JP5340093B2 - 架橋ヒアルロン酸の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、特に減量した架橋剤により、架橋ヒアルロン酸を製造する方法に関するものである。

架橋ヒアルロン酸は、二糖類からなる、分子量が400Dの多糖類であり、この二糖類は、β−１，４−グルコシド結合により架橋結合されたβ−１，４−グルクロン酸とβ−１，３−アセチルグルコサミンを含むものである。さらにβ−１，３−グルコシド結合によれば、前記二糖類と他の二糖類とを架橋結合させることにより、線状多糖類を形成されることができる。現在のヒアルロン酸は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓなどの細菌により合成してなるもの又は例えば、ニワトリのトサカなど動物組織からの抽出してなるものが一般的である。

ヒアルロン酸塩とその誘導体であるヒアルロン酸は、生体適合性、生物分解性及び粘弾性に優れ、化粧品、生体臨床医学、医療品及び製薬工業における応用に好適なものである。また、有機体内の線状ヒアルロン酸は、例えばヒアルロニダーゼなどの酵素又はフリーラジカルにより簡単に分解されることから、有機体内に線状ヒアルロン酸として維持できる時間は非常に短く、さらに、線状ヒアルロン酸は機械強度に弱いものであるので、線状ヒアルロン酸の応用は限られている。故に、現在では架橋ヒアルロン酸が最も広く用いられている。

実際に応用の目的に適用するための方法には、例えば、溶液形態、ヒドロゲル形態、溶液とヒドロゲルの特性を併せて持つ形態、混合された溶液とヒドロゲルとからなる形態など多様な形態の前記架橋ヒアルロン酸が用いられている。その架橋ヒアルロン酸の製造方法は、架橋剤とヒアルロン酸とを混合させて架橋結合反応を発生させ、架橋ヒアルロン酸を得るステップと、余分な架橋剤を除去するために架橋ヒアルロン酸を精製するステップとを有し、その内、架橋ヒアルロン酸を精製するステップは、例えば、透析手段又は水や緩衝溶液による洗浄手段により行っても構わない。しかしながら、前記透析手段又は洗浄手段は、特に結合状態端と自由状態端とを有する余分な架橋剤を完全に除去することができなく、下記特許文献１に示すように、前記架橋剤の自由状態端はまだ活性を有しているので、動物に適用すると副作用を起こす恐れがある。

また、前記透析手段又は洗浄手段により架橋ヒアルロン酸を精製する製造方法には、以下に示すような欠点を有する。
１．工業規模での精錬が容易ではない。
２．滅菌条件を用いない場合、前記架橋ヒアルロン酸の最終生成物に汚染物が容易に混入してしまう。しかしながら、前記透析手段又は洗浄手段により架橋ヒアルロン酸を精製する製造方法は、中性状態又は略中性状態にて行われるものであるので、滅菌条件の維持が容易ではない。
３．架橋結合が不十分なヒドロゲル形態の架橋ヒアルロン酸は著しく膨張するものであり、この膨張する架橋ヒアルロン酸を洗浄すると、大量の架橋ヒアルロン酸が失われ易いので、この膨張する架橋ヒアルロン酸の洗浄は容易ではない。これに対して、高度に架橋結合が行われた架橋ヒアルロン酸はあまり膨張しないものであるので、余分な架橋剤を除去することが難しい。
４．さらに、架橋結合が不十分な架橋ヒアルロン酸は、洗浄すると容易に流失してしまうので、残留する架橋ヒアルロン酸の潤滑性が低下することから、架橋ヒアルロン酸の注射を行うに足りる潤滑性を得るために、前記残留の架橋ヒアルロン酸に直鎖又は架橋ヒアルロン酸溶液を添加しなくてはならない。

下記特許文献２に開示される、硝子体液の代用品として応用される架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法は、セ氏５０度のアルカリ状態において、多官能性架橋剤を用い、ヒアルロン酸塩を２時間架橋結合させた後、室温で一晩静置させることにより、ゲルを得るステップと、未反応の架橋剤を除去するため、ゲルを千切りにし、蒸留水で徹底洗浄を２４時間行った後、さらに煮沸した塩水で８時間洗浄を行うことにより、０．２３％〜１．２％固形分を有するゲルを得るステップとを有するものである。しかしながら、前記方法には、以下に示すような欠点を有する。
（１）複雑な精製ステップが必要となる。
（２）煮沸した塩水で架橋剤を除去すると、ゲルが膨張し、固形分が低下したゲルしか得られないことから、前記固形分を増大させるた、さらに他のステップが必要となる。
（３）浸透圧の調整及びｐＨ値の調整をするためには、前記架橋ヒアルロン酸をバッファーで再び膨張させなくてはならないので、工業生産に適用することができない。

下記特許文献３には、低分子量又は高分子量のヒアルロン酸を架橋結合させることにより、単相のゲルを得る方法が記載され、該単相ゲルは、十分な機械強度及び注射に好適な性質を有するものである。しかしながら、セ氏５０度で架橋結合反応後、該単相ゲルには、３００ｐｐｍ以上の架橋剤が残留し、透析手段を行ってもこの残留した架橋剤を完全に除去することができない。即ち、透析手段又は洗浄手段では、両端が共に自由状態端である架橋剤及び両端が夫々結合状態端と自由状態端である架橋剤を除去することはできない。

下記特許文献４に開示される、注射可能な重合体のヒドロゲルの製造方法は、（ａ）１種類又は複数種類の重合体を架橋結合させることにより、ゲルを形成させるステップと、（ｂ）前記ゲルを洗浄するステップと、（ｃ）前記ゲルを精製するステップと、（ｄ）ヒドロゲルを製造するために前記ゲルを均一化させるステップとを有し、この方法は、二官能性又は多官能性の高濃度の架橋剤を用いてヒドロゲルを製造するので、架橋剤が前記ヒドロゲルに残留してしまい、また、前記ヒドロゲルを洗浄及び精製するためには、２〜３日が必要となる。故に、この洗浄及び精製されたヒドロゲルは、略中性状態のものであるので、微生物に汚染され易いという問題がある。

