤, 주름살 치료용 삽입물, 성형 보조물, 관절염 치료용 삽입물, 약물 전달체 등 여러 가지 용도로 개발되고 있다. 특히, 히알루론산 유도체 젤은 그 독특한 유변 물성으로 인하여 여러 응용 분야에서 관심이 집중되고 있다. 미국특허 제5,356,883호는 다양한 카르보디이미드를 사용하여 O-아실우레아나 N-아실우레아로 카르복시기가 변형된 히알루론산 유도체 젤의 합성예를 개시하고 있다. 또한, 미국특허 제5,827,937호는 두 단계의 가교반응에 의해 가교화된 다당류 젤의 합성예를 개시하고 있고, 미국특허 제5,399,351호에서는 다양한 유변 물성의 젤의 제조에 대해 개시하고 있다.

그러나, 이들 특허들에 개시되어 있는 히알루론산 유도체는 높은 점탄성을 가지고 있지 못하다.

따라서, 본 발명의 목적은 종래에 알려져 있는 히알루론산 유도체와 화학적 구조가 전혀 다르면서 높은 점탄성을 나타내는 히알루론산 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 이러한 히알루론산 유도체를 간단한 과정에 의해 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 이러한 히알루론산 유도체의 생체적합성 소재로서의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따른 히알루론산 유도체는 글리콜 고분자가 아미드 결합에 의해 히알루론산에 결합되어 있는 구조로 되어 있다.

본 발명에서의 상기 히알루론산은 히알루론산 자체와 그것의 염을 모두 포함하는 개념이므로, 본 발명에서의 용어 "히알루론산"은 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산과 히알루론산의 혼합물을 의미한다. 상기 히알루론산 염에는, 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등과 같은 무기염과, 히알루론산 테트라부틸암모늄 등과 같은 유기염이 모두 포함된다. 경우에 따라서는, 이들의 둘 또는 그 이상의 조합이 사용될 수도 있다. 본 발명에서 히알루론산의 분자량은 특별히 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 100,000 내지 10,000,000이다.

상기 글리콜 고분자는 분자쇄의 양 말단에 수산기(-OH)를 가지고 있는 고분자로서, 본 발명에 사용될 수 있는 바람직한 글리콜 고분자로는 폴리에틸렌글리콜과, 폴리에틸렌글리콜 및 폴리프로필렌글리콜의 블록 공중합체(일명, 플루로닉(Pluronic))를 들 수 있다. 폴리에틸렌글리콜과 플루로닉은 독성이 없고 용해도가 우수하기 때문에 히알루론산 유도체의 안정성을 향상시키는데 기여한다.

본 발명에 따른 히알루론산 유도체는 이러한 글리콜 고분자가 아미드 결합에 의해 히알루론산 또는 그것의 염에 결합되어 있다. 히알루론산은, 상기 화학식 1에서 보는 바와 같이, 분자쇄 중에 카르복실기(-COOH)를 가지고 있고, 글리콜 고분자는 양쪽 말단에 수산기(-OH)를 가지고 있으므로, 근본적으로 아미드 결합(-CONH-)을 형성할 수 없다. 그러나, 이후 제조방법에서 설명하는 바와 같이, 본 발명에서는 글리콜 고분자의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단의 수산기를 활성화시켜 자유아민기를 도입하고, 그러한 자유아민기가 히알루론산의 카르복실기와 아미드 결합을 형성한다.

본 발명에 따른 히알루론산 유도체는 유착방지용 젤, 주름살 치료용 삽입물, 성형보조물, 관절염 치료용 삽입물, 약물전달체 등 다양한 용도에 사용될 수 있고, 젤, 필름, 실 등과 같이 용도에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 히알루론산 유도체 젤은 점탄성이 매우 우수하여 관절염 치료용 삽입물 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 히알루론산 유도체는 히알루론산과 글리콜 고분자가 아미드 결합(공유 결합)으로 연결되어 있으므로, 생체내 여러 조건에서도 견딜 수 있는 특징을 가지며, 카르보디이미드를 이용한 종래의 히알루론산 유도체와는 전혀 다른 물성을 가진 새로운 생체 소재이다.

본 발명에 따른 히알루론산 유도체의 바람직한 예로는, 글리콜 고분자의 양쪽 말단에 각각 히알루론산이 아미드 결합되어 있는 구조로서, 하기 화학식 2와 3의 유도체를 들 수 있다.

상기 식에서, m, n, x, y 및 z 는 각각 1 또는 그 이상의 정수로서, n>z>y>x 의 조건을 만족한다.

상기 식에서, a, b, n, x, y 및 z 는 각각 1 또는 그 이상의 정수로서, n>z>y>x 의 조건을 만족한다.

화학식 2의 히알루론산 유도체는 글리콜 고분자로서 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 [히알루론산-폴리에틸렌글리콜-히알루론산]의 골격을 가지고 있고, 화학적 3의 히알루론산 유도체는 글리콜 고분자로서 플루로닉을 포함하는 [히알루론산-(폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜)-히알루론산]의 골격을 가지고 있다. 앞서의 설명과 같이, 히알루론산과 글리콜 고분자의 연결은 아미드 결합으로 이루어져 있다.

본 발명의 히알루론산 유도체는, 글리콜 고분자가 히알루론산에 아미드 결합에 의해 직접적으로 결합되어 있는 경우뿐만 아니라, 키토산을 경유하여 간접적으로 결합되어 있는 경우도 포함한다. 즉, 히알루론산과 글리콜 고분자 사이에 키토산이 위치하는 유도체들을 포함한다. 이 경우에도, 글리콜 고분자가 연결되어 있는 키토산과 히알루론산의 연결은 아미드 결합으로 이루어져 있다. 그러한 바람직한 예로서, 하기 화학식 4와 5의 히알루론산 유도체를 들 수 있다.

상기 식에서, a, l, m, n, x 및 y 는 각각 1 또는 그 이상의 정수로서, m>l 및 n>x>y 의 조건을 만족한다.

상기 식에서, a, b, l, m, n, x 및 y 는 각각 1 또는 그 이상의 정수로서, m>l 및 n>x>y 의 조건을 만족한다.

화학식 4의 히알루론산 유도체는 글리콜 고분자로서 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 [히알루론산-키토산-폴리에틸렌글리콜]의 골격을 가지고 있고, 화학적 5의 히알루론산 유도체는 글리콜 고분자로서 플루로닉을 포함하는 [히알루론산-키토산-(폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜)]의 골격을 가지고 있다. 키토산을 경유하여 글리콜 고분자가 히알루론산에 연결되어 있는 화학식 4와 5의 히알루론산 유도체에 있어서, 글리콜 고분자와 키토산의 연결은 우레탄 결합(-NHC(=O)O-)으로 이루어져 있지만, 궁극적으로 히알루론산에 결합되는 부위, 즉, 히알루론산과 키토산의 연결은 아미드 결합(-NHC(=O)-)으로 이루어져 있다.

상기 키토산은 히알루론산 유도체의 점탄성을 향상시키는 역할을 한다. 본 발명에서의 키토산은 키토산 자체와 그것의 올리고머를 모두 포함하는 개념이며, 그것의 분자량은 특별히 제한되는 것은 아니며 바람직하게는 10,000 내지 1,000,000이다.

본 발명은 또한, 아미드 결합에 의해 히알루론산에 글리콜 고분자가 결합되어 있는 히알루론산 유도체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 히알루론산 유도체의 제조방법은, 글리콜 고분자가 직접 히알루론산에 연결되어 있는 구조의 유도체(Ⅰ)(예를 들어, 화학식 2와 3의 유도체)와, 글리콜 고분자가 키토산을 경유하여 히알루론산에 연결되어 있는 구조의 유도체(Ⅱ)(예를 들어, 화학식 4와 5의 유도체)에서 서로 다르다.

우선, 글리콜 고분자가 직접 히알루론산에 연결되어 있는 구조의 유도체(Ⅰ)를 제조하는 방법은,

(A) 글리콜 고분자의 한쪽 또는 양쪽 말단에 자유아민기를 도입하는 단계; 및

(B) 상기 자유아민기가 도입된 글리콜 고분자를 히알루론산과 아미드화 반응을 행하는 단계;

를 포함하는 것으로 구성되어 있다.

