TWI387620B - 交聯透明質酸之製造方法 - Google Patents

Description

交聯透明質酸之製造方法

本發明係有關一種製造交聯透明質酸(cross-linked hyaluronic acid，cross-linked HA)之技術。詳言之，本發明係關於一種降低產品中交聯劑含量之交聯透明質酸製造方法。

透明質酸為一多醣，其結構由β-1,3-葡萄糖乙醯胺(β-1,3-N-acetyl glucosamine)及β-1,4-葡萄糖酸(β-1,4-glucuronic acid)以β-1-4鍵結形成分子量約為400 D之雙醣重覆單位，此雙醣重覆單位再以β-1-3鍵結重覆連結，形成之直鏈高分子聚合物。其商業來源可由菌種如鏈球菌屬的醱酵以及動物組織如雞冠中萃取得到。

透明質酸、其鹽類或其衍生物由於不具有種屬特異性，且具有良好的生物相容性、黏彈性、保濕性及生物可降解性，而廣泛應用於化妝品、生物醫學、醫療器材及製藥上。

直鏈的透明質酸在生物體內易因酵素(如透明質酸水解酵素)及自由基的作用而發生降解，因而降低在生物體內的滯留時間，亦因缺乏機械強度而限制其應用範圍，故於實際應用時，常將透明質酸進行交聯，製備成可溶於水的交聯透明質酸溶液或不溶於水的交聯透明質酸凝膠(hydrogel)，或介於兩者之間的物質，亦可視需要混合兩者使用。

然而，藉由交聯劑進行透明質酸的交聯反應以製備交聯透明質酸時，常有大量交聯劑殘留於產物中，而不利於應用於生物體內，目前最常用以去除或降低殘留交聯劑的方法包括以透析法或以水或緩衝溶液清洗。但此類純化方法效果有限，同時對於一端已是鍵結態而另一端仍為自由態官能基的交聯劑而言，並無法以透析或清洗的方式去除，且此種含有自由態官能基之交聯劑具有反應性，如美國發明專利第5808050號所示，於動物體中使用時具有風險。

另一方面，以透析或清洗交聯透明質酸尚有製程放大不易之問題，且因於中性或接近中性環境下純化，無菌條件難以控制，再者，若交聯透明質酸為凝膠狀態時，交聯程度低的交聯透明質酸因膨潤大，清洗不易，得到的產物之透明質酸含量低；交聯程度高的交聯透明質酸則因膨潤低，殘留的交聯劑更加不易去除。再者，於清洗過程中，交聯程度低的透明質酸易流失，而喪失潤滑性質，對於需充填於針劑中的應用，需另外添加直鏈或交聯的透明質酸溶液以增加其潤滑性質。

美國發明專利第4716154號揭露一種無菌、不含熱原的交聯的透明質酸製法，可作為眼球的玻璃狀液(vitreoushumor)取代物。此合成方式是以多官能基交聯劑，在鹼存在下，於高溫如50℃進行交聯反應2小時，反應後置於室溫過夜，由於殘留有未反應之交聯劑，接著將所得膠體切成小塊後，以蒸餾水清洗24小時，再以沸騰的生理食鹽水清洗8小時，得到固含量0.23%~1.2%的膠體。該專利文獻 強調因此方法殘留有未反應之交聯劑，徹底清洗所合成的膠體極端重要且不可缺少。此方法的缺點包括有：(1)需有複雜的膠體純化步驟；(2)因以沸騰的生理食鹽水去除交聯劑，使膠體膨潤而僅得到固含量偏低的膠體，如需提高固含量，則需額外步驟；(3)需重新於生理緩衝溶液中膨潤，以調整其滲透壓及酸鹼值，不利於工業上使用。

美國發明公開第2006/0194758A1號將高、低分子量的透明質酸混合反應，產生一種單相的具良好機械性質的膠體，改良了可注射性，但此方法於50℃交聯反應結束後，未經透析純化前殘留大量未反應的交聯劑，其濃度超過300 ppm以上，之後藉透析法以純化試圖去除交聯劑，但其效果不佳，難以有效去除未反應且自由態的交聯劑，亦無法去除已為鍵結狀態但交聯劑的另一端尚具自由態官能基的交聯劑。

美國發明公開第2005/0281880A1號揭露一種可注射凝膠的製備方法，其步驟包含：在一個密閉容器內，交聯一種或多種聚合物形成膠體；清洗該膠體；純化該膠體；均質該膠體形成凝膠。該方法使用了高濃度雙官能基或多官能基交聯劑，有上述鍵結態交聯劑殘留的問題。再者，膠體清洗、純化的時間需2至3天，由於此時溶液的酸鹼值已接近中性，產生微生物汙染的風險。