下記特許文献５に開示される、架橋多糖類組成物の製造方法は、（ａ）アルカリ溶液において、多糖類と二官能性又は多官能性のエポキシドとを互いに接触させ、実質的にエーテル結合で前記多糖類と結合される該エポキシドにより架橋結合される多糖類を提供するステップと、（ｂ）実質的にアルカリ溶液からエポキシドを除去せずに、該エポキシドで架橋結合される多糖類を乾燥させることにより、架橋多糖類基質を形成させるステップと、（ｃ）水溶性の溶剤で前記架橋多糖類基質を洗浄するステップと、（ｄ）酸性基質で前記架橋多糖類基質を中和させることにより、架橋多糖類ゲルを得るステップとを有するものであるので、この方法による生成物には、架橋剤が残留するといった問題がある。

下記特許文献６には、沈殿手段による架橋剤を除去する架橋ヒアルロン酸の製造方法が記載されるが、この方法により製造されるヒアルロン酸にも架橋剤が残留するといった問題がある。

下記非特許文献１に示すように、アルカリ条件においてポリマーを架橋結合させることによりゲルを形成させる時、架橋結合反応と加水分解反応とが互いに競合し、反応の進行の初期段階においては、架橋剤の濃度が高いので、主に架橋結合反応が行われるが、一定量の架橋剤が消費されると、加水分解反応が行われ、ゲルの分解及び劣化が促進される。この副作用を防ぐためには、アルカリ条件において架橋結合反応を行う時、ゲルにまだ大量の架橋剤が残留しているにもかかわらす、反応を中止しなくてはならない。

この製造方法は、アルカリ条件においてセ氏２５〜６０度で１０分間〜２４時間ヒアルロン酸と二官能性又は多官能性の架橋剤による架橋結合反応を行うことにより、ゲルを得るステップと、前記ゲルを精製することにより架橋剤を除去するステップとにより行われるものであるが、完全に前記架橋剤を除去することができないのみならず、温度及びアルカリ性により反応を行う時間が変動する。故に、前記方法により得られた架橋ヒアルロン酸には、相当な又は著しい程度の架橋剤が残留してしまうといった問題があった。

本発明は、前記従来技術の欠点を改善するために、従来技術の問題を軽減又は解消することができる架橋ヒアルロン酸の製造方法を提供するものである。

米国特許５，８０８，０５０号 米国特許４，７１６，１５４号 米国特許出願公開２００６／０１９４７５８Ａ１号公報 米国特許出願公開２００５／０２８１８８０Ａ１号公報 米国特許出願公開２００７／００２６０７０Ａ１号公報 米国特許４，７１６，２２４号

Y. Tokita and A. Okamoto, "Hydrolytic Degradation of Hyaluronic Acid", Polymer Degradation and Stability, 48:269-273 (1995) Nelis and Sinsheimer, "A sensitive Fluorimetric for the Determination of Aliphatic Epoxides under Physiological Conditions", Anal. Biochem., 115:151-157 (1981)

本発明は、前記従来技術の欠点を改善すると共に、前記従来の技術の問題を軽減又は解消することを課題とする。

そこで、出願されたのが本発明であって、減量された架橋剤により、架橋ヒアルロン酸を製造する方法を提供することを目的としている。

本願の請求項１の発明は、アルカリ条件において、セ氏１０〜３０度の低温で、４８時間以上の反応時間をかけて１種類又は複数種類のポリマーと架橋剤とを架橋結合させることにより、架橋ヒアルロン酸を形成させるステップを有し、該ポリマーは、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、それらの誘導体、それらの混合物からなる群より選択されるものであることを特徴とする架橋ヒアルロン酸の製造方法、を提供する。

本願の請求項２の発明は、前記ヒアルロン酸塩がヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸亜鉛からなる群より選択されるものであることを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法、を提供する。

本願の請求項３の発明は、前記アルカリ条件が０．０５〜１．５Ｎ’であることを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法、を提供する。

本願の請求項４の発明は、前記アルカリ条件が無機塩基によるものであることを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法、を提供する。

本願の請求項５の発明は、前記無機塩基が水酸化ナトリウム、水酸化カリウムからなる群より選択されるものであることを特徴とする請求項４に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法、を提供する。

本願の請求項６の発明は、前記架橋剤が多官能性エポキシド化合物であることを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法、を提供する。

本願の請求項７の発明は、前記架橋剤が二官能性エポキシド化合物であることを特徴とする請求項６に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法、を提供する。

本願の請求項８の発明は、前記架橋剤が１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ポリポロピレングリコールジグリシジルエーテル、ポリテトラメチレングリコールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンポリグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル、１，２，７，８−ジエポキシオクタン、１，３−ブタジエンジエポキシド、それらの混合物からなる群より選択されるものであることを特徴とする請求項７に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法、を提供する。

本願の請求項９の発明は、前記架橋剤の濃度が０．０５〜２ｗ／ｖ％であることを特徴とする請求項６に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法、を提供する。

本願の請求項１０の発明は、前記低温がセ氏１５〜３０度であることを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法、を提供する。

本願の請求項１１の発明は、前記低温がセ氏２０〜３０度であることを特徴とする請求項１０に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法、を提供する。

本願の請求項１２の発明は、前記反応時間が３〜２８日間であることを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法、を提供する。

本願の請求項１３の発明は、前記ポリマーの濃度が２〜４０ｗ／ｖ％であることを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法、を提供する。

本願の請求項１４の発明は、前記低温で架橋結合を行うステップの前に、さらに、セ氏３５〜６０度の高温で架橋結合反応を行うステップを有することを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法、を提供する。

本願の請求項１５の発明は、前記低温で架橋結合を行うステップの後に、さらに、前記架橋ヒアルロン酸に透析手段を施すステップを有することを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法、を提供する。