상기 단계(A)에서, 글리콜 고분자의 말단(한쪽 또는 양쪽 말단)에 자유아민기의 도입은,

(a) 글리콜 고분자의 한쪽 또는 양쪽 말단을 활성화시키는 단계; 및

(b) 활성화된 글리콜 고분자를 디아민 화합물과 반응시키는 단계;

를 포함하는 것으로 구성된 방법에 의해 실행될 수 있다.

상기 단계(a)에서의 활성화는, 단계(b)에서 디아민 화합물과의 반응에 의해 글리콜 고분자의 말단에 자유아민기가 도입될 수 있는 상태로 변화시키는 것으로서, 예를 들어, 하기 화학식 6 또는 7에서와 같은 구조를 가지는 활성화된 글리콜 고분자를 제조하는 것이다. 자유아민기를 글리콜 고분자의 양쪽 말단에 도입하는 경우에는, 당연히 하기 화학식 6 또는 7이 각각 대칭적인 구조를 가지도록 단계(a)에서 활성화된 글리콜 고분자를 제조한다.

상기 화학식 6과 7에서, R1 과 R2 는 각각, HO-PEG-CH2CH2O-, HO-PEG-CH2CH2CH2O-, HO-PEG-CONH(CH2)5O-, HO-PEG-S-OCH 2CH2O-, HO-PEG-S-CH2CH2O-, HO-PEG-NHCOCH2CH2O-, HO-PEG-CO(CH2)3O-, HO-PEG-COCH2CH 2O-, HO-PEG-, HO-PEG-CH2O-, MeO-PEG-CH2CH2O-, MeO-PEG-CH2CH2CH2O-, MeO-PEG-CONH(CH 2)5O-, MeO-PEG-S-OCH2CH2-, MeO-PEG-S-CH2CH2O-, MeO-PEG-NHCOCH2CH2O-, MeO-PEG-CO(CH2 )3O-, MeO-PEG-COCH2CH2O-, MeO-PEG-, MeO-PEG-CH2O-, HO-PLU-CH2CH2O-, HO-PLU-CH2CH2 CH2O-, HO-PLU-CONH(CH2)5O-, HO-PLU-S-OCH2CH2O-, HO-PLU-S-CH2CH 2O-, HO-PLU-NHCOCH2CH2O-, HO-PLU-CO(CH2)3O-, HO-PLU-COCH2CH2-, HO-PLU-, HO-PLU-CH2 O-, MeO-PLU-CH2CH2O-, MeO-PLU-CH2CH2CH2O-, MeO-PLU-CONH(CH2)5O-, MeO-PLU-S-OCH 2CH2O-, MeO-PLU-S-CH2CH2O-, MeO-PLU-NHCOCH2CH2O-, MeO-PLU-CO(CH2)3O-, MeO-PLU-COCH2 CH2-, MeO-PLU- 또는 MeO-PLU-CH2O- 이고, 여기서, PEG 는 -(CH2CH2O)n- 이고 (n 은 1 이상의 정수), PLU 는 -(CH2CH2O)a-(CH2CH(CH3)O)b-(CH2 CH2O)c- 이며(a, b, c 는 각각 1 이상의 정수), Me 는 메틸기이다.

활성화된 글리콜 고분자의 합성방법의 예들이 이후 설명하는 실시예 1 내지 4에 설명되어 있다.

상기 단계(a)에서 얻어진 활성화된 글리콜 고분자의 예로는 하기 화학식 8 내지 10의 고분자를 들 수 있다.

상기 화학식 8 내지 10에서 분자쇄의 반복단위인 a, b, n, x 및 y 는 각각 1 또는 그 이상의 정수이다.

화학식 8의 고분자는 글리콜 고분자로서 폴리에틸렌글리콜의 양쪽 말단이 활성화되어 있고, 화학식 9의 고분자는 글리콜 고분자로서 플루로닉의 한쪽 말단이 활성화되어 있으며, 화학식 10의 고분자는 글리콜 고분자로서 플루로닉의 양쪽 말단이 각각 활성화되어 있다.

화학식 8에서와 같이, 양쪽 말단이 활성화된 폴리에틸렌글리콜의 바람직한 분자량은 1,000 내지 40,000이며, 화학식 10에서와 같이, 양쪽 말단이 활성화된 플루로닉의 경우 바람직한 분자량은 5,000 내지 50,000이다.

상기 단계(b)에서 활성화된 글리콜 고분자를 디아민 화합물과 반응시키면 치환반응에 의해 자유아민기를 가지는 글리콜 고분자가 얻어진다. 상기 디아민 화합물은 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, 에틸렌디아민, 프로필렌디아민, 이소프로필렌디아민, 부틸렌디아민 등을 포함하며, 그 중에서도 에틸렌디아민이 특히 바람직하다. 하기 화학식 11과 12에는 각각, 상기 화학식 8과 10의 활성화된 글리콜 고분자에 에틸렌디아민 화합물을 치환반응시켜 양쪽 말단에 자유아민기를 가지는 글리콜 고분자들의 예가 개시되어 있다.

활성화된 글리콜 고분자의 한쪽 또는 양쪽 말단에 자유아민기를 도입하는 예시적인 방법들이, 이후 설명하는 실시예 5 내지 8에 설명되어 있다.

이렇게 자유아민기가 도입된 글리콜 고분자를 히알루론산과 아미드화 반응을 시키면(단계(B)), 글리콜 고분자가 아미드 결합에 의해 히알루론산이 직접 연결되는 히알루론산 유도체(Ⅰ)가 제조된다.

적정한 가교반응을 유도하기 위하여, 아미드화 반응에서 히알루론산의 농도는 0.01 내지 100 ㎎/㎖인 것이 바람직하고, 자유아민기가 도입된 글리콜 고분자와 히알루론산의 혼합비는 1 : 100 내지 100 : 1(히알루론산의 카르복실기 : 글리콜 고분자의 자유아민기)의 비인 것이 바람직하다.

히알루론산은, 앞서 설명한 바와 같이, 분자쇄 중에 카르복실기를 포함하고 있으며, 자유아민기와의 반응에 의해 아미드 결합을 이룰 수 있다. 상기 아미드화 반응은, 히알루론산의 카르복실기를 활성화시켜 행해질 수도 있는데, 이러한 활성화는 카르복실기 활성화제를 반응액에 첨가함으로써 달성될 수 있다. 그러한 카르복실기 활성화제의 예로는 카르보디이미드(carbodiimide)계 화합물을 들 수 있으며, 그것의 바람직한 예로는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC), 1-에틸-3-(3-(트리메틸암모니오)프로필) 카르보디이미드(ETC), 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸) 카르보디이미드(CMC) 등을 들 수 있다. 그 중에서도 EDC가 특히 바람직하다.

바람직하게는, 상기 카르복실기 활성화제와 함께 활성반응 보조제를 사용할 수 있다. 상기 활성반응 보조제의 바람직한 예로는 N-히드록시석신이미드(NHS), 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(HOOBt), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt), N-히드록시-설포석신이미드(Sulfo-NHS) 등을 들 수 있다. 그 중에서도 NHS가 특히 바람직하다.

활성화제와 활성반응 보조제의 첨가량은 이들의 활성도, 히알루론산의 농도 등 여러 요인들에 의해 결정될 수 있으며, 예를 들어, 0.0001 내지 100 ㎎/㎖의 EDC와 0.00001 내지 100 ㎎/㎖의 NHS를 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명에서의 반응은 0 내지 40℃, 바람직하게는 실온에서, pH 2 내지 8로 0.5 내지 20 시간 동안 행할 수 있다.

다음으로, 글리콜 고분자가 키토산을 경유하여 히알루론산에 연결되어 있는 구조의 유도체(Ⅱ)를 제조하는 방법은,

(A1) 글리콜 고분자의 한쪽 말단에 자유아민기를 도입하는 단계;

(B1) 상기 자유아민기가 도입된 글리콜 고분자를 키토산과 반응시켜 키토산-글리콜 고분자 결합체를 제조하는 단계; 및

(C1) 상기 키토산-글리콜 고분자 결합체를 히알루론산과 아미드화 반응을 행하는 단계;

를 포함하는 것으로 구성되어 있다.