美國發明公開第2007/0026070A1號揭示一種多醣交聯凝膠的方法，包括在一鹼性溶液中，使多醣與二或多官能基環氧化物接觸，以提供一種以環氧化物交聯的多醣，其中 環氧化物基本上是以醚鍵與多醣聯結；在實質上未從鹼性介質中移除環氧化物的情況下，乾燥該環氧化物交聯的多醣；以水可溶的溶劑合理清洗交聯的多醣；中和交聯的多醣基質，形成交聯的多醣凝膠。此方法同樣具有已是鍵結狀態但尚含自由態官能基的交聯劑殘留問題。

如要製備交聯的透明質酸固態物，常用去除交聯劑的方法是沉澱法，如美國專利第4716224號，但此方法仍有上述尚含自由態官能基之鍵結態交聯劑殘留的風險存在。

另一方面，於鹼性環境下之交聯反應時，透明質酸同時也被水解，故鹼性環境下之反應是交聯反應與水解反應相互競爭，如Y. Tokita及A. Okamoto,"Hydrolytic Degration of Hyaluronic Acid",Polymer Degration and Stability, vol. 48,pp. 269-273(1995)文獻所述。在鹼性環境反應初期，交聯劑的濃度最高，故反應以交聯反應為主，但當反應一段時間交聯劑消耗一定量後，若以同樣溫度繼續進行反應，則反應以水解反應為主，同時也會破壞膠體的性質，使膠體性質劣化，造成發生膠體裂解、顏色變成深黃色或甚至變為褐色而無法使用，故於鹼性環境反應時，進行一段時間的反應後就必須終止反應，雖然此時還殘留有大量的交聯劑。以雙官能基或多官能基環氧化物在鹼性條件下進行交聯反應時，大多在25℃至60℃下進行，反應時間則在10分鐘至24小時之間，但實際的反應時間與所使用的溫度及鹼濃度有關。而這些反應下所得的膠體，大多有去除交聯劑的純化步驟或雖無純化的程序，但仍殘留有相當量 或大量的交聯劑。

目前文獻中已知之去除交聯劑的方法都有其缺點，且都無法有效去除交聯劑或降低交聯劑含量，尤其無法去除一端已是鍵結態另一端仍為自由態官能基的交聯劑。業界亟需一種降低產品中交聯劑含量之交聯透明質酸製造方法。

發明概述

本發明提供一種交聯透明質酸之製造方法，其包含於自約10℃至約30℃之低反應溫度，使包含交聯劑與透明質酸、其金屬鹽類、其衍生物或其混合物之溶液於鹼性環境進行交聯反應超過約48小時。

根據本發明之方法不需經由純化步驟，即可製得於產物中交聯劑含量低、生物相容性高且可供動物體應用之交聯透明質酸，以克服習知技術中使用純化步驟之缺點。

發明詳細說明

本發明提供一種交聯透明質酸之製造方法，其包含於自約10℃至約30℃之低反應溫度，使包含交聯劑與透明質酸、其金屬鹽類、其衍生物、或其混合物之溶液於鹼性環境進行交聯反應超過約48小時。

本發明所言之「透明質酸」又稱為玻尿酸，係指一多醣化合物，其結構由β-1,3-葡萄糖乙醯胺及β-1,4-葡萄糖酸以β-1-4鍵結形成分子量約為400 D之雙醣重覆單位，此雙醣重覆單位再以β-1-3鍵結重覆連結，形成之直鏈高分子聚合物。

本發明所言之「透明質酸金屬鹽類」係指由透明質酸與金屬離子所形成之鹽類，較佳地，其係為鉀鹽、鈉鹽或鋅鹽。

本發明所言之「透明質酸衍生物」係指含有羥基之多醣類，例如但不限於羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose，CMC)、褐藻酸鹽(alginate)、軟骨素-4-硫酸鹽(chondroitin-4-sulfate)、軟骨素-6-硫酸鹽(chondroitin-6-sulfate)、咕頓樹膠(xanthane gum)、殼聚糖(chitosan)、果膠(pectin)、瓊脂(agar)、鹿角菜膠(carrageenan)或瓜耳樹膠(guar gum)。

本發明所言之「交聯透明質酸」係指在含有交聯劑存在下，使相同分子或不同分子的透明質酸、其金屬鹽類、其衍生物或其混合物間，發生部分交聯或完全交聯後，所形成之分子網狀結構型態的交聯透明質酸。其物理型態可為固態、液態(指溶於水或緩衝溶液的交聯透明質酸)、凝膠(指被水或緩衝溶液膨潤的交聯透明質酸膠體)、介於液態和凝膠間之混合物或是水不溶的固體，此物理型態可由加入反應的交聯劑含量和合成方法而定。

