TW201620496A - 具有改良抗性之多糖軟組織充填劑 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於包括肝素原(heparosan)之多糖軟組織充填劑及其製備方法。本發明之多糖軟組織充填劑宜用於治療或美容應用，諸如用於充填皺紋。

Description

具有改良抗性之多糖軟組織充填劑
本發明係關於包括肝素原(heparosan)之多糖軟組織充填劑及其製備方法。本發明亦關於此等多糖軟組織充填劑之治療及美容用途。
替代或充填生物組織或增加組織體積在眾多治療及美容應用中可係必需或期望的。一種達成此之方法係將基於永久或生物可降解材料之黏彈性產品引入生物組織中。
就治療應用而言，該黏彈性產品可用於增加特定組織，例如括約肌、尿道或聲帶之體積。在美容應用之情況下，潛在應用包括充填皺紋、掩飾瘢痕或擴大唇部體積。注射黏彈性產品係與美容手術相比具有較低風險之單一非侵入式方法。
使用基於永久材料之黏彈性產品提供在組織中之長停留時間之優勢，但具有重大缺陷。例如，注射聚矽氧與以出現皮膚小瘤及潰瘍為特徵之不期望的長期效應相關聯。此外，注射含於溶液或生物聚合物基質中之粒子需要承擔非所需之發炎反應風險，及轉移合成片段甚至可導致出現肉芽腫。
由此，為凝膠形式的基於交聯生物可降解生物聚合物之黏彈性產品越來越多地用於治療處理及皮膚醫學護膚品領域。在此等凝膠中使用之生物可降解聚合物通常係天然存在聚合物，在注射其之組織中 隨時間再吸收。大量市售凝膠製品，特定而言皮膚充填劑，採用交聯透明質酸(HA)作為較佳生物可降解聚合物。可使用不同交聯劑，諸如DVS(二乙烯碸)、DEO(二環氧辛烷)及BDDE(1,4-丁二醇二縮水甘油醚)。
生物可降解生物聚合物凝膠通常分為兩種不同類型，「單一相」(或「單相」)凝膠及「二相」(或「雙相」)凝膠。雙相凝膠包括由一或多種分散於液相或非交聯生物聚合物基溶液(例如，參見EP 0 466 300 B1)中之交聯生物聚合物(例如，透明質酸鈉)組成的材料。該交聯生物聚合物材料藉由表面降解緩慢降解，而該非交聯生物聚合物(例如，透明質酸鈉)非常快速降解。因此，當期望組織體積增長時，在首次注射後需要大量後處理步驟，其降低使用者之生活品質。市售雙相生物可降解凝膠之實例尤其包括皮膚充填劑Hylaform®、Restylane®及Perlane®。
單相凝膠亦可基於一或多種交聯生物可降解生物聚合物(例如，透明質酸鈉)，但僅包括單一相，意指其係不具有可見粒子之凝膠。鑑於交聯性質，此等凝膠經歷緩慢表面降解。此等單相黏彈性凝膠係描述在例如WO2008/068297 A1、US8,450,475 B2、US8,455,465 B2、US7,741,476 B2、及US8,052,990 B2中。市售單相HA凝膠尤其包括Juvéderm®、Teosyal®、Glytone®、及以商標名Belotero®、Esthélis®、Fortélis® Extra、及Modélis®Shape出售之單相雙交聯(聚增密(polydensified))HA凝膠。
充填劑改良之抗性(即在人體中較長停留時間)係有益，此係由於預期之為獲得滿意效果所需處理之數量及頻率下降。交聯顯著改良抗性。然而，注射高度交聯聚合物係更困難，其係不期望之特徵。此外，在注射凝膠時，聚合物之非交聯部位變得更易於會促進凝膠降解之生化及酶促侵蝕。
由此，已經進行額外嘗試以進一步提升生物聚合物基充填劑之抗性。例如，提出將由交聯HA或(甲基)丙烯酸製備之粒子併入交聯HA聚合物基質(參見例如WO 00/01428 A1及US 2010/0028435 A1)。然而，此途徑與不期望之發炎反應及甚至肉芽腫之風險相關聯。此外，WO 2013/149161 A1揭示高分子量肝素原(一種與HA相似但對降解更具抗性之聚合物)之製法，及提出其用作尤其用於組織擴大之生物材料組合物。
發明目標
鑑於上文，本發明之目標係提供一種軟組織充填劑，其具有長時間抗性，容易注射及具有強產生組織體積增長之能力。
上文目標藉由提供以交聯凝膠形式之可注射軟組織充填劑組合物來解決，該組合物包括肝素原及透明質酸(HA)、或其鹽之一。此等新穎類型之軟組織充填劑在人體中具有長停留時間(即，長時間抗性)，可易於經由針頭注射及具有極佳創建體積之能力。
在第一態樣中，本發明提供為凝膠形式之第一可注射軟組織充填劑組合物，其包括肝素原及透明質酸(HA)(或其鹽之一)與交聯劑(較佳地1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE))交聯，以形成交聯HA-肝素原基質。較佳地，此為凝膠形式之第一組合物藉由使用BDDE作為交聯劑使肝素原(或其鹽之一)與HA(或其鹽之一)之混合物交聯，以形成包括肝素原及HA聚合物之交聯HA-肝素原基質來製備，其係藉由BDDE在分子間(即在HA分子、肝素原分子、或HA與肝素原分子間)或分子內交聯。
在另一態樣中，本發明提供為凝膠形式之第二可注射軟組織充填劑組合物，其包括(i)與BDDE交聯之透明質酸(HA)(或其鹽之一)之預形成凝膠，及(ii)與BDDE交聯之肝素原(或其鹽之一)之預形成凝膠 的混合物。
在又一態樣中，本發明提供為凝膠形式之第三可注射軟組織充填劑組合物，其包括雙交聯透明質酸(HA)-肝素原基質，其藉由以下製備：(a)BDDE交聯肝素原(或其鹽之一)以形成交聯肝素原凝膠，混合HA(或其鹽之一)與該交聯肝素原凝膠，及BDDE交聯該HA(或其鹽之一)與該交聯肝素原凝膠以獲得該雙交聯HA-肝素原基質，或(b)BDDE交聯HA(或其鹽之一)以形成交聯HA凝膠，混合肝素原(或其鹽之一)與該交聯HA凝膠，及BDDE交聯該肝素原(或其鹽之一)與該交聯HA凝膠以獲得該雙交聯HA-肝素原基質。
在又一態樣中，本發明提供為凝膠形式之第四可注射軟組織充填劑組合物，其包括三交聯透明質酸(HA)-肝素原基質，其藉由以下製備：BDDE交聯肝素原(或其鹽之一)以形成交聯肝素原凝膠，BDDE交聯HA(或其鹽之一)以形成交聯HA凝膠，混合該交聯肝素原凝膠與該交聯HA凝膠，及BDDE交聯該交聯肝素原凝膠與該交聯HA凝膠的混合物以獲得該三交聯HA-肝素原基質。
在另一態樣中，本發明提供第五可注射軟組織充填劑組合物，其包括交聯(較佳地BDDE交聯)之肝素原基質及羥磷灰石鈣。
在另一態樣中，提供包括一種含有本發明可注射軟組織充填劑之注射器的套組。
