KR20070073507A

KR20070073507A - 잎새버섯에서 분리한 균주의 액체 배양 및 효소 분해에의한 다당체의 제조방법

Info

Publication number: KR20070073507A
Application number: KR1020060001472A
Authority: KR
Inventors: 김시경
Original assignee: 김시경; 주식회사 마크로케어
Priority date: 2006-01-05
Filing date: 2006-01-05
Publication date: 2007-07-10
Also published as: KR100834228B1

Abstract

본 발명은 잎새버섯(무이버섯, Grifola frondosa) 의 균사체 액체 배양 및 효소 분해에 의한 베타-글루칸(beta-glucan)이 주 성분인 다당체의 제조방법에 관한 것으로서, 담자균류인 잎새버섯( Grifola frondosa ) 균주를 포도당 4%, 이스트추출물(yeast extract) 0.5%, 맥아추출물(malt extract) 0.5%, 일인산칼륨(KH₂PO₄) 0.1%,황산마그네슘(MgSO₄) 0.05% 의 배지 조성물에서 균사체 액체 배양 시에 다당체를 제조하는 방법과, 배양 중기에 배지를 추가로 급이(feeding)하여 다당체 생성을 증가시키 방법, 다당체 생성에 활성탄을 첨가하여 다당체 생성을 증가시키는 방법을 적어도 포함하는 것을 특징으로 하여 일반적인 배양법보다도 약 2 배 이상의 다당체를 얻을 수 있고, 또한 효소 생산 균주의 직접 배양으로 인해 효소의 사용 비용을 절감할 수 있으며, 효소처리 또는 효소 생성균 배양 시 세포벽 파쇄 추출뿐 아니라 고분자 베타-글루칸(beta-glucan)의 저분자화 효과로 용해성을 증가하여 건강식품에 대한 적용성을 증대시켜 분말제조와 액상제조 시에 유용성을 제공한다.

잎새버섯(무이버섯, Grifola frondosa), 베타-글루칸(beta-glucan), 다당체, 면역증강, 세포벽 파쇄

Description

잎새버섯에서 분리한 균주의 액체 배양 및 효소 분해에 의한 다당체의 제조방법{A manufacturing method of polysaccharose from Grifola frondosa by liquid culturing and enzyme decomposition}

도 1 은 본 발명의 잎새버섯(Grifola frondosa)에서 분리한 균주의 액체 배양 및 효소 분해에 의한 다당체의 제조방법에 따른 실시예에서의 다당체 수득량을 도시하는 실험도표.

도 2 는 본 발명의 잎새버섯(Grifola frondosa)에서 분리한 균주의 액체 배양 및 효소 분해에 의한 다당체의 제조방법에 따른 실시예에 의한 균사체 추출분말의 베타-글루칸의 함량표.

본 발명은 잎새버섯(Grifola frondosa)에서 확보한 균주를 사용하여 균사체 액체 배양을 통해 다당체를 생산하는 것으로서, 더욱 상세하게는 균사체 액체 배양 시에 생성되는 세포 외의 다당체를 추출하고, 배양액에 세포벽을 파쇄하는 효소를 반응시켜서 균사체 세포벽을 파쇄한 뒤에 세포 내의 다당체를 효과적으로 얻는 방법의 제공에 관한 것이다.

또한 생산효율을 높이면서 효소 사용의 동등한 효과를 보기 위해서 효소를 생성하는 균주를 잎새버섯 균사체 배양액에 필수 배지만을 첨가하여 배양함으로써 세포벽 파쇄 효과와 대량생산을 가능하게 하는 방법에 관한 것이다.

용이하게 자연 채취할 수 있는 잎새버섯의 균사체 액체 배양 시에 생성되는 다당체의 주성분은 베타(beta)-1,3-(1,6)디(D)-글루칸(glucan) 이고, 버섯의 자실체나 균사체에 의한 항암 효과 등을 나타내는 성분이 다당체 중에서 바로 베타-글루칸(beta-glucan) 임이 입증되고 있다.