상기 단계(A1)에서의 자유아민기 도입 방법은, 글리콜 고분자의 한쪽 말단에만 자유아민기를 도입한다는 것을 제외하고는, 히알루론산 유도체(Ⅰ)의 제조방법에서의 단계(A)와 동일하다.

상기 단계(B1)에서의 키토산-글리콜 고분자 결합체의 제조는 치환반응에 의해 이루어지며, 하기 화학식 13과 14에는, 글리콜 고분자로서 폴리에틸렌글리콜과 플루로닉을 각각 사용한 상기 결합체들의 예가 개시되어 있다.

상기 화학식 13과 14에 있어서, a, b, m, n, x 및 y 는 1 또는 그 이상의 정수로서, n>x>y 의 조건을 만족한다.

키토산-글리콜 고분자 결합체를 제조함에 있어서, 키토산과 활성화된 글리콜 고분자의 혼합비는 1 : 100 내지 100 : 1(키토산의 아민기 : 글리콜 고분자의 반응기)인 것이 바람직하다.

키토산-글리콜 고분자 결합체의 제조방법의 예들이, 이후 설명하는 실시예 15 내지 18에 설명되어 있다.

상기 단계(C1)에서의 아미드화 반응은, 키토산과 히알루론산의 아미드화 반응이라는 점을 제외하고는, 히알루론산 유도체(Ⅰ)의 제조방법의 단계(B)에서의 아미드화 반응과 동일하다.

경우에 따라서는 상기 단계(C1)에서 아미드화 반응을 행하여 얻어진 히알루론산 유도체(Ⅱ)를 젤, 필름, 실 등과 같은 일정한 형태로 만든 다음, 잔류 카르복실기 및 아민기에 대해 추가적인 아미드화 반응을 행할 수도 있다. 이는 히알루론산 유도체(Ⅰ)의 경우에도 마찬가지이다.

본 발명에 따른 제조방법들의 각 반응단계에서의 생성물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 의하여 반응계로부터 분리 및/또는 정제될 수 있다. 분리 및 정제방법의 예로는, 증류(대기압하 증류 및 감압증류를 포함), 재결정, 칼럼 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 상 분리, 용매 추출, 투석, 세척 등을 들 수 있다. 정제는 각 반응단계마다 또는 일련의 반응단계들 이후에 수행할 수 있다.

또한, 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위내에서, 공정의 효율성 및 수율의 향상을 위하여, 상기 공정들의 일부가 변형되거나 기타 제조공정들이 포함될 수 있으며, 이들은 모두 본 발명에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명에 따른 히알루론산 유도체의 합성에 필요한 원료물질 및 시약은 문헌의 방법에 의해 또는 전술한 방법에 의해 용이하게 제조 가능하거나, 상업적으로 구입 가능하다.

이하, 실시예를 참조하여 본 발명의 내용을 상세히 설명하지만, 본 발명의 범주가 그것에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 폴리에틸렌글리콜의 활성화 - 1

폴리에틸렌글리콜(분자량: 2,000)을 100 ㎎/㎖의 농도로 용매인 염화메틸렌 30 ㎖에 용해시켰다. 여기에, 중화제인 트리에틸아민 607.2 ㎕을 넣은 다음, 4-니트로페닐 클로로포메이트를 40.3 ㎎/㎖의 농도로 첨가하였다. 실온에서 24 시간 동안 반응시킨 후, 반응물을 빈용매(poor solvent)인 n-핵산에 넣어 침전시키고, 침전물을 분리한 후 여러 차례 빈용매로 세척하였다. 침전물은 질소가스로 3 일간 건조시켰다(4.0956g, 수율: 97.3%).

[실시예 2] 폴리에틸렌글리콜의 활성화 - 2

폴리에틸렌글리콜(분자량: 5,000)을 100 ㎎/㎖의 농도로 용매인 염화메틸렌 30 ㎖에 용해시켰다. 여기에, 중화제인 트리에틸아민 379.5 ㎕을 넣은 후, 4-니트로페닐 클로로포메이트를 25.19 ㎎/㎖의 농도로 첨가하였다. 실온에서 24 시간 동안 반응시킨 후, 반응물을 빈용매인 n-핵산에 넣어 침전시키고, 침전물을 분리한 후 빈용매로 여러 차례 세척하였다. 침전물은 질소가스로 3 일간 건조시켰다(3.6881g, 수율: 98.2%).

[실시예 3] 폴리에틸렌글리콜의 활성화 - 3

폴리에틸렌글리콜(분자량: 8,000)을 100 ㎎/㎖의 농도로 용매인 염화메틸렌 30 ㎖에 용해시켰다. 여기에, 중화제인 트리에틸아민 151.8 ㎕을 넣은 후, 4-니트로페닐 클로로포메이트를 10.08 ㎎/㎖의 농도로 첨가하였다. 실온에서 24 시간 동안 반응시킨 후, 반응물을 빈용매인 n-핵산에 넣어 침전시키고, 침전물을 분리한 후 빈용매로 여러 차례 세척하였다. 침전물은 질소가스로 3 일간 건조시켰다(3.2390g, 수율: 98.08%).

[실시예 4] 플루로닉의 활성화

플루로닉 F127(분자량: 12,600)을 100 ㎎/㎖의 농도로 용매인 염화메틸렌 30 ㎖에 용해시켰다. 여기에, 중화제인 트리에틸아민 192.9 ㎕을 넣은 후, 4-니트로페닐 클로로포메이트를 12.8 ㎎/㎖의 농도로 첨가하였다. 실온에서 24 시간 동안 반응시킨 후, 반응물을 빈용매인 n-핵산에 넣어 침전시키고, 침전물을 분리한 후 빈용매로 여러 차례 세척하였다. 침전물은 질소가스로 3 일간 건조시켰다(3.190g, 수율: 94.27%).

[실시예 5] 폴리에틸렌글리콜의 아민기 도입 - 1

실시예 1에서 제조한 활성화된 폴리에틸렌글리콜(분자량: 2,000)을 50 ㎎/㎖의 농도로 용매인 염화메틸렌 20 ㎖에 용해시켰다. 여기에, 에틸렌디아민 240 ㎕을 넣고, 실온에서 24 시간 동안 반응시켰다. 반응액을 빈용매인 n-핵산에 넣어 침전시키고, 침전물을 분리한 후 빈용매로 여러 차례 세척하였다. 침전물(912.7 ㎎, 수율: 73.58%)을 질소가스로 3 일간 건조시켰다. 건조 후 다시 물에 녹여 컷-오프가 1,000 정도인 투석막을 이용하여 2 일간 투석하였다. 투석 후 질소가스로 1 일간 건조시켰다.

[실시예 6] 폴리에틸렌글리콜의 아민기 도입 - 2

실시예 2에서 제조한 활성화된 폴리에틸렌글리콜(분자량: 5,000)을 50 ㎎/㎖의 농도로 용매인 염화메틸렌 20 ㎖에 용해시켰다. 여기에, 에틸렌디아민 96.16 ㎕을 넣고, 실온에서 24 시간 동안 반응시켰다. 반응액을 빈용매인 n-핵산에 넣어 침전시키고, 침전물을 분리한 후 빈용매로 여러 차례 세척하였다. 침전물(899.9 ㎎, 수율:82.10%)은 질소가스로 3 일간 건조시켰다. 건조 후 다시 물에 녹여 컷-오프가 3,500 정도인 투석막을 이용하여 2 일간 투석하였다. 투석 후 질소가스로 1 일간 건조시켰다.

[실시예 7] 폴리에틸렌글리콜의 아민기 도입 - 3

실시예 3에서 제조한 활성화된 폴리에틸렌글리콜(분자량: 8,000)을 50 ㎎/㎖의 농도로 용매인 염화메틸렌 20 ㎖에 용해시켰다. 여기에, 에틸렌디아민 60.1 ㎕을 넣고, 실온에서 24 시간 동안 반응시켰다. 반응물을 빈용매인 n-핵산에 넣어 침전시키고, 침전물을 분리한 후 빈용매로 여러 차례 세척하였다. 침전물(906.9 ㎎, 수율: 85.55%)은 질소가스로 3 일간 건조시켰다. 건조 후 다시 물에 녹여 컷-오프가 6,000 정도인 투석막을 이용하여 2 일간 투석하였다. 투석 후 질소가스로 1 일간 건조시켰다.