在另一態樣中，本發明提供用於製備本發明之第一至第五可注射軟組織充填劑組合物的方法。特定而言，其提供：(i)一種製備本發明第一可注射軟組織充填劑組合物之方法，其包括以下步驟：(a)提供包括透明質酸(HA)、肝素原及交聯劑(較佳地1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE))之水性混合物，及(b)較佳地使用BDDE作為交聯劑交聯(a)之混合物，以獲得交聯 HA-肝素原基質，及(ii)一種製備本發明第二可注射軟組織充填劑組合物之方法，其包括以下步驟：(i)提供包括透明質酸(HA)(或其鹽之一)、及1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)的水性混合物，(ii)使用BDDE作為交聯劑交聯(i)之混合物，以獲得交聯HA凝膠，(iii)提供包括肝素原(或其鹽之一)及1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)的水性混合物，(iv)使用BDDE作為交聯劑交聯(iii)之混合物，以獲得交聯肝素原凝膠，及(v)混合步驟(ii)之該交聯HA凝膠與步驟(iv)之該交聯肝素原凝膠；或(iii)一種製備本發明第三可注射軟組織充填劑組合物之方法，其包括以下步驟：(a’)提供包括肝素原(或其鹽之一)及1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)的水性混合物，(b’)使用BDDE作為交聯劑交聯(a’)之混合物，以獲得交聯肝素原凝膠，(c’)混合HA(或其鹽之一)及可選之BDDE與該交聯肝素原凝膠，及(d’)使用BDDE作為交聯劑交聯(c’)之混合物，以獲得雙交聯HA-肝素原基質，或其包括以下步驟：(a”)提供包括HA(或其鹽之一)及1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)的水性混合物， (b”)使用BDDE作為交聯劑交聯(a”)之混合物，以獲得交聯HA凝膠，(c”)混合肝素原(或其鹽之一)及可選之BDDE與該交聯HA凝膠，及(d”)使用BDDE作為交聯劑交聯(c”)之混合物，以獲得雙交聯HA-肝素原基質；或(iv)一種製備本發明第四可注射軟組織充填劑組合物之方法，其包括以下步驟：(1)提供包括HA(或其鹽之一)及1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)的水性混合物，(2)使用BDDE作為交聯劑交聯(1)之混合物，以獲得交聯HA凝膠，(3)提供包括肝素原(或其鹽之一)及1,4丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)的水性混合物，(4)使用BDDE作為交聯劑交聯(3)之混合物，以獲得交聯肝素原凝膠，(5)混合(2)之該交聯HA凝膠與(4)之該交聯肝素原凝膠及可選之BDDE，及(6)使用BDDE作為交聯劑交聯(5)之混合物，以獲得三交聯HA-肝素原基質；或(v)一種製備本發明第五可注射軟組織充填劑組合物之方法，其包括以下步驟：(A)提供包括肝素原(或其鹽之一)及交聯劑(較佳地1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE))的水性混合物，(B)較佳地使用BDDE作為交聯劑交聯該肝素原(或其鹽之一)，以獲得交聯肝素原基質，及 (C)添加羥磷灰石鈣。
在另一態樣中，本發明係關於一種本發明可注射軟組織充填劑、或本發明套組之用途，其用於替代或充填生物組織或增加該生物組織之體積。特別有利地，該充填劑組合物係用於皮膚醫學護膚品領域以減少皮膚皺紋或線。
本發明之較佳實施例在隨附申請專利範圍中闡明。
本發明之發明者意外地發現交聯多糖(諸如透明質酸(HA))與肝素原產生展現在體內之長停留時間，而同時展現用作例如皮膚醫學護膚品應用中之軟組織充填劑之有利性質的凝膠。
肝素原(HEP)係屬於多糖之葡萄糖胺聚糖(GAG)家族的生物聚合物。在人體中，其係在肝素與硫酸肝素生物合成之中間產物。肝素原之結構係與透明質酸(HA)之結構高度相似，由於其具有與透明質酸相同之單糖組分糖及與HA之不同點在於，HA中之尿甘酸(GlcUA)與N-乙醯胺基葡萄糖(GlcNAc)間之β-(1,3)糖苷鍵係由HEP中之β-(1,4)糖苷鍵替代及在於HA中之N-乙醯胺葡萄糖(GlcNAc)與尿甘酸(GlcUA)間之β-(1,4)糖苷鍵係由HEP中之α-(1,4)糖苷鍵替代：GlcUA-β-(1-4)-[GlcNAc-α-(1-4)-GlcUA-β-(1-4)]n-GlcNAc HEP
GlcUA-β-(1-3)-[GlcNAc-β-(1-4)-GlcUA-β-(1-3)]n-GlcNAc HA
肝素原之主要特徵係其極佳生物相容性。乙醯肝素攜帶大量負電荷及羥基及係由此係高度親水性，其增加組織相容性。此外，由於肝素原聚合物甚至在修飾後仍然包括發生在天然硫酸乙醯肝素及肝素聚合物中之拉伸的事實，肝素原係非免疫原性(例如，不引起抗體)。此外，由於在肝素原與透明質酸間之結構相似性，相同化學修飾(包 括交聯)，如用於透明質酸之已知化學修飾可在官能團上進行。
此外，人體內不產生細胞間水解酶，該酶特定地降解肝素原，導致與透明質酸相比之人體內長時間抗性。此外，沒有發生可能之有害分解產物累積。本文使用之術語「抗性」指軟組織充填劑在延長時間內耐受體內降解之能力。由此術語抗性係同義地用於指「(在體內)停留時間」或「壽命」。
本發明可注射軟組織充填劑提供數個優於已知充填劑之優點，包括極佳生物相容性、改良抗性、低擠壓力(方便注射性)、高水分保持性、無免疫原性、及由人體安全吸收，同時維持用作軟組織充填劑之期望機械及流變性質。
在第一態樣中，本發明係關於為凝膠形式之第一可注射軟組織充填劑組合物，其包括肝素原及透明質酸(HA)或其鹽之一與1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)交聯，以形成交聯HA-肝素原基質。
本文使用之術語「軟組織充填劑組合物」意欲意指用於或適宜用作軟組織充填劑之組合物。具有本發明意義之「軟組織充填劑」指經設計以添加體積至軟組織缺乏區域的材料。術語「軟組織」一般指連接、支撐、或環繞其他身體結構及器官的組織。在本發明中，軟組織包括例如肌肉、肌腱(將肌肉連接至骨頭的纖維帶)、纖維狀組織、脂肪、血管、神經及滑膜組織(環繞關節之組織)。在本發明上下文中，該軟組織充填劑較佳地係皮膚充填劑。軟組織充填劑之應用包括但不限於皮膚醫學護膚品應用，諸如增加唇部豐滿度、擴大面頰、處理皮膚線或皺紋、或治療應用，諸如增加有需要之其他組織(諸如括約肌、尿道或聲帶)之體積。
根據本發明，該可注射軟組織充填劑組合物係凝膠。本文使用之術語「凝膠」，一般指在室溫下之流動性介於液體或固體流動性之間的材料。此外，術語「凝膠」意欲意指能夠吸收水分之材料(即 「水凝膠」)，通常以基於該凝膠總重量(不包括視情況存在之粒子(即羥磷灰石鈣)之重量)計至少90重量%的水含量。在本發明中，該可注射軟組織充填劑組合物一般包括生理上可接受之載液，較佳地無熱原等滲緩衝液，更佳地生理鹽水溶液。
依照本發明，多糖可用於形成「基質」。本文使用之術語「基質」意欲意指以溶液或凝膠形式之交聯或非交聯多糖網狀物。本文使用之術語「透明質酸」或「HA」意指透明質酸、透明質酸鹽、及任何透明質酸鹽，諸如透明質酸鈉。類似地，本文使用之術語「肝素原」包括其任何鹽。
此外，本發明之軟組織充填劑組合物係「可注射」。這意味著該軟組織充填劑組合物適用於注射至皮膚或其他組織以將該軟組織充填劑組合物帶至期望之目標部位。具有本發明意義之「可注射」組合物可在標準狀態常壓下由注射器分配。
一般而言，除非另作聲明，否則本發明之軟組織充填劑係不限於特定類型凝膠及包括可注射單相及雙相凝膠，其包括具有整合或共價共交聯生物聚合物粒子或具有分散於其中之其他粒子之交聯基質的可注射凝膠、聚增密或雙交聯凝膠(即以凝膠中之交聯程度變化為特徵之凝膠)、三交聯凝膠及非交聯凝膠。本發明之軟組織充填劑可係與在US 2010/0316683 A1(其以引用之方式併入本文中)中所描述之HA凝膠類似製備的單相凝膠。此外，本發明之軟組織充填劑可依照在WO 2013/185934 A1(其亦以引用之方式併入本文中)中所描述之方法來製備。聚增密凝膠(即雙交聯凝膠)之製備描述在例如EP 1 711 552 B1(其亦以引用之方式併入本文中)中。