자실체 열수 추출 시에는 분말화하였을 경우에 베타-글루칸(beta-glucan)의 함량이 10 % 내외로 낮지만, 균사체 액체 배양 시에 정제액을 분말화 하였을 경우 베타-글루칸(beta-glucan)의 함량이 60 % 이상을 차지하고 있어서 각종 생리활성을 증가시키는 데는 균사체 액체 배양에 의한 다당체를 얻는 방법이 효율적이다.

지금까지 알려진 잎새버섯 베타-글루칸(beta-glucan)이 주성분인 다당체를 얻는 방법은 국내 특허 공개번호 2002-0081825호 (발명의 명칭 : 잎새버섯에서 유래한 단백 다당체의 제조방법)에서는 잎새버섯으로부터 열수추출 및 알코올혼합에 의한 추출에 의한 제조가 있으며, 특허공고 번호 1983-0000309호 (발명의 명칭 : 제암활성을 가진 다당류의 제조법)에서는 잎새버섯 자실체나 균사체로부터 분리정제방법에 의한 제조 등이 있으나,

상기 특허들에서 균사체 액체 배양 시에 얻을 수 있는 균사체와 다당체의 생성양과 다당체의 주성분인 베타-글루칸(beta-glucan)의 함량에 대한 언급이 없어서 이 방법에 의한 다당체 획득의 효율성을 입증할 근거가 없다.

상기의 공개 방법들을 보완하여 잎새버섯 균사체 액체 배양과 효소 반응에 의해 베타-글루칸(beta-glucan)이 주성분인 다당체의 대량생산 기술이 필요한 실정이다.

본 발명의 잎새버섯(Grifola frondosa)에서 분리한 균주의 액체 배양 및 효소 분해에 의한 다당체의 제조방법에서는 잎새버섯 균사체 액체 배양과 효소 반응에 의해 베타-글루칸(beta-glucan)이 주성분인 다당체의 대량생산의 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.

이에 본 발명자들은 베타-글루칸(beta-glucan)이 주성분인 다당체를 높은 수율의 생산량을 얻기 위해 연구한 결과,

잎새버섯 균주를 분리하고 균사체의 대량 생산을 위해서 배지, 페어(pH), 교반(agitation), 통기(aeration) 등을 설정하는 배양 최적 조건을 얻을 수 있었다.

균사체 액체 배양액 분리 정제 시, 세포 외 다당체와 열수추출 및 효소반응에 의해 세포벽 파쇄로 인한 세포 내 다당체까지 추가로 수득할 수 있었다.

또 대량생산 배양 시에 효소 사용에 의한 고비용의 부담을 줄이기 위해 효소 생산 균주를 배양액에 균사체를 배지원으로 사용하고 필수 배지만을 첨가하여 배양을 해서 균사체의 세포벽 파쇄로 인한 다당체의 수득량을 증가시킴으로써 본 발명을 완성하였다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 제조방법에서의 제조공정은

(1) 잎새버섯 균사체 액체 배양 시, 다당체를 최대한 생성하기 위한 배양조건을 최적화 시키고,

(2) 최적화된 배양조건에 의한 배양액을 열수추출과 에탄올 침전을 시키기 전에 효소 반응을 시켜서 세포벽을 파쇄한 뒤 세포 내 다당체를 추출하여 배양에 의한 다당체의 수율을 높이고,

(3) 또는 배양종료액에 세포벽 파쇄 효소 생성 균주를 배양액에 배양하여 다당체를 추출하고, 파쇄된 균사체를 제외한 추출액을 에탄올 침전시켜서 고함량 베타-글루칸(beta-glucan)을 분말화하는 것을 기본적인 기술적인 사상으로 하고 있다.

이하의 부수된 도면과 실시예와 함께 본 발명의 잎새버섯(Grifola frondosa)에서 분리한 균주의 액체 배양 및 효소 분해에 의한 다당체의 제조방법을 더욱 상세하게 설명한다.

도 1 은 본 발명의 잎새버섯(Grifola frondosa)에서 분리한 균주의 액체 배양 및 효소 분해에 의한 다당체의 제조방법에 따른 실시예에서의 다당체 수득량을 도시하는 실험도표, 도 2 는 본 발명의 잎새버섯(Grifola frondosa)에서 분리한 균주의 액체 배양 및 효소 분해에 의한 다당체의 제조방법에 따른 실시예에 의한 균사체 추출분말의 베타-글루칸의 함량표이다.