本發明所言之「交聯反應」係指使兩透明質酸、其金屬鹽類、其衍生物或其混合物直鏈間產生鍵結之反應。在鹼性環境下，根據本發明之交聯反應係以醚鍵形成交聯，不產生副產物，理論上反應可完全進行。

於本發明之一具體實施例中，鹼性環境中鹼濃度為自約0.05 N至約1.5 N；較佳為自約0.05 N至約1 N；更佳為自 約0.2 N至約0.5 N；尤佳係為自約0.25 N至約0.5 N。另一方面，鹼性環境較佳係由無機鹼提供，其中該無機鹼較佳係選自由氫氧化鈉及氫氧化鉀所組成之群，其中「鹼濃度」的定義係指1升的反應物中的液體之體積(包含溶劑、鹼及交聯劑之體積，但不包含透明質酸、其金屬鹽類、其衍生物或其混合物之體積)中所含鹼的當量數。

根據本發明之方法，該交聯反應係使用交聯劑進行。本發明中所言之「交聯劑」係指可將兩透明質酸、其金屬鹽類、其衍生物或其混合物直鏈間產生鍵結之物質。通常該交聯劑具有多個官能基可分別與多個之透明質酸、其金屬鹽類、其衍生物或其混合物直鏈產生鍵結，並進一步彼此進行交聯反應。較佳地，該交聯劑係為多官能基環氧化物；更佳為雙官能基環氧化物。於本發明之一較佳具體實施例中，該交聯劑係選自由1,4-丁二醇二縮水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether)、乙二醇二縮水甘油醚(ethylene glycol diglycidyl ether)、1,6-己二醇二縮水甘油醚(1,6-hexanediol diglycidyl ether)、多丙二醇二縮水甘油醚(polypropylene glycol diglycidyl ether)、多四甲撐二醇二縮水甘油醚(polytetramethylene glycol diglycidyl ether)、新戊二醇二縮水甘油醚(neopentyl glycol diglycidyl ether)、多甘油多縮水甘油醚(polyglycerol polyglycidyl ether)、二甘油多縮水甘油醚(diglycerol polyglycidyl ether)、甘油多縮水甘油醚(glycerol polyglycidyl ether)、三羥甲基丙烷多縮水甘油醚(tri- methylolpropane polyglycidyl ether)、季戊四醇多縮水甘油醚(pentaerythritol polyglycidyl ether)、山梨糖醇多縮水甘油醚(sorbitol polyglycidyl ether)、1,2,7,8-二環氧辛烷(1,2,7,8-diepoxyoctane)及1,3-二環氧丁烷(1,3-butadiene diepoxide)及其混合物所組成之群。

本發明所屬技術領域中具通常知識者可視所需之交聯透明質酸之交聯程度及交聯劑種類選擇合宜之交聯劑濃度，於本發明之一較佳具體實施例中，交聯劑之濃度為自約0.05至約2w/v%；更佳為自約0.1至約1.5w/v%；尤佳為自約0.1至約1.0w/v%，最佳為自約0.6至約1.0w/v%。

本發明之技術特徵在於使用長時間之低溫反應溫度條件進行交聯反應，根據本發明之低反應溫度係指約10℃至約30℃；較佳係自約15℃至約30℃；最佳為自約20℃至約30℃。於此低反應溫度下進行之交聯反應，所形成之交聯透明質酸不會因鹼的水解作用而快速劣化，於使交聯劑消耗至合理的含量後即終止反應。本發明中所言之低反應溫度不限於以單一溫度反應，亦可為多種低反應溫度之組合。本發明所言之「使交聯劑消耗至合理的含量」是指在最後所得的交聯產物中交聯劑含量可為後續繼續利用之濃度，例如1 ppm以下、2 ppm以下、5 ppm以下、10 ppm以下、15 ppm以下或20 ppm以下，但並不意謂限定本發明，根據本發明交聯劑的消耗並不侷限於因交聯反應而消耗，亦可能因水解作用而消耗，也可能交聯作用及水解作用一起消耗。於本發明之具體實施例中，可控制所得的產物的未反 應完全之交聯劑含量為低於1 ppm、2 ppm、2至5 ppm、5至10 ppm、10至15 ppm或15至20 ppm。本發明所言「具有自由態官能基之交聯劑」係包含未與透明質酸、其金屬鹽類、其衍生物或其混合物反應之交聯劑及部分官能基與透明質酸、其金屬鹽類、其衍生物或其混合物反應，使交聯劑官能基與透明質酸、其金屬鹽類、其衍生物或其混合物間產生鍵結但部分官能基未反應而為自由態時之交聯劑。較佳地，該交聯反應係於交聯透明質酸劣化前即停止，本發明所言「劣化」係指經交聯反應後的所得之交聯透明質酸，因為鹼的水解作用變成深黃色或甚至深褐色，使其無法應用，或是指所合成的產物開始發生明顯降解。通常交聯反應之時間與交聯反應之溫度相關，溫度越高，所需之時間越短，溫度越低，所需之時間越長；反應時間亦與交聯劑之濃度及鹼濃度相關，綜合上述，根據本發明之反應時間係超過48小時，較佳係約3至約28天，更佳係約3至約11天，最佳係約3至約7天。