就交聯凝膠而言，本發明之軟組織充填劑較佳地係同時具有單相、內聚、及持久特徵之可注射凝膠。本文使用之術語「內聚」意指凝膠重新聚集及不鋪展開或分裂之傾向。該凝膠之內聚特徵由此有助 於獲得軟組織中之高相容性及長抗性。
本發明進一步係關於為凝膠形式之第二、第三、第四及第五軟組織充填劑組合物，其在下文描述。不言而喻，上文提供之關於第一可注射軟組織充填劑組合物的解釋及定義(例如，術語抗性、軟組織充填劑組合物、軟組織充填劑、軟組織、充填劑、凝膠、水凝膠、基質、透明質酸、肝素原、可注射、凝膠類型、內聚等之定義)同等地應用於本發明第二、第三、第四及第五(下文進一步解釋)可注射軟組織充填劑組合物。
根據本發明，其進一步提供一種為凝膠形式之第二可注射軟組織充填劑組合物，其包括(i)與BDDE交聯之透明質酸(HA)(或其鹽之一)的預形成凝膠、及(ii)與BDDE交聯之肝素原(或其鹽之一)的預形成凝膠之混合物。此凝膠組合物可藉由首先製備(i)及(ii)，及隨後依照熟習此項技術者已知之技術以期望之重量比物理混合(i)及(ii)獲得。
較佳地，第二可注射軟組織充填劑組合物可藉由本文描述之本發明方法獲得。(i)：(ii)之重量比較佳地係0.1：99.9至99.9：0.1，更佳地1.0：99.0至99.9：1.0，特佳地5：95至95：5、10：90至90：10或20：80至80：20，及最佳地30：70至70：30或40：60至60：40。
此外，本發明係關於一種為凝膠形式之第三可注射軟組織充填劑組合物，其包括雙交聯透明質酸(HA)-肝素原基質，藉由以下製備：(a)BDDE交聯肝素原或其鹽之一，以形成交聯肝素原凝膠，混合HA(或其鹽之一)與該交聯肝素原凝膠，及BDDE交聯HA(或其鹽之一)與該交聯肝素原凝膠以獲得該雙交聯HA-肝素原基質，或(b)BDDE交聯HA(或其鹽之一)，以形成交聯HA凝膠，混合肝素原(或其鹽之一)與該交聯HA凝膠，及BDDE交聯該肝素原(或其鹽之一)與該交聯HA凝膠以獲得該雙交聯HA-肝素原基質。
較佳地，第三可注射軟組織充填劑組合物藉由本文描述之本發 明方法獲得。可使用餘留在該第一交聯反應混合物中之BDDE進行第二交聯(例如，藉由將用於第二交聯之HA或肝素原添加至包括交聯第一聚合物(即HA或肝素原)的第一交聯反應混合物)。通常，伴隨著添加第二聚合物(即待在第二交聯步驟交聯之HA或肝素原)之反應混合物稀釋，導致在凝膠中不同程度(例如，較低程度)之交聯(不均勻交聯)。
或者在第一交聯步驟後添加補充量之BDDE以實現第二交聯。通常，該添加量(實質上)係低於第一(初始)交聯之添加量。根據本發明之雙交聯凝膠有利地以促進可注射行、體內長維持性及極佳黏彈性性質為特徵。
本文使用之術語「聚增密」指以與凝膠中之交聯程度變化為特徵的凝膠，或換言之，「聚增密」凝膠(至少)具有兩個不同密度等級，較密集部分(較高交聯程度)及低密集部分(較低交聯程度)。一般而言，本發明之雙交聯或三交聯凝膠，例如由第一交聯反應以交聯第一多糖，接著第二交聯反應以交聯第二多糖)製備之雙交聯凝膠係此等聚增密凝膠。此外，本發明之聚增密凝膠通常係單相且顯示高內聚性。該雙交聯方法(動態交聯技術)在此項技術中已知及描述於例如EP 1 711 552 B1中，其以引用之方式併入本文中。
另外，本發明係關於一種為凝膠形式之第四可注射軟組織充填劑組合物，其包括三交聯透明質酸(HA)-肝素原基質，其藉由以下製備：BDDE交聯肝素原(或其鹽之一)以形成交聯肝素原凝膠，BDDE交聯HA(或其鹽之一)以形成交聯HA凝膠，混合該交聯肝素原凝膠與該交聯HA凝膠，及BDDE交聯該交聯肝素原凝膠及該交聯HA凝膠之混合物以獲得該三交聯HA-肝素原基質。
如上文關於本發明雙交聯凝膠所解釋，存在於該(第一及/或第二)交聯反應混合物之殘餘BDDE可用於實現進一步(第三)交聯反應或視情況添加補充量BDDE。上文關於第三組合物之所提供之註釋相似 地應用於第四組合物。
在下文中，描述本發明之不同可注射軟組織充填劑組合物之特定實施例(第五可注射軟組織充填劑在下文進一步描述)。除非另作聲明，否則下文描述之此等組合物之解釋、定義及其他特徵同等應用於本發明之第一、第二、第三、第四及第五可注射軟組織充填劑組合物而不需要明確提及。此外，應瞭解在本發明組合物或套組上下文中描述之全部實施例同等應用於處理、使用之方法及反之亦然。由此，組合物或套組、處理或使用方法之上下文中之特定實施例之提及描述用於全部此等標的類型之實施例。
在本發明之第一、第三或第四軟組織充填劑之交聯HA-肝素原基質中肝素原對HA之重量比範圍可係約0.1：99.9至99.9：0.1或約1：99至約99：1，較佳地約50：50至約1：99，更佳地約25：75至約1：99，更佳約10：90至約1：99，特佳約5：95至約1：99，及最佳地約3：97至約1：99。
本發明可注射軟組織充填劑組合物之交聯HA-肝素原基質較佳地具有以下修飾程度：表示為約0.5%至約25%，更佳地約2.0%至約20%，甚至更佳地約3.0%至約15%，更佳地約4.0%至約12%，仍更佳約5.0%至約10.0%，特佳地約6.0%至約9.0%，及最佳地約7.0%至約8.0%之單與雙交聯之BDDE交聯劑總數對HA與肝素原二糖單元總數之比。
修飾程度可依照此項技術中已知之方法(Edsman等人，Gel Properties of Hyaluronic Acid Dermal Fillers，Dermatol.Surg.2012，38：1170-1179；Guarise等人，SEC determination of cross-link efficiency in hyaluronan fillers，Carbohydrate Polymers 2012，88：428-434；Kenne等人，Modification and cross-linking parameters in hyaluronic acid hydrogels-Definitions and analytical methods，Carbohydrate Polymers 2013，91：410-418)，藉由NMR測定。
簡言之，在進行NMR測量之前使經透析及殺菌之凝膠降解。該 降解可藉由硫酸軟骨素酶AC(Edsman等人，前述；Kenne等人，前述)、NAOH(Guarise等人，前述)、添加透明質酸酶(例如，150U羊透明質酸酶至1g凝膠)或藉由在90℃培育至少35h進行。隨後凍乾獲得之溶液，溶於D2O，及充分均質化。
NMR測量可在例如500MHz下，在環境溫度下具有數次重複之20度脈衝以接收適當解析度之光譜進行。依照參考文獻，修飾程度(MoD)，藉由計算HA之N-乙醯基訊號對BDDE之亞甲基訊號之比來評定。對於HA之N-乙醯基而言，當溶於D2O時臨界訊號位於約2.0ppm處及對於BDDE而言位於約1.6ppm處。為計算修飾程度，依照參考文獻(Edsman等人，前述及Kenne等人，前述)，確定整數值及需要考慮N-乙醯基(CH3)3H質子對亞甲基(CH2CH2)4H質子之比。