[실시예 8] 플루로닉의 아민기 도입

실시예 4에서 제조한 활성화된 플루로닉(분자량: 12,600)을 50 ㎎/㎖의 농도로 용매인 염화메틸렌 20 ㎖에 용해시켰다. 여기에, 에틸렌디아민 56.75 ㎕을 넣고, 실온에서 24 시간 동안 반응시켰다. 빈용매인 n-핵산에 넣어 침전시키고, 침전물을 분리한 후 빈용매로 여러 차례 세척하였다. 침전물은 질소가스로 3 일간 건조시켰다. 건조 후 다시 물에 녹여 컷-오프가 12,000∼14,000 정도인 투석막을 이용하여 2 일간 투석하였다. 투석 후 질소가스로 1 일간 건조하였다(921.3 ㎎, 수율: 88.74%).

[실시예 9] 폴리에틸렌글리콜이 아미드 결합에 의해 히알루론산에 결합된 히알루론산 유도체 젤의 제조 - 1

5.0 ㎎/㎖의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 1,000,000 이상) 수용액 10 ㎖을 제조하였다. 또한, 실시예 6에서 제조한 아민기가 양쪽 말단에 도입된 폴리에틸렌글리콜(분자량: 5,000)을 1.0 ㎎/㎖의 농도로 수용액 5 ㎖을 제조하였다. 상기 히알루론산 나트륨 수용액을 교반시키면서, 상기 아민기가 양쪽 말단에 도입된 폴리에틸렌글리콜 수용액을 첨가하였다. 이를 교반하면서, 0.0588 ㎎/㎖의 농도로 EDC와, 0.0706 ㎎/㎖의 농도로 NHS를 각각 1 ㎖씩 천천히 첨가하였다. 첨가 후 25℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 아세톤에 첨가하여, 아민기가 양쪽 말단에 도입된 폴리에틸렌글리콜과 히알루론산이 결합된 히알루론산 유도체를 침전시켰다. 침전물(52 ㎎, 수율: 94.54%)을 용액에서 분리하여 세척 후 건조하였다. 건조된 히알루론산 유도체에 물을 첨가하여 10 ㎎/㎖의 농도로 만들었을 때, 점탄성이 증가된 수용성 젤이 형성되었다.

[실시예 10] 폴리에틸렌글리콜이 아미드 결합에 의해 히알루론산에 결합된 히알루론산 유도체 젤의 제조 - 2

5.0 ㎎/㎖의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 1,000,000 이상) 수용액 10 ㎖을 제조하였다. 또한, 실시예 6에서 제조한 아민기가 양쪽 말단에 도입된 폴리에틸렌글리콜(분자량: 5,000)을 1.0 ㎎/㎖의 농도로 수용액 5 ㎖을 제조하였다. 상기 히알루론산 나트륨 수용액을 교반하면서, 상기 아민기가 양쪽 말단에 도입된 폴리에틸렌글리콜 수용액을 첨가했다. 이를 교반하면서, 0.1471 ㎎/㎖의 농도로 EDC와, 0.1765 ㎎/㎖의 농도로 NHS를 각각 1 ㎖씩 천천히 첨가하였다. 첨가 후 25℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 아세톤에 첨가하여, 아민기가 양쪽 말단에 도입된 폴리에틸렌글리콜과 히알루론산이 결합한 히알루론산 유도체를 침전시켰다. 침전물(40.3 ㎎, 수율: 73.27%)을 용액에서 분리하여 세척 후 건조하였다. 건조된 히알루론산 유도체에 물을 첨가하여 10 ㎎/㎖의 농도로 만들었을 때, 점탄성이 크게 증가된 수용성 젤이 형성되었다.

[실시예 11] 폴리에틸렌글리콜이 아미드 결합에 의해 히알루론산에 결합된 히알루론산 유도체 젤의 제조 - 3

5.0 ㎎/㎖의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 1,000,000 이상) 수용액 10 ㎖을 제조하였다. 또한, 실시예 6에서 제조한 아민기가 양쪽 말단에 도입된 폴리에틸렌글리콜(분자량: 5,000)을 1.0 ㎎/㎖의 농도로 수용액 5 ㎖을 제조하였다. 상기 히알루론산 나트륨 수용액을 교반시키면서, 상기 아민기가 양쪽 말단에 도입된 폴리에틸렌글리콜 수용액을 첨가하였다. 이를 교반하면서, 0.2941 ㎎/㎖의 농도로 EDC와, 0.3529 ㎎/㎖의 농도로 NHS를 각각 1 ㎖씩 천천히 첨가하였다. 첨가 후 25℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 아세톤에 첨가하여, 아민기가 양쪽 말단에 도입된 폴리에틸렌글리콜과 히알루론산이 결합한 히알루론산 유도체를 침전시켰다. 침전물(47.2 ㎎, 수율: 85.82%)을 용액에서 분리하여 세척 후 건조하였다. 건조된 히알루론산 유도체에 물을 첨가하여 10 ㎎/㎖의 농도로 만들었을 때, 점탄성이 크게 증가된 수용성 젤이 형성되었다.

[실시예 12] 플루로닉이 아미드 결합에 의해 히알루론산에 결합된 히알루론산 유도체 젤의 제조 - 1

5.0 ㎎/㎖의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 1,000,000 이상) 수용액 10 ㎖을 제조하였다. 또한, 실시예 8에서 제조한 아민기가 양쪽 말단에 도입된 플루로닉(분자량: 12,600)을 1.0 ㎎/㎖의 농도로 수용액 5 ㎖을 제조했다. 상기 히알루론산 나트륨 수용액을 교반시키면서, 상기 아민기가 양쪽 말단에 도입된 플루로닉 수용액을 첨가했다. 이를 교반하면서 0.0588 ㎎/㎖의 농도로 EDC와 0.0706 ㎎/㎖의 농도로 NHS를 각각 1 ㎖씩 천천히 첨가하였다. 첨가 후 25℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 아세톤에 첨가하여, 아민기가 양쪽 말단에 도입된 플루로닉과 히알루론산이 결합한 히알루론산 유도체를 침전시켰다. 침전물을 용액에서 분리하여 세척 후 건조하였다. 건조된 히알루론산 유도체(17.9 ㎎, 수율: 32.55%)에 물을 첨가하여 10 ㎎/㎖의 농도로 만들었을 때, 점탄성이 증가된 수용성 젤이 형성되었다.

[실시예 13] 플루로닉이 아미드 결합에 의해 히알루론산에 결합된 히알루론산 유도체 젤의 제조 - 2

5.0 ㎎/㎖의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 1,000,000 이상) 수용액 10 ㎖을 제조하였다. 또한, 실시예 8에서 제조한 아민기가 양쪽 말단에 도입된 플루로닉(분자량: 12,600)을 1.0 ㎎/㎖의 농도로 수용액 5 ㎖을 제조하였다. 상기 히알루론산 나트륨 수용액을 교반하면서, 상기 아민기가 양쪽 말단에 도입된 플루로닉 (분자량: 12,600) 수용액을 첨가하였다. 이를 교반하면서, 0.1471 ㎎/㎖의 농도로 EDC와, 0.1765 ㎎/㎖의 농도로 NHS를 각각 1 ㎖씩 천천히 첨가하였다. 첨가 후 25℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 아세톤에 첨가하여 아민기가 양쪽 말단에 도입된 플루로닉과 히알루론산이 결합한 히알루론산 유도체를 침전시켰다. 침전물을 용액에서 분리하여 세척 후 건조하였다. 건조된 히알루론산 유도체(22.7 ㎎, 수율: 41.27%)에 물을 첨가하여 10 ㎎/㎖의 농도로 만들었을 때, 점탄성이 크게 증가된 수용성 젤이 형성되었다.