根據本發明，包含透明質酸、其金屬鹽類、其衍生物或其混合物之反應溶液中透明質酸、其金屬鹽類、其衍生物或其混合物之濃度較佳為自約2至約40 wv%；更佳為自約10至約30 wv%；尤佳為自約15至約20 wv%。根據本發明之透明質酸、其金屬鹽類或其衍生物分子量理論上並未有限制，可單獨為低分子量、高分子量，也可為兩種高、低分子量的透明質酸、其金屬鹽類或其衍生物之任意混合。其分子量例如為10萬以下、10至50萬之間、50萬至100萬 之間、100萬至150萬之間、150萬至200萬之間、250萬至300萬之間。較佳為混合高、低分子量之透明質酸、其金屬鹽類、其衍生物或其混合物進行交聯反應，具有反應溶液黏度低及適合製程放大的優點。

於本發明之一較佳具體實施例中，當使用1,4-丁二醇二縮水甘油醚1v/v%作為交聯劑時，包含透明質酸、其金屬鹽類、其衍生物或其混合物溶液中透明質酸、其金屬鹽類、其衍生物或其混合物之濃度為20 w/v%、鹼濃度為0.25 N時，所需的反應時間為3至28天。

根據本發明之方法較佳係於無菌條件下進行，但不限於僅在無菌條件下進行，亦可於一般的環境下進行，只要最終產物的交聯劑可降低至合理的範圍以下及具有良好的生物相容性即可，其中生物相容性的性質可藉細胞毒性試驗進行測試。實際上，根據本發明於低反應溫度下進行交聯反應雖需較長之反應時間，但由於是在鹼性的環境中，不容易有微生物的污染，亦無先前技術中於中性緩衝溶液中清洗膠體所產生微生物的污染的高風險。

較佳地，根據本發明之方法係於低反應溫度中進行交聯反應前，另包含一於高反應溫度中進行交聯反應之步驟，其中該高反應溫度為自約35℃至約60℃；較佳為自約35℃至約50℃；更佳自約35℃至約40℃。於此態樣中，其係於高反應溫度進行交聯反應一段時間，使透明質酸、其金屬鹽類、其衍生物或其混合物先進行部份的交聯反應，在其性質尚未劣化，或未開始有明顯降解發生前，再置於低反 應溫度繼續進行反應，使交聯劑消耗至合理的含量後終止反應。本發明中所言之高反應溫度不限於以單一溫度反應，亦可為多種高反應溫度的組合。

於本發明之較佳具體實施例中，當高反應溫度為約35℃時，進行交聯反應小於約72小時；較佳為自約4至約48小時；更佳為自約6至約12小時。當高反應溫度為約40℃時，進行交聯反應小於約48小時；較佳為自約2至24小時；更佳為自約3至約6小時。當高反應溫度為約50℃時，進行交聯反應小於約8小時；較佳為自約0.1至約2小時；更佳為自約0.2至約1小時。當高反應溫度為約60℃時，進行交聯反應小於約2小時；較佳為自約0.1至約0.5小時；更佳為自約0.2至約0.3小時。

較佳地，根據本發明之方法另包含一稀釋步驟。其係將交聯反應中所得之交聯透明質酸含量，經稀釋為所欲之濃度及生理上可接受之滲透壓或酸鹼值。稀釋之方法例如使用水、中性溶液、緩衝溶液、鹽類溶液或其混合物加入反應液中而得。例如調整交聯透明質酸之含量於在5 mg/mL至60 mg/mL之間，較佳在10 mg/mL至40 mg/mL之間，最佳在20 mg/mL至30 mg/mL之間，滲透壓為280至340mOsm/kg之間。

較佳地，根據本發明之方法另包含一中和步驟，其係將交聯反應中所需之非中性酸鹼環境，中和為中性環境，較佳為pH值在6.5至7.5之間，俾利於動物體內應用。於本發明之一具體實施例中，稀釋步驟與中和步驟可同時進行。