用於製備本發明軟組織充填劑之肝素原聚合物分子量範圍可係約0.5 x 105Da至約6.8 x 106Da，較佳地約1.0 x 105Da至約5.0 x 106Da，及更佳地約1.0 x 105Da至約3.5 x 106Da。在另一較佳實施例中，肝素原聚合物之分子量係約0.5 x 105Da至約1.0 x 106Da或更少，更佳地約2.0 x 105Da至約8.0 x 105Da，及最佳地約3.0 x 105Da至約7.0 x 105Da。
用於製備本發明軟組織充填劑之HA聚合物分子量係不作特定限制，但通常在約1.0 x 105Da至約5.0 x 106Da之範圍，較佳地在約3.0 x 105Da至約3.0 x 106Da之範圍，及更佳地在約5.0 x 105Da至約2.5 x 106Da之範圍。
本文可採用各種方法來測定HA之分子量，諸如固有黏度(例如，根據Chinese Pharmacopoeia，第2版，2006)、毛細管電泳法(CE)(例如，根據Kinoshita等人，Biomed.Chromatogr.，2002，16：141-45)、高效凝膠滲透層析法(HPGPC)(例如，根據Kim等人，Food Chem.，2008，109：63-770)、及與尺寸排除層析法組合之多角度雷射光散射 (SEC-MALLS)(例如，依照Hokputsa等人，Eur.Biophys.J.Biophys.Lett.，2003，32：450-456)。
修飾程度及(在低許多程度上)多糖分子量對降解能力有影響及，由此允許調整本發明可注射軟組織充填劑之抗性。使用之多糖(例如，HA及/或肝素原)之分子量越高，一般導致該軟組織充填劑在人體中之停留時間越長。關於交聯程度以下適用：交聯程度越高，在人體中停留時間越長。
在本發明之一較佳實施例中，本發明可注射軟組織充填劑組合物之HA包括具有第一分子量的第一HA及具有不同於第一分子量之第二分子量的第二HA。
較佳地，該HA包括具有在約0.5至1.0 x 105Da至低於約1.0 x 106Da範圍之第一分子量的第一HA及具有在約1.0 x 106Da至約5.0 x 106Da範圍之第二分子量的第二HA，更佳地具有在約1.0 x 105Da至約9.0 x 105Da範圍之第一分子量的第一HA及具有在約1.1 x 106Da至約4.0 x 106Da範圍之第二分子量的第二HA，及最佳地具有在約2.0 x 105Da至約6.0 x 105Da範圍之第一分子量的第一HA及具有在約1.3 x 106Da至約2.0 x 106Da範圍之第二分子量的第二HA。
在本發明可注射軟組織充填劑組合物中第一HA對第二HA之重量比較佳係約50：50至約99：1，更佳地約70：30至約95：5，及最佳地約85：15至約95：5。
在另一較佳實施例中，本發明可注射軟組織充填劑組合物之肝素原包括以具有不同分子量為特徵之第一肝素原及第二肝素原。
較佳地，該肝素原包括具有在約1.0 x 105Da及9.0 x 105Da範圍之第一分子量的第一肝素原及具有在約1.0 x 106Da至3.0 x 106Da範圍之第二分子量的第二肝素原，更佳地具有在約1.0 x 105Da及5.0 x 105Da範圍之第一分子量的第一肝素原及具有在約1.5 x 106Da至約 3.0 x 106Da範圍之第二分子量的第二肝素原。
在本發明可注射軟組織充填劑組合物中第一肝素原對第二肝素原之重量比較佳係約50：50至約99：1，更佳地約70：30至約95：5，及最佳地約85：15至約95：5。
在一較佳實施例中，本發明之可注射軟組織充填劑組合物進一步包括非交聯HA及/或非交聯肝素原。將該非交聯聚合物作為潤滑劑添加至充填劑及有助於製備最終產物流及促進注射。
該非交聯HA較佳地具有約3.0 x 105Da至約3.0 x 106Da，更佳地約8.0 x 105Da至約2.5 x 106Da，及最佳地約1.0 x 106Da至約1.5 x 106Da之分子量。該非交聯肝素原較佳地具有約1.0x105 Da至約6.8 x 106Da，更佳地約5.0 x 105Da至約5.0 x 106Da，及最佳地約1.0 x 106Da至約3.5 x 106Da之分子量。
該非交聯HA及/或該非交聯肝素原之總量較佳係基於存在於該可注射軟組織充填劑組合物中之交聯及非交聯肝素原及HA聚合物之總重量計約0.001重量%至約50重量%或約0.01重量%至約40重量%或約0.1重量%至約35重量%或約1重量%至約30重量%，更佳地約1重量%至約20重量%，及最佳地約5重量%至約20重量%。
較佳地，本發明之可注射軟組織充填劑組合物不含有除非交聯HA之外之其他非交聯聚合物。亦較佳地，本發明之可注射軟組織充填劑組合物不含有任何非交聯聚合物。在上下文中，本文使用之術語「聚合物」指具有重複結構單元之任何天然或合成可聚合化合物，包括多糖，諸如HA及肝素原。
根據本發明，存在於本發明可注射軟組織充填劑組合物中交聯與非交聯肝素原及交聯與非交聯HA聚合物之總濃度較佳係約0.5mg/ml至約40mg/ml、約1mg/ml至約40mg/ml、約5mg/ml至約35mg/ml或約10mg/ml至約35mg/ml，更佳地約15mg/ml至約30mg/ml， 甚至更佳地約18mg/ml至約28mg/ml，及最佳地約20mg/ml至約26mg/ml。此外，在該充填劑組合物含有非交聯肝素原及/或非交聯HA聚合物的情況下，較佳地該交聯HA-肝素原基質及該添加之非交聯肝素原及/或HA聚合物具有在上述範圍內之濃度。
本發明進一步設想使用除HA及肝素原之外一或多種額外多糖，較佳地基於含於本發明可注射軟組織充填劑組合物之全部多糖總重量計其含量低於10重量%。理想地，該聚合物係自然源。使用自然源聚合物允許更佳生物相容性，其賦予降低發炎反應之風險。適宜額外多糖之實例包括(但不限於)硫酸軟骨素、角質素、硫酸角質素、肝素、硫酸肝素、纖維素及其衍生物、殼聚糖、鹿角菜膠、黃原膠、及藻酸鹽、或其鹽之一。
除HA及肝素原外之額外多糖較佳地係全部與該HA-肝素原基質之透明質酸及肝素原聚合物共交聯。然而，在較不佳實施例中，除HA及肝素原外之額外多糖可部分或全部以非交聯形式存在。
在一較佳實施例中，本發明之可注射軟組織充填劑組合物不含有任何除HA及肝素原外之非交聯及交聯聚合物。
本發明還進一步設想本發明之可注射軟組織充填劑組合物可包括通常具有約1μm至約1000μm，特定而言10μm至200μm之平均粒度之粒子。該等粒子較佳地係整合在本發明可注射軟組織充填劑組合物之交聯HA-肝素原基質中。該粒子可係交聯粒子，特定而言交聯HA粒子。
較佳地，該等粒子係陶瓷粒子。本文使用之特別適宜的陶瓷材料係選自羥磷灰石、氟磷灰石、及氯磷灰石、或其混合物之磷灰石。較佳地，該等粒子係羥磷灰石鈣粒子。該等陶瓷粒子(例如羥磷灰石鈣粒子)通常以約1重量%至約65重量%或約5重量%至約60重量%之含量，特定而言以約10重量%至約50重量%之含量，較佳地以約20重量 %至約40重量%之含量含於可注射軟組織充填劑中。該等陶瓷粒子(例如羥磷灰石鈣粒子)之粒度較佳地係在約1μm至約1000μm之範圍，更佳地在約10μm至約200μm之範圍，及最佳地在約25μm至約50μm之範圍。此外，該陶瓷粒子較佳地具有約5%至約65%之體積百分數。