本願の請求項１６の発明は、前記低温で架橋結合を行うステップの後に、さらに、前記架橋結合反応を行うことにより、非中性の元の反応環境を中和させるためのステップを有することを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法、を提供する。

本願の請求項１７の発明は、前記低温で架橋結合を行うステップの後に、さらに、前記架橋ヒアルロン酸を均一化させるステップを有することを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法、を提供する。

本願の請求項１８の発明は、前記架橋ヒアルロン酸において、自由状態の官能基を有する架橋剤の含量が２０ｐｐｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法、を提供する。

本願の請求項１９の発明は、前記ポリマーの含量が、５〜６０ｍｇ／ｍＬ以下であることを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法、を提供する。

本願の請求項２０の発明は、前記誘導体がカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、アルギン酸塩、コンドロイチン−４−サルフェート、コンドロイチン−６−サルフェート、キサンタンガム、キトサン、ペクチン、寒天、カラギーナン、グアールガムからなる群より選択されるものであることを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法、を提供する。

本願の請求項２１の発明は、前記反応時間が３〜２８日間であることを特徴とする請求項３に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法、を提供する。

本発明は上記の課題を解決するものであり、アルカリ条件において、セ氏１０〜３０度の低温で、４８時間以上の反応時間をかけて一種類又は複数種類のポリマーと架橋剤とを架橋結合させることにより、架橋ヒアルロン酸を形成させるステップを有し、該ポリマーは、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、それらの誘導体、それらの混合物からなる群より選択されるものであることを特徴とする架橋ヒアルロン酸の製造方法、を提供する。本発明に係る方法は、自由状態の官能基を有する架橋剤の濃度を低減させることにより、精製工程に対する必要性を低減させるものである。
また、本発明に係る他の材料、効果及び新規の性質は、以下にて明確且つ詳細に説明する。

以下、本発明の好適な実施の形態を詳細に説明するために、用語の定義を行う。

ヒアルロン酸塩（hyaluronate）とは、金属イオンと結合したヒアルロン酸である。
即ち、本発明は、ヒアルロン酸の分子量、ヒアルロン酸塩の分子量、それらの誘導体の分子量及びそれらの混合物の分子量に限られないので、低分子量又は高分子量を有するヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩及びそれらの誘導体、又は低分子量又は高分子量を有するヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩及びそれらの誘導体からなる混合物をであってもよく、ヒアルロン酸の分子量、ヒアルロン酸塩の分子量、それらの誘導体の分子量及びそれらの混合物の分子量は、例えば、１００，０００Ｄ以下、１００，０００Ｄ〜５００，０００Ｄ、５００，０００Ｄ〜１，０００，０００Ｄ、１，０００，０００Ｄ〜１，５００，０００Ｄ、１，５００，０００Ｄ〜２，０００，０００Ｄ、２，０００，０００Ｄ〜２，５００，０００Ｄ、２，５００，０００Ｄ〜３，０００，０００Ｄであってもよい。

架橋ヒアルロン酸（cross-linked hyaluronic acid）は、架橋剤により、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、それらの誘導体及びそれらの混合物を、部分的又は完全に架橋結合させてなるネットワーク構造を有するポリマーであり、この架橋ヒアルロン酸は、固体、液体（該架橋ヒアルロン酸が水又はバッファー溶液に溶解される場合）、ヒドロゲル（該架橋ヒアルロン酸が水又はバッファー溶液に膨張させられる場合）、又は液体とヒドロゲル又は不溶性の固体とからなる混合物であっても構わない。また、この架橋ヒアルロン酸は、使用される架橋剤及びこの架橋ヒアルロン酸の製造方法により、その状態が異なるが、本発明においての架橋ヒアルロン酸は、固体、液体、ヒドロゲル、又は前記固体と液体とからなる混合物であり、粒状、海綿状、細長形状、球状、楕円状、またはそれらに類似したものであっても構わない。
また、本発明に係る架橋結合反応においては、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、それらの誘導体及びそれらの混合物からなる群より選択された２つの反応物の間において、例えば２つの直鎖の間におけるエーテル結合など化学結合が形成させるように、副産物が生じることなく、架橋結合反応が完全に行われる。

自由状態の官能基を有する架橋剤（cross-linking agent with a free-state functional group）は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、それらの誘導体及びそれらの混合物と未反応な少なくとも１つの官能基を有する架橋剤である。

本発明に係る方法は、例えば滅菌条件などの特殊条件、又は一般条件において行っても構わなく、例えば、ヒドロゲル洗浄する時に発生し易い汚染を防止するため、細菌の生長を防ぐことができるアルカリ条件を用い、本発明に係る方法を行ってもよい。

本発明に係る架橋ヒアルロン酸の製造方法は、アルカリ条件において、セ氏１０〜３０度の低温で、４８時間以上の反応時間をかけて一種類又は複種類のポリマーと架橋剤とを架橋結合させることにより、架橋ヒアルロン酸を形成させるステップを有し、該ポリマーは、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、それらの誘導体、それらの混合物からなる群より選択されるものである。

本発明に係る架橋ヒアルロン酸の製造方法においては、前記低温で架橋結合を行うステップの前に、さらに、セ氏３５〜６０度の高温で架橋結合反応を行うステップ、或いはセ氏３５〜５０度の高温で架橋結合反応を行うステップ、或いはセ氏３５〜４０度の高温で架橋結合反応を行うステップとを有し、これにより、劣化が始まる前に、部分ポリマーを架橋結合させることができる。

