KR101521058B1

KR101521058B1 - 생체적합성 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101521058B1
Application number: KR1020140175217A
Authority: KR
Inventors: 임재영; 정병철
Original assignee: 이노팜 주식회사
Priority date: 2014-12-08
Filing date: 2014-12-08
Publication date: 2015-05-15
Also published as: CN106999626A; US10414833B2; CN106999626B; EP3231455A4; WO2016093451A1; JP6561133B2; EP3231455A1; US20170335021A1; JP2017537215A

Abstract

본 발명은 생체적합성 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 베타-글루칸(ß-Glucan)과 히알루론산(Hyaluronic acid)의 하이브리드 조성물이 하이브리드 가교결합(hybrid-Crosslinked)에 의하여 제조된다. 본 발명의 생체적합성 조성물은 열과 생체 효소에 대한 안정성이 높아 의료용 소재로 사용될 수 있다.

Description

생체적합성 조성물 및 이의 제조방법{Biocompatible Composition And Method For Producing Thereof}

본 발명은 생체적합성 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 인체 내부에 삽입 또는 피부에 접촉되는 의료용, 화장품 등에 사용 가능한 생체적합성 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

인체 내부에 삽입되는 의료용 도구, 보형물 등의 소재는 혈액, 조직, 기관 등에 직접 접촉되는 것으로서, 안정성이 반드시 수반되어야 하며 이러한 소재를 생체적합성 소재라 한다. 현재, 생체적합성 소재를 개발하기 위하여 여러 가지 제조방법들이 연구되어 왔다. 특히, 기존에 개발된 생체적합성 소재들의 개별 성질을 보완하기 위하여 이들을 가교결합 함으로써 새로운 소재를 개발하는 연구에 박차를 가하고 있다.

히알루론산(Hyaluronic acid) 및 그 유도체는 높은 점도를 가지며, 생체적합성이 뛰어나고 완전한 생분해성을 가지고 있어, 광범위한 용도로 사용되고 있다.

그러나 히알루론산 및 그 유도체는 열과 생체 효소(히알루로니다아제, hyaluronidase 등)에 의하여 쉽게 분해되어 히알루론산 고유의 성질을 상실하게 된다. 생체 내에 삽입되는 보형물의 경우, 빠른 생분해성 및 고유의 성질 상실은 인체 내에 보형물 삽입 주기를 짧게 만들 뿐만 아니라, 점도 및 탄성을 감소시킴으로써 보형물로서의 기능을 저하시키는 요인이 된다. 예컨대, 일반적인 히알루론산 필러의 생체내 유지기간은 6개월 내지 1년이나, 그 기간 안에서도 본래의 점도 및 탄성을 쉽게 잃어 문제가 되고 있다.

결국, 히알루론산 및 그 유도체는 생체적합성은 확보하였으나, 필러 등의 리모델링 시술 주기를 짧게 만드는 단점 등을 보완해야만 한다. 또한, 보형물 등이 생체 내에서 분해되었을 경우, 분해된 산물이 인체에 악영향을 끼치지 않고, 오히려 유익한 효과를 가져올 수 있어야 할 것이다.

히알루론산 겔, 그의 제조방법 및 그를 함유하는 의학용 재료 (한국 등록특허 공보 제10-0374666호)

본 발명은 열과 생체효소에 완전하게 분해되되, 단기간에 쉽게 분해되지 않고 본래의 점도와 탄성을 유지하는 생체적합성 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 일 실시예에 따른 생체적합성 조성물은 베타-글루칸(ß-Glucan) 및 히알루론산(Hyaluronic acid)의 하이브리드 가교결합(hybrid-Crosslinked)물이다. 상기 베타-글루칸은 식물로부터 유도된 베타-(1,3)-글루칸, 베타-(1,4)-글루칸, 베타-(1,6)-글루칸 또는 이들 중 적어도 2 이상의 혼합으로 이루어질 수 있으며, 베타-(1,3)에 측쇄를 갖는 베타-(1,6) 글루칸을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 베타-글루칸은 30,000 ~ 300,000 Da의 분자량을 갖는 것을 사용하는 것이 바람직하며, 잎새버섯(Grifola frondosa) 균사체로부터 유도된 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 생체적합성 조성물을 제조하는 방법은 (a) 분자량이 30,000 ~ 300,000 Da인 베타-글루칸과 히알루론산을 혼합하는 단계 및 (b) 에폭사이드기(Epoxide), 에피할로히드린기(Epihalohydrin) 및 디비닐설포닐기(Divinylsulfone) 중, 적어도 하나를 포함하는 가교제를 첨가하는 단계를 포함한다. 상기 (a) 단계의 베타-글루칸 및 히알루론산은 1:9 ~ 9:1의 질량비로 혼합할 수 있다. 상기 (b) 단계의 가교제는 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(1,4-Butandiol diglycidyl ether, BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(Ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE), 1-(2,3-에폭시프로필) 2,3-에폭시시클로헥산(1-(2,3-Epoxypropyl)-2,3-epoxycyclohexane), 1,2-에탄디올 디글리시딜 에테르(1,2-Ethandiol diglycidyl ether) 및 이들의 혼합으로부터 이루어진 군으로부터 선택할 수 있다.