在本發明之一特佳實施例中，含有陶瓷粒子(特定而言羥磷灰石鈣粒子)之上述本發明可注射軟組織充填劑組合物進一步包括甘油及/或甘露醇及/或利多卡因(lidocaine)。
本發明仍進一步設想將至少一活性物質(例如一或多種麻醉劑)包含在本文描述之可注射軟組織充填劑組合物中。該麻醉劑通常係局部麻醉劑諸如利多卡因。較佳地，該利多卡因以基於該可注射軟組織充填劑組合物之總重量計約0.05重量%至約5.0重量%，更佳地約0.1重量%至約2.0重量%，甚至更佳地約0.1重量%至約2.0重量%，仍更佳地約0.1重量%至約1.0重量%，特佳地約0.1重量%至約0.5重量%，及最佳地約0.2重量%至約0.4重量%之濃度包含在本發明之軟組織充填劑中。
此外，本發明可注射軟組織充填劑組合物可視情況包括一或多種選自多元醇、維生素、胺基酸、金屬、礦物質之化合物。此外，本發明之軟組織充填劑亦可包括特定干細胞及/或生長因子及/或常規添加劑(例如，PH調節劑及滲透壓調節劑)。
本文使用之示例性多元醇包括(但不限於)甘露醇、甘油、丙二醇、山梨醇、赤蘚糖醇、木糖醇、乳糖醇、麥芽糖醇及葡萄糖。特別適用於本文的係甘露醇及甘油。多元醇之總濃度一般在約0.01mg/ml與約50.0mg/ml間，較佳地在約0.5mg/ml至約20.0mg/ml間，更佳地在約1.0mg/ml與約5.0mg/ml間。多元醇可用作抗氧化劑，其改良凝膠對體內降解之耐受能力。
適宜維生素包括維生素C、維生素E及B族維生素，即B1、B2、 B3、B5、B6、B7、B9及B12纖維素中之一或多者。維生素C或維生素E之濃度較佳地係約0.01mg/ml至約10.0mg/ml，更佳地約0.1mg/ml至約5.0mg/ml，及B族維生素之總濃度較佳地係約0.01mg/ml至約10.0mg/ml，更佳地約0.1mg/ml至約5.0mg/ml。該維生素可存在以刺激及維持細胞新陳代謝及，由此促進膠原蛋白產生。特佳用於本文的係維生素C、維生素E及維生素B6。
依照本發明，對於不具有粒子(例如，陶瓷粒子如羥磷灰石鈣)之充填劑組合物而言，該可注射軟組織充填劑組合物一般具有約20Pa至1000Pa，較佳地約100Pa至約500Pa，更佳地約250Pa至約500Pa之在1Hz交叉頻率(f)下的彈性模量G'。在包括粒子(例如，陶瓷粒子如羥磷灰石鈣粒子)之充填劑組合物之情況下，在1Hz交叉頻率(f)下之彈性模量G'可係在約400Pa至約5000Pa範圍，較佳地約500Pa至約2000Pa範圍，更佳地在約600Pa至約1500Pa範圍。
經由27G½針頭在12.5mm/min之速度下使用標準注射器測得之本發明可注射軟組織充填劑組合物之注射力通常係在約10N與約40N間，較佳地在約10N與約35N間，更佳地在約15N與約30N間，及最佳地在約20N與約25N間。
該滲透壓較佳地在約200mOsmol/l至約400mOsmol/l，更佳地約280mOsmol/l至約330mOsmol/l。此外，由於本發明之可注射軟組織充填劑組合物意欲注入人體內，本發明可注射軟組織充填劑組合物之PH一般在約6.5至約7.5間，較佳地在約6.8至約7.4間。
在另一態樣中，本發明係關於包括與BDDE交聯之肝素原基質及羥磷灰石鈣之第五可注射軟組織充填劑組合物。
該肝素原較佳地以基於該第五可注射軟組織充填劑組合物之總重量計至少0.1重量%或至少0.5重量%，更佳地在約0.1重量%與約10.0重量%間或約0.5重量%與約4.0重量%間，及最佳地在約1.0重量%與約 3.0重量%間或約1.5重量%與約2.5重量%間之含量存在。肝素原一般在該可注射軟組織充填劑組合物中係唯一交聯聚合物。然而，第五可注射軟組織充填劑組合物可進一步包括非交聯肝素原及/或非交聯HA，較佳地以如上文在本發明之其他含有肝素原/HA之組合物所闡明之含量及具有如上文在本發明之其他含有肝素原/HA之組合物所闡明之分子量。
該等羥磷灰石鈣粒子通常以高於約1重量%，較佳地約10重量%至約70重量%，更佳地約30重量%至約60重量%，及最佳地約40重量%至約50重量%之含量含於第五可注射軟組織充填劑組合物。
該等羥磷灰石鈣之粒度較佳地在約1μm至約1000μm之範圍，更佳地在約10μm至約200μm之範圍，特佳地在約20μm至約100μm之範圍，及最佳地在約25μm至約50μm之範圍。此外，該陶瓷粒子較佳地具有約5%至約65%之體積百分數。
此外，至少一活性物質(例如一或多種麻醉劑)可含於該可注射軟組織充填劑組合物中。該麻醉劑通常係局部麻醉劑諸如利多卡因，其較佳地以如上文關於其他本發明可注射軟組織充填劑組合物定義之濃度包括於該組合物中。
此外，本發明之第五可注射軟組織充填劑組合物可視情況包括一或多種選自多元醇、維生素、胺基酸、金屬、礦物質之化合物。此外，本發明軟組織充填劑亦可含有干細胞及/或生長因子及/或常規添加劑(例如，pH調節劑及滲透壓調節劑)。對於此等可選化合物之更詳細定義，其係指上文關於本發明其他可注射軟組織充填劑組合物賦予之定義及解釋。
較佳地，第五可注射軟組織充填劑組合物進一步包括甘油及/或甘露醇及/或利多卡因。
第五可注射軟組織充填劑組合物可具有約400Pa至約5000Pa， 較佳地約500Pa至約2000Pa，更佳地約600Pa至1500Pa之在1Hz交叉頻率(f)下之彈性模量G'。此外，經由27G½針頭在12.5mm/min之速度使用標準注射器測得之注射力通常係在約10N與約40N間，較佳地在約10N與約35N間，更佳地在約15N與約30N間，及最佳地在約20N與約25N間。滲透壓較佳地係約200mOsmo1/l至約400mOsmol/l，更佳地約280mOsmol/l至約330mOsmol/l。可注射軟組織充填劑組合物之pH一般係約6.5至約7.5，較佳地約6.8至約7.4。
在本發明上下文中，肝素原亦可係兩種或多種具有不同分子量之肝素原之混合物。較佳地，該肝素原包括具有約0.5 x 105Da至約9.0 x 105Da，更佳地約1.5 x 105Da至約5.0 x 105Da之第一分子量之第一肝素原，及具有約1.0 x 106Da至約6.8 x 106Da，更佳地約1.5 x 106Da至約5.0 x 106Da之第二分子量之第二肝素原。
在另一態樣中，本發明係關於一種套組，其包括含有本發明之可注射軟組織之充填劑的注射器。
在另一態樣中，本發明係關於一種製備本發明之第一可注射軟組織充填劑組合物之方法，其包括以下步驟：(a)提供包括透明質酸、肝素原及1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)之水性混合物，(b)使用BDDE作為交聯劑，較佳地在鹼性條件下交聯(a)之該混合物，以獲得透明質酸肝素原基質。
步驟(a)通常包括在鹼性溶液中使純淨、乾燥透明質酸聚合物與肝素原聚合物水合。在步驟(a)中提及之透明質酸較佳地係透明質酸鈉(NaHA)。可藉由將期望量之固體NaOH添加至乾燥HA與肝素原聚合物，，接著添加適宜水性溶劑(例如純水)來製備鹼性溶液，以在鹼性條件下使該聚合物混合物水合。在步驟(a)之變型中，在水合期間該交聯劑(即BDDE)亦可存在，即，存在於鹼性溶液中。該等聚合物 之水合一般耗時約1h至約3h及較佳地係在混合下進行。