前記ステップのうち、温度がセ氏３５度である場合には、前記架橋結合反応が７２時間以下、或いは４〜４８時間、或いは、６〜１２時間であることが好ましい。

前記温度がセ氏４０度である場合には、前記架橋結合反応が４８時間以下、或いは２〜２４時間、或いは３〜６時間であることが好ましい。

前記温度がセ氏５０度である場合には、前記架橋結合反応が８時間以下、或いは０．１〜２時間、或いは０．２〜１時間であることが好ましい。

前記温度がセ氏６０度である場合には、前記架橋結合反応が２時間以下、或いは０．１〜０．５時間、或いは０．２〜０．３時間であることが好ましい。

また、本発明に係る架橋ヒアルロン酸の製造方法においては、前記低温で架橋結合を行うステップの後に、さらに、該架橋ヒアルロン酸を希釈させるステップを有し、これにより、該ヒアルロン酸の濃度を所望の濃度に調整できると共に、浸透圧及びｐＨ値を動物の生理条件に好適な程度に調整することができる。尚、前記希釈を行う工程においては、水、中和溶液、バッファー溶液、食塩水、又はそれらの混合物を用いてもよい。

尚、前記架橋ヒアルロン酸の濃度は、５〜６０ｍｇ／ｍＬ、或いは１０〜４０ｍｇ／ｍＬ、或いは２０〜３０ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、浸透圧は、２８０〜３４０ｍＯｓｍ／ｋｇであることが好ましい。

本発明に係る架橋ヒアルロン酸の製造方法においては、前記低温で架橋結合を行うステップの後に、さらに、前記架橋結合反応が行うことにより、非中性の元の反応環境を中和させるためのステップを有し、これにより、非中性の元の反応環境を、動物に好適な例えば６．５〜７．５のｐＨ値を有する中性環境となるように中和させることができる。なお、架橋結合反応の反応環境を中和させるステップ及び架橋ヒアルロン酸を希釈させるステップを同時に行っても構わない。

更に、本発明に係る架橋ヒアルロン酸の製造方法においては、前記低温で架橋結合を行うステップの後に、さらに、前記架橋ヒアルロン酸を均一化させるステップを有する。

尚、前記ヒアルロン酸塩が、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸亜鉛からなる群より選択されるものであることが好ましい。

また、前記アルカリ条件は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムからなる群より選択される無機塩基によるものであることが好ましい。

本明細書において、「Ｎ」は、１リットルの溶液における塩基のモル当量とする。

本明細書において、「Ｎ’」は、溶剤、塩基、及び架橋剤を溶液の一部とすると共に、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸金属塩、ヒアルロン酸の誘導体、及びヒアルロン酸の混合物を溶液から除外するように計算した１リットルの溶液における塩基のモル当量とする。

尚、前記アルカリ条件は、０．０５〜１．５Ｎ’、或いは０．０５〜１Ｎ’、或いは０．２〜０．５Ｎ’であることが好ましく、０．２５〜０．５Ｎ’であることがより好ましい。

更に、前記ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体は、ヒドロキシ基を有するものであり、また、該ヒアルロン酸塩誘導体が、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、アルギン酸塩、コンドロイチン−４−サルフェート、コンドロイチン−６−サルフェート、キサンタンガム、キトサン、ペクチン、寒天、カラギーナン、グアールガムからなる群より選択されるものであることが好ましい。

また、前記架橋剤が多官能性エポキシド化合物、或いは二官能性エポキシド化合物であることが好ましい。

前記架橋剤が１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ポリポロピレングリコールジグリシジルエーテル、ポリテトラメチレングリコールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンポリグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル、１，２，７，８−ジエポキシオクタン、１，３−ブタジエンジエポキシド、それらの混合物からなる群より選択されるものであることが好ましい。

一方、前記架橋剤の濃度は、０．０５〜２ｗ／ｖ％、或いは０．１〜１．５ｗ／ｖ％、或いは０．１〜１。０ｗ／ｖ％であることが好ましく、０．６〜１．０ｗ／ｖ％であることがより好ましい。

前記低温は、セ氏１０〜３０度、或いはセ氏１５〜３０度、或いはセ氏２０〜３０度であることが好ましい。また、低温のアルカリ条件においては、架橋ヒアルロン酸の加水分解がなされないので、架橋ヒアルロン酸の急速な劣化が起こらないと共に、架橋剤が合理的な濃度以下まで消費されると前記架橋結合反応が停止する。

前記架橋ヒアルロン酸の劣化においては、架橋結合反応の後、アルカリ条件にて起こる加水分解により、前記架橋ヒアルロン酸が深黄色又は深褐色となり、最終生成物を著しく壊滅させるてしまう。尚、この発明においては、僅かに黄色又は褐色がかった架橋ヒアルロン酸が使用可能なものとする。、即ち、この発明においては、架橋ヒアルロン酸を僅かな黄色又は僅かな褐色を帯びるものにする反応は、前記架橋ヒアルロン酸の劣化と定義したものではない。

前記「架橋剤が合理的な濃度以下まで消費される」とは、架橋剤が例えば、１ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、４ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下又は２０ｐｐｍ以下など、この後の工程に適用できる濃度まで消費されることである。しかしながら、前記消費濃度は、本発明の範囲を制限するためのものではないと共に、本発明における架橋剤は、架橋結合反応のみにより消費されるものではなく、例えば、加水分解反応など他の反応により消費されることもある。尚、本発明の実施例においては、未反応な架橋剤の濃度を１ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下、２〜５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、１０〜１５ｐｐｍ以下又は１５〜２０ｐｐｍ以下に制御することができる。

前記反応時間は、３〜２８日間、或いは３〜１１日間、或いは３〜７日間であることが好ましい。尚、前記反応時間は、前記架橋剤の濃度、塩基の濃度及び反応温度により影響されるものである。

更に、前記ポリマーの初期濃度は、２〜４０ｗ／ｖ％、或いは１０〜３０ｗ／ｖ％、或いは１５〜２０ｗ／ｖ％であることが好ましい。

下記の実施例は、さらに本発明を詳細に説明するためのものであり、本発明の請求項の範囲を制限するためのものではない。

実施例１においては、ヒアルロン酸ナトリウムの濃度が２０ｗ／ｖ％であり、塩基の濃度が０．５Ｎ’であり、低反応温度がセ氏３０度であり、架橋剤（１，２，７，８−ジエポキシオクタン）の濃度が１ｖ／ｖ％である。