[실시예 14] 플루로닉이 아미드 결합에 의해 히알루론산에 결합된 히알루론산 유도체 젤의 제조 - 3

5.0 ㎎/㎖의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 1,000,000 이상) 10 ㎖ 수용액을 제조하였다. 또한, 실시예 8에서 제조한 아민기가 양쪽 말단에 도입된 플루로닉(분자량: 12,600)을 1.0 ㎎/㎖의 농도로 수용액 5 ㎖을 제조하였다. 상기 히알루론산 나트륨 수용액을 교반시키면서, 상기 아민기가 양쪽 말단에 도입된 플루로닉 수용액을 첨가하였다. 이를 교반하면서, 0.2941 ㎎/㎖의 농도로 EDC와, 0.3529 ㎎/㎖의 농도로 NHS를 각각 1 ㎖씩 천천히 첨가하였다. 첨가 후 25℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 아세톤에 첨가하여 아민기가 양쪽 말단에 도입된 플루로닉과 히알루론산이 결합한 히알루론산 유도체를 침전시켰다. 침전물을 용액에서 분리하여 세척 후 건조하였다. 건조된 히알루론산 유도체(28.3 ㎎, 수율: 51.45%)에 물을 첨가하여 10 ㎎/㎖의 농도로 만들었을 때, 점탄성이 증가된 수용성 젤이 형성되었다.

[실시예 15] 키토산-폴리에틸렌글리콜 결합체의 제조 - 1

5.0 ㎎/㎖의 농도로 키토산(분자량: 1,600 이하, 유진바이오) 수용액 20 ㎖을 제조하였다. 또한, 실시예 1 에서 제조한 활성화된 폴리에틸렌글리콜(분자량: 2,000)을 2.353 ㎎/㎖, 4.706 ㎎/㎖ 및 7.059 ㎎/㎖의 농도로 상기 키토산 수용액에 첨가하여 서서히 교반하였다. 첨가 후 25℃에서 24 시간 동안 반응시킨 후, 미반응의 키토산과 활성화된 폴리에틸렌글리콜을 제거하기 위하여, 컷-오프(cut-off)가 6,000 정도인 투석막을 이용하여 2 일간 실온에서 투석하였다. 투석 후 질소가스로 건조하여 키토산과 폴리에틸렌글리콜의 결합체(활성화된 폴리에틸렌글리콜의 농도에 따라 각각 125.4 ㎎, 243.5 ㎎ 및 348.1 ㎎, 수율: 57.62%, 72.62% 및 76.85%)를 얻었다.

[실시예 16] 키토산-폴리에틸렌글리콜 결합체의 제조 - 2

5.0 ㎎/㎖의 농도로 키토산(분자량 : 1,600 이하, 유진바이오) 수용액 20 ㎖을 제조하였다. 또한, 실시예 2에서 제조한 활성화된 폴리에틸렌글리콜(분자량: 5,000)을 각각 5.8825 ㎎/㎖, 11.765 ㎎/㎖ 및 17.6475 ㎎/㎖의 농도로 상기 키토산 수용액에 서서히 첨가하면서 교반하였다. 첨가 후 25℃에서 24 시간 동안 반응시킨 뒤, 미반응의 키토산과 활성화된 폴리에틸렌글리콜을 제거하기 위하여, 컷-오프가 12,000 정도인 투석막을 이용하여 2 일간 실온에서 투석하였다. 투석 후 질소가스로 건조하여, 키토산과 폴리에틸렌글리콜의 결합체(활성화된 폴리에틸렌글리콜의 농도에 따라 각각 118.28 ㎎, 218.5 ㎎ 및 329.4 ㎎, 수율: 54.3%, 62.18% 및 72.72%)를 얻었다.

[실시예 17] 키토산-폴리에틸렌글리콜 결합체의 제조 - 3

5.0 ㎎/㎖의 농도로 키토산(분자량: 1,600 이하, 유진바이오) 수용액 20 ㎖을 제조하였다. 또한, 실시예 3에서 제조한 활성화된 폴리에틸렌글리콜(분자량: 8,000)을 각각 9.412 ㎎/㎖, 18.824 ㎎/㎖ 및 28.236 ㎎/㎖의 농도로 상기 키토산 수용에 첨가하여 서서히 교반하였다. 첨가 후 25℃에서 24 시간 동안 반응시킨 뒤, 미반응의 키토산과 활성화된 폴리에틸렌글리콜을 제거하기 위하여, 컷-오프가 12,000∼14,000 정도인 투석막을 이용하여 2 일간 실온에서 투석하였다. 투석 후 질소가스로 건조하여 키토산과 폴리에틸렌글리콜의 결합체(활성화된 폴리에틸렌글리콜의 농도에 따라 각각 110.34 ㎎, 204.12 ㎎ 및 301.2 ㎎, 수율: 50.69%, 60.88% 및 66.50%)를 얻었다.

[실시예 18] 키토산-플루로닉 결합체의 제조

5.0 ㎎/㎖의 농도로 키토산(분자량: 1,600 이하) 수용액 20 ㎖을 제조하였다. 또한, 실시예 4에서 제조한 활성화된 플루로닉 F127(분자량: 12,600)을 각각 5 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 15 ㎎/㎖ 및 20 ㎎/㎖의 농도로 상기 키토산 수용액에 첨가하여 서서히 교반하였다. 첨가 후 25℃에서 24 시간 동안 반응시킨 후, 미반응의 키토산과 활성화된 플루로닉을 제거하기 위하여, 컷-오프가 12,000 ∼ 14,000 정도인 투석막을 이용하여 2 일간 실온에서 투석하였다. 투석 후 질소가스로 건조하여 키토산-플루로닉 결합체(활성화된 플루로닉 F127의 농도에 따라 각각 188.5 ㎎, 136.4 ㎎, 248 ㎎ 및 339 ㎎, 수율: 47.125%, 45.47%, 62% 및 67.8%)를 얻었다.

[실시예 19] 폴리에틸렌글리콜이 키토산을 경유하여 히알루론산에 결합된 히알루론산 유도체 젤의 제조 - 1

5.0 ㎎/㎖의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 1,000,000 이상, LG Life Sciences Ltd.) 수용액 10 ㎖을 제조하였다. 또한, 실시예 16에서 제조한 키토산(분자량: 1,600 이하)과 폴리에틸렌글리콜(분자량: 5,000)의 결합체(활성화된 폴리에틸렌글리콜의 농도가 5.8825 ㎎/㎖, 11.765 ㎎/㎖ 및 17.6475 ㎎/㎖인 것으로부터 제조된 결합체)를 1.0 ㎎/㎖의 농도로 수용액 5 ㎖을 제조하였다. 상기 히알루론산 나트륨 수용액을 교반시키면서, 상기 키토산-폴리에틸렌글리콜 결합체 수용액을 첨가하였다. 이를 교반하면서, 0.0588 ㎎/㎖의 농도로 EDC와, 0.0706 ㎎/㎖의 농도로 NHS를 각각 1 ㎖씩 천천히 첨가하였다. 첨가 후 25℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 아세톤에 첨가하여, 키토산과 폴리에틸렌글리콜의 결합체와 히알루론산이 결합한 히알루론산 유도체를 침전시켰다. 침전물을 용액에서 분리하여 세척 후 건조하였다. 건조된 히알루론산 유도체(사용된 키토산-폴리에틸렌글리콜 결합제 중 활성화된 폴리에틸렌글리콜의 농도에 따라 각각 22.3 ㎎, 32.6 ㎎ 및 14.4 ㎎, 수율: 41.82%, 59.27% 및 26.18%)에 물을 첨가하여 10 ㎎/㎖의 농도로 만들었을 때, 점탄성이 증가된 수용성 젤이 형성되었다.