본 발명의 실시예적인 제조방법은 다음과 같다.

잎새버섯 균주로부터 액체 배양 생산성을 향상시키기 위해서 배지 조성 즉 탄소원, 질소원, 기타 무기염류 각각의 조성에 적정량을 사용하고,

페아(pH)의 조절, 교반(agitation) 및 통기(aeration)의 제공, 증식기(로그페이즈:log phase)에서의 추가 배지의 제공(feeding) 및 흡착제의 첨가 등에 대한 최적 조건으로 액체배양을 하였다.

기존의 방법에서는 균사체 액체 배양액에서 열수 추출에 의해 균사체 다당체를 분리, 정제함으로써 다당체를 획득하는 것이 가능하지만, 본 배양에서는 세포 외 다당체를 회수하고 열수추출에 의한 세포 내 다당체의 회수가 가능하였다.

한편, 배양 중에는 엔도글루카나아제(endo-1,3-beta-glucanase)와,

FIS(fruiting-inducing substance, 자실체 형성 유도물질)로 알려진 성분들이 생성되어 엔도글루카나아제는 이미 생산된 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 분해하여 수율을 떨어뜨리는 요인이 되며, FIS는 균사체의 생장을 억제하고 자실체 형성을 유도하는 물질로서, FIS에 의해 균사체 생장이 중단되면 베타-글루칸의 생성도 중단되는 요인이 될 수 있다.

상기 배양액에 활성탄 분말을 0.1 - 3 % 의 양으로 첨가하여 FI,S색소 및 단백질 성분 등을 흡착시킴으로써 보다 효과적으로 다당체를 회수할 수 있다.

세포 내 다당체 추출에 있어서 기존의 방법에서는 균사체 액체 배양액에서 열수 추출에 의해 균사체 다당체를 분리, 정제함으로써 다당체를 획득하는 것이 가능하지만, 균사체 내에서 존재하는 세포 내의 일부 다당체는 여과공정에서 균사체와 함께 버려지는 것이 일반적이었다.

종료된 배양액에 효소반응을 시킨 결과 세포 내 유용한 다당체를 추가로 획득할 수 있었다.

잎새버섯 균사체의 세포벽을 파쇄할 수 있는 효소는 아밀라아제(amylase), 셀룰라아제(cellulase),글루카나아제(glucanase),헤미셀룰라아제(hemicellulase), -글루코시다제(glucosidase),라이소자임(lysozyme),키틴나아제(chitinase),펙티나아제(pectinase) 등에서 세포벽 파쇄 효과를 최대한 얻을 수 있는 2 종 이상을 동시에 사용하는 것이 바람직하다.

효소 반응 시에 역가를 최대한 높이기 위해서 페아(pH)와 온도는 효소의 특성에 맞게 조건을 변경하여야 한다. 상기 방법에서는 균사체 세포벽 파쇄에 가장 효과가 좋은 셀룰라아제와 라이소자임을 혼합하여 사용하였다.

균사체 세포벽을 파쇄하기 위해 셀룰라아제와 기타 세포벽 파쇄 효소 중에 1종 내지 2 종을 사용하는 것이 가장 적합한 방법이지만, 정제된 효소를 사용하는 것은 다당체의 추가 수득량과 효소의 사용량에 대한 비용적인 면을 고려해야 한다.

균사체 액체 배양으로 다당체를 대량 생산 시에 효소를 구입 또는 자체 생산하여 사용하는 것은 시간과 비용이 많이 드는 단점이 생긴다.

본 발명에서는 효소반응으로 다당체의 생산량을 늘리는 것을 확인하고, 배양액에 세포벽을 파쇄하는 셀룰라제(cellulase) 생성 균주를 배양 접종한다. 무기염류의 최소량만으로 첨가된 배양액에 배양을 한 결과 균사체의 파쇄효과와 베타-글루칸(beta-glucan) 분말 제조 시에 용해도를 증가시켰다.