工程においては、８．９ｍＬの脱イオン水と、１ｍＬの５Ｎの水酸化ナトリウム溶液と、０．１ｍＬの１，２，７，８−ジエポキシオクタンと、高分子量ヒアルロン酸（ＨＨＡ，平均分子量が１，３５０，０００であるもの）による２ｇの高分子量ヒアルロン酸ナトリウム（乾燥重量）とを、室温で電磁撹拌機により５分間持続的に撹拌した後、セ氏３０度の恒温容器において下記表１に記載される反応時間に従って保存する。

そして、前記架橋ヒアルロン酸を、７９．２ｍＬのｐＨ値が７．０±０．２の０．０７３Ｍのリン酸緩衝溶液及び０．８ｍＬの６Ｎの塩化水素溶液に加え、ｐＨ値及び浸透圧を動物の生理条件に好適な程度に調整してから、架橋ヒアルロン酸を均一化させる。

また、自由状態の官能基を有する架橋剤の総量を測定する方法は、ヒアルロニダーゼを用いる加水分解反応ステップと、前記非特許文献２による方法を用いるステップとを有し、架橋ヒアルロン酸において自由状態の官能基を有する架橋剤の総量が１〜３００ｐｐｍである場合においては、上述の方法に対して校正を行うと、良い線形関係を示す。

その後、０．１ｇの架橋ヒアルロン酸を５０ｍＬの容量のフラスコに入れ、架橋ヒアルロン酸を溶解させるために、３ｍＬの６Ｎの硫酸溶液をさらに加え、架橋ヒアルロン酸が溶解した時、さらに脱イオン水を前記用量フラスコの目盛りまで加え、第４．０版ヨーロッパ薬局方（２００２）に記載の方法を用いてグルクロン酸を測定し、架橋ヒアルロン酸の含量を算出する。尚、異なる反応時間に対する架橋ヒアルロン酸の含量と、自由状態の官能基を有する残留の架橋剤の含量は夫々、下記表１に記載される通りである。

実施例２においては、ヒアルロン酸ナトリウムの濃度が２０ｗ／ｖ％であり、塩基の濃度が０．５Ｎ’であり、低反応温度がセ氏３０度であり、架橋剤（１，３−ブタジエンジエポキシド）の濃度が１ｖ／ｖ％である。

実施例２においては前記実施例１の方法が適用されるが、架橋剤に１，３−ブタジエンジエポキシドが用いられる。尚、異なる反応時間に対応する架橋ヒアルロン酸の含量及び自由状態の官能基を有する残留の架橋剤の含量は夫々、下記表１に記載される通りである。

実施例３においては、ヒアルロン酸ナトリウムの濃度が２０ｗ／ｖ％であり、塩基の濃度が０．２５Ｎ’であり、低反応温度がセ氏１０度であり、架橋剤（１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）の濃度が１ｖ／ｖ％である。

工程においては、９．４ｍＬの脱イオン水と、０．５ｍＬの５Ｎの水酸化ナトリウム溶液と、０．１ｍＬの１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルと、高分子量ヒアルロン酸（ＨＨＡ，平均分子量が１，３５０，０００であるもの）による２ｇの高分子量ヒアルロン酸ナトリウム（乾燥重量）とを、室温で電磁撹拌機により５分間持続的に撹拌してから、セ氏１０度の恒温容器において下記表１に記載される反応時間に従って保存する。

そして、前記架橋ヒアルロン酸を、７９．６ｍＬのｐＨ値が７．０±０．２の０．１Ｍのリン酸緩衝溶液及び０．４ｍＬの６Ｎの塩化水素溶液に加え、ｐＨ値及び浸透圧を動物の生理条件に好適な程度に調整してから、架橋ヒアルロン酸を均一化させる。

その後、自由状態の官能基を有する架橋剤の総量を、前記実施例１と同様の方法により測定する。尚、異なる反応時間に対応する架橋ヒアルロン酸の含量及び自由状態の官能基を有する残留の架橋剤の含量は夫々、下記表１に記載される通りである。

実施例４においては、ヒアルロン酸ナトリウムの濃度が２０ｗ／ｖ％であり、塩基の濃度が０．２５Ｎ’であり、低反応温度がセ氏２０度であり、架橋剤（１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）の濃度が１ｖ／ｖ％である。

実施例４においては前記実施例３の方法が適用されるが、実施例３とは異なる温度が低反応温度として設定される。尚、異なる反応時間に対応する架橋ヒアルロン酸の含量及び自由状態の官能基を有する残留の架橋剤の含量は夫々、下記表１に記載される通りである。

実施例５においては、ヒアルロン酸ナトリウムの濃度が２０ｗ／ｖ％であり、塩基の濃度が０．２５Ｎ’であり、低反応温度がセ氏３０度であり、架橋剤（１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）の濃度が１ｖ／ｖ％である。

実施例５においては前記実施例３の方法が適用されるが、実施例３とは異なる温度が低反応温度として設定される。尚、異なる反応時間に対応する架橋ヒアルロン酸の含量及び自由状態の官能基を有する残留の架橋剤の含量は夫々、下記表１に記載される通りである。

実施例６においては、ヒアルロン酸ナトリウムの濃度が２０ｗ／ｖ％であり、塩基の濃度が０．２Ｎ’であり、低反応温度がセ氏３０度であり、架橋剤（１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）の濃度が１ｖ／ｖ％である。

工程においては、９．５ｍＬの脱イオン水と、０．４ｍＬの５Ｎの水酸化ナトリウム溶液と、０．１ｍＬの１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルと、高分子量ヒアルロン酸（ＨＨＡ，平均分子量が１，３５０，０００であるもの）による２ｇの高分子量ヒアルロン酸ナトリウム（乾燥重量）とを、室温で電磁撹拌機により５分間持続的に撹拌してから、セ氏３０度の恒温容器において下記表１に記載される反応時間に従って保存する。その後、前記架橋ヒアルロン酸を、７９．６８ｍＬのｐＨ値が７．０±０．２の０．１Ｍのリン酸緩衝溶液及び０．３２ｍＬの６Ｎの塩化水素溶液に加え、ｐＨ値及び浸透圧を動物の生理条件に好適な程度に調整してから、この架橋ヒアルロン酸を均一化させる。