[실시예 20] 폴리에틸렌글리콜이 키토산을 경유하여 히알루론산에 결합된 히알루론산 유도체 젤의 제조 - 2

5.0 ㎎/㎖의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 1,000,000 이상, LG Life Sciences Ltd.) 수용액 10 ㎖을 제조하였다. 또한, 실시예 16에서 제조한 키토산 (분자량: 1,600 이하)과 폴리에틸렌글리콜(분자량: 5,000)의 결합체(활성화된 폴리에틸렌글리콜의 농도가 5.8825 ㎎/㎖, 11.765 ㎎/㎖ 및 17.6475 ㎎/㎖인 것으로부터 제조된 결합체)를 1.0 ㎎/㎖의 농도로 수용액 5 ㎖을 제조하였다. 상기 히알루론산 나트륨 수용액을 교반시키면서, 상기 키토산-폴리에틸렌글리콜 결합체 수용액을 첨가하였다. 이를 교반하면서, 0.1471 ㎎/㎖의 농도로 EDC와, 0.1765 ㎎/㎖의 농도로 NHS를 각각 1 ㎖씩 천천히 첨가하였다. 첨가 후 25℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 아세톤에 첨가하여, 키토산-폴리에틸렌글리콜 결합체와 히알루론산이 결합한 히알루론산 유도체를 침전시켰다. 침전물을 용액에서 분리하여 세척 후 건조하였다. 건조된 히알루론산 유도체(사용된 키토산-폴리에틸렌글리콜 결합체 중 활성화된 폴리에틸렌글리콜의 농도에 따라 각각 24.4 ㎎, 33.7 ㎎ 및 30.8 ㎎, 수율: 44.36%, 61.27% 및 56%)에 물을 첨가하여 10 ㎎/㎖의 농도로 만들었을 때, 점탄성이 크게 증가된 수용성 젤이 형성되었다.

[실시예 21] 폴리에틸렌글리콜이 키토산을 경유하여 히알루론산에 결합된 히알루론산 유도체 젤의 제조 - 3

5.0 ㎎/㎖의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 1,000,000 이상, LG Life Sciences Ltd.) 수용액 10 ㎖을 제조하였다. 또한, 실시예 16에서 제조한 키토산 (분자량: 1,600 이하)과 폴리에틸렌글리콜(분자량: 5,000)의 결합체(활성화된 폴리에틸렌글리콜의 농도가 5.8825 ㎎/㎖, 11.765 ㎎/㎖ 및 17.6475 ㎎/㎖인 것으로부터 제조된 결합체)를 1.0 ㎎/㎖의 농도로 수용액 5 ㎖을 제조하였다. 상기 히알루론산 나트륨 수용액을 교반시키면서, 상기 키토산-폴리에틸렌글리콜 결합체 수용액을 첨가하였다. 이를 교반하면서, 0.2941 ㎎/㎖의 농도로 EDC와, 0.3529 ㎎/㎖의 농도로 NHS를 각각 1 ㎖씩 천천히 첨가하였다. 첨가 후 25℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 아세톤에 첨가하여, 키토산-폴리에틸렌글리콜 결합체와 히알루론산이 결합한 히알루론산 유도체를 침전시켰다. 침전물을 용액에서 분리하여 세척 후 건조하였다. 건조된 히알루론산 유도체(사용된 키토산-폴리에틸렌글리콜 결합체 중 활성화된 폴리에틸렌글리콜의 농도에 따라 각각 26.5 ㎎, 34.1 ㎎ 및 44.8 ㎎, 수율: 48.18%, 62% 및 81.45%)에 물을 첨가하여 10 ㎎/㎖의 농도로 만들었을 때, 점탄성이 크게 증가된 수용성 젤이 형성되었다.

[실시예 22] 폴리에틸렌글리콜이 키토산을 경유하여 히알루론산에 결합된 히알루론산 유도체 필름의 제조

5.0 ㎎/㎖의 농도로 키토산(분자량: 10,000 이상)-염산 용액 20 ㎖를 제조하였다. 또한, 실시예 2에서 제조한 활성화된 폴리에틸렌글리콜(분자량: 5,000)을 각각 5.8825 ㎎/㎖, 11.765 ㎎/㎖ 및 17.6475 ㎎/㎖의 농도로 상기 키토산-염산 용액에 첨가하여 서서히 교반하였다. 첨가 후 25℃에서 24 시간 동안 반응시킨 후, 미반응의 키토산과 활성화된 폴리에틸렌글리콜을 제거하기 위하여, 컷-오프가 12,000 정도인 투석막을 이용하여 2 일간 실온에서 투석하였다. 투석 후 질소가스로 건조하여 키토산-폴리에틸렌글리콜 결합체(활성화된 폴리에틸렌글리콜의 농도에 따라 각각 187.3 ㎎, 310.1 ㎎ 및 391.8 ㎎, 수율: 86.06%, 92.48% 및 86.50%)를 얻었다.

또한, 10.0 ㎎/㎖의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 200,000, LG Life Sciences Ltd.) 수용액 20 ㎖을 제조하였다. 위에서 제조한 키토산-폴리에틸렌글리콜 결합체를 2.5 ㎎/㎖의 농도로 용액 20 ㎖을 제조하였다. 상기 히알루론산 나트륨 수용액을 교반시키면서, 상기 키토산-폴리에틸렌글리콜 결합체 용액을 첨가하였다. 이를 교반하면서, 1.25 ㎎/㎖의 농도로 EDC와, 1.5 ㎎/㎖의 농도로 NHS를 각각 첨가하였다. 첨가 후 25℃에서 4 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 컷-오프 12,000∼14,000의 투석막을 이용하여 2 일간 투석한 후, 동결건조를 하여 생성물(사용된 키토산-폴리에틸렌글리콜 결합체 중 활성화된 폴리에틸렌글리콜의 농도에 따라 각각 141.6 ㎎, 137.4 ㎎ 및 138.75 ㎎, 수율: 56.64%, 54.96% 및 55.50%)을 얻었다.

얻어진 히알루론산 유도체를 2% 용액으로 제조하여 패트리디쉬에 넣고 5 일간 자연 건조시켜 필름을 제조하였다. 제조된 필름을 다시 에탄올 : 물 비율이 8 : 2인 혼합 용매에 넣고, 2.0 ㎎/㎖의 농도로 EDC와, 2.0 ㎎/㎖의 농도로 NHS를 각각 첨가하여 2차 가교시켰다. 하기 표 1에는 제조된 필름의 용해도과 팽윤도가 개시되어 있다.

HA(분자량: 20만)-키토산/PEG(MW=5,000)* HA(분자량: 20만)-키토산/PEG(MW=5,000)** 필름 2차 가교에탄올:물 = 8:2 필름 2차 가교에탄올:물 = 8:2 용해도 1주후 일부분해 2주후 안정 1주후 일부분해 2주후 안정 팽윤도 6.53 4.167 7.64 4.772 수분 함량 84.69% 76% 86.92% 79%

* [키토산]:[PEG(MW=5,000)] = 10:1

** [키토산]:[PEG(MW=5,000)] = 20:1

[실시예 23] 폴리에틸렌글리콜이 키토산을 경유하여 히알루론산에 결합된 히알루론산 유도체 실의 제조

5.0 ㎎/㎖의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 200,000) 20 ㎖ 수용액을 제조하였다. 또한, 실시예 16에서 제조한 키토산(분자량: 1,600 이하)과 폴리에틸렌글리콜(분자량: 5,000)의 결합체(활성화된 폴리에틸렌글리콜의 농도가 5.8825 ㎎/㎖, 11.765 ㎎/㎖ 및 17.6475 ㎎/㎖인 것으로부터 제조된 결합체)를 5.0 ㎎/㎖의 농도로 용액 5 ㎖을 제조하였다. 상기 히알루론산 나트륨 수용액을 교반시키면서, 상기 키토산-폴리에틸렌글리콜 결합체 용액을 첨가하였다. 교반을 하면서, 1.0 ㎎/㎖의 농도로 EDC와, 1.2 ㎎/㎖의 농도로 NHS를 각각 첨가하였다. 첨가 후 25℃에서 4 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 컷-오프 12,000 ∼ 14,000의 투석막을 이용하여 2 일간 투석한 뒤, 동결건조하여 생성물(사용된 키토산-폴리에틸렌글리콜 결합체 중 활성화된 폴리에틸렌글리콜의 농도에 따라 각각 121 ㎎, 115.6 ㎎ 및 114.25 ㎎, 수율: 96.8%, 92.48% 및 91.40%)을 얻었다.