較佳地，根據本發明之方法另包含一均質步驟，其係將最後產物碾碎、壓碎而均勻分散成顆粒或溶液者，例如可使用均質機或其它碾碎或壓碎之機器進行均質。

根據本發明之方法所製得之交聯透明質酸，依其型態可為溶液、凝膠、溶液與凝膠之混合物或進一步乾燥或冷凍乾燥為顆粒或固體，固體的形狀可為但不限於海綿狀、片狀、條狀、球狀或橢圓狀。根據本發明之方法不需經由純化步驟，即可製得於產物中交聯劑含量低、生物相容性高且可供動物體應用之交聯透明質酸，以克服習知技術中使用純化步驟之缺點。

茲以下列實例予以詳細說明本發明，唯其並不意謂本發明僅侷限於此等實例所揭示之內容。

實例一：透明質酸鈉濃度=20 w/v% HHA、鹼濃度=0.5 N、反應溫度=30℃、交聯劑濃度=1 v/v%之1,2,7,8-二環氧辛烷

取8.9 mL的去離子水加入1 mL之5 N氫氧化鈉水溶液及0.1 mL交聯劑1,2,7,8-二環氧辛烷，在磁石攪拌下加入2克(乾重)平均分子量為135萬之透明質酸鈉(high molecular weight hyaluronic acid，HHA)，室溫下攪拌5分鐘後，置於30℃恆溫箱中反應如表1所示之反應時間。反應後，所得反應物中加入79.2 mL之pH為7.0±0.2之0.073 M磷酸鹽緩衝溶液及0.8 mL之6 N的氯化氫水溶液，以使得均質後至生理上可接受的pH值及滲透壓，再將膠體溶液均質後，即 可得交聯透明質酸產物。

均質後之交聯透明質酸產物之具有自由態官能基之交聯劑含量測定是將產物經透明質酸水解酵素水解，再依據Nelis和Sinsheimer所使用的方法(A Sensitive Fluorimetric for the Determination of Aliphatic Epoxides under Physiological Conditions, Anal. Biochem., Vol. 115, pp. 151-157，1981)，於吸收波長為370nm下進行測定，此測定方法在具有自由態官能基之交聯劑含量為1至300 ppm時檢量線具良好之線性關係；產物的交聯透明質酸含量測定則先取精秤後的產物約0.1克置於50 mL的定量瓶中，加入3 mL的6 N的硫酸水溶液先行溶解產物後，以去離子水稀釋溶液至定量瓶刻度，再依據歐洲藥典第四版(2002版)所使用的方法進行測定醛醣酸(glucuronic acid)含量後，再換算得交聯透明質酸含量。不同反應時間下所得的產物其交聯透明質酸含量和具有自由態官能基之交聯劑含量如表1所示。

實施例二：透明質酸鈉濃度=20 w/v% HHA、鹼濃度=0.5 N、反應溫度=30℃、交聯劑濃度=1 v/v%之1,3-二環氧丁烷

除交聯劑改為1,3-二環氧丁烷外，其餘反應條件及含量的測定方法同實施例一。不同反應時間下所得的產物其交聯透明質酸含量和具有自由態官能基之交聯劑含量如表1所示。

實施例三：透明質酸鈉濃度=20 w/v% HHA、鹼濃度=0.25 N、反應溫度=10℃、交聯劑濃度=1 v/v%之1,4-丁二醇二 縮水甘油醚

取9.4 mL的去離子水加入0.5 mL之5 N氫氧化鈉水溶液及0.1 mL交聯劑1,4-丁二醇二縮水甘油醚，在磁石攪拌下加入2克(乾重)平均分子量為135萬之透明質酸鈉(HHA)，室溫下攪拌5分鐘後，置於10℃恆溫箱中反應。反應後，所得反應物中加入79.6 mL之pH為7.0±0.2之0.1 M磷酸鹽緩溶液及0.4 mL之6 N的氯化氫水溶液，以使得均質後至生理上可接受的pH值及滲透壓，再將膠體溶液均質後，即可得到交聯透明質酸產物。產物之交聯透明質酸含量和具有自由態官能基之交聯劑含量的測定方法同實施例一。不同反應時間下所得的產物其交聯透明質酸含量和具有自由態官能基之交聯劑含量如表1所示。