その後、自由状態の官能基を有する架橋剤の総量を、前記実施例１と同様の方法により測定する。尚、異なる反応時間に対応する架橋ヒアルロン酸の含量及び自由状態の官能基を有する残留の架橋剤の含量は夫々、下記表１に記載される通りである。

備考：アステリスクは、校正範囲（１〜３００ｐｐｍ）を逸脱していることを示す。

実施例７においては、ヒアルロン酸ナトリウムの濃度が１０ｗ／ｖ％であり、塩基の濃度が０．０５Ｎ’であり、高反応温度がセ氏５０度であり、低反応温度がセ氏３０度であり、架橋剤（１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）の濃度が１ｖ／ｖ％である。

工程においては、９．８ｍＬの脱イオン水と、０．１ｍＬの５Ｎの水酸化ナトリウム溶液と、０．１ｍＬの１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルと、高分子量ヒアルロン酸（ＨＨＡ，平均分子量が１，３５０，０００であるもの）による１ｇの高分子量ヒアルロン酸ナトリウム（乾燥重量）とを、室温で電磁撹拌機により５分間持続的に撹拌してから、セ氏５０度の恒温容器において７時間保存すると共に、セ氏３０度の恒温容器において下記表２に記載される反応時間に従って保存する。

そして、前記架橋ヒアルロン酸を、９．８７ｍＬの脱イオン水、２０ｍＬのｐＨ値が７．０±０．２の０．１５Ｍのリン酸緩衝溶液及び０．１３ｍＬの６Ｎの塩化水素溶液に加え、ｐＨ値及び浸透圧を、動物の生理条件に好適な程度に調整してから、架橋ヒアルロン酸を均一化させる。

その後、自由状態の官能基を有する架橋剤の総量を前記実施例１と同様の方法により測定する。尚、異なる反応時間に対応する架橋ヒアルロン酸の含量及び自由状態の官能基を有する残留の架橋剤の含量は夫々、下記表２に記載される通りである。

実施例８においては、ヒアルロン酸ナトリウムの濃度が２０ｗ／ｖ％であり、塩基の濃度が０．５Ｎ’であり、高反応温度がセ氏４０度であり、低反応温度がセ氏２５度であり、架橋剤（１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）の濃度が１ｖ／ｖ％である。

工程においては、８．９ｍＬの脱イオン水と、１ｍＬの５Ｎの水酸化ナトリウム溶液と、０．１ｍＬの１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルと、高分子量ヒアルロン酸（ＨＨＡ，平均分子量が１，３５０，０００であるもの）による２．０ｇの高分子量ヒアルロン酸ナトリウム（乾燥重量）とを、室温で電磁撹拌機により５分間持続的に撹拌してから、セ氏４０度の恒温容器において３時間保存すると共に、セ氏２５度の恒温容器において下記表２に記載される反応時間に従って保存する。

そして、前記架橋ヒアルロン酸を、７９．２ｍＬのｐＨ値が７．０±０．２の０．０７３Ｍのリン酸緩衝溶液及び０．８ｍＬの６Ｎの塩化水素溶液に加え、ｐＨ値及び浸透圧を動物の生理条件に好適な程度に調整してから、この架橋ヒアルロン酸を均一化させる。

その後、自由状態の官能基を有する架橋剤の総量を、前記実施例１と同様の方法により測定する。尚、異なる反応時間に対応する架橋ヒアルロン酸の含量及び自由状態の官能基を有する残留の架橋剤の含量は夫々、下記表２に記載される通りである。

実施例９においては、ヒアルロン酸ナトリウムの濃度が２０ｗ／ｖ％であり、塩基の濃度が０．５Ｎ’であり、高反応温度がセ氏４０度であり、低反応温度がセ氏２５度であり、架橋剤（１，２，７，８−ジエポキシオクタン）の濃度が１ｖ／ｖ％である。

実施例９においては、前記実施例８の方法が適用されるが、架橋剤に１，２，７，８−ジエポキシオクタンが用いられる。尚、異なる反応時間に対応する架橋ヒアルロン酸の含量及び自由状態の官能基を有する残留の架橋剤の含量は夫々、下記表２に記載される通りである。

実施例１０においては、ヒアルロン酸ナトリウムの濃度が２０ｗ／ｖ％（１０ｗ／ｖ％のＨＨＡ及び１０ｗ／ｖ％のＬＨＡ）であり、塩基の濃度が０．２５Ｎ’であり、高反応温度がセ氏４０度であり、低反応温度がセ氏１０度であり、架橋剤（１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）の濃度が０．６ｖ／ｖ％である。

工程においては、９．４４ｍＬの脱イオン水と、０．５ｍＬの５Ｎの水酸化ナトリウム溶液と、０．０６ｍＬの１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルと、高分子量ヒアルロン酸（ＨＨＡ，平均分子量が１，３５０，０００であるもの）による１ｇの高分子量ヒアルロン酸ナトリウム（乾燥重量）と、低分子量ヒアルロン酸（ＬＨＡ，平均分子量が４４０，０００であるもの）による１ｇの低分子量ヒアルロン酸ナトリウム（乾燥重量）とを、室温で電磁撹拌機により５分間持続的に撹拌してから、セ氏４０度の恒温容器において４時間保存すると共に、セ氏１０度の恒温容器において下記表２に記載される反応時間に従って保存する。

そして、前記架橋ヒアルロン酸を、７９．６ｍＬのｐＨ値が７．０±０．２の０．１Ｍのリン酸緩衝溶液及び０．４ｍＬの６Ｎの塩化水素溶液に加え、ｐＨ値及び浸透圧を動物の生理条件に好適な程度に調整してから、この架橋ヒアルロン酸を均一化させる。