실시예 1; 배양조건 최적화

잎새버섯 버섯 균사체는 야생에서 채취한 잎새버섯 포자를 배양하고 준비한다. P.D.A(potato dextrose agar) 평판 배지에서 26 ℃에서 10 일간 배양한 후 4 ℃에서 보존하였고, 1 개월마다 계대 배양하면서 사용하였다.

다시 종균용 배지 100 ml를 함유한 1L 삼각플라스크에 접종하고, 26 ℃, 100 rpm으로 10 일간 진탕 배양하였다.

본 발명에서 사용한 발효기는 5L 용량으로서 배양 체적을 3L 로 하고, 상기 단계의 균사체를 포도당 2 ~ 5 %, 바람직한 것은 4 %, 효모 추출물 0.3 ~ 0.8 %, 바람직한 것은 0.5 %, 맥아추출물 0.3 ~ 0.8 %, 바람직한 것은 0.5%, 일인산칼륨(KH₂PO₄) 0.05 ~ 0.2 %, 바람직한 것은 0.1 %, 황산마그네슘(MgSO₄) 0.01 ~ 0.1 %, 바람직한 것은 0.05 % 를 함유한 액을 121 ℃ 로 15 분간 멸균처리하고 접종액을 배양액 대비 5~20 %, 바람직하게는 10 % 를 접종한다.

배양조건으로는 중성으로부터 약산성의 쪽이 균체의 생육이 양호하게 되기 위해 pH 4~6, 바람직한 것은 pH 5, 온도 20 ~ 35 ℃, 바람직한 것은 26 ℃, 회전수 100 ~ 500 rpm, 바람직한 것은 300 rpm, 통기량 0.5 ~ 2 vvm, 바람직한 것은 1 vvm으로 배양기간은 5 ~ 15 일간, 바람직한 것은 10 일간으로 배양한다.

상기 배양액에 다당체의 생성량을 증대시키기 위해서 증식기(log phase)인 배양 3~4 일째에 베타-글루칸을 형성하는 주성분인 포도당과 효모추출물을 첨가한다.

또 상기 배양액에 다당체의 생성량을 증대시키기 위해서 배양 중기인 4 ~ 7 일째에 활성탄 분말을 0.1-3 % 바람직하게는 0.5 % 를 첨가할 수 있다.

배양 종료액에 동량의 이온수를 첨가하여 100 ℃, 2 시간 동안 열수추출을 한다. 열처리 된 배양액에 압착 여과기로 다당체와 균사체 및 불용성 물질들을 분리한다. 여액을 한 외 여과하여 배지 중에 사용되지 않은 포도당과 염류를 제거하고, 2-4배량의 (v/v %)에탄올, 바람직하게는 3 배량을 가하여 4℃에서 12 시간 다당체를 침전시킨 후 에탄올로 3회 정도 세척한다. 이 침전액을 원심분리하여 45℃, 24 시간 이상 동결 또는 진공건조하여 다당체 분말을 얻을 수 있었다.

실시예 2; 세포벽 파쇄

[실시예 1]에서와 동일한 방법으로 배양을 한 후 배양액을 100 ℃에서 30 분 동안 열처리를 한다.

세포 외 다당체와 일부 세포 내 다당체가 추출되고 교반(agitation)이 원활한 상태에서 효소반응을 시킨다. 셀룰라아제와 라이소자임 의 첨가량은 배양액 액량 기준으로 각각 0.1~ 2 %, 바람직하게는 0.5%를 사용하고, 10 ~ 20 시간, 바람직하게는 15 시간 정도 반응시킨다.

반응이 종료되었을 경우에 효소의 활성 억제 및 변성(denaturation)시키고 다당체를 추출하기 위해서 다시 100 ℃, 2 시간 열수추출을 한다.

이하 반응은 [실시예 1]의 정제방법과 동일하나 알코올을 4-6배 량, 바람직하게는 5 배량을 첨가하여 4 ℃ 이하에서 48 시간 침전시켜 저분자화 된 다당체까지 회수한다.