얻어진 히알루론산 유도체를 10% 용액으로 제조하여, 에탄올과 아세톤의 혼합 용매에 23G의 바늘이 장착된 주사기로 방사하여 실을 제조하였다. 제조된 실을 1 일 정도 충분히 응고시킨 후, 다시 에탄올 : 물 비율이 8 : 2인 용매에 넣고, 2.0 ㎎/㎖의 농도로 EDC와, 2.0 ㎎/㎖의 농도로 NHS를 각각 첨가하여 2차 가교시켰다. 최종적으로 제조된 실은 미세하고 균일한 굵기와 부드러운 표면을 가지고 있었다.

[실시예 24] 플루로닉이 키토산을 경유하여 히알루론산에 결합된 히알루론산 유도체 젤의 제조 - 1

5.0 ㎎/㎖의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 1,000,000 이상) 수용액 10 ㎖을 제조하였다. 또한, 실시예 18에서 제조한 키토산(분자량: 1,600 이하)과 플루로닉(분자량: 12,600)의 결합체(활성화된 플루로닉 농도가 5 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 15 ㎎/㎖ 및 20 ㎎/㎖인 것으로부터 제조된 결합체)를 1.0 ㎎/㎖의 농도로 수용액 5 ㎖을 제조하였다. 상기 히알루론산 나트륨 수용액을 교반시키면서, 상기 키토산-플루로닉 결합체 수용액을 첨가하였다. 이를 교반하면서, 0.0588 ㎎/㎖의 농도로 EDC와, 0.0706 ㎎/㎖의 농도로 NHS를 각각 1 ㎖씩 천천히 첨가하였다. 첨가 후 25℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응물을 아세톤에 첨가하여 키토산-플루로닉 결합체와 히알루론산이 결합한 히알루론산 유도체를 침전시켰다. 침전물을 용액에서 분리하여 세척한 후 건조하였다. 건조된 히알루론산 유도체(사용된 키토산-플루로닉 결합체 중 활성화된 플루로닉의 농도에 따라 각각 29.7 ㎎, 25.8 ㎎, 26.8 ㎎ 및 24 ㎎, 수율: 54%, 46.91%, 48.73% 및 41.82%)에 물을 첨가하여 10 ㎎/㎖의 농도로 만들었을 때, 점탄성이 증가된 수용성 젤이 형성되었다.

[실시예 25] 플루로닉이 키토산을 경유하여 히알루론산에 결합된 히알루론산 유도체 젤의 제조 - 2

5.0 ㎎/㎖의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 1,000,000 이상) 수용액 10 ㎖을 제조하였다. 또한, 실시예 18에서 제조한 키토산(분자량: 1,600 이하)과 플루로닉(분자량: 12,600)의 결합체(활성화된 플루로닉 농도가 5 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 15 ㎎/㎖ 및 20 ㎎/㎖인 것으로부터 제조된 결합체)를 1.0 ㎎/㎖의 농도로 수용액 5 ㎖을 제조하였다. 상기 히알루론산 나트륨 수용액을 교반시키면서, 상기 키토산-플루로닉 결합체 수용액을 첨가하였다. 이를 교반하면서, 0.1471 ㎎/㎖의 농도로 EDC와, 0.1765 ㎎/㎖의 농도로 NHS를 각각 1 ㎖씩 천천히 첨가하였다. 첨가 후 25℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응물을 아세톤에 첨가하여, 키토산-플루로닉 결합체와 히알루론산이 결합한 히알루론산 유도체를 침전시켰다. 침전물을 용액에서 분리하여 세척한 후 건조하였다. 건조된 히알루론산 유도체(사용된 키토산-플루로닉 결합체 중 활성화된 플루로닉의 농도에 따라 각각 32.6 ㎎, 26.2 ㎎, 28.9 ㎎ 및 30 ㎎, 수율: 59.27%, 47.64%, 52.55% 및 54.54%)에 물을 첨가하여 10 ㎎/㎖의 농도로 만들었을 때, 점탄성이 크게 증가된 수용성 젤이 형성되었다.

[실시예 26] 플루로닉이 키토산을 경유하여 히알루론산에 결합된 히알루론산 유도체 젤의 제조 - 3

5.0 ㎎/㎖의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 1,000,000 이상) 수용액 10 ㎖을 제조하였다. 또한, 실시예 18에서 제조한 키토산(분자량: 1,600 이하)과 플루로닉(분자량: 12,600)의 결합체(활성화된 플루로닉 농도가 5 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 15 ㎎/㎖ 및 20 ㎎/㎖인 것으로부터 제조된 결합체)를 1.0 ㎎/㎖의 농도로 수용액 5 ㎖을 제조하였다. 상기 히알루론산 나트륨 수용액을 교반시키면서, 상기 키토산-플루로닉 결합체 수용액을 첨가하였다. 이를 교반하면서, 0.2941 ㎎/㎖의 농도로 EDC와, 0.3529 ㎎/㎖의 농도로 NHS를 각각 1 ㎖씩 천천히 첨가하였다. 첨가 후 25℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응물을 아세톤에 첨가하여, 키토산-플루로닉 결합체와 히알루론산이 결합한 히알루론산 유도체를 침전시켰다. 침전물을 용액에서 분리하여 세척 후 건조하였다. 건조된 히알루론산 유도체(사용된 키토산-플루로닉 결합체 중 활성화된 플루로닉의 농도에 따라 각각 39.4 ㎎, 30 ㎎, 32.5 ㎎ 및 33.9 ㎎, 수율: 71.64%, 54.55%, 59.10% 및 61.64%)에 물을 첨가하여 10 ㎎/㎖의 농도로 만들었을 때, 점탄성이 크게 증가된 수용성 젤이 형성되었다.

[실험예 1] 히알루론산 유도체의 점탄성 측정

실시예 11, 14, 21 및 26에서 제조한 히알루론산 유도체와 히알루론산을 10 ㎎/㎖의 농도로 5 ㎖을 제조한 후, 유변학적 특성을 확인하기 위하여 레오미터(rheometer)로 측정하였다. 0.02 ~ 1 Hz의 진동수에서 측정한 복합 점도(complex viscosity)가 도 1에 개시되어 있다. 히알루론산에 비해, 본 발명에 따른 히알루론산 유도체들의 점도가 향상되고 있음을 확인할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 히알루론산 유도체는 우수한 생체적합성과 매우 높은 점탄성을 가지므로, 젤, 필름, 실 등의 형태로서 유착방지용 젤, 주름살 치료용 삽입물, 성형보조물, 관절염 치료용 삽입물, 약물 전달체 등 다양한 용도로 사용될 수 있으며, 특히 관절염 치료용 삽입물로서 높은 점탄성을 오랜 기간동안 유지시켜 줄 수 있으므로, 그것의 교환횟수를 현격히 줄이는 등의 효과를 가진다.

상기에서 본 발명은 기재된 구체예를 중심으로 상세히 설명되었지만, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정은 당연히 첨부된 특허청구범위에 속한다.

도 1은 본 발명에 따른 히알루론산 유도체의 점탄성을 종래의 히알루론산과 비교하여 레오미터로 나타내는 도면이다.