更に、自由状態の官能基を有する架橋剤の総量を、前記実施例１と同様の方法により測定する。尚、異なる反応時間に対応する架橋ヒアルロン酸の含量及び自由状態の官能基を有する残留の架橋剤の含量は夫々、下記表２に記載される通りである。

実施例１１においては、ヒアルロン酸ナトリウムの濃度が３０ｗ／ｖ％（１５ｗ／ｖ％のＨＨＡ及び１５ｗ／ｖ％のＬＨＡ）であり、塩基の濃度が０．２５Ｎ’であり、高反応温度がセ氏４０度であり、低反応温度がセ氏２５度であり、架橋剤（１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）の濃度が０．６ｖ／ｖ％である。

工程においては、９．４４ｍＬの脱イオン水と、０．５ｍＬの５Ｎの水酸化ナトリウム溶液と、０．０６ｍＬの１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルと、高分子量ヒアルロン酸（ＨＨＡ，平均分子量が１，３５０，０００であるもの）による１．５ｇの高分子量ヒアルロン酸ナトリウム（乾燥重量）と、低分子量ヒアルロン酸（ＬＨＡ，平均分子量が４４０，０００であるもの）による１．５ｇの低分子量ヒアルロン酸ナトリウム（乾燥重量）とを、室温で電磁撹拌機により５分間持続的に撹拌してから、セ氏４０度の恒温容器において４時間保存すると共に、セ氏２５度の恒温容器において下記表２に記載される反応時間に従って保存する。

そして、前記架橋ヒアルロン酸を、７９．６ｍＬのｐＨ値が７．０±０．２の０．１０Ｍのリン酸緩衝溶液及び０．４ｍＬの６Ｎの塩化水素溶液に加え、ｐＨ値及び浸透圧を動物の生理条件に好適な程度に調整してから、この架橋ヒアルロン酸を均一化させる。

更に、自由状態の官能基を有する架橋剤の総量を、前記実施例１と同様の方法により測定する。尚、異なる反応時間に対応する架橋ヒアルロン酸の含量及び自由状態の官能基を有する残留の架橋剤の含量は夫々、下記表２に記載される通りである。

実施例１２においては、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの濃度が２０ｗ／ｖ％であり、塩基の濃度が０．２５Ｎ’であり、高反応温度がセ氏４０度であり、低反応温度がセ氏２５度であり、架橋剤（１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）の濃度が１ｖ／ｖ％である。

実施例１２においては、前記実施例１１の方法が適用されるが、２ｇ（乾燥重量）の低分子量ヒアルロン酸ナトリウムが用いられる。尚、異なる反応時間に対応する架橋ヒアルロン酸の含量及び自由状態の官能基を有する残留の架橋剤の含量は夫々、下記表２に記載される通りである。

実施例１３においては、ヒアルロン酸ナトリウムの濃度が２０ｗ／ｖ％（１０ｗ／ｖ％のＨＨＡ及び１０ｗ／ｖ％のＬＨＡ）であり、塩基の濃度が０．２５Ｎ’であり、高反応温度がセ氏４０度であり、低反応温度がセ氏２５度であり、架橋剤（１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）の濃度が０．１ｖ／ｖ％である。

工程においては、９．４９ｍＬの脱イオン水と、０．５ｍＬの５Ｎの水酸化ナトリウム溶液と、０．０１ｍＬの１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルと、高分子量ヒアルロン酸（ＨＨＡ，平均分子量が１，３５０，０００であるもの）による１．０ｇの高分子量ヒアルロン酸ナトリウム（乾燥重量）と、低分子量ヒアルロン酸（ＬＨＡ，平均分子量が４４０，０００であるもの）による１．０ｇの低分子量ヒアルロン酸ナトリウム（乾燥重量）とを、室温で電磁撹拌機により５分間持続的に撹拌してから、セ氏４０度の恒温容器において４時間保存すると共に、セ氏２５度の恒温容器において下記表２に記載される反応時間に従って保存する。

そして、前記架橋ヒアルロン酸を、７９．６ｍＬのｐＨ値が７．０±０．２の０．１０Ｍのリン酸緩衝溶液及び０．４ｍＬの６Ｎの塩化水素溶液に加え、ｐＨ値及び浸透圧を動物の生理条件に好適な程度に調整してから、この架橋ヒアルロン酸を均一化させる。

更に、自由状態の官能基を有する架橋剤の総量を、前記実施例１と同様の方法により測定する。尚、異なる反応時間に対応する架橋ヒアルロン酸の含量及び自由状態の官能基を有する残留の架橋剤の含量は夫々、下記表２に記載される通りである。

実施例１４においては、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの濃度が２０ｗ／ｖ％であり、塩基の濃度が０．２Ｎ’であり、高反応温度がセ氏４０度であり、低反応温度がセ氏３０度であり、架橋剤（１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）の濃度が１ｖ／ｖ％である。

工程においては、９．５ｍＬの脱イオン水と、０．４ｍＬの５Ｎの水酸化ナトリウム溶液と、０．１ｍＬの１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルと、低分子量ヒアルロン酸（ＬＨＡ，平均分子量が４４０，０００であるもの）による２．０ｇの低分子量ヒアルロン酸ナトリウム（乾燥重量）とを、室温で電磁撹拌機により５分間持続的に撹拌してから、セ氏４０度の恒温容器において４時間保存すると共に、セ氏３０度の恒温容器において下記表２に記載される反応時間に従って保存する。

そして、前記架橋ヒアルロン酸を、７９．６８ｍＬのｐＨ値が７．０±０．２の０．１０Ｍのリン酸緩衝溶液及び０．３２ｍＬの６Ｎの塩化水素溶液に加え、ｐＨ値及び浸透圧を動物の生理条件に好適な程度に調整してから、この架橋ヒアルロン酸を均一化させる。

更に、自由状態の官能基を有する架橋剤の総量を、前記実施例１と同様の方法により測定する。尚、異なる反応時間に対応する架橋ヒアルロン酸の含量及び自由状態の官能基を有する残留の架橋剤の含量は夫々、下記表２に記載される通りである。