實施例四：透明質酸鈉濃度=20 w/v% HHA、鹼濃度=0.25 N、反應溫度=20℃、交聯劑濃度=1 v/v%之1,4丁二醇二縮水甘油醚

除反應溫度改為20℃外，其餘反應條件與測定方法同實施例三。不同反應時間下所得的產物其交聯透明質酸含量和具有自由態官能基之交聯劑含量如表1所示。

實施例五：透明質酸鈉濃度=20 w/v% HHA、鹼濃度=0.25 N、反應溫度=30℃、交聯劑濃度=1 v/v%之1,4丁二醇二縮水甘油醚

除反應溫度改為30℃外，其餘反應條件與測定方法同實施例三。不同反應時間下所得的產物其交聯透明質酸含量和具有自由態官能基之交聯劑含量如表1所示。

實施例六：透明質酸鈉濃度=20 w/v% HHA、鹼濃度=0.2 N、反應溫度=30℃、交聯劑濃度=1 v/v%之1,4-丁二醇二縮水甘油醚

取9.5 mL的去離子水加入0.4 mL之5 N氫氧化鈉水溶液及0.1 mL交聯劑1,4-丁二醇二縮水甘油醚，在磁石攪拌下加入平均分子量為135萬之透明質酸鈉(HHA)2.0克(乾重)，攪拌5分鐘後置於可控制溫度的恆溫箱中以30℃反應一定時間後(反應時間如表1所示)，所得反應物中加入0.32 mL之6 N氯化氫水溶液及79.68 mL pH為7.0±0.2之0.10M磷酸鹽緩溶液，以使得均質後至生理上可接受的pH值及滲透壓，再將膠體溶液均質後，即可得到交聯透明質酸產物。產物的交聯透明質酸含量和具有自由態官能基之交聯劑含量的測定方法同實施例一。不同反應時間下所得的產物其交聯透明質酸含量和具有自由態官能基之交聯劑含量如表1所示。

由表1之結果可得知當於低反應溫度進行交聯反應超過2天時，其產品交聯劑之含量低，可應用於生物體內。

實施例七：透明質酸鈉濃度=10 w/v% HHA、鹼濃度=0.05 N、高反應溫度=50℃、低反應溫度=30℃、交聯劑濃度=1v/v%之1,4-丁二醇二縮水甘油醚

取9.8 mL的去離子水加入0.1 mL之5 N氫氧化鈉水溶液及0.1 mL交聯劑1,4-丁二醇二縮水甘油醚，在磁石攪拌下加入平均分子量為135萬之透明質酸鈉(HHA)，攪拌5分鐘後置於可控制溫度的恆溫箱中以50℃反應7小時後，再以30℃下反應一定時間後(反應時間如表2所示)，所得反應物中加入去離子水9.87 mL、0.13 mL之6 N氯化氫水溶液及20 mL pH為7.0±0.2之0.15 M磷酸鹽緩溶液，以使得均質後至生理上可接受的pH值及滲透壓，再將膠體溶液均質後，即可得到交聯透明質酸產物。產物的交聯透明質酸含量和具有自由態官能基之交聯劑含量的測定方法同實施例一。不同反應時間下所得的產物其交聯透明質酸含量和具有自由態官能基之交聯劑含量如表2所示。

實施例八：透明質酸鈉濃度=20 w/v% HHA、鹼濃度=0.5 N、高反應溫度=40℃、低反應溫度=25℃、交聯劑濃度=1v/v%之1,4-丁二醇二縮水甘油醚

取8.9 mL的去離子水加入1 mL之5 N氫氧化鈉水溶液及0.1 mL交聯劑1,4-丁二醇二縮水甘油醚，在磁石攪拌下加入平均分子量為135萬之透明質酸鈉(HHA)，攪拌5分鐘後置於可控制溫度的恆溫箱中以40℃反應3小時後，再以25℃下反應一定時間後(反應時間如表2所示)，所得反應物中加入0.8 mL之6 N氯化氫水溶液及79.2 mL pH為 7.0±0.2之0.073 M磷酸鹽緩溶液，以使得均質後至生理上可接受的pH值及滲透壓，再將膠體溶液均質後，即可得到交聯透明質酸產物。產物的交聯透明質酸含量和具有自由態官能基之交聯劑殘留量的測定方法同實施例一。不同反應時間下所得的產物其交聯透明質酸含量和具有自由態官能基之交聯劑含量如表2所示。

實施例九：透明質酸鈉濃度=20 w/v% HHA、鹼濃度=0.5 N、高反應溫度=40℃、低反應溫度=25℃、交聯劑濃度=1v/v%之1,2,7,8-二環氧辛烷

除交聯劑改為1,2,7,8-二環氧辛烷，其餘反應條件及含量的測定方法同實施例八。不同反應時間下所得的產物其交聯透明質酸含量和具有自由態官能基之交聯劑殘留量如表2所示。

實施例十：透明質酸鈉濃度=20 w/v% HA(10 w/v% HHA+10 w/v%LHA)、鹼濃度=0.25 N、高反應溫度=40℃、低反應溫度=10℃、交聯劑濃度=0.6 v/v%之1,4-丁二醇二縮水甘油醚