본 발명에 따른 생체적합성 조성물은 히알루론산 및 베타-글루칸이 가교결합된 신규 소재로써, 열과 생체 내 효소에 대한 안정성이 큰 이유로 인체 내에 본래의 형태 및 성질을 유지할 수 있으며, 생체 내 분해된 후에는 콜라겐 합성을 촉진하는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 베타-(1,3)에 측쇄를 갖는 베타-(1,6) 글루칸의 화학식이다.
도 2는 본 발명의 생체적합성 조성물이 생리적 식염수에 팽윤된 상태를 촬영한 이미지이다.
도 3은 본 발명의 생체적합성 조성물이 주사바늘을 통해 압출되는 상태를 촬영한 이미지이다.

후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 실시예로 기술되고 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 따라서, 후술하는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 행하여지는 것이 아니며, 본 발명의 범위는 특허청구범위에 기재된 내용 및 그와 균등한 모든 범위를 포괄하는 것으로 받아들여져야 한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 생체적합성 조성물은 베타-글루칸 및 히알루론산이 하이브리드 가교결합(hybrid-Crosslinked)된 형태를 갖는다. 본 발명의 생체적합성 조성물을 제조하기 위하여 사용될 수 있는 원료들을 먼저 설명하고자 한다.

< 베타-글루칸 >

본 발명의 생체적합성 조성물 제조에 사용될 수 있는 베타-글루칸은 포도당(glucose) 단량체가 글리코시드 결합(Glycosidic bond)으로 연결된 중합체의 형태를 갖는다. 베타-글루칸은 자연의 식물로부터 유도할 수 있다. 예컨대, 베타-글루칸은 버섯류, 호모의 세포벽, 곡류 등으로부터 추출하여 유도될 수 있다. 다만, 본 발명의 생체적합성 조성물을 제조하기 위하여 사용될 수 있는 베타-글루칸은 자연의 식물뿐만 아니라 화학적 합성 및 중합에 의하여도 유도될 수 있다. 바람직한 실시예로서, 다른 버섯류에 비하여 베타-글루칸 함량이 높고 균사체 배양 기간이 비교적 짧은 잎새버섯(Grifola frondosa) 균사체 배양액으로부터 베타-글루칸을 추출하여 사용할 수 있다.

베타-글루칸의 생체에 대한 면역 증가 효과는 이미 보고된 바 있다(FEMS immunology and medical microbiology, 13 (1): 51-57; Vetvicka, V et al, (1996)). 일본에서는 베타-글루칸이 항암용 의약품 또는 기능성 식품으로 판매되고 있으며, 미국 FDA는 베타-글루칸의 안전기준을 확립하여 면역력 증가 효과 및 그 안정성을 인증하였다. 또한 베타-글루칸은 피부 미용 관련 업계에서 점탄성, 보습특성, 생체적합성, 콜라겐 합성 촉진 효과, 피부재생 및 보호 효과를 높이기 위하여 화장품 원료로 사용된다(Journal of Cosmetic Science, 27(5): 292).

베타-글루칸은 포도당 단량체들이 연결되는 위치에 따라, 베타-(1,3)-글루칸, 베타-(1,4)-글루칸, 베타-(1,6)-글루칸으로 분류된다. 본 발명에 사용될 수 있는 베타-글루칸은 베타-(1,3)-글루칸, 베타-(1,4)-글루칸, 베타-(1,6)-글루칸 또는 이들의 적어도 2 이상의 혼합을 포함하고, 각각이 측쇄를 갖는 베타-(1,3)-글루칸, 베타-(1,4)-글루칸, 베타-(1,6)-글루칸도 포함한다. 특히, 상기 베타-글루칸 중 베타-(1,3)에 측쇄를 갖는 베타-(1,6)-글루칸을 사용하는 것이 바람직하다. 도 1은 베타-(1,3)에 측쇄를 갖는 베타-(1,6)-글루칸의 화학식이다.