在步驟(b)中，在步驟(a)獲得之混合物係與BDDE交聯。該交聯一般在鹼性條件下進行，通常在鹼性水溶液中。適宜交聯技術為熟習此項技術者熟知及不在本文詳細解釋。例如，該交聯可藉由添加有效量之交聯劑起始及可在20℃至60℃(例如50℃)之溫度下進行。較佳地，在交聯反應之前及/或在交聯反應期間可機械均質化該反應混合物。與BDDE之交聯導致形成穩定醚鍵，其提升製備之凝膠在體內條件下之穩定性。
該交聯反應可藉由在純化期間使用酸中和及/或除去交聯劑來停止。後者可例如藉由透析進行，其允許除去該交聯劑及未反應之聚合物短鏈。用於透析之水溶液一般係緩衝溶液。此緩衝溶液之組成經選擇以具有期望物理化學(pH、莫耳滲透壓濃度)及流變性質。適宜緩衝溶液包括(但不限於)磷酸鹽緩衝液、等滲鹽水及PBS緩衝液。在純化後，該充填劑組合物一般充填入注射器，隨後藉由一般技術者已知之技術，例如藉由蒸氣殺菌、高壓釜等使其滅菌。
此外，本發明係關於一種製備如本文上文(參見發明內容部分)及在附屬專利申請範圍中所揭示之本發明第二、第三及第四可注射軟組織充填劑組合物的方法。用於製備此等組合物之技術為熟習製造多糖充填劑技術者熟知。上述反應條件亦應用於製造第二、第三、第四及第五(參見下文)組合物。交聯一般藉由進行透析停止。這去除該交聯劑、未反應小聚合物鏈、不期望之反應產物及其他雜質。一般而言，本發明之軟組織充填劑組合物係無菌。為此，本發明之(第一、第二、第三、第四及第五)軟組織充填劑組合物可充填入注射器及習知上藉由高壓釜在例如121至132℃下處理2至30min殺菌。
此外，本發明係關於一種製備本發明第五軟組織充填劑組合物之方法，其包括步驟(A)：提供包括肝素原(或其鹽之一)及1,4-丁二醇 二縮水甘油醚(BDDE)之水性混合物，步驟(B)：使用BDDE作為交聯劑交聯該肝素原以獲得交聯肝素原基質，及步驟(C)：添加羥磷灰石鈣。在步驟(B)之後及步驟(C)之前，純化該交聯肝素原基質以移除過量BDDE。視情況，可添加非交聯HA或甘油作為潤滑劑。
在另一態樣中，本發明係關於一種本發明可注射軟組織充填劑組合物、或本發明套組之用途，其用於在治療或美容應用中替代或充填生物組織或增加生物組織之體積。特定而言，本發明係關於一種替代或充填生物組織或增加生物組織體積之方法，其包括給有需要之個體投與有效量之本發明可注射軟組織充填劑組合物。該投與一般藉由注射(例如，皮下或皮內注射)發生。
較佳地，僅出於美容目的(例如，用於改良視覺外觀，特定而言面部)投與本發明可注射軟組織充填劑組合物。在一特佳實施例中，本發明可注射軟組織充填劑組合物用作諸如藉由連續穿刺技術經皮內或皮下注射至目標部位(例如，需要增加(擴大)體積之組織)之皮膚充填劑。
特定而言，本發明可注射軟組織充填劑組合物或套組可用於治療應用，諸如用於增加括約肌、尿道或聲帶之體積，或用於(皮膚)美容領域，諸如用於擴大或充填皮膚之皺紋或細線(例如，鼻唇溝、嘴角紋、颏溝、低下颌、口唇接縫等)、充填皮膚凹陷、掩飾瘢痕、增加唇部體積、擴大面頰、鼻子矯正、及/或改良皮膚水合作用及皮膚紋理。
本發明現進一步藉由以下非限制性實例進行闡明。
實例
下文提供之實例闡明本發明可注射軟組織充填劑之製法，該充填劑具有在人體中之良好抗性、極佳生物相容性、及用作軟組織充填劑之理想機械及流變性質。
實例1 製備單相型HA凝膠(先前技術)
將3.43g透明質酸(η=0.6m3/kg；Mw=3.0 x 105Da)於13ml注射用水中稀釋以使該透明質酸水合，再交聯。在水合16小時後，均質化該混合物直至獲得透明溶液。
該交聯反應隨後藉由將2.48g 2M NaOH溶液、5.74g注射用水、及390mg 1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)添加至反應混合物來起始，接著在50℃下混合1小時及在50℃下交聯3小時。接著，使用1M HCl將pH調整至生理pH，及使用pH 7.0之PBS緩衝液將體積稀釋至53.52ml。
獲得之凝膠隨後對35公升pH 7.0之PBS緩衝液透析48小時(分離之限制：MW=12至14kDa)。所得之凝膠產物具有25mg/ml之經調整總透明質酸濃度。使用pH 7.0之PBS緩衝液完成該調整。最後，該凝膠藉由蒸氣殺菌在127℃殺菌4至10分鐘。所得之凝膠係下文的「凝膠A」。
實例2 製備單相型肝素原凝膠(先前技術)
將3.68g肝素原(MW=2.0 x 105Da)於12.77ml注射用水中稀釋以使該肝素原水合，再交聯。在水合16小時後，均質化該混合物直至獲得透明溶液。
該交聯反應隨後藉由將2.48g 2M NaOH溶液、5.73g注射用水、及390mg 1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)添加至該反應混合物來起始，接著在50℃下混合1小時及在50℃下交聯3小時。接著，使用1M HCl將pH調整至生理pH，及使用pH 7.0之PBS緩衝液將體積稀釋至53.39ml。
獲得之凝膠隨後對35公升pH 7.0之PBS緩衝液中透析48小時(分離 之限制：MW=12至14kDa)。所得之凝膠產物具有25mg/ml之經調整總肝素原濃度。使用pH 7.0之PBS緩衝液完成該調整。最後，該凝膠藉由蒸氣殺菌在127℃殺菌4至10分鐘。所得之凝膠係下文的「凝膠B」。
實例3 製備根據本發明之肝素原/HA軟組織充填劑
將1.71g透明質酸(η=0.6m3/kg，MW=3.0 x 105Da)及1.84g肝素原(MW=2.5 x 105Da)於12.88ml注射用水中稀釋以使該透明質酸及肝素原水合，再交聯。在水合16小時後，均質化該混合物直至獲得透明溶液。
該交聯反應隨後藉由將2.48g 2M NaOH、5.71g注射用水、及390mg 1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)添加至該反應混合物來起始，接著在50℃下混合1小時及在50℃下交聯3小時。接著，使用1M HCl將pH調整至生理pH，及使用pH 7.0之PBS緩衝液將體積稀釋至53.71ml。
獲得之凝膠隨後對35公升pH 7.0之PBS緩衝液透析48小時(分離之限制：MW=12至14kDa)。所得之凝膠產物具有12.5mg/ml之經調整總透明質酸濃度及12.5mg/ml總肝素原濃度，即，25.0mg/ml之總聚合物濃度。使用pH 7.0之PBS緩衝液完成該調整。最後，該凝膠藉由蒸氣殺菌在127℃殺菌4至10分鐘。所得之凝膠係下文的「凝膠C」。
實例4 製備根據本發明之交聯HA凝膠與交聯肝素原凝膠的物理混合物
首先，根據實例1製備交聯HA凝膠(凝膠A)。分開地，根據實例B製備交聯肝素原凝膠(凝膠B)。
接著，預形成之交聯HA凝膠A與預形成之交聯肝素原凝膠B係藉由經由魯爾鎖定適配器連接含有凝膠A之第一1mL注射器及含有凝膠 B之第二1mL注射器，接著手動來回混合20次以1：1重量比混合。凝膠A與凝膠B之物理混合物係下文的「凝膠D」。
實例5 製備根據本發明之HEP核+HA殼軟組織充填劑
將1.79g肝素原(「HEP」；MW=2.0 x 105Da)於6.44mL注射用水中稀釋以使該肝素原水合，再交聯。在水合16小時之後，均質化該混合物直至獲得透明溶液。