取9.44 mL的去離子水加入0.5 mL之5 N氫氧化鈉水溶液及0.06 mL交聯劑1,4-丁二醇二縮水甘油醚，在磁石攪拌下加入平均分子量為44萬之透明質酸鈉(low molecular weight hyaluronic acid，LHA)及平均分子量為135萬之透明質酸鈉(HHA)各1克(乾重)，攪拌5分鐘後置於可控制溫度的恆溫箱中以40℃反應4小時後，再以10℃下反應一定時間後(反應時間如表2所示)，所得反應物中加入0.4 mL 之6 N氯化氫水溶液及79.6 mL pH為7.0±0.2之0.10 M磷酸鹽緩溶液，以使得均質後至生理上可接受的pH值及滲透壓，再將膠體溶液均質後，即可得到交聯透明質酸產物。產物的交聯透明質酸含量和具有自由態官能基之交聯劑含量的測定方法同實例一。不同反應時間下所得的產物其交聯透明質酸含量和具有自由態官能基之交聯劑含量如表2所示。

實施例十一：透明質酸鈉濃度=30 w/v% HA(15 w/v%HHA+15 w/v%LHA)、鹼濃度=0.25 N、高反應溫度=40℃、低反應溫度=25℃、交聯劑濃度=0.6v/v%之1,4-丁二醇二縮水甘油醚

取9.44 mL的去離子水加入0.5 mL之5 N氫氧化鈉水溶液及0.06 mL交聯劑1,4-丁二醇二縮水甘油醚，在磁石攪拌下加入平均分子量為44萬之透明質酸鈉(LHA)及平均分子量為135萬之透明質酸鈉(HHA)各1.5克(乾重)，攪拌5分鐘後置於可控制溫度的恆溫箱中以40℃反應4小時後，再以25℃下反應一定時間後(反應時間如表2所示)，所得反應物中加入0.4 mL之6 N氯化氫水溶液及79.6 mL pH為7.0±0.2之0.10 M磷酸鹽緩溶液，以使得均質後至生理上可接受的pH值及滲透壓，再將膠體溶液均質後，即可得到交聯透明質酸產物。產物的交聯透明質酸含量和具有自由態官能基之交聯劑含量的測定方法同實施例一。不同反應時間下所得的產物其交聯透明質酸含量和具有自由態官能基之交聯劑殘留量如表2所示。

實施例十二：透明質酸鈉濃度=20 w/v%LHA、鹼濃度=0.25 N、高反應溫度=40℃、低反應溫度=25℃、交聯劑濃度=0.6 v/v%之1,4-丁二醇二縮水甘油醚

除透明質酸改為低分子量透明質酸鈉(LHA)2.0克(乾重)外，其餘反應條件及含量的測定方法同實施例十一。不同反應時間下所得的產物其交聯透明質酸含量和具有自由態官能基之交聯劑殘留量如表2所示。

實施例十三：透明質酸鈉濃度=20 w/v% HA(10 w/v%HHA+10 w/v%LHA)、鹼濃度=0.25 N、高反應溫度=40℃、低反應溫度=25℃、交聯劑濃度=0.1 v/v%之1,4-丁二醇二縮水甘油醚

取9.49 mL的去離子水加入0.5 mL之5 N氫氧化鈉水溶液及0.01 mL交聯劑1,4-丁二醇二縮水甘油醚，在磁石攪拌下加入平均分子量為44萬之透明質酸鈉(LHA)及平均分子量為135萬之透明質酸鈉(HHA)各1.0克(乾重)，攪拌5分鐘後置於可控制溫度的恆溫箱中以40℃反應4小時後，再以25℃下反應一定時間後(反應時間如表2所示)，所得反應物中加入0.4 mL之6 N氯化氫水溶液及79.6 mL pH為7.0±0.2之0.10 M磷酸鹽緩溶液，以使得均質後至生理上可接受的pH值及滲透壓，再將溶液均質後，即可得到交聯透明質酸產物。產物的交聯透明質酸含量和具有自由態官能基之交聯劑含量的測定方法同實例一。不同反應時間下所得的產物其交聯透明質酸含量和具有自由態官能基之交聯劑含量如表2所示。