상기 베타-글루칸은 분자량이 30,000 ~ 300,000 Da인 베타-글루칸을 분획하여 제조하는 것이 점도, 팽윤성, 주사기 압출성 향상에 바람직하다.

< 히알루론산 (Hyaluronic acid) >

히알루론산은 아미노산과 우론산으로 이루어진 다당류의 하나로, N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine) 및 글루쿠론산(Glucuronic acid)으로 이루어진 고분자 화합물이다.본 발명에 사용될 수 있는 히알루론산은 100,000 ~ 1,000,000 Da의 분자량을 갖는다. 본 발명의 실시예에 사용된 히알루론산은 분자량이 150,000 ~ 300,000 Da인 것으로 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich) 제품을 구입하여 사용하였다.

<생체적합성 조성물의 제조>

본 발명의 생체적합성 조성물의 제조방법은 (a-1) 베타-글루칸을 염기성 수용액에 희석하여 수용액을 제조하는 단계, (a-2) 수용액의 pH를 9 ~ 13으로 조절하는 단계, (a-3) 베타-글루칸을 염기성조건에서 과산화수소 및 열을 가하여 저분자 베타-글루칸(30,000 ~ 300,000 Da)으로 가수분해하는 단계, (a-4) 저분자량의 베타 글루칸을 분리하는 단계, (a-5) 베타-글루칸 수용액과 상기 히알루론산을 1:9 ~ 9:1의 질량비로 혼합하는 단계, (b) 가교제를 첨가하는 단계, (c) 25℃ ~ 80℃에서 2 ~ 8 시간 동안 가교결합 반응을 진행시키는 단계를 포함한다.

구체적으로, 자연의 식물로부터 베타-글루칸을 염기성 수용액에 용해한 후 균질화 한다(a-1). 상기 염기성 수용액은 수산화나트륨 수용액, 탄산수소나트륨 수용액, 수산화칼슘 수용액, 수산화바륨 수용액, 수산화알루미늄 수용액, 암모니아수를 포함한다. 바람직하게는 수산화나트륨 수용액을 사용하여 pH를 9 ~ 13 사이로 조절한다(a-2). 이어서, 과산화수소를 0.5 ~ 1.5 %(v/v)를 첨가한 후 100℃ ~ 180℃ 온도 및 1 ~ 2 기압하 조건에서 10 ~ 90 분 동안 가수분해한다(a-3).

가수분해된 베타-글루칸은 다양한 분자량을 가질 수 있다. 여과장치를 이용하여 가수분해된 베타-글루칸으로부터 30,000 ~ 300,000 Da 분자량을 갖는 베타-글루칸을 분리한다(a-4). 다음, 분리된 베타-글루칸을 동결건조한다.

동결건조된 베타-글루칸을 염기성 수용액에 용해한 후, 균질화 한다. 이어서, 히알루론산을 혼합한다(a-5). 이때, 베타-글루칸과 히알루론산은 1:9 ~ 9:1의 질량비로 혼합되는 것이 바람직하다.

이어서, 가교제를 첨가한다(b). 상기 가교제는 에폭사이드기(Epoxide), 에피할로히드린기(Epihalohydrin) 및 디비닐설포닐기(Divinylsulfone) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 에폭사이드기는 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(1,4-Butandiol diglycidyl ether, BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(Ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE), 1-(2,3-에폭시프로필) 2,3-에폭시시클로헥산(1-(2,3-Epoxypropyl)-2,3-epoxycyclohexane), 1,2-에탄디올 디글리시딜 에테르(1,2-Ethandiol diglycidyl ether) 및 이들의 혼합으로부터 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이중 안정성이 검증되고 다른 가교제에 비하여 염증 또는 알러지 반응이 적은 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르를 사용하는 것이 바람직하며, 상기 가교제의 첨가량은 가교제 첨가 전의 베타-글루칸 및 히알루론산의 혼합물의전체 부피 대비 0.1 ~ 5.0 %(v/v)를 첨가할 수 있다.

이어서, 25℃ ~ 80℃에서 2 ~ 8 시간 동안 하이브리드 가교결합 반응을 진행시킨다(c). 가교 반응이 종료되면, 염산을 이용하여 생리적 pH(7.4)로 중화하고, 세척하여 동결 건조할 수 있다.