該交聯反應隨後藉由將1.24g 2M NaOH溶液、2.86g注射用水、及190mg 1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)添加至該反應混合物來起始，接著在50℃下混合1h及在50℃下交聯1小時以獲得預交聯之肝素原凝膠。
分開地，將1.79g透明質酸(η=0.6m3/kg，MW=3.0 x 105Da)於6.44ml注射用水中稀釋以使該透明質酸水合，再交聯。在水合16小時後，均質化該混合物直至獲得透明溶液。
隨後將獲得之HA溶液添加至上文獲得之預交聯肝素原凝膠，均勻混合，及該交聯反應藉由將1.24g 2M NaOH溶液、2.86g注射用水、及190mg 1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)添加至該反應混合物來起始，接著在50℃下混合10分鐘及在50℃下交聯3小時。接著，使用1M HCl將pH調整至生理pH，及使用pH 7.0之PBS緩衝液將體積稀釋至50.70ml。
獲得之凝膠隨後對35公升pH 7.0之PBS緩衝液透析48小時(分離之限制：MW=12至14kDa)。所得之凝膠製品具有23.0mg/ml之經調整總聚合物濃度(11.5mg/ml總肝素原濃度及11.5mg/ml之總HA濃度)。使用pH 7.0之PBS緩衝液完成該調整。最終，該凝膠藉由蒸氣殺菌在127℃殺菌4至10分鐘。所得之凝膠係下文的「凝膠E」。
實例6 製備根據本發明之HA核+HEP殼軟組織充填劑
將1.79g透明質酸(η=0.6m3/kg，MW=3.0 x 105Da)於6.44ml注射用水中稀釋以使該透明質酸水合，再交聯。在水合16小時之後，均質化該混合物直至獲得透明溶液。
該交聯反應隨後藉由將1.24g 2M NaOH溶液、2.86g注射用水、及190mg 1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)添加至該反應混合物來起始，接著在50℃下混合1h及在50℃下交聯1小時以獲得預交聯之HA凝膠。
分開地，將1.79g肝素原(「HEP」，MW=2.0 x 105Da)於6.44ml注射用水中稀釋以使該肝素原水合，再交聯。在水合16小時後均質化該混合物直至獲得透明溶液。
隨後將獲得之肝素原溶液添加至上文獲得之預交聯HA凝膠，均勻混合，及交聯反應藉由將1.24g 2M NaOH溶液、2.86g注射用水、及190mg 1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)添加至該反應混合物來起始，接著在50℃下混合10分鐘及在50℃下交聯3小時。接著，使用1M HCl將pH調整至生理pH，及使用pH 7.0之PBS緩衝液將體積稀釋至51.49ml。
獲得之凝膠隨後對35公升pH 7.0之PBS緩衝液中透析48小時(分離之限制：MW=12至14kDa)。所得之凝膠產物具有23.0mg/ml之經調整總聚合物濃度(11.5mg/ml總肝素原濃度及11.5mg/ml之總HA濃度)。使用pH 7.0之PBS緩衝液完成該調整。最後，該凝膠藉由蒸氣殺菌在127℃殺菌4至10分鐘。所得之凝膠係下文的「凝膠F」。
實例7 在實例1至6中製備之凝膠A至F之比較
在此實例中，在實例1至6製備之凝膠A至F以其擠壓力、彈性模量(G')與黏性模量(Tanδ)、及其對藉由透明質酸酶之酶促降解的抗性 進行特徵分析。
使用配有1°、50mm直徑圓錐之Anton Paar MCR 302流變儀進行全部流變測量。以0.1mm固定間隙，在0.1至10Hz頻率(f)下進行測量。經由30G½針頭在12.5mm/min速度下使用標準注射器來測量注射力。
在第一實施例中，使用100U透明質酸酶使凝膠A至F經歷酶促降解。該透明質酸酶處理不導致凝膠B(交聯肝素原)之任何降解，如由隨時間之恆定彈性模量(G')表明(未顯示結果)。然而，發現凝膠C(交聯HEP+HA)、凝膠E(HEP核+HA殼)、及凝膠F(HA核+HEP殼)對酶促降解敏感。顯著地，與凝膠A、C、D、及E相比，凝膠F較不易於降解。不受任何理論束縛，此效應可能由於存在環繞HA核之較少可降解HEP殼(或「塗層」)。這全部係更顯著，由於發現具有相對結構(HEP核+HA殼)之凝膠E具有與凝膠A(交聯HA)相似之降解特性。
此外，使凝膠A至F經歷流變及擠壓力測試。結果顯示在表1中。
1=僅交聯HA(cHA)
2=僅交聯HEP(cHEP)
3=交聯HEP+HA
4=凝膠A與凝膠B之1：1混合物
5=HEP核+HA殼
6=HA核+HEP殼
如從表1可見，根據本發明之凝膠C至F具有在15至32N範圍內之低擠壓力值。對比而言，凝膠A(即交聯HA凝膠)具有62N之較高擠壓 力。此外，凝膠C至E具有與在凝膠A(cHA)及凝膠B(cHEP)中觀察到之彼等相同範圍之G'及Tanδ值。凝膠F具有與凝膠C至E相比較低之G'及Tanδ，但是展現較高酶促降解抗性(參見上文)。由此，該等實例表明根據本發明之凝膠可經由細針頭輕易擠出同時具有理想黏彈流變性質(G'及Tanδ)。

Claims (15)

  1. 一種為凝膠形式之可注射軟組織充填劑組合物，其包括與1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)交聯之肝素原(heparosan)及透明質酸(HA)或其鹽之一，以形成交聯HA-肝素原基質。
  2. 一種為凝膠形式之可注射軟組織充填劑組合物，其包括(i)與BDDE交聯之透明質酸(HA)(或其鹽之一)之預形成凝膠、及(ii)與BDDE交聯之肝素原(或其鹽之一)之預形成凝膠的混合物。
  3. 一種為凝膠形式之可注射軟組織充填劑組合物，其包括雙交聯透明質酸(HA)-肝素原基質，其藉由以下製備：(a)BDDE交聯肝素原(或其鹽之一)，以形成交聯肝素原凝膠，混合HA(或其鹽之一)與該交聯肝素原凝膠，及BDDE交聯該HA(或其鹽之一)及該交聯肝素原凝膠，以獲得該雙交聯HA-肝素原基質，或(b)BDDE交聯HA(或其鹽之一)，以形成交聯HA凝膠，混合肝素原(或其鹽之一)與該交聯HA凝膠，及BDDE交聯該肝素原(或其鹽之一)及該交聯HA凝膠，以獲得該雙交聯HA-肝素原基質。
  4. 一種為凝膠形式之可注射軟組織充填劑組合物，其包括三交聯透明質酸(HA)-肝素原基質，其藉由以下步驟製備：BDDE交聯肝素原(或其鹽之一)，以形成交聯肝素原凝膠，BDDE交聯HA(或其鹽之一)，以形成交聯HA凝膠，混合該交聯肝素原凝膠與該交聯HA凝膠，及BDDE交聯該交聯肝素原凝膠與該交聯HA凝膠之該混合物，以獲得該三交聯HA-肝素原基質。
  5. 如請求項1至4中任一項之可注射軟組織充填劑組合物，其中在該交聯HA-肝素原基質中肝素原對HA之重量比係約1：99至約99：1，例如，約50：50至約99：1，及/或其中該交聯HA-肝素原基質 具有約0.5%至約25%之修飾度，其表示為單與雙連接之BDDE交聯劑總數對HA與肝素原二糖單元總數之比。