實施例十四：透明質酸鈉濃度=20 w/v%LHA、鹼濃度=0.2 N、高反應溫度=40℃、低反應溫度=30℃、交聯劑濃度=1v/v%之1,4-丁二醇二縮水甘油醚

取9.5 mL的去離子水加入0.4 mL之5 N氫氧化鈉水溶液及0.1 mL交聯劑1,4-丁二醇二縮水甘油醚，在磁石攪拌下加入平均分子量為44萬之透明質酸鈉(LHA)2.0克(乾重)，攪拌5分鐘後置於可控制溫度的恆溫箱中以40℃反應4小時後，再以30℃下反應一定時間後(反應時間如表2所示)，所得反應物中加入0.32 mL之6 N氯化氫水溶液及79.68 mLpH為7.0±0.2之0.10 M磷酸鹽緩溶液，以使得均質後至生理上可接受的pH值及滲透壓，再將膠體溶液均質後，即可得到交聯透明質酸產物。產物的交聯透明質酸含量和具有自由態官能基之交聯劑含量的測定方法同實施例一。不同反應時間下所得的產物其交聯透明質酸含量和具有自由態官能基之交聯劑含量如表2所示。

由表2之結果可得知當於高反應溫度反應一段時間後繼續進行低反應溫度交聯反應超過2天時，其產品具有自由態官能基之交聯劑之含量低，可應用於生物體內。

上述實施例僅為說明本發明之原理及其功效，而非限制本發明。因此，習於此技術之人士對上述實施例所做之修改及變化仍不違背本發明之精神。本發明之權利範圍應如後述之申請專利範圍所列。

Claims (15)

1. 一種交聯透明質酸之製造方法，其包含於自約10℃至約30℃之低反應溫度，使包含交聯劑與透明質酸、其金屬鹽類、含有羥基的多醣類或其混合物之溶液於鹼性環境進行交聯反應超過約48小時，其中於低反應溫度中進行交聯反應前，另包含一於高反應溫度中進行交聯反應之步驟，其中該高反應溫度為自約35℃至約60℃；其中該交聯劑係為多官能基環氧化物；其中該含有羥基的多醣類係選自由羧甲基纖維素、褐藻酸鹽、軟骨素-4-硫酸鹽、軟骨素-6-硫酸鹽、呫頓樹膠、殼聚糖、果膠、瓊脂、鹿角菜膠及瓜耳樹膠所組成之群。
2. 根據請求項1之方法，其中該透明質酸之金屬鹽類係為鉀鹽、鈉鹽或鋅鹽。
3. 根據請求項1之方法，其中鹼性環境中鹼濃度為自約0.05 N至約1.5 N。
4. 根據請求項1之方法，其中鹼性環境係由無機鹼提供。
5. 根據請求項4之方法，其中該無機鹼係選自由氫氧化鈉及氫氧化鉀所組成之群。
6. 根據請求項1之方法，其中該交聯劑係為雙官能基環氧化物。
7. 根據請求項1之方法，其中該交聯劑係選自由1,4-丁二醇二縮水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether)、乙二醇二縮水甘油醚(ethylene glycol diglycidyl ether)、1,6-己 二醇二縮水甘油醚(1,6-hexanediol diglycidyl ether)、多丙二醇二縮水甘油醚(polypropylene glycol diglycidyl ether)、多四甲撐二醇二縮水甘油醚(polytetramethylene glycol diglycidyl ether)、新戊二醇二縮水甘油醚(neopentyl glycol diglycidyl ether)、多甘油多縮水甘油醚(polyglycerol polyglycidyl ether)、二甘油多縮水甘油醚(diglycerol polyglycidyl ether)、甘油多縮水甘油醚(glycerol polyglycidyl ether)、三羥甲基丙烷多縮水甘油醚(tri-methylolpropane polyglycidyl ether)、季戊四醇多縮水甘油醚(pentaerythritol polyglycidyl ether)、山梨糖醇多縮水甘油醚(sorbitol polyglycidyl ether)、1,2,7,8-二環氧辛烷(1,2,7,8-diepoxyoctane)及1,3-二環氧丁烷(1,3-butadiene diepoxide)及其混合物所組成之群。
8. 根據請求項6之方法，其中交聯劑之濃度為自約0.05至約2 w/v%。
9. 根據請求項1之方法，其中該低反應溫度係為自約15℃至約30℃。
10. 根據請求項9之方法，其中該低反應溫度係為自約20℃至約30℃。
11. 根據請求項1或3之方法，其中交聯反應進行約3至約28天。
12. 根據請求項1之方法，其中包含透明質酸、其金屬鹽類、含有羥基的多醣類或其混合物之溶液中透明質酸、其金屬鹽類、含有羥基的多醣類或其混合物之濃度為自 約2至約40 w/v%。
13. 根據請求項1之方法，另包含一稀釋步驟，其係將交聯反應中所得之交聯透明質酸稀釋為所欲之濃度及生理上可接受之滲透壓或酸鹼值。
14. 根據請求項1之方法，另包含一中和步驟，其係將交聯反應中鹼環境，中和為中性環境。
15. 根據請求項1之方法，另包含一均質步驟，其係將交聯反應中所得之交聯透明質酸碾碎、壓碎而均勻分散成顆粒或溶液。