実施例１５においては、高分子量ヒアルロン酸ナトリウムの濃度が１０ｗ／ｖ％であり、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、ナトリウム塩）の濃度が１０ｗ／ｖ％、塩基の濃度が０．３Ｎ’であり、高反応温度がセ氏４０度であり、低反応温度がセ氏２０度であり、架橋剤（１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）の濃度が０．６ｖ／ｖ％である。

工程においては、９．３４ｍＬの脱イオン水と、０．６ｍＬの５Ｎの水酸化ナトリウム溶液と、０．４ｇの塩化ナトリウムと、０．１ｍＬの１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルと、高分子量ヒアルロン酸（ＨＨＡ，平均分子量が１，３５０，０００であるもの）による１．０ｇの高分子量ヒアルロン酸ナトリウム（乾燥重量）と、１．０ｇ（乾燥重量）のカルボキシメチルセルロース（ナトリウム塩）とを、室温で電磁撹拌機により５分間持続的に撹拌してから、セ氏４０度の恒温容器において４時間保存すると共に、セ氏２０度の恒温容器において下記表２に記載される反応時間に従って保存する。

そして、前記架橋ヒアルロン酸を、７９．５０ｍＬのｐＨ値が７．０±０．２の０．０１Ｍのリン酸緩衝溶液及び０．５ｍＬの６Ｎの塩化水素溶液に加え、ｐＨ値及び浸透圧を動物の生理条件に好適な程度に調整してから、この架橋ヒアルロン酸を均一化させる。

更に、自由状態の官能基を有する架橋剤の総量を、前記実施例１と同様の方法により測定する。但し、加水分解酵素には、ヒアルロニダーゼとセルラーゼ（ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ １．５Ｌ、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ｆｅｒｍｅｎｔ Ｌｔｄ．）とからなる混合物が用いられる。尚、異なる反応時間に対応する架橋ヒアルロン酸の含量及び自由状態の官能基を有する残留の架橋剤の含量は夫々、下記表２に記載される通りである。

また、架橋結合反応の反応時間が２日を越える場合には、前記架橋ヒアルロン酸を動物に応用することができる。

備考：アステリスクは、校正範囲（１〜３００ｐｐｍ）を逸脱していることを示す。

実施例１５においては、前記架橋ヒアルロン酸における高分子量ヒアルロン酸ナトリウムの濃度が１ｗ／ｖ％、カルボキシメチルセルロースの濃度が１ｗ／ｖ％である。

本発明は上記の構成を有することから、自由状態の官能基を有する架橋剤の濃度を低減させることにより、精製工程の必要性を低減させることができる。

Claims (19)

1. アルカリ条件において、セ氏１０〜３０度の低温で、４８時間以上の反応時間をかけて１種類又は複数種類のポリマーと架橋剤とを架橋結合させることにより、架橋ヒアルロン酸を形成させるステップを有し、該ポリマーは、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、ヒアルロン酸とヒアルロン酸塩との混合物、ヒアルロン酸とヒドロキシ基を有する多糖類との混合物、及びヒアルロン酸塩とヒドロキシ基を有する多糖類との混合物からなる群より選択されるものであり、
   前記低温で架橋結合を行うステップの前に、さらに、セ氏３５〜６０度の高温で架橋結合反応を行うステップを有し、さらに、
   ヒドロキシ基を有する前記多糖類が、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、アルギン酸塩、コンドロイチン−４−サルフェート、コンドロイチン−６−サルフェート、キサンタンガム、キトサン、ペクチン、寒天、カラギーナン、グアールガムからなる群より選択されるものであることを特徴とする架橋ヒアルロン酸の製造方法。
2. 前記ヒアルロン酸塩がヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸亜鉛からなる群より選択されるものであることを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法。
3. 前記アルカリ条件が０．０５〜１．５Ｎ’であることを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法。
4. 前記アルカリ条件が無機塩基によるものであることを特徴とする請求項１に記載の 架橋ヒアルロン酸の製造方法。
5. 前記無機塩基が水酸化ナトリウム、水酸化カリウムからなる群より選択されるものであることを特徴とする請求項４に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法。
6. 前記架橋剤が多官能性エポキシド化合物であることを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法。
7. 前記架橋剤が二官能性エポキシド化合物であることを特徴とする請求項６に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法。
8. 前記架橋剤が１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ポリポロピレングリコールジグリシジルエーテル、ポリテトラメチレングリコールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンポリグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル、１，２，７，８−ジエポキシオクタン、１，３−ブタジエンジエポキシド、それらの混合物からなる群より選択されるものであることを特徴とする請求項７に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法。
9. 前記架橋剤の濃度が０．０５〜２ｗ／ｖ％であることを特徴とする請求項６に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法。
10. 前記低温がセ氏１５〜３０度であることを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法。
11. 前記低温がセ氏２０〜３０度であることを特徴とする請求項１０に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法。
12. 前記反応時間が３〜２８日間であることを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法。
13. 前記ポリマーの濃度が２〜４０ｗ／ｖ％であることを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法。
14. 前記低温で架橋結合を行うステップの後に、さらに、前記架橋ヒアルロン酸に透析手段を施すステップを有することを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法。
15. 前記低温で架橋結合を行うステップの後に、さらに、前記架橋結合反応を行うことにより、非中性の元の反応環境を中和させるためのステップを有することを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法。
16. 前記低温で架橋結合を行うステップの後に、さらに、前記架橋ヒアルロン酸を均一化させるステップを有することを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法。
17. 前記架橋ヒアルロン酸において、自由状態の官能基を有する架橋剤の含量が２０ｐｐｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法。
18. 前記ポリマーの含量が、５〜６０ｍｇ／ｍＬ以下であることを特徴とする請求項１に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法。
19. 前記反応時間が３〜２８日間であることを特徴とする請求項３に記載の架橋ヒアルロン酸の製造方法。