이상의 제조 방법으로 본 발명의 생체적합성 조성물을 제조할 수 있다. 본 발명 생체적합성 조성물은 인체 내에 삽입되는 수술용 기구, 보형물, 필러, 화장품 소재 등으로 다양하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예를 통하여 본 발명의 생체적합성 조성물의 제조방법을 보다 상세히 설명하는 한편, 본 발명이 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 베타-글루칸 수용액 제조 및 가수분해

잎새버섯(Grifola frondosa)으로부터 추출된 베타-글루칸을 획득하였다. 상기 베타-글루칸은 베타-(1,3)에 측쇄를 갖는 베타-(1,6) 글루칸이다. 상기 베타-글루칸 분말 20g을 1.0% 수산화나트륨용액 100㎖에 용해하여 투명한 용액이 얻어질 때까지 균질화한 후, 과산화수소 1.0 %(v/v)를 첨가하였다. 그 후, 베타-글루칸을 121℃에서 60분 동안 고온고압(121℃, 1.2기압) 처리하여 가수분해하였다. 가수분해한 베타-글루칸을 한외여과장치를 이용하여 분자량별로 분획한 후 동결건조 하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

[표 1]

2. 하이브리드 가교결합 조성물 제조

30,000 ~ 300,000 Da의 저분자 베타-글루칸 분말 4g을 1.0% 수산화나트륨용액 100㎖에 용해한 후 투명한 용액이 얻어질 때까지 균질화 하였다. 4.0%(w/v) 히알루론산 수용액을 제조한 후 저분자 베타-글루칸 수용액에 첨가하였고, 이를 교반을 통하여 균질하게 혼합하였다. 획득된 베타-글루칸 및 히알루론산 혼합물의 전체 부피 대비 0.3%(v/v)의 BDDE(1,4-butandiol diglycidyl ether)를 첨가한 후 60℃에서 6시간 동안 가교반응을 진행시켰다. 가교반응을 종료한 후 5N 염산(HCl)을 첨가하여 pH를 생리적인 pH(7.4)로 중화하였다. 제조된 하이브리드 가교결합 조성물을 에탄올로 3 ~ 4회 세척한 후 동결건조하여 획득하였다.

<실험예 1-팽윤도>

실시예에서 제조된 생체적합성 조성물(실시예)에 대한 팽윤도 및 히알루론산이 가교결합되지 않은 저분자량의 베타-글루칸(비교예)에 대한 팽윤도의 측정 결과를 표2에 나타내었다. 실시예의 동결건조 후, 생체적합성 조성물을 측정한 중량(건조 중량, Wd) 및 24시간 동안 생리식염수에서 팽윤시킨 후 표면의 물기를 제거하고 측정한 중량(팽윤 중량, Ws)을 아래의 공식을 이용하여 계산하였다.

[팽윤도 = (Ws - Wd) / Wd]

[표 2]

도 2는 생체적합성 조성물이 실험예 1에서 생리적 식염수에 팽윤된 상태를 촬영한 이미지이다.

<실험예 2-주사기 압출성>

실험예 1의 팽윤된 생체적합성 조성물의 압출되는 힘을 측정하기 위하여 1cc 주사기에 충진 후 27G x 1/2" 주사바늘을 통하여 조성물이 압출되는지 측정하였다.

도 3은 본 발명의 생체적합성 조성물이 주사바늘을 통하여 압출되는 상태를 촬영한 이미지이다. 도 3에서 보이는 바와 같이 본 발명에 따른 30,000 ~ 300,000 Da의 저분자 베타-글루칸 및 히알루론산의 하이브리드 가교결합 조성물은 27G 주사바늘을 통하여 쉽게 압출되며, 또한 우수한 점탄성을 나타내었다.

<실험예 3-열에 대한 안정성>

본 발명의 생체적합성 조성물(실시예) 및 상용 가교 히알루론산(비교예)의 열분해에 대한 안정성을 비교 측정하기 위하여 121℃에서 60분간 고열고압 처리하여 멸균 전과 후의 각 점도를 비교하였다. 점도 측정은 브룩필드 점도계(Brookfield Rheometer)로 측정하여 그 결과를 표 3에 나타내었다. 비교예의 가교 히알루론산은 시그마-알드리치에서 구입한 분자량 150,000 ~ 300,000 Da인 히알루론산을 이용하여 4.0%(w/v) 히알루론산 수용액을 제조한 후, 히알루론산 수용액 전체 부피 대비 0.3%(v/v)의 BDDE(1,4-butandiol diglycidyl ether)를 첨가한 다음 60℃에서 6시간 동안 가교반응하여 제조하였다.