Claims (31)

  1. 글리콜 고분자가 아미드 결합에 의해 히알루론산에 결합되어 있는 구조를 가지는 히알루론산 유도체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 히알루론산은 히알루론산 자체, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 자체 및 히알루론산 염이며, 상기 히알루론산 염은 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등의 무기염과, 히알루론산 테트라부틸암모늄 등의 유기염인 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체.
  3. 제 1 항에 있어서, 글리콜 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 플루로닉(폴리에틸렌글리콜과 폴리프로필렌글리콜의 블록 공중합체), 또는 폴리에틸렌글리콜 및 플루로닉인 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 유도체는 글리콜 고분자가 히알루론산에 직접 연결되어 있는 구조의 유도체(Ⅰ)이거나, 또는 글리콜 고분자가 키토산을 경유하여 히알루론산에 연결되어 있는 구조의 유도체(Ⅱ)인 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 유도체(Ⅰ)는 글리콜 고분자의 양쪽 말단에 히알루론산이 각각 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 유도체(Ⅰ)는 하기 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체.
    (2)
    (상기 식에서, m, n, x, y 및 z 는 각각 1 또는 그 이상의 정수로서, n>z>y>x 의 조건을 만족한다)
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 유도체(Ⅰ)는 하기 화학식 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체.
    (3)
    (상기 식에서, a, b, n, x, y 및 z 는 각각 1 또는 그 이상의 정수로서, n>z>y>x 의 조건을 만족한다)
  8. 제 4 항에 있어서, 상기 유도체(Ⅱ)는 하기 화학식 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체.
    (4)
    (상기 식에서, a, l, m, n, x 및 y 는 각각 1 또는 그 이상의 정수로서, m>l 및 n>x>y 의 조건을 만족한다)
  9. 제 4 항에 있어서, 상기 유도체(Ⅱ)는 하기 화학식 5로 표시되는 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체.
    (5)
    (상기 식에서, a, b, l, m, n, x 및 y 는 각각 1 또는 그 이상의 정수로서, m>l 및 n>x>y 의 조건을 만족한다)
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 유도체는 생체적합성 소재로 사용되는 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 생체적합성 소재는 관절염 치료용 삽입물인 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 유도체는 젤, 필름 또는 실의 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체.
  13. (A) 글리콜 고분자의 한쪽 또는 양쪽 말단에 자유아민기를 도입하는 단계; 및
    (B) 상기 자유아민기가 도입된 글리콜 고분자를 히알루론산과 아미드화 반응을 행하는 단계;
    를 포함하는 것으로 구성되어 있는, 글리콜 고분자가 직접 히알루론산에 연결되어 있는 구조의 제 1 항에 따른 히알루론산 유도체의 제조방법.
  14. (A1) 글리콜 고분자의 한쪽 말단에 자유아민기를 도입하는 단계;
    (B1) 상기 자유아민기가 도입된 글리콜 고분자를 키토산과 반응시켜 키토산-글리콜 고분자 결합체를 제조하는 단계; 및
    (C1) 상기 키토산-글리콜 고분자 결합체를 히알루론산과 아미드화 반응을 행하는 단계;
    를 포함하는 것으로 구성되어 있는, 글리콜 고분자가 키토산을 경유하여 히알루론산에 연결되어 있는 구조의 제 1 항에 따른 히알루론산 유도체의 제조방법.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 상기 단계(A) 또는 단계(A1)에서, 글리콜 고분자의 말단(한쪽 또는 양쪽 말단)에 자유아민기의 도입은,
    (a) 글리콜 고분자의 한쪽 또는 양쪽 말단을 활성화시키는 단계; 및
    (b) 활성화된 글리콜 고분자를 디아민 화합물과 반응시키는 단계;
    를 포함하는 것으로 구성된 방법에 의해 실행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 단계(a)에서의 활성화는, 단계(b)에서 디아민 화합물과의 반응에 의해 글리콜 고분자의 말단에 자유아민기가 도입될 수 있는 상태로 변화시킨 활성화된 글리콜 고분자를 얻는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 활성화된 글리콜 고분자는 하기 화학식 6 또는 7로 표시되는 구조 또는 그것의 대칭 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
    (6)
    (7)
    (상기 화학식 6과 7에서, R1 과 R2 는 각각, HO-PEG-CH2CH2O-, HO-PEG-CH2CH 2CH2O-, HO-PEG-CONH(CH2)5O-, HO-PEG-S-OCH2CH2O-, HO-PEG-S-CH2 CH2O-, HO-PEG-NHCOCH2CH2O-, HO-PEG-CO(CH2)3O-, HO-PEG-COCH2CH2O-, HO-PEG-, HO-PEG-CH 2O-, MeO-PEG-CH2CH2O-, MeO-PEG-CH2CH2CH2O-, MeO-PEG-CONH(CH2)5O-, MeO-PEG-S-OCH 2CH2-, MeO-PEG-S-CH2CH2O-, MeO-PEG-NHCOCH2CH2O-, MeO-PEG-CO(CH2)3O-, MeO-PEG-COCH 2CH2O-, MeO-PEG-, MeO-PEG-CH2O-, HO-PLU-CH2CH2O-, HO-PLU-CH2CH2CH2 O-, HO-PLU-CONH(CH2)5O-, HO-PLU-S-OCH2CH2-, HO-PLU-S-CH2CH2O-, HO-PLU-NHCOCH2CH 2O-, HO-PLU-CO(CH2)3O-, HO-PLU-COCH2CH2O-, HO-PLU-, HO-PLU-CH2O-, MeO-PLU-CH2CH2O-, MeO-PLU-CH2CH2CH2O-, MeO-PLU-CONH(CH2)5O-, MeO-PLU-S-OCH2CH2O-, MeO-PLU-S-CH2 CH2O-, MeO-PLU-NHCOCH2CH2O-, MeO-PLU-CO(CH2)3O-, MeO-PLU-COCH2CH2O-, MeO-PLU- 또는 MeO-PLU-CH 2O- 이고, 여기서, PEG 는 -(CH2CH2O)n- 이고 (n 은 1 이상의 정수), PLU 는 -(CH2 CH2O)a-(CH2CH(CH3)O)b-(CH2CH2O)c- 이며(a, b, c 는 각각 1 이상의 정수), Me 는 메틸이다)
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 활성화된 글리콜 고분자가 하기 화학식 8 내지 10 중의 어느 하나에 의해 표시되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
    (8)
    (9)
    (10)
    (상기 화학식 8 내지 10에서 분자쇄의 반복단위인 a, b, n, x 및 y 는 각각 1 또는 그 이상의 정수이다)
  19. 제 18 항에 있어서, 화학식 8의 활성화된 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 1,000 내지 40,000이고, 화학식 9 또는 10의 활성화된 플루로닉의 분자량은 5,000 내지 50,000인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  20. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 단계(B) 또는 단계(C1)의 아미드화 반응에서 히알루론산의 농도는 0.01 내지 100 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  21. 제 13 항에 있어서, 단계(B)에서 자유아민기가 도입된 글리콜 고분자와 히알루론산의 반응 혼합비는 1 : 100 내지 100 : 1(히알루론산의 카르복실기 : 글리콜 고분자의 자유아민기)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  22. 제 14 항에 있어서, 상기 단계(B1)에서의 키토산-글리콜 고분자 결합체는 하기 화학식 13 또는 14로 표시되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
    (13)
    (14)
    (상기 화학식 13과 14에 있어서, a, b, m, n, x 및 y 는 1 또는 그 이상의 정수로서, n>x>y 의 조건을 만족한다)
  23. 제 14 항에 있어서, 상기 단계(B1)에서의 키토산-글리콜 고분자 결합체의 제조시, 키토산과 활성화된 글리콜 고분자의 반응 혼합비는 1 : 100 내지 100 : 1(키토산의 아민기 : 글리콜 고분자의 반응기)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  24. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 단계(B) 또는 단계(C1)의 아미드화 반응은 카르복실기 활성제의 첨가에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 카르복실기 활성화제는 카르보디이미드(carbodiimide)계 화합물로서, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC), 1-에틸-3-(3-(트리메틸암모니오)프로필) 카르보디이미드(ETC), 또는 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸) 카르보디이미드(CMC)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 카르복실기 활성화제는 EDC인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 24 항에 있어서, 상기 아미드화 반응에 활성반응 보조제가 더 첨가되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 활성반응 보조제의 바람직한 예로는 N-히드록시석신이미드(NHS), 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(HOOBt), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt), 또는 N-히드록시-설포석신이미드(Sulfo-NHS)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 활성반응 보조제는 NHS인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  30. 제 24 항 또는 제 27 항에 있어서, 상기 카르복실기 활성화제의 첨가량은 0.0001 내지 100 ㎎/㎖이고, 활성반응 보조제의 첨가량은 0.00001 내지 100 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  31. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 상기 단계(B) 또는 (C1)에서 아미드화 반응을 행하여 얻어진 히알루론산 유도체를 젤, 필름, 실 등과 같은 일정한 형태로 만든 다음, 잔류 카르복실기 및 자유아민기에 대해 추가적인 아미드화 반응을 행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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