실시예 3; 균주 배양

셀룰라아제 생성 균주인 트리코더마리세이(Trichoderma reesei) 균 성장에 필요한 최소 배지 조성은 무기염류 중에서 황산암모늄 0.1~0.5 %, 바람직하게는 0.2 %, 일인산칼륨 0.1~0.5 %, 바람직하게는 0.2 % 를 별도 멸균하여 배양액에 첨가한 후 균주의 접종량은 01~10 %, 바람직하게는 5 % 를 접종하고, 배양시간은 12~72 시간, 세포벽 분해의 효과를 얻기 위해서는 48 시간 정도 배양한다. 배양 후 효소실활을 시키고 열수추출하기 위해 다시 100 ℃, 2 시간 열처리를 한다.

이하 반응은 [실시예 1]의 정제방법과 동일하나 알코올을 4-6 배량, 바람직하게는 5 배량을 첨가하여 4 ℃ 이하에서 48 시간 침전시켜 저분자화 된 다당체까지 회수한다.

실시예 4; 베타-글루칸 측정

본 배양에 의해 얻어진 잎새버섯 균사체의 베타-글루칸을 알려져 있는 효소 분석법 (McCleary, B.V. Journal of the Institute of Brewing, 91, 285-295, 1985; Manzi, P. Food Chemistry, 68, 315-318,2000)을 제조된 분말에 맞게 전처리하여 정량하였다.

배양방법 및 추출방법에 따른 다당체 회수 결과는 도 1 , 2의 표에서 나타내었다.

이상에서 설명한 바와 같이,

본 발명은 잎새버섯 버섯 균사체 배양을 통해서 다당체를 얻는 방법을 향상시킬 수 있었을 뿐만 아니라, 효소처리에 의해 균사체의 세포벽을 파쇄하여 균사체 내에서 생성되는 다당체를 추가로 추출하여 일반적인 배양법보다도 약 2 배 이상의 다당체를 얻을 수 있었고, 또한 효소 생산 균주의 직접 배양으로 인해 효소의 사용비용을 절감할 수 있었다.

효소처리 또는 효소 생성균 배양시 세포벽 파쇄 추출뿐 아니라 고분자 베타-글루칸(beta-glucan)의 저분자화 효과로 용해성을 증가시킬 수 있으며 건강식품에 대한 적용성을 증대시켜 분말제조와 액상제조 시에 유용한 발명인 것이다.

Claims

담자균류인 잎새버섯( Grifola frondosa ) 균주를 포도당 4%, 이스트추출물(yeast extract) 0.5%, 맥아추출물(malt extract) 0.5%, 일인산칼륨(KH₂PO₄) 0.1%,황산마그네슘(MgSO₄) 0.05%의 배지 조성물에서 균사체 액체 배양 시에 다당체를 제조하는 방법과,

상기 배양 중기에 배지를 추가로 급이(feeding)하여 다당체 생성을 증가시키는 방법,

상기 다당체 생성에 활성탄을 첨가하여 다당체 생성을 증가시키는 방법;

을 적어도 포함하는 것을 특징으로 하는 잎새버섯(Grifola frondosa)에서 분리한 균주의 액체 배양 및 효소 분해에 의한 다당체의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 배양액 분리 정제공정 시에 세포벽을 파쇄하는 효소 반응으로 세포 내의 다당체를 추가 수득하는 것을 특징으로 하는 잎새버섯(Grifola frondosa)에서 분리한 균주의 액체 배양 및 효소 분해에 의한 다당체의 제조방법
제 1 항에 있어서,

상기 배양액에 셀룰라제 생성 균주를 접종하여 균사체 세포벽을 분해하는 효 소를 생성하여 세포벽 파쇄 후 세포 내 다당체를 추가 수득하는 것을 특징으로 하는 잎새버섯(Grifola frondosa)에서 분리한 균주의 액체 배양 및 효소 분해에 의한 다당체의 제조방법.
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,

상기 효소반응이 종료된 배양액에서 파쇄된 균사체와 효소를 분리하고 용해성이 증가 된 베타-글루칸(beta-glucan) 분말을 제조하는 것을 특징으로 하는 잎새버섯(Grifola frondosa)에서 분리한 균주의 액체 배양 및 효소 분해에 의한 다당체의 제조방법.