[표 3]

상기 표 3에서 보이는 바와 같이 본 발명의 생체적합성 조성물이 비교예보다 열 분해에 대하여 안정성이 뛰어남을 알 수 있었다.

<실험예 4-효소 분해에 대한 안정성>

1.0 % 히알루론산 수용액(비교예) 및 생체적합성 조성물(실시예)의 히알루노니다제(hyaluronidase) 효소에 대한 안정성을 비교 조사하였다. 효소 히알루로니다제 1,500 IU를 실시예와 비교예에 각각 첨가하여 37℃에서 30분간 반응한 후 브룩필드 점도계(Brookfield Rheometer)로 점도를 측정하여 측정 결과를 표 4에 나타내었다.

[표 4]

상기 표 4에서 보는 바와 같이 본 발명의 생체적합성 조성물이 비교예에 비하여 생체내 효소 분해에 대한 안정성이 더욱 뛰어남을 알 수 있었다.

Claims

잎새버섯(Grifola frondosa) 균사체로부터 유도되고, 30,000 ~ 300,000 Da의 분자량을 갖는 베타-글루칸(β-Glucan)과 히알루론산(Hyaluronic acid)이 하이브리드 가교결합(Hybrid-Crosslinked)된 생체적합성 조성물.
제1항에 있어서,
상기 베타-글루칸은 식물로부터 유도된 베타-(1,3)-글루칸, 베타-(1,4)-글루칸, 베타-(1,6)-글루칸 또는 이들의 적어도 2 이상의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 조성물.
제1항에 있어서,
상기 베타-글루칸은 베타-(1,3)에 측쇄를 갖는 베타-(1,6) 글루칸을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 조성물.
삭제
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제1항에 있어서,
상기 생체적합성 조성물은 베타-글루칸과 히알루론산이 1:9 ~ 9:1의 질량비로 혼합되어 제조된 것을 특징으로 하는 생체적합성 조성물.
제1항 내지 제3항 및 제6항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 생체적합성 조성물은 인체 내에 삽입되는 것을 특징으로 하는 생체적합성 조성물.
제1항 내지 3항 및 제6항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 생체적합성 조성물은 화장품으로 사용되거나 피부 및 조직 충진제, 창상피복제 또는 약물 전달체로 사용되는 것을 특징으로 하는 생체적합성 조성물.
(a) 분자량이 30,000 ~ 300,000 Da인 베타-글루칸(ß-Glucan)과 히알루론산(Hyaluronic acid)를 혼합하는 단계; 및
(b) 에폭사이드기(Epoxide), 에피할로히드린기(Epihalohydrin) 및 디비닐설포닐기(Divinylsulfone) 중, 적어도 하나를 포함하는 가교제를 첨가하는 단계를 포함하는 생체적합성 조성물을 제조하는 방법에 있어서,
상기 (a) 단계는 (a-1) 베타-글루칸을 염기성 수용액에 희석하는 단계,
(a-2) 희석된 수용액의 pH를 9 ~ 13으로 조절하는 단계,
(a-3) 베타-글루칸을 가수분해하는 단계,
(a-4) 여과장치를 이용하여 분자량이 30,000 ~ 300,000 Da인 베타-글루칸을 분리하는 단계,
(a-5) 상기 베타-글루칸과 상기 히알루론산은 1:9 ~ 9:1의 질량비로 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 조성물을 제조하는 방법.
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제9항에 있어서,
상기 (b) 단계의 가교제는 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(1,4-Butandiol diglycidyl ether, BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(Ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE), 1-(2,3-에폭시프로필) 2,3-에폭시시클로헥산(1-(2,3-Epoxypropyl)-2,3-epoxycyclohexane), 1,2-에탄디올 디글리시딜 에테르(1,2-Ethandiol diglycidyl ether) 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 생체적합성 조성물을 제조하는 방법.
제9항에 있어서,
상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계의 베타-글루칸과 히알루론산이 혼합된 혼합물의 전체 부피 대비 0.1 ~ 5.0 %(v/v)의 가교제를 상기 혼합물에 첨가하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 조성물을 제조하는 방법.
제9항에 있어서,
상기 (b) 단계의 가교제를 첨가한 후,
(c) 25℃ ~ 80℃에서 2 ~ 8 시간 동안 가교결합 반응을 진행시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 조성물을 제조하는 방법.