  6. 如請求項1至5中任一項之可注射軟組織充填劑組合物，其中該肝素原具有約0.5 x 105Da至約6.8 x 106Da之分子量，及/或該HA具有約1.0 x 105Da至約5.0 x 106Da之分子量，及/或其中該HA包括具有在約1.0 x 105Da至低於約1.0 x 106Da範圍之第一分子量的第一HA及具有在約1.0 x 106Da至約5.0 x 106Da範圍之第二分子量的第二HA，及/或該肝素原包括具有在約1.0 x 105Da及9.0 x 105Da範圍之第一分子量的第一肝素原及具有在約1.0 x 106Da至約3.0 x 106Da範圍之第二分子量的第二肝素原。
  7. 如請求項1至6中任一項之可注射軟組織充填劑組合物，其進一步包括非交聯HA及/或非交聯肝素原，其中該非交聯HA具有例如約3.0 x 105Da至約3.0 x 106Da之分子量，及/或其中該非交聯肝素原具有例如約1.0 x 105Da至約6.8 x 106Da之分子量，及/或其中該非交聯HA及/或該非交聯肝素原之總含量係基於存在於該可注射軟組織充填劑組合物中之交聯及非交聯肝素原及HA聚合物的總重量計約1重量%至約50重量%。
  8. 如請求項1至7中任一項之可注射軟組織充填劑組合物，其中存在於該可注射軟組織充填劑組合物中之交聯與非交聯肝素原及交聯與非交聯HA聚合物之總濃度係約10mg/ml至約35mg/ml，及/或其中該組合物進一步以例如基於該可注射軟組織充填劑組合物之全部多糖之總重量計低於10重量%之含量包括一或多種除HA及肝素原外之多糖，該一或多種其他多糖係選自例如由下列組成之群：硫酸軟骨素、角質素、硫酸角質素、肝素、硫酸肝素、纖維素及其衍生物、殼聚糖、鹿角菜膠、黃原膠、及藻酸鹽、或其鹽之一。
  9. 如請求項1至8中任一項之可注射軟組織充填劑組合物，其中該可注射軟組織充填劑組合物不含有除非交聯HA外之其他非交聯聚合物，或其中該可注射軟組織充填劑組合物不含有任何非交聯聚合物，或其中該可注射軟組織充填劑組合物不含有任何除HA與肝素原外之非交聯及交聯聚合物。
  10. 如請求項1至9中任一項之可注射軟組織充填劑組合物，其中該組合物進一步包括具有約1μm至約1000μm之平均粒度之粒子，其中該粒子係例如陶瓷粒子，特定而言羥磷灰石鈣粒子，及其中該等陶瓷粒子係例如以約5重量%至約60重量%之含量含於該可注射軟組織充填劑組合物，及/或其中該組合物進一步包括至少一種活性物質，例如，麻醉劑，特定而言利多卡因(lidocaine)，更特定而言以基於該可注射軟組織充填劑組合物之總重量計約0.05重量%至約5.0重量%之含量的利多卡因，及/或該組合物進一步包括一或多種選自由下列組成之群的化合物：多元醇、維生素、胺基酸、金屬、及礦物質。
  11. 如請求項1至10中任一項之可注射軟組織充填劑組合物，其中對於不具有粒子之充填劑組合物而言在1Hz交叉頻率(f)下的彈性模量G'係約20Pa至1000Pa，及對於具有粒子之充填劑組合物而言約400Pa至約5000Pa，及/或其中經由27G½針頭在12.5mm/min速度下使用標準注射器測得之注射力係約10N至35N，及/或其中滲透壓在約200mOsmol/l至約400mOsmol/l之範圍，及/或其中pH係在約6.5與約7.5間。
  12. 一種包括與BDDE交聯之肝素原基質及羥磷灰石鈣之可注射軟組織充填劑組合物，其中基於該可注射軟組織充填劑組合物之總重量計，該肝素原以例如約0.5重量%與約4.0重量%間之含量存在，及/或該羥磷灰石鈣以例如約1重量%與70重量%間之含量存 在。
  13. 一種包括注射器之套組，該注射器含有如請求項1至12中任一項之可注射軟組織充填劑。
  14. 一種製備如請求項1或就附屬於請求項1而言之請求項5至11中任一項之可注射軟組織充填劑組合物之方法，其包括以下步驟：(a)提供包括透明質酸(HA)、肝素原及1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)之水性混合物，及(b)使用BDDE作為交聯劑交聯(a)之該混合物，以獲得交聯HA-肝素原基質；或一種製備如請求項2或就附屬於請求項2而言之請求項5至11中任一項之可注射軟組織充填劑組合物之方法，其包括以下步驟：(i)提供包括透明質酸(HA)(或其鹽之一)及1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)之水性混合物，(ii)使用BDDE作為交聯劑交聯(i)之該混合物，以獲得交聯HA凝膠，(iii)提供包括肝素原(或其鹽之一)、及1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)之水性混合物，(iv)使用BDDE作為交聯劑交聯(iii)之該混合物，以獲得交聯肝素原凝膠，及(v)混合步驟(ii)之該交聯HA凝膠及步驟(iv)之該交聯肝素原凝膠；或一種製備如請求項3或就附屬於請求項3而言之請求項5至11中任一項之可注射軟組織充填劑組合物之方法，其包括以下步驟：(a’)提供包括肝素原(或其鹽之一)及1,4-丁二醇二縮水甘油醚 (BDDE)之水性混合物，(b’)使用BDDE作為交聯劑交聯(a’)之該混合物，以獲得交聯肝素原凝膠，(c’)混合HA(或其鹽之一)及可選之BDDE與該交聯肝素原凝膠，及(d’)使用BDDE作為交聯劑交聯(c’)之該混合物，以獲得雙交聯HA-肝素原基質，或其包括以下步驟：(a”)提供包括HA(或其鹽之一)及1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)之水性混合物，(b”)使用BDDE作為交聯劑交聯(a”)之該混合物，以獲得交聯HA凝膠，(c”)混合肝素原(或其鹽之一)及可選之BDDE與該交聯HA凝膠，及(d”)使用BDDE作為交聯劑交聯(c”)之該混合物，以獲得雙交聯HA-肝素原基質；或一種製備如請求項4或就附屬於請求項4而言之請求項5至11中任一項之可注射軟組織充填劑組合物之方法，其包括以下步驟：(1)提供包括HA(或其鹽之一)及1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)之水性混合物，(2)使用BDDE作為交聯劑交聯(1)之該混合物，以獲得交聯HA凝膠，(3)提供包括肝素原(或其鹽之一)及1,4丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)之水性混合物，(4)使用BDDE作為交聯劑交聯(3)之該混合物，以獲得交聯肝 素原凝膠，(5)混合(2)之該交聯HA凝膠與(4)之該交聯肝素原凝膠及可選之BDDE，及(6)使用BDDE作為交聯劑交聯(5)之該混合物，以獲得三交聯HA-肝素原基質；或一種製備如請求項12之可注射軟組織充填劑組合物之方法，其包括以下步驟：(A)提供包括肝素原(或其鹽之一)及1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)之水性混合物，(B)使用BDDE作為交聯劑交聯該肝素原(或其鹽之一)，以獲得交聯肝素原基質，及(C)添加羥磷灰石鈣。
  15. 一種如請求項1至12中任一項之可注射軟組織充填劑組合物或如請求項13之套組之用途，其用於替代或充填生物性組織或增加生物性組織之